CZ304897B6 - Způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA a neterapeutické použití bakteriální nebo kvasinkové buňky - Google Patents

Abstract

Řešení popisuje způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA do organizmu odlišného od člověka provedený za neterapeutickým účelem. Tento způsob obsahuje krmení uvedeného organizmu bakteriální nebo kvasinkovou buňkou obsahující expresní vektor obsahující dva promotory orientované vzhledem k sekvenci DNA tak, že jsou po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedené promotory schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA. Dále se popisuje neterapeutické použití bakteriální nebo kvasinkové buňky obsahující expresní vektor obsahující dva promotory orientované vzhledem k sekvenci DNA tak, že jsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání příslušného transkripčního faktoru na uvedené promotory, k produkci dvouřetězcové RNA v organizmu odlišném od člověka krmením organizmu odlišného od člověka bakteriální nebo kvasinkovou buňkou.

Description

Způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA a neterapeutícké použití bakteriální nebo kvasinkové buňky

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA do organizmu, zainteresovaného expresního vektoru a plazmidu, buňky a organizmu transformované nebo transfektované zainteresovaným plazmidem, použití expresního vektoru obsahujícího promotoiy specificky orientované vzhledem k sekvenci DNA, rostlinné buňky, a způsobu produkce rostliny rezistentní proti zamoření škůdcem.

Dosavadní stav techniky

Nedávno bylo popsáno (Nátuře 391: 806-811, únor 1998), že vnesení dvouřetězcové RNA do buňky vede k silnému a specifickému ovlivnění exprese endogenních genů v buňce a tento vliv je podstatně účinnější než vnesení každého z řetězců RNA jednotlivě, jak se provádí při tzv. antisense technikách. Bylo zjištěno, že k tomuto specifickému snížení aktivity genu dochází u červa, resp. hlístice Caenorhabditis elegans (C. elegans) po vnesení RNA do genomu nebo do tělní dutiny.

Předkládaný vynález užívá této techniky pro novou metodu přiřazení funkce genům nebo DNA fragmentům, které byly sekvencovány v různých programech, např. v projektu sekvencování lidského genomu, a kterým nebyla dosud přiřazena žádná specifická funkce, a dále metodu identifikace DNA zodpovědné za vznik konkrétního fenotypu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA do organizmu odlišného od člověka provedený za neterapeutickým účelem, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje krmení uvedeného organizmu bakteriální nebo kvasinkovou buňkou obsahující expresní vektor obsahující dva promotory orientované vzhledem k sekvenci DNA tak, že jsou po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedené promotory schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA.

Výhodně uvedený expresní vektor obsahuje dva identické promotory lemující sekvenci DNA.

Výhodně uvedený expresní vektor dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selekční markér.

Výhodně je uvedená nukleotidová sekvence kódující uvedený selekční markér orientovaná vzhledem k promotorům tak, že k transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA dojde po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedené promotory.

Výhodně uvedená nukleotidová sekvence kódující selekční markér leží mezi dvěma identickými promotory schopnými iniciovat transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na promotoiy.

Výhodně uvedený selekční markér obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující sup-35 pro vnesení do C. agens s mutací pha—1.

Výhodně je uvedená bakteriální nebo kvasinková buňka nebo organizmus odlišný od člověka adaptován tak, že exprimuje uvedený transkripční faktor.

-1 CZ 304897 B6

Výhodně je uvedeným organizmem odlišným od člověka C. elegans a uvedenou bakteriální buňkou je E. coli.

Výhodně je uvedeným kmenem E. Coli kmen negativní na RNAzu III.

Výhodně je organizmem mutanta C. elegans nuc-1.

Předmětem vynálezu je rovněž neterapeutické použití bakteriální nebo kvasinkové buňky obsahující expresní vektor obsahující dva promotory orientované vzhledem k sekvenci DNA tak, žejsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání příslušného transkripčního faktoru na uvedené promotory, k produkci dvouřetězcové RNA v organizmu odlišném od člověka krmením organizmu odlišného od člověka bakteriální nebo kvasinkovou buňkou.

Výhodně expresní vektor obsahuje dva identické promotory lemující sekvenci DNA tak, že jsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedené promotory.

Výhodně expresní vektor dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selekční markér.

Výhodně je uvedená nukleotidová sekvence kódující selekční markér orientována vzhledem k promotorům tak, že po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedené promotory dojde k transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA.

Výhodná uvedená nukleotidová sekvence kódující selekční markér leží mezi identickými promotory schopnými iniciovat transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na promotory.

Výhodně uvedený selekční markér obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující sup-35 pro vnesení do C. elegans s mutací pha-1.

Výhodně je expresním vektorem plazmid obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obr. 1. Výhodně je expresním vektorem kvasinkový dvouhybridní vektor zobrazený na obr. 4.

Výhodně byl exon 5 genu sup-35 klonován v plazmidu.

Výhodně je expresním vektorem plazmid obsahující (a) dva promotory T7 vedené jeden ke druhému, (b) restrikční místo nebo vícečetné klonovací místo mezi oběma promotory a (c) genomovou DNA C. elegans sup35 mezi oběma promotory upravenou tak, že obsahuje několik stopujících kodonů k zabránění expresi celé délky proteinu sup35.

V rámci každého předmětu vynálezu je nukleotidová nebo DNA sekvence jak v „sense“ (souhlasně se směrem transkripce), tak i v „anti-sense“ (proti směru transkripce) orientaci vzhledem k jednotlivému promotoru s vlastnostmi popsanými výše, nebo alternativně je mezi dvěma identickými promotory. Oba případy provedení vynálezu poskytují dsRNA transkripcí iniciovanou z promotoru po navázání vhodného transkripčního faktoru.

Buňky podle předkládaného vynálezu mohou být izolovány z organismu nebo mohou být součástí organismu. Pokud jsou buňky součástí organismu (jsou obsaženy v organismu), organismus

-2CZ 304897 B6 může být adaptován tak, aby exprimoval vhodný transkripční faktor. Organismem může být jakýkoliv organismus jako je rostlina, živočich, houba nebo kvasinka, ale výhodně je to hlístice C. elegans, a sice divoký typ nebo mutanta C. elegans obsahující mutaci nuc-1 nebo pha-ts nebo kombinaci těchto mutací. V alternativním provedení vynálezu je DNA nebo cDNA knihovna nebo DNA fragment nebo jeho fragment vnesen, výhodně transfekci nebo transformací, do mikroorganismu, jako je např. buňka bakterie nebo kvasinky, kterými je pak výhodně krmena hlístice C. elegans. V tomto provedení předkládaného vynálezu je mikroorganismus adaptován tak, aby exprimoval vhodný transkripční faktor. Výhodně je mikroorganismus E. coli.

V každém aspektu předkládaného vynálezu je DNA knihovna, DNA homolog nebo jeho fragment konstruován ve vhodném DNA vektoru, který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující daný transkripční faktor. Alternativně je tento transkripční faktor kódován dalším vektorem.

V dalším alternativním provedení buňka nebo organismus exprimují, nebojsou adaptovány, aby exprimovaly daný transkripční faktor. Výhodně kterýkoliv vektor použitý ve způsobu podle vynálezu obsahuje selekční markér, což může být např. nukleotidová sekvence kódující gen sup-35 nebo jeho fragment. Nukleotidová sekvence je orientována vzhledem k promotoru tak, že navázání transkripčního faktoru na promotor iniciuje transkripci DNA do dvouřetězcové RNA. Obr. 10 ilustruje vektory a orientaci sekvencí DNA, které umožňují tvorbu dsRNA v C. elegans. V jednom provedení vynálezu je DNA lokalizována mezi dvěma promotory ve vektoru schopném exprimovat dsRNA po navázání transkripčního faktoru na tyto promotory. Alternativně obsahuje vektor dvě kopie sekvence DNA uspořádané v sense a anti-sense orientaci vzhledem k promotoru, přičemž jeho markér je selektovatelný, je-li obsažen v mutantě C. elegans pha-1. Výhodně je promotor kterýkoliv z promotorů T7, T3 nebo SP6 a transkripční faktor obsahuje příslušnou polymerázu.

Selekční markér výhodně obsahuje nukleotidovou sekvenci schopnou inhibovat expresi nebo zabránit expresi genu v dané buňce, přičemž jde o gen, který poskytuje známý fenotyp. Tato nukleotidová sekvence je součástí genu nebo je identická s genem poskytujícím tento fenotyp, přičemž sama tato sekvence je orientována vzhledem k vhodnému promotoru (promotorům) schopnému iniciovat transkripci dvouřetězcové RNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na promotor (promotory). Alternativně nukleotidová sekvence je součástí genu neboje identická s genem poskytujícím daný fenotyp, přičemž nukleotidová sekvence je taková, že umožňuje integraci tohoto vektoru nebo dalšího vektoru homologní rekombinaci do genomu dané buňky, přičemž po této integraci je nukleotidová sekvence schopná inhibovat expresi genové sekvence poskytující daný fenotyp. V takovém provedení vynálezu nukleotidová sekvence obsahuje stop kodony vhodné k zabránění translace nukleotidové sekvence po její integraci do genomu.

Výhodně lze ve způsobech podle vynálezu přidat k buňkám nebo organismům sloučeniny s cílem vyhledávat daný fenotyp (screening), např. fenotyp rezistence nebo vnímavosti ke sloučenině ve srovnání s divokým typem. Promotory jsou výhodně indukovatelné promotory. Transkripční faktory jsou v někteiých provedeních vynálezu odvozeny z fágů, jako je např. T7 polymeráza řízená fágovým promotorem. Avšak pokud je užit C. elegans, je výhodný promotor specifický pro červy nebo tkáňově specifický promotor jako jsou např. Iet858, SERCÁ, UL6, myo-2 nebo myo-3. Výhodně je užit kmen E. coli negativní na RNázu III nebo výhodněji kmen negativní na RNázu.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob přípravy transgenního organismu, s výjimkou člověka, obsahujícího exogenní transkripční faktor a transgen, kteiý obsahuje promotor operativně spojený s fragmentem DNA, který je exprimován po navázání transkripčního faktoru, přičemž tento způsob obsahuje kroky, kdy se a) připraví první transgenní organismus obsahující první konstrukt obsahující DNA kódující exogenní transkripční faktor a druhý transgenní organismus obsahující druhý konstrukt obsahující alespoň jeden promotor operativně spojený s požadovanou sekvencí DNA, která je exprimována po navázání transkripčního faktoru prvního transgenního organismu, a b) kříží první a druhý transgenní organismus a vybere se potomstvo exprimující požadovanou sekvenci DNA. V jednom provedení vynálezu první a druhý transgenní organismus jsou připraveny vnesením prvního a druhého konstruktu transformací do mikroorga-3 CZ 304897 B6 nismů, které jsou užity jako potrava pro požadovaný organismus. Výhodně druhý konstrukt obsahuje požadovanou sekvenci DNA v takové orientaci vzhledem k promotoru, která umožňuje iniciaci transkripce DNA na dsRNA po navázání transkripčního faktoru. V tomto provedení vynálezu druhý konstrukt obsahuje dva promotory obklopující požadovanou sekvenci DNA, přičemž tyto promotory mohou iniciovat transkripci sekvence DNA do dsRNA po navázání transkripčního faktoru na dané promotory. Alternativně je sekvence DNA jak v sense, tak i v anti-sense orientaci vzhledem k promotorům, takže poskytuje dsRNA po navázání transkripčního faktoru na promotory. V každém z těchto provedení vynálezu první a/nebo druhý konstrukt výhodně obsahuje reportérový gen operativně spojený s promotorem, který je schopen iniciovat transkripci reportérového genu po navázání transkripčního faktoru. Výhodně reportérový gen kóduje některý z genů jako je luciferáza, zelený fluorescenční protein, β-galaktosidáza nebo β-laktamáza.

Předkládaný vynález se také týká způsobu ověření klonů identifikovaných v kvasinkovém dvouhybridním vektorovém experimentu, přičemž tyto experimenty jsou odborníkovi dobře známy a byly poprvé navrženy v publikaci Chien et al., 1991 pro detekci interakce protein-protein. Způsob podle vynálezu obsahuje kroky, kdy se poskytne konstrukt obsahující DNA kódující protein identifikovaný v kvasinkovém dvouhybridním vektorovém experimentu, přičemž tento konstrukt je takový, že DNA je ve vhodné orientaci vzhledem k jednomu nebo více promotorům schopným zahájit transkripci dané DNA do dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na dané promotory, konstruktem se transformuje buňka, jako je např. bakteriální buňka, nebo alternativně organismus obsahující požadovaný transkripční faktor, a identifikují se fenotypové změny v dané buňce nebo organismu, přičemž organismem může být C. elegans nebo podobný organismus, a srovnají se s divokým typem. Výhodně transkripční faktor je indukovatelný v buňce nebo organismu. Sekvence DNA může být lokalizovaná mezi dvěma promotory, a to jak v sense, tak i v anti-sense orientaci vzhledem k jednotlivému promotoru, jak bylo již popsáno výše. Výhodně je promotorem fágový promotor polymerázy a transkripčním faktorem je RNA polymeráza, výhodně T7 RNA polymeráza. Předmětem předkládaného vynálezu jsou také vektory vhodné pro transformaci buněk nebo organismů a pak samotné buňky nebo organismy.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob snížení zamoření rostlin škůdci, přičemž tento způsob spočívá v tom, že obsahuje kroky, kdy se a) identifikuje sekvence DNA z daného škůdce, která je kritická pro jeho přežití, růst, proliferaci nebo reprodukci, b) sekvence z kroku a) nebo její fragment se klonuje do vhodného vektoru vzhledem k jednomu nebo několika promotorům schopným transkripce dané sekvence do RNA nebo dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na dané promotory a c) vektor se vnese do rostliny.

Takže výhodný způsob podle vynálezu poskytuje zvláště selektivní mechanismus pro snížení zamoření škůdcem, v někteiých případech zamoření rostliny parazitem, kdy škůdce tím, že cizopasí na rostlině, pozře také exprimovanou dsRNA v rostlině, a tím inhibuje expresi DNA, která je kritická pro jeho přežití, růst, proliferaci nebo reprodukci. Ve výhodném provedení vynálezu je škůdce kterýkoliv škůdce patřící do skupiny obsahující Tylenchulus spp., Radophulus ssp., Rhadinaphelenchus ssp., Heterodera ssp., Rotylenchulus ssp., Pratylenchus ssp., Belonolaimus ssp., Canjanus spp., Meloidygne ssp., Globodera ssp., Nacobbus ssp., Ditylenchus ssp., Aphelenchoides ssp., Hirscmenniella ssp., Anguina ssp., Haplolaimus, ssp., Heliotylenchus ssp., Criconemalla ssp., Xiphinema ssp., Longidorus ssp., Trichodorus ssp., Paratrichodorus ssp., Aphelenches ssp. Sekvence DNA nebo její fragment podle tohoto aspektu vynálezu je klonována mezi dva tkáňově specifické promotory, jako jsou např. kořenově specifické promotory.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká vektorů užitých ve způsobech podle vynálezu pro konstrukci požadované knihovny. Tyto vektory podle vynálezu obsahují dva shodné promotory orientované tak, že jsou schopné iniciovat transkripci sekvence DNA lokalizované mezi nimi na dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na tyto promotory. Sekvence DNA např. obsahuje vícečetné klonovací místo. Výhodně expresní vektor obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selekční markér. Vjednom provedení vynálezu je nukleotidové sekvence kódující selekční markér lokalizovaná mezi dva shodné promotory orientované tak, že jsou schopné ini-4CZ 304897 B6 ciovat transkripci sekvence DNA lokalizované mezi nimi na dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na tyto promotory. Výhodně selekční markér obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující sup-35, pro vnesení do C. elegans nesoucí mutaci pha-1.

Výhodně transkripční faktory obsahují buďto fágovou polymerázu, která se váže na svůj odpovídající promotor, nebo C. elegans specifický promotor, ještě výhodněji T7 polymerázu. Výhodně vektor obsahuje vícečetné klonovací místo ležící mezi dvěma uvedenými promotory.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje expresní vektor pro expresi vhodného transkripěního faktoru pro použití při způsobech podle vynálezu. Tento vektor obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující vhodný transkripční faktor operativně spojenou s vhodnou sekvencí kontrolující expresi. Výhodně sekvence kontrolující expresi obsahuje promotor, který je indukovatelný, konstitutivní, obecný nebo tkáňově specifický, nebo jejich kombinaci. Výhodně transkripční faktor obsahuje fágovou polymerázu, výhodně T7, T3 nebo SP6 RNA polymerázu.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje selekční systém pro identifikaci transformace buněk nebo organismů vektorem podle vynálezu, přičemž tento systém obsahuje vektor podle vynálezu, kde selekční markér obsahuje nukleotidovou sekvenci schopnou inhibovat nebo zabránit expresi genu v buňce nebo organismu, přičemž tento gen je zodpovědný za vytvoření známého fenotypu. Výhodně tato nukleotidová sekvence odpovídá části nebo je celá shodná s genem vytvářejícím známý fenotyp, a přitom je tato nukleotidová sekvence sama lokalizována mezi dva shodné promotory orientované tak, že jsou schopné iniciovat transkripci sekvence DNA lokalizované mezi nimi na dsRNA po navázání vhodného transkripčního faktoru na tyto promotory. Alternativně nukleotidová sekvence obsahuje sekvenci, která je částí nebo je zcela shodná se sekvencí genu, který vytváří daný fenotyp buňky nebo organismu, a která je taková, že po integraci vektoru homologní rekombinací v chromosomu dané buňky nebo organismu inhibuje expresi dané genové sekvence vytvářející uvedený známý fenotyp. Výhodně podle tohoto provedení vynálezu nukleotidová sekvence obsahuje stop kodony dostatečné ktomu, aby zabránily translaci nukleotidové sekvence po integraci do chromosomu. Výhodně sekvence známého genu obsahuje gen sup-35 nebo jeho fragment, který je selektovatelný identifikací potomstva rostoucího při teplotě vyšší než 25 °C po vnesení do mutanty C. elegans pha-1 a 123ts.

Ještě další aspekt vynálezu poskytuje způsob přiřazení funkce sekvencí DNA v mnohabuněčném organismu, přičemž tento způsob obsahuje kroky, kdy se a) konstrukt obsahující daný fragment DNA klonovaný mezi dva promotory schopné iniciovat transkripci v daném mnohabuněčném organismu se vnese do mnohabuněčného organismu schopného iniciovat transkripci z daného promotoru a b) identifikuje se fenotyp mnohabuněčného organismu ve srovnání s divokým typem.

Předkládaný vynález je dále vysvětlen formou příkladů, které mají pouze ilustrativní funkci, a připojených obrázků.

Objasnění výkresů

Obr. 1 je nukleotidová sekvence plazmidu PGN1 podle předkládaného vynálezu.

Obr. 2 je nukleotidová sekvence plazmidu PGN100 podle předkládaného vynálezu.

Obr. 3 je schematické znázornění vektorů a transformačních režimů použitých ve způsobech podle vynález.

Obr. 4 je schéma expresního vektoru použitého podle vynálezu.

-5CZ 304897 B6

Obr. 5 je schematické znázornění expresního vektoru T7 RNA polymerázy pro transkripci C. elegans.

Obr. 6 je schéma plazmidů PGN1.

Obr. 7 je schematické znázornění zlepšeného vektoru pro inhibici dsRNA kódujícího sup-35 dsRNA.

Obr. 8 je schéma expresního vektoru použitého k integraci do genomu C. elegans.

Obr. 9 je schéma znázorňující pozici sekvence (sekvencí) DNA vzhledem k vhodnému promotoru schopnému iniciovat z dané sekvence DNA expresi dsRNA.

Obr. 10 znázorňuje plazmid pGN108.

Obr. 11 znázorňuje plazmid pGN 105.

Obr. 12 znázorňuje plazmid pGN400.

Obr. 13 znázorňuje plazmid pGN401.

Obr. 14 znázorňuje plazmid pGNIO.

Obr. 15 je schéma plazmidů pAS2 s přímým a zpětným promotorem T7/T3/SP6.

Obr. 16 je schéma plazmidů pGAD424 s přímým a zpětným promotorem T7/T3/SP6.

Obr. 17 je schéma plazmidů „pAS2-cyh2-HA+,both T7-final“.

Obr. 18 je schéma plazmidů „pGAD424-without-FULL-ICE-BOTH-T7“.

Obr. 19 a) je schéma plazmidů pGN205 a b) je schéma plazmidů pGN207.

Příklady provedení vynálezu

Příklad A

Konstrukce uspořádané a hierarchicky seskupené cDNA knihovny a její použití

Použitý vektor byl vektor pro E. coli nesoucí dva promotory T7 s vícečetným klonovacím místem (MCS) ležícím mezi nimi. Promotory byly orientovány navzájem směrem proti sobě v blízkosti MCS. V přítomnosti T7 RNA polymerázy, exprimované v E. coli, C. elegans nebo jiném organismu, dochází k produkci RNA z obou T7 promotorů. Jelikož jsou promotory orientovány navzájem opačně, z DNA vložené (klonované) do MCS mezi oba promotory se tvoří obě vlákna RNA a vzniká tak dvouřetězcová RNA (dsRNA) po navázání T7 polymerázy.

cDNA knihovna C. elegans byla připravena odborníkovi známým standardním způsobem a vložena do MCS. Pak byla transformací vnesena do E. coli a výsledné E. coli byly kultivovány a uschovány na 96jamkových destičkách. V tomto stadiu může být plazmidová DNA izolována a uskladněna také na 96jamkových destičkách organizovaných odpovídajícím způsobem jako kolonie E. coli. Přibližně 100 000 kolonií E. coli bylo testováno. Při tomto postupu knihovna obsahuje 5 x celkovou exprimovanou cDNA z C. elegans, což poskytuje značnou možnost, že v knihovně jsou přítomny i sekvence s nízkou hladinou exprese. Výsledkem bylo 1041 destiček

-6CZ 304897 B6 s 96 jamkami. Destičky byly hierarchicky seskupeny podle potřeby. Pro seskupení klonů byly uspořádány do matice 10 x 100. Jestliže hierarchické seskupování je po 8 nebo 12 (což je nejpohodlnější, neboť destička představuje mřížku 8 x 12), pak dostaneme asi 87 destiček čili 8352 jamek. Jestliže hierarchické seskupování je po 96 jamkách, což je právě plná destička, pak to vede k 11 destičkám a tudíž 1041 jamkám. V kterémkoliv stádiu hierarchického seskupování lze izolovat plazmidovou DNA, což je méně pracné a spotřebuje se méně destiček, ale na druhé straně to vede ke ztrátě komplexity, ačkoliv to neplatí pro případ seskupování po 12. Seskupování lze také provádět s původní DNA. Následující pokusy ukazují, jak bylo provedeno seskupování jak DNA tak E. coli knihovny.

Uspořádaná knihovna pro RNAi technologii nesoucí všechny geny z genomu C. elegans a její použití

Jelikož už je dokončován projekt sekvencování celého genomu, lze využít tyto informace při aplikacích T7 RNA inhibiční technologie. Každý gen z genomu C. elegans může být tudíž klonován pomocí PCR techniky. Výhodně lze klonovat exony s nejmenší délkou 500 bp. Pokud jsou exony příliš malé, menší fragmenty lze izolovat pomocí PCR, nebo dokonce i částí intronů a sousední exony lze izolovat užitím PCR, takže je klonována alespoň dostatečná část translatovaného úseku. Pro tento účel bylo potřeba provést alespoň 1700 jednotlivých PCR reakcí. Tato kolekce PCR produktů pak byla klonována do T7 vektoru jak byl popsán (obsahuje 2 promotory orientované navzájem proti sobě a mezi nimi vícečetné klonovací místo). Každý PCR produkt byl klonován nezávisle, nebo byl využit ke generování náhodné knihovny, analogické popsané cDNA knihovně. Když se každý PCR produkt klonoval jednotlivě, je možné pak seskupovat výsledné bakterie a plazmidovou DNA různými způsoby. Za prvé, kolekci jednotlivě klonovaných PCR produktů ve vektoru T7 je možné seskupit náhodně, jak je popsáno pro náhodnou knihovnu. Seskupení je také možné provést racionálnějším způsobem. Tak např. je možné geny C. elegans analyzovat moderními nástroji bioinformatiky (tzv. biologie in silico). Různé geny z genomu patří do nějaké genové rodiny nebo mají v genomu homology. Takže se seskupí členy genové rodiny nebo mají v genomu homology. Takže se seskupí členy genové rodiny nebo homologní členové. Tímto způsobem se počet 1700 klonů zredukoval na podstatně přijatelnější počet. Taková knihovna se pak může užít pro screening fenotypu způsobem podle vynálezu. Výsledný fenotyp poskytuje funkční popis genu nebo genové rodiny nebo homologních genů z genomu C.elegans. Jelikož knihovna sestává z alespoň části každého genu, tento způsob umožňuje popis celého genomu ve funkčně-fenotypových termínech. Pro tento účel je třeba do červa, resp. hlístice vnést dvouřetězcovou RNA (dsRNA). Toto vnesení klonů ať už samotným nebo seskupených klonů, ať už náhodným nebo racionálním způsobem, lze provést několika různými způsoby, jak je zde popsáno.

Příklad vektoru pro expresi dvouřetězcovou RNAi

Pro tento účel se může užít jakýkoliv vektor obsahující promotor T7 a vícečetné klonovací místo (existuje mnoho komerčně dostupných vektorů těchto vlastností). Byly navrženy oligonukleotidové primery obsahující T7 promotor a reverzní komplementární řetězec, oba s vhodným zákončením. Tyto primery mohou být hybridizovány, a pokud byly dobře navrženy, klonovány do vybraného vektoru. Minimální sekvence promotoru T7 je následující:

TAATACGACTCACTATAGGGCGA

Ačkoliv může být pro konstrukci T7 expresního vektoru užit jakýkoliv vektor, následující příklady ukazují, jak lze dojít k tomuto cíli s vektorem pGEM-3zf(+).

- vektor pGEM-3zf(+) (Promega) byl naštěpen restrikčními enzymy HindlII a Sáli,

- primery oGNl a oGN2 byly smíchány ve finální koncentraci 1 pg/30 μΐ, přivedeny do varu a ponechány zchladnout na teplotu místnosti,

-7 CZ 304897 B6

- primery byly ligovány do vektoru standardním postupem ligace. Výsledným vektorem byl pGNl (uvedený na obr. 1), který obsahuje dva promotory T7 orientované proti sobě navzájem a mezi nimi leží vícečetné klonovací místo.

Sekvence oligonukleotidových primerů oGNl a oGN2 byly následující:

oGNl: AGC TGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT oGN2: TCG AAA GCT TCT CGC ATA ATA GTG AGT CGT ATT AC

Příklad konstrukce knihovny

RNA může být izolována z každého organismu, který je vnímavý na RNAi. Obecně shrnuto, izolovaná RNA se kopíruje do dvouřetězcové cDNA a poté se připraví vhodný vektor pro klonování. Existuje řada postupů a také souprav pro molekulární biologii, které jsou komerčně dostupné od mnohých firem, jako je např. Promega, Clontech, Boehringer, Mannheim, BRL atd., které umožňují:

- izolovat RNA,

- případně izolovat polyA RNA (několik souprav je k dispozici),

- syntetizovat první řetězce cDNA pomocí AMV reverzní transkriptázy, náhodných hexamerů jako primerů a/nebo oligo(dT) primerů,

- syntetizovat druhý řetězce cDNA pomocí Rnázy H, DNA polymerázy I,

- zarovnat konce pomocí T4 DNA polymerázy,

- připojit adaptor pomocí T4 DNA ligázy,

- případně ošetřit produkt T5 polynukleotidylkinázou a

- klonovat DNA do vektoru.

Výsledná ligační směs je považována za cDNA knihovnu. Ligační směs obsahuje všechny cDNA vzniklé v proceduře ligované do požadovaného vektoru. Pro uspořádání knihovny je potřeba ji transformací vnést do buněk E. coli.

Aplikace E. coli knihovny nebo DNA knihovny

T7 RNA produkční kmen:

- standardním kmenem je BL21 (DE3): F-ompT(lon)hsds(r-m) a kmen Β E. coli λ (DE3). Případně lze užít variantu BL21 (DE3), např. byla užita BL21 (DE3)pLysS.

- kterýkoliv jiný kmen E. coli, který tvoří T7 RNA polymerázu, který lze podle potřeby zkonstruovat. Připraví se snadno užitím fága, který je komerčně dostupný, v tomto případě byl užit vektor XCE6 (dostupný od firmy Promega). Téměř každý kmen E. coli může být transfekován tímto fágem a vytváří pak T7 RNA polymerázu.

- mutanta RnázalII E. colv.

-8CZ 304897 B6 v principu jsou dostupné různé kmeny, pro první experimenty byl vybrán kmen AB301-105: ma-19, suc-11, bio-3, gdhA2, his95, mc-105, relAl, spoTl, metBl (Kinder et al., Mol. Gen. Genet. 126: 53), ale existují i vhodnější kmeny. Tento kmen byl infikován XCE6 a byla tak zkonstruována varianta produkující T7.

Hlístnice C. elegans divokého typu lze pěstovat na shlucích bakterií. Bakterie exprimují T7 RNA polymerázu. To vede k tomu, že ve střevu C. elegans se nachází velké množství dsRNA, která difunduje do celého organismu a vede k inhibici exprese. Tato knihovna se pak může užít pro screening několika fenotypů. Tato technika má výhodu, že detekovat relevantní geny v určité metabolické dráze je mnohem rychlejší než užitím dosud známé technologie užívající C. elegans. navíc, pokud se najde zajímavý fenotyp, geny za něj zodpovědně se mohou snadno klonovat.

Pomocí hierarchického seskupování je možné snadno najít při druhém screeningu relevantní klon ve shluku (poolu). DNA inzert v tomto klonu se pak sekvencuje. Tento experiment tak poskytuje současně jako biochemické, tak i genetické informace.

Kmen divokého typu C. elegans se může kombinovat s různými sloučeninami pro screening fenotypů, rezistence k léčivům a vnímavosti k léčivům. Kmen C. elegans může být mutovaný kmen a screening může být na zlepšený fenotyp, redukovaný fenotyp nebo nový fenotyp. Kmen C. elegans může být mutovaný kmen a screening knihovny se může kombinovat se sloučeninami. Takže se může screenovat na rezistenci k léčivům, vnímavost k léčivům, zlepšený fenotyp, redukovaný fenotyp nebo nový fenotypů. Kmen E. coli může být jakýkoliv kmen exprimující T7 RNA polymerázu, např. kmen BL21 (DE3), ale tvorba dsRNA může být zvýšena užitím zvláštního kmenu E. coli, který je negativní na Rnázu III. Rnáz III rozpoznává specifickou kličku ve struktuře dsRNA. Může být také užit kmen E. coli, kde jsou odstraněny jiné Rnázy než Rnáza III nebo kmen E. coli, kde je odstraněna jedna nebo více Rnáz. Exprese T7 RNA polymerázy v nejznámějších kmenech E. coli a konstrukty, které jsou k dispozici pro vytvoření kmenů E. coli produkujících T7 RNA polymerázu, obecně obsahují indukovatelný promotor. Tímto způsobem je tvorba T7 RNA polymerázy regulována, a tudíž je regulována i produkce dsRNA. Výhodně je možné tuto vlastnost využít k pulznímu nakrmení hlístic C. elegans ve specifickém růstovém stadiu. Hlístice se pěstují na neindukovaných kmenem E. coli. Když dosáhnout požadovaného stadia, indukuje se v bakteriích tvorba T7 RNA. To dovoluje zkoumat funkce jakéhokoliv genu v libovolném okamžiku životního cyklu živočicha.

Prohledávání knihovny na existenci homologních nebo domněle zajímavých lidských genů a přiřazení funkce těmto genům

Stovky genů byly izolovány v různých projektech sekvencování genomů, expresních studiích, hybridizačních studiích apod. Popsaná cDNA knihovna poskytuje způsob, jak ověřit nebo vůbec přiřadit funkci těmto genům rychlým a účinným způsobem. Tak nejdříve je třeba pomocí bioinformatických nástrojů (in silico biologie) identifikovat homolog nebo homology genu v C. elegans. Připraví se PCR primery a pomocí PCR se pak izolují fragmenty DNA. PCR se může provádět po hierarchickém seskupení. Pozitivní shluk nebo jednotlivá jamka obsahující bakterie poskytující pozitivní signál se pak poskytne jako potrava C. elegans a vyhodnocuje se požadovaný fenotyp.

PCR se také může provádět na DNA izolované z C. elegans. Výsledná DNA se může klonovat do T7 vektoru a transformací vnést do kmenu E. coli produkujícího T7 RNA polymerázu, který je pak jako potrava poskytnut C. elegans. V závislosti na tom, co je nejrychlejší a spolehlivější se vybere vhodný způsob.

Pokud gen patří do genové rodiny, poskytne se směs bakterií jako potrava C. elegans. Každá z bakterií nese část člena genové rodiny, přitom kmeny E. coli, růstové podmínky, kombinace sloučenin jsou stejné, jak byly popsány výše.

-9CZ 304897 B6

Pokud se užije racionálně uspořádaná knihovna, kde jsou klonovány všechny geny C. elegans a organizovány strukturovaným způsobem, homology C. elegans a případně další homology, ortology a členy genové rodiny lze vystopovat snadno v této knihovně užitím přístupu biologie in silico. V takovém kroku se neužívá PCR a izolují se bakterie nebo přímo DNA, na kterých se pak pěstuje C. elegans.

Následující série experimentů byla provedena k otestování RNAi vektorů a různých kmenů

E. coli, které byly připraveny

1. Konstrukce testovacího plazmidu

Lze použít jakoukoliv cDNA, která poskytuje jasný fenotyp, když je vyřazena u C. elegans nebo použita při RNAi experimentu. Je známo, že např. unc-22 je dobrý kandidát, ale mnoho dalších genů je také vhodných. V tomto pokusu byl vybrán citlivý systém, který je možné užít ještě v pozdějších stadiích. Systém byl testován se sup-35 na pozadí pha-1. Exon 5 genu sup-35 byl izolován pomocí PCR a byl klonován do vektoru pGNl a promotorem T7. Výsledný vektor byl označen pGN2. Mutanta pha-1 (e2123) C. elegans netvoří potomstvo při teplotě vyšší než 25 °C, což je způsobeno vývojovou poruchou v embryogenezi. Když je vyřazen (systémem „knockout“) nebo inhibován gen sup-35 u tohoto kmenu, vytváří se potomstvo i v této teplotě. Kombinace mutanty pha-1 a sup-35 RNAi je tedy dobrý testovací systém.

2. Testování RNAi pomocí kmenu E. coli produkujícího dsRNA

- pGN2 byl vnesen do E. coli BL21 (DE3) a byla indukována T7 RNA polymeráza pomocí IPTG. Kmen C. elegans phal (e2123) byl inokulován na tyto bakterie a pěstován při teplotě 25 °C. Jelikož jde o mutantu s embryonální poruchou při této teplotě, nedochází ke vzniku potomstva. Když je gen sup-35 účinně inhibován dsRNA přítomnou v E. coli, potomstvo vzniká.

- pGN2 byl vnesen do E. coli kmenu AB301-105 (DE3) a byla indukována T7 RNA polymeráza pomocí IPTG. C. elegans kmen pha-1 (e2123) byl inokulován na tyto bakterie a pěstován při teplotě 25 °C. Jelikož jde o mutantu s embryonální poruchou při této teplotě, nedochází ke vzniku potomstva. Když je gen sup-35 účinně inhibován dsRNA přítomnou v E. coli, potomstvo vzniká.

3. Zlepšení kmenu C. elegans, aby lépe přijímal dsRNA

Před inokulaci C. elegans na bakterie E. coli, které produkují dvouřetězcovou sup-35 RNA, byla provedena mutageneze C. elegans pomocí EMS (ethylmethylsulfonová kyselina) a potomstvo takto mutovaných C. elegans bylo inokulováno na bakterie. C. elegans živené těmito bakteriemi poskytly větší potomstvo, které obsahovalo mutaci, vedoucí ke zlepšenému příjmu dsRNA, a které bylo vhodné pro použití v dalších experimentech.

Trvalá integrace vektoru produkujícího dsRNA do genomu C. elegans tvořící T7 RNA polymerázu.

Byl zkonstruován vektor pro E. coli nesoucí následující znaky: dva promotory T7 orientované proti sobě navzájem, a restrikční místo nebo vícečetné klonovací místo ležící mezi těmito promotory. Navíc tento vektor může obsahovat genomovou DNA sup35 z C. elegans upravenou tak, že obsahuje několik stop kodonů v různých intervalech, takže ze sup35 genomového fragmentu nemůže být tvořen protein plné délky, jakje znázorněno na obr. 8. Jakákoliv cDNA nebo fragment cDNA mohou být klonovány do vícečetného klonovacího místa mezi dva promotory T7. Když je tento vektor vnesen do kmenu C. elegans, kteiý exprimuje T7 RNA polymerázu, cDNA nebo její fragment se transkribuje a vytváří dsRNA.

Tento vektor je navržen pro použití smutantou C. elegans pha-1 (e2123), která exprimuje T7 RNA polymerázu. Exprese T7 RNA polymerázy může být konstitutivní, regulovaná, všeobecná

- 10CZ 304897 B6 nebo tkáňově specifická. Tyto mutanty C. elegans pha-1 (e2123) netvoří potomstvo při teplotě vyšší než 25 °C vzhledem k vývojovým problémům v embryogenezi. Když je gen sup-35 účinně inhibován nebo vyřazena jeho funkce („knock-out“), pak potomstvo vzniká.

Když se vektor vnese do C. elegans, integruje se homologní rekombinací (integrací Campbellova typu). Bylo prokázáno, že k homologní rekombinaci u C. elegans dochází, i když s nízkou frekvencí (Plasterk a Gronen, EMBO J. 11: 287-290, 1992). Homologní rekombinace v genu sup35 povede k vyřazení funkce genu, neboť dva vzniklé geny sup35 ponesou stopkodony. Výsledné organismy C. elegans a jejich potomstvo, pokud k této rekombinaci dojde ve vajíčku, budou mít kopii vektoru integrovanou ve svém genomu. Selekce se provádí tím, že pouze organismy s vyřazenou funkcí sup35 mají potomstvo při teplotě vyšší než 25 °C. Kromě toho výsledné C. elegans trvale produkují dsRNA z fragmentu DNA klonovaného mezi dva promotory T7. Tento kmen C. elegans lze považovat za transgenní kmen s redukovanou funkcí genu, jehož fragment byl klonován mezi dva promotory T7.

DNA lze přenést do C. elegans různými způsoby, včetně injekce, balistickou transformací, inkubací v roztoku DNA nebo podáváním bakterií v potravě. Také lze uvažovat o nových metodách, které zvyšují účinnost transformace.

Cílový kmen C. elegans může navíc obsahovat i další mutace kromě pha-1 mutace (e2123) a exprimovat i jiné geny než T7 RNA polymerázu.

Příklad B

Kvasinkový dvouhybridní vektor pro RNAi

Může být zkonstruován kvasinkový dvouhybridní RNAi vektor nesoucí dva promotory T7. Takové vektory jsou určeny pro replikaci jak v kvasinkách, tak v E. coli. Obecně cDNA knihovny pro kvasinkový dvouhybridní systém se připravují ve vektorech Gal4 nebo LexA. Knihovna se konstruuje ve vektoru, který má aktivační doménu jednoho z těchto genů. Může se zkonstruovat takový vektor, kterýje vhodný pro dvouhybridní screening a který také obsahuje dva promotory T7 orientované proti sobě s vícečetným klonovacím místem mezi nimi. Uspořádání sekvencí v plazmidu pak bude „kostra plazmidu, (Gal4-T7), MCS, T7, kostra“. cDNA knihovna C. elegans konstruovaná s tímto vektorem může být použita jako standardní kvasinková dvouhybridní knihovna v experimentu, jehož cílem je izolovat protein interagující s daným proteinem. Jakmile je jednou klon izolován, plazmid může být vnesen do buněk kmenu E. coli produkujícího T7 RNA polymerázu, a který tudíž bude produkovat dsRNA z klonovaného fragmentu. Bakterie produkující dsRNA se pak podá jako potrava C. elegans a vyhodnotí se výsledný fenotyp. Stejně jako v předchozích příkladech, tato ověřovací procedura pro nově izolovaný dvouhybridní kvasinkový klon je podstatně kratší než standardní postup, který vyžaduje PCR a/nebo klonovací kroky, experimenty s RNA a/nebo „knock-out“ experimenty. Ve většině případů jsou izolované klony nejdříve sekvencovány, a na základě sekvence se rozhodne, zda se bude pokračovat s dalšími experimenty. Každý klon izolovaný v popisovaném experimentu může být snadno vnesen do vhodných buněk E. coli a pak podán jako potrava C. elegans. Ověření se pak provede analýzou fenotypu.

Pro aplikaci tohoto postupu byl připraven kvasinkový dvouhybrid se známým genem jako „návnada“ a nově konstruovaná knihovna jako „cíl“. Proteiny kódované cílovými klony (tj. klony z knihovny), které interagují s návnadovým proteinem, vedly k pozitivním kvasinkovým klonům exprimujícím reportérovou molekulu, jako je např. LacZ pozorovatelná po obarvení X-gal. Plazmid kódující cílový protein je izolován přímo z kvasinkového kmenu a vnesen do E. coli. E. coli je přitom kmen E. coli produkující T7 RNA polymerázu. V takovém případě se pak z DNA klonované do klonovacího místa ve vektoru tvoří dsRNA. Pokud se tato dsRNA jako po-11 CZ 304897 B6 trava poskytne C. elegans způsobem popsaným výše, dojde k inhibici genu C. elegans a výsledkem je určitý fenotyp.

- Tento kvasinkový dvouhybridní vektor se může výhodně použít ke konstrukci uspořádané a hierarchicky seskupené knihovny, jak bylo popsáno v předchozím příkladu.

- Může být zkonstruován kvasinkový kmen, který podmíněně produkuje T7 RNA polymerázu. Po experimentech s kvasinkovým dvouhybridním systémem může být indukována exprese T7 RNA polymerázy, což vede k produkci dsRNA v kvasinkách. Následně pak lze podat kvasinky jako potravu pro C. elegans. Bylo prokázáno, že C. elegans se může živit kvasinkami.

Konstrukce kmenu produkujícího T7 RNA polymerázu a jeho aplikace

Může být připraven kmen C. elegans exprimující T7 RNA polymerázu. Exprese může být všeobecná a konstitutivní, ale také může být regulovaná tkáňově specifickým promotorem, indukovatelným promotorem nebo časově specifickým promotorem, a nebo promotorem, který nese jednu z těchto charakteristik anebo kombinuje více těchto charakteristik. DNA se vnese do kmen C. elegans. To se provede buďto injekcí, vstřelením mikročástic, elektroporaci nebo jak bylo popsáno výše zkrmením vhodných bakterií nebo kvasinek. Pokud je DNA plazmid, jaký byl popsán v předchozích příkladech, tj. plazmid nesoucí klonovaný fragment DNA nebo PCR fragment mezi dvěma promotory T7, pak se v buňce nebo celém organismu tvoří dsRNA z této DNA nebo PCR fragmentu, což vede k utlumení odpovídajícího genu. Vnesená DNA se může projevit dočasným utlumením genu. Vnesená DNA může vytvořit extrachromosomální strukturu, která může vést ke katalytickému vyřazení genu nebo redukci funkčního fenotypu. Plazmid se také může integrovat do genomu organismu, což vede ke stejnému vyřazení genu nebo redukci funkčního fenotypu, ale tyto změny jsou trvale přenosné.

- Plazmidová DNA nesoucí cDNA nebo její část nebo EST fragment nebo PCR fragment z C. elegans klonovaný mezi dva promotory T7, jak bylo popsáno v příkladech A a B, může být vnesena standardním způsobem do C. elegans bez T7 RNA polymerázy a pak se analyzují fenotypy.

- DNA z uspořádané nebo seskupené knihovny jako v příkladu A může být vnesena standardním způsobem (injekcí, vstřelením mikročástic) do C. elegans bez T7 RNA polymerázy a pak se analyzují fenotypy. S hiearchickým uspořádáním lze snadno najít původní klon.

- Stejný postup lze užít s mutantou C. elegans exprimující T7 RNA polymerázu. Pak se provádí screening na rozšířený, redukovaný nebo nový fenotyp.

- Postup lze užít k provádění screeningu sloučenin. Screening se provádí buďto s kmenem divokého typu, nebo s mutovaným kmenem na rozšířený nebo nový fenotyp.

- DNA lze vnést do C. elegans novým způsobem. Jedním z nich je vnesení prostřednictvím E. coli. V takovém případě je jako potrava pro C. elegans podána hierarchicky uspořádaná knihovna. Aby se zabránilo strávení E. coli DNA ve střevu hlístice, je výhodné užít kmen C. elegans deficitní na Dnázu, jako je např. kmen nuc-1 (el392). Tato metoda se jeví jako velmi zajímavá, neboť je nezávislá na transformační účinnosti jiných metod aje obecně rychlejší a méně pracná.

2) Předpokládané zlepšení metody

- Byl navržen vektor nesoucí cDNA sup-35 nebo její část, klonovanou mezi dva T7 promotory, přičemž zbytek vektoru je stejný, jak byl popsán v příkladech A a B. Tento vektor může být vnesen do mutanty C. elegans phalts. V takovém případě pak existuje teplotní selekční systém a jedině ty C. elegans, které přijaly cDNA a tudíž exprimují dsRNA sup35, přežívají za restriktivní teploty. Hierarchicky uspořádaná knihovna je vnesena kterýmkoliv z výše popsaných způsobů.

- 12CZ 304897 B6

- Vektor může být užit ke konstrukci knihovny, která je pak vnesena do E. coli exprimující T7 RNA polymerázu. V tomto případě jde o stejný screening jako v příkladu A s dodatečným screeningem na C. elegans, kde dsRNA sup-35 je aktivní.

- DNA a/nebo dsRNA sup-35 mohou být vneseny na různých plazmidech. Jak při krmení DNA (příklad C) tak i při krmení dsRNA (příklady A a B), tyto dva plazmidy jsou přítomny v jedné bakterii nebo se C. elegans krmí směsí bakterií, z nichž jedna nese konstrukt sup-35.

Příklad konstrukce C. elegans produkující T7 RNA polymerázu

Existuje několik možností přípravy T7 RNA polymerázy v C. elegans. T7 RNA polymeráza může být exprimována pomocí různých promotorů, ať už konstitutivních, indukovatelných, všeobecných, tkáňově specifických, nebo jejich kombinací. K příkladům takových promotorů patří promotor proteinu tepelného šoku hsp-16, střevní promotor gesl, promotor cet858, ale také promotor dpy7 a promotorový element GATA1. V tomto příkladu je T7 RNA polymeráza exprimována pod kontrolou promotoru hsp-16, který je dostupný ve vektoru pPD49.78. T7 polymeráza je izolována pomocí PCR užitím oligonukleotidových primerů GN3 a GN4.

Výsledný PCR produkt je štěpen restrikčními enzymy Nhel a Ncol stejně jako vektor, do kterého se má klonovat, což je vektor Fire pPD49.78. Vzniklý vektor je pGNIOO ilustrovaný na obr. 2. Sekvence primerů byly následující:

oGN3: CAT GGC AGG ATG AAC ACG ATT AAC ATC GC, oGN4: ATG GCC CCA TGG TTA CGG GAA CGC GAA GTC CG.

Vektor byl vnesen do C. elegans standardním postupem, tj. mikroinjekcí.

Takto byly připraveny následující kmeny:

- divoký typ (pGNIOO)

-nuc-1 (el392) (pGNIOO)

-pha-1 (e2123) (pGNIOO)

- pha-1, nuc-1 (pGNIOO)

Všechny tyto kmeny jsou schopny produkovat T7 RNA polymerázou po teplotní indukci nebo alternativně po indukci těžkými kovy jako např. po aplikaci těžkého kadmia nebo rtuti. Procedura teplotní indukce je jednoduše přenesení C. elegans do teploty 30 až 33 °C alespoň na 1 hodinu a pak zpět do standardní teploty (15 až 25 °C).

Kmen divokého typu produkující T7 RNA polymerázu může být použit k produkci jakékoliv RNA v C. elegans. Konkrétně řečeno, plazmidy z výše popsaných knihoven se vnesou do C. elegans a pak se vyhodnotí fenotypy.

Mutanta nuc-1 C. elegans se užívá tak, že se DNA vnáší prostřednictvím bakterií, které jsou potravou pro C. elegans. Jelikož mutanta nuc-1 neštěpí DNA, plazmid může projít střevní stěnou. Pokud se dostane do buněk, které tvoří T7 RNA polymerázu, produkuje se dsRNA, která inhibuje gen, z něhož je RNA transkribována.

Mutantní kmen pha-1 C. elegans, který tvoří T7 RNA polymerázu, může být použit ke zlepšení postupů popsaných výše. DNA může být vnesena vstřelením, injekcí nebo podáním v potravě. Konkrétně se tento kmen užívá s vektory, které tvoří dsRNA z genu sup-35 a požadovaného genu, kterým je PCR produkt, cDNA nebo knihovna, jak byla výše popsána.

- 13CZ 304897 B6

Mutanta pha-l,nuc-l produkující T7 RNA polymerázu se užívá pro vnášení DNA prostřednictvím bakterií. DNA je výhodně plazmid, který produkuje dsRNA ze sup-35 a požadovaného genu. Tento kmen tvoří T7 RNA polymerázu především v trávicím traktu. K přenosu DNA výhodně dochází, když se C. elegans podává jako potrava bakterie nesoucí uvedený plazmid. Aplikace RNAi technologie na rostlinách

Hlístice (nematoda) zodpovídají za značnou část škod na rostlinách a zejména na zemědělských plodinách. Postupy RNAi technologie podle vynálezu mohou být využity na rostlinách, aby se zabránilo poškozování rostlin parazitickými hlísticemi. V prvním kroku se z hlístice parazitující na rostlině izoluje fragment DNA, který je kritický pro přežití nebo růst červa nebo pro jeho výživu, či proliferaci. Jakýkoliv gen, jehož exprese je esenciální, je vhodný pro tento účel.

Část tohoto genu, exon nebo cDNA se klonují. Fragment DNA se klonuje tak, aby byl řízen tkáňově specifickým promotorem, výhodně kořenově specifickým promotorem. Klonovaná DNA řízená kořenově specifickým promotorem se pak vnese do požadované rostliny, a sice postupy technologie transgenních rostlin. Pro každou parazitickou hlístici se může užít jiný úsek DNA a podobně pro každý druh rostliny je potřebný jiný promotor.

Kořen rostliny pak produkuje RNA nebo dsRNA z vneseného klonovaného úseku DNA, pokud byl užit kořenově specifický promotor. Jelikož hlístice parazituje na rostlině, RNA nebo dsRNA je spolknuta a/nebo strávena hlístici. RNA nebo dsRNA se pak dostane do buněk hlístice, kde zahájí své inhibiční působení na cílové DNA. V závislosti na povaze klonovaného úseku DNA z hlístice, hlístice buď není schopna přežití, výživy, množení atd., což zabrání dalšímu parazitování hlístice na rostlině a ochrání rostlinu.

Konstrukce C. elegans produkující T7 RNA polymerázu

Aby bylo dosaženo produkce T7 RNA polymerázy nebo jiné RNA polymerázy u živočicha, případně hlístice, a konkrétně C. elegans, je možné zvolit několik přístupů. T7 RNA polymeráza může být exprimována pomocí různých promotorů. K takovým promotorům patří indukovatelné promotory, konstitutivní, všeobecné a tkáňově specifické promotory nebo jejich kombinace.

Příklad 1

Konstrukce základního vektoru pro expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans

Kódující sekvence T7 RNA polymerázy byla amplifikována pomocí PCR z ÁCE6 (Novagen, Madison, USA) užitím oligonukleotidových primerů:

oGN25 (ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) a oGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) standardním postupem PCR (viz „PCR, A Practical Approach, Ed. J. McPherson et al., IRL Press, 1993). Výsledný fragment DNA kódující T7 RNA polymerázu byl štěpen restrikčními enzymy Agel a EcoRI a vložen do vektoru Fire pPD97.82 naštěpeného před tím také Agel a EcoRI. Výsledný konstrukt kódoval otevřený čtecí rámec pro T7 RNA polymerázu fúzovaný s jaderným lokalizačním signálem (NLS) velkého T antigenů SV40 s aminokyselinovou sekvencí MTAPKKKRKVPV. Sekvence jaderného lokalizačního signálu je potřebná pro přemístění T7 RNA polymerázy z cytoplazmy do jádra, kde je pak schopna vázat se na svůj specifický promotor, tj. T7 promotor. Směrem „upstream“ (proti směru transkripce) od kódující sekvence fuzního proteinu T7 polymerázy leží minimální promotor (myo-2), před kterým je ještě vícečetné klono- 14CZ 304897 B6 vací místo (MCS), do kterého lze vložit promotory pro C. elegans. Tento plazmid (pGN105 uvedený na obr. 11) je základní plazmid s T7 RNA polymerázou, který umožňuje expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans. Různé deriváty tohoto plazmidu, kde do vícečetného klonovacího místa jsou vloženy promotoiy, dovolují indukovatelnou, konstitutivní, všeobecnou nebo tkáňově specifickou expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans, neboť exprese je pak regulována promotorem klonovaným do vícečetného klonovacího místa.

Následující promotory jsou známy tím, že indukují expresi v uvedených tkáních (přičemž tento výčet rozsah předkládaného vynálezu nijak neomezuje):

let—858 (všudypřítomná exprese), myo-2 (exprese v hltanu), myo-3 (exprese ve svalovině tělní stěny), egl-17 (exprese v hltanu), myo-3 (exprese ve svalovině tělní stěny), egl-15 (exprese v děložním svalu) a unc-119 (ve všech neuronech).

Příklad 2

Konstrukce vektoru pro expresi T7 RNA polymerázy ve svalové tkáni C. elegans

Kódující sekvence T7 RNA polymerázy byla amplifikována pomocí PCR z XCE6 užitím oligonukleotidových primerů:

oGN43 (GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC) a oGN44 (CACTAGTGGGCCCTTACGCGAACGCGAAGTCCG) a pak naštěpen restriktázami Agel/Spel a vložena do vektoru pGK13 předem naštěpeného také Agel/Spel. Tento vektor obsahuje silný promotor SERCA, který řídí expresi v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny. Jaderný lokalizační signál (NLS) z velkého T antigenů SV40 byl vložen před kódující sekvenci T7 RNA polymerázy vložením dvou překrývajících se oligonukleotidů:

oGN45 (CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT) a oGN46 (CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC) do restrikčních míst Sacl/Agel. Výsledný konstrukt byl označen pGN108 a je uveden na obr. 10. Vnesení tohoto plazmidu do C. elegans vedlo k expresi T7 RNA polymerázy v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny.

Pro otestování exprese a funkčnosti T7 RNA polymerázy v C. elegans řízené promotorem SERCA, byl plazmid pGN108 kódující T7 RNA polymerázu pod kontrolou SERCA promotoru injikován do C. elegans. Současně byl injikován testovací vektor. Tento testovací vektor kódoval GFP řízenou T7 promotorem (vektor pGN401 na obr. 13). Plazmid pGN401 byl zkonstruován vložením dvou překrývajících se oligonukleotidů:

oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) a oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) do vektoru Fire pPD97.82 naštěpeného Sacl/Agel, čímž se vytvořil T7 promotor. Dále byl současně vnesen selekční markér pro selekci transformant (rol6, pRF4). Tento selekční vektor je odborníkům dobře znám. Transgenní rostliny generace Fl pak mohou být snadno selektovány, neboť projevují fenotyp rol6. Transgenní C. elegans exprimují GFP v hltanu, děložním svalu, ocasu a svalovině tělní stěny. Tyto údaje jasně ukázaly, že T7 RNA polymeráza byla funkčně exprimována z promotoru SERCA a že exprimovaná T7 RNA polymeráza se vázala na T7 promotor přítomný ve vektoru pGN401 a iniciovala tak transkripci genu GFP, který byl funkčně

-15 CZ 304897 B6 exprimován, což vedlo k fluorescenci na svalové tkáni, kde promotor SERCA indukoval expresi T7 RNA polymerázy.

Příklad 3

Konstrukce vektoru pro všudypřítomnou expresi T7 RNA polymerázy v C. elegans

Fúzní gen NLS-T7 RNA polymeráza byl izolován zpGN108 vyštěpením XmaI/Bspl201 a klonován do vektoru Fire pPD103.05 naštěpeného také XmaI/Bspl201. Tím byl připraven vektor, kde T7 RNA polymeráza byla klonována tak, že její exprese je řízena promotorem let858. Tento specifický promotor umožňuje expresi T7 RNA polymerázy ve všech tkáních. Výsledný plazmid byl pojmenován pGNl 10 (je uveden na obr. 14).

Příklad 4

Konstrukce vektoru pro expresi DNA fragmentů, genů a cDNA řízenou T7 promotorem a zprostředkovanou T7 RNA polymerázou

Vektor Fire pPD97.82 byl štěpen restriktázami Sacl/Agel a sekvence T7 promotoru byla vytvořena vložením překrývajících se oligonukleotidů:

oGN41 (CCCGGGATTAATACGACTCACTATA) a oGN42 (CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT) do restrikčního místa Sacl/Agel. Konstrukt (pGN400 na obr. 12) obsahuje otevřený čtecí rámec pro GFP klonovaný mezi restrikční místa Sací a EcoRI, řízený promotorem T7. Do místa vzniklého vyjmutím genu GFP jakožto Agel/SacI fragment lze klonovat do vektoru jakýkoliv požadovaný fragment DNA nebo cDNA. Výhodně je požadovaný fragment DNA připraven pomocí amplifikace v PCR, kdy jsou místa Sacl/Afel vložena do oligonukleotidových primerů. Fragment po PCR je naštěpen a gen GFP zpGN400 je nahrazen amplifikovaným fragmentem. Jakýkoliv vektor, který obsahuje T7 promotor, může být použit pro expresi indukovanou T7 RNA polymerázou v C. elegans, např. komerčně dostupné vektoiy pGEM a pBluescript. To bylo demonstrováno pomocí vektoru pGN401, který vedl k expresi GFP pod kontrolou T7 promotoru v transgenní C. elegans exprimující T7 RNA polymerázu.

Použití vektoru pGN400 mělo tu výhodu, že vektor obsahuje 3'UTR fragment (netranslatovaný fragment 3'-konce) z unc-54, který zvyšuje transkripční stabilitu RNA.

Příprava permanentní tkáňově specifické „pseudo knock-out“ RNAi linie C. elegans.

V současnosti se linie s vyřazenou funkcí genu, tzv. knock-out u C. elegans získávají po náhodné mutagenezi ve velkém rozsahu a následnou selekcí pomocí PCR. Tato metoda je velmi rozsáhlá, časově náročná a zdlouhavá. Bylo popsáno, že vnesení dvouřetězcové RNA do buňky vede k silnému a specifickému narušení exprese endogenního genu. U C. elegans může být exprese potlačena injekcí RNA do tělní dutiny, nebo inkubací C. elegans v roztoku obsahujícím dsRNA nebo tak, že se jako potrava pro C. elegans podává E. coli exprimující dsRNA odpovídající požadované DNA. Buňky C. elegans mají schopnost přijímat dsRNA z extracelulámího prostředí. Bylo popsáno, že mRNA je cílem tohoto genetického zásahu, zprostředkovaného dsRNA (Montgomery a Fire, 1998). Bylo také navrženo, že cílové RNA je degradována v jádru ještě před tím, než dojde k translaci. Ačkoliv snížení genové exprese zprostředkované RNAi se může přenášet na následující generace, dědičnost je špatná a účinek se rychle ztrácí v průběhu dalších generací. To je způsobeno pravděpodobně postupným snižováním zásoby dsRNA. V popisovaném experi-16CZ 304897 B6 mentu je navržena metoda, jak zkonstruovat linii C. elegans s permanentním dědičným RNAi fenotypem. Tato metoda obsahuje vytvoření transgenní linie C. elegans vnesením plazmidů obsahujících fragmenty cDNA cílového genu v sense a antisense orientaci pod kontrolou promotoru C. elegans nebo transkripční invertované repetice cDNA z jediného konstruktu. Alternativně je dsRNA transkribována z vektoru nesoucího cDNA obklopenou dvěma T7 promotory v kmenu C. elegans, který exprimuje T7 polymerázu. Výsledkem je transgenní C. elegans se stálým dědičným „pseudo knock-out“ fenotypem. Exprese cDNA nebo T7 RNA polymerázy může být všeobecná a konstitutivní nebo může být regulovaná tkáňově specifickým promotorem. Proti RNAi indukované externí dsRNA (vnesené injekcí, inkubací v roztoku nebo potravou) tato metoda umožňuje získat podmíněnou, tkáňově specifickou inhibici genové exprese.

Inhibice exprese unc-22 pomocí RNA vede ke „škubajícímu“ („twitching“) fenotypu

Ucn22 cDNA (exon 22) byla klonována v sense a antisense orientací do vektoru pPD103.05 (A.Fire č. L2865) obsahujícího promotor let858, který je schopen exprimovat sekvence RNA ve všech tkáních. Výsledné plazmidy byly označeny pGN205 (viz obr. 19a) a pGN207 (viz obr. 19b). Tyto konstrukty byly vneseny do C. elegans společně se selektivním markérem (rol6,GFP). Transgenní jedinci generace Fl (exprimující rol-6 nebo GFP) projevovali „škubající“ („twitching“) fenotyp, což ukazuje, že RNAi může být zprostředkována endogenní transkripcí RNA z transgenní DNA. Fenotyp RNAi kosegregoval se selekčním markérem v dalších generacích. Tak byla vytvořena linie C. elegans s permanentním RNAi fenotypem.

Příprava stabilní linie s T7 RNA polymerázou a dvojitě transgenní C. elegans

Expresní systém v C. elegans založený na exogenní RNA polymeráze vyžaduje dva plazmidy. Jeden kóduje RNA polymerázu pod kontrolou specifického promotoru, zatímco druhý kóduje fragment DNA, který má být exprimován, pod kontrolou T7 promotoru. V případě semistabilní RNAi nazývané také „pseudostabilní knock-out“ je požadovaná DNA klonována mezi dva T7 promotory, takže je pak produkována dsRNA.

Jelikož expresní systém T7 RNA polymerázy je znám tím, že jde o systémem s vysokou expresí, vznikající problémy při vytváření dvojitě transgenních organismů. Když je gen, který má být exprimován v hlístici C. elegans toxický, má letální účinek a důsledkem je konstrukce C. elegans bez vysoce regulované stabilní exprese požadovaného genu. Pokud je požadovaný gen esenciální pro přežití organismu, RNAi s fragmentem DNA z tohoto genu vede také k letálnímu účinku, takže pseudostabilní knock-out není možný.

K překonání uvedeného problému původci předkládaného vynálezu navrhli systém sestávající ze dvou transgenních organismů. První organismus je transgenní na T7 RNA polymerázu, přičemž tato T7 RNA polymeráza může být exprimována ve všech buňkách nebo jen ve specifických buňkách nebo tkáních, jak bylo ukázáno v předchozích příkladech. Druhý transgenní organismus je transgenní na požadovaný fragment DNA. To může být cDNA spojená s T7 promotorem, nebo pokud je cílem provedení RNAi, pak DNA fragment příslušného genu klonovaný mezi dva T7 promotory.

Oba dva transgenní organismy byly životaschopné a neprojevovaly žádné aberantní fenotypy. A to proto, že T7 RNA polymeráza exprimovaná v prvním organismu není toxická pro tento organismus, dokonce ani tehdy, je-li exprimována ve vysoké hladině. V druhém transgenním organismu požadovaný gen není exprimován nebo dsRNA není produkována, jelikož tento organismus neobsahuje T7 polymerázu.

Exprese požadovaného genu nebo cDNA nebo RNAi s fragmentem DNA může pak být dosaženo spářením dvou transgenních organismů. Takové potomstvo je pak dvojitě transgenní a exprimuje požadovaný gen nebo exprimuje dsRNA z fragmentu požadované DNA.

-17 CZ 304897 B6

Pro vytvoření dostatečného počtu samců pro takové páření, jeden z transgenních organismů je samčí mutanta C. elegans s fenotypem upřednostňujícím vznik samců. Příkladem takové mutanty je mutanty him-5. Výhodně je tato mutanta užita k přípravě transgenní C. elegans sT7 RNA polymerázou, zatímco hermafroditní C. elegans nese DNA fragment kontrolovaný T7 promotorem.

Pro účinnou selekci dvojitě transgenního potomstva může být do druhého organismu vnesen druhý transgen. Tento transgen obsahuje reportérový gen pod kontrolou T7 promotoru. Reportérovým genem může být GFP, luciferáza, β-galaktozidáza nebo β-laktamáza. Příkladem takových transgenů jsou vektory pGN400 a pGN401.

Pro získání indukovatelné, tkáňové specifické exprese transgenů v C. elegans byla připravena zásoba samců (tj. him-5) nesoucích konstrukt T7 RNA polymerázy pod kontrolou různých promotorů C. elegans, které umožňují tkáňově specifickou expresi. Tito samci pak byli pářeni s hermafrodity nesoucími požadovaný gen pod kontrolou T7 promotoru.

Dále mohou být transgeny integrovány do genomu organismu. V odborné literatuře byly popsány metody pro dosažení stabilní integrace plazmidu do genomu (Methods in Cell Biology, Vol. 48, 1995, ed. Epstein a Shake, Academie Press) a jejich součástí je ozařování organismů. Tak lze ošetřit oba typy organismů, ale výhodně se ošetřují organismy exprimující T7 RNA polymerázu. Tím se připraví kolekce hlístic C. elegans, které trvale exprimují T7 RNA polymerázu pod kontrolou různých promotorů. K příkladům takových promotorů patří myo-2 (exprese v hltanu), myo-3 (exprese ve svalovině tělní stěny), egl-15 (exprese v děložním svalu), unc-119 (ve všech neuronech), let—858 (všechny buňky) a ges-1 (střevo).

Konstrukce kvasinkového dvouhybridního vektoru s promotorem T7 pro RNAi pGAD424 s přímým a zpětným promotorem T7/T3 a/nebo Sp6

Ve většině dvouhybridních experimentů je cDNA knihovna klonována do plazmidu pGAD424 (viz obr. 16), který byl opatřen dalšími restrikčními místy ve vícečetném klonovacím místě (polylinkeru) jako je např. Ncol (Clontech). Tato knihovna pak umožňuje screening vazebných proteinů v kvasinkovém dvouhybridním experimentu. Byl zkonstruován nový kvasinkový dvouhybridní vektor se stejnými možnostmi pro provádění dvouhybridního experimentu, který navíc obsahuje dva dodatečné T7 promotory, takže tento vektor může být použit pro pseudostabilní knock-out indukovaný T7 RNA polymerázou. Pro tento účel byl vložen přímý T7 promotor pomocí T7-linkeru (obsahujícího následující oligonukleotidové primery:

aattcttaatacgactcactatagggcc a catgggccctatagtgagtcgtattaag) do místa EcoRI-NcoI v pGAD424. Výsledný vektor byl označen pGAD424-without-FULLICE-both-T7. Pečlivě byly eliminovány stop kodony a byly užity maximálně kompatibilní aminokyseliny. Stejná strategie byla použita pro zpětný T7 (sestávající ze dvou oligonukleotidových primerů:

gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcaa gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) s místem BamHI a Pstl. Aby se zabránilo ztrátě míst Sáli, bylo toto místo vloženo do primeru.

Místo Sáli je důležité, neboť většina knihoven se klonuje právě do tohoto místa a adaptery jsou dostupné. To činí nově zkonstruovaný vektor kompatibilním s již existujícími vektory.

-18CZ 304897 B6 pAS2 s přímým a zpětným promotorem T7/T3 a/nebo Sp6

Analogický kvasinkový dvouhybridní vektor byl zkonstruován na základě pAS2 (Clontech). Parciálním štěpením EcoRV bylo možné odstranit značnou část genu cyh2. Správný konstrukt byl izolován a ověřen restrikčním štěpením BglII. Toto restrikční místo je přítomno ve fragmentu EcoRV, který bylo třeba z pAS2 eliminovat. Tím byl odstraněn gen cyh2, který je slabě toxický a podílí se na růstové retardaci. Tento gen není esenciální k provádění RNAi a kvasinkového dvouhybridního experimentu. Po eliminaci EcoRV fragmentu se restrikční místo EcoRI lokalizované mezi DNA sekvencí kódující GAL4DB a HA (epitop) stalo jedinečným místem v plazmidů a lze ho užít k substituci HA linkerem obsahujícím T7 promotor. Tím je zajištěno setrvání všech restrikčních míst, dovolujících klonování ve shodě se čtecím rámcem a kompatibilitu s předchozími vektory a pGAD424. Byl použit linker (oligonukleotidové primery:

gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcacatgggccctatagtgagtcgtattaag a gtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg) s místy BamHI a Pstl. Aby se zabránilo ztrátě místa Sáli, bylo vloženo do primeru. Výsledný vektor byl nazván „pAS2-cyh2-HA+both T7-fmal“.

Přítomnost T7 promotoru (nebo alternativního T3 nebo SP6 promotoru) v pGAD424 dovoluje rychlý přechod od interagujícího proteinu kRNAi a přiřazení funkce izolovanému fragmentu DNA. Další výhodou je schopnost dosáhnout in vitro transkripce svázané s in vitro translací (ATG je v souhlasném čtecím rámci jak s GAL4DB tak i GAL4AD) značeného proteinu, který může být užit pro in vitro kontroly (např. testy „pull-down“) interakcí protein-protein.

Sekvence plazmidů a polymerázy T3 a SP6 jsou uvedeny v následujícím seznamu sekvencí.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob vnesení dvouřetězcové RNA nebo DNA schopné produkovat dvouřetězcovou RNA do organizmu odlišného od člověka provedený za neterapeutickým účelem, vyznačený tím, že obsahuje krmení uvedeného organizmu bakteriální nebo kvasinkovou buňkou obsahující expresní vektor obsahující dva promotory orientované vzhledem k sekvenci DNA tak, že jsou po navázání vhodného transkripěního faktoru na uvedené promotory schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že uvedený expresní vektor obsahuje dva identické promotory lemující sekvenci DNA.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že uvedený expresní vektor dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selekční markér.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že uvedená nukleotidová sekvence kódující uvedený selekční markér je orientovaná vzhledem k promotorům tak, že k transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA dojde po navázání vhodného transkripěního faktoru na uvedené promotory.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že uvedená nukleotidová sekvence kódující selekční markér leží mezi dvěma identickými promotory schopnými iniciovat transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripěního faktoru na promotory.
6. 6. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačený tím, že uvedený selekční markér obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující sup-35 pro vnesení do C. elegans s mutací pha-1.
7. 7. Způsob podle některého z nároků laž6, vyznačený tím, že uvedená bakteriální nebo kvasinková buňka nebo organizmus odlišný od člověka je adaptován tak, že exprimuje uvedený transkripění faktor.
8. 8. Způsob podle některého z nároků laž 7, vyznačený tím, že uvedeným organizmem odlišným od člověka je C. elegans a uvedenou bakteriální buňkou je E. coli.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že uvedeným kmenem E. coli je kmen negativní na RNAzu III.
10. 10. Způsob podle některého z nároků laž 9, vyznačený tím, že organizmem je mutanta C. elegans nuc-1.
11. 11. Neterapeutické použití bakteriální nebo kvasinkové buňky obsahující expresní vektor obsahující dva promotory orientované vzhledem k sekvenci DNA tak, že jsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání příslušného transkripěního faktoru na uvedené promotory, k produkci dvouřetězcové RNA v organizmu odlišném od člověka krmením organizmu odlišného od člověka bakteriální nebo kvasinkovou buňkou.
12. 12. Použití podle nároku 11, při kterém expresní vektor obsahuje dva identické promotory lemující sekvenci DNA tak, že jsou schopné iniciovat transkripci uvedené sekvence DNA na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripěního faktoru na uvedené promotory.

    -38CZ 304897 B6
13. 13. Použití podle nároku 12, při kterém expresní vektor dále obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující selekční markér.
14. 14. Použití podle nároku 13, při kterém uvedená nukleotidová sekvence kódující uvedený selekční markér je orientována vzhledem k promotorům tak, že po navázání vhodného transkripčního faktoru na uvedené promotory dojde k transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA.
15. 15. Použití podle nároku 14, při kterém uvedená nukleotidová sekvence kódující selekční markér leží mezi identickými promotory schopnými iniciovat transkripci nukleotidové sekvence na dvouřetězcovou RNA po navázání vhodného transkripěního faktoru na promotory.
16. 16. Použití podle nároku 13 nebo 14, při kterém uvedený selekční markér obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující sup-35 pro vnesení do C. elegans s mutací pha-1.
17. 17. Použití podle nároku 11, při kterém expresním vektorem je plazmid obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou na obr. 1.
18. 18. Použití podle nároku 11, při kterém expresním vektorem je kvasinkový dvouhybridní vektor zobrazený na obr. 4.
19. 19. Použití podle nároku 18, při kterém exon 5 genu sup-35 byl klonován v plazmidu.
20. 20. Použití podle nároku 11, při kterém expresním vektorem plazmid obsahující (a) dva promotory T7 vedené jeden ke druhému, (b) restrikční místo nebo vícečetné klonovací místo mezi oběma promotory a (c) genomovou DNA C. elegans sup-35 mezi oběma promotory upravenou tak, že obsahuje několik stopujících kodonů k zabránění expresi celé délky proteinu sup-35.