DD298949A5 - Alpha-amylase-codierende dna-sequenzen von dicotyledonen pflanzen, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer verwendung - Google Patents

Abstract

Beschrieben werden DNA-Fragmente, die eine Kartoffel-a-Amylase codieren. Diese Fragmente enthalten eine wie in den Figuren 1 bis 5 angegebene Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon. Ferner werden DNA-Fragmente beschrieben, die ein anti-sense-mRNA-Molekuel codieren, das mit einer von einem DNA-Fragment der Figuren 1 bis 4 transkribierten mRNA hybridisieren kann. Ferner werden in einem Wirtsorganismus, z. B. einer Pflanze, insbesondere einer Kartoffelpflanze, replizierbare Vektoren beschrieben, die eines der genannten DNA-Fragmente enthalten, sowie Mikroorganismen, die eines der beschriebenen DNA-Fragmente enthalten. Darueber hinaus werden genetische Konstrukte beschrieben, die eines der vorstehend genannten DNA-Fragmente enthalten, sowie die Verwendung solcher Konstrukte zur Herstellung genetisch modifizierter Pflanzen. Schlieszlich werden genetisch modifizierte Pflanzen beschrieben, die eine erhoehte oder verminderte a-Amylase-Aktivitaet gegenueber den entsprechenden nicht-modifizierten Pflanzen aufweisen, oder eine regulierbare, z. B. bei niederen Temperaturen, a-Amylase-Aktivitaet haben.{a-Amylase-Gen; a-Amylase; dicotyledone Pflanze; genetisch modifizierte Pflanze; Kartoffel; Herstellung von Kartoffelchips; Herstellung von Spirituosen; reduzierender Zucker; DNA-Rekombinations-Technik; Nachweis von a-Amylase-Genen}

Description

Anwendungsgebiet dor Erfindung

Dio Anwondung dor Erfindung orfolgt auf dom Gobiot dor Horstollung gonotisch modifiziorto: Pflanzun mit gowünschton Stoffwochsoloigonschafton.

Charakteristik dos bekannten S' andos der Technik

In don lotzton Jahron wurden intonsivo Forschungsarboiton übor Pflnnzengono und cloron Regulation botricbon. Pflanzongononio sind komplex und onthalten oino großo Anzahl von Chromosomen. Dios macht dio Aufklärung von Gonon und insbosondom deron Regulation sehr schwierig. Außordom worden violo Pflnnzongono zu vorschiodonon Zoitpunkton in dor Entwicklung dor Pflanzo oxprimiort, wodurch dio Difforonziorung der Pflanzonzollon gowa'htInistot wird.

a-Amylaso, dio in der Stäikohydrolyso mitwirkt, gibt os in allen Pflnnzon. Übor α-Amylaso in moiiocotylodonon Pflanzen, wio Gorsto und Weizen, wurden ausgiobigo Forschungsarboiton geleistet und dio a-Aniylaso-Gone dieser monocotylodonon Pflanzen wurdon isoliort. Es wurden auch Forschungsarbeiten übor dio ci-Amylaso aus dicotylcdonon Pdanzon durchgeführt, bisher jedoch lediglich auf enzymatischem Niveau. Es war bisher nämlich nicht möglich, a-Ainylaso-Geno aus dicotylocionen Pflanzen zu isolioron odor zu charakterisieren.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung stellt DNA-Fragmonto bereit, die dio α-Amylaso von dicotyledonon Pflanzen codioron. Außordom stellt dio Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser DNA-Fragmente sowie von Toilsoquonzen und Analoga davon boroit. Ferner stellt dio Erfindung mit den genannten DNA-Fragmonton genetisch modifizierte Pflanzen mit gowünschton Stoffwechseleigonschnften und Vorfal iron zur Herstellung cursor Pflanzon boroit.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, u-Amylaso-codierendo DNA-Fragmünte, Teiiscquenzcn und Analoga davon bereitzustellen, die die Horstollung von gonotisch modifizierten Pflanzen mit gowünschton Stoffwechseleigenschaftcn gostatton, aufgrund derer diese Pflanzen gewünschte vorteilhafte Eigenschafton für dio Horstollung von Pflanzcnproduktcn und gewünschte vorteilhafte Eigenschaften für dio Bereitstellung von Ptlanzonzüchtungsmaterial aufweisen.

Die erfindungsgemäßen DNA-Fragnvjnte und Varianten davon, z.B. ein α-Amylaso codierender Teil, der in den Figuren 1 bis 5 angegebenen Nucleotid-Sequenz sowie Teilsequcnzen und Analoga davon bilden die Grundlage für Strategiun zur Herstellung transgenor Pflanzen bei dor unterschiedliche wesentliche Eigenschafton von Pflanzen, z.B. dor Gattung Solanum tuberosum, modifiziert werden können. Dazu gehört die planmäßige Verminderung dor α-Amylase-Akiivitat, um das Risiko von Maillard-Roaktionen und von Gcschmacksmodifikationon/beeinträchtigungen, z.B. bei dor Herstellung von Kartoffelchips zu vermeiden, oder die planmäßige Erhöhung der a-Amylase-Aktivität in Kartoffeln, die für die Fermentation bei der Herstellung von alkoholischen Getränken (Spirituosen) verwondot worden.

Diese Strategion sowie andere wirtschaftlich interessante Strategien zur Herstellung transgenor Pflanzen, bei denen die Eigenschaften von Pflanzon modifiziert werden, worden durch die vorliegende Erfindung ermöglicht und nachstehend genauer beschrieben.

Kartoffeln werden neben ihrer sehr wichtigen Verwendung für den direkten Verbrauch für viele unterschiedliche industrielle Zwecke verwendet, /v^;e als Rohmaterial bei der Herstellung von Kartoffelchips und bei der Horstollung von Alkohol. Bei beiden Herstellungen ist der Abbau der Stärke in den Kartoffeln wichtig. Wie nachstehend beschrieben wird, ist die beim Stärkeabbau mitwirkende α-Amylaso somit ein wichtiges Enzym.

Bei der Herstellung von Kartoffelchips ist der Abbau von Stärke zu reduzierenden Zuckern kritisch. Ein großer Teil dos Stärkeabbaus, bei dem sich ein hoher Gehalt an reduzierenden Zuckern ergibt, bereitet ein Problem, da reduzierende Zucker sogenannten Maillard-Reaktionen während dos Bratens von Kartoffeln in Pflanzenöl unterworfen worden. Dadurch erhnlten die Chips eine uogewünschte braune Färbung und einen unangenehmen, verbrannten Geschmack. Dies wird von unerwünschten Änderungen in Geschmack und Textur der Kartoffelchips begleitet.

Andererseits ist ein hoher Gehalt reduzierender Zucker als Ergebnis einei ' -hon a-Aiiylase-Aktivität wünschenswert, wenn die Kartoffeln zur Herstelung von Alkohol verwendet werden sollen.

Zur Erläuterung wird anschließend eine kurze Diskussion der Verwendung von Kartoffeln zur Herstellung von Chips bzw. Alkohol gegeben:

Die Herstellung von Kartoffelchips beginnt mit dem Schälen der Kartoffeln in speziellen Schälmaschinen. Sodann werden die Kartoffeln sortiert, wobei ungeeignete Kartoffeln entfernt werden, beispielsweise grüne Knollen oder Kartoffoln, die beim Ernten beschädigt wurdon. Die Kartoffeln werden sodann mit Schneidmaschinen in Scheiben geeigneter Dicke, üblicherweise etwa 1,5mm, zerschnitten. Dio in Scheiben geschnittenen Kartoffeln worden anschließend gewaschen und getrocknet. Sodann werden die Kartoffelscheiben in eine großo Bratvorrichtung überführt, die üblicherweise ein Fassungsvermögen von etwa 2000kg Kartoffelchips pro Stunde hat. Nach dem Braten in heißem Pflanzenöl in dor Bratvorrichtung wrden die

Kartoffolschoibon als fortigo Kartelfolchips orhnlton und sind fortig für dio Verpackung. Wio vorstohond orwithnt, orfolgon boim Dralon unorwünschto Maillard-Ronktionon, vvonn roduziornndo Zuckor In (lon Knrtoffolschoibon onthalton sind. Zur Horstolluno von Alkohol aus Kortoffon boginnt das Vorfahron mit dom Kochon dor gowaschonon Kartoffeln. Dns Kochon golntinisiort dio Stärko. Dio Kartoffeln wordon üblichorwoiso in olnom Autoklaven boi oinor Tomporotur von otwa 150⁰C odor in einem kontinuierlichen Vorfahren gokocht. Während dos Erwärmons bis zum Kochon ist oino thormolabilo a-Amylaso, mit der dio Kartoffolmosso vorsotzt wurdo, vnrantwortlich für oino ηnfangliche Saccharifiziorung, boi dor oino boginnondo Umwandlung von Stärko zu reduziorandnn Muckern orfolgt. Nach dom Kochon wird dio golatinisiorto Stärko durch dio Einwirkung von Gn/ymen saccharifiziort. Dadurch wird t'or Viskosobroi verflüssigt und dio Stärko in formontiorbaro Vorbindungon, wio Glukoso, umgowondolt. Der Brei wird vor» otwa 1üO°C auf etwa 3OX vor dor Zugabo dor Enzymo abgokühlt. Dio Enzymo sind üblicliorw» <so ontwodor aus grünom Malz odor trookonom Malz (ookoimtor Gorsto), oxtrohiorto Enzymo odor ζ. B. baktoriollo α-Amyloso odor Aniyloglucosidaso von Pilzon. Nach dor Saccharifiziorung wird dor Broi mit Hcfo vorsotzt, und dio F !rmontiorung dor formontiorbaron Zuckor zu Alkohol und Kohlendioxid orfolgt während einos Zoitraumos von 2-3 Tagen. Sodann wird dor Alkohol aus dom Broi durch kontinuierliche Destillation ontfornt. Daboi wird Rohalkohol mit otwa 9 j Vol.-% orhnlton, dor durch Roktifiziorung woitorgoroinigt wordon kann.

Stärko oxistiort in zwei unterschiedlichen Formen, Amylose und Amylopectin. Amyloso ist dio unvorzwoigto Form dor Stärko und bostoht aus D-Glucoso-Einhoiton, dio über a-1,4-Bindungon vorbunden sind. Amylopectin ist oino vorzwoigto Form dor Stärko, dio D-Glucoso-Einhoiton onthält, dio übor a-1 ,G-Oindungon sowio über a-1,4-Bindungon vorbundon sind, woboi das Verhältnis zwischen a-1,6- unda-1,4-Bindung indor Größenordnung von otwa 1 bis 30 liogt. Es wird angonommon, daß dio verzweigten Amylopectino otwa 2000 bis etwa 200000 Glucosooinhoiton onthalton, doron unvorzwoigto Amyloso-Molokülo nur oin paar tausorul Glucoso-Ein'ioiton onthalton.

Sowohl Amylopectin und Amylose werdon durch a-Amylaso hydrolysiert. Daboi word'jr» die intornon a-1,4-Bindungon hydrolysiert und es werdon orhalton Ma toso (bostohond aus zwei Glucoso-Einhoiton), Maltotriose (bostohond aus droi Glucose-Einhuiton) und a-Doxtrin (bostohond aus mohroron Glucoso-Einhoiton, onthaltond oino a-1,6-Bindung und a-1,4-Bindung). AIIo Produkte dora-Amylaso-Hydrolyso, d.h. Maltose, Maltotrioso und a-Doxtrin, worden durch dio Einwirkung anderer Enzymo zu Glucoso üborführt. Eine andoro Amylaso-Form, dio ß-Amylaso, wird z.B. in Malz gofundon. Sio hydrolysiert Stärko zu Maltose Stärko kann außerdem durch das Enzym Stärkophosphorylaso hydrolysiert wordon. Es wird jedoch anyonommen, daß lediglich a-Amylaso zur Hydrolyso intakter Stärkomolokülo fähig ist, während ß-Amylaso und Starkophosphorylaso lodiglich auf die Produkte der a-Amylaso-Hydrolyso einwirken könnon. Wahrend somit a-Amylaso dio internen a-1,4-Bindungon hydrolysiert, arboitot ß-Amylase lodiglich an Roston dor nicht-reduziorondon Enden. a-Amylaso ist somit oin notwendiges Enzym boi der Hydrolyso von Stärko und der Umwandlung von Stärko zu z. B. Glucosu und Fructose Nährstoffe worden in Pflanzon in Form von Stärko gespeichert, dio ggf. in Zuckor als Energiequelle für das Pflanzenwachstum üborführt wird. Kartoffelknollen sind stärkoroich, woboi die Stärko nach dom Koini und, wie nachstehend boschrieben, boi der Lagerung bei verhältnismäßig niedrigen Temperaturen in Zucker überfüh-t wird.

Es ist allgemein bekannt, daß oin Teil der Stärko golagortor Kartoffoln wJhrond dor Lagerung dor Kartoffeln zu Glucoso hydrolysiert wird und daß dio Glucoso teilweise zu Fructoso umgowantiolt wird. Das Verhältnis der Hydrolyso von Stärke zu den roduziorondon Zuckern Glucoso und Fructoso stoigt mit sinkenden Temperaturen. Daher habon Kartoffoln, dio oino Zeit lang bei oinor Temperatur von weniger als otwa 7 bis 8⁰C gelagert wurden, üblichorwoiso verhältnismäßig höhere Zuckergohalte, während Kartoffeln, die bei oinor Tomperatu" von etwa 8X oder mohr gelagert wurden, einen verhältnismäßig niedrigeren Zuckergehalt haben. Dies mag darauf hinweisen, daß das Problem oinos verhältnismäßig höhoron Gehalts reduzierender Zuckor in Kartoffoln für dio Herstellung von Kartoffelchips durch oino Lagerung der Kartoffeln bei otwa 8°C oder mehr golöst worden könnte. Dies ist jedoch keine idoalo Lösung, da die Kartoffeln in einem nicht tolerierbaren Verhältnis bei solch verhältnismäßig hohen Temperaturen zu keimen beginnen. Zwar läßt sich das Keimen durch das Besprühen der Kartoffel mit Antikeimmittcln verhindern oder beschränken, jod-ich ist dies aus der Sicht des Verbrauchers nicht wünschenswert. Es wäre vorteilhaft, die Zuckermenge in Kartoffoln einer bestimmton Kartoffolsorte vermindern zu können. Somit wäre die Verminderung dos Zuckergohalts vorteilhaft fur Kartoffeln, dio z. B. zur Herstellung von Kartoffelchips vcrwendot wordon. Es ist jedoch bisher nicht möglich gewesen, cino zufriedenstellende Regulierung dos Zuckergehalts von Kartoffeln durch die bekannten Pflanzonzüchtungsmothoden zu orzielen.

Erfindungsgemäß wird nunmehr dio Möglichkeit zur Steuerung der a-Amylaso-Aktivität durch Strategion zur Herstellung transgenor Pflanzen ermöglicht. Dieser und weitere Aspekte dor Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Kurze Beschreibung der Figuren Dio Figuron zeigen:

Fig. 1: Die Nucleotidsequenz der Kartoffel-α- Amylase-Mossongor-RNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Kartoffela-Amylaso-Vorläuforproteins. Dio Figur zeigt die Sequenz des Messenger-RNA-ähnlichen Stranges der kombinierten Insertionon der Kartoffel-a-Amylaso-cDNA-Clono AmyZ3 und AmyZ4 ohne dio terminalen EcoRI-Rostriktionsschnitts'.ellen. AmyZ3 und AmyZ4 haben in den überlappenden Bereichen identische Nucleotidsoquenzen (vgl. Fig. 11), mit der Ausnahme, daß AmyZ3 eine Intronsoquenz von 128 Nucleotiden, dio in der Figur (Nucleotide 296 bis 423, einschließlich) hat. Die Consonsus-5'- und 3'-Nuclootide an den Exon-Intron-Gronzon, GT und AG, sind in der Figur jeweils doppelt unterstrichen. Ein Consensus-Verzweigungspunkt (Nucleotide 390 bis 396) ist eingerahmt. Die Nucleotidsequonz dos 5'-Signalpoptids bis zum Nucleotid 540 enthält vier offono Loserastor, dio im Detail in Fig. 17 dargestellt sind. Dio für das a-Amylaso-Vorläuforprotein codieronde Region beginnt mit Nuclootid 541 und endet mit Nucleotid 1761; dio Länge dos a-Amylase-Vorläuferprotoins beträgt 407 Aminosäuren. In dor Figur ist die abgeleitete Aminosäuresequenz unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes für Aminosäuren dargestellt. Die wahrscheinliche Prozessierungsstello des Vorläuferproteins ist durch oinen Pfeil dargestellt. Die 3'-nicht-translatierte Region ist wenigstens 200 Nucleotide lang, don Poly(A)-Schwanz nicht eingeschlossen, aber wahrscheinlich nicht viel länger, da das wahrscheinliche Poly(A)-Signal 30 Nucleotide vom Ende entfernt gefunden wird; das Poly(A)-Signal ist in der Figur unterstrichen.

Fig. 2: Die Nucleotidsequenz der Kartoffel-a-Amylase-Messenger-RNA und die abgeleitete Aminosäuresequenz dos Kartoffel· a-Amylase-Vorläuforproteins. Die Figur zeigt die Sequenz dos Mossenger-RNA-ähnlichen Stranges dor Insertion des Kartoffel-a-Amylase-cDNA-Clons AmyZ7 ohno dio terminalen EcoRI-Restriktionsschnittstollen. Dio Nucleotidsoquenz

codiert für oino a-Amylaso-Vorläuforprotoin (boi Aminosliuro Nr. 2 boi)innoml), und dio So(|uonz onthttlt (Ins G-Nuclootid (Nr. 1 in dor Fiyur) dos Initiationscodons ATU. D.i4 oAmylnsoLosorostor ondot mit Position 1219, und dio Lrtnyo dos a-Amylaso-Vorlftuforprotoins bolrf rjt 407 Aminosäuren, das Initiationscodon eingeschlossen. Dio waluschoinliclio Prozosniorungsstollo dos Vorläuforprotoins ist durch oinon Ploil dargostollt. Dio Sequenz ondot mit oinor 187 Nuclootido langen 3'-nicht-translntiotton Rogion, gofolgl von oinoni noun Nuclootido Ipiignn Poly(A)-Schwanz.

Fig. 3: Dio partielle Nucloolidsaquonzdor Kartoffol-a-Amylaso-Mossonyor-RNAuiiddid ahyolcitoto Aminositurcsoquonz von oineni Toil dos Kartoffol-a- Amylaso-Vorläuforprotoins. Dio Figur zeigt dio Scquonz dos Mossongor-RNA-ithnlichon Stranges dor Irisortion dos Koftoffol-a-Amylaso-cDNA-Clor.j AmyZ1 ohno dio toiniinnlon EcoRI-Rostriklionsschnittstcllon. Das olfono losorastrr für dioson Toil dor a-Amylnso boginnt mil Nuclootid β und ondot mit Nuclootid 1052 und dio orsto Aminosäuro läßt sich nuf Aminosäure G9 dor in Fig. 1 gozoigton Soquonz ausrichton . Clon AmyZI enthält ilnlior koino Nuc'ootido, dio für das Signalpoptid codioren. Es fohlon somit etwa 50 Codons vom N-Torminus dor roifon a-Amylaso. Oio Soquonz ondot mit oinor 163 Nuclootido Innyoii 3'-nicht-translntio(ton Region.

Fig.4: Dio partielle Nuclootidsoquonz dos Km toffola-Amylaso-Mossonyor-RNA und dio ahgoloitoloAminor.niirosoquonzoinos Toils einos Knitofful-a-Amylaso-Vorlauforprotoin. Dio Figur zoigt dio Soquonz dos Mossongor-RNAiihnlichon Strangos dor Insortion dos Kartoffol-a-Amylaso-cDNA-Clons AmyZG ohno dio torminnlon EcoRI-Rostriktionsschniltstollon. Dos offono Losorastor für dioson Toil doi α Amylaso boginnt mit Nuclootid 3 und ondot mit Nuclootid 647. Dio orsto Aminosäure läßt sich auf Aminosäure 133 dor in Fig.1 gozoigton Soquinz ausrichton. Dio r.oquonz ondot mit oinor 3GO Nuclootido langon 3-nichttrnnsliUiorton Rogion.

Fig. 5: Dio p.irtiollo Nuclootidsoquonz oinor Psoudo-Kartoffol-a-Amyloso-Massongor-RNA und dio abgeloitoto Aminosäurosoquonz dor a-Amylaso. Dio hior gozoigto Soquonz trägt im Vorgloich zum (imktionollon Gon zwoi Dolotionon. Die Figur zeigt dio Soquonz dos Mossongor-RNA-ähnlichon Strangos der Insortion dos Kortoffol-a-Amylasoc-ÜNA-Clons AmyZ2 ohno dio torminalon EcoRI-Rostriktionsschnittstollon.

Fig. 6: Einen schomatischon Querschnitt durch dio Kortoffol, woboi dio Gowobo, aus denen dio in Ueispiol 1 bosclw ioboncn Probon ontnommon wurden, dnrgostollt sind. A: Koim ohno Olättor oder Wurzeln; ti: Verbindung zwischen Koim und Knollo; C; Stranggowobo dor Knollo; D: Paronchym-Gowebo.

Fig. 7: Dio Struktur und das Subcloniorungsvorfahron dos Gorsto-a-Amylaso-cDNA-Clons |)M/C. Plasmid 036 war dor von J. C. Rogers mit dor Information orhaltono Clon, daß dios oin BamHI-Mindlll-Subclon von pM/C (JDC (1985), Od. 260, S.3731) ist. Die vollständige) Soquonz war jedoch nicht publiziort, und dor kurzo unbekannte üoroich ist durch oinon Storn gekennzeichnet. Das gokennzoichnoto Hinf-Fragmont aus Plasmid 036 wurde in pßS-subcloniort und orgab das hone Kopionzahlon orgobondo Plasmid pBS036. Diesos wurdo in don in Fig.4 gozoigton Experimontcn analysiort und diente als Quölle der Hybridisiorungs-Sondo, dio aus dom, am unteren Endo dor Figur gokonnzeichnoton Sacl-Iragment bostoht. Einzelno Linien stollen Voktor-Soquonzen und nichtcodiorondo Gorsto-Soquonzcn, doppolto Linien dio für Gorsto-a-Amylasi: codiorondo Rogion dar.

Fig.8: Dio Hybridisierung von Gerstoa-AmylasocDNA-Fragmonton mit radioaktiv markiortor cDNA aus Kartoffel (Dianolla)· Koimen. Rostriktionsfragmonto aus Gorsto-a-Amylaso-cDNA-Clonen und Kontrollplasmido wurdon zweifach auf 2% Agarosogol aufgetronnt, und dio Ethidiumbromid-gofärbton Fragmonto sind in Abschnitt B dargestellt. Dio Fragmente wurdon auf Nitrocellulosefilter transferiert, und ein Filter wurdo mit 5 χ 10'cpm radioaktiv markiortor cDNA, die aus von Dianolla-Koimonisoliortor PoIy(A)-RNA synthotisiert worden war, hybridisiert (Abschnitt A). Der andoro Filter wurdo mit 4 χ lO'cpm radioaktiv markiortor cDNA, die aus Poly(A)-reichor RNA aus Gerstenblättern hergestellt worden war, hybridisiort. Beide Filtor wurden unter Bedingungen niodrigor Stringcnz hybridisiert (Hybridisierung bei 07⁰C in 6 x SSC, Waschvorgängo boi 67⁰C in 4 χ SSC). Oie Abschnitte A und B zoigon Autoradiogrammo dir Filter. Die folgenden Plasmid-DNAs wurdon auf die verschiedenen Spuron (2 (ig pro Spur) aufgetragen: Spur 1: pBR327,mitEcoRI und Pstl gospalton (setzt ein 723 bp-Fragmcnt froi, das als negative Kontrollo dient); Spur 2: pKG3730, mit Pstl gcspalton (sotzt oin für Gcrsto-Ubiquitin codierendes 78GI>p-Fragmont frei. Ubiquitin-Geno sind stark konserviert und treten in allen Eurokaryonton auf (17)-das Fragmont client als positivo Kontrollo); Spur 3: pBSO36, mit Sacl gespalten (setzt das nachfolgend als Sonde verwendeto 800bp-Fragmont froi); Spur 4: pBR327 mit BstNI gespalten (Größenmarker: 1855bp, 928bpund475bp); Spur 5: Plasmid-pBSO50, mit Pstl gospalton (sotzt ein für Gersto-a-Amyla.o-TypAcodiorendos cDNA-Fragmentfroi); Spur 6: Plasmid 036, gospalton mit BamHI und Hindlll (setzt das aus pM/C subclonierte Fragmont frei, siehe Fig. 3). Dio starken Banden in Abschnitten A und B beruhen auf nicht erklärton, nicht näher charakterisierten Hybridisierungon mit dor unbekannten Region der Plasmido036und pBS036, in Fig.3 mit Siorncn gekonnzeichnet. Dio schwächeren, i'nch Droiecke gekennzeichneten Banden stellen die spezifischen Hybi Jisicrungen der für Gerste-a-Amylaso codierenden Regionen dar; a-Amylase-Mcssenger-RNA ist bislang nicht in Gerstenblattgowebo nachgewiesen worden. Spur 2 in Abschnitt A zoigt, daß Kartoffel-Messcngor-RNA, wie erwartet, Ubiquitin codierende Sequenzen enthält.

Fig.9: Die Analysen der wahrscheinlichen Kartoffela-Amylaso-cDNA-Clono. Plasmid-DNA von sechs der acht gereinigten Plasmide aus der Kartoffel-cDNA-Genbank wurdo mit EcoRI gespalten, auf einem 2% Ayarosegel fraktioniert und mit Ethiumdiumbromid gefärbt (schwarze Spuren). Die Fragmente wurden auf oinon Nitroccllulosefilter transferiert, und der Filter wurde unter Bedingungen niodrigor Stringenz (Hybridisierung bei 67⁰C in 6 χ SSC, Waschvorgänge boi 67^rC in 4 χ SSC) mit der nicktranslatiorten Gerste-a-Amylase-Sacl-Sonde hybridisiert. Die woißen Spuren zeigen die resultierenden Autoradiogramme und dio hybridisierenden EcoRI-Fragmonte im Original-Autoradiogramm sind mit Pfeilen bezeichnet. Die vollständigen, den Plasmiden gegebenen Namen sind AmyZ2 etc. M1 und M2 sind Größenmarker; M1 ist pPR327, mit BstNI gespalten (1855bp, 928bp und 475bp), M2 ist pBR327, mit Hinfl gospalton (1631 bp, 517 bp, 452bp, 298bp und 154bp). Abschnitt C zoigt die homologe, im selben Experiment durchgeführte Hybridisiorung von mit Sacl gespaltenem pBS036 mit dor Sacl-Sondo.

Fig. 10: Dio EcoRI-Rostriktionskarten von Kartoffel-a-Amylaso-cDNA-Clonon. Alle Rostriktionskartcn sind nach dor Bostimmung der DNA-Sequenzen verfeinert worden. In den Restriktionskarten der Clone sind lediglich die EcoRI-Restriktionsschnittstellen dargestellt. Die terminalen EcoRIRostriktionsschnittstellen befinden sich im EcoRI-Linker, mit don die Insertionen in die EcoRI-Restriktionsschnittstelle im Vektor, pBlueScript SK-, eingefügt wurde. Dio Sequenzen dor Insoriionun von AmyZ5,7 und 8 sind vollständig identisch. Die mit der Gerste-a-Amylaso-Sondo hybridisierenden Fragmente sind durch eino besonders dünne Linio gekennzeichnet. In Fig.9 hybridisierten schwache, 285 Basenpaare lango Banden in den Spuron Z5 und Z7, und die kryptische EcoRI-Restriktionsschnittstelle, aufgi und derer diese Banden

(HillMielion, ist in Klammern dnrgnstollt. Dio ciiigokroiston Znhlon mn oboron Endo dor lijur konnzoichnon dio in Soulli in· und Northorn-Hybfidisiori.in(ion(Fig.19bzw. Fig. 21) vo'wondoton EcoRI-Fragmonto. Clou AmyZ2onthält (ils Ergebnis oins nonunion Cloniorungs-Arlufncls οίηοιι Strang V)n .'6 nicht stabilen T-Roston.

l^:ig. 11: Dio Soquon. . rungsstrntogio (Or dio lnsortionon dor Plnsmido AmyZ3 und AmyZ4 und dio zusamm.infossondo Rostriktionsknrto fur AmyZ3/4. Dio Pfeile zolgon dio Richtung und Lilngo dor in don oinzolnon Soquonziorungsnnalyson orhaltonon Soquonzen. Dio Abkürzung tür dio Spnltungsstollon dor Hostfiktionsoitjynio sind E - - EcoRI, M - Hindill, Ha --- llnolll, X - Xholl. Oborhnlb dor Rostriktionsknrto ist dio Logo dos ollcnon Losornstors für (lon ci-Amylaso-Vorläiifor oingornhmt dnrgoGtollt. Dio gostricholton Zoilon bozoichnon dio Signnlpoptido und die woißon Toilo (Ins rrifo üAmyliiso-Protein. Ir· dor kombiniorlon HcsUiklionsknrlo ous AmyZ3 und AnIyZ¹I ist dio Lo(|o dor offonon Losornotor in dor 'j Signalpopticlsoquonz dargostolll; gonnuoro Einzolhoiton sind in Fig. 17 dargpstollt.

Fig. 12: Oio Soquriuitv^nyaitratogio für dio lnsortionon dor Plasmido AmyZ¹ und AmyZO. Dio Pfoilozoigoii dio Richtung und I jingo dor in dun oinzolnon Soquonziorungsannlyson orhaltoncn Soquoiuon. Dio Abkürzung für dio Spaltungsstollon dor RostriktionsonzymosiiKlE - EcoRI, H " Hindill, B - DnniHI, Bg " DgIII, Ha · · Hnolll, T " Taql. Oborhnlbdor Rostriktionsk iito ist dio Lngo dos offonon Losorastors für ci-Amylnso oingurnhmt dnrgosiolli.

Fig. 13: Dio Soquonziorungsstrntogii für dio lnsortionon dor Plasmido AmyZ2 und AmyZ/. Dio Pfoilo zoigon dio Dichtung und Liingo doi in (lon oinzolnon Soquonziorungsanalyson orhaltonon Soquonzon. Dio Insertion in Plnsmid AmyZ2 hat als Rosultflt oinos h.iulig auftrotondonCloniorungs-Artofacts auf dor 5'-Soito oinon Strang von 7GT-RoStCn. In für dio Soquonzbo.stimmung vorwondoton Subclonon wurdo oin Toil dor T-Rosto dolotiort, und dieser Votgang ist durch den Pfoildnrgostollt. Dio Abkürzung für dio Spaltungsstollon dor Rostriktionsonzymo sind Al - AIuI₁E EcoRI, H - Hiiullll, Dg " DgIII. Oborhalb dor Rostriktiunskarto ist dio Lngo dos offonon Losorastors für dio u-Amylnso e ingoi ahmt dorgcstollt.

Fig. II: Dio Nuclootidsoquonzhomologiozwischon doncodiorondon So(|uonzonnus Kartoffel-und Gnrsto-a-Ainylaso. Diese Figur zeigt in dor oboron Roiho dio Soquonz dos FcoRI-Fr;igmonts ous ArnyZ<1, das mit der Gorsto-Sacl-Sondo (Fig. 3), wie in Fig. 5 dargostollt, hybridisiert. Dio Knitoffolsoquonz ist dom ontsprochondon Dorcich in der Sacl-Sondo gogonühorgostollHU - Uraoil ersetzt T, wonn dio Soquonz als RNA goschriobon v\ ird). DiuOosamthomologiozwischon (lon Soquonzon botrrtgt 63,b% (nichtkomplomontiiro Nuclootido sind in dio Gosamtlängo oingoschlosson). Ein üoroich von 1Ί6 Nuclooticlon mit oinor Homologie von 73%istoingorahmt, und darin ist oin kleiner, Ί6 NuclcoticJo m't80% Homologie umfessondor Rahmon dargostollt.

Fig. 15: Dio Homologie zwischen dor Kartoffol-AmyZ3-<1-a-Amylasu und dor Gorsto-a-Amylaso. Dio Figur zoigt dio Aminosäure dos roifon Kartoffol-a-Amyliiso-Enzyms in dor oboren Roiho (aus Fig. 1) und das roifo, aus dor pM/C-Soquonz abgeleitete Gorsto-Amylaso B-Enzym in dor untoron Roiho (2Ί). Idontischo Aminosäuren sind durch einen Strich und konsorviotto Aminosäuron durch zwoi Punkto dargostollt. Lücken wurdon oing sfügt, um dio Ähnlichkeit auf ein Höchstmaß zu bringen. Dor Prozentsatz identischer Aminosäuren beträgt 45,6% (nicht übereinstimmende Aminosäuren sind in der Gosamtlängo oingoschlossen).

Fig. 16: Dio Homologie zwischon Kartoffol-AmyZ1-a-Amylaso und Gorsto-a-Amylaso. Dio Figur zeigt in der unteren Roiho dio partielle Aminosäuresequenz dos roifon Kartoffol-ci-Amylaso-Enzyms (von Fig. 3) und in der oberen Roiho das reife, durch pM/C codiorto Gorsto-Amylaso-B-Enzym (2Ί). Idontischo Aminosäuren sind durch zwei Punkto und konservierte Aminosäuren durch oinon Punkt dargostollt. Eine Lücko wurdo eingefügt, um dio Ähnlichkeit auf oin Höchstmaß zu bringen. Dor Prozentsatz identischer Aminosäuren beträgt 64,1% (dio nicht üboreinstimmendo Aminosäure ist in der Gosnmtlängo oingoschlossen).

Fig. 17: Don offonon Losorastor am 5'-Endo der AmyZ3-Soquonz. Dor Umfang dor offonon Losoraster ist oben, dio Aminosäuresequenzen sind unten dargestellt. Dio Lago des Introns in AmyZ3 ist ebenfalls dargostollt.

Fig. 18: Das HydrophilitätsprofildosKartoffel-a-Amylaso-Vorläufnrproteins. Dio Aminosäuresequenz ist in Fig. 1 dargestellt, und die Anal/si Λ/urJe nach dem Verfahron von Hopp und Woods (25) durchgeführt. Ein Teil des Diagramms ist erweitert, um den kurzen hydrophoben Boreich dos Signalpeptids zu veranschaulichen. In der untorcn Darstellung sind die zum hyclrophobon Bereich boitragondon Aminosäuren durch kloino Kroiso und dio wahrschoinlicho Prozessierungsstollo durch einen Pfeil dargostollt.

Fig. 19: Southorn-Hybridisiorungon von gonomischor DNA aus Kartoffeln mit Kartoffol-a-Amylaso-Sondon. Saturna-DNA wurdo mit Restriktionsonzymon gespalten und auf einem 0,8% Agarosegel aufgotrennt, die DNA-Fragmonto auf Nitrocellulosofilter transferiert und die Filter unter Bo/Iingungon mittlerer Stringcnz mit nicktranslatierten EcoRI-Fragmonton aus AmyZ3 hybridisiert. Dio Figur zeigt dio rosultierondon Autorndiogrammo. Spuren 1 und 2 enthalten mit Hindill gespaltene DNA, Spur 3 enthält mit BamHI gospaltono DNA und Spuren 4 und 5 enthalten mit EcoRI

gospaltene DNA. Spur 6 zeigt oino kürzero Belichtungszeit von Spur 3. Dio in der Mitte befindlichen Suren 2, 3 und 4 wurden mit den nicktranslatiorten EcoRI-Fragmonton Nr. 2,3 und 4 aus AmyZ3 hybridisiert, und Spuron 1 und 5 wurden mit dom nicktranslatierten EcoRI-Fragment Nr. 1 hybridisiert (Fig. 10). Dio Zahlen auf der linken Seito bezeichnen in Kbp den Größenmarkor. Diesor besteht aus mit Ethidiumbromid gofärbton Hindlll-Fragmonten von lambda-Phagon-DNA.

Fig. 20: Southorn-Hybridisiorungon zweier Kartoffelsorton mit ci-Amylaso-Sondon dos AmyZ3/4- und dos AmyZI-Typs. Das verwendete Verfahren ist in Fig. 19 boschrieben worden. Das auf dor linkon Seito befindliche Autoradiogramm zeigt die Hybridisierung der vollständigen a-Amylase-lnsortion aus Plasmid AmyZ3 mit gonomischor DNA aus den Kartoffelsorten Saturna und Dianella. Das Autoradiogramm auf der rechten Soito zoigt die Hybridisiorung der vollständigen a-Amylaso-lnsortion aus Plasmid AmyZ6 mit genomischor DNA der Kartoffolsorton Saturna und Dianella. Die Abkürzungen für dio Rostriktionsenzymnamen sind: H = Hindlll, B = BamHI, E = EcoRI. Die Zahlen in der Mitte bezeichnen den Ethidiumbromid-gofärbton Größenmarkor (Hindlll-Fragmonte von lambda-Phagon-DNA) in Kbp.

Fig. 21: Northern-Hybridisierung von Kartoffel-RNA. RNA aus Keimen und Knollen aus den Sorten Saturna und Dianolla wurdo nach Denaturierung auf Agarosegelen aufgetrennt und die ebenfalls Kartoffel-RNA enthaltenden Kontrollspuren wurden mit Methylen-Blau gefärbt, um dio ribosomalen RNAs sichtbar zu machon. Die Endpunkte ihrer Wanderung sind durch dünne Pfeile dargostollt, der obore Pfeil zeigt dio 26S-RNA (etwa 4400 Nucleotide) und der untere Pfeil zeigt dio 18S-RNA (ungefähr 1850 Nucleotide). Die RNA in den übricion Spuren wurdo auf Nitrocellulose transferiert, die Filter mit spezifischen Kartoffel-a-Amylase-Sonden hybridisiert und anschließend autoradiographiort. Keim-RNA aus Saturna wurde mit dem nicktranslatiorten EcoRI-Fragment Nr. 1 aus AnyZ3 !Fig. 10) hybridisiert, die drei andoron RNAs wurden mit dem nicktranslatierten EcoRI-Fragmont Nr. 2,3 und 4 aus An-yZ3 hybridisiert. Dio Dianella-Koim-RNA war die für dio Konstruktion der cDNA-Genbank verwendete Poly(A)-roicho Fraktion, wohingogen dio anderen droi Spuren Gosamt·

UNA onlliioltoii. Dio dickon l'loüo bozoichnon <lio Position von im Originnl^Autormliogrnmm sichtbaren u-Aniylnsospezifischem Unnduii.

Fig. 22; Dio roduii irondon Zuckormongon in golngorton Knrtoffoln. Dio Mongon ηι> (ilucoso und f-'rtirtoso (dio phosplr'fvliorio.i Forriion oingoschhmon)vvurdon zur Zoit dor Ernto undwAhromi dor nnchfolgnndon lnii(|on l.<igorunu tail boi I C in vior Knrtoffolsorton bestimmt. Dio Figur zoigt dio Sunmio dor Glucose- und Frucloso-Mongon, dio lusnnunon dio rodu/iorondon Zucker darstellen.

Fig 23: Οίο roduziorondon Zuckormongon bol vorecliiodonon Lngorungetomporoturon. Dio Mongon nn Glucoso und Fiuctoso (dio phosphoryliorton Formen oingosch! mc.i) wurden li\ vlor Kortoffolsorton, dio 19 Wochon bol 8'C, 19 Wochon tmi 6^fC und 6 Wochon boi A'C golagort worden wiron, boslimml. DIo Prohon wurden nus nllon Knrtoffoln nm snlbon I inj hergestellt. Dio Figur zoigt dio Summo dor Glucose· und Fr.ictoso-Mongon, dio .'usnmmon dio roduziorondon Zurkor darslollon.

Fig. 24: Dio a-Amylaso-Mongon in golngorton Kortoffoln. Dio u-Amylnso-AklivitÄt wurdo im SnIt von vior Knrtoffolsorton, die fur jo 19 Wochon boi 8'C und boi OC golngorl worden wnron, bostimmt (Mothndo 2). Dia Figur zeigt dio boi (lon boidon Tomporaturon erhnllonon Durchschnitlsworlo als oino Funktion (lot Mongo nn reduzierenden Zuckern nnch 19 Wochnn Lngorung boi 8'C.

Dotallllorto Boschrolbun_to dor Erfindung

In oinor orston Ausfiihrungsform botrifft dio Erfindung oin DNA-Frngmont, das im wesentlichen cino Nuclcotidsoquonz dor Figuron 1 bis 5 odor oino Toilsoquonz odor oin Analogon dnvon orhält. Οίο in Figur 1 gozeigto Nuclcotidsciiuonz wurdo Huf Gruiullngo von zwoi Kartoffolo-AmylnaocDNA-Clonon durch Hybridisieren mit oinom Oorstoo-Ainylnso-Gon gomaß Boispiol 5 und nnschlioßondor Soquonziorung (Ooispiol O) orhalton. Oio cDNACIono wurden nu9 oinor cONAGonb.ink oihnlton, dio wio in Boinpiel A beschrieben, aus oinor polyA-roichon Knrtoffol-HNA konstruiort wurdo. Dio Knrtoffol, nus dor dio MNA isoliort wurdo, wnr oino Knrtoffol dor Sorto Dinnolln. Dio in (lon Figuron 1 und Ί nngogobonon Nuclootid-Soquonzon codioron cino Form dor Knrtoffol-a-Amyloso, und dio in (lon Figuron 3 und Ί nngcgobonon Nucleotid-SoquonzoM codioron oinon Toil oinor zwoitcn '"omi dor α-Amylnso. Dio ontsrfochondon Aiiinosüurd-noqiionzon worden obonfnlls in don Figuron 1 bis <1 nngogobon. AIIo viir a-Amylaso-Aminosiluron-Soquonzon troton nur einmal auf. Figur 5 zoigt dio Nuclootid-So(|uonz oinor don in don Figuron 1 und 2 nrujogcbonon Soquonzon ähnlichen pmliollon Kartoffol-a-Amylnso-cDNA, dio das Produkt eines Psoudogons ist, das korn (lAmylnso-Protoin codiort.

In oinor nndoron Ausführungsform botrifft dio Erfindung oin α Amylnso-Gon, das oin im wosontlu hon in don Figuron ¹ is G gozoigtos ONA-Frngniont odor oino Toilsoquonz oder oin Annlogon dnvon enthält. Oor Ocgriff „Gen" wird für dio Be/oichnung oinor DNA-Soquonz vorwondot, dio boi dor Horstollunn, oinor Polypoptidkotto mitwirkt und dom codiorondon Qoroi. h vorausgohondo und nachfolgondo Ooroicho (Signnlpoptid- und η ichfolgondo Soquonzcn) sowio inturvcniorondo Sequenzen, sogonannto Introns, onthiilt, dio sich zwischon (lon oinz Inu.i codiorondon Scgmonton (sogenannten flxons) odor im Signnlpoptid- odor nachfolgenden Boroich bofindon. Dor Si-jnalpoptid-Bcrcich woist oino rcgulatoriscl'.e Scquonz auf, dio dio Expression dos Gens auf dom Nivonu dor Transkription und dor Translation stouort. Dio rogulntorischo Sequenz ist üblicherweise oin Promotor. Dor nnchfolgordo Boroich enthalt Soquonzon, dio boi dor Termination dor Transkription dos Gons mitwirkon und (j(jf. Scquonzcn, dio für die Polyadcnylicrung des Transkripts und dos S'-nicht-translnticrton Borcichs verantwortlich sind. Dor Bogriff ,.Teilsequenz" wird für oino Nucleotidsequonz < orworu'ot, dio von oinom orfindungsgcmüßcn ONA-Frugmont oder Gen abgeleitet ist und cino charnktoristischo Nuclootid-Sequonz di> /on aufwoist. Üblichorwoiso ist dio Teilsequenz oin Teil einer in (lon Figuron 1 bis 5 angogobonon Nucleotid-Scquonz, d. h. sio ist einige Nuclcotido kurzer nls oino diosor Nu .lootid-Seiricnzon. Daboi ist dio Toilso(|uonz entweder ein fortlaufender Abschnitt von Nucleotiden nus oinor Nuclootid-Sequonz dor Figuron 1 bis 5 odor sio ist aus oinom odor mohroron gotronnton Nucleotiden odor Nucloolid-Soquonzcn cinor Nuclootid-Siiquonz nus don Figuron 1 bis 5 zusammengesetzt.

In dor vorliegenden Beschreibung und don Ansprüchen bcdoutct der vorstohond gonnnnto Hogrilf „Teilsoquonz" eino Nuclcotid-Soiiuonz mit einer Lange von vorzugsweise mindestens 15 Nuclootidon, vorzugswoiso mindostons 16 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens 18 Nucleotiden, vorzugswoiso mindostons 20 Nucleotiden und bosondors bovorzüfjt mindostons 50 Nucleotiden. Bekanntlich könnon solcho kleinen Frngmonto boi PCR-Vorfahron vorwondot wordoti. In oinor orfindungsgi ,niiß besonders bovorzugton Ausführungsform botrifft der Bogriff „Teilsoquon<r" oino DNA-Soquonz, dio mit einer boliebigon dor vorstehend beschriebenen orfindungsgemäßon DNA-Soquonzon hybridisiert und ein Polypeptid mit ci-Amylaso-Aktivitnt codiert. In oinor orfindungsgomäß besonders bevorzugten Ausführungsform sind dio DNA-Frar.imonto und Toilscquonzori von dicotylodonon Pflanzon nbgclcitot. Bosondors bovorzugt werdon DNA-Fragmcnto und Toilscquonzcn, dio - borGchnot als Durchschnitt dos codierenden Boroichos - cinon GC-Golinlt von otwa Ί0 bis 50% aufwoison.

Dor Bogriff „Analogon" bozoichnot boi don orfindurigsgcmäßon DNA-Fragmenton oino Nuclootid-Soquenz, dio oin Polypeptid codiort, das identisch odor im wesentlichen identisch mit dom von einem orfindungsgomüßon DNA-Fragment codiortm Polypoptid odor oino Toiisequonz davon ist. Es ist bokannt, daß dioselbo Aminosäure von unterschiedlichen Codons codiert worden kann. Die Verwendung c!or Codons hängt u. a. mit dor Präforonz dos fraglichen Organismus zusammon, der dio Nucleotid-Sequonz oxprimiert. So ni; Minn mindostons oin Nucleotid der Codons dos orfindungsgomäßon DNA-Fragments durch andcro ausgetauscht werden, dio bei dor Exprossion oin Polypeptid ergeben, das identisch odor im wosontliclion indontisch mit dom vom botroffondon DNA-Fragment codierten Polypeptid ist. Diese Soquonzon in (lon Figuron 1,2 und 5 sind oin Boispiel analoger Sequenzen, die Sequenzen dor Figuren 3 und 4 ein woitoros Beispiel. Außerdom botrifft dor Bogriff „Analogon" auch Variationen in der Sequonz, wio Substitutionen, insertionon, Additionen odor Umlagorungon von mindestens oinom Nuclcotid, wobei dio Variationen koine wesentliche Auswirkung auf das von dom DNA-Fragment odor dor Toilsoquon? davon codiorto Polypoptid haben. Der Begriff „Substitution" botrifft das Ersetzen von mindestens oinom Nuclcotid in dor vollständigen Nuclootid-Soquonz durch mindestens ein anderes Nucleotid. Der Begriff „Addition" botrifft dio Addition von mindostons einem Nuclootid an oinem der Enden der vollständigen Nucleotid-Sequenz. Der Begriff „Insertion" botrifft den Einbau von mindestens oinom Nucleotid in die vollständige Nucleotid-Soquenz. Der Bogriff „Delotion" botrifft dio Dolotion von mindestens oinom Nuclootid aus der vollständigen Nucleotid-Scquenz nn einem der beiden Enden dor Sequenz odor nn irgendoinom gcoignotcn Punkt inr.orhnlb davon. Der Bogriff „Umlagoruiuj" botrifft don Austausch von zwoi oder mehr Nucleotiden untereinander. Es werdon die üblichen Abkürzungen für Nucleotide vorwondot, d. h. A bedeutet Adonin, T bedeutet Thymidin, G bodoutot Guanin und C bedeutet Cytosin

Das erfindungsgemäße DNA-Fragment, das Co im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 5 abgebildoto Nuclootid-Soquonz

nttthttll, UHt niet) η nc l\ fm dm Dmynneo verwenden, ι Il mi IU 1I' Annly<p, din /um Nm hwni* dpi Oniainpntmn von ο Amylnjncodierenden Grnon in voim hiodenon Oiy.misinpn, vorrugawoiso I'llniwpn (vgl lloispipl 7H), veiwondo¹ wphIpii knnn tntd/ddnr iuf Identifizierung von (icwehen dos Oynnismu·;, dio oinon hohen ('"InH ,in ii-Amyl.ne G'mcn iind/ndnr ηιΙΙΝΛ I.Moüsmiynf UNA", UoIo, I'otonHNAI haben und von Giuvrlien, dm Vo ι η ο Mil-.ht-nOi.no i'nd/ddpr ηιΜΝΛ Ιι,ιΙίίι. Om pilinduningpm,il!irMi ONA-Fragniomo ko,^Nnon .inch Im das Absuchnn von /uchl inysmatcii.il mil soinen Gehnlt nn ti-ΛιηγΙ.κο -ιηΜΝΛ voiwpiidet worden. Ondurch wild n* mcnjlich, tti oinom fruhon St.ulium tu '>citiinmon, ol> dir t'llnn/n mm ΙκιΙιπ n AmyliisoAktivitnt entwickeln wird. Dio Uf slimmuny boruhl mil oinoi ι< t > 1111 (ion zwischen dor oAniylnsn Aktiviint und tipi Mpiiyo ι odu/iprondnr Zucker in ninji voryoytibenon I'lhn/o. t-ilindunysyom.111 Wi-ido itini ciistnn MnI oiknnnt, ι! ill pi-,η solchn Koiiolntion besteht. Oil» fruhoAbsichon von Zurhtungsnintcrinl hat oino Heiho von Vnitoilon uiitl stnllt oinon neuen und sohr /wp.rt mit Hiyon Antat/ zur Charakterisierung von Kiiitoffol/uchtinntoiint in. Hinblick nu( tion Stiirknmnt.iholismu» <1.-»r.

Foinor lassen sich dio in don I iguion 1 und?yp/oiytonDNA<Ftnymnnto/ur HoiMolluny ein" il'nlyppptids.d Ii oinoi Knilollol ti-Amylnso, mit Hilfo von DNA Hokombinnlions-Vorfnhion vorwondon On? linfjostnlltn I'olyppptid is) oino vvn 'nro orfintlunysyrniilKc AusluliiunysfurnMindkiinniiiulniilu r Woijo win dio iililichon Aiuylnso vrrwnndnt wrrdrn, /I) liriin Hr.iiion otto ils Ilostiiiullnil von Dotorgons-Mittcln. Wie ιι,ι :hstctinnil nrhiitoil. s1>Hlon dio in tion I ιψιιηη ;) untl ·1 ι|Γ/π(||ι·ιι ONA-St luonjon lodiylirh pniliollo Niiclnolid-Sciiiinninn tlof Knilollol tiAmylnsiiinHNA und pnit' >. ' " iii tlos Kaitollolti-AmylnsnVoilniifors tlnr. Jrtloi h Insxnn sich dio noch fehlmidon CionHoiPitho, ohwn'il d ι vo So(|uciwon hisnoi nicht hnstimmt wtiidnn, durch llyl)riilisiorun<| nut nAinyl.iso cONAtMonrn nun i)Piii>niir.< hen (ipnl),iiil>-n orhnlton.

VVio vorstehend hoschriolmn, wuitlon dio in tion Piyuren 1 l)is O dnninstplllPii Nucleolitl-üpiiuriifpn n\s einor KiirtolklcDNA-Gonbnnk oihnltcn. Gonnuor gosnyt wurtlo dio NuclootitlSotjuoni ntit oinor cDNA-(ionl>nnk orhnltpn, dio nut polyAroichor MNA aus dnn Koimon oinor Kartoffel (Solnnuni U boiosum) dor Sorto Dinnolh, wio nnch»tohontl unter .Mntorinl tintl Mothodon" bnjchriobon, orhaltan wurdo. Int vorhoyondon üusinMnnnlinny «ind tlii Hojrilfo .KirtoC'il" unit .SoIm.um tuhorottim" niutnuechbnr. Dio von (lon in (lon Fiyuion 1 bit Ί j|o;oiytei> NuclrotidSo()uomcn codiorion l'olypoplido linbon im votorulichon dio Aminosrturo-Soquonion dor boidon untorschiedlichon a-A ·lyl.iso-Typon von So'inuni tuhorosuni dor Sexto Dinnrlln, InsbosondorocodiorondioNurlootidSotiuoniondor Fiyuion 1 ii>'l2oincnTypdoro.-AmAlyso,wnhronddioNurlootid''.o(|u<<n{fln von don Fitjuron 3 und ·1 oinon nndoron Typ dor α AmyMso codioron.

Dio in Figur 1 ypjoiyto NuclootidSoiiuen/ onlliitli oin Inngos, ollonos I i'sornstnr von 40/ Codons, 11.τι I iniin Nur.lootid 0Ί? liPiiinnt und boini Nuclootitl 1 7Gl ondot. uns l.osornstor codiort oinon «AniylisoVorl.iufor. Dor «-Amylose-Vorlnufnr ontliftll oin Siyiiiilpoptid, vornmtlich codiort von don Nucleotiden O-tt his &05 und oin roifos viAmylisn Γη/ym, vermutlich codiert von den Nucleotiden 596 t)is 1761.

Außerdemonth.iltdioinFiyur 1 yoioiytoNucleolid-Sonuoninicht-codiormidoPnr^. .·, I h. iii'OnO'-nichttrnnslntioitenHoroif.h, oino soyoniinnto6'-Siynnlso()U''n/, dio oino lntr on S(M)U on» von 128 Nucluoiidon (fi ..! v.'i.M ?0 his Λ ?Ί) und oino 3'· nicht· trnnsl.itiorton Heroich onthAlt. Din in Fiytir 1 yotoiyto Nuclootid-So<|uont wird weiter in Hoispiol 8 nfthnr diskutiert. Dio in Fiytir 2 yoioiyto Nuclootid-Sciitioni enlliAlt pin Innyos offonos LcserAstor, (Ins heim Nucleotid Γ l>eyinnt und heim Nuclootid 1219 ondot. Diosos Loser nstor codiort oinon o-AmylosoVorlttufor. Ons roifoa-Amylnsoliiiiyni wir d vor mutlich von den Nucleotiden 03 bis 1219 codiert.

Wio in don Boispiolon anyoyobon, wurden mis der Kmloffol-cDNATinntiAiik uninrschiodlicho o-AmylnsocDNA-Clono erhalten. Einer dnvon onthiolt kein Intron lAinyi) und oinor dnvun (Amy3) oiMhinlt oin lntfon mit oinnr l.flngo von 1 ^U Nucleotiden. Dio Vcrteiluny der Introns in u-Amylnsc-Gonon, inshcsondoro K wtollclo-AmylASO-Gonon, ist nicht boknnnt. Es wurdo yctciyt, d.ili diea-Amylaso-Gci.u in oinor Gen fnmilio nngoordnot sind. Moylichoiwoiso bofindot siclidnrin jowoils nur oin Gon fur jcdnndcr boidon chnruktcrisiorton Typen von a-Amyl.iso-Gonon, dio durch unterschiedliche AIIoIo (Hoispiol 10) roprnsontiort werden. Innerhalb oinor Gonfnmilio wird oin hohor Grnd von Homoloyio zwischen don codiorondon Uoroichon dor Gone οι wnr i«-.t, wührond oino yorinyoro Honioloyio iwischon don nicht-codioronden Uoroichon orwnrtot wire'. Hei unterschiedlichen Allclcn dossolbon Gens wird oino nusyoprttyto Homoloyio bei nllon Allolon crwdrtet.

Dio Abfr '¹JO von Mnßnnhmon, durch dio d^;o in don Fiyuron 1 bis 5 nnycycbonon Nucleolid-Soiiunnion nufyoklitrt wurden, wird in den Boispiolcn 2 bis 6 crlhtitcrt. Aus den dort nnyogoborion Erklnrunyon wird doutlich, dnß die A.'ordnuny dor Experimente fur dio Isolierung der dio im wesentlichen in don Figuren 1 bi j 5 nnyoy obonon Nucleotitl-So(|uon:on onthnltondon cONA-Clono sehr schwioo ι w.ir. Somit orgibt sich aus Doispiol 5, dnß dio Mmifiykoit positiver Clone, dio mis der Knrtoffol-ci-Amylnso-cDNA· Gonbiink isoliert wurden, sehr yoriny ist, d.h. otwn 0,008%. Dios woist dnrnuf hin, dnß os fur dio Konstruktion oinor KartoffelcDNA-Genbank wichtig wnr, oin GCWf)I)O ju w.ihlon, in dom oino misrcichond yroßo Monyo ci-Aniylnso-niHNA vorkommt. Außerdem wnr dio Herstclluny vorwondbaror Gorsto-a-Amylnso-SondonmolokOlo gomrtß Ooispiol 2 wosontlich, insbesondere im Hinblick nuf dio Konstruktion eines Sondonmohkuls, (Ins optimnlo Hybridisiorungs-Eigonschnften mit don cDNA-Cloncn aufweist, dio mis Kartoffol-a-Amylaso-rnRNA orhnlton wurdon. Ein solches Sondonmolokül wurdo konstruiert. Dios ergibt sich daraus, (I.iß alle mit dom Sondonmolokül hybridisierenden Clono mit der gewünschten ct-Arr yliiso-Nucl'iotid-Sequcn; hybridisierten. Außerdem war os wichtig, gooignoto Hybridisiorungs-Oedinyungon zu wfthlon, dio nicht zu violon positiven So()uonzon (dios führt zu .schwarzen" Fil'orn, mit (Ionon koino doutlichon Ergobnisso erhallen worden können) odor zu Filtern fuhren, boi (ionon überhaupt koino Mybridisiorung orfolyt ist. Dio Hybrit'isiorungs-Bodingurigon gostntton dio Isoliorung von zwei Formon von Knrtoffol-a-Amylnso-cDNA-Clonon, :lio so unterschiedlich sind dnß sio untor normrion Oodingungon nicht krouzhybridisiorcn. Außerdem wurdo boi dor Hybridisioruny nnstollo von Lachsspormion-DNA E.coli-DNA als Tr(Iyor verwendet. Lachsspermion-DNA ist dor üblichorwoiso vorwondcte Träger. Dio Vorwondung von E.coli DNA ist sohr vorteilhaft, da dio Hintorgrundsignalo minimiort odor im wosontlichor· vormiodon worden. Das nusgohond von oinom DNA-Fragmont, onthaltond dio Nuclootido 541 bis 1 761 der in Figur 1 dargostollton Nucloc d-Sequenzodor oinor Toilsc()iicnz odor oinom Anabgon dnvon oxprimiorto Polypeptid ist oin a-Amylaso-Vorlaufor, d. h. os enthält das roifo a-Amylaso-Znzym sowio oin Signnlpoptid, dio durch oino Spalt- odor Prozossiorungs-Stollo getrennt sind, ü.is Signnlpoptid diont dor Vermittlung dos Transports dos Vorläufers durch Membranen, d. h. aus dor ZoIIo oder dom Gr vcbo heraus, in (Ionon sio yobildot wird. Wio in Buispiol 13 boschrieben ist dio Struktur des Siynalpoptids untypisch, möglicherweise aufgrund oines unüblichon Transport-Mechanismus. Der a-Amylaso-Vorläufer ist oino woitoro Ausfuhrungsform diosor Erfindung.

Dio Nuclootido 956bis 1 761 dor in Figur 1 angogobonon Nuclootid-Sequenz codioron oin roifos a-Amyloso-Enzym, d.h. oin Enzym ohno oin Signalpoptid. Zwar wird davon ausgegangen, daß das ci-Arnylnso-Hnzym moistens als Vorläufoi hergestellt wird, d.h. oin Signalpoptid enthaltend, das beim Prozessieren des Vorläufers im ihn horstollondon Organismus abgespalten worden kann, wodurch das rrifo a-Amylaso-Enzym ontstoht, jedoch kann dio roifo a-Amylaso auch direkt hergestellt wordon.

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Somit betrifft dio Erfindung in oinor woitoron Ausführungsform oiii DNA-Fragmont, dos int wosontlichon din Nuclootid-Soquonz onthrilt, dio boim Nucloolid 696 dar in Figur 1 nngogobonon Nuclootid-Soquonz hoginnt und boim Nuclootid 1 701 davon onclol, odor eino Toilso(|uonz odor oin Anologon davon.

Ferner betrifft dio Erfindung oin DNA-Fragment, (Ins im wosontlichon oino boim Nuclootid 53 boginnondo und boim Nuclootid 1 219 ondondo, Nuclootid-Soquonz dor in Figur 2 gozoigton Nuclootid-Soquonz, dio oino Kartoffol-ci-Amylnso codiort, odnr oino Toilso(|uonz oder nin Anologon davon enthält. Außerdem botrifft dio Erfindung oin DNA-Frngmont, dos im wosontlichon oino boim Nuclootid (> boginnondo und boim Nuclootid 1052 ondondo Nuclootidso(|uonz dor in Figur 3 gozoigton Nuclootid-Sc<|ucnz, dio oino pnrtiallo Kortoffol-a-Amylnso codiort, odor oino Toilsoquonz odor oin Annlogons du .on onlhnlt. Fcrnor botrifft dio Erfindung oin DNA-Fragmont, das im wosontlichon oino Nuclootid-Soquonz onthhlt, dio boim Nuclcotid 3 der in Figur A gezeigten Nuclootid-Soquonz boginnt, dio oino pnrtiollo Knrtoffol-a-Amylnso codiort, und boim Nuclootid 6Ί7 davon ondct, odor oino Toilsoc|uonz odor oin Annlogon davon onthält.

Das orfindungsgomilßo DNAFragmont ist vorzugsweise oin DNA-Fragmont, dus zu oinor in den Figuren 1 bis 5 gozoigton Nuclootid-Soquonz odor oiiu Analogen odor oinor Toilsoquonz davon homolog ist, d. It. eines, das mit dor DNA-Soquonz unter dofiniorton Hybridisiorungsbodingungon boi G χ SSC und 67X und anschlioßondom Abwaschoit mit A χ SSC und 67°C hybridisiert und das oinon GC-GoImIt im Bereich von otwn Ί0 bis 50% hat. Dor Bogriff „llomologio" bozoichnot daboi eins Vorliogon oinos boliobigon Ausmaßes von Komplomontnrität iwischon oinom gogobopon Sondenmolokül und dor nnalysiorton Nucloinsäuro-Spozios. Das minimal nnchwoisbnro Ausmaß von Homologie ist oiito Funktion dor wnhrond dor Hybridisiorung angcwondoton oxporimontolloit Bodingungon und dor Charaktoristika dos Sondonmoloküls dor analysierten Nucloinsäuro-Spnzics. Dahor sind die Größo dos Sondonmoloküls sowio dio Komplexität dor isolierten Nuclcotid-Soquonz wichtig, z.B. im Hinblick auf Roinhoit, Gehalt an ondoren Ni'cloinsäuro-Scquonzon als den mit α Amylase-Genon vorwandten, otc. Wio in den Beispielen besrhriobon, findet man Soquonzen, die homolog zu (lon in (lon Figuron 1 bis A gczoigtcn, Kartoffol-a-Amylasecodiorondon Nuclootid-So^uonzon sind, in nndoion Organismen als (lon untorsuchton, z. B. in andoron Kartoffclsorton odor in andoron dicotylodonon Pflanzen dor nachstehend orwiihnton Typen. Dio Erfindung betrifft auch dioso Nucleinsäure-Soquenzon. Somit lassen eich ontsprochondo a-Amylasocodiorundo Nuclootid-Sequonzon aus andoron dicotyledonen Pflanzon, wio andoran Pflanzen der Familie Solanacuno, z.B. andoren Kartoffolsorten, laicht durch Hybridisierung unter don vorstehend angegobanen Bedingungen mit oinom crfindungsgomäßon DNA-Fragmont isolioron, das im wesentlichen oino wie in Figur 1 angogobone Nuclootid-Soquonz cdor oin Annlogon oder eine Toilsoquenz davon onthält.

Forner botrifft die Erfindung oin DNA-Fragmeni, das ein a-Amylaso-Psoudogon ist. Dor Bogriff „a-Amylase-Pseudogon" betrifft ein ursprünglich aktives a-Amylase-Gon, das so mutiert ist, z.B. r'urch Substitutionen oder Doletionon, daß es nicht mehr aktiv ist, jedoch durch Hybridisierung mit einem DNA-Fragmont, enthnltond eine Nucleotid-Sequenz, wo im wesentlichen in Figur 1 bis A angegeben, ο du ι eine Toilsequonz oder ein Annlogon davon, als o-Amylaso-Gon identifiziert werden kann. Die in Figur 5 angogebono cDNA-Sequonz ist ein Boispiel des Produkts oinos aktiven Psoudogons. Die a-Amylaso-Psoudogono sind, wio nachstohond für dio richtigen Gono erläutert, vorwondbar.

Aus dor vorstohondon Boschroibung ergibt sich, daß dio in don Figuren 1 bis 5 gozoigton Nucleotid-Soquonzon von oinor dicotylodonon Pflanze, nämlich oinor Kai toffol der Sorto Dianolla, abgoloitot sind. Obwohl Nucleotid-Soquonzen, die von andoren Pflanzon isoliert worden könnon, insbesondere von andoron Kartoffolsorten als (irr Sorto Dianolla, oir.c r.ndoro Sequenz haben können, wird orwartot, daß sio in oinom Ausmaß mit einom orfindungsgomäßcn DNA-Fragment homolrg sind, das sie bei don vorstehend angogobonen Hybridisiorungsbodingungon mit einom DNA-Fragmont Ii ,htkK sioron könnon, das oino im wosontlichon wio in don Figuron 1 bis 5 angogobono Nuclootid-Soquonz onthält. Wio νυι. (vond orwähnt, sind diese Nuclootid-Sequenzen eine orfindungsgomäßeAusfühnjngsform. Üblicherweise wordon mit dieson 'ih'ndungsgomäßen DNA-Fragmenten hybridisiorondo Nuclootid-Soquenzon in Pflanzon der Familio Solanacoao gefundoit, insb ι iondere in dor Gattung Solanum, insbesondere Solanum tuborosum oder S.molongena (Auborgine). Andere Boispiolo sind Pflanzon der Gattung Lycoporsicon, z.B. Lvcoporsicon osciilonlum (Tomate,, djr Gattung Capsicum, z.B. Capsicum annuum (Pfeffor), der Gattung Nicotiana, z.B. Nicotiana tabacum (Tabak), dor Gattung Ipomooo, z. B. Ipomooa batatus (Süßkartoffol), de·· Gattung Brassica, z. B. Brassica napus (Rübsamen), dor Gattung Medicago, insbosondore Modicago sntiva (Lucerne), der Gattung Trifolium spp. (Kloe), Glycinomax (Sojabohne), der Gattung Arachis, insbesondor) Arnchis hypogaoa (Erdnuß), Phasoolus spp., Vicia spp., Vig'na spp. (Bohnen), der Gattung Pisum, insbosondore Pisum sativum, ¹A urzolnutzpflanzon, wie der Gattung 3ota, insbesondere Bota vulgaris (Zuckerrübe) und der Gattung Daucus, insbesondre Daucus carota (Karotten).

Ein erfindungsgomäßos DNA-Fragrnont kann inin.lostons oino zv/oito Nuclootid-Sequenz enthalten, dio ein zwoites Polypoptid odor oinon Toil davon codioit, so daß ein Fusions'irotein codiert wird, boi dem mindestens ein Teil des orfindungsgemäßon DNA-Fragments zusammen mit oinem andoron DNA-Fragment oder Gen oxprimiert wird. Für bestimmte Zwecke kann es wünschenswert sein, daß das vom orfindungsgemäßen DNA-Fragment codierte Polypeptid als Fusionsprotein vorliegt, d. h. ein Protein, in dam oin Polypeptid mit einor im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 7 gezeigte Aminosäure-Sequenz oder ein Fragmem oder Analogon davon mit einem zweiten Polypoptid fusioniert ist. Es kann vorteilhaft sein, daß das zweito Polypoptid ein zu den Eigenschaften dos Fusionsproteins beisteuorndos ist, z. B. die Aktivität, wie die onzymatischo Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypoptids durch Modifizierung, beispielsweise herabsetzt oder erhöht. Ferner kann ein Fusionsprotein zwoi oder mohr enzymatischo Aktivitäten haben, wobei eine eine a-Amylase-Aktivität und die andere(n) eine a-Amylase-Aktivität oder eine enzyrnatische Aktivität ist, dio z. B. normalerweise zusammen mit einer a-Amylaso verwendet wird. Somit werdon, wio vorstehend für die Herstellung von Alkohol boschrieben, mohrorere Enzyme verwendet, d. h. mindestens eino Cellulase und ß-Glucosidaso. Somit kann ein Fusionsprotein mit einer a-Amylase-Aktivität zusammen mit einer Cellulase- und/odor ß-Glucosidase-Aktivität vorteilhaft für die Herstellung von Alkohol sein. Außerdom könnon die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente oder Teile davon mit einem Polypeptid fusioniert sein, das den Transport aus Zellen oder Geweben heraus veranlaßt, z. B. sogenannte Exoenzyme. Am Transport beteiligte Signalpeptide werden nachstehend genauer beschrieben. Das Fusionsprotein kann funktionieren, wenn es in einem höheren Organismus, wie einer Pflanze, oxprimiort wird, kann aber auch nützlich sein boi der Expression in niederen Organismen, wie Bakterien oder Höfen. Somit kann bei dor Herstellung dos Polypeptide durch DNA-Rokombinations-Verfahren, z. B. wie nachstehend beschrieben, die Go winnung oder Isolierung des Polypoptids leichter und wirtschaftlicher sein, wenn das zu gewinnende Polypeptid ein Fusionsprotein ist. Das zweite Polypeptid, mit dem das vorstehend definierte Polypeptid fusioniert ist, kann eines sein, das antigene Determinanten enthält, gegen die Antikörper gezüchtet werden können, wobei die Antikörper zur Gewinnung des Fusionsproduktes verwondot werden können, z. B. nach den Prinzipion der Chromatographie, wio Affinitätschromatographio, boi denen Polypeptide mit Hilfe immobilisierter Anitkörpor gowonnon werden können. Verfahren zur Isolierung des Polypeptids werden nachstohond genauer beschrieben.

Wio vorstehend und in don anschließendem Boispiolon boschriobon, wurdon dio in don Figuren 1 bis 5 gozoiglon Nuclootid-Soquonzon ous oinor cDNA-Gonbonk orhnlton, die mit aus dor Knrtoffolsorto Dianolla isiliortor mRNA konstruiort wurde. Auf (lioso Woise Insson sich ontwodor Toilsoquonzon dos DNA-Frogmonts, ontlioltoncl oii.u .viu in (lon Figuron 1 bis 5 angogobono So(|uonz und dazu nnnlogo odor homologo Soquonzon aus oinoin andoron Organismus odor domsolbon Organismus gowinnon, dio eino ondoro als dio in don Figuron 1 bis 5 angogoboiio a-Amylaso codioron. Daboi golton dio vorstohond angegobenon Dofinitionon für die verwendeten Bogrif fo. Homologe Nuclootid-Soquonzon lassen sich aus cDNA orhalton, dio durch Horstollung einer cDNA-Genbank als Grundlage dor mRNA oino ι a-Amylnso-bildondon Organismus hergestellt wurdo, z. B. durch Anwendung oinos Vorfahrons, dos ähnlich dom zur Isolierung dor in don Figuren 1 his 5 ongogobunon Nuclootid-Soquonz ist. In oinor andoron Ausführungsform könnon dio Nucloolid-Soquonzon, ζ. B. wio nachstohond boschriobon, vom Gonom oinos a-Amylaso-bildendon Organismus durch Absuchon nach gonomischon Soquonzon, dio mit oinom orfindungsgomäßon DNA-Fragment hybridisieren, abgoloitot worclon. Dies kann durch Etabliorung einor gonomischon Gonbank dor Pflonzo, z.B. dor Kartoffol, und Absuchen nach a-Amylaso-bildondon Clonon durch Hybridisierung mit oinom erfindungsgomäßon DNA-Fragmont orfolgon. Erfindungsgomiißo DNA-Fragmonto, onthaltond oino im wesentlichen wio in don Fiyuron 1 bis 5 ongogobono Nuclootid-Soquonz odor oino Toilsoquonz odor oin Analogon davon, könnon nucli synthotischo DNA soin, dio in üblichorwoiso durch DNA-Synthoso horgostollt wurdo. Die moiston ouknryontischon Gono onthol' ί Introns, dio sich, wio vorstohond boschriobon, in Größe, Zusammensetzung und Logo von don Genon dorsolbon Gonfamilio untorschoidon könnon. Daher können a-Amylaso-Gono oder DNA-Fragmonto, dio Toilo davon enthalten, Introns unterschiedlicher Größo, Zusammensetzung und Lago enthalten. Dioso Introns könnon sich von don in Figur 1 angegebenen unterscheiden. Somit betrifft dio Erfindung auch oin DNA-Fragmont, onthaltond oino wio in Figur 1 gozoigto Nuclootid-Soquonz odor oin Analogon odor oino Toilsoquonz davon, insbesondere den Toil der Soquonz, dor eino roifo a-Amylaso codiert, d.h. der don Nucleotiden 596 bis 1 761 dor in Figur 1 gozeigton Soquonz entspricht, wobei das DNA-Fragmont fornor mindostons oinon nicht-codioronden Bereich, wio mindestens eine regulatorischo Soquonz und/oder Intron enthält. In diesem Zusammenhang wird dor Begriff „Intron" in scinor üblichen Bedoutung verwendet, d. li. als DNA-Sogment, das transkribiert, abor nicht translation wird, da es durch das Zusnmmonspleißcn von RNA-Soquonzon ontfornt wird, dio von don DNA Soquonzon auf boidon Soiton dos Introns transkribiert wurden. Ein Intron kann eino Vielzahl von Größen aufwoisnn. In Pflanzen hat os üblichorwoiso oino Größo von otwa 50 bis 500 Nucleotiden. Ein erfindungsyomäßos DNA-Fragmont kann obonso einen odor mehrere 5'- oder 3'-nicht-n anslatiorto Boroicho onthalton. Diese müssen immer vorhanden sein, um eine Expression dos Gens odor dor DNA-Soquonz zu erhalten, dio dazwischen liegt. Die 5'- und 3'-nicht-translatierton Boroicho sind spezifisch für dio das DNA-Frogmont oder Gen oxprimiorenden Organismen. Dementsprechend sollte der a-Amylase-codiorenden Soquonz ein 5'-nicht-translatierter Bereich vorgesehen, und ein 3'-nichttranslatiertor Boreich sollte darauf folgon, um die Expression in dem Organismus zu ermöglichen. Dor nichttranslatiorte Bereich kann ein natürlicherweise in der Sequenz vorkommondor soin odor einer, clor anstelle der oder zusätzlich zu lon in den Figuron 1 bis 4 angegebonon 5'· und/oder 3'-nicht-translatierton Bereichen synthetisch eingebaut wurdo, wobei sich die Boreiche in Zusammensetzung und/odor Länge unterscheiden können, und zwar vorzugswoiso so, daß die speziellen Aufforderungen des Organismus erfüllt worden, der das orfindungsgemäßo DNA-Fragment oxprimiort.

Wie vorstohond erläutert, enthält die in Figur 1 gozoigto Nuclootid-Sequenz oino ein Signalpeptid codierende Sequenz, dio außergewöhnlich in Zusammensetze ig und Länge ist. Forner wird darauf hingewiesen, daß AmyZ3/4 und AmyZ7 idontiscno Signalpeptide codieren, außer daß AmyZ 7 ein Met-Codon fehlt. Die Art oinesboi einem vorgegebenen Organismus verwendeten Signalpeptides hängt u.a. vom Organismus und dom Teil davon ab, z.B. der speziellen ZoIIo oder des speziellen Gowobos, in dom das Polypoptid (auch Vorläufer) hergestellt wird, und zu welchem Toil derselben Zelle oder zu welcher anderen Stelle im Organismus das Polypeptid gegebenenfalls transportiert worden soll. Somit kann ein die in Figur 1 angegebene Nuclootid-Soquonz oder eine Toilsequonz oder ein Analogon davon, insbosondore die Nucleotide 596 bis 1761 der Soquonz onthaltendos DNA-Fragment ein andores Signalpoptid als das dor in Figur 1 angogcbono Nucleotid-Sequenz aufwoisen, so daß ein Vorläufor-Protoin ontsteht, das sich von dom von der in Figur 1 angegebenen Nuclootid-Sequenz codierten unterscheidet. Das Signalpuptid kann so ausgewählt werden, daß es den speziellen Anforderungen dos den Vorläufer herstellenden Organismus gerecht wird, einschließlich eines t,^awunscriten anschließenden Transports des Vorläufers innerhalb des Organismus. Übliche Signalpeptido haben oinon Kornboreich aus hydrophoben Aminosäuren, und somit enthält das orfindungsgomäße DNA-Fragmont vorzugsweise einen Beroich von Codons, der hydrophobo Aminosäuren codiert.

Die Expression von Genon ist in allen Organismen einer Regulation unterworfen, die in Pflanzen üblicherweise selir kompliziert ist. Dabei wirkt ein Netzwerk unterschiedlicher regulatorischer Systeme und Faktoren zusammen. Obwohl derzeit nur wonig über die Regulation von Pflanzen bekannt ist, wurden unterschiedliche regulatorische Mechanismen aufgeklärt, wobei wichtige Regulationsformen die gowcbospczifische Regulation und die Entwicklungsregulation sind. Um dio Expression eines erfindungsgemäßon DNA-Fragments oder Gens, enthaltend dioses DNA-Fragmont, zu ändern, läßt sich eine regulatorischo Sequenz funktionell mit dom DNA-Fragment oder Gen verbinden, so daß eine Expression des Fragments oder Gons unter der Kontrolle der inserierten regulatorischon Soqucnz erzielt wurde. Dementsprechend botrifft die Erfindung auch oin DNA-Fragment, das eino im wesentlichen wie in den Figuren 1 bis 4 angegebene Nucleotid-Sequenz oder eine Tcilscqucnz oder ein Analogon davon und außerdem mindostons eine regulatorischo Sequenz enthält. Üblicherweise ist die regulatorische Sequenz ein konstitutiver oder regulierbarer Promotor. Der Begriff „Promotor" bezeichnet eino kurze DNA-Sequenz, an die die RNA-Polymorase vor der Transkription der DNA, an die der Promotor funktionell gebunden ist, bindet, so daß die Transkription ablaufen kann. In seiner breiteren Bedeutung betrifft der Begriff „Promotor" aber auch RNA-Polymerase-Bindungsstellen sowie regulatorische Sequenzelemento, die bis zu mehrero hundert Basonpaare von der Transkriptions-Startstelle und gelegentlich sogar weiter davon entfernt liegen. Ein „konstitutivor Promotor" ist ein Promotor, der im wesentlichen keiner Regulation, wie Induktion oder Repression unterworfen ist, aber eine kontinuierliche und im wesentlichen unveränderte Transkription der DNA-Sequenz gestattet, mit der er funktionell verbundon ist, und zwar in allen aktiven Zellen des Organismus, vorausgesetzt daß andere Anforderungen für den Ablauf d9r Transkription erfüllt sind.

Ein „regulierbarer Promotor" ist ein Promotor, dessen Funktion durch mindestens einen Faktor reguliert wird. Diese Faktoren sind entweder solche, dio durch ihr Vorliegen die Expression eines erfindungsgemäßen DNA-Fragments gewährleisten odor dio die Expression dos DNA-Fragments suf rimieren, so daß ihre Abwesenheit die Expression der DNA-Sequenz hervorruft. Somit können eier Promotor und ggf. die damit assoziierten rogulatorischon Sequenzen durch das Vorliegen oder die Abwesenheit von mindestens einem Faktor aktiviert werden, der die Transkription des DNA-Fragments beeinflußt, das eine im wesentlichen wie in Figur 1 angegebene Nucleotid-Soquin'. odor ein Analogon oder eine Teilsequenz davon enthält.

Andeio Fcrmon rogulatorischer Sequonzon sind stromaufwärts ur J stromabwärts gologono Soquonzon, dio boi dor Kontiollo der Transkriptions-Termination und beim Entforncn von lntrons niitwlrkon, sowie für die Polyndenyllorung und Initiation der Translation verantwortliche Soquenzon. Wonn die regulatorischo Soquonz In olnor Pflanzo, wio oinor dicotylodonen Pflanzo, z. B. oinor Kartoffolpflanze, funktionieren soil, 1st olno solcho rogulatorischo Suquenz vorzugswoiso eino von oinor dicutylodonon Pflanze abgeloitoto, z. B. oino von oinom a-Amylaso-Gon abgoloitoto.

Die dio Aktivität oinos I'romotors roguliorondon Fnktoron köimon sich untorschoidon, u.a. durch don vorwondoton Promotor sowio don Organismus, In dom or funktionieren soll. Eino gowobospozifische Regulation läßt sich durch bestimmte intrinsischo Faktoron rogulieron, die die Expression von Gonon sicherstellen, die für ein bostimmtos gowohnspezifischos Proteines codioren. Solcho Faktoren gibt os in Säugorn und Pflanzon, so daß sich spezifische Gowobo ontwickoln könnon. Eine geringe Anzahl guwobespozifischor Soquonzen wurde beschrieben Dazu gohört dor Patotin-Prom< >r, dor in Knollen und zu oinom goringoron Ausmaß in Blättern von Kartoffolpflonzon arboitot. Dor Potatin-Promotor Ist oin starker Promotor und wird In (44) nähor beschrieben. Auch biattspezifischo Promotoren wurden gefunden. Dio Entwicklungsrogulation von Pflanzon ist an der strukturollon und funktionollen Difforonziorung von Zollon, Gowobon odor Organon während der Entwicklung botoiligt, z.B. an der embryonalen odor rogonerativon Entwicklung. Daraus ergibt sich ö*s Entstohon von Strukturen und Funktionen, dio unterschiedliche Formen von Zollon, Gowobon odor Organon in untorscniodlichon Toilon der Pflanzo charaktorisioren. Die boi der Entwicklungsregulation botoiligten Mochanismon sind noch lango nicht aufgeklärt. Es wurdo jodoch gozoigt, daß Phytohormone daran botoiligt sind. Fornor wird eino Beteiligung unterschiedlicher Hormone und anderer intrinsischor Faktoron, wio während Samen- odur Pflanzen-Entwicklung und -Wachstum synthetisierte Vorbindungon, an dor Regulation erwogen. Es wird auch davon ausgegangen, daß sich die Entwicklungsregulation als nützlich für die Regulation dor α-Amylasa-Gon-Exprossion orwoisonkann.

Eino andere aufgeklärte Promotorform ist oin von einom Pflanzonvirus abgoloitotor Promotor, z. B. c'n CaMV („cauliflower mosaic vi'i.s")-Promotor. Dies ist oin starker konstitutivor Promotor.

Andoro Pr jmotoron lassen sich vom Ti-^lasmid ableiten, wie der Octopin-Synthaso-Promotor, der Nopalin-Syn'.haso-Promotor, dor Mannopin-Synthase-Promotor und Promotoren von andoronoffonen Losornstorn in der T-DNA wio ORF7. Im allgemeinen ist os vorteilhaft, oinon aus dem fraglichen Wirtsorganismus isolierten Fromotor zu vorwonden, um sicherzustellen, daß die Promotoren vom Wirtsorganismus akzeptiert worden, obwohl oin Promotor aus derselbon Unterklasse von Organismen, z. B. Dicotyloclonen, in dor Rogol gonau und wirksam arbei'ot. Dio mediatorische Sequenz kann ein a-Amylaso-Promotor soin, d.h. oin Promotor, der natürlicherweise in Verbindung mi: ci-Amyluso-Gonon gefunden wird und on ihrer Transkription botoiligt ist. Ein a-Amylaso-Promotor läßt sich aus einom Uoiieiiun α-Λπ ylaso-Gen erhalton, das durch I lybridisierung, z. B. wio nachstehend genauer boschriobon, mit oinom erfindungsgen aßen DNA-Fragment erhalton worden kann, wolchos oino im wesentlichen wio indon Figuren 1 bis 5gozoigto Nuclcotid-So.juonzoder oino Toilsoquenz oder oin Analogon davon enthält. Üblicherweise sollte der a-A:uylase-Promotor vom solben Organismus orhalton worden, in dem er funktionieren soll. Er kann aber auch aus einom anooron Organismus, vorzuusw. ise derselbon Unterklasse erhalton werden. Gegebenenfalls und sofern gewünscht, läßt sich der natürliche Promotor für den Anwendungszweck modifizieren, z. B. durch Modifikationen der Promotor-Nucleotid-Sequenz, so daß ein in anderer Weise als dor natürliche Promotor arbeitender Promotor erhalten wird, z.B. ein schwächerer odor oin stärkoror. Somit wäro ein a-Amylase-Promotor geeignet für die Konstruktion einer trensgonon Kartoffelpflanze (dies wird nachstehend genauer boschlieben).

Eine bestimmte α Amylase-Grundaktivität wird benötigt, um bestimmten Pflanzen Wachstum und Entwicklung zu ermöglichen und um ihre wesentlichen Stoffwerhselfunktionon durchzuführen. Somit müßten beim Entworfon neuer Pflanzonkonstrukte, insbesondere neuer Kartoffelpflanzen-Konstrukte, in denen oino vorminderte a-Amylaso-Aktivität gewünscht wird, die Konstrukt vorzugsweise so entworfon worden, daß eine niedrigere Expression der a-Amylaso im Vorgleich zur Expression in der natürlichen Pflanze erhalten wird, während aber oin Expressionsniveau beibehalten wird, das zur Absicherung der für Wachstum und Entwicklung der Pflanze wesentlichen Stoffwechselfunktionen ausreicht. Dies trifft beispielsweise bei der Konstruktion transgenor Kartoffeln zur Verwendung bei der Herstellung von Ka^rtoffelchips zu.

Ein Verfahren zum Absenken der Expression der intrinsischen a-Amylaso in oin u Pflanze wirkt auf dom Niveau der Translation. Dies läßt sich erzielen durch Bereitstellung einer anti-sonso-RNA, dio die Translation einer vom intrinsischon a-Amylase-uen codierten mRNA inhibiert, wobei die anti-sonso-RNA eino Nucleotid-Sequonz enthält, J^;e im wesentlichen oine im Vorhältnis zu den in den Figuren 1 bis 5 gezeigten oder einer Toilsoquenz oder eines Analogons davon entgegengesetzte Orientierung hat. Die Begriffe „intrinsische a-Amylase" bzw. „intrinsischo a-Amylase-Gono" betreffen in Pflanzen natürlicherweise häufig vorkommende a-Amylase-Enzymo und a-Amylase-Gene, wobei os mehrere davon geben kann.

Wie nachstehend in Beispiel 7 näher beschrieben, repräsentieren die in den Figuren 1 bis 5 angegobonon Nucleotid-Sequenzen zwei stark unterschiedliche Typen von cDNA-Clonen.

Ein Typ wird durch die ClonoAmyZ3/4, AmyZ7 und AmyZ2 (Figuren 1,2 und 5; „AmyZ3/4-Typ") und dor andere Typ durch die Clone AmyZ1 und AmyZ6 (Figuren 3 und 4; „AmyZ 1-Typ") repräsentiert. Dia Nucleotid-Sequonz-Homologie zwischen diesen Clonen der beiden Typ ; ist niedrig, etwa 55 bis 60%. Deshalb kann die Translation der mRNA von einom der beiden Typen unabhängig vom anderen verhindert worden, da die beiden Typen so unterschiedlich sind (andererseits ist die Homologie innerhalb joder der beiden Typen sehr hoch, weit über 90%). Um die Translation der mRNA beider DNA-Typen zu verhindern, müssen Konstrukte mit zwei Typen von anti-Messonger-Genen hergestellt worden (vgl. Beispiel 24). Dabei ist die Tatsache, daß die Clone AmyZ 1 und AmyZ6 nicht vollständ'g sind, verhältnismäßig uninteressant.

Somit wird in einer Ausführungsform der Erfin iung ein DNA-Fragment boreitge&ollt, das eine anti-senso-RNA codiert, d. h. ein mRNA-Molckül, das zur Hybridisierung mit oinor von den intrinsischon a-Amylase-Genen transkribierten mRNA fähig ist und dadurch die Translation davon inhibiert. Die Expression der die anti-sense-RNA codierenden Nucleotid-Sequonz kann entweder konstitutiv oder reguliert sein. Die Sterke des die Transkription der Nucleotid-Sequenz regulierenden Promotors sollte von einer Größenordnung sein, die die Herstellung ausreichender Mengen von anti-sense-RNA pro Zeiteinheit gestattet, so daß die Translation der a-Amylase-mRNA inhibiert wird, die von der intrinsischen a-Amylase-Genen gebildet wird. Die Transkription des eine anti-sense-RNA codierenden DNA-Fragments läßt sich, wie vorstehend beschrieben, regulioron, beispielsweise durch eine geeignete Promotor-initiierte Transkription „in entgegengesetzter Richtung" eines erfindungsgemaßen DNA-Fragments. Beispielsweise kann ein a-Amylase-Gon-Promotor zu diesem Zweck nützlich sein. Andere Promotor-Typen oder andere re.gulatorische Sequenzen wie die vorstehend erwähnten, können ebenfalls vorwendet werden. Die anti-sense-RNA muß in den Geweben oder Zellen, in denen die zu steuernden a-Amylase-Gene exprimiert werden, vorliegen, damit sio mit der intrinsischen a-Amylase-mRNA hybridisieren kann und somit d!e Translation davon inhibiort. Die die anti-sense-RNA codierende DNA-

Sequenz muß im Genom dor Pflanze vorliegen, um sicherzustellen, daß clio DNA-Soquonz im Wirtsorganismus stabil boiboholton wird.

Vorzugswoiso ist oin anti-sonso-RNA-Molokül codiorondes DNA-Fragmont im wosontlichon komplementär zu einem orfindungsgomäßon DNA-Fregmont, so daß oino wirksame Hybridisiorung dor boidon RNA-Molokülo bereitgestellt wird, wodurch oino wirksamu Hommunu der Translation oinor α-Amylaso-niRNA in a-Amyloso orzlolt wird. Das oin antl-sonso-RNA-Molekül codierende DNA-Fragment weist vorzugsweise oino Größo auf, die eine ausreichende Homologie zwischen dor anti· sonse-RNA und der mRNA, mit der sie hybridisieren soll, gewährleistet, z. B, don komplomontäron Strang olnor vollständigen Soquenz einer der Figuron 1 bis 5. Im allgemeinen sollte das DNA-Fragmont so lang wio möglich sein. Daraus orgibt sich oino hoho Wahrschr .nlichkoit der Kollision und somit der Hybridisiorung zwischon dor davon transkribiorton RNA und mRNA, mit dor dioso hybridisieren soll. Dio anti-sonso-Rogulotion in Pflanzon wird fornor in (59, (60) und (C1) beschrieben. Wie vorstehend orläutort, botnlft dio Erfindung auch von einem wio vorstohond dof iniorten DNA-Fragmont codiorto Polypeptide d. h. von einem DNA-Fragmont, das eino im wesentlichen wio in don Figuron 1 bis 4 abgobildoto Nuclootid-Soquonz oder oino TeiUequonz odor oin Analogon davon enthält odor oin damit untor don vorstohond angogobenon Hybridisiorungsbodingungon hybridisiorondos DNA-Frngmont. Die Erfindung botrifft fornor Analoga odor Fragmonto dos Polypeptide. Dor Begriff „Analogen" botrifft im Zusammenhang mit don orfindungsgomäßon Polypeptiden Protoine odor Polypoptido mit einer ähnlichen Aminosäure-Zusammonsotzung und -Sequenz wio der in Figur 1 odor 2 gozoigton Aminosäuro-Sequonz dor α-Amy läse aus Solanum tuhorosum, wobei geringfügigo Abweichungen in dor Aminosäure-Sequenz gestattet sind, z. B. Substitutionon, Delotionon, Additionen, Insertionen odor Umlagorungon von oinor oder mohrornn Aminosäuren im Polypeptid, dio keine wosontlicho Beeinträchtigung clor onzymatischen Eigenschafton dos Polypoptids im Vergleich zum in den Figuron 1 und 2 gozoigton Polypeptid habon. Die Bogriffo „Substitution", „Insertion", „Addition" und „Umlagerung" wurdon vorstehend bei clor Beschreibung dor orfindungsgemäßen DNA-Fragmente orklärt und sind hier entsprechend anzuwenden. Unters*·.iiode in den Kohlenhydratreston otc, dio koino nachteilige Auswirkungen auf dio onzymatischon Eigonschafton dos Analof jns habon, worden ebenfalls vom Bogriff „Analogon" erfaßt. Der Bogriff „Analogon" umfaßt den Begriff „Homolog" in seinor üblichen Bedeutung, d. h. oin entwicklungsmäßig verwandtes Protein odor Polypoptid. Das analoge Polypoptid odor Protein kann von einem anderen Organismus als Solanum tuborosum abgoloitot sein, z. B. von einer anderen dicotylodonon Pflanzo, oder kann partiell oder vollständig synthetischen Ursprungs sein. Dor Begriff bcdoutct auch jedo beliebige enzymatischo Teilsequenz und jedes beliebige funktionell Äquivalent oder Dorivat einor wie in Fig. 1 oder 2 angegebenen Aminosäure-Sequenz. Dor Bogriff „onzymatischo Teilsoquonz" bezeichnet eino Aminosäure-Sequenz, dio mindostons oin aktives Zentrum dos a-Amylaso-Enzyms aufweist. Dor Bogriff .aktives Zontrum" betrifft den Teil dor Aminosäure-Sequenz, dor dirokt oc'er indirekt an der Umwandlung von Stärke zu reduzierendem Zucker beteiligt ist, d. h. an dor Hydrolyse von a-1,4-Bindungon in der Stärke Der Bogriff „funktionellos Äquivalent" betrifft alle enzymatisch aktiven Substanzen mit der Fähigkeit, Stärko in reduzierende Zucker, wie Glucose und Fructose, in einer ähnlichen Weise wie a-Amylase umzuwandeln, d.h. a-1,4-Bindungen zu hydrolysieren. Das funktionell Äquivalent kann von einom anderen Organismus als Solanum tuborosum abgeleitet sein, z.B. von einer anderen dicotylodonon Pflanze, oder kann partiell odi:r vollständig synthetischen Ursprungs sein. Es wird darauf hingewiesen, daß die Ähnlichkeiten zwischen don Aminosäuro-Soquenzon von α-Amy laso aus Solanum tuberosur.i, wio in Fig. 1 und 2 angegeben, und dom funktionalen Äquivalent mehr qualitativ als quantitativ sind, was eher von der Art als vom Ausmaß der Aktivität des funktionollen Äquivalents abhängt.

Die Erfindung betrifft auch von dicotylcdonon Pflanzen abgeleitete Polypeptide mit einer hohon Homologie, üblicherweise mindostons etwa 60%, z. B. mindestens etwa 70%, mit einer, wie in einor der Fig. 1-4 angegobonon, Aminosäuro-Sequonz einer Kartoffel-a-Amylase. Der Bogriff „Homologie" botrifft das Vorliegen irgendeiner Form von Ähnlichkeit zwischon einer gegebenen Aminosäure-Sequenz und einer in den Fig. 1-4 dargestellten Aminosäure-Sequonz. Natürlich Iningt die Homologie von der Anzahl der zu vergleichenden Aminosäure-Rosten sowie von den tatsächlich verglichenen Teilon dor zu vergleichenden Aminosäure-Sequenz ab. Der Begriff „Ausmaß an Homologie" botrifft den Teil identischer Aminosäure-Reste in den zu vergleichenden Aminosäure-Sequenzen. Im vorliegenden Zusammenhang ist das Ausmaß an Homologie zwischen zwei beliebigen Aminosäure-Sequenzen die Anzahl identischer Aminosäuro-Reste an entsprechenden Positionen in den beiden zu vergleichenden Aminosäure-Sequenzon im Vergleich zur Gesamtzahl der in don boidon Aminosäure-Sequenzen verglichenen Aminosäure-Reste. Das Ausmaß an Homologie zwischon zwei Aminosäure-Sequenzen sollte bei größtmöglicher Überlappung zwischen den beiden Aminosäure-Sequenzen bestimmt werden, d. h. die zu vergleichenden Aminosäure-Sequenzen sollten so gelegt werden, daß dio größtmögliche Überlappung zwischen identischen Aminosäure-Resten erhalten wird, so daß das maximale zwischen den beiden zu vergleichenden Aminosäure-Sequenzen erhältliche Ausmaß an Homologie erzielt wird. Vorzugsweise gehört die dicotylcdono Pflanze, von der das Polypeptid abgeleitet ist, zur Familie Solanaceao, insbesondere der Gattung Solanum, da ein hohes Ausmaß an Homologie zwischen Polypeptiden diesor Pflanzen erwartet wird. Somit wird eine Homologie von a-Amylase jeder anderen Kartoffelpflanze mit den orfindungsgomäßen Polypeptiden erwartet. Es wird auch erwartet, daß verwandte Pflanzen der Familie Solanaceae, wie Pflanzen der Gattung Capsicum, z. B. Capsicum annuum, Lycopersicon, ζ.B. Lycopersicon lycoporsicum, und Nicotiana, z.B. Nicotiana tabacum, sowio dicotyledone Pflanzen anderer Familien Polypeptide enthalten, die zu don orfindungsgemäßen Polypeptiden, d.h. a-Amylase, homolog sind. Zu den im wesentlichen in den Fig. 1-4 gezoigton Aminosäurn-Sequenzen oder zu Fragmenten odor Analoga davon homologe Polypeptide lasson sich durch die Isolierung von Genen oder mRNAs erhalten, die solche Polypeptide codieren, wobei ein erfindungsgemäßes DNA-Frejment verwendet werden kann, und durch Herstellung des Polypeptide auf Grundlage der Kenntnis soldier Gene odor mRNAs. Dies wird nachstehend näher erläutert. Insbesondere wird erwartet, daß sich die erfindungsgemäßen DNA-Fragmente, insbesondere eine in den Fig. 1 oder 3 dargestellte Nucleotid-Sequonz enthaltende DNA-Fragmonto, zur Isolierung entsprechender DNA-Fragmente aus mit Kartoffeln nahe verwandton Pflanzen verwenden lassen, z. B. der Tomate (Lycopersicon). Durch die Herstellung einor a-Amylase in der nachstehend beschriebenen Weise, d. h. durch Anwondung von DNA-Rokombinations-Verfahren oder durch Flüssig- odor Festphasen-Polypeptidsynthese, ist es möglich, ein erfindungsgemäßes Polypeptid in im wesentlichen reiner Form zu erhalten, was für bestimmte Zwecke vorteilhaft ist. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff „im wesentlichen rein", daß das fragliche Polypeptid im wosontlichon frei von anderen Bestandteilen ist, z.B. von anderen Bestandteilen, die die enzymatische Aktivität des Polypeptids beeinflussen können. Diese anderen Bestandteile können sich aus der Herstellung und/oder Gewinnung des Polypeptids ergeben oder in anderer Weise zusammen mit dem Polypeptid gefunden werden. Die hohe Reinheit des erfindungsgemäßen Polypeptids ist vorteilhaft, wenn die Polypeptide wegen ihrer enzymatischen Eigenschaften verwendet werden sollen, z. B. bei dor Hydrolyse odor dem Abbau von Stärke, z. B. bei der Herstellung von Spirituosen. Aufgrund ihrer hohen Reinheit können sie eine höhere enzymatische

Aktivität habon und somit in oinor yoriiigoron nls dor üblichem a-Amyloso-Mongo für dio Hydrolyse» von Stiirko vorwondot werden. Boispiolswoiso knnn os boi dor Herstellung von Spirituosen, boi dor gegenwärtig dio baktoriollo a-Amylnso votwoiulol wird, vorteilhaft sein, oin orfindungsgomä ßos Polypoptid zu vorwondon, insbosondoro in solnor im woooihlichon roinon Form, tin das orfindungsgomäßo Polypoptid don natürlichen, für dio Hydrolyso von Störko in natürlichen Pflanzon vorantwortlichon a-Amylaso-Enzymon ähnolt odor im wosontlichon identisch dnmit ist. Dio Roinhoit dor orfindungsgomäßon Polypoptido läßt sich durch oino Wostorn-Blot-Analyso und durch Sichtbarmachung dor Polypeptide mit Coomasio-Brillanlblau-Färbung odor mit anderen üblichen Mothodon beistimmen.

Οίο erfindung* lomäßon Polypeptide lassen sich durch jodos üblicho Vorfahren horstollon, z. B. durch oin Vorfahren, boi dom DNA-Rekombinations-Vorfahren vorwondot worden, odor durch Fost- odor Flüssigphason-Poptidsynthosj. Die orfindungsgomäßon Polypoptido, dio im wosontlichon oino wio in don Fig. 1- A angogobono Aminosäuro-Soquonz odor dio oinos Analogons odor Fragments davon habon, lasson sich durch oin Vorfahron horstollon, boi dom man dio folgondon Schritte durchführt:

a) Insortion eines wie vorstohond boschriobonon DNA-Fragments, d. h. oinos DNA-Fragmonts, onlhaltond oino im wesentlichen wio in Fig. 1 enge jobono Nuclootid-Soquonz odor oin Analogon odor oino Toilsoquonz davon, gogobononfalls in oinor gooignol rnodifi;iorton Form, in oinon Exprossions-Voktor,

b) Transformation oinos gooignoton Wirtsmikroorganismus mit dom in Schritt a) horgostollton Voktor:

c) Züchtung dos In Schritt b) hergestellton Mikroorganismus unter gooignoton Bedingungen odor Expression des Polypeptids; und

d) Ernton dos Polypoptids aus dor Kultur.

Das Vorfahren kann gogobononfalls oinon woitoron Schritt onthalton, boi dom das hergostcllto Polypoptid mindostons oinor Modifikation untorworfen wird.

In Schritt a) des Verfahrens kann dio gegebononfalls ausgeführte Modifizierung dor Sequonz vor odor nach dom Einbau der Sequenz in don Vektor erfolgon. Dio Modifizierung kann ausgeführt wordon, um das ausgohond von dor DNA-Soquenz oxprimierto Polypoptid an oinon gewünschton Zweck anzupasson, z. B. um oinos odor mohroro aktivo Zentren dos Polypoptids, wio vorstohond erläutert, zu modifizieren. Dio Modifikation kann Substitutionen, Additionen, Insertionon odor Doletionen von einem odor mohroron Nucleotiden in dor Sequenz odor oinor Kombination davon umfassen, woboi dio vorstohendon Erläutorungon dor Begriffe Substitution, Addition, Insortion, Umlagerung odor Dolotion von Aminosiiuro-Rosten in der Aminosäure-Sequenz zu berücksichtigen sind.

Die Transformation in Schritt b) des Vorfaluons kann in üblicher Woiso durchgeführt worden, beispiolswciso wie von Maniatis et al. (12) beschrieben. Die Züchtung des Wirtsmikroorganismus in Schritte!) dos Verfahrens kann in einem üblicherweise) für dio Fermentation vorwondoton und an don gowünschton Wirtsorganismus angopaßton Kulturmedium orfolgon und zwar unter pH-, Temperatur-, Belüftungs-Bedingungen otc, die an don gowünschtcn Mikroorganismus-Typ angepaßt sind, z. B. wio von Maniatis et al. (12) beschrieben.

In Stufo d) dos Verfahrens kann das Ernton dos Polypoptids oder oinos Analogons oder Fragments davon in üblicher Woiso, wie durch Fällung, Gelfiltration, lononaustausch-HPLC-Roversphasen-Chromatographio odor durch Immunaffinitäts-Chromatographio erfolgen.

Das hergestellte Polypeptid kann einer odor mehreren Modifizierungen untorworfen werclon, z. B. um ein oder mehrere aktive Zentren davon zu modifizieren, oder um ungewünschte Teile des Polypoptids zu entfernen, z. B. eine Signalsequnnz oder einen T(>l eines Fusionsproteins. Die Modifikation kann in üblicher Weise durchgeführt wordon, beispielsweise durch Temperaturbehandlung, Behandlung mit einem chemischen Stoff, wio Formaldehyd oder Glutaraldehyd, oder mit einem geeigneten protoolytischen Enzym, z. B. mit Trypsin, odor durch Substitution, Addition, Insortion odor Deletion von mindestens einer Aminosäure im Polypoptid in der vorstohond erläuterten Weise.

In einer anderen Ausführungsform des Verfahrens kann das Polypoptid oder ein Analogon oder Fragment davon nach üblichen Methoden der Flüssig- oder Festphasen-Peptidsyntheso hergestellt worden. Bei der Fostphasen-Synthese wird die Aminosäure-Sequenz durch Anhängen einor Startaminosäure an einen festen Träger und anschließendes sequentielles Anhängon anderer Aminosäuren der Sequenz über Peptidbindungon bis zur gowünchton Länge konstruiert. Dio Festphasensynthese läßt sich im wesentlichen wie von R. B. Merrifield (6) beschrieben, herstellen. Dor feste Träger, an don die Startaminosäuro gebundon wird, kann auch als Träger für oin erfindungsgomäßes Polypeptid dienen, wenn es gewünscht wird, das erfindungsgomäße Polypeptid an einen festen Träger zu binden.

In der anderen Ausführungsform vermittelt die Signalsoquonz den Transport dos erfindungsgomäßon Polypoptido bei der Herstellung nach DNA-Rekombinations-Verfahren, die nachstehend genauer boschrieben worden, aus der Zelle heraus, und das das rekombinante Polypeptid enthaltende Fermentations-Medium kann, so wie es ist, vor jeglicher Gewinnung oder Isolierung dos a-Amylase-Enzyms verwendet worden.

In einer anderem Ausführungsform botrifft die Erfindung einen in einem Wirtsorganismus zur Roplikation befähigten Voktor, der ein wie vorstehend beschriebenes DNA-Fragment trägt, d. h. ein DNA-Fragment, enthaltend eine im wesentlichen eine in den Fig. 1-5 gezeigte Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon oder ein a-Amylase-Gen, enthaltend das DNA-Fragment oder ein DNA-Fragment, das ein Anti-Senso-RNA-Molekül codiert, das mit einor von einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment transkribierten mRNA hybridisieren kann. Der Voktor kann entweder ein autonom replikativer sein, wie oin Plasmid oder einor, ck, zusammen mit dem Wirtschromosom repliziert wird, wie ein Bakteriophago oder die Randsequenzen von Ti-Vektoren. Zu Herstollungszweoken ist eier Vektor ein Expressions-Voktor, der das DNA-Fragment im für die Herstellung ausgewählton Organismus exprimieren kann. Daher ist der Expressions-Vektor ein Vektor, der die für die Expression erforderlichen regulatorischen Sequenzen trägt, wie den Promotor, ein Initiationssignal und ein Torminationssignal, etc. Der Vektor kann ebenso einer für dio Diagnose von a-Amylase Genen oder mRNAs von Kartoffeln und anderen Organismen soin. Zu diesem Zweck ist eine Expression nicht erforderlich. Verfahren zur Diagnose werden nachstehend weiter erläutert. In einor anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Organismus, dor ein, wie vorstehend definiertes, inseriertos DNA-Fragment, enthaltend eine im wesentlichen wie in den Fig. 1-5 gezeigte Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsequenz oder ein Analogon davon oder ein a-Amylase-Gen oder Pseudogen.onthaltond das DNA-Fragment oder ein DNA-Fragment, das ein zur Hybridisierung mit einer von einem erfindungsgemäßen DNA-Fragment transkripierten mRNA fähiges Anti-Sonse-RNA-Molekül codiert.

Der Begriff „inseriert" betrifft das DNA-Fragment (oder Toilsequenz oder Analogon, oder Gen oder Pseudogon), das in den Organismus oder einen Vorfahren davon durch genetische Manipulation inseriert wurde. Mit anderen Worten kann der

Organismus oinor soiii, dor nicht natürlichorwoiso odor schon an sich oin solchos DNA-Fragmont in soinom Gonom onthioll, oder oinor, dor natürlichorwoiso odor schon an sich oin solchos DNA-Frogmont onthiolt, jodoch in oinor goringoron Anzahl, so daß der Organismus mit dom insoriortcn DNA-Fragmont oino höhoro Anzahl solcher Fragmonto oufwoist als soino natürlich vorkommondon Gogonstücko.

Pas vom Organismus gotragono DNA-Frogmont kann Toil dos Qonoms dos Organismus soin odor von oinom wio vorstohond angogebonon Voktor gotragon worden, dor im Organismus onthalton ist. Das DNA-Fragmont kann im üonom odor im wio vorstohond angogobonon Expiossions-Voktor im Losorahmon mit oinom odor mohroron zwoiton DNA-Frogmonton vorlicgon, die oin zwoitos Polypeptid odor oinon Toil davon codioron, so daß oin Fusionsprotoin codiort wird, wio os z. B. vorstohond dofiniort wurde.

Der Organismus kann ein höhoror Organismus, wie oino Pllenzo soin, vorzugsweise oino dicotylodono Pflanze, wio oino Pllanzo der Familio Solanacoao, odor ein niederer Organismus, wio oin Mikroorganismus. Ein niodoror Organismus, wio oin Baktorium, z. D. oin gramnogativos Baktorium, wio oin Baktorium der Gattung Eschorichia, z. B. E.coli, odor oin grampositivos Baktorium, wio oinos dor Gattung Bacillus, z.B. B.subtilis, odor oino Hofe, wio oino dor Gattung Saccharomycos, odor ein Pilz, z.B. dor Gattin j Asporgillus, ist nützlich für dio Herstellung oinos, wio vorstohond ongogobonon, rokombinanton Polypoptids. Da dio moisten Organismen schon von Natur aus a-Amylaso bildon, kann os wünschonswort soin, dio natürlich vorkommondo a-Amylaso-Produktionzumodifizioron, d.h. zu stoigorn, zu vorminclornoderzu zerstöron, so daß dio von Natur aus vorkommende a-Amylaso-Produktion nicht die Horstollung oinor orfindungsgomäßon a-Amylaso booindußt. Es kann jodoch vorteilhaft sein, daß der für oino gewünschte rekombinanto Horstollung vorwondoto Mikroorganismus obonso soino natürliche a-Amylaso bildot, z.B., um einen additivon Effokt zwischon don boidon gobildoton a-Amylason zu orhalton. üio rekombinanto Horstcllung wird nachstehend gonauor boschriobon.

Boispiolo solchor Mikroorganismen sind dor Stamm E.coli K-12, dor das Plasmid pAmyZ3 onthalt und boi dor Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) am 4. April 1989 unter dor Hintorlogungsnummor DSM 5275 nach don Vorschriften dos Budapostor Vortragos hinterlegt wurdo, dor Stamm E.coli K-12 onthaltcnd das Plasmid pAmyZ<1, das boidor Doi tschon Sammlung von Mikroorganismen am 4. April 1989 untor dor Hintorlogungsnummor DSM 0276 nach don Vorschriften dos Budapester Vortragos hinterlegt wurdo, E.coli, enthaltend das Plasmid pAmyZ7, das boi der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen untor der Hinterlogungsniimmer DSM 5884 am 18. April 1990 nach don Vorschriften dos Budapostor Vortragos hinterlegt wurdo, E.coli, onthaltond das Plasmid pAmyZ1,dasboidor Deutschen Sammlung von Mikroorganismen untor dor Hinterlegungsnummer DSM 5882 am 18. April 1990 nach den Vorschriften dos Budapester Vortragos hinterlogt wurdo, und E.coli, enthaltend das Plasmid pAmyZ6, das bei dor Deutschon Sammlung von Mikroorganismen unter dor Hinterlegungsnummer DSM 5883 am 18. April 1990 nach don Vorschriften des Budaposter Vertrages hinterlegt wurde. Dor Organismus kann auch eine Zollinio, z.B. eine Säugerzollinic, oder vorzugsweise oino Pflanzonzellinio sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Organismus eine Pllanzo, d. h. eino genetisch modifizierte Pflanze, wie sie nnchstohond genau boschriobon wird.

In oiner woitoron Ausführungsform betrifft dio Erfindung oin genetisches Konstrukt zur Inhibition dor Translation cinos mRNA-Moloküls, das von einem wio vorstehend beschriebenen DNA-Fragrnont codiort wird und eino im wosontlichon wio in don Fi'j. 1-5 gozeigte Nucleotid-Sequenz oder oino Teilsoquenz odor oin Analogon davon enthält. Dieses Konstrukt enthält; (1) eine rogulatorische Sequenz, die funktionoll vorbundon ist mit (2) oinom wio vorstehend beschriebenen DNA-Fragment, das oin zur Inhibition dor Translation dor intrinsischon a-Amylaso-mRNA fähiges RNA-Molokül codiort, wobei das DNA-Fragmont oino im wesentlichen wio in don Fig. 1-4 gezoigto Nuclcotid-Scquonz in entgegengesetzter Orientierung oder oin Analogon odor eino Teilsequenz davon enthält, und (3) oino Transkriptions-Torminations-Scquenz, dio funktionoll mit dom DNA-Fragment (2) verbunden ist. Das Prinzip dieses genetischen Konstrukts ist die Konstruktion einer genetisch modifizierten Pflanze, in der die a-Amylase-Produktion so veimindort ist, daß oino Pflanze mit oiner verminderten u-Amylase-Aktivität orhalton wird. Beispielsweise wird das genetische Konstrukt bei der Konstruktion oiner gonotisch modifizierten Kartoffelpflanzo mit oiner verminderton a-Amylaso-Aktivität verwendbar soin, wodurch sich oino verminderte Menge reduzierender Zucker in der Pflanze ergibt, d. h. eine als Rohmaterial zur Chips-Horstellung verwendbare Kartoffelpflanze. Wenn das genetische Konstrukt zur Konstruktion einer Kartoffelpflanzo zu diesem Zweck verwendet werden soll, beruht das DNA-Fragment vorzugsweise auf einer Nucleotid-Sequenz, die komplementär zu einer in Kartoffelknollen gut exprimierten Sequenz ist, oder auf einer, die ein ausreichend hohes Ausmaß an Homologie (d. h. sie hybridisiort untor den oben angegebonon Bedingungen) mit einer a-Amylase-mRNA dor Knollo hat, üblicherweise einer die normalerweise in oinsm anderen Gowobo als der Knollo oxprimiert wird, wie in Keim oder Blatt. In oinor anderen Ausführungsform kann dio Nucleotid-Sequonz von einem Psoudogen transkribiert sein.

Die Bedingungen, unter denen dar onetische Konstrukt verwendet wird, sollten sicherstellen, daß das vom genetischen Konstrukt exprimierte Anti-Sonse-RNA-Molekül mit einer von don intrinsischon a-Amylase-Gonen transkribierten mRNA hybridisieren kann. Vorzugsweise ist das genetische Konstrukt in derselben ZeIIo odor in demselben Gewebe aktiv, in denen dio intrinsischon a-Amylaso-Gono aktiv sind. Vorzugsweise ist das genetische Konstrukt stabil in das Gonom integriert, um damit dio Vererbung von Generation zu Generation zu gewährleisten. Zur Reduktion der Menge reduzierender Zucker in einer Kartoffelpflanze verwendbare genetische Konstrukte worden in Beispiel 24 genauer beschrieben.

Wie vorstehend ausgeführt, kann es vorteilhaft sein, einen Organismus mit einer (gegenüber dem natürlich vorkommenden Organismus) erhöhten a-Amylase-Aktivität zu konstruieren. Vorzugsweise ist der Organismus eine Pflanze, insbesondere eino Kartoffelpflanze. Eine Kartoffelpflanze mit einer erhöhten a-Amylase-Aktivität gegenüber dor natürlich vorkommenden Kartoffol läßt sich als Rohmaterial zur Herstellung von Spirituosen verwenden, da eine erhöhte a-Amylase-Aktivität zu oiner erhöhten Menge reduzierender Zucker in der Kartoffol führt, was vorteilhaft für dio Herstellung von Spirituosen ist. Dementsprechend betrifft die Erfindung auch ein genetisches Konstrukt, das sich zur Herstellung eines wio vorstehend beschriebenen Polypeptide eignet, d.h. einom von einem erfindungsgomäßen DNA-Fragment enthaltend eine im wesentlichen wio in Fig. 1 oder 2 gezeigten Nucleotid-Sequenz oder eine Teilsoquonz oder ein Analogon davon oder ein a-Amylase-Gen codiorten Polypeptid. Dieses Konstrukt enthält (1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit (2) einem wie vorstehend dofinierten, das Polypeptid codierenden DNA-Fragment (3) eine Transkriptions-Terminations-DNA-Sequonz, die funktionell mit dem DNA-Fragment (2) verbunden ist. Vorzugsweise wird das zur Herstellung eines erfindungsgomäßen Polypeptide, z. B. einer α-Amy läse oder einem Teil davon, verwendbare genetische Konstrukt zur Konstruktion einer Pflanze vorwendet, die eine erhöhte a-Amylase-Aktivität im Vergleich zur das genetische Konstrukt nicht enthaltenden Pflanze hat. Eine genetisch modifizierte Pflanze mit einer erhöhten α-Amylase-Aktivität ist vorteilhaft für bestimmte industrielle Anwendungen, wie für die Bereitstellung

eines Kartoffol-Rohmatorials mit einom höhoron Golialt an roduziorondon Zuckorn als Ergebnis oinor hähoron a-Amylaso-Aktivität. Boi dor Konstruktion ninor Pflanze mit oinor erhöhten a-Amylase-Aktivität soll das gonotischo Konstrukt in einom Gowobo oder oinor ZoIIo, in don )n dio a-Amylaso für dio gowünschto Aktivität orfordorlieh ist odor aus donon dio a-Amylaso zum Wirkungsort transportiert wird, aktiv soin. Vorzugttwoiso wird das gonotischo Konstrukt in Vorbindung mit oinom ondoron u-Amylaso-Gen inseriert und kann gogobononfalls unter dor Kontrollo dor rogulotorischon a-Amylitso-Soquonz dor Pllanzo inseriert werdon, so daß koino zusätzliche rogulatorischo Soquonz orfordorlich Ist. Ein zur Horstellung oinos wio vorstohond boschriobonon Polypeptide, d.h. oinor a-Amylaso odor einem Toil davon, vorwondbaros gonotischos Konstrukt kann in oinor andoren Ausführungsform oin wio vorstohond boschriobonos orfiiulungsgomäßos a-Amylaso-Uon onthalton, aus dom dor Promotor ontfornt wurdo, wobei das Gen mit oinor zur Stouorung dor Transkription dos Gons fähigon rogulatorischon So(|uonz, vorzugsweise oinom Promotor vorbunden ist. Ein gonotischos Konstrukt, onthaltond oin a-Amylaso-Gon olino oinon Promotor, kann in dio Pdanzo, d.h. oino Kortoffolpflanzo, insoriort worden, in dar eine orhöhto a-Amylaso-Aktivität gewünscht wird. Dio in don vorstohond boschriobonon gonotischon Konstrukton onthalleno rogulatorischo Sequenz ist vorzugswoiso oin Pflanzonpromotor, wio ein konstitutiver oder reguliorbaror PManzenpromotor. Dor Promotor kann, wio vorstohond boschriobon, ausgestaltet soin. Wenn das genetische Konstrukt in oinor genetisch modifizierten Kartoffolpflanzo vorwondot worden soll, ist der Promotor vorzugsweise ein Pflanzenpromotor, der dor CaMV-Promotor odor dor NOS-Promotor, dor α-Amylaso-Promotor odor dor Promotor oinos Kartoffol-Polyubiquitin-Gons soin kann. Dios sind nur zur Erläutorung angogobono Ooispiolo von Promotoren. Andoro Soquonzon könnon diosolbo Aufgabo übornohmon. Dio Transkriptions-Tcrminations-Soquonz dos gonotischon Konstrukts ist oino Nuclontid-Soquenz, dio die Termination dor Transkription oinos DNA-Fragmonts und dio Bereitstellung oinos Polyadonyliorungs-Signals bewirken kann. Vorzugsweise ist sie von oinor Pllanzo abgeleitet, d. h., sio ist vorzugswoiso oino Pflnnzon-Transkriptions-Torminations-Soquonz. Sio kann vom a-Amylaso-Gon solbst abgoloitot soin. Das gonotischo Konstrukt kann außordom mit oinom Markör boroitgcstollt wordon, der dio Solnktion dos gonotischon Konstrukts in oinor Pflanzenzolle gostattot, in die er eingoführt wurdo. Es sind vorschiodono Markör bekannt, dio in Pflanzonzollon vorwondct worden können, insbesondere Marker, dio eine Antibiotika-Resistenz bewirken. Zu dioson Markorn gohöron dio Rosistonz gogen G418, Hygromycin, Bleomycin, Kanamycin odor Gontamycin.

Wie vorstehend erliiutort, wird das gonotischo Konstrukt vorzugswoiso zur Modifizierung oinor Pf lanzo vorwondot. Somit botrifft dio Erfindung auch eine genetisch modifizierte Pflanze, dio in ihrem Gonom oin wio vorstohond boschriobonos gonctischos Konstrukt enthalt. Das gonotischo Konstrukt kann orfindungsgomäß die a-Amylaso-Aktitivität vermindern odor zu oinor Erhöhung dor a-Amylase-Aktivität führen. Die Erfindung betrifft daher außordom eine genetisch modifiziorto Pflanzo, dio oino erhöhte oder verminderte a-Amylaso-Aktivität im Vorgloich zu oinor entsprechenden nichtmodifizierton Pflanzo aufweist. Es wird daneben häufig erwünscht sein, daß in der genetisch modifizierten erfindiingsgomäßon Pflanze die a-Amylaso-Aktivität durch unterschiedliche Faktoren gesteuert werden kann, z. B. durch Faktoron wie Temperatur. Wenn dio fragliche Pflanze beispielsweise eine Kartoffelpflanze ist, wird es für bestimmte Zwecke wünschenswert sein, dio a-Amylase-Aktivität bei verhältnismäßig niedrigen Temperaturen rogulioron zu können, z.B. zu vormindern, so daß die Kartoffoln boi niedrigen Temperaturen ohno die Umwandlung von Stärko zu reduzierenden Zuckorn golagort werden könnon. Somit botrifft die Erfindung außerdem eine genetisch modifiziorto Pflanzo, in der dio a-Amylaso-Aktivität boi niodrigon Temperaturen reguliert worden kann, insbesondere bei Temperaturen unterhalb von otwa 8°C.

Eine genetisch modifizierte Pflanze kann auch Anti-Sonse-mRNA horstellen, die die Stärkezersetzung durch Hybridisierung an eine von einem a-Amylase-Gen transkribierte niRNA vermindert. Deshalb botrifft die Erfindung forner eine gonotisch modifizierte Pflanze, insbesondere Solanum tuborosum, die eine zur Hybridisierung an eine von oinom wio in don Fig. 1-4 gezeigten DNA-Fragment transkribierte mRNA hybridisiert und dadurch deren Translation inhibiert und die Stärkozersotzi/ig im Vergleich zur entsprechenden nichtmodifizierten Pflanze vermindert.

Wie vorstehend erläutert, wird erwartet, daß von anderen dicotyledonon Pflanzen als der Kartoffel abgeleitete a-Amylaso-Gene ein hohes Ausmaß an Homologie mit einem erfindungsgemäßen DNA-Fragmont haben, das die im wesentlichen in den Fig. 1-5 angegebenen Nuclootid-Soquenz oder eine Toilsoquonz oder ein Analogon oder oin wie vorstehend beschriebenes erfindungsgemäßos a-Amylaso-Gon enthält. Somit ist die durch das erfindungsgemäße genetische Konstrukt zu modifiziorondo Pflanze vorzugsweise eine dicotylondone Pflanze, da das genetische Konstrukt erwartungsgemäß in solchen Pflanzen aktiv ist, insbesondere im Hinblick auf die Verminderung des a-Amylase-Gohalts in dor Pflanze, da ein hohes AusmaP an Homologie von solchen Konstrukten erwartet wird. Vorzugsweise gehört die Pflanzo zur Familie Solanaceae, insbesondere dei Gattung Solanum, insbesondere Solanum tuborosum. In einer anderen Ausführungsform kann die in den Fig. 1-5 gezeigte Nucleotid-Sequonz zur Isolierung entsprechender Sequenzen aus anderen Pflanzen verwendet werden, worauf sie, wie hier beschrieben, modifiziert werden kann.

In den letzten Jahren haben sich großo Bemühungen darauf konzentriert, zweckmäßige Methoden zur Konstruktion neuer Pflanzen oder Pflanzenzellen zu entwickeln, die spezifische und gewünschte Eigenschaften aufweisen. Eine Reihe solcher Methoden beruhen auf DNA-Rekombinations-Techniken, und mittlerweile sind geeignote Pflanzon-Transformations-Systeme verfügbar. Es wird davon ausgegangen, daß die erfindungsgemäßen Pflanzen, z. B. Pflanzen mit den vorstehend beschriebenen Eigenschaften, jn einfacher Weise durch diese üblichon Methoden konstruiert werdon können. Beispiele davon werdon nachstehend genauer boschrieben.

Das grundlegende Prinzip der Konstruktion genetisch modifizierter Pflanzen ist die Insertion von genetischer Information in das Pflanzengonom, um eine stabile Beibehaltung des inserierten genetischen Materials zu erhalten. Es gibt mehrere Techniken zur Insertion der genetischen Information, wobei die beiden Hauptprinzipien die direkte Einführung der genetischen Information und die Einführung der genetischen Information mit einem Vektor-System sind. Somit botrifft die Erfindung in einer weiteren Ausführungsform ein Vektor-System, das ein wio vorstehend definiertes genetisches Konst'ukt trägt und zur Einführung des genetischen Konsti ukts in das Genom einer Pflanze fähig ist, wie einer Pflanze der Familie Solanaceae, insbesondere der Gattung Solanum, insbesondere Solanum tuberosum. Das Vektor-Systom kann einen Voktor enthalten. Vorzugsweise enthält es jedoch zwei Vektoren. Falls zwei Vektoren vorliegen, wird das Vektor-Systom üblicherweise als binäres Vektor-System bezeichnet. Binäre Vektor-Systome worden genauer in (53) „Binary vectors" beschrieben. Ein ausgiebig angewendetes System zur Transformation von Pflanzenzellen mit einem vorgegebenen genotischon Konstrukt, z. B. einem wie vorstohend beschriebenen, beruht auf der Verwendung eines Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens oder eines Ri-Plasmids aus Agrobacterium rhizogenes; vgl. (42), (54). A. tumofaciens ruft bekannterweise Wurzelhalsgallen in Pflanzen hervor, worauf sich das Wachstum von Pflanzengowebe ergibt, das eines oder mehrere Aminosäure-Derivate bildet, die normalerweise nicht von der Pflanze

gobildot wordon und als Opino bekannt sind, Diosos Gowobo läßt sich zu vollständigen Pflanzon rogonorioron, din hostimmlo transforniiorto Phonotypon boibohalton, z.B. Phonotypon, die von Ti- odor Ri-Plosmicl-Soquonzon codiort wordon. Dio Ti- und Ri-Plasniido Wagon sogonannto T-DNA („tronsforlorte" DNA), dio in Tumoren stabil in das Gonom dor Wirtspflanzo intogriort gofundon wurde, und fornor oinon Virulonz-Boroich, dor wosontlich Wr dio Bildung von Pllonzontumoren ist, nbor nicht in doron Aufrochtorhaltung verwickelt ist. Din natürliche T-DNA onthitlt mohrore Gono, woboi jodos untor dor Konirollo oinos T-DNA-Promotors steht. Forner enthält sic ..η dor Roplikolion dos Plasmids botoiligto genetische Information. Dm T-DNA-Promotoron ähnoln in ihrer Struktur ouknryontischon Promotoren und (unktionioron anschoinond nur in dor Pflanzon-Wirtszollo. Fromd-DNA, z.B. ein orfindungsgomäßos DNA-Fragment, laßt sich loicht In ein Ti- oder Ri-Plasmicl nach üblichon Mothodon im Boroich dor Genmanipulation insorioron. Somit kann das Ti- oder Ri-Plasmicl als Vektor für das Überführen von gonotischor Information in oino geeignete Pflanzonzollo vorwondot wordon. Vor clor Anwonclung dos Ti- oder Ri-Plasmids als Voktor wordon din an dor Bildung von Tumoron botoiligten Gono vorzugswoiso ontfornt, um jojiicho Beeinträchtigung durch dioso Gono zu vormeidon. Mohroro untorschiodlicho Ti- und Ri-Plasmido wurden konstruiort, dio zur Konstruktion oinos vorstehend boschriobonon Pflanzon- odor Pflanzonzoll-Konstrukts gooignot sind. Nicht als Beschränkung zu intorprotiorondo Boispiolo solchor Ti-Plasmido wordon nachstehend in Boispiol 25 aufgozoigt. Ein woitoros Boispiol ist das Plasmid pGV3850. Vorzugsweise trägt dor zu vorwondonde Voktor gooigncio Markör, z.B. oino Antibiotika-Rosistonz odor Horbizid-Rosistonz codiorondo Gono, so daß man bestimmen kann, ob dio DNA-Insortion in clor gowünschton Loge in das Plasmid insoriurt ist und außordem mit dom Voktor transformierte Pflanzonzollon soloktioron kann.

Das erfindungsgemäßo, in das Ti-Plasmid zu insoriorondo DNA-Fragmont soll vorzugsweise zwischon den Endso(|uonzon clor T-DNA oclor bonachbart zu einer T-DNA-Sequenz insoriort wordon, um oine Unterbrechung clor unmittelbar dio T-DNA-Endsoquonzon umgobondon Soquonzon zu vormoidon, da mindestens oinor diosor Boroicho anschoinond ossontioll für die Insertion der modifizierten T-DNA in das Pflanzongonom ist.

Aus clor vorstehend ongogobonen Erklärung orgibt sich, daß das erf indungsgomäßo Vektor-Systom vorzugsweise oino Virulonz-Funktion onthält, die zur Infoktion dor Pflanzo fähig ist, und forner mindestens einon Rnndtoil oinor T-DNA-Scquonz, woboi der Randtoil auf domsolbon Voktor wio das gonotischo Konstrukt liogt. Außorclom ist das Voktor-Systom vorzugswoiso oin Agrobactorium tumofacions-Ti-Plasmid oder ein Agrobactorium rhizogones-Ri-Plasmid oder oin Derivat davon, da dioso Plasmido gut bekannt sind und woitläufig bei clor Konstruktion transgonor Pflanzon vorwondot wordon. Es gibt viele Vektor-Systomo, dio auf diesen Plasmiden oder auf Derivaten davon basioron.

Boi clor Konstruktion oinor transgonon Pflanzo mit oinom Voktor wird bovorzugt, daß das in dio Pflanzo zu insoriorende gonotischo Konstrukt zuorst in oinom Mikroorganismus konstruiort wird, in dom dor Voktor ropliziorbar ist und dor einfach zu manipulioren ist. Ein Beispiel eines nützlichem Mikroorganismus ist E.coli. Es könnon jedoch auch andere Mikroorganismen mit den vorstehenden Eigonschsftoi V3rwondot werdon. Wonn ein Vektor oinos wio vorstohond angogobonen Voktor-Systems in E.coli konstruiert wurde, wird er gogobononfalls in einon geeigneten Agrobactorium-Stamm transferiert, z. B. in Agrobactorium tumefiicions.

Somit wird das orfindungsgomäßo DNA-Fragmont tragende Ti-Plasmid vorzugsweise in einon gooignoten Agrobactorium-Stomm üborführt, z. B. A. tumofacions, um auf dioso Weise oino das orfinduncisgemäßo DNA-Fragmont tiagendo Agrobactorium· Zolle zu erhalten, woboi die DNA anschließend in die zu modifizierende Pflanzonzollo üborführt wird. Diese Transformation läßt sich durch oino Anzahl von Methoden durchführen, z. B. wio in (53) und in der EP-A0122791 beschrieben. Bei Kartoffeln und anderen Solanaceao wird jedoch moistens dio Infektion von Blattstückon mit A. tumofacions durchgeführt; vgl. (7¹) Die direkto Infoktion von Pf lanzongowobon durch Agrobactorium ist oin oinfachos Vorfahren, das häufig angowen^et und in (54) beschrieben wird. Üblicherweise wird dio zu infizierende Pflanze verwundet, z. B. durch Schnoidon dor Pflanzo mit einor Rasierklinge odor durch Punktion dor Pflanzo mit einer Nadel oder Roiben der Pflanzo mit einem Schmiergelmittel. Die Wunde wird sodann mit Agrobacterium infiziert, z.B. in Form einor Lösung. In einor anderen Ausführungsform wird dio Infektion einer Pflanzo auf einom Teil oines Pflanzongewobes durchgeführt, z. B. auf einem Toil eines Blattes, einer Wurzel, einos Stengels oder eines anderen Toils der Pflanze. Die infizierte Pflanze oder der infizierte Pflanzontoil werdon sodann in einem geoignoton Kulturmecliu ί gezüchtet und zu roifon Pflanzen horangozoqen.

Wenn Pflanzenzellcn konstruiort wordon, können diose Zellen nach üblichen Gowebe-Kultur-Verfahren gozüchtot und gehalten werdon, wio durch Züchtung der Zellon in oinom geeigneten mit den trforderlichen Wachstumsfaktoren, wio Aminosäuren, Phytohormonnn odor Vitartvnen, angereicherten Kulturmedium.

Es wird davon ausgegangen, daß oin orfindungsgomäßos DNA-Fragment, insbosondore dosson regulotorischo Sequenzen, bei einem Vorfahren zur Expression anderor als dor orfindungsgomäßon Polypeptide, z.B. von nicht mit α-Amylaso verwandten Prot jinen oder Enzymen, verwendet werdon kann. Insbesondere gilt dios für die Herstellung pflanzlicher Polypeptide, die normalerweise in bestimmten Entwicklungsstadion oder in gowobo- oder zellspezifischor Weise entsprechend der Art der Expression der a-Amylase exprimiert werden, jedoch auch für andere gewünschte biologische Substanzen, z.B. pharmazeutische Produkte, Farbstoffe, Geschmacksstoffe, Phytohormone, primäre oder sekundäre Metaboliten, die entweder direkt durch Expression einer sie codiorenden DNA-Soquenz hergestellt werden können oder als Ergebnis der Wirkung der von der DNA-Sequenz exprimiorten Substanz hergestellt werden. Wie vorstehend beschrieben, ist die Expression des a-Amylase-Gens charakteristisch für Enzyme codierende Gene (im Gegensatz zu Strukturproteinen oder Speichorprotoinen), d.h. der Expressionsspiegel ist verhältnismäßig niedrig und liegt in der Größenordnung von etwa 0,01 %a-Amylaso-mRNA der GesamtmRNA, ausgewertet auf Grundlage der Cloniorungshäufigkeit.

Genauer gesagt, lassen sich auch andere Polypeptide mit einem Konstrukt exprimioron, das einon normalerweise bei dor Transkription eines α-Amy lase-Gens mitwirkenden regulatorischen Bereich enthält, z. B. einen α-Amy lase-Promotor, sowie eine das herzustellende Polypeptid codierende DNA-Sequenz, wobei diese so miteinander verbunden sind, daß die Expression der DNA-Sequenz untor dor Kontrolle dos regulatorischen Boreichs erfolgt. Dieses Konstrukt läßt sich beispielsweise wie vorstehend beschrieben in ein geeignetes Pflanzon-Transformations-System insorioron und kann in das Genom einer Pflanze eingeführt worden, in dem es stabil beibehalten und exprimiert wird.

Wie sich aus der Einleitung dieser Beschreibung ergibt, kann das orfindungsgemäße DNA-Fragment für diagnostische Zwecke verwendet werden. Dies wird nachstehend näher erläutert.

Unterschiedliche Formen der Diagnose lassen sich mit dem erfindungsgemäßen DNA-Fragment durchführen. In oinor gogebenon Probe lassen sich a-Amylase-mRNAs sowohl qualitativ als iuch quantitativ durch Hybridisierung mit dom erfindungsgemäßen DNA-Fragmsnt unter für diese Hybridisierung geeigneten Bedingungen bestimmen. Außerdem lassen sich

in oinom Organismus, wie einer Pflanzo, vorliogondo a-Amyloso-codiorondo Gono mit dom orf indungsgomäßon DNA-Fragmont identifizieren und isolioron, z. B. durch Absuchon oinor Gonbank olnos solchon Organismus.

Wonn das DNA-Fragment für diagnostische Zwocko vorwondot worilon soll, ist os hitufig zweckmäßig, os mit oinor für (lon Nnchwois verwondbnron Markiorung zu vorsohon. Somit botrifft dio Erfindung in oinor nndoron Ausführungsform ein wio vorstohond boschriobonos DNA-Fragment, das oino Markiorung aufweist. Vorzugswoiso ist dio Markiorung ein Fluorophor, oin radioaktives Isotop odor oin komploxbildondor Stoff wio Diotin.

Boispiolo von als Markiorungssubstanzon vorwondbaron Isotopoii sind ¹M, "C, ¹⁶S und ³¹P. Dio von dioson Isotopon abgostrnhlto Radioaktivität kann in oinom Gamma-Zählor, oinom Scintillntions-Zöhlor odor durch Autoradiogrophio und anschlioßondo Densitomotrio in üblichor Woiso gomosson werdon.

Komploxbildendo Stoffo sind z. B. Protein A, Biotin (das oino Komplex mit Avidin und Stroptavidin bildet) odor Locitin. In diosom Fall ist clor Komplex selbst nicht direkt nachwoisbar, so doß dio Markiorung dor Substanz erfordorlich i: ι, mit dor dor Komplexbildner einen Komplex bildot. Dazu können boliobigo dor vorstohond gonannton Markierungen vorwondot wordon. In einer woitoron Ausführungsform botrifft dio Erfindung oin Vorfahron zur Isolierung oinos a-Amylaso-Gons odor oinor a-Amylaso-mRNA aus oinom Organismus, z. B. oiner Pflanzo, insbosondoro aus oinor dicotylodonon Pflanzo. Boi diosom Vorfahron wird oino Nucloinsä uro-onthaltondo, aus oinor Gonbank odor oinor cDNAGonbank oinos Organismus orholtono Probo mit einem orfindungsgoma'ßnn DNA-Frogmont, das oino im wosontlichon wio in don Fig. 1-5ongogobono Soquonzodor oino Toilsoquonz odor oin Analogon davon onthält, gogobononfalls in morkiotter oder donaturiortor Form, odor mit einer RNA-Kopio davon unter für dio Hybridisiorung zwischon dom DNA-Fragmont odor dor RNA-Kopio mit dor Nucloinsouro dor Probo günstigon Bedingungen in Borührung gebracht und dor hybridisiorondo Clon wird gowonnon, um oin a-Amylaso-Gon odor oino mRNA-Kopie dos Organismus zu orhnlton.

Boi der Identifizierung und Isolierung oinos α-Amylase-Gons oder cDNA-Clons in oiner Probo mit dom orfindungsgomäßen DNA-Fragment kann in üblichor Woiso durchgeführt werdon, z. B. wio von Maniotis in (12) boschriobon. Boispiolsweiso wird zur Charakterisierung eines a-Amylaso-Gons in anderen Pflanzon dio Anwendung üblicher Southorn-Tochnikon bovorzugt, z. B. wio in Beispiel 16 und in „Material und Mothodon" boschriobon.

In oiner weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung oin Vorfahron zur Quantifizierung des a-Amylaso-mRNA-Gohalts in unterschiedlichen Gewoben eines Organismus, z. B. einor Pflanzo, insbosondoro oinor dicotylodonon Pflanzo. Dnboi wird oino vom Organismus orhaltone Nucloinsäureonthaltondo Probo mit oinom gogobononfalls markiorton odor donaturiorton orfindungsgemäßon DNA-Fragment, enthaltend eine im wosontlichon wio in don Fi(j. 1-4 gozoigto Nuclootid-Soquonz odor oino Toilsoquonz odor oin Analogon davon, odor mit einor RNA-Kopio davon untor für die Hybridisiorung zwisc'ion dom denaturiorten DNA-Fragment odor der RNA-Kopio mit dor RNA dor Probo günsiigon Bodingungon in Borührung gebracht und dio Mengo hybridisierter Nuclainsäure wird bestimmt; vgl. [AO).

Die Messung der a-Amylase-mRN Λ kann wichtig soin, da angenommen wird, daß os oino Vorbindung zwischon dom α-AmylasomRNA-Gehalt in einer Zelle und der Mongo gt Jildoten a-Amylaso-Enzyms gibt. Die Bestimmung des a-Amylaso-mRNA-Gohalts UUt sich somit für die Pflanzonzüchtung vorwondon, z.B. wenn dor charakteristische Gehalt einor Pflanzo an roduzierondon Zuckern mit einem andoron Merkmal kombiniort wordon soll.

Die Hybridisierung sollte nach üblichen Hybridisierungsv^r fahren untor gooigneton Bodingungon im Hinblick auf z. B. Stringenz, Inkubalionszoit, Temperatur, das Verhältnis zwischen dem zur Identifizierung anzuwendenden orfindungsgomößen DNA-Fragment und der zu untersuchondon Probe, Puffer und Solzkonzontration odor andoron für die Hybridisioruiig wichtigon Bedingungen durchgeführt werden. Dio Auswahl der Bedingungen hängt untor anderem vom Ausmaß der Komplemontarität zwischon don zu hybridisiorondon Fragmenten ab, d.h., ein hohes Ausmaß an Komplementarität orfordert stringontore Bedingungen, wio niedrige Salzkonzontrationen, niedrige lononstärke dos Puffors und höhore Tomperaturon, wogegen oin niedriges Ausmaß an Komplomontarität woniger stringente Bedingungen orfordort, z.B. höhere Salzkonzentrationon, höhoro lonenstärke des Puffers oder niedrigere Temporaturen, damit oino Hybridisiorung stattfindet.

Der Träger, an den dio DNA- oder RNA-Fragmonte der zu untersuchondon Probe in denaturierter Form gebunden worden, ist vorzugsweise ein festes Trägermaterial und kann irgondeino günstige Gestalt haben. Somit kann or boispiolswciso als Platte z. B. als dünne Schicht oder als Mikrotitorplatto, als Stroifen, als Fastpartikel, z.B. als Korn wie als Latexkorn, als Filter, als Film oder als Papier vorliogen.

Das feste Trägermaterial kann aus einom Polymer aufgebaut soin, vorzugswoiso aus Nylon oder Nitrocellulose. Das zum Nachweis dos Vorliegons des a-Amylaso-Gons verwendete DNA-Fragment ist vorzugsweise markiert, z.B. wio vorstehend beschrieben, und das Vorliegen hybridisiorendor DNA wiru urch Autoradiographio, Scintillationszählung, Lumineszons oder durch chemische Umsetzung bestimmt.

Eine andere Möglichkeit zum Nachwois dos Vorliogons oinos spezifischen α-Amyloso-Gons, ζ. B. eines durch dio vorstehend beschriebenen gonotischon Vorfahron in einon Organisrr - , wio eine Pflanze, insbesondere oine dicotyledono Pflanzo, oin'V ührtos a-Amylase-Gen odor ein Teil davon, ist die Anwendung dor Polymorase-Ketten-Reaktion (vgl. [5]), d.h., os wird ein Verfahren verwendet, in dem das a-Amylaso-Gon oder don Teil davon enthaltende, in einer Probe vorliegende DNA-Fragment einer vielfachen Amplifikation unterworfen wird. Die Polymorase-Ketten-Roaktion (PCR) ist oin für die Amplifikation einer DNA i;i einer Probe verwendetes Verfahren. Das Verfahren boinhaltot die Verwendung von zwoi Oligonucleotid-Primern, dio das zu amplifizierende DNA-Fragmont flankieren. Die Oligonucleotid-Primer können beispielsweise 10 bis 20 Nucleotide enthalten und enthalten die flankierenden Bereiche des a-Amylase-Gens odor eines Teils davon. Die Oligonucleotid-Primer worden so konstruiert, daß ein Primer am Plus-Strang, und zwar 5'seitig der Ziel-DNA, und der andere Primer am Minus-Strang, und zwar 5'seitig dor Ziel-DNA hybridisiert. Die Primer werden mit don entgegengesetzten, zu amplifizieronden DNA-Strängen hybridisiert und mit DNA-Polymorase, z. B. dem Klonow-Fragmont dor E. coli-DNA-Polymoraso I odor einer anderon verwendbaren DNA-Polymerase, wie der Taq-DNA-Polymerase, verlängert, so daß eine zur DNA-Sequenz, on die die Primer angelagert sind, komplementäre DNA-Sequenz synthetisiert wird. Nach der Synthese dieser komplementären Sequenzen wird die synthetisierte DNA denaturiert, z.B. durch Erhitzen von den „parentalen DNA-Strängen" abgotrennt, und die parontalenSträngo sowie die neu synthetisierton DNA-Stränge werdon einem erneuton PCR-Amplifikationszyklus unterworfen. Auf diese Woiso läßt sich eine wesentliche Amplifikation spezifischer DNA-Sequonzon erzielen, die in dem zu analysierenden Organismus enthalton sind. Durch die Anwendung des PCR-Amplifikations-Verfahrens ist en möglich, a-Amylaso-codierenoo DNA-Sequenzen in S6hr kloinen Proben, z. B. in Embryos oder selbst in Einzelzellen nachzuweisen

Die nach den vorstehend beschriebenen Methoden auf den Gehalt an einom a-Amylase-Gon odor einem Teil davon zu

unttusuchondo Probo konn aus Pflamontoilon, wio Blättern, Stongoln, Knollon, Blüten, Wurzeln, Koimlingon, Schößlingen odor Samen, ontnommon vvordon.

Dio vorstehend zum Nachweis oinos Qohalts an α-Amylaso-Gonon odor mHNAs in oinor Probo könnon von bosorulorer Wichtigkeit boi PflanzenzüchtungsProgrammon sein. Kartoffolsorton könnon auf dor Gruncllngo dor Beobachtungen, daß dor Gehalt an culuziorondon Zuckorn in golagorton Kartoffeln wio lit don Boisplolon boschriobon mit dor ci-Amylaso-Aktivitöt korroliort ist uml daß sich dieso Korrelation auch auf Schößlinge und vormutlich auf andoro Toilo, wio Diättor, orstrockt, auf ihro Tondonz abgosucht vvordon, Zuckor in golagorton Kartoffoto schon in oinom Stadium zu akkumulioron, wonn dio jungon Pflanzen ein paar üläuor gebildot habon, d.h. in olnom sohr frühen Stadium. Oios laßt sich boispiolswoiso durchführen durch Auftupfen von RNAExtrakton aus 0,1-0,5 g ßlattmatorial (z.B. orhalton wio nachstohond in „Matorialion und Mothodon") auf zur Mybridisiorung gooignoto Filtor und durch Hybridisiorung mit oinom orfindimgsgomttßon DNAFrogmont, das gogobononfnlls mit oinor Markierung verschon ist, wio Biotin odor oinom radioaktiven Isotop. Als Standard kann dio Mybridisiorung mit ähnlich markierten Ul)i(|uitin-r.«diorendon Boroichon irgondoinos Organismus, z. B. Gorsto, vorwondot worden, da Ubi(|uitin-Soquonz sohr stark konsorviort und in untorschiodlichon Pflanzongowobon konstitutiv oxprimiort worden. Dio Ergobnisso wordon mit ähnlichen „Dot-Blot" vorglichon, dio aus oinor Analyse von Kartolfolsorton mit bokannton Zuckorcharaktoristika orhalton wurdon, z.B. von don vior Kartolfolsorton, dio in „Matorialion und Mothodon" boschriobon sind. Dio vorstohond boschriobono „Dot-Blof-Analyso kann mit oinor großen Mongo von Züchtungsmatorinl durchgoführt wordon und führt zur frühon Bestimmung dor Zuckorcharaktoristika oinor gogobonon Kartoffolsorto.

Rostriktions-Frogmont-Längon-Polymorphismon (RFLP) wordon immer häufiger zur Vorfolgung spezifischer AIIoIo von Gonon in untorschiodlichon Organismen eingesetzt. Dio AIIoIo wordon ontwodor selbst verfolgt, odor sio wordon als Markör (vorbundon odor nicht vorbundon) boi Krouzungonbolrr'fond andoro Mrikmalo, z.B. Pathogon-Rosistenz und morphologische Morkmalo, wio Knollonfarbe. Bisher wurdo dio Mothodo vorwiogend b-,, fv'onschon oingosotzt, sio wurde jodoch auch boi Pflanzon oingosolzt, z. B. boi Kartoffeln; vgl. (27). Es wird davon ausgi gangon, d JIi ein orfindungsgomrißos DNA-Fragmont zur RFLP-Analyso von a-AmylosoGonon oingosotzt wordon konn, insbosoi u!o ο boi dicotylodonon Pflanzon, wio dor Kortof fol. Dioso Annahme boruht auf don Ergebnissen von gonomischon Southorn-Hybridisiorungon von Kartoffol-DNA mit oinom erfindungsgemäßon DNA-Fragment. Pflanzen der Spezies Solarium tuberosum habon wenige a-Amylaso-Gene und orgoben doshalb oin oinfaches Fragmonlmustor, mit dom man Polymorphismon leicht ausworton kann. Somit lasson sich Gonomo loiclit wio vorstohond boschriobon auf a-Amylaso-codiorondo AIIcIo nach don Grundsätzen dos Rostriktions-Fragmont-Längon-Polymorphismus untersuchen, d.h. wio in (2'') boschriobon. Ein Boispiol der Anwendung oinos a-Amylaso-Gons boi diosor Technik wird in Boispiol 28 und in don Fig. 19 und 20 boschriobon

Im vor Mögend' η Zusammenhang wordon dio üblichorwoisi für Aminosäuren vorwondoton Abkürzungon vorwendot.

Ausführungsbelsplele Material und Methoden

Karloffolsorton

Dio folgenden Kartofft.sorton wurdon bonutzt: Dianollo, Saturna, Bintjo, Lady Rosotta.

Dioso Kartoffolsorton wurdon ausgewählt, um dio Beziehung zwischon reduzierendem Zucker und a-Amylaso-Aktivität zu voranschaulichen und um dio Sorte und/oder das Gowobo zu bostimmon, aus der/dem a-Amylase-Clono in dor vorteilhaftesten Woiso isoliert worden konnten.

Dianolla ist oino aufgrund ihres hohon Stärkegohaltos lIs Ausgangsmatorial für dio Alkohnlformontation vorwondote Sorte.

Dianolla wurdo gewählt, da dio Sorte gut bokannt ist und wahrscheinlich oin außergewöhnliches Boispiol für den Zuckormetabolismus in Kartoffeln darstellt.

Die Sorte Saturna ist bokannt für ihren niodrigon Gehalt an roduziorondon Zuckern, was sio besonders goeignot für den Gebrauch in der Herstellung von z.B. Kartoffolchips macht. Sie ist eine dor wenigen Kartoffelsorton, in der dor Zuckergehalt niedrig genug ist, um nach verlängerter Lagerung Kartoffelchips horstcllon zu könnon. Die Sorte ist allordings rolativ anspruchsvoll in der Kultivierung, insbesondere was don Wasserbedarf betrifft. Es ist daher wünschonswort, daß nouo Kartoffolsorton mit oinom gleichermaßen niodrigon Gohalt an roduziorondon Zuci- :rn gozüchtot wordon.

Bintjo ist eine bekannte Sorto, die vor allem für don normalen Vorbrauch vorwondot wird. Ihr Gohalt an reduzierenden Zuckern liegt zwischen dom von Dianella und Saturna.

Lady Rosotta ist oino noue Sorte, die in dor Herstellung von z. B. Kartoffolchips verwendet wird. Sie ist cine dor wenigen Kartoffolsorton, doren Gohalt an reduzierenden Zuckorn niedrig genug ist, um in dor Herstellung von Chips vorwondot wordon zu können. Sie bofindot sich allordings noch in der Vorsuchsphaso.

Bakterielle Stamme

HB101: hsm, hrs, rocA.gal, pro str", rocA1, ondA1, gyrA96,thi, hsdR 17, supE 44, relA 1, lambda ,

Adac- proAB), |F\ traD36, proAB, Lacl^qZ-AM 15| XL1-Bluo: ondA1,hsdR17(ri,m;),supE44,thi-1,lambda"',rocAi,gyrA9e,rolA1,A(lac),|F',proAB,lacl^q,

ZAM15,Tn10(tet^R)l

BB4: rocA\lacl^q,ZAMi5,tet"

JM109: siehe Referenz (48)

XL1: sioho Referenz (20,49)

BB4: siehe Referenz (31)

IIU101: siehe Referenz (50)

PhagenundPlatmlde

lambda-ZAP: siohoRofo'onz(31)

R408lntorlorenz·

resistontorHelforphage: siohoRoforonz(31)

|)OR327: siohoRoforonz(51)

pBS+,pBS-: eiohoRoforonz(31)

Medium und Platten L-N»hr-(LB)-M3diiim: Pro Liter: 60 Hofooxtrnkt, 5g NZ-AmId, 5g NnCI, 5y Uncto-Popton, Acoklovioron.

LB-Platten:

LBModium, plus 15g BnctoAgnr pro Litor. Autoklovloron. In Plostik-Potri-Schalon (25 nil ρ,ο Plntto) gioßon. Tot-Plaiton: Wio LB-Platten, plus 17mg Totracyclin pro Litor nach Autoklavioron. Amp-Platton: Wio LB-Platton, plus 35mg Apicillin pro Litor rinch Autoklavioron. AXI-Plntron: Wio LB-Pliilton, plus 35mg Ampicillin, 120my IPTG (lsopropylthiooolnctosii)), 4Omo Xyal (in Oiiiiothylfornioniid gelöst) pro Liter

nach Autoklavieren.

Xy al: 5-Broni-4 chlor-Sindolylß-D-galaclosid. Minimal-Modium:

ΊΟΟ111Ι HjO, 1 ml Lösung B, 10OmI Lösung A, 5ml (0,5mg/ml) Thinmin, 5ml 20%Glycorol. Lösuno A ist 10g (NH₄)jSO₄,24g Na₂HPO₄,15g KHjPO₄,15g NaCI pro Litor H₁O. Lösung B ist 20Og MgCI₂ · 2 H₂0,7,2g CnCI₂ · 2 H₂O und 20ml Mikroniihrlösung pro Litor. Mikronährlösu ig ist 10μΜ FoCI₂, 50OnM CoCI, 2 H₂O, 40OnM HjBüj, UOnM MnCI₂, 3OnM CoCI₁,1OnM CuCI₂, 3nM (NH₄)_eMa_;0₂₄. Boi Platten wordon 15g Agnr pro Litor hinzugcgobcn. Autoklaviorcn.

Einfrleron von Kartollolprobon

Um dio Amylaso-Aktivitnt mosson zu können, wurdon dio Kartoffclprobon zunächst gofro'on. Ein Motalloinior wurdo zu Vj mit flüssigem Stickstoff gofüllt, und oino zur Hälfte mit dom Kortoffolmntorial gefüllte Plnstikschüssol wurdo in don Eimor mit flüssigom Stickstoff gostollt. Eine in flüssigem Stickstoff gokühlto Schüssol zum Mischon wurdo mit dom gckühlion Kartoffolmntorial aufgofüllt, und zvvoi Toolöffol Ascorbinsäure wurdon zugogobon. Das Kartoffolmatorial wurdo gemischt, bis es oino mehlartige Konsister.z bosaß. Ein 800-ml-Bocher wurdo in flüssigom Stickstoff gekühlt und oino Kartoffolprobo hineingegossen. Jodo P obe wurdo in zwoi Portionon ai'fgotoilt, dio in zwoi Stomackor-Taschon gostollt wurdon. Dio Taschen wurden so schnoll wi j möglich in oinon Gofriorschrank gostollt. Diosos gofrorono Kartoffolmatoriol wird fortan als „vorbohandeltos Matorial" bozoichnot.

Bestimmung der reduzierenden Zuckermengen In Kartoffeln

25g dos Vürbohandolton Materials wurdon mit Eiswassor auf 125ml aufgofüllt, 1 Minuto gomischt und 10 Minuton boi OX und MOOOUpM zentrifugiert. Dor Üborstand wurdo abgogosson, storilfiltriort, 10 Minuton in oinom Wasserbad erhitzt und nochmals sterilfiltriort. Dio Bestimmung der Mengen an D-Glucose vor und nach der enzymatischen Hydrolyso von Sucrose, sowie die Bestimmung dor Mengen an D-Fructose nach der Bestimmung der Mongon an D-Glucoso wurdon mit einem Sucrose/D-Glucoso/D-Fructoso-Tostkit von Boehringor Mannhoim gomäß der Vorschrift dbs Horstolle.'s durchgeführt.

Qualitative Bestimmung der Amalyto-Aktlvitlt in Kartoffeln

Kartoffolknollen (Sorten Saturnn und Dianolla) wurdon bei 20⁰C 14 Tage lang in einem Dunkelschrank gelagort. Gowobooxtrakto dieser Knollen und ihrer weißon Koimo wurdon präpariert, indom 2g frisches Gowobo (odor in manchen Fällen 10ggefroronesGewobe)in5mlO,1 MTris-HCKpH 6,2), ImMCaCI₂ · 6 H₂Ogomahlon wurden. Das Homogonat wurde 5 Minuton bei 10000UpM und 4⁰C in 15ml Corox-Röhrchon zentrifugiert. 5μΙ dos Überstandos wurdo auf oino Glasplatte gotropft, dio mit einer dünnen Schicht 1 % Gaw./Vol. Stärke bodockt war. Dio Glasplatte wurdo (mit dor dünnon Schicht nach obon) auf vier Schichten bofoutctcs Filterpapier in eine Potri-Schalo gestellt. Um dio Funktion des Enzyms zu garantieren, wurdo darauf geachtet, daß dio Stärkoplatto unter feuchten Bedingungen inkubiert wurdo. Dio Potri-Schalo wurdo 16 Stunden ontwedor bei 20'C oder bei 37⁰C inkubiort. Die Stärkcplatton wurdon in Ij/Kl-Lösung getaucht und mit doionisiertom Wasser gespült. Dio Ij/Kl-Lösung gibt Stärke eine tiefblaue Farbo, dio verschwindet, wonn Stärko zu Glucose und Maltose gospalton wordon ist (cino „starke" Reaktion). Bei einer „schwachen" Reaktion ist der Punkt rötlich, mit einer doutlichon Änderung in dor Oborflächo im Vorgloich zur Umgebung (woichor) (7).

Quantitative Bestimmung der a-Amylaso-Aktivltat (Methode 2) Folgendos Vorfahren wurdo für jede Probe vorbehandeln Kartoffolmatorials vorwendet. AIIo Bestimmungen wurdon zwoifach

ausgeführt. Von jedor Probe vorbehandeln Kartoffolmetorials wurden vier Probon entnommon und damit acht Bestimmungengemacht.

Ein 75-ml-Bechor wurdo mit dem wio obon vorbehandelten Material gofüllt und mit Parafilm vorsiegelt. Nach dem Auftauen,

wahlweise in einem Wasserbad, wurde die Flüssigkeit in ein Zentrifugr.nröhrchon dekantiert und 10 Minuten bei 14000UpMzentrifugiert. 10ml Puffer (pH 5,5) wurdo mit einer 10-ml-Pipotto in einon Erlenmoyor-Kolbon pipottiort, und oino Phadabas blauo

Stärkepulvertablotte (Pharmacia Diagnostics Ltd.) wurde zugogobon. Dio Tablotte wurde durch loichtos Schütteln dos Kolbens

golosl. Schließlich wurdon BmI Überstand von dor zonlrifuyioMon riüseiykoit mit oinor ömll'ipolto ;u dor Losung uoyebon, woboidnrnufgoachtot wurdo, dnß «los PrAzipitnt nicht aufgerührt wurrio. NnchZuynbo von 10000I.E. Penicillin wurd.idor Kolben mit Pnrnfilm versiogolt.

Dio Kolbon svurdon 48 Stunden in oin 45'C-Wd ^sorb.vl ijostollt, dnnndi in oinor Wonno mit knltom Wnssor gekühlt. Din ι iptischn Dichto dor Probon wurde spoktrophotomoUiscn boi GPOnm ermittolt, woboi oin l'uffor mit oinom f>)\ Wort von 0,5 nls Hl'H'lprobn dient ν Dio Koniontrntion von a-Amyloso in don l'robon wurdo nutomotisch nut (lot Grundingo diosor Mossungon bororhnol Οίο Protoinkonzontrntion in den ÜberstAndon wurdo gomHß dor Mothodo von Lowiy Ci?) bostimmt.

Ernto von Kartolfolgowabo für RNA/DNA-Iiollorungon Knollen (Dinnolln, Snturnn) wurden boi 20 C in oinon Dunkolschrnnk gologt. Oiο sich ontwickolndon woißon Koimo wurden nn< h M Togon yoorntot und in kloinoro Stücke yoschnitlon. Uns Gowobo wurdo sofort nnch dan) Sthnoidon in Trockonois (jolroron

und boi -80C bis zur Woitorvorwondunynufbownlut. Knollen (Dianolla.Saturnn, Uintjo, LndyRosnttn) wurdon yoschtilt und mitoinor Reiho direkt auf oino auf Trockonois yoloyto Alufolie goriobon. 10y Poi (ionon worden boi 00 C bis zum Gobr juchyolayort.

Extraktion von RNA aus Kartoffelkolmen

Gi «nmt-RNA nus woißon Knrtoffolkoimon (Solnnum tuhorosum, Dinnolln- und Snturnn-Sorton) wurdo nnch Zorroibon in flüssiyom Stickstoff yomitß der im folyondon boschrioboncn Gunnidinthiocynnnt/NSnrcosin-Mothodo nnch Knplnn ot nl. 18) oxtrohiort und yeroinigt.

10g qofrorono, in Schnibon goschnittono Kortoffolkoimo wurdon In 0 Volumen (Gow./Vol.) 5,OM Gunnldinthiocynndt. 5OmM Tfis-HCI IpH /,5), 1OmM EOTA und 5% 2-Mn.captoolhanol homogonisiort. One Homoyonnt wurdo mit 4% Gow./Vol. N-Laurylsnrcosin und 0,15y/ml (En.(konzentration) festem CsCI vor »out. Ons Hon ogonnt wurdo 20 Minuten boi 10000 UpM und 4 X zentrifugiert, um Zolltrümmor zu ontfomon. Dor Überstand wurdo vorsichtig über oin 2,5-ml-Kiison 5,7MCsCI, 0,1 M FDTA geschichtet und in oinom Bockmnn SW-41-Rotor 18 Stunden boi 37000UpM und 20'C iontrifugicrt. Nnch dor Zontriluyation wurdo das Homoyonnt vorsichtig mit oinor Postour-Pipotto ontnommon und dio Polynllomo Hohrchon clrolmnl mit Wnssor yowasclion. Nach Entfornuny dos CsCI-Kissons wurdon dio RNA-Pollols in 1OmM Tris-HCI (pH 7,G) rojuapondiort und (h.rcli Zugnbo von 2,5 Volumen knltom Ethnnol gefüllt.

Uns Pollot wurdo in 1OmM Tris-HCI rosuspondiort und nnch Zuynbo von 10OmM (Endkonio'itrntion) NnCI mit 2,5 Volumen knllom Ethanol gofallt. Das RNAPollot wurdo in lOniM Tris-HCI (/>H 7,5), 2mM EDTA, 10OnM NnCI r^suspondiort und dio HNA-Konzontration durch Mocsung dor optischon Dichto boi 260nm (OD 1 fin oino Lösu i;i mit ΊΟμμ RNA pro ml) bostimmt. Dio für dio Iso'iarung vonPoly(A)-roichor RNA vorwondotoGosnmt-RMA wurdo in 1OmM Tris-HCI (->H /,6), 2mM FDTA, 10OmM NiiCI und 0,b ^Jo Sodiumdodocylsulfnt (SDS) rosuspondiort.

Extraktion von RNA aus Knollen Es war nicht möglich, RNA aus Knoilonyowobo mil dor obon boschrinbonon konvontionollon Mothodo (d.h. mit dor Guanidinthiocynnat/N-Sarcosin-Mothodo) iu isolioron. Guanidinthiocyonat rongiorto mit der Stitiko, und die Produkto hntton

oino goloeartiyo Kc iiston/. Es war unmöglich, dio RNA nus diosor trübon Flüssigkeit durch (Ins CsCI-Klsson zu zentrifugieren.

Dio hior gonanr)ton Erfindor mußton dnhor oino andoro Mothodo entwickeln: Das in flüssigem Stickstoff ^lomahlcno Knollongowobo wurdo in 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 5OmM EDTA, 50OmM NaCI, r.% 2-Morcnptoothnnol, 1 % SDS rosuopondiert

und 20 Minuten boi 65X inkubiort. Das Homogonnt wurdo mit 3% (Gow./Vol.) N-Lnurylsnrcosin und 0,15g/ml(Endkon»->ntration)'2Stom CsCI vorsotit. Das Homogonat wurdo 20 Minuten boi 10000UpM und 4'C zentrifugiert (International),um Zollt'ümmor zu ontfornon. Dio RNA wurdo dann durch Zontrifugntion übor ein CsCI-Kisson, wio obon boschriobon (9), isoliert.

RNA-Elektrophoreso

Dio RNA-Probon wurdon in 0,OM Glyoxal (doionis ort, boi -20X golnyert), 1OmM Na₁HPO₄ZNaH₁PO/ (pH 6,5), 00% DMSO (Dimcthylsulfoxid, boi A'C golayort) (10) donaturiort. Sio wurdon dann oino Stundo boi 50°C inkubiort und 5 liif 10 Minuten vor Zugabe dos Probonpuffors (35% Ficoll IMolokulargowicht (MW) 400000), 0,01 M Νη₂ΗΡΟ₄/ΝηΗ,ΡΟ₄ IpH 6,5), 0,4% Uromphonol-Blau) auf Eis gestellt. Dio Probon wurdon auf oin 1,5% Agarosogol in 1OmM Na₁HPCyNaHjPO₄ {p\\ C\5) goladon und dio Rloktrophoroso mit 1OmM Na₁HPO₄ZNaH₁PO₄ (pH 6,5) als Elektrophoroso-Puffor unter Pufforzirkulotion boi 35mA für otwa 2Vj Stunden (11) durchgeführt. Ein odor zwoi Spuren wurdon vom GoI abgetrennt und dio RNA übor Nacht in Mothylon-Blnu-Lösung (33,5ml 3M Natriumacet it, 100ml 1 M Essigsäure 10mg Mothylon-Blau, mit H₁O auf 500ml auffüllen) yofärbt.

Northern Blot

Eino Glasplatte wurdo in einer Wanno auf oinon TrAgor gostollt, dor die Glasplatte um 5 bis 6cm anhob. Ein in 0,025M Na₁HPO₁/ NaH₁PO₄ (pH 6,5) befcuiiiOtos Stück filtorpapior wurdo so auf dio Glasplatte gologt, daß dio Endon und Soiton don Bodon der Wanne borührten.

Es wurde so viel 0,025M Na₁HPO₄ZNaH₁PO₄ (pH 6,5) in dio Wanno gogosson, daß diu Oberfläche dio Glasplatte gerade berührte Das RNA-GeI wurdo auf des feuchte Filterpapier gologt. Eino Gono-Scroon- (New England Nucloar·) Membran wurdo genau in doi Größe des GoIs geschnitten, in 0,025 M Ne₁HPO₄ZNoH₁PO₄ (pH 6,5) getaucht und auf das GoI gologt, woboi vcrmiodon wurde, Lufi.ilason zwischen GoI und Membran zu bokommon. Dio Rander der Momhran wurdon durch vior Stücke Parafilm abgedeckt und ein mit 0,025MNa₁HPO₄ZNaH₁PO₄ (pH 6,5) befeuchtotes Stück Filterpapier wurdo obenauf gologt. Mohrore Stücke (20 bis 25) Filterpapier wurden obenauf gelegt, und auf diese wiederum mehrere Lagen Papiortüchcr (C bis 8cm). Filtorpapior und Papiertüchor waron in der Größe dos GoIs geschnitten. Eino Glasplatte und oin Gewicht wurdon auf dio Papiortüchcr gostollt. Dio Transferdauer betrug 16 Stunden. Papiertüchor, Filterpapier und Parafilm wurdon entfernt. Größonmarkor !18S rRNA und 28S rRNA) wurdon auf dor Membran markiert, woboi das über Nacht in Mcthylon-Blau gofarbto Golstück vorwondot wurdo. Dio Mombran wurdo in 0.025M Na₁HPO₄ZNaH₁PO₄ (pH 6,5) gowaschon, an dor Luft gotrocknet und zwei Stundon bei 80'C(ID gebacken.

Hybridisierung von RNA

Dio Oono-Scroon-Mombron wurdo 30 Minuton in Ox SSC boi Raumtemperatur untor konstnntom Gchütteln bofouchtot. Dio Membran wurde anschließend in olnor Lösung aus 50% Formamid (doionlslort), 0,2% Polyvinylpyrrolidon (MW 40000), 0,2% Rindorsorumalbumin,0,2% Ficoll (MW400000), 0.05M TrIe-HCI (pH 7,5), 1,0M NaCI, 0,1 % Na₄P₂O,, 1,0% SDS, 10% Doxtransulphat (MW 500000) donaturiortor, ultrasr.hallbohnndoltorLach88porma-ONA(50ug/ml) und ΙΟμο/ml PoIy(A)-RNA prtthybridisiort, Das Volumen der Prähybridisiorungslösung war ΙΟΟμΙ/cni¹ Membran. Dio Prähybridisiorung wurdo in oinor vorsiegolton Plastiktüte, dio 6 Stundon bol 42⁰C untor konstantem Schüttoln inkubiort wurdo, durchgeführt. Danach wurdon V» dos FlUssigvolumons von der folgenden Lösung dazugegebon: 50% Formamid (doionisiort), 0,2% Polyvinylpyrrolidon (MW 40000),0,2% Rindersorumalbumin, 0,2% Ficoll (MW400000), 0.05M TrIe-HCI (pH 7,5), 0,1 % Na₄PjO₇,1,0% SDS, donaluriorto, ultraschatlbohandolto Lachssporma-DNA (5Ομο/ηιΙ|, PoIy(A)-RNA (10pg/ml) und dio donaturiorto, radioaktiv mnrViorto Sonde (5ng/ml Pnihybridisiorungs- und Hybridisiorungslösung). Dio Tüto wurdo wiodor vorsiogolt und untor konstantom Schüttoln 16 bis 20 Stundon hoi 42⁰C hybrlort. Dio Hybridisiorungslösung wurdo ontfornt und dio Mombran 2x6 Minuton bei Raumtomporatur in 2XSSCJmMEOTA, 10mMTrisHCI,pH 7,59,jooinmaM0 Minuton und oii.mal 30 Minuton boi 67⁰C in 2x SSC, 10% SDS und schließlich jo einmal 5 Minuten und oinmal 30 Minuton boi Raumtomporatur in 0,1 χ SSC gewaschen. AIIo Waschvorgängo fanden untor konstantem Schüttoln (11) statt. Dio Mombran wurdo an der Luft getrocknet, mit einer Plastikfolio bodeckt und mit odor olino Intonsiviorungsschirm boi -8O⁰C autoradiographiort. Dio Lachssporma-DNA und dio radioaktive Sondo wurden durch zehnminütigos Kochen in oinom Wossorhad donaturiort und vor dor Zugabe zur Hybridisiorungslösung auf Eis gestellt.

Isolierung von Poly(A)-relchor RNA Eino Oligo(dT)-Säulo wurdo wio folgt horgestollt:

2gOligo(dT)-Colluloso/Typ 2 (orworbon von Collaborativo Rosoarch, Inc., Rosoarch Product Division, 1365 Main Stroot, Waltham, Mass., USA) wurdon oinmal mit 1OmM Tris-HCI (pH 7,5) und oinmal mit 0,5M KOH gowaschon und durch 8 bis 10 Waschvorgängo mit 1OmM Tris-HCI (pH 7,5) noutralisiort. Dio Säulo wurdo boi Raumtemperatur in 1 % SDS gogosson und aufbewahrt. Dio Chromatographio orfolgto bei 30^cC und dio Puffor wurdon vor Gobrauch auf 3O⁰C erwärmt. Das 1 % SDS wurdi durch don Durchfluß von 2 Volumon 1OmM Tris-HCI (pH 7,5) durch die Säule ontfernt. Vor Zugabo dor RNA-Probo wurdo dio Säulo durch den Durchfluß von 2 Volumon 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 50OmM NaCI auf Hochsalzpuffor eingestellt. Dio in 2mM EDTA, 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 10OmM NaCI und 0,5% SDS gelöstoGosomt-RNA wurdo 10 Minuten auf 55"C erhitzt (um Aggrogationen aufzulösen), auf 3O⁰C abgekühlt und duf eino Konzentration von 50OmM NaCI eingestellt. Die Lösung wurdo dann vorsichtig auf die Spitze dor Säule aufgetragen und dio Säule mit 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 50OmM NaCI gowaschon, bis die OD_2M dos Eluats niedriger als 0,01 war. Die angoroichorto PoIy(A)RNA wurde mit 1OmM Tris-HCI (pH 7,5) oluiert, und 10 Fraktionen ä 1 ml wurdon gesammolt. Dio Poly(A)-roicho RNA wurde aus den Fraktionen mit don höchsten OD_2to-VVorto_n durch Einstollon dor Lösung auf 10OmM NaCI (Endkonzontration) und Zugabe von 2,5 Volumon kaltom Ethanol gofällt. Dio RNA wurde 20 Minuton boi 100G0 UpM und 4⁰C (SorvallKühlzcntrifugo) zentrifugiert und unter Vakuum gotrocknot. Das trockono Pellet wurdo auf Eis in storilom Wasser (1 pg Poly(A)-roicho RNA pro μΙ) rosuspondiert und boi -20⁰C (12) gelagert.

Isolierung gonomlschor DNA

Gonomische DNA wurde aus woißen Kartoffolkeimen taoliort. 10 g gefrorono, in Schoibon goschnittono Kartoffolkoimo wurdon in flüssigem Stickstoff zermahlen und in 4 Volumon (Gow./Vol.)Proteinase K Puffer (1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 10OmM NaCI, 5mM EDTA, 1 % SDS und 0,2 mg/ml Proteinaso K) homogenisiert. Das Gemisch wurdo eine Stundo boi 3O⁰C untor zeitweiligem Rühien inkubiort und anschließend 15 Minuten bei 10000UpM und 4⁰C zentrifugiert. 1 Volumen Chloroform/Isobutanol (24:1) wurde zum Überstand gegeben. Dio Phasen wurdon anschließend sechs- bis siebenmal gründlich durchmischt, zwischen am Mischvorgangon stohongolasson (dor gesamto Vorgang dauorto etwa 20 Minuton) und 20 Minuton boi 10000UpM und 4^CC zentrifugiert. Die organische Phaso (mit Chlorophyll, (nils vorhanden, und Proteinon in der Interphase) wurde verworfen, das Gemisch nochmals mit 1 Volumon Chloroform/Isobutanol (24:1! extrahiert und 20 Minuten bei 10000UpM und 4⁰C zentrifugiert. 2,5 Volumen kaiton Ethar.ols wurdon zur oberen Phaso gogobon und das Gemisch über Nacht boi -20⁰C gelagert. Nach einom Zontrifugationsschritt (lOMinuton boi 10000UpM und 4⁰C) wurde das Pellet sorgfältig im Vakuum getrocknet und in 20ml TE-Puffer (1OmM Tris-HCI IpI I 8,0) 1 niM EDTA) rosuspondiort. Dio Lösung wurdo vor dor Bandiorung im CsCI-Gradionten bei 4⁰C gelagert. Um zu teston, ob die gonomischo DNA oin hohes Molokulargewicht besaß, wurdon 1 bis 10μΙ der genomischen DNA auf einom 1 % Agarosegol analysiert; nicht degradierte DNA verbleibt als breite Bande in dor Nähe der Tasche. Die genomische DNA wurdo anschließend auf einom CsCI-Graiiionten bandiort: 20g CsCI wurden in 20ml gonomischer DNA gelöst und 1,25ml EUiidiumbromidlösun'j (Stammlösung: 5pg/ml) wurden hinzugegoben. Eino andere Lösung (A) wurde angesotzt: Festes CsCI wurde in TE-Puffor (Gew./Vol.) golöst und 0,2 mg Ethidiumbromid pro ml wurdon hinzugogoben. Die DNA-Lösung wurdo in „Quick-soaC'-Polyallomor-Röhrchon gefüllt, dio anschließend mit Lösung (A) aufgefüllt und vorsiegelt wurden. Die Röhrchen wurden in oinom Beckman VTI-65-Rotor 48 Stunden bei 4500C UpM und 15⁰C zentrifugiert. Die Zentrifuge wurde ohne Einsatz der Bremse gestoppt. Dio gonomische Bande wurde unter UV-Licht mit einer Spritze abgezogen und das Ethidiumbromid mit CsCI-gesättigtem Isopropanol sieben- bis achtmal oxtrahiort. Das CsCI wurde anschließend durch 72stündige Dialyse der DNA in TE-Puffer entfernt, woboi der Puffor sechsmal gewechselt wurdt. In dor Rogol war os nicht nötig, dio DNA in diesem Stadium zu fällen (Fällung wurde vormieden, da hochmolokularo DNA sohr schlecht in Lösung geht), es sei donn, sehr wenig DNA wurde isoliert. Die DNA-Konzentration wurdo boi OD₂₆₀Tn bestimmt, woboi vorausgesetzt wurde, daß einer Konzentration von 50pg DNA pro ml eine OD_Jio-1 entspricht. Genomircho DNA, die für Restriktionsspaltungen verwendet wurdo, wurde bei 4⁰C (45) gelagert.

Preparation von Plasmld-DNA

Die Präparation von kleinen Mengen Plasmid-DNA wurde wie folgt durchgeführt: Die Plasmide-tragenden bakteriellen Stämme wurden als 2ml Übernachtkultur (L-Nähr-(LB-)-Medium, versetzt mit entweder 15pg/ml Tetracyclin (tot] oder 35pg/ml Ampicillin), gezogen. Die einzelnen Schritte wurden in 1,5-ml-Eppondorf-Gefäßen und die Zentrifugation in einer Eppendorf-Zontrifugo bei 4⁰C durchgeführt. Die Zellen aus der Übernachtkultur wurden durch zweiminütigo Zentrifugation pelletiert, mit 1ml 1OmM Tris-HCI (pH 8,5), 1 mM EDTA gewaschen und 2 Minuton zentrifugiert. Das Pellot wurde durch Vortexen in 150μ115% Sucrose, 5OmM Tris-HCI (pH 8,5), 5OmM EDTA rosuspondiort. 50 μΙ Lysozym (4 mg/ml) wurden hinzugegoben und das Gemisch

30 Minuton boi Raumtemperatur und 30 Minuton au( Eis inkubiort. 400μΙ oiskoltos H₃O wurden hinzugogobon, das Gomisch 5 Minuton auf Eiegoholton, 15 Minuten boi 70 bis 72°C Inkubiort und 15 Minuton zontrifupiort. 75μΙ 5,OM Natriumporchlornt und 200μΙ Isopropanol (das lsopropanol wurdo boi Raumtomporatur gelagert) wurden zum Üborstond gegobon und das Gomisch 15 Minuton boi 5⁰C zontrifugiort. Das Pollot wurdo in 300μΙ 0,3 M Notriumacotot rosuspondiort, und 2 bis 3 Volumor. knitos Ethanol wurdon hinzugegeben. Die Fällung dor DNA erfolgte ontwo'lor 5 Minuton boi -00¹C odor übor Nacht boi -20X. DIo DNA wurdo 5 Minuton zontrifupiort, 2 Minuton im Vakuum gotrocknot und in 20μΙ H₁O rosuspondiort. Dio Ausbouto botrug 5 bis 10|ig Plasmid-ONA (Ί6).

Plasmidpräparationon in großem Maßstab wurdon durchgeführt, indom dor für oino kloino Präparation vorwondoto Ansatz zehnmal so groß gewählt wurdo. Von allon Bestandteilen wurdo dio zohnfacho Monge vorwondot, woboi 15-ml-Corox-Röhrchon vorwendet wurdon. Zontrifugationon wurdon in einer Sorvall-Kühlzentrifugo boi 4⁰C durchgeführt. Abweichungen von obigom Protokoll wordon im folgondon dargostellt: Nach dom Inkubationsschritt boi 70-72⁰C wurdo 30 Minuton boi 17000UpM tontrifugiort. Nach Zugabo von Isopropanol odor kaltom Ethanol wurdo 15 Minuton boi 17000UpM zontrifugiort. Dio nach dor letzten Zentrifugation pollotierte Plasmid-DNA wurdo in M₂O rosuspondioit, in oin Eppondorf-Gofaß üborführt und kurz zontrifugiort, uir nichtgolösto Partikel zu ontfornon. Dor Üborstand wurdo auf eino Endkonzontration von 0,3 M Natriumneotat eingestellt, und 2 bis 3 Volumen koltos Ethanol wurdon hinzugogobon. Das Pellet wurdo in 40μΙ H₂O rosuspondiort. Die Ausbouto botrug in der Regel 20 bis 80Mg Plasmid-DNA.

Um sohr saubero Plasmid-DNA zu orhalten, wurdon 200-300Mg dor aus dom großen Ansatz isoliorton Plasmid-DNA auf oinom CsCI-Gradionton bandiort. Festes CsCI wurdo in H₂O (1:1, Gow./Vol.) gelöst, und 0,2mg Ethidiumbromid pro ml wurdon hinzugogobon. Die Lösung wurdo in oin „Quick-soar-Pulyallomor-Röhrchon dokantiort und dio Plasmid-DNA (mit CsCI im Verhältnis 1:1 (Gow./Vol.I versotzt) wurdo hinzugogobon. Das Röhrchon wurdo aufgofüllt, vorsicgolt und in oinom Qockman VTI-65-Rotor 16 bis 18 Stunden bei 40000UpM und 15⁰C zontrifugiort. Die Zontrifugo wurdo ohno Einsatz dor Bromso durch Setzen der Zoitschaltuhr auf 0 gestoppt. Dio Plasmidbando wurdo mit oinor Spritze abgosaugt, und dos Ethidiumbromid mit CsCI-gosättigtem Isopropanol sieben- bis achtmal oxtrahiort. Das CsCI wurdo durch 48stündigo Dialyse in 1OmM Tris-HCI (pH 8,0), 1 niM EDTAentfornt, woboi dor Puffer droimal gowochsolt wurdo. Fällung dor DNA orfolgto durch Einstelion dar Lösung auf eino Konzentration von 0,3 M Natriumacetat und Zugabo von 2 bis 3 Volumon kaltom Ethanol (12).

Restriktionsspaltungen

Alle Rostriktionsondonucloason stammten von Biolabs odor Boohringor Mannheim und wurdon gemäß Anweisung der Horstoller vorwondot. Pro pg DNA wurdo oino Einheit Enzym oingosotzt. Dio Inkubationsdauor botrug 2 Stundon. Boi Doppolspaltungen wurdon dio Pufferbedingumjon dom zweiten Enzym ontwoder durch Änderung des Roaktionsvolumons odor durch Zugabo notwendiger Komponenten angep.ißt.

Elektrophoretliche Auftrennung von DNA-Fragmenten Nichtdenaturierendo Gele

Agarosegelo wurden verwendet für die Schätzung dor Konzentration von Plasmid-DNA, zur Auftronnung rostriktionsgospaltonor, genomischor DNA (0,8% oder 1 % Agarosogolo), für die Erstellung von Restriktionskarton boi Plasmid-DNA, sowie für Southern-Blot- (2% Agarosogolo-) oder Northorn-Blot- (1,5% Agarosogolo-) Experimente Dio für Northern Blot-Exporimonte verwendeten Gele wurden oben beschrieben. Dio anderen Gele wurdon in oinor horizontalen Plattengelapparatur gegossen, und die Elektrophorese wurde entweder in 2x McArdle-Puffor (2x McArdlo-Puffor:80mM Tris, 3OmM NaCI, 24mMNatriumacotat,4,4mM EDTA, mit Eisessig auf pH 8,0 eingestellt) 18 Stundon boi 45mA oder in 1 χ TBE-Puffor (1 χ TBE:89mM Tris-Borat, 89mM Borsäure, 2mM EDTA) 2 bis 3 Stunden boi 7OmA durchgeführt. Die Gele enthielten 5pg Ethidiumbromid pro ml Gel. Vor dom Auftragen wurdon dio DNA-Probon mit Proben-Puffor (35% Ficoll (MW40000), 5mM EDTA, 0,04% Bromphonol-Blau) versetzt. Dio Gele wurdon unter langwolligom UV-Licht untor Vorwendung eines Orange-Filters und Polaroidfilm Nr.665 (13,14) photographic«.

5% Acrylamidgele wurden für die Erstellung von Rostriktionskarten von Plasmid-DNA und für die Isolierung spezifischer DNA-Fragmente verwendet. Das Gel (0,1 cm χ 12 cm χ 15cm) wurdo zwischen zwei Glasplatten, dio von Spacern auseinandergehalten wurdon, gegossen. Ein Gel enthält 37ml H₂0,17,5ml 19% Acrylamid, 1%8isacrylamid, 4,4 ml TEMED (0,5% Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramothylothylendiamin), 7 ml 1Ox TBE, 4,4 ml AmperO,6% Ammoniumperoxodisulfat). Die Elektrophorese wurdo 2 Stunden bei 18O-2OOV in einer vertikalen Plattengelopparatur durchgeführt. Dos Gel wurdo 30 Min."*i \\, 5 Mg/ml Ethiumbromid gefärbt, wonach dio Bonden unter langwolligem UV-Licht sichtbar waren und, wie obon beschrieben (13), photogrephiert wurden.

DNA-Sequenziergele

8% Acrylamid - 8 M Harnstoffgelc (0,035cm χ 20cm χ 47cm) wurdon für die Auftrennung von DNA-Fragmenten nach Sequenzierreaktionen verwendet. Ein Gel enthielt die folgendon Bestandteile: 15,75ml 38% Acrylamid, 2% Bisacrylamid, 36(, Harnstoff UH I H₂O ad 70 ml. Die Lösung wurde untor Verwendung von einem Löffel Ionenaustauscher 30 Minuton unter Rühren deionisiert und nach Entfernung des Ionenaustauschers durch Filtration mit 7,5ml 1OxTBE, 1ml H₂O, 2,7ml Ampor (1,6%) versetzt. Die Lösung wurde entgast, auf Eis gekühlt und mit 40μΙ konzentriertem TEMED versetzt. Das Gel wurde sofort zwischen zwei durch Spacer auseinandergehaltene Glasplatten gegosson. Die Elektrophorese wurde 1 Vj bis 4 Stunden bei 4OW durchgeführt. Das Gel wurde anschließend auf einem Geltrocknor getrocknet und 3 bis 48 Stunden bei Raumtemperatur (12) autoradiographiert.

Isolierung von DNA aus Gelen

DNA-Fragmente wurden aus Acrylamid-Gelon oluiert, um Probleme mit in Agarose vorkommenden, für Enzyme toxischen Substanzen zu umgehen. Die 5% Acrylamid-Golmatrix mit dem entsprochenden DNA-Fragment wurdfi zusammen mit 200μΙ 0,5x TBE in einen Dialyseschlauch transferiert. Der Schlauch wurdo parallel zu den Elektroden in eine horizontale Gelapparatur gelegt und mit 0,5x TBE durchtränkt. Die Elektrophorese wurdo 2 bis 4 Stunden bei 150V durchgeführt. Der Strom wurdo 30 Sekunden umgepolt und der Schlauch unter UV-Licht kontrolliert. Die Lösung wurde auf eine Konzentration von 0,3M Natriumacetat eingestellt und die DNA mit 2 bis 3 Volumen kaltem Äthanol (12) gefällt.

Southern Transfer

Ein 2% Agarosogol wurdo 2 χ 1G Minuten mit Donaturiorungspuffor (0,5M NaOH, 1,5M NaCI) durchtränk;. Dio Flüssitjkoit wurclo fortwhhrond durch oinon Magnotrühror gorührt. Das GoI wurdo anschließend drolmnl 10 Minuton mit Noutralisiorungspuffor (0,5M Tris-HCI ΙμΗ /,01,3,OM NaCI) durchtränkt. Das neutralisiorto GoI wurdo auf oino, mit oiiioni in 2Ox SSC (Ix SSC:0,1öM NaCI, 0.015M Natriumeitrat, pH 7,0) gotränluom Stück Filtorpnplor bodockte fnstc Unterlage golo&i, wobei dio Enden dos Filtorpapiors in oino Schnlo mit 2Ox SSC gotaucht worden waron, um oinon Docht zu bildon. Ein in dor Größo dos GoIs geschnittener Nitrocollulosofiltor wurdo in H]O und in 2Ox SSC angofouchtot und unter Vormoidung von Luftblosonbildung auf das GoI (jologt. Vior Stücko Parafilni (oln „Rogonschirm") wurden auf dio Ränder dor Nitrocollulosofiltor gologt. Ein in 2Ox SSC angofouchtotos Stück Filtorpapior wurdo obenauf golegt und darauf ein Stapol trockonon Filtorpapiors. Auf diesen Stapel wurdon mohroro, in der Größo dos Gels goschnittono Legen Papierlocher und darauf schlioßlich oino Glasplatte und ein Gewicht gologt. Dor Transfer wurue 16 bis 18 Stunden durchgeführt, dor Nitrocollulosofiltor markiort, 10 Minuten in 3x SSC gewaschen, an der Luft getrocknet u id 2 Stunden boi 8O⁰C im Vakuum gebacken. Das Vorfahron war das gloicho für 0,H% Agarosjgolo mit großon DNA-Fragmonten außor daß dio Gele durch 2x IBminütigos Tränkon in0,25M HCI (15) vorbohandolt wurdon.

Nlck-Translatlon

Folgende Bestandteile wurdon in oinom Eppondorf-Gofaß gemischt:

3μΙ 1Ox Nick-Puffor (50OmM Tris-HCI [pH 8,0), 5OmM MgCIj, 10OmM ß-Morcaptoothanol) 2 μΙ oinor Mischung 1 niM dCTP, 1 mM dGTP und 1 mM TP in H₂O enthaltend, 0,4 bis 2pg eines isolierten DNA-Fragmonts (aus oinom 5% Acrylamidgol) 4μΙ DNase (1 mg/ml), 10~⁴ vordünnt

1 μΙ DNAPolymeraso I (Ko.nborg)

Das Gesamtvolumen wurdo mit HjO auf 30μΙ oingostollt.

Dor Ansatz wurde 2 bis 3 Stunden boi WC inkubiert (16). Aus oinor Pasteur-Pipotto wurdo oino Säulo hergestellt, diose mit normaler Glaswolle gestopft und bis zu oinor Höhe von 7 bis 8cm mit SophadoxG-100 (das SephadoxG-100 wurde mit TE-Puffor (1OmM Tris-HCI (pH 8,0], 1 mM EDTA) äquilibriort) aufgefüllt.

Dio radioaktiv markiorto DNA wurdo unter Verwendung von TE-Puffer über dio Säulo Chromatographien, das orsto Radioaktivitätsmaximum wurdo gesammelt und dio Menge eingebauter Radioaktivität durch Flüssigscintillationsmessung abgeschätzt. Sonden mit oinor spezifischen Aktivität von 2x 10⁷ bis 8x 10" cpm/pg DNA wurden verwendet. Sie wurden vor Zugabo zu den Hybridisiorungslösungen hitzodonaturiert.

Für die Hybridisiorung mit lambda-ZAP-Phagonfiltorn wurdon die Mongen der Bestandteile im Ansatz verdoppelt. Dios galt nicht a"P-dATP, das in einor Mongo von 10OpCi eingesetzt wurdo (doppolto Nick-Translation). Dios ergab in der Regel eine Aktivität von 1,7x lO'cpm ρτοδμΙ eingesetzter SondoO^g), was für eine Plastiktüte mit Filtern einer Größo von 22cm χ 22cm ausreichte.

Markierung von cDNA

Radioaktiv markiorto cDNA für Hybridisierungsexporimonte wurdo durch Ei i'strangsynthoso an Foly(A)-mRNA in Gogenwart eines radioaktiv markierten Nucloolids horgostellt.

Die folgenden Bestandteile wurdon in oinom autoklavieren Eppendorf-Gofäßgomischt:

1 μΙ einer 2Ox cDNA-Stammlösung (1 xcDNA-Stammlösung; 5OmM Tris-HCI (pH 8,3), 10OmM KCI, 1OmM MgCIj, 5mM Dithiothreitol),

jeweils 1 μΙ dCTP (1OmM), dGTP (1OmM) und dTTP (1OmM)

1 μΙ dATP (100μΜ plus 5OpCi o"P-dATP

2μΙ Oligo (dT) (P.L. Biochemical)

1 bis 3μg Poly(A)-reicho RNA

20 Einheiten RNasin (ein RNase-Hemmor, Biotoc Inc.)

40 Einheiten Vogelmyeloblastosis-Virus Reverse Transkriptase (J.W. Beard, Life Scienco Inc.) steriles H₂O ad 20μΙ.

Der Ansatz wurdo 45 Minuten bei 37°C inkubiert, anschließend 1 μΙ dATP (1 OmM) hinzugefügt und der Ansatz 15 Minuton bei 37⁰C inkubiort (Chase-Reaktion, 15). Die RNA-DNA-Hybrido wurdon durch Chromatographie über eine Sophadex G-100-Säule (7 bis 8cm Höhein einer Pasteur-Pipetto, die mit normaler Glaswolle gestopft und mitTE-Puffor (1OmM Tris-HCI [pH 8,0), 1mM EDTA) äquilibriert worden war) gereinigt. Das erste Radioaktivitätsmaximum wurde gesammelt, u id die Hybride wurden durch Zugabe von 5j.il tRNA (1 mg/ml), 8OmM NaCI und 2,5 Volumen kaltem Ethanol gefällt. Die Reaktion wurde durch Elektrophorese von 5x 10⁵cpm des RNA-DNA-Hybrids auf einem 5% Acrylamidgel überprüft. Das Gel wurde über Nacht boi Raumtemperatur autoradiographiort, und os zeigte einen Schmier, der am stärkston in der Nähe der Taschon war. Die RNA wurde mit 0,4 M NaC H (Endkonzentration) 1 Stunde boi 50"C hydrolysiert und mit HCI neutralisiert. Die cDNA konnte dann zur Hybridisierungslösung gegeben werden (17).

Unter Zuhilfenahme einer anderen Methode zur Herstellung radioaktiv markierter cDNA wurde eine geringe Menge an PoIy(A)-reicher RNA für die Herstellung der lambda-ZAP-Genbank verwendet. Die radioaktiv markierte cDNA wurde hergestellt, um sicherzustellen, daß die RNA während des Isolationsverfahrens nicht degradiert worden war. Ausgc'iond von 2 pg PoIy(A)-roicher RNA wurden der erste und der zweite Strang mit 2OpCi 0.³²PdATP unter Vorwendung eines Boohringer Mannheim cDNA-Synthose-Kits synthetisiert. V» der doppelsträngigen cDNA wurde auf einom 5% Acrylamidgel elektrophoretisiert. Das Gel wurdo getrocknet und boi Raumtemperatur autoradiographiert. Die resultierenden Bandon und der Schmier zeigte, daß die cDNA ein hohes Molekulargewicht hatte (12).

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Hybrldislorung von DNA

Dio Nitrocollulosofiltor aus Soulhorn-Transfors bzw. die lambda-ZAP-Plaquo-Filtor wurden in 2x SSC (1 χ SSC: 0,15M NaCI, 0,01BM Nntriumcitrot, pH 7,0) angofouchtot und in elno hitzovorslogolto Plastlktüto mit vorgowärmtor (67⁰C) Prähybridisierunoslösung transforiort. Die Prähybrldlsiorung wurdo 2 Stundon bei 67°C durchgeführt, woboi dio Tutu vorsichtig geschüttelt wurde. Dio Lösung wurdo durch vorgowUrmto (G7°C) Hybridlsiorungslösung ausgetauscht, dio radioaktive Sondo wurdo zugogobon und dio Hybridislorunn wurdo 18 Stundon boi 67"C durchgeführt. Dio Tüto wurdo vorsichtig goschüttelt, um oine konstante Bewegung dos Nitrozoll isofiltors in dor Hybridisiorungslöaung zu gowährloiston. Nach Beendigung dor Hybridisiorung wurden dio Filter gowaschon, voboi vorschioclon stringonto Bodingungon bonutzt wurdon:

Bedingungen nledorlger Strlngenz:

Prähybridisiorungs- und Hybridisiorungslösungon:

10x Donhardt's (0,2% Polyvinyl-Pyr-oüdon |MW 40000I,0,2% Ficoll |MW 40000|, 0,2% Rinderserumalbumin), 6x SSC, 0,1 % SDS, lOpg/ml PoIy(A)-RNA, 50pg/ml hitzodonoturiorte, goschorto E. coli-DNA (nicht Lachssporma-DNA), und dio hitzodenaturierte, radioaktiv markierte Sondo. Dio Filter wurdon In vorgewärmton (67"C) Lösungen gowaschon: 2x 15 Minuten in 1Ox Donhardt's, 4x SSC, 0,1 % SDS; 4x15 Minuten In 4x SSC, 0,1 % SDS. DIo Filter wurdon an dor Luft gotrocknot, mit einer Plastikfolio bedockt und 3 bis 24 Stundon bol -8O⁰C mit und ohno Vorstärkorfolion nutoradiographiort.

Bedingungen mlttlorer Strlngonz:

Prähybridisiorungs- und Hybridisiorungslösungen waren die gleichen wio oben, mit der Ausnahme, daß 6x SSC durch 4χ SSC ersetzt worden war. Dio folgenden Waschlösungon waren boi 67⁰C vorgewärmt:

1Ox Denhardts, 2x SSC, 0,1 % SDS (2x 15 Minuten) und 1 χ SSC, 0,1 % SDS (4x15 Minuten). Dio Filtor wurden an der Luft getrocknet, mit Vita-Wrap bodeckt und 3 Stundon bis 3 Wochen mit und ohno Verstärkorfolion autoradiographiort.

Das Vorfahren für gonomischo Filtor war wie folgt (Bedingungen mittlerer Stringonz):

Prähybridisiorungs- und Hybridisiorungslösung:

1Ox Donhardts, 3x SSC, 0,1 % SDS, 10% (Gow./Vol.) Doxtransulfat, 10pg pro ml PoIy(A)-RNA und 50pg/ml denatuiiorte, goscherto E.coli DNA. Dio Filtor wurden in vorgewärmter (67⁰C) Hybridisiorungslösung ohne Doxtransulfat 5x 10 Minuten boi 67°Cund4x 15 Minuten in 1Ox Oenhardts, 1x SSC, 0,1% SDS gowaschon. Dio Filtor wurdon in 3x SSC gospült, ander Luft gotrocknot und, wioobonbesciIi iobon (12 und 18), autoradiographiort.

Auffüllen von zurückstehenden 3'-Endon (zur Subclonlerung von Hinf-Fragmenten aus pO36) Folgende Komponenten wurden in ein Eppendorf-Gofäß pipottiort: 10μΙ mit bis zu 1 Mg dos DNA-Fragmonts, 1 μΙ einer 2mM Lösung der vier dNTPs, 2μΙ 1Ox Nick-Translations-Puffor (0,5M Tris-HCI IpH 7,21,0,1 M Mg SO₄, 1 mM Dithiothreitol, 500Mg/ml Rindorserumalbumin), H₂O ad 2OmL Zwei Einheiton Klenow-Polymeraso wurdon hinzupipottiort, der Ansatz wurde durchmischt und 30 Minuten boi 22⁰C inkubiert. Dor Ansatz wurdo 5 Minuten auf 7O⁰C erhitzt, um dio Polymeraso zu inaktivieren, zweimal mit gesättigtem Phenol (das Phenol wurdo zuerst mit 0,1 M Tris-HCI, dann zwoimal mitTE-Puffer, (1OmM Tris-HCI IpH 8,0), 1,OmM EDTA) gemischt) und einmal mit Chloroform extrahiert, mit 0,3 M Natriumacetat (Endkonzentration) und 2,5 Volumen kaltem Ethanol gefällt und zweimal mit 70% kaltem Ethanol gewaschen. Das DNA-Fragment mit don glatton Enden wurdo anschließend mit einem Vektor mit glatten Enden in T4-DNA-Ligaso-Puffor (12) ligiert.

Subclonlerung

Preparation der Vektoren

Die Vektoren (pBS-oder pBS + ) wurden mit ein oder zwei Restriktionsenzymon gespalten, zweimal mit gosättigtem Phonol (das Phenol wurde zuerst mit 0,1 M Tris-HCI, dann zweimal mit TE-Puffor, (1OmM Tris-HCI IpH 8,0), 1mM EDTA) gemischt) und einmal mit Chloroform extrahiert, mit 0,1 M NaCI und 2,5 Volumen kaltem Ethanol gefällt. Das Pellet wurdo in 80% kaltem Ethanol gewaschen und in H₂O bei einar Konzentration von 25 bis 50 ng/μΙ resuspendiert. Die Vektoren wurdon jeweils auf Signal-/ Rausch-Verhältnis (Selbstligation mit und ohne T4-DNA-Ligase) vor Gebrauch gotostot.

Llgation

Das Plasmid mit dem zu subclonierendon Fragment wurde mit ein oder mehroren geeigneten Rostriktionsenzymen gespalten und über ein 5-%-Acrylamidgel elektrophoretisiert. Anschließend wurde das Fragment, wie im Abschnitt „Isolierung von DNA aus Gelen" beschrieben, isoliert. 1 μΙ (25 ng/μΙ) des gelösten Voktors wurdo zum Fragment pipottiort (Verhältnis von Vektor zu Fragment =1:2, dio Anzahl an Molekülen betroffond), desgleichen 2μΙ T4-Ligations-Puffor (5x T4-Ligations-Puffer: 5OmM Tris-HCI IpH 7,6), 1OmM MgCI₂,1 mM ATP, 1 mM Dithiothreitol, 5% (Gew./Vol.) Polyothylonglycol-8000), 0,5μΙ T4-DNA-Ligaso (BRL) und H₂O ad 10 μΙ). Der Ansatz wurdo 20 Stunden boi 14⁰C inkubiort, falls dioligiorton DNA-Fragmento üborhängende Enden hatten. Hatte die DNA glatte Enden, wurdo 1 μΙ T4-DNA-Ligase hinzupipottiort und der Ansatz eino Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Sofern der Ligationsansatz nicht sofort verwendet wurde, wurdo er bei -20°C aufbewahrt. In der Regel wurden lediglich 5μΙ des Ligationsansatzes für eino Transformation verwendet.

Preparation von kompetenten Zellen

4ml L-Nährmedium (darin jeweils 1OmM MgSO₄ und 1OmM MgCI₂), angesotzt aus autoklavierten 1M Stammlösungen von MgSO₄ und MgCI₂ von wurden mit JM 109-Zellen (oder anderen Zellen, z. B. HB101) angeimpft. Dio Zellen wurden als Übernachtkultur bei 37°C gezogen. 1 ml dor Übernachtkultur wurdo zu 40ml vorgewärmtem (37⁰C) LB-Medium (darin jo 1OmM MgSO₄ und 1OmM MgCI₂) gegeben. Die Kultur wurde bei 250 bis 275UpM geschüttelt. Bei einer OD₄₅₀ von 0,8 bis 0,9 wurdon die Zellen 10 Minuten boi 5000UpM und 4⁰C obzontrifugiert. Es war von Bedoutung, daß die OD₄₅₀ unter 1 war, um sicherzustellen, daß sich die Zellen in der exponentiellen Wuchsphase befanden. Das Pellet wurdo sehr vorsichtig in 30 ml kaltem 0,1 M CaCI₂ (autoklaviert) in einem Zentrifugenröhrchen rosuspendiert, wobei das Röhrchen während dos Verfahrens durch ein Eisbad gekühlt wurdo und anschließend 10 Minuten bei 5000UpM und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurdo sehr vorsichtig in 15 ml kaltem 0,1 M CaCI₂ resuspendiort, 20 Minuten auf Eis gehalten und 10 Minuten boi 5000UpM und 4X zentrifugiert. Die Zellen wurden vorsichtig in 3ml kaltem 0,1 M CaCI₂ rcsuspondiort und wenigstens 1 Stunde lang auf Eis gohalten, bovor sie gebrauchsfertig waren (19).

Transformation

5μΙ dosLigationsonsatzos, 95|il kaltos, storilos TCM (1OmM Tris-HCI [pH 7,5), 1OmM CaCI₂,1OmM MgCI₂) und 200μΙ kompotonto JM 109Zollen (odor Zöllen oinos ancloron Stammos) wurdon zusammonplpottiort. Das Gomisch wurdo mindostons Ί0 Minuton auf Eis, dann 5 Minuten boi 37⁰C (odor 2 Minuton bol 42°C) Inkublott. Das Gomisch wurdo anschlioßond in oin 0,OmI L-Nährmedium, 1OmM MgSO₄,1OmM MgCI₁ onthaltondos storilos Glasgofaß trnnsforiort, Ί5 Minuton boi 37^CC untor loichtom Schütteln inkubiort und untor storilon Bodingungon auf 5 AXI-Plotton (odor andoron gooignoton Platton, z. B. amp- odor tot-Platten) a 0,2ml pro Platte ausplattiort. Dio Platton wurdon 10 Minuton zum Trocknon stohongolnsson, anschlioßond umgodroht und über Nacht boi 37⁰C inkubiort. Sio wurden in Plnstikboutoln mit dom Dodon nnch obon boi 4⁰C cologort.

Isolierung und Testen von Subclonon

1 bis 6 rekombinanto Clono (weiß auf AXI-Platton, wenn pBluo-Script als Vektor bonutzt wurdo) wurdon von jcdor Platto isoliort. Von diesen Clonen wurdo Plasmid-DNA isoliert, mit dom geoignoton Rostriktionsonzym bzw. mit gooignoton Rostriktionsonzymon gospalton und auf oinom 2% Agarosogol analysiort, um sichorzugohon, daß das oingobauto Fragmont dio richtige Größe hatto. War dios dor Fall, so wurdo clorClonüborNucht in <1 ml L-Nährmodium kulliviort, mit 25% storilomGlycorol versetzt und bei -8O⁰C gelagert. Botroffs Soquonziorung oinos oingobauton Fratjmentos sioho „Plasmid-Soquonzierung". Betreffs Fragmont-Isolio'ung (Sondon) und Nick-Translation, sioho unter don entsprechenden Abschnitton (12, 20).

Absuchen der lambda-ZAP-Qonbank

Dor Titer der amplifmorton limibda/APGonbank wurde vor dom Absuchungs-Vorfahron zwoimal bostimmt. Infoktionskompotento BU4-Zellon wurdon durch Animpfon oiner 300μΙ 20% Maltose enthaltenden, frisch hergostollten 30ml L-Nährmodium-Kultur und Übernnchtkultivierung bei 37⁰C präparirrt. Die Zellon wurdon 10 Minuten boi 10000U|)M und 4⁰C zentrifugiert, vorsichtig in kaltom, sterilem 1OmM MgSO₄ (30ml) rosuspondiort und bis zur Woitervorwondung auf Eis gchalton. 100μΙ der in χ-Puffor (22mM KH₂PO₄,49mM Na₂HPO₄,85mM NaCI, 1 mM MgSO₄,0,1 mM CaCI₂,0,001 % Golatino, autoklaviort) verdünnton lambda-ZAP-Phagen wurdon mit 0,2ml frisch infoktionskompetont gomachton BB4-Zollon 30 Minuton bei Raumtemporatur inkubiort und anschlioßond mit 2,5ml warmem (42⁰C), 0,6% Topagar (darin 1OmM MgSO₄) auf LB-Platton ausplattiert.

Für das Absuchen der Genbank wurden 22cm χ 22cm LB-Platton (3 bis 4 Stunden bei 37⁰C getrocknet) verwendet. Jede Platte kann otwa 1x10* lambda-ZAP-Plaquos aufnehmen. Die Phagon wurden mit 1 ml BB4-Zellon (präpariert wio oben beschrieben) 30 Minuten boi Raumtemporatur inkubiert. Dieses Gomisch wurdo anschließend zu 25ml warmor (42⁰C), 0,3% Topagaroso (darin 1OmM MgCI₂) pipettiort und die Lösung auf eine frischo, trockono LB-PIaUo dekantiert. Große I.ß-Platton wurdon (mit dom Bodon nach unton) übor Nacht boi 37⁰C inkubiert. Von jodor Platto wurdon zwei Plaquo-Lifts durchgeführt. Die Platten wurdon zuvor 1 bis 2 Stunden bei 4⁰C gohalten, um zu verhindern, daß dio Agaroso-Schicht am Nitrocollulo".ofilter haftet. Dirokt vor Gebrauch wurden sie auf Eis gestellt und vorblieben dort während dor Arboitsschritto mit der Nitrocellulose. Zwei Nitrocollulosofiltor (A und B) sowie dio Platte wurdon an drei Stellen zwecks eindoutigor Orientierung dor Filter in bezug auf dio Platto markiert. Filter A wurdo 45 Sekunden auf die Plaques gelegt, anschließend in Donaturiorungspuffor (0,5M NaOH, 1,5M NaCI) mit den Phagon nach oben transferiert und dort 45 Sekundon gelasson, anschlioßond 5 Minuton im Neutralisiorungspuffcr (0,5M Tris HCI [pH 7,51,3,OM NaCI) und schließlich in 2x SSPE (1 x SSPE: 18OmM i^v>aCI, 1OmM NaH₂PO₄,1 mM EDTA, pH 7,4) wenigstens 2 Minuten lang gobadot. Der Filter wurde an dor Luft getrocknet und 2 Stunden boi 8O⁰C im Vakuum gebacken. Filter B wurde nach Filter A 120 Sekunden auf dieselbe Platte gelegt und weiter wie Filter A bohandolt (12). Diese Filter wurden für die Hybridisiorung bonutzt. Dio Autoradiogrammo beider Filter wurdon so orientiert, daß die Signale von Filter A mit den Signalen von Filter B auf Präsenz auf beiden Filtern verglichen werden konnten. Die positivon Plaques wurdon mit oinom Skalpell herausgeschnitten (1 -cm'-Blöckchun) und in 1 ml φ-Puffer transferiert, wobei die Röhrchen vor Gebrauch goschüttolt wurden. Alle Röhrchen mit Phagen in φ-Puffer wurden nach Zugabe von 2 bis 3 Tropfon Chloroform untor Luftausschluß (Parafilm) bei 4°C gelagert. Die dio Plaques enthaltenden Platten (22cm χ 22cm) wurden gelagert, indem ein Stück in Chloroform getränktes Whatman-Filterpapier in den Deckel golegt wurde, die Platton mit Parafilm luftdicht verschlossen und mit den Plaques nach oben bei 4⁰C aufbewahrt wurdon. Um einen positiven Plaque aus einem etwa 2000 Plaques enthaltenden 1-cm²-Blockzu isolieren, wurden Verdünnungen in φ-Puffer hergestellt, und die Phagen mit BB4-Zollon und 2,5ml I % warmem (42⁰C) Top-Agar (darin 10mM MgCI₂) auf runden, frischen LB-Platten (8,5cm Durchmesser) ausplattiert. Die Verdünnung, welche 1500 bis 3000 Plaques ^rgnb, wurde für die Nitrocollulosofilter-Abzüge woitorverwondot. Das Vorfahren entspricht genau dem für die großen U2cm χ 22cm) LB-Platten verwendeten, mit der Ausnahme, daß die Filter (A und B) markiert wurden, indem eine Kanüle durch die Filter bis zum Plattonbodon gestochen wurde. Nach Hybridisiorung der runden Filter und Autoradiographie wurdon die positiven Signale von A und B übereinandergelegt. Die Plaques wurden isoliort, indem die Spitze einer Pasteur-Pipette durch den Agar bis zum Plattenboden gestochen wurde und dio Plaques durch Blasen am freien Ende der Pasteur-Pipetto in 1 ml φ-Puffer transferiert wurden. Es wurdon wiederum Verdünnungen hergestellt, und eine Verdünnung mit 150 bis 300 Plaques wurde für die Abzüge mit don Nitrocollulosefiltorn verwendet. Das Verfahren war dasselbe, wie das für die Verdünnung auf 1 500 bis 3000 Plaques beschriebene. Die positiven Plaques wurdon isoliort und verdünnt, und die 15 bis 30 Plaques ergebende Verdünnung wurde für die Abzüge mit Nitrocellulosefiltern vorwendet. Bei diesem Schritt hybridisierten in der Regel alle Plaques auf den Filter A und B, was belegte, daß dio isolierten Plaques alle von ein und demselben Plaque abstammten. War dies nicht der Fall, so wurde das Verfahren nochmals durchgeführt, mit dem Ergebnis, daß die Phagenkultur nun nicht mehr kontaminiert war. Die Phagon waren anschließend bereit für das „Excisionsprotokcll für lambda-ZAP-Phagen".

Exclslonsprotokoll für lambda-ZAP-Phagen

4ml frischen LB-Mediums wurden mit XL 1 -Blau-Zellen für eino Übornachtkultur (vorsichtig geschüttelt bei 37⁰C) angeimpft. 0,5ml der Übernachtkultur wurden zu 25 ml frischen LB-Mediums gegeben und unter Schüttoln bei 37⁰C gehalten, bis OD₄₆₀ = 0,5 erreicht war. In ein vorgewärmtes, steriles Glasgofäß wurden pipettiort:

10OpIXLI-BIaU-ZeIlCn₁OD₄₅O = 0,5

100μΙ einer sauberen, mehr als 1 χ 10⁵-Phayonpartikel enthaltenden lambda-ZAP-Phagen-Stammlösung 5MlR408Helferphage(1 x 10^epfu/ml)

2μ11 M steriles MgSO₄.

Das Gefäß wurde 15Miiuiton boi 37⁰C yohalton. Nach Zugabo von 2,GmIf rischon LB-Modiums wurde das Gofäß 4 Stuiulonboi 37°C hoftig goschüttolt. Das Gofäß wurde 20 Minuten auf 7O⁰C orhitzt, 1,0ml dor Suspension wurdon nnscliliiiotul in oin autoklaviortes Eppondorf-Gofäß transforiort. Das Gefäß wurdo kurz zontrifugiort, dor Üborstand anschlioßond in oin frischos, autoklaviortos Eppondorf-Gofäß transforiort. Dio gowonnonon Phogon konnon boi diosom Schritt 1 bis 2 Monato boi4^cC golagort worden. Um dio vorpackton, gowonnonon Plnsmide auf Zollon zu übortrogon, wurdo das folgondo Vorfnhron angowondot: 4 ml frischen LB-Mediuin wurdon mit XL 1-Blau-Zollon ols Übornachtkultur angoimpft und, wio obon boschriobon, kultiviert. In zwoi sterile Glasgefäße wurden jowoils 100μΙ XL 1 -Blau-Zollon olnor OD = 0,5 pipottiort. In das erste Ginsgefäß wurdon 200μΙ, in das zwoite 2μΙ dos vorpockton Plasmids pipettiert. Dio Gofäßo wurdon 15 Minuton boi 37⁰C goholton. ΙΟΟμΙ Suspension aus jodom Glasgefäß wurden in oin frisches storilos, 100μΙ frisches LO-Modium enthaltendes Glasgofäß transforiort. Dio 200μΙ Su >onsion wurden auf einer trockonon (20 Minuton boi 37⁰C gotrocknoton) LB-Ampiclllin-Platto ousplottiort und mit dom Bodon nach obon über Nacht boi 37⁰C inkubiort (31).

Die auf den Platten wachsenden Kolonion onthiolton das pBluo Script-Plasmid mit dor cDNA-lnsortion. Dio Kolonion von dicson Platten wurdan in 35mg Ampicillin pro Litor onthnltondom LB-Modium kultiviort.

DNA-Soquenzlorung

Das zu sequonziorondo Plosmid (Doppolstrangtomplat) wurdo not h dom Verfahren zur Präparation kleiner Plasmidmongon goroinigt. Dio DNA wurdo 5 Minuton boi Raumtemperatur in 0,2 M NaOH denaturiert, (Ins Gemisch wurdo durch Zugabo von 0,4 Volumon 5M Ammoniumacotat (pH 7,5)noutralisiorUindanschlioßund mit 4 Vol"iion kaltom Ethanol 5 Minuton boi -80X gefällt. Das Pollot wurdo mit 70% kaltem Ethanol aowaschon und in 10μΙ H₂O rosuspondiort. Zwoi Roaktionon wurden für jodos P'asmid angosetzt, oino für jodon vorwoncloton Primor. Es wurdon oin 17-mor Soquonzior-Primor (# 1212, Biolabs) und oin rovorser Soquonzior-Primor (# 1201, Biolabs) vorwondot.

Die Soquenzier-Reaktion wurdo mit oinom Soquonaso* DNA-Scquoncing Kit der Firma Unitod Statos Biochemical Corporation untor Verwendung dos im Kits onthaltondon Soqucnzior-Protokolls (22) durchgeführt.

Beispiel 1

Amylaso-Aktlvlt&t In Kartoffolgowobo

Es ist wünschenswert, zu wissen, in welchem Gewebe Amylase aktiv ist, da in solchem Gowobe vermutlich Amylase-mRNA vorkommt. Zum Wachstum von Knollenkoimen bodarf os oinor Nahrung (wio Saccharose) aus der Knolle und zur Deckung diosos Bodarfs wird Stärke abgebaut. VoischiedonoGowobo von keimenden Kartoffuln wurdon doshalb auf Amylase-Aktivitötgotostot. Dünnschnitte von keimenden Knmlon (Dianolla, Saturna) wurdon in Ij/Kl-Lösung golegt. Das Poriderm (Zollon, dio dio Knollenhaut bilden), das vaskuläro Gowobo und dio Keimen wurdon nicht gefärbt, währond dor Rest dos Knollongowobos (Parenchym·, Vorratszellen) gefärbt wurde. Während dieser Tost anzeigt, wo Stärke anwesend (dunkelblaue Farbe) und wo Stärke abwesend ist (die farblosen Bereiche), zeigt er nicht, wo Amylase vorhandon ist. Es gibt koinon sichtbaren Unterschied im Farbmuster von Saturna- und Dianolla-Kartoffoln.

Dünnschnitte von Koimon wurden auf eino 1-%-Starkoplatto gol jgt und 1 Stunde bei 37⁰C ohne sichtbaren Effekt inkubiert. Zum Vorgleich: Der auf eine 1-%-Stärkoplatto gotropfto Mäuseurin nach 20 Minuton Inkub-'ion bei 37⁰C (23) einen klaren Flock. Obwohl dio Schnitte sehr dünn waron, könnto die Entfernung, die das Enzym zurückzulegen hat, um mit dem Substrat in Kontakt zu kommen, noch z'i lang soin. Auf der Grundlage des für dio koimonden Knollen boobachtoton Färbungsmustors wurde entschieden, ai's den verschiedenen, in Figur 6 angedeuteten Boreichen Extrakto herzustellen.

Die Extrakte wurden wie vorstohond beschrieben („Material und Methoden") sowohl von Dianella als auch von Saturna bereitet. Nach 16 Stunden Inkubation boi 2O⁰C zeigton nur Dianolla-Koime eino schwache Reaktion (orango-farbenor Fleck). Ein weiteror Satz von Extrakten wurdo bei 37⁰C inkubiort, und hier zoigton Dianolla-Koimo oino starke Reaktion (klarer Fleck) und bewiesen damit das Vorhandensein von Amylase in dioson Koimon. Saturna-Koimo zoigton nach oinor Inkubation bei 37⁰C eine schwache Reaktion, schwächer als dio für Dianella-Koime bei 2OX gefundene. Der boobachtote klare Unterschied in den Amylasemongcn von Dianella- und Saturna-Keimon korreliert mit don in diesen Sorten gofundonen Zuckermongen (vgl. Beispiol 20 und Figur 22). Um eino stärkere Reaktion von Saturna-Koimen zu erhalton, wurden vor dom Zorroiben in 5ml Extraktionspuffer (vgl. „Material und Methoden") 10g eingefroren (5 Minuten boi -7O⁰C, 1 Stunde bei -20X). Nach Inkubation bei 37X war der Fleck rosarot, abor die Roaktion war nicht so klar, wio dio gefundene Reaktion mit 2g frischon Dianolla-Koimen.

Der Rest der Zellextrakte (B, C und D sowohl von Dianella als auch von Saturna) zeigte (auf dor 1%igen Stärkeplatte) eine stärker blaue Farbe nach Anfärben mit einer Ij/Kl-Lösung als die Umgebung. In dioson Flecken ist deshalb mehr Stärke vorhanden als in der Umgebung. Das Parenchym-Gewebo (D in der Zeichnung) von beiden Sorten wurde auch getestet, nachdem es eingefroren worden war, und die Flocke waron noch dunklor als die Umgobung. Das gefrorene Parenchym-Gewebe wurde dann ohne Extraktionspuffer zerrieben und dor sich ergebende Karto(fels;ift wurde (nach Zentrifugation zur Entfernung der Debris) getestet. Eine sehr schwache Reaktion wurde nach der Inkubation bei 37⁰C sowohl für den Saft aus Saturna als auch aus Dianella gefunden. Diese Reaktion kann dadurch verursacht soin, daß es so viel Substrat (d. h. Stärke) für die Amylase im Parenchym-Gewebe gibt, daß das Enzym langer braucht, um die Stärke auf der Platte abzubauen. Es wurde eino maximale Inkubationszeit von etwa 16 Stunden angewendet, da sich dio Platten zusammenrollten, wenn sie bei 37⁰C viel länger als 16 Stunden inkubiert wurden.

Auf dor Basis des vorstehend Erwähnten kann man schließen, daß Amylase-Aktivität sowohl in den Keimen als auch in dem Knollen-Paronchym-Gewebo von Sauturna- und Dianella-Kartoffeln vorhandon ist. Die höchsto Aktivität ist in Dianella-Keimen zu finden.

Beispiel 2

Herstellung von Gerste-a-Amylase-Sonden

Zwei Plasmide (050 und 036), von denen jedes eine Gerste-a-Amylase codiert, wurden von John C. Rogers vom Washington University Medial Center, St. Louis, USA, zur Verfugung gestellt. Die beiden Plasmide wurdon ursprünglich konstruiert aus Poly(A)-reicher RNA, die aus der Aleuron-Zellschicht von Gerstokörnern nach Hormoninduktion isoliert wurde. Das Plasmid 050 codiert eine Typ A (= Clon E) (27)-a-Amylase, und das Plasmid 036 codiert eine Typ B (= pM/C) (24)-a-Amylase. Entsprechend der mit den Plasmiden enthaltenen Information enthält p050 die Gerste-Pstl-Insertion von Clon E inseriort in die Pstl-Stelle dos

Polylinkors dos Vektors ρ St'64 (26). Zur Erhöhung dor Plosmid-DNA-Ausbouton wurdo clossolbo Pstl-Fragmont in don Voktor pOS- (31) insoriort. Diosor nouo Clon pDS050 onlhält somit clio idontische, in Clon E cloniorto Insertion. Entsprochond dor erhaltenen Information enthält das Plasmid 036 oln BamHI-Hindlll-Frnumont aus dom Clon pM/C, insoriort in don Polylinkor dos Vektors pSP64 (Fit). ')· Die vollständige Soquonz dos Frogmonts Ist nicht publiziert, und wio in Ooispiol 3 gozoigt wird, onthält das Fragmont Soquonzon, clio oin starkes falsches Hybridisiorungssigiinl vorursnchon. In hotorologon Hybridisiorungon mit oiiior niodrigon Stringonz („Matorial und Mothodon") kann das Signal-/Rousdi-Vorhältnis orhöht wordon, worin dio hotorologo Sondo nur Soquonzon onthält, dio in don Kontrolloxporimonton hybridisioron (Boispicl 3). Dio Gorsto-Insortion in pO3C onthält zwoi Sacl-Stollon, dio don codiorondon Abschnitt toilon und naho boim Torminationscodon (Positionen 699 und 1388 in Fig.2) dor Roferonz 24) liegen. Es wurdo angonommon, daß dio 5'-Signalpoptid-Soquonz und dor Anfang dos das Signalpoptid von Gorsto· a-Amylase codiorondon Ooroichs zwischon Gorsto und Kartoffol nicht konsorviort ist, und oino Ilinll-Slollo in dor Position 152 dor vorstehend erwähnten Figur wurdo vorwondot, um dioorston 152 Nuclootidoousdor Gorsto-Sondo wio folgt zu ontfornon. Das in Fig. 1 gozoigto Hinfl-Fragmont, in dom dio rochtssoitigo Stolle in· ^v'"ktor pSP64 liegt, wurdo in dom Voktor pBS- subcloniort, und unter don Rekombinanton wurdo eino ausgewählt, in dor das Liu. ..orte Fragmont dio in Fig. 7 gozoigto Oriontiorung aufwoist. Dieses Plasmid, pBS036, sotzt nach dor Spaltung mit Sacl zwoi Fragmonto froi, dio im wosontlichon nur roifo Gorsto-a-Amyloso codierende Boreicho onthalton. Zusätzlich orgibt pBS036 bossoro Plasmid-DNA-Ausbouton als 036.

Beispiel?

Feststellung einer Hybridislorung zwischen Gorsto-a-Amyloso-Gen-Soqiionzon und Kartoffol-Nuclootld-Sequonzen Poly(A)-roicho RNA, dio, wio unlor „Matorial und Mothodon" boschriobon, aus Dianolla-Koimon horgostollt wordon war, wurdo ausgewählt, da in diosom Gowobo die höchste a-Amylaso-Aktivität boobachtot wordon war (Ooispiol 1). Um ·. ι klären, ob dos komploxo Gomisch von Mossongor-RNA in dor Poly(A)-RNA-Präparntion Soquonzon onthält, dio mit Gerstoa-Amylaso-Soquonzon hybridisioron, wurdon dio Plasmido pBSOriO, pBS036 gonau wio das Plasmid 050 mit raclioaktivor komplomontärer DNA hybridisiert, dio von Poly(A)-roichor RNA untor Vorwondung oinor Mothodo synthetisiert worden war, dio in „Matorial und Mothodon" für die erste Strangsynthoso boim cDNA-Clonioron boschriobon wurdo. Dio Hybridisiorungsbodingungcn (Hybridisiorung boi 67°Cin6x SSC, Waschen boi67°C in4x SSC) wurdon auf dor Grundlagodor vorhorigon Erfahrung mit hetorologen Hybridisierungon in komploxon Molokülgomischon (28, 29) ausgesucht.

Das Ergebnis dos Vorsuches ist in Fig.8 gezeigt. Es zeigt, daß dio KartoffolcDNA mit Gorstoa-Amylaso codiorondon Bereichen spezifisch hybridisiert. Besonders gut hybridisiert das 800bρ Sacl-Fragment aus pBS036, das don C-terminalen Toil dor Gorste-o.· Amylase Typ B codiert, wohingogon das den N-terminalon Toil codiorondo 350bp Sacl-Fragmont nicht hybridisiert. Durch das Fohlen einer Hybridisiorung oinos DNA-Fragmontos mit ähnlicher Größe von oinom Kontrollplasmid (Spur 1, Figur 8) ist aufgezeigt, daß die Hybridisiorung spezifisch ist. Das die α-Amylaso Typ A codiorondo Gerste-Fragmont aus dom Plasmid pBS050 hybridisiert ebenfalls, wonn auch schwach, mit dor KartoffolcDNA. Als positive Hybridisiorungskontrollo wurclo oin Plasmid verwendet, das oin hochkonserviertos ubiquitäios Protein, Ubiquitin, codiort. Wie erwartet, hybridisiert os mit dor Kartoffol-cDNA. Die Intensität der Hybridisierung mit dem Ubiquitin codieronden Fragment, dem 800bp Sacl-Fragment aus pBS036 und der Pstlnsertion aus pBS050 ist schwach, vorglichen mit der Hybridisiorung von zwoi starken Banden, in don pBS036 enthaltenden Spuren, und es wurdo gefolgert, daß die starken Bonden auf oino Hybridisierung dor cDNA mit dem durch einen Storn in Fig.7 gekennzeichneten kleinen Bereich zurückzuführon waren. Dio Soquonz dos Boroichos ist nicht bokannt, os wird aber vormutet, daß dio starke Hybridisiorung das Ergobnis oinor Zufallshomologio mit ribosomalon RNA-Soquonzon (die sogar in den am besten gereinigten Poly(A)-reichon RNAs zu finden sind) ist. Diese Aufnahme wird durch den Befund gestützt, daß die Gorste-cDNA oine ähnlich starke Hybridisiorung orgibt.

Die Ergebnisse des Versuchs zoigon, daß (1) Dianolla-Keime Poly(A)-roicho RNA-Soquonzon enthalten, dio spezifisch mit Gerstea-Amylaso codiorondon Soquonzon hybridisioron, (2) daß 800bp Sacl-Fragmont aus pBS036 die am boston gooignote Sondo ist und (3) dio Hybridisiorungsbedingungon ausreichend pormissiv sind, um dio Hybridisiorung festzustellen, ohne oino zu hohe Hintcrgrundhybridisierung zu schaffen. Es wurde dio Schlußfolgerung gezogen, daß das 800bp Sacl-Fragmont (die Sonde in Fig. 7) verwendet werden konnte, um eino aus einer Poly(A)-reichen RNA aus Dianella-Koimcn hergestellte cDNA-Gcnbank abzusuchen durch Hybridisiorung boi 67⁰C in 6x SSC undWaschon boi67°C in4x SSC.

Beispiel 4

Konstruktion einer KartolfolkoinvcDNA-Gonbank

Poly(A)-mRNA wurdo aus Dianolla-Kcimen, wie unter „Matorial und Mothodon" boschrioben, hergestellt. Die Qualität der Poly(A)-mRNA wurde dadurch getestet, daß aus einem kleinen Antoil, wie vorstehend beschrieben, cDNA synthetisiert wurde. Die von der Poly(A)-mRNA abgeleitete cDNA wurdo in den Vektor lombda-ZAP mi' Hilfe von EcoRI-Linkern (30) cloniort. lambda-ZAP ist ein Hybridvektor, der aus einem lambda-Vektor besteht, in den das pBlueScript SK(-)-Plasmic) inseriert ist. lambda-ZAP hat sechs einmal vorkommende Cloniorungsstellon, in donon man Insertionen von 0-10Kb Länge unterbringen kann. Es hat die Fähigkeit, den inserierten Boreich mit Hilfo oinos Holfor-Phagens automatisch auszuschneiden, zu zirkularisieron und so df s ^tt'^ aScript SK(-)-Plasmid zu bilden. Die inserierte cDNA befindet sich im Polylinkor des pBluoScript SK(-)-Plasmids (31). Der gosc.iätzte Titer der primären Genbank war ungefähr 7,0 χ 10'pfu (plaque forming units), wovon ungofähr9%Nicht· Rekombinante waren. Der Bestand dor nicht amplifiziorton Genbank war 8,0 χ 10⁵pfu/ml, und dor Bestand der amplifizierten Genbank (10° pfu aus dor primären Genbank wurden amplifiziert) war 4,0 χ 10'°pfu/ml.

Herstellung der Sac800-Sondo

3 χ 10|ig von sehr reinom (CsCI-bandiertem) pBS036 (Fig.7)-Plasmid wurden mit Sacl gespalten und in oinom 5%igen Mcrylamidgel elektrophoretisioii. BstNI gespaltenes pBR327 wurde als Größon-Referonz vorwendet und ergab drei Banden: 1855bp, 928bp und 475bp. Die Sac800-Bande wurdo isoliert, in 30μΙ H₂U suspondiort und bei --2O⁰C aufbewahrt. Jedes Mal, wenn oin doppelter Nick-Translations-Ansatz gemacht wurde, wurden 5μΙ des aufbowahrten Sondenmoleküls verwendet.

Beispiele

Isolierung von Kartoffol-a-AmylasocDNA-Clonon

Ein Satz von Nitrocollulosofiltorn (3A und 3D, mit 1 χ 10^s Plaquos) wurde bol niedriger Stringonz (hybridisiert in Gx SSC und gowaschon mit 4x SSC, wio vorstehend boschriobon) mit ungofähr 1,7 χ lO'cpm dor radioaktiven SncOOO-Sondo hybridisiort. Einwoitoror Satz von Nitrocollulosoiiltorn(2A und 2B, mit 1 x 10* Plaquos) wurdo wiodor mit ungefähr 1,7 x 10'cpm dor radioaktiven Sac800-Sondo boi otwas höhoror Stringonz hybrid'siort (Hybridisiorung und Woschon in 2x SSC). Nach drei S Hindern Autodiographin mit zwoi Verstärkerfolie!! zoigto dor Röntgenfilm dor Filtor 3 A und 3D (dio Niodrig-Stringonz-Iiltor) positivo Signale, vväluond dor Röntgenfilm dor Filtor 2A und 2Q (dio Höhor-Stringonz-Filtor) koino Signolo zoigton. Sogar nach 18 Stunden Autorediographio von 2Aund 2Dzolgton sio noch koino positivon Signale Unter ungofähr 100000 Clonon wurdon ncht positive Signalo von don Filtorn 3 A und 30 und ein zusätzliches positives Signal auf dom Filter 3 A in oinom Bereich gofundon, in dom dio beidon Filtor nicht üborlappon. Dio Häufigkeit von a-Amylaso-cDNA-Clonon in dor Gonbank gibt oinon Hinwois auf die Vorbroitung von a-Amylaso-Mossongor-RNA in dor gesamten DianolloKoim-Mossongor-RNA. Dio Häufigkeit war 8 χ 10"⁶, somit war dio a-Amylaso-mRNA verhältnismäßig solton und machto ungefähr 0,008% der Gosamt-Mossongor-RNA aus. AIIo neun Signale waron auf dor ursprünglichon L-Nährmodium-Platto (22 cm ' 22 :m) vorhanden und wurdon davon isoliert (Schritt 1) (vgl. „Matorial und Mothodon"). Ihnon wurdon dio Namen ZAP1 undZAP9 gegeben. Nach oinor Sorionvordünruing wurdon sio ausplattiort, und von joder Platto (mit 1500 bis 3000 Plaquos pro Piano) wurdon zwoi doppolto Abzügo (A, B) horgostollt. Dio Nitrocollulosofiltor wurdon boi niodrigor Stringonz mit dom radioaktiven SacÖOO-Frnomont hybridisiert (1,5 x lO'cpm bis 3,0 χ 10'cpm wurdon zu jedom Beutel mit vior bis sechs Rundfiltorn gegoben, wobei die Fitor jowoils zu Poaron, d. h. dio Filter A und B von dot solbo'i Platto in oinom Boutol waron). ZAP2,3,4,5, β und 7 zeigten positivo Signale (oinor bis violo Kandidaten), und sio wurdon sorionwoiso von dlosom Schritt aus (Schritt 2) vordünnt. ZAP 1,8 und 9 waron zu sehr vordünnt worden und zeigton koino Signale; sio wurdon dahor nochmals vom Originalisolat (Schritt 1) aus schrittweise verdünnt. Geeignoto Vordünnungon, d. h. 200 bis 500 Plaquos für ZAP2, 3,4, 5, 6 und 7 und 1500 bis 3000 Plaques für ZAP 1,8 und 9 wurdon vorwendot, um Replikas von A und B anzufortigon. Dio so orholtonen Nitrocollulosofiltor wurden mit dent radioaktiv markierton SacSOO-Fragmont, wio oben boschriobon, hybridisiort.

ZAP 1 und ZAP8 zoigton an diosor Stolle (Schritt 2) positive Signale ZAP9 hingogon zeigte koine positiven Signale und wurdo nicht weiter untersucht. Es war möglich, einen oinzigen positiven Plaquo von den Platten mit ZAP2,3,4,5,6 und 7 zu isolioron. Sio waren an diosor Stello so woit aufboroitot, daß das Plasmid herausgeschnitten wordon konnte ZAP 1 und ZAP8 wurdon schrittweise vordünnt (Schritt 2), und oino gooignote Verdünnung von jodom wurdo vorwondot, um Roplikas anzufortigon. ZAP2,3, 4, 5,6 und 7 wurdon obonfalls vordünnt, wobei Platton mit 20 bis 50 Plaquos für dio Anfertigung von Roplikas verwendet wurdon. Dieser Schritt (Schritt 3) wurde als zusätzliche Kontrollo für diosen Phagon durchgeführt. AIIo Filtor wurdon mit dom radioaktiv markierton Sac800Fragmont bei niodrigor Stringenz hybridisiort. ZAP 1 und ZAP2 zeigten positivo Signale, und es wor möglich, von beiden einen einzigen positivon Plequo zu isolieren. ZAP 1 zoigto während dos Isolierungsvorfahrons ein schwächeres Signal als dio andoron; trotzdom war os während dos gosamton Vorfahrons anwosond. ZAP 1 und ZAP8 wurdon obonfalls für Kontrollhybridisiorungon auf Roinheit ausplattiort. AIIo acht ZAP 1 -8-Phagon stammten von ein und demselben Plaquo ab, da alle Plaquus auf don Platton hybridisierton. Dio Plasmide aus don Phagen ZAP 1 bis ZAP8 wurden gomäß dem Excisionsprotokoll untor „Matorial und Mothoden" herausgeschnitten.

Aus einer großen Anzahl Ampicillin-resistenter Kolonion wurdon zwoi Kolonien von ZAP 1 bis ZAP8 ausgewählt und über Nacht zwecks Plasmidpräparation hochgezogon. Dio Plasmido wurden mit A my Z1 bis AmyZ8 bezeichnet. Alle Kolonien enthielten Plasmido. Plasmido AmyZ 2-7 wurdon mit EcoRI gespalten und auf oinom 2-%-Agarosogol analysiort, woboi mit BstNI oder Hinfl gespaltenes pBR 327 als Größonmarker verwendet wurdo (Fig. 9). Dos Gel enthält ebenfalls mit Sacl gespaltenes pBS036 (Fig. 7). Das Gel wurde für einon Southern Transfer, wio in „Matorial und Mothodon" beschrieben, vorwondot, und dor Nitrocollulosofiltor wurdo untor Bedingungn niodrigor Stringonz mit dem radioaktiv markierton Sac800-Fragmont (1 x 10°cpm zugogoben) hybridisiort. Bei allen Plasmiden zeigte mindestens ein Fragment oin positives Signal (Fig.9), was bestätigte, daß die richtigen cDNA-Clono isoliert wordon waron. AmyZ 2,3,4,5,6 und 7 und spätor A^r.iyZ 1 und 8 wurden in 25% storilom Glycerol fur längoro Lagerung (-80'C) eingefroren.

Beispiele

Restriktionskartenanalyse der a-Amylaso-cDNA-Clone und DNA-DNA-Sequenz-Analyso AmyZ 2, 3,4, 5,6 und 7 wurden mit EcoRI gespalten und auf einem 5-%-Acrylamidgel oloktrophorotisiort, was dieselben Fragmente, wio in Fig.9 zu sehen, ergab. AmyZ 1 und 7 wurdon gleichermaßen behandelt, und dio rosultioronden EcoRI-Fragmente aller acht Clone sind in Fig. 10 dargestellt.

Die EcoRI-Fragmente, sowie nach Spaltung mit anderen Restriktionsonzymon erhalteno Fragmente wurden isoliort und in den pBS-Vektor (s. „Material und Methoden") subcloniort. Die Fragmonto wurden in don zwischen don Sequenzior-Primer-Bindungsstellon lokalisierten Polylinkor cloniort. Dio Subclono wurdon auf korroktelnsertionsgrößo hin analysiort und in 25% sterilem Glycerol für längere Lagerung eingefroren.

Die Sequenzierungsstrategio für die Kartoffelinsertionen von AmyZ3 und Z4 ist in Fig. 11, die Strategie für dio Insertionen von AmyZ1 und AmyZC in Fig. 12 und die Sequenzierungsstrategie für AmyZ 2 und AmZ7 in Fig. 13 gezeigt. EcoR-Fragmentovon AmyZ 5 und AmyZ8 wurdon ebenfalls sequenziert, und die Ergebnisse zeigten, daß diese beiden Clone mit AmyZ 7 identisch sind.

Die Nucleotidsoquonzen wurden untor Zuhilfonahmo der Bockman MicroGono Soquonco Softwaro analysiert. Dio Soquonzen der Kartoffelinsortionen sind in Fig. 1 bis 5 wio folgt gezeigt: Fig. 1 = AmyZ3/4, Fig. 2 = A.""yZ7, Fig. 3 = AmyZ 1, Fig.4 = AmyZ6 und Fig.5 = AmyZ2.

Beispiel 7

Wenigstens fünf o-Amylaso-Gene zwoi verschiedener Typen sind In Kartoffolkolmgewebo aktiv Dio cDNAs in AmyZ 1-8 enthalten Kopien von ct-Amylaso-Mossonger-RNAs aus Kartoffolkoimgowobo und sind so Produktkopien von Kartoffol-a-Amylase-Genen. Dio in Fig. 1 bis 5 gezeigten Sequenzen sind alle verschieden und dahor Produkte verschiedener Gene. Dies zeigt, daß wenigstens fünf verschiedene Gene in Kartoffelkoimen der Sorte Dianella aktiv sind. Paarweiso Vergleiche der fünf Sequenzen aus Fig. 1 bis 5 zeigen, daß sie in zwei Gruppen fallen, wie in dor folgendon Tabello veranschaulicht. Die Sequenzen wurdon gegeneinander ausgerichtet und dio Tabello zoigt dio prozentuale Homologie zwischen Sequenzpaaren zu einem solchen Ausmaß, daß sie üborlappen. Um dio Ausrichtung zu optimieren, wurdon Lücken eingefügt, und dio Lücken wurden für dio Berechnung der Homologie in die Gesamtlänge mitcinbozogen.

	%Nuclootidsoquonzhomologio	AmyZ 1	AmyZ 6	AmyZ 3/4	AmyZ 7
	91,1	55,4	98,9	99,2
AmyZ6	55,5	55,4	98,5
AmyZ 3/4	55,5	59,2
AmyZ 7	60,1
AmyZ 2 P

Ee ist deutlich, daß dio Sequenzen von AmyZ 3/4, AmyZ 7 und AmyZ 2 auch botrotte dor 3'-nicht-tr nnslntiorton Roy ionon in dor Tnt sohr homolog sind. Diosos lirgnbnis läßt vormuton, daß dio droi onuprochondon Gono AIIoIo dossolbon Gons sind, was im Boroich dos Möglichon ist, da dio gowählto Kortotfolsorto (sowio ondoro, kommerziell vorwondoto Knrtoffolsorton) totropoid ist. Nachfolgond worden dio Clono/Soquonzen AmyZ3/4, AmyZ7 und AmyZ2 als dor AmyZ3/4-„Typ" bozoichnot. AmyZ 1 und AmyZ6 sind gloichormaßon sohr homolog, in diosom FnII jodoch ist dor Homologiogrnd otwns niodrigoi, und dio Untorschiedo zwischon don Gonon sind in don 3'-nichttrnnslatiorton Rogionon konzontriort. AmyZ 1 und AmyZG könnton dio Produkto von Allelon oinos Gons soin, sio könnton nbor auch vorschiodono, zu oinor „Sub-Gon"-Familio gchörondo Gono soin. Nachfolgond worden dio Clono/Soquenzon AmyZ 1 und AmyZ β als dor AmyZ 1 -„Typ" bozoichnot. Aus clor Tabollo läßt sich ontnohmon, daß dio Homologio zwischon don Nuclootidsoquonzon oinor jodon Soquonz dos AmyZ3/4-Typs nuf dor ninon und dos AmyZ 1-Typs auf dor andoron Soito niedrig, d.h. 55 bis 60%, ist. Diosos Ergobnis zoigt, daß zwoi untorschiodlicho Typen von Kartoffolu-Amylaso-cDNA-Clonen isolioit wordon sind.

Nuclootidsoquenzon sind durch einen zusätzlichen Poramotor, dio Nucleotidzusammonsotzung, gokonnzoichnnt. Diosor Paramotor, in dor Regol als dor „CG-Gohalt" bozoichnot, ist bosondors nützlich zur Untorschoidung von codiorcndon und nichtcodierendon Rogionon. Es ist bokannt, daß codiorondo Rogionon oinon 1 Γ> bis 20% höhoron CG-Gohalt als nicht-codiorondo Rogionon haben (Salinas, J.g., Mntnssi, L.M., Montoro und G.Bornardi „Compositional compartmontalization and compositional patterns in tho nucloar gonomos of plants" in Nucloic Acids Rosoarch (1988), (3d. 16, Soiton 4269-4285). Dioso Information hilft boi der Lokalisierung von Introns und Exons in Gonon. Darübor hinaus habon dio codiorondon Regionen (und Gonomo) verschiedener Pflanzcnartcn vorschiodonc CG-Gehalte, und os gibt oino relativ scharfo Untortoilung zwischon monocotylodoncn und dicotylodonon Pflanzen. Der CG-Gehalt der codiorendon Rogionon von Kiirtoffel-ci-Arrylase-cDNAs liegt in allon Fällen unter 50%, wohingegen der CG-gohalt der für a-Amylaso codiorondon Rogionon nus Gotroido übor 50% liegt. Dio Boispiolo deuten an, daß für u-Amylaso codierende Rogionen aus nndoron Pflanzen auf dor Basis dos CG-Gohalts dor monocotyledonen odor dicotylodonon Gruppe dor Angiospormon zugeordnet wordon könnon.

Beispiele

Nucleotldsoquenz dor Kartoffol-a-Amylaso AmyZ3/4-Messonger-RNA mit Slgnalpeptld-, haupt-codlorendor Region und a'-nlcht-translatleitor Region

Fig. 1 zoigt dio Sequenz dos Messengor-RNA ähnlichen Stranges dor zusammengefaßten Insortonon dor Kartoffola-AmylasocDNA-Clone AmyZ3 und AmyZ4, und Fig. 11 zeigt eino Zusammenfassung dor Struktur dor boidon Clone. AmyZ3 und AmyZ4 haben in don üborlappondon Regionon idontischo Nuclootidsoquonzon (vgl. Fig. 11), mit der Ausnahme, daß AmyZ3 oino Intron-Sequenz von 128 Nucleotiden in der 5'-Signalpeptid-Soquonz (manchmal d^;o „5'-nicht-translatiorto Rogion" genannt) hat. Das Intrcn endot mit don jowoiligon, an don 5'- und 3'-Exon-lntron-Gronzon gofundonon Nuclootidon, GT und AG, und das Intron enthält oinon Consonsus-Verzweigungspunkt. Consonsus-Exon-Intron-Gronzen und -Vorzweigungspunkto für Pflanzenintrons sind von Brown (NUCLEIC ACIDS RES. (19861, Bd. 14, S. 9549-9559) zusammengestellt wordon. Dio Nucleotidsoquenz vom 5'·? inalpeptid bis zu Nuclootid 540 enthält vioi offene Lesoraster, die im Dotail in Fig. 17 gezeigt sind. Dio das a-Amylase-Vorliiuforprotoin codierende Region beginnt mit Nuclootid 541 und ondot mit Nuclootid 1761, und die daraus abgeloitoto Längn dos a-Amylaso-Vorläuforprotoins beträgt 407 Aminosäuren. Dio 3'-nicht-translatiorto Rogion ist ohne den Poly(A)-Schwanz wenigstens 200 Nucleotide lang, aber wahrscheinlich nicht viol länger, da ein wahrscheinliches Poly(A)-Signal 30 Nucleotide vom Ende entfernt gefundon wird. Poly(A)-Signalo sind in Tieren, v/o praktisch allo Gene die Sequenz AATAAA etwa 20 Basenpaare von dor Polyadenylierungsstelle (Proudfoot & Brownloo, Naturo [1976|, Bd. 263, S. 211-214) entfeint habon, extrem gut konserviert, in Pflanzen, obwohl AT-roich IHunt et al., Plant Molecular Biology 11978), Bd. 8,8.23-35IjOdOChZiOmIiCh dogonoriert.

Beispiel 9 Besonderheiten dor Nuclootldsequenz dor Kartoffol-a-Amylase AmyZ3/4-Mossenger-RNA

Fig. 11 veranschaulicht dio ungewöhnliche Struktur der Kartoffol-a-Amylaso-Mossongor-RNAs: sie haben sohr lange, offene Lesorastor onthaltendo 5'-Signalpoptid-Rogionon (Fig. 17). Zusätzlich sind in don AmyZ3- und Z4-Clonen zwoi verschiedene Typen von Transkripton aus demselben Gon isoliert wordon, wobei das oino ein Intron in der Signalpeptid-Region hat. Normalerweise machen nicht-gespleißto Transkripto oinon sehr goringcn Bestandteil dor PoIy(A)-RNA aus. Die Tatsache, daß ein nicht-gesploißtes Transkript (in einem cDNA-Clon) isoliert worden ist, doutet an, daß sio ziomlich häufig sind und möglicherwoiso oino bostimmto Funktion habon. In anderen Systemen wurde gezeigt, daß solche Introns oinon stabilisierenden Effekt auf die Mosscnger-RNA haben (Callis, J., Fromm, M. und Walbot, V., Genes and Dovolopmont |1987|, Bd. 1, S. 1183-1200; Huang, M.T. F. und Gorman, C. M., Nucloic Acids Res., 11990), Bd. 18, S. 937). Dio Menge an von der Messongor-RNA translatierton Proteinen könnte so durch den Grad, mit dem das Signalpoptid-Intron herausgespleißt wird, reguliert werden. Lange Signalpoptid-Sequonzen mit offenen Leserastorn sind kürzlich auch in Erbsen-Phytochrom-Transkripten gefundon worden (Sato, Plant Mol. Biol [1988], Bd. 11, S.697-710). Es ist nicht bokannt, ob die Lesoraster in Kartoffel-a-Amylase- oder Erbsen-Phytochrom-ö'-Signalpeptid-Sequenzen tatsächlich in den Pflanzen translatiort worden. Dies könnte getestet werden, indem Antikörper gegen künstliche Peptide mit der in Fig. 11 gezeigten Sequenz gemacht wordon und dioso Antikörper in Reaktionen mit Pflanzenzollextrakten eingesetzt werden.

Beispiel 10

')lo Nuclootidsoquonzon von KartoKol-a-Amyloso AmyZ7 und AmyZ2-Mo«»onger-RNAs FiQ. ? zoiot dio Niiclootidsoquoni dos Mossongor-RNA-tthnlichon Stranges dor Insoilion dos KnrtoffolaAmylasocDNA-Clons AmyZ 7. Uio Soquonz ist solu homoloo zur Soquonz von AmyZ3/<1, dor Clon Ist am 5'Enclo allerdings kürzor, und das orsto Nuclootid in Fig.2 l-nnn auf Nuclootid 543 in Fig. 1, dos dns dritte Nuclootiddnslnitiiitionscodons ist, ousgorichtot wordon. Dio Ausrichtung läßt sich olino Lückon übor das Translntions-Stopcodon hinnus durchführen und dns von AmyZ7 codiorto Vorläuforprotoin ist obonso wio das von AmyZ3/4 codiorte Ί07 Aminosäuren lang. DIo 3'nichttranslatiorto Rogion ist 187 NtK:li>ntido lang, daran schlioßt sich oin noun Hnsonpnnro langer l'oly{A)-Schwanz an.

Fig. 5 zoigt Ίίο Nuclootidsoquonz dos Mossongoi -RNA-ähnlichon i.'.trniujos dor Insoition (U Kortoffol-ct-Amyloso-cDNA-Clons AniyZ2. DioSoquonzistalsAmyZ2Pbozoichtiot,umnnzuzoigon, dnlSuinwähronddosClonioronsamö'-Endefälschlichorwoiso oingobautor Strang von 70T-RoStOn nicht in Fig.5onthaltonist.Dio Soquonz ist sohr homolog zur Soquonz von AmyZ3/4, allordings ist dor Clon sowohl am 5'-, als auch am 3'-EmIo kürinr. Dos orsto Nuclootid In Flg. 5 lilßt sich auf das Nuclootid 1023 in Fig. 1 und das lotzto Nuclootid in Fig.5 auf dns Nuclootid 1756 in Fig. 1 ausrichten. Unorwarlotorwoiso oriordort dns Ausrichton, ilaß zwoi Lückon in dio AmyZ2-Soquonz oingofügt wordon (als froM Siollen in Fig.5 dargostollt). Daraus folgt, daß dor offono a-Amylaso-Losornstor untorbrochon ist und das AmyZ 2 nicht für oinon Toil oinor Kartoffol-a-Amyloso codiert. AmyZ2 woist, im Vorgloich zu AmyZ3/4, zwoi Dolotionon auf: oino Dololio \ könnte oinom onzymntischon Fohlor währond dor Synthoso dor doppolsträngigoi\ cDNA im Cloniorungnvorfnhron zugcJuiobon wordon, das Auftrotor. zwoior solchor Fohlor In oinom Clon ist jedoch sohr unwahrscheinlich. Man kann dahor darauf schließen, daß im AmyZ 2 ontsprochondon Gon mindostons zwoi Dolotionon in dor codiorondon Region vorhanden sind. Andors ausgodrückt, hat das AmyZ2-Gon fatalo Mutationon orlittor und ist oin Psoudogon gowordon. Während dor woitoron Evolution wordon in solchon Gonon woitoro Mutationon gosetzt, gogon dio os koino Soloktion gibt, und mit dar Zeit wird das Gon auch die Fähigkeit, transkribiert zu wordon, verlioron. Es ist dahor ziomlicti selten, daß l'souclogeno aktiv sind. Obwohl AmyZ2 nicht länger für oinon Toil oinor Kartoffol-a-Amyloso codiort, trägt soino Isoliorung zur Aufhellung der Struktur von Kortoffol-u-Amylaso-Gonon und Genfamilionboi und kenn obonso wie AmyZ 3/4 und AmyZ7 (odor Fragmonto dnvon) in Hybridisiorungsvorsuchon vorwondot wordon.

BoisplolH

IMuclootldsoquonzon dor Kartoffol-a-Amyloso AmyZ 1 und AmyZ6-Mossongor-RNAs Fig.3 zoigt dio Sequenz Jos Mossongor-RNA-ähnlichon Strangos dos Kortoffol-a-Amylaso-cDNA-Clons AmyZ 1. Dio Soquonz ist wesentlich vorschiodon vom AmyZ3/4-l yp (Beispiel 7), das orsto Nuclootid in Fig. 3 jodoch kann ungefähr auf Nuclootid 740 in Fig. 1 ausgoi ichtot wordon. Das orsto, im solbon Losorastor wio das a-Amylaso-Gon bofindlicho Coclon ist das Stopcodon, diosos Stopcodon ist jodoch so nah an o'ui Cloniorungsstollo, daß os oinom Cloniorungsfohlor zugoschriobon wordon kann. Es ist dahor nicht wahrscheinlich, daß AmyZ1 das Produkt oinos Psoudogonsist, wio für AmyZ 2 in Doispiol lOboschriobon. Dor offono a-Amylase-Lesorastor ist 350 Codons Inng, und dio Soquonz ondot mit oinor 163 Nuclootido !»ngon S'-nicht-translatiorton Region, dio koinon Poly(A)-Schwanz hat.

Fig.4 zeigt die Sequonz dos Mossongor-RNA-ähnlichon Stranges dos Kartoffol-a-Amylaso-cDNA-Clons AmyZG. Sie ist zu dor Soquonz von AmyZ 1 zu 91 % homolog, dio Hälfto dor Nucleotiduntorschiodo zwischon AmyZ 1 und AmyZ6 ist jodoch in oinor Region stromabwärts vom Stopcodon in AmyZ 1 konzentriert. AmyZ 6 ist am 5'-Endokür/or als AmyZ 1; Nuclootid 1 in Fig. 4 kann auf Nuclootid 201 in Fig. 3 ausgerichtet wordon. AmyZ 6 hat oino, ein Bnsonpaar umfassondo, Position 806 in Fig. 3 ontsprcchondo Nuclcotiddoletion. Dar Ergebnis hieraus ist, daß dor offono a-Amylnse-Lcsorraster von AmyZ6 am 3'-Endo 66 Codons kürzer ist als der offono Lesorastor von AmyZ 1. Diosos Ergobnis wird weitor im Ooispiol 14 orläutort. Dio AmyZ6-Soquonz ondot mit oinor 360 Basonpaaro langen S'-nicht-trnnslntierton Rogion. Do AmyZ6 und AmyZ 1 sohr homolog sind, ontspricht dor orsto Toil dor 3'-nicht-translatiortcn Region in AmyZ6 dor Region in AmyZ 1, dio für dio 66 terminalon Amirr näuron codiort.

Beispiel 12

Randhomologion zwischon Kartoffel· und Gorsto-a-Amylnso-Mossongor-RNA» Nachdem dio Nuclootidscquonz dor Kartoffol-a-Amylaso-cDNA-Clono bestimmt wordon war, wurdo dio tatsächliche Homologio zum Sac 1-Fragment dor Gorstc-a-Amylaso-Sondo (Fig. 7), mit der dio Isolierung dor ontsprochondon Kartoffel-cDNA-Clono durchgeführt worden war, bestimmt. In Fig. 10 sind dio EcoRI-Fragmonto dor AmyZ-Clono, die mit dor Gorsten-Sondo hybridisieren, dargestellt. In Fig. 14 ist dio Nuclootidsoquonz dos hybridisierenden EcoRI-Fragments aus AmyZ4 gegen dio entsprechende) Sequenz dor Gerston-S.ondo ausgerichtet. Es ist ersichtlich, daß die Homologie nur 63,5% beträgt. Innerhalb dioser Sequonz gibt es jedoch oino küriore, 146 Nuclootido lango Rogion mit oinor Homologio von 73%, die oinon Kern von 46 Nucleotiden mit 80% Homologio enthält. Dieselbe Art von Verglolch wurde mit dom mit dor Gorston-Sondo (Fig. 9 und Fig. 10) hybridisierenden EcoRI-Frayment aus AmyZ6 durchgeführt. Insgesamt betrögt die Homologio 66%, eino kürzore Region von 110 Nucleotiden hat eine 77-%·, und ei ι Kern von 62 Nucleotiden hat eine 84-%-Homologio. Es ist frühor gezeigt wordon, daß Homologion in dieser Größenordnung jorado ausreichen, um hybridisierondo Scquenzon in hoterologen Hybridisiorungon untor Bedingungen niedrigor Stringonz zu finden (Nielsen & Gausing, FEBS Lottors |1987), Bd. 225, S. 159, P. S. Nielsen, Dissertation (1987], Univorsität von Aarhus, Dänemark). Die Analyse hobt dio Bedeutung oinor vorsichtigen Optimierung, nämlich (1) die Herkunft der für die Kartoffol-cDNA-Gonbank verwendeten Messenger-RNA, (2) dio Hybridisiorungsbedingungen und (3) die Beschränkung dor Länge der Gerston-Sonde auf das Subfragment, das dio Bereiche ausreichender Homologie für dio Isolierur g der Kartoffel-a-Amylase-Clono enthält, hervor.

Beispiel 13

Eigenschaften dos a-Amylase-Vorläuferprotolns, für das AmyZ3, Z4 und Z7 codioron Die Nucleotidsequenz in Fig. 1 enthält einen langen offenen Leseraster von 407 Codons, und dio abgeleitete Aminosäuresequenz ist unterhalb der Nucleotidsequenz dargestellt. Um dio Identität des Kartoffol-a-Ar.iylaso-Clons 2u bokräftigon, wurdo dio abgeloitote Aminosäuresequenz mit der von der Sequonz von pM/C abgeleiteten Sequonz dor Gersto-ci-Amylase verglichen. Dor Vergleich ist in Fig. 15 dargestellt. Der Anteil an identischen Aminosäuren beträgt 45,6%, und in 72 Positionen befinden sich ähnliche Aminosäuren. Diosor Grad an Ähnlichkeiten ist trotz der Anzahl an Lücken, dio eingefügt wurden, um dieÄhnlichkoit auf ein Höchstmaß zu bringen, signifikant und deutet an, daß dio beiden Sequenzen einen gemeinsamen evolutionären Ursprung besitzen (Doolittle, Science [1981 ], Bd.214, S. 149-1 bu). Die Plasmide AmyZ3 und Z4 sind daher Kartoffol-a-Amylaso-cDNA-

Clono. Darübor hinaus ist das Im Knston in Fig. 15 dargostollto l'opticl so(jnr in a-Amylnson von Srtugotioron und Insoklon konserviert (vgl. (55)).

Dio in Fi(J. 2 dargestellte Nuclootidsoquoni, dio iu dor in Fig. 1 gozoigton Soquoni in dom llnroLn, in dom sio utorlappon, 99,2% homolog ist, codiort wio AmyZ3/4 für oin 407 Aminosäuron langos Peptid (mit dor Ausnnhmo, < .iß dio orston boidon Nuclootido dos lniiiiitionscodons in AniyZ 7 folilon). Dio Soquonion dor durch AmyZ3/4 und AinyZ/codior, ¹Da-AmVInSO-VOrIiIUfOrPrOtOlIiO unterscheiden sich an droi Positionell, woboi in jodor Position ähnlicho Aminosiluron gofundon wordon: Position 37 hut Luucin nnstcllo von Isoloucin, Position 333 hat Phenylalanin anstollo von Tyrosin und Position 3B!> hat Valin nnstollo von Mothionin. a-Amylaso wird als Vorliiuforprotoin in Gorsto und Waizon mit oinom sogonannton Gignalpoptid am Ν·Τ( ι minus dos Poptids synthetisiert. Signolpoptido vorniittoln dun Transport durch Mombrnnon und hubon gomolnsnmo, zum Teil zwischc n Prokaryonton und EukaryontonkonsoiviortoEigonschafton (Watson, NUCLEIC ACIDS RES. 1198Ί), Bd. 12, S. 51Ί5 -5164). Sio sind 15 bis 30 Aminosäuren lang und boinhalton im mittloron Uoroich oino hydrophobo Rogion. Dio Aminosäuren dirokt vor und hinter dor Prozossiorungsstollo ontsprochon oinom bostimmlon Mustor, das dazu vorwondot wird, dio ProzossiorungsMollo in Vorliiuforprotoinon, wo sio nicht oxporimontollomiittolt wordon ist, vorauszusngonlvonHoijno, Eur. J, Diochom. [1983|, (3d. 133, S. 17-21). Um dio Strukturon dos vollständigen a-Aniylaso-Vorläuforprotoins und (Ins Signalpoptids zu veranschaulichen, wurdo ein Hydrophilitätsprofil für das Poptld borochnot (Fig. 18). Dio Figur zeigt don kurzon hydrophobon Borolch in dor Nähe dos N-Tomiinus dos Vorläuforprotoins, woboi dio ontsprochondon Aminosäuren niilior bozoichnot sind. Dio wahrschoinlichsto Prozossiorungsstollo ist gokonnzoichnot. Sio wurdo untor Anwondung dor von von Hoijno vorgoschlagonon Rc join gofundon; dor Glyciiirost in Position -1 ist von bosondc ror Dodoutiing, dor Argininrost in Position 3 i'l^'owohnlich. Vu glichon mit onderon ouknryontischon Signalpoptidon ist dio hydrophobo Rogion kurz. Kuiro hydrophobo Rogionon fiiulot man häufiger in prokaryontischon Signalpoptidon. Es wird gefolgert, J₁(J das Kartoffol-u-AmylasüVorlniifurprotoin mit oinom Signolppptid bocjinnt und daß dio wahrscheinlich« Prozossiorungsstollo nach dom Glycin in Position 18 ist. Dio Struktur dos Signalpoptids ist jodoch «typisch und könnto auf oinr ι speziellen Tinnsportniochanismus hindeuten. Der Ort dor Aktivität dos roifon Enzyms ist weder in Kartoffolkoimon noch in Gotroido genau hoknnnt.

Das Hydrophilitätsprofil dos roifon a-Amyhiso-Enzyms (Fig. 18) zoigt koino nusgoprhgton hydrophoben od'.r hydrophilon Regionen, und dio Analyso sagt voraus, daß das fcnzym löslich ist.

Dio Aminosäurezusammonsotzung der von AmyZ3 und Z4 codiorton roifon a-Amylaso wird in dm fnlgondon Tnhollo mit der Zusammensetzung dor zwoi Arton von Gorstoa-Amylaso vorglichon.

a-Amylnson: Aminosaurozusammonsotzung (%)

Aminosäure	Kartoffel	GorstoA(niodrigorpl)	Gorsto ü(hohorpl)
		(Amy2)	(AmyD
AIn	6,7	11 I	8,7
Arg	4,9	3,0	4,5
Asn	4,6	4,1	4,0
Asp	6,9	8,9	9,2
Cys	0,8	U	0,7
GIn	4,1	2.)	3,2
GIu	4,1	3,1	4,0
GIy	8,2	10,6	10,9
HIs	3,9	2,9	4,0
Ho	6,4	5,6	6,2
Leu	6,4	6,0	7,2
Lys	6,2	5,3	5,9
Mot	1,8	2,9	1,5
Pho	4,4	3,6	4,0
Pro	4,4	4,1	4,7
Ser	7,5	5,1	3,2
Thr	5,1	4,1	4,2
Trp	4,1	3,9	4,0
Tyr	4,4	3,9	3,7
VaI	5,1	6.8	6,2
MW	4439/	45288	4G003
sauer (D, E)	11.1	12,1	13,1
basisch(R,K)	11.1	8,9	10,4
aromatisch
(F, W, Y),	12,9	11,4	11,6
hydrophob
(F, W, Y, I, L, M, V)	32,6	32,6	32,7
Nettoladung boi
pH 7,0	O	-13	-11

Die Gerste- (und Weizen)a-Amylasen sind sauer (pls 4,9-6,0) und saut · ^:. leutral (pls 6,3-7,5). In der neueren Nomenklatur sind Typen mit höherem pl vorzugsweise mit Amyh und Typen mit nie' icom pl mit A.ny2 bozoichnot. DieKartoffel-a-Amylasevom Typ AmyZ3/4 ist neutral und die Sequenz ist dio Soque izwie in Hcispi'jl 15 beschrieben, ist die Sequenz von den Gotreido-Typ 1 · und und -Typ 2-Sequenzon gleichermaßen vorcchiodi n.

Beispiel 14

Eigenschafton de· TeIIw der ct-Amylato, IQr d!o AmyZ 1 und AmyZe codloron

DionicdrigoHomologiodor NuclootidsO(|uonzdosKarloliol-AmyZ3/4-Typsauf dor oinmiunddosAinyZ 1-1 ypsnuf clof tindorcii Soito (55 60%, Uoispicl 7) I ο > 11 ο naho, dal$ sin fur oindoutiy vorschioilono ci-Amylason codioroii. Oios ist in dor Tm dor Fall: dio Homologie der Aminosit uroscquonzon zwischon dor AmyZ 3/4-a-Amyloso und dom Toil dor Amy Z1 -u-Amylnso botr ayt lodiglich '15,9⁰O. a-Amylaso ist aus Kartoffoln gmoinigt worden (Fnn, M. I.., Tniwnnin 11975), Dd. 20, S. 71 70, os ist jedoch nicht möglich, dnrnus abzuloiton, ob dio Preparation oino Mischung ausdomAmyZ3/4-Typ und dom AmyZI-Typ wnr odor nur oinon Typ (dor wiodorum wahrscheinlich omo Mischunu nus oiiy vnrwiindlon a-Amylason ist, dio I)Oi jodom Typ yofundon wordon und in Fiy. 1 und 2 bzw. Fiy.3 und<1dnryostollt sind) onthilll.

Wioin Fiy.3 und Ί dargestellt und in Uoispiol 11 boschriobon, 1st dio AmyZO-u-Amylaso am C-torminalon fc'ndo OO Aminostturon kürzor als dio AmyZ 1-u-Amylaso. Vorschiodono Lftnyon in dor C-torniinolon ftoyion sind mich boi Gorstoa-Amylnson gofundon wordon (Hunng, J.-K.,Swoglo, M., Dnndoknr, A. M. und Muthukrishnon, S., Plnntt Mol. Biol. |1984|, Bd. 9, S. 3 -17). Oios /Ji(Jt, dafi dor C-torminaloBoroich nicht wichtig für dio kataly tische I unktion dos Eruyms ist, do(iUntorschiodo in dor Länyojodocli nndoro Eiyonschofton dor Enzyme, wio spoiifischo Aktivität, TompcaturabhHnglgkoit und pH-Optimum, booinllusson konnon. Fig. lezoiyloinenVorglcichdorAminositurosoqutinzon, mjfgcichlussoltvomGorstoa-Amylaso-ClonpM/CundvomKnftoffol-u-AmylnsoClon AmyZ 1. Dio Durchnumoriorung dor Aminostluron bezieht sich mil das GorstouAmyloso-Vorlttuforprotoin. Trot/ dos Ergobnissos, daß dio lokalon Nucleotld-Sciiuonzhomologion zwischon dur pM/C-S.i(|uoni und (lon jnwoiliyon ΑηιγΖ3/Ί· und AmyZ 1 -Typ-So(|iionzon nicht wosontlich vorschlodon sind (doispiol 12), botrtigt dio Aminosaurosoi|uonihomologio 2wischon dor Gorsto-pM/C-n-Amylnso und dor Kartoffol-AmyZ 1-u-Amylaso 04,1 % und i: t somit siymliknnt u'ößor als dio iwischon dor Gorsto-a-Amyloso urul (lon Kortoliel-ArnyZ3/4-Typ-a-Amylnson (45,0%, Fig. 15). Ebonso wio dio AmyZ3/4-o-Amylaso ist dio AniyZ 1·α Amylaso nicht vonugswoiso homolog Ju oinom dor Typen von Gotroido-ci-Amyloson (Uoispiol 15). Etwa 87 % dor vollstnndigcn, roifon Aniinosituroso'.|uoni dos Kartoffol-a-Amylaso-Typ AniyZ 1 ist in I ig. 3 dnrgostcllt. Ein Voryloich diosos Poplids mit dom ontsprochoncion Peptid dor AmyZ3/4-a-Amylnso joigt, dnli dio AniyZ 1 -o-Aniylnr.o sauror als dio AmyZ3/'1-a-Amylaso, abor bas'ischor als dio boidon, in dor Tnbollo in Uoispiol 13 aufyofuhrton iursto-o-Amylason ist. Dio Ladung dos in Fig.3gozoi(jtonToilsdcr a-Amylaso ist daher etwa --6boi/>H7.

Bolsplol 15

Üliorbllck Ober Gotroldo-a-AmylasoGonsoquonzon, Vergleiche dor obgololtoton Anilnoseurosoquomon und Ihr Vorhftltnls tu

don Kartoflol-a-Amylasen

In dor folgondon Tabelle sind dio in don Gonbank· und EMDL-Sc(|uonz-Datonbankon gofundonon (Mlniizoiva-AniylnsivCionc/ cDNA-Soquonzon iusnn<mon mit ihron Typon, sowoit zuyoordnol, dio Datonbank-Eintragungon, dio Clon-Namon I dio

Litoraturstollon nufgolistot.

Typ	Namo	Clon
Amy I	BLYAMY1	amy 1
	(HVAMY 1)
	BLYAMY 1 A	P141.117
	(HVAMY 1 A)
	BLYAMYABE	priV 19
	(HVAMYABE)
	BLYAMYABD	pM/C
	(HVAMYABD)
	BLYAMYABA	103
	(HVAMYABA)
	BLYAMVABB	168
	(HVAMYABA)
	BIYAMYABC	96
Amy 2	BLYAMY 2	amy?
	(HVAMY 2)
	BLYAMYG	Lnmbda-aniy'32b
	(HVAMYG)
	BLYAMMYAA	E
	(HVAMYA)
	BLYAMY 2 A	ρ 155,3
	(HVAMY 2 A)
Amy 1	M 24286	M24286
Amy 32	(OSAMYA)	M24941
?	(OSAAMYB)	pOSi37
Amy 1		Amy 1/13
Amy 2		Amy 2/54
Amy 3	WHTAMYA	liimbda-amy3/33
	(TAMY 3 or TAAMYA)

Hoforonz

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O'Neill, S. D., Kumagai, M. H., Mejumdar, A., Huang, N., Sutliff,

T. D. Rodriguez, R. L. (1989) nicht veröffentlicht Baulcombe, D. C, Huttly, A. K., Martionssan, R. A„ Barker, R. F.

und Jarvis, M. G. (1987) Mol. Gon. Gcnot 209,33-40.

Dot Nemo dos Clons entspricht dom in dor Datenbank aufgoführton: GonBank vom National Institute of Hoalth

lusummo;· :|ostollt. Dor in Klnmmorn aufgoführton Namodos Cloni ontsprichtdom in dor Datonbank; EMDL, vom Europonn

Moloculi.i liolony Lnboralory zusammongostollt. Dio orston 11 Clr>no wurden aus Goreto (Hordoum vulgaro), dio nitchston clroi

aus Rois (. ι via sativa) und dio lottton droi nus Woizon (Triticum icotivum) isoliort.

Oio T.iLoiio zoigt, daß eino Anzahl von ci-Amylaso-Gonsoquonzor in Gnrsto, Woizon und Hois ormittolt worden 1st. Dio Gotroido

sind, wio alle Grflsor, monocotylodono ΙΜΙαη.-οη, wohlngogon dio Kortofiol olno dicotylodono Pllonzo ist; in don Datonbankon gibtos koino a-Amylaso-Gonsoquonzon aus dicotylodonon l'flonzon.

AIIo in do* Tobollo aufgoführton Nuclootidsoquonzon wurdon aufgosclilüssott, und pnnrwoiso Momologion aller a-Amylaso- Aminosdurosonuonzon wurdon borochnot. Die Aminosfiurosoquonzon dor in Fig. 1-4 dargostollton Kartoffol-a-Amylaso wurdo

nuf ähnliche W iiso miteinander und mit nllonAmlnosauroscquonzon aus Gotroido vorglichon. Das Ergobnis ist in dor folgenden

Tabollod.irgo lollt:

Aminosaurohomologio	BLYAMY 1	ELYAMY1	A	BLYAMYABE	BLYAMYABD	BLYAMY 2	BLYAMYG	BLYAMYAA	BLYAMY 2 A
Gorsto *	91,6	92,7	98,5	73,0	96,4	98,7	88,1	70,6
	98,4	91,4	75,6	73,0	99,8	87,6	74,8	63,3
DLYAMY1 A	99,8	70,8	76,1	73,2	87,9	66,9	67,8	63,6
GLYAMYABE	72,8	70,1	75,9	69,9	74,5	66,9	07,4	69,3
BLYAMYABD	72,8	71,0	73,4	82,1	67,8	64,2	73,6	8-1,9
BLYAMY 2	73,0	62,2	85,0	70,3	67,2	73,3	94,5	60,4
BLYAMYG	69,7	80,5	72,5	69,4	73,4	93,3	64,0	59,9
BLYAMYAA	91,8	68,6	72,2	93,2	94,:i	63,0	03,3	61,5
BLVAMY 2 A	70,0	68,1	94,5	72,5	Γ.2,6	62,7	67,8	41,5
M 24.186	69,1	92,8	75,3	66,0	63,3	67,3	44,3	41,5
ÜSAMYA	93,0	70,3	67,8	64,1	67,8	45,7	44,3
OSAMYB	72,2	63,3	68,1	67,1	4-1,3	45,7
Amy 1/13	62,3	02,2	68,6	46,2	44,3
Amy 2/54	64,1	65,1	<!/,2	4G,2
WHTAMYA	C/,1	45,1	47,5
AmyZ 1	45,9	45,1
A~nyZ6	45,9							Kartoffel *
Amy Z 3/4				Woizon^
Amy Z 7	M24286	OSAMYA	OSAAMYB	Amy 1/13	Amy 2/54	WHTAMYA	AmyZ1	Amy Z 8
Reis*	70,3	75,8	69,7	72,5	64,2	56,0	91,7	56,6 Amy Z 3/4
	,7,8	69,8	66,4	64,8	62,8	59,5	45,9	57,1 99,3
OSAMYA	82,/	67,5	66,8	64,4	67,8	43,6	45,9
OSAMYB	73,5	72,1	61,0	67,1	44,6	43,9
Amy 1/13	69,5	62,7	68,3	46,2	44,6
Amy 2/54	61,6	68,3	42,7	46,2
WHTAMYA	64,1	43,3	42,7
AmyZ1	45,0	43,3
Amy Z 6	45,0
Amy Z 3/4
Amy Z 7

Unter den violon Beobachtungen, dio mit einer Homologiematrix gemacht werden können, sind die folgenden von besonderer Bedeutung für Kartoffel-a-Amylason. Gorsto und Woizon sind ong vorwandt, und die fottgodruckton Zahlen in dor Tabelle zeigen, daß Gorsto und Woizon ong verwandte Sub-Genfamilien haben, die für Amylaso Typ 1 bzw. Amylaso Typ 2 codieren. In Woizon ist oin drittor Typ von a-Amylase, Amylase Typ 3, gofundon worden, der in Gorsto bishor noch nicht gofunden wurde. Rois ist nicht so eng mit Gerste und Woizon vorwandt, wie dioso untereinander, und die Zuordnung der Reis-a-Amylase zu don drei Typen von Woizon-a-Amylason ist wenigor klar. Dio Kartoffel ist mit den Gotroidopflanzen nur sehr woitläufig verwandt. Jede dor Kartoffelsequonzen ist zu allen Gotreidosequenzon etwa gleich homolog, und die Kartoffol-a-Amylason können auf dor Grundlage von Aminosaurovorgloichon keinem der droi Typen von Gotroido-Amylason zugeordnet worden. Auf dor andoron Soito fällt ins Auge, daß die Kartofol AmyZ 1 -Typ-a-Amylason oinon höhoren Homolgiograd zu don Gotroido-a-Amylason, als zu den Kartoffel-AmyZ3/4-Typ-a-Amylasen haben.

Beispiel 16 Anordnung von a-Amylase-Gonon in Kartoffeln DNA aus Kartoffeln wurdo in Southorn-Hybridisiorungen (15) analysiert, woboi zwei Reihen von Exporimonton durchgeführt

wurden. Im ersten Experiment (Fig. 19) wurden einzelne EcoRI-Fragmonto von AmyZ3 mit DNA aus dor Kartoffelsorte Saturnahybridisiert, und in diesem Experiment wurden dio zu dem AmyZ3/4-Typ von Sequenzen gehörenden Allole/Geno untersucht.

Im zweiten Experiment (Fig. 20) wurde DNA aus zwei Kartoffelsorten cetronnt mit den vollständigen Insertionen aus AmyZ3/4

und AmyZ 1-Typ-Sequenzen hybridisiert. Diosos Experiment zoigt, daß dio zwei Typen von Sequenzen aufgrund der zwischenden beiden Typen von Soquonzen auftretenden niedrigen Sequonz-Homologie nicht kreuzhybridisieren. Darübor hinaus zeigtdas zweite Experiment DNA-Fragmont-Poiymorphismen in den a-Amylase-Genon verschiedener Kartoffolsorten.

Fig. 19 zeigt das Ergebnis eines Experiments, in dem DNA der Kartoffelsorte Saturna mit EcoRI, Hindlll oder BamHI gespalten

wurde, die Fragmente auf Agarosegelon aufgetrennt und auf Nitrocellulosofiltor transferiert wurden. Ein Filter wurde mit denradioaktiv markierten EcoRI-Fragmenton Nr.2,3 und 4 aus AmyZ 3 (vgl. Fig. 10) und ein anderer, identischer Filter mit EcoRI-

Fragmant Nr. 1 hybridisiert. Die EcoRI-Mustor zoigen vier starke Banden (etwa 6,0,4,0,2,2 und 1,5Kb) und sechs schwächere

Bnndon (olwa /,7,6,8,4,5,3,1,2,8,2,5 und 1,OKb) mit don Sondon 2, 3 und 4. Einigodor Dandon hybridisieren cbonso mit Sonde 1. Da.'.,jor hinaus tnurhon zwei nouo Dandon (1,7 und 1,2 Kb) auf. Das Hindlll-Mustor zeigt drei starke Dandon (otwa 15,7,0 und 1 .·' Kb) und droi schwachoro Dondon (5,4,4,4 und 1,8Kb) mit don Sondon 2,3 und 4. Das I₁OKb- und bosondors das 1,4Kb-Signal louchton mit Sondo Nr. 1 sohr stark auf, und dioso Fragmonto onthnltoii don Toil dor AmyZ3/4-Typ-Gono mit dom Stnrt dos offenen a-Amyloso-Losorastors. Fig. 20 zoigt das Ergebnis oinosExporimonls, in dom DNA dor Kartoffolsorton Saturna und Diano'la mit EcoRI, Hindill odor üninH I gospalton und zwoi idontischo Fillor, wio obon buschriobon, angofortigt wurdon. Ein Filter wurdo mit der radioaktiv markiorton, vollständigen Insertion von AmyZ 3, dor andoro Filter mit dor radioaktiv markierten, vollständigen Insortion von AmyZ 6 hybridisiort. Dio mit don AmyZ 3-Soquonzon hybridisiorondon Saturna-DNA-Fragmonto sind die (iloichon in Fig. 19 und Fig.20, mit dor Ausnahmo, daß dio schwilchoron Bnndon In Flg. 19 in Fig. 20 nicht deutlich zu solion sind. Wenn dio mit dor AmyZ 3-Sondo in Fig. 20 orhaltonon DNA-Fragmont-Mustor von Saturna- und Dianollo-DNA mitoinandor verglichen wordon, zeigt sich, daß oinigo Dandon in boidon Mustern, manchmal mit vorondortor rolativor Intensität, andoro Danden jedoch in einor dor DNAs nicht miftroton. Ein Boispiol ist dio Abwosonhoit dos 15Kb Hindlll-Frogmonts in Dianella-DNA, dio anstelle clesson oino stttrkoro, doutlich sichtbaro Doppolbando bol 7,0Kb hnt. Dioso Art von DNA-Fragmont-Poiymorphismus kann in RFLP-Analyson, wio in Beispiel 27 boschriobon, untersucht v/oicinn.

Die Isolierung von droi vorschiodonon, abor stark homologon cDNA-Clonen logto für die AmyZ 3/4-Typ-Amylase -Soquonzon dor Sorte Dianolla naho, daß dioso droi Soquonzon von droi Allolon dossolbon Q-Amylaso-Gons abstnmmon. Das in Fig. 19 unc. 20 sichtbare, sohr einfacho Bondonmustor logt, kombiniert mit dom Wisson, daß dio AmyZ 3/4-Typ-Soquonzon sowohl Ecof", als auch Hindlll-Rostriktionsschnittstollon bositzon, nnho, daß Kartoffoln nur oin a-Amylnso-Gon dos AmyZ3/4-Typs, jedoch I is zu vior verschiodono Allole pro Sorto habon. Dio Beschränkung von Southorn-Analyson müssen jedoch berücksichtigt worden sowohl sohr großo air auch koino DNA-Fragmonto wordon möglichorwoiso nicht or faßt. In Fig. 20 wurdon Saturna· und Dianolla-DNAs mit don vollständigen Insortionon aus AmyZ3 und AmyZG hybridisiurt. Die DNA-Bcindonmustor sind vollständig verschieden für die boidon vorschiodonon Typon von a-Amylaso-Soquonzon, was, wio aufgrund dor niodrigon Soquenzhomologio zwischon den boidon Typon von Genen orwartot, zoigt, d?ß sie nicht krouzhybridisioron. Wio in Boirf.ml 7 beschrieben, könnton ArnyZ 1 ' AmyZ6 die Produkto von Allolon oinos Gens soin, möglichorwoiso sind sio abor auch verschiedene Gone, dio zur sollx.. ib-Gonfamilie gohören. Das mit dor AmyZG-Sondo auftrotondo ßandonmustor ist komploxor als das mit dor AmyZ3-Sondo gesohone Mustor, was möglichorwoiso andoutot, daß os mohr als oin AmyZ 1 -Typ-Gen in Kartoffeln gibt. Die Southern-Analyse schließt daher nicht aus, daß AmyZ 1 und AmyZG zwei vorschiodono Gono darstellen (dio Möglichkeit von bis zu acht verschiedenen Allolon oingoschlosson). Ebonso wio mit dor AmyZ3-Sonde sind die mit dor AmyZG-Sonde auftretenden Bandonmustor in boidon Kortoffolsorton verschieden. Somit können boido Typen von a-Amylaso-Sequenzen in RFLP-Anolyson vorwendot werden.

Beispiel 17

ci-Amylase-Messonger-RNA In Kartoffelkelmon und -knollen

Saturna-RNA wurde in zwoi verb.-hiodonen Experimenten mit dom AmyZ3 EcoRI-Fragmont Nr. 1 und don EcoRI-Frayment Nr. 2 + 3 + 4 (s. Fig. 10) hybridirier*. In beiden Exporimonten war oino Bando von 1500 Nucleotiden sichtbar. Dio anderen RNA·ProbonwurdonmittionAmyZ.?t:coRI FragmontonNr.2 + 3 + 4hybridisiort.DiorosultiorondonAutoradiogrammosindin Fig. 21 dargestellt, und dio Größen der jeweiligen Transkripto sind in der folgenden Tabelle gcgobon.

Kartoffolsorten	Gowi-bu	Transkriptgrößo,
		Nucolotido±100
Dianella	Keim	1950
Saturna	Keim	1500
Dianella	Knollo	(1 950)
Saturna	Knolle	1700 und 2400

Die Transkript-Größon sind Näherungswerte, die Unterschiede in don Transkript-Größen jedoch klar. Darüber hinaus ist bekannt, daß die eino Bande in Dianella-Koim-RNA wenigstens drei Typon von a-Amylaso-Transkripton enthält: die reifo Mossonger-RNA, einen Vorläufer mit oinom 128 Nucleotide langen Intron, AmyZ3 und Z4 (vgl. Fig. 11) entsprechend und eino AmyZ2 entsprechende mRNA (Fig. 12).

Die Knollen-RNAs wurden aus bei 8°C golagorton Knollon isoliert. Dio Knollon wurdon nach 19 Wochen Lagerung in der letzten Januarwoche entnommen. a-Amylase-Transkripte wurdon sowohl in Saturna, als auch in Dianella gofunden, dio Dianella-RNA-Qualität war jedoch suboptimal. Es ist möglich, daß auch Dianolla-Knollen lange Transkripte zusätzlich zu doi für die reife a-Amylasc-Messengcr-RNA charakteristischen Größe enthalten.

Die Hybridisierung wurde unter stringenten Bedingungen durchgeführt, und daher wurden nur a-Amylase-Sequenzon dos AmyZ3/4-Typs entdeckt, vom Cloninrungsergebnis ist jedoch bokannt, daß es wenigstens zwei Transkripto des AmyZ 1 -Typs in Dianolla-Koimon gibt. Das lango Transkript in Saturna-Knollon-RNA ist wahrscheinlich oin häufig vorkommender, nichtgesploißter a-Amylaso-Transkript-Vorläufnr und die Anwosonhoit dieses Transkripts läßt vermuten, daß die Kontrolle der a-Amylase-Genexprossion teilweise auf der Ebene dor RNA-Roifung kontrolliert wird.

Beispiel 18

Isolierung zusätzlicher Kartoffel-a-Amylase-cDNA-Clono und Kartoffol-a-Amylase-Qene Zwei sehr verschiedene Typen von a-Amylase-cDNA-Clonen sind mit einer Gerste-a-Amylase-Sonde unter Vorwendung von Hybridisierungsbedingungen besonders niedriger Stringenz aus Kartoffeln isoliert worden. Die AmyZ3/4-Typ-Clone (AmyZ 2,3, 4,5 und 7) oder Teile davon auf der einen Seite und die AmyZ 1-Typ-Clone (AmyZ 1 und 6) oder Teile davon auf der anderen erlauben nun, unter Verwendung von Standardmothoden (12), die Isolierung aller Sequenzen der beiden Typen von Kartoffel-α-Amylaso, also Genen, Pseudogonon oder Messenger-RNAs (cDNAs eingeschlossen). Standardbedingungen beinhalten angemessen hohe Stringonz beim Hybridisieren (z.B. Hybridisierung bei 67⁰C in 2x SSC, der letzte Waschvorgang boi67°Cin 1 x SSC), was den Hintergrund beim Hybridisieren und das Auftreten von falschen Signalen herabsetzt und daher die Isolierung zusätzlicher a-Amylase-Soquenzen stark vereinfacht.

Beispiel 19 Isolierung von u-Amylaie-Gonen und cDNA-Clonun nus anderen dlcotyledonen Pflanzen Dio Nuclootid-Soquonzhomologio zwischen dom Kartoffola-AmylasocDNACIon-Typ AmyZ3/4 und Typ AmyZ 1 und

irgendwelchen anderen a-Amylaso-Gonon odor Massongor-RNAs aus dicotylodonon Pflanzon, hosondors aus dor Solanacoao-

Familio ist größor als zwischon solchon α-Amy laso-codiorondon Soquonzon aus dicotylodonon und dor Gor '.to

(monocotylodononl-a-Amylaso-Sondo.

α-Amyloso-Gono und cDNA-Clono aus dicotylodonon Pflanzen, mit Ausnahmo von Kartoffoln, worden dalior mit AmyZ3/4-Typodor AmyZ 1-Typ-Soquonzon odor Teilon davon als Sondo untor Hybridislorungsbodingungon, dio idontisch odor stringontor

Rind als dio für dio Isolierung dor AmyZ-Sorio von Cloncn mit dor Gorsto-a-Amylaso-Sondo boscluiobono, isoliort. Beispiel 20 Mengen an reduzierenden Zuckern In vier, bei 8^CC gelagerten Kartoffeltorten

Roihon von biochemischen Untorsuchungon wurdon ausgeführt, um Kartoffolsorton in bozug auf Mengen an roduziorondon Zuckern in golagorton Kartoffeln (dieses Beispiol), don Effekt dor Killtoinduktion (Boispiol 21) und dio Aktivitäten von a-Amylaso (Beispiel 22) zu charaktorisioron. Die Ergebnisse bilden die Grundlogo für Mothodon, mit donon die Mongon on roduziorondon Zuckern in Kartoffoln angehobon odor vorringort worden, woboi a-Amylaso-Gonkonstrukto in trnnsgnnon Kartoffolsorton verwendet worden.

In don vier in „Matorial und Mothodon" boschriobonon Kartoffolsorten wurdon die Mongon an roduziornndon Zuckern in den Kartoffeln zum Zoitpunkt dor Entnahmo vom Fold und während der Zoitspanno der Lagerung über den Winter bostimmt. Dio Ergobnisso mit boi 8⁰C golagorton Kartoffoln sind in Fig. 22 dargostollt. Dio Kurvon voranschaulichen dio beträchtlichen Unterschiodo in don Mongon an roduziorondon Zuckorn, dio in vorschiodonon Sorton gofundon wordor.. Dio Untorschiodo siegeln in etwa das bekannte Spoktrum an roduziorondon Zuckormongen in kultiviorlcn Kartoffeln widor.

Beispiel 21 Mengen an reduzierenden Zuckorn bol vorschiodonon Logorungstompornturon Koitoffoln, dio 19 Wochon boi 8⁰C, 19 Wochen boi 6⁰C und 6 Wochen boi 4T golagort wordon waron, wurdon am solbon Tag

aufboroitot, und die Mongon an Glucose und Fructose wurdon ermittelt. Das Ergobnis (Fig. 23) zoigt das sogonannto,käiteinduziorte Versüßen von Kartoffoln, eine natürliche) Roaktion gegon kältere Tomporaturon. Dor Vorgloich der Mongon anreduzierenden Zuckern in vier verschiedenen Kartoffolsorton zoigt, daß das relative Anstoigon der Zuckormongen am größton in

Sorton mit niedrigem Zuckorgehalt und am niedrigsten in Sorton mit hohem Zuckorgehalt ist, das Verhältnis zwischon don Zuckormengon in den vior Sorton bleibt jedoch gleich. Es zoigt, daß oino dio innoron Mongon an roduziorondon Zuckorn

verringernde Methode ebonso die Lagorungseigenschafton boi niedrigen Tomporoturon vorbossort.

Beispiel 22

Beziehung zwischen reduzierenden Zuckermengen und α-Amylase-Aktlvltat In gelagerten Kartoffeln In dem im vorigen Ooispiel beschriebenen Exporimont wurde dio a-Amylase-Aktivität in vier Kortoffolsorton nach 19 Wochon Lagerung boi 6°C und 8⁰C bostimmt (Mothodo 2). Sowoit bokannt, sind dios dio erston erfolgreichen Mossungon von a-Amylase-Aktivität in gelagerten Kartoffeln (Ross & Davios, Potato Research (1987), Bd.30, S. 675-678; Davies & Ross, J. Plant Physiol. (19871, Bd. 126, S. 387-396). Dio Aktivitäten waren ähnlich boi 6"C und 8⁰C, und in Fig. 24 ist dio durchschnittliche Aktivität bei den Temperaturen mit don Mongon an reduzierenden Zuckern bei 8°C in Bozichung gesetzt. Dio Figur zeigt eine gute Korrelation zwischon reduzierenden Zuckormongon und a-Amylaso-Aktivität. Dioso Beobachtung ist die Grundlago für Methoden zur Verringerung und Vermehrung dor Mongon an roduziorendon Zuckorn in gelagerten Kartoffeln durch spczifischo Kontrolle der α-Amy lase-Produktion.

Beispiel 23 Korrelation zwischen Mengen an reduzierenden Zuckorn und a-Amylase-Gen-Aktlvltat Um die Idee, daß a-Amylase-Aktivrflt in der Weise genetisch vorbestimmt ist, daß a-Amylase-Aktivität durch die Exprossionsintensität der a-Amylase-Gene festgelegt ist, weiter zu untermauern, wurdon aus den vier oben erwähnten Kartoffelsorten hergestellte RNA-P-oben durch somiquantitative Northern-Hybridisierung untersucht, woboi Insortionon aus

den isolierten a-Amylase-cDNA-Clonon als Sonden vorwondet wurden. Relative Transkriptintensitäton wurdon durch Abtastender in den Northern-Hybridisierurigenerhaltonon Autoradiogramme bostimmt (Barkadottir et al., Developmental Genetics |1981,8d.8,S.49&-511).

Beispiel 24 Verfahren zur Reduzierung der a-Amylaso-(reduzlerenden Zucker-Menge in Kartoffeln

Ein Plasmid wurde in E. coli konstruiert, das die folgenden Elemente in besagter Reihenfolge enthalt. (1) einen Pflanzenpromoter, (2) die a-Amylase-lnsertion aus z. B. AmyZ4 in einer Orientierung, die der in Fig. 7 von links nach rechts verlaufenden Orientirrung entgegengesetzt ist, (3) eino Pflanzon-Transkriptionstorminator-Soquenz, z. B. aus dom Nocalino Synthetase (NOS)-Gon, wie in den multiplen Clonierungsstellen von pCaMVCN (Fharmacia LKB Biotechnology) bereitgestellt. Als Promotor kann der CaMV-Promoter und der NOS-Promoter (Genkassette, Pharmacia LKB Biotechnology) zur starken und mittelstarken konstitution Expression des Antisense-Stranges der a-Amylasc-Sequenz verwendet werden. Als Promoter kann ebenfalls der dos Kartoffel-Polyubiquitin-Gens, der unter Verwendung von pKG 3730 als hotorologe Sonde (vgl. Beispiol 3) isoliert wordon war, zur niedrigen konstitutivon Expression dos Antisense-Stranges der a-Amylase-Sequenz oder oin Kartoffol-a-Amylaso-Promoter, der spezifische Aktivität in denselben F'flanzenzellon wie das a-Amylase-Gen, von dem dor Promoter stammt, zeigt, verwendet werden. Die Beispiele der Promoter und Terminatoren dienen der Veranschaulichung, andore Sequonzen können dieselbe Aufgabe ausführen.

Eine Antisense-Konstr Aktion mit der gesamten Sequenz von AmyZ4 wurde unter Vorwendung der Sad -Restriktionsschnittstelle im pBSK-Vektor und der EcoRV-Rostriktionsschnittstollo im AmyZ4-Clon horgostollt. Das Kartoffol-Fragment wurde in das Plasmid pEnhancod-Poter-Linker (pEPL, (63)) cloniert, das zuerst mit Sac1 und dann mit sma 1 gespalten wurde. Das resultierende Plasmid wurde p(antiAinyZ4) genannt.

pEPL wurde aus pCaMVCN (64,G5) konstruioit, woboi dasCAT-Gon durch Spaltung mit I'st1 ontforntwurdo. Ein kloinor Linkor (Linker; Pst 1 -BamH 1 -Ba11 -Pst 1) wurdo in clioso Plasmid-Pst 1 -Rostriktionsschnittstollo oingofügt, woraus das pLlso (pL) genannte Plasmid ontstand. pL wurdo mit Hincll und BgIII gospalton, und das rosultiorondo Fragir. nt mit dom 35S-Promotor und dom NOS-Torminator wurdo in ein ondoros, mit EcoHV und BgIII gospaltonos pL-Plasmid cloniort. RoMriktionsspaltungon mit EcoRV und Hincll oryobon glatto Endon. Das rosultiorondo Konstrukt wurdo pEnhoncod-Llso IpEU gononnt. pEL untorschoidot sich grundlegend darin von pCaMVCN, daß es olnon veränderten 35S-Promotor mit einer Taiulom-Diiplikalion dor 250 Basonpaaro dor stromaufwärts vom Promotor liogondon Soquonz onthalt. Der vorändorto 35S-Prornotor hat oino im Vorgloich zum natürlichem 35S-Promotor otwo zohnmal so hoho transkriptionollo Aktivität (CO). pEL wurdo mit Pstl und BgIII gospalton, wodurch dor NOS-Torminotor ontfornt wurdo. Anstollo dosson wurdo oin CnMV-Torminotor (DW2t) oingofügt. Dor Pflonzonvirustorminotor ist olliziontor als dor Pflanzoncjontorminator (07). Schließlich wurdo oin Linkor (Pstl-BoMHI-Srna I-Snc I-Sall-Sphl) in clio zwischen dem 35S-Promotor mit dor orhöhton Aktivität uii'J dom CaMV-Torniinator bolindlicho Pstl· Rcstriktionsschnitlstollo oingofügt. Diosos Plasmid wurdo pEPL genannt.

Eino Antisonso-Konstruktion wurdo obonfalls mit AmyZ6 gomocht, woboi dor Kartoffolclon mit Sacl und EcoRV (wio AmyZ4) gospalton wurde. Das Kartolfol-Frogmont wurdo in das zuerst mit Sacl und df nn mit Smal gospaltono Plosmid pEPL cloniort. Das resultierende Plasmid wurdo p(anti-AmyZO) genannt. Sowohl p(anti-AmyZ'l) öle auch p(nntl-AmyZ6) wurden mit Hindill gespalten, um die den gosomton 35S-Promoter mit orhöhtor Aktivität, dio AmyZ<1- oder AmyZ5-l»sortionon in Antisenso-Richtung und don CaMV-Torminalor onthaltondon Fragmonte zu isolioron. Es war nötig, ρ(οη'ί-<·ι,. .yZ4) partioll zu spalten, da dio AniyZ4-Kartoffol-lnsortion oino Hindlll-Rostriktionsschnitlstollo onthalt. Die isoliorton Fragmonto wurden in dio Hindill-Rostriktionsschnittstcllo dos binäron Voktors pB1121 (68,69, 70) cloniort. Dio Hindlll-Rostriktionsschnittstollo in pB1121 bofindot sich zwischen dom Kanamycinrosistonzgon und dom ß-Glucuronidaso (GUS)-Gon. Dio Antisonse-Konstruktion (onti-AmyZ4 odor anti-AmyZG), das Kanamycinrosistonzgon und das GUS-Gon habon jowoils ihron oigenon Promotor und Terminator. Noch Isolierung dor pBI 121-anti-AmyZ4 (odor anti-AmyZP)-Konstruktion aus E. coli wurdo dor Agrobactorium tumofacions Stamm LBA4404, der das entwaffnoto Holforplasmid pAL4404 (71,72) onthalt, unter Vorwendung dor triparontalon Pearungsmothodo (73) transformiert. Ein Solarium tuborosum-Transformations-Modollüyiitom wurdo mit don Kartoffolsorton Dionollo und Saturna aufgobaut. Ein oin Horbicid-Rosistonzmarkorgon onthaltondos pB1121-Plasmid wurdo votwondot, um oin Modellsystom in dioson Kartoffolsorton zu schaffon. Das pB1121 -Plasmid mit dom Markcrgon wurdo mit LBA4404, wio oben boschrieben, gopaart, und der resultiorondo A. tumofacions-Stamm wurdo In LB-Medium mit 50Mg/ml Kanamycin gezogen. Die Zollon wurden mit Dianolla- odor Saturna-Kartoffelknollonschoibon, wio in (74) boschrioben, co-kultiviort, mit dor Ausnahme, daß koino Tabakfuttorzollplatton vorwondot wurden. Sowohl Dianolla- als auch Saturnaschoibon entwickelten Keime auf Kanamycin-Platten (Selektion auf Tronsformanton). Sio wurden auf GUS-Exprossion (70) untersucht, und oino blouo Farbe zoigte an, daß dio Keime mit dom Markorgon transformiert worden waron. Diosos Modollsystom wurde benutzt, um dio anti-AmyZ4- bzw. die anli-AmyZ6-Konstruktion durch Co-Kultiviorung nut pBI 121-anti-AmyZ4 oder pBI 121-Anti-AmyZ6 in pAL«1404 gemäß dom boroits oben für das Markorgon beschriobonon Verfahren in das Genom von z. B. sowohl von Dianella, als auch Saturna zu bringen.

Erfolgreich transformierte Kartoffolpflänzchon oxprimierton α-Amylase-anti-Mossongor-RNA von dor eingefügten, dreiteiligen Genkonstruktion, woboi dio Translation von a-Amylaso durch Basonpoarungdnra-Amylase-Mossenyor-RNA mit dor α-Amylasoanti-Messenger-RNA vorhindort wi'd. Die niedrigere Menge an a-Amy la so vermindert don Abbau an Stärke, wodurch die Bildung an reduzierenden Zucker herabgesetzt wird. Eine sogar noch größoro Inhibiorung dor Translation von α-Amy läse wurde erreicht, wenn sowohl das anti-AmyZ4-, als auch das anti-AniyZ6-Konstrukt verwendet wurdon.

Die α-Amylasen von anti Mossonger RNAs troton in dor Natur in Gorston Endospormon und Alourongowebo auf (Rogers, J.C₁ Plant Mol. Biol. [1983], Bd. 11, S. 125-138). Sie besitzen jodoch keine gute Komplomentarität in bezug auf eine dor aktiven a-Amylase-Messenger-RNAs, und es ist nicht bekannt, ob sio dio Translation inhibieren.

Beispiel 2!i Vorfohron zur Erhöhung der a-Amylaso-(roduzloronden Zucker)-Mongon In Kartoffeln Ein Plasmid wurdo in E. coli konstruier, dos die folgenden t'lemento in besagtor Reihonfolgo onthalt. (1) oinen Pllanzenpromotor,

(2) ein, wio in Beispiel 18 boschrieben, isoliertos Kartoffol-a-Amylaso-Gen, aus dom der Promotor bis zum

Transkriptionsstartpunkt (± etwa 20 Bascnpaaro) entfernt worden ist. Die verwendeten Pllanzenpromotorcn waron dieselben,

wio in Beispiel 24 aufgeführt. Zusätzlich dazu kann oin Patatin-Promotor verwondot werdon. Patatin-Gono worden im Parenchym-

Gewebe von Knollen (44) stark oxprimiort (Bcroich D in Fig.6). Amy24(dor die gosam ο a-Amylase-Messengor-RNA-Löngo enthaltende, cDNA-Clon) wurdo mit BamHI und Sail (dioso Restril'.tionsschnittstelli η befinden sich im pBSK-Polylinkor) gespalten, und das resultierende Kartoffol-Fragment wurde in das

mit denselben Enzymen gespaltene Plasmid pEPL (in Beispiel 24 beschrieben) cloniort. Dieses, pfsonso AmyZ4) gonannte

Konstrukt tragt, in folgender Reihenfolge, don in Beispiel 24 beschriebenen 35S-Promotor mit erhöhter Aktivität, dio AmyZ4- Insertion in der Sinnrichtung und don CaMV-Torminator (beschrieben in Boispiel 24). Dieses dreitoiligo Fragment wurdo durch

partielle Hind lil-Spaltung des Plasmids plsenso AmyZ4) isoliert, in die einzige Hind Ill-Rostriktionsschnittstolle von pB1121cloniert und dann beispielsweise In das Dianolla-Kartoffolgonom unter Verwendung der in Beispiel 24 beschriebenen Methodetransferiert.

Erfolgreich transformierte Pflänzchen oxprimieron a-Amylaso-Messonger-RNA mit größerer Intensität als nicht-transformierte Pflanzen, und produzieren somit mehr a-Amylase als dio Eltornpflanze. Dio orhöhto Moiuje an α-Amylaso wird ihrerseits don Abbau von Stärko und damit die Menge an reduzierenden Zuckern orhöhon. Untor Vorwendung einer Konstruktion mit einem Patatin-Promotor wird sich der Überschuß an α-Amylaso in der Mitte der Knollen ansammeln, einen Teil der Stärke zu Zucker

umsetzen und für den Stärkeabbau während des ersten, auf die Fermentation vorbereitenden Erhitzungsschritts zur Verfugungstehen.

Beispiel 26 Produktion von Kartoffol-ci-Amylaso in Mikroorganismen Der vollständige offene Leseraster für don Kartoffel-a-Amylase-Vorläufer wird mit Haell und Dral aus AmyZ4 herausgeschnitten. Haell spaltet zwischen dom Initiationscodon. ATG und Codon Nr. 2, und dio Haell-Rostriktionsschnittstelle wird aufgefüllt und mit

oinor aufgefüllten Ncol-Restriktionsschnittstollo (was dio Soquonz CCATG ergibt), wodurch das Initiationscodon wiederhergestellt wird, ligiort. Einmal vorkommende Ncol-Rcstriktionsschnittstollon findot man gewöhnlich im Initiationscodon von

E. coli-Exprossionsvoktoren (ζ. B. μΚΚ233·2,Pharmacia LKO Biotochnology). Dral spaltet 51 Dosonpaaro hinter dom Torminntionscodon, wodurch sich oln glatlos E ml ο ergibt. Dio Ncol-Rostriktionsschnittstollo wurde obonfalls int Exprossionsplasmid wiodor horgostollt, um don vollständigem offonon Losornstor für don a-Amvlaso-Vorliliifor loir.ht nuf andcro Exprossionsvoktoron für E.coli, andoio f'roknryonton oder Euknryontoii, wio z. B. Hofo, übortrayon zu könnon. On Siynalpcptido ähnliche Eigonschofton in Proknryonton und Eukaryonton (Boispiol 13) hnbon, könnto das Kortoffol-a-Amylaso-VorliUifurprotcin im neuen Wirt richtig zu roifor a-Amylaso prozossiort wordon. Altornativ dazu worden codiorondo Royionon von nndoron Signalpoptiden vorwondet, um dio für das Kartoffol-a-Amylaso-Siynalpoptid codiorondo Rogion zu orsotzon. Um dio AmyZI -Typ-a-Amylaso horzustollon, wurdo oin cDNA-Clon, wio in Boispiol 18 boschriobon, isoliert, dor offono Losoraslor mit gooignoton Rostriktionsonzym hornusgoschnitlon unu, gonau wio obon boschriobon, in einen Exprossionsvcklor clonicrt.

Beispiel 27

Schnelles Absuchen von Kartollolsorton In Zuchtprogrammon durch Dot-Blot Auf dor Grundlage von Boobachtungon, daß dor Gohnlt on roduziorondon Zuckorn in golagnrton Kartoffeln in üoziohung zur a-Amylaso-Aktivität stoht (Boispiol 22) um¹, daß dioso Boziotuing Koimo (üoispiol 17) und clalior wahrscheinlich Blotter einschließt, könnon Kartoffolsorton boroits in einom Stadium, worin jungo Pllänzchon wonigo Blattor gobildol hnbon, auf iluo Neigung, Zucker in golagcrton Kartoffeln wizusiimmoln, abgosucht wordon. 0,1 bis 0,5g aus Ulattormatcrinl extrahiorto RNA wurdo auf für Hybridisiorungen gooignoto f'iltor gotropft und mit radioaktiv odor mit Biotin markiorton a-Amylaso-cDNA-Soquonzon hybridisiert. Als Roforenz kann dio Hybridisiomng mit ähnlich markiorton für Ubiquitin codiorondun Rogionon aus irgondoinem Organismus, ?.B. Gorsto, vorwondot worden, da Ubiquitin-Soquonzon äußorst gut konsorviort und dio Ubiquitin-Geno in vorschiodonon Pllanzongowobon konstitutiv oxprimiert wordon (Gausing & Barkorddottir, Eur. J. Biochom. |1986|, Bd. 158, S. 57-62). Dio Ergebnisse wordon mit ähnlichen Dot-Blots von Kartoffolsorton, doron Zuckoroiy enschnfton bekannt sind, vorglichon (z.B. mit (Ionon der in „Matorialuncl Mothodon" boschriobonon vior Sorton). Ein solcher Dot-Blot ann mit einer großen Mongo an Zuchtmatorial durchgeführt wordon, wodurch oino früho Bowortung in bozug auf dio Zuckoroigonschoftcn möglich wird.

Beispiel 28

RFLP-Anrlyso mit a-Amylnso-Qon-Sequonzon

Rostriktionsfragmontla'nyon-Polymorphismon wordon zunohmond häufig vorwondot, um bostimmto AHcIo von Gonon zu verfolgen. Dios wird sowoit hauptsachlich in Menschen, jedoch auch in Pflanzen, z. ü, in dor nahen Verwandten dor Kartoffel, nämlich dor Tomate, durchgeführt (Vallejos ot al., Goi.otics |1986), Bd. 112, S.93-105). Die Ergebnisse von 'jcnomischcn Southorn-Hybridisicrungon von Knrtoffcl-DNA mit d::i isolicrtrn a-Amylaso-Scquonzon zeigten (Fig. 19 und 20), daß Kartoffeln wonigo a-Amylaso-Gono haben, dio oin einfaches B.uidonmustor ergeben, wodurch Polymorphismon leicht auszuwerten sind. Beispiele für Polymorphismon sind in Fig. 20 dargostollt. Polymorphismcn in mit a-Amylaso-Soquonzon hybri'lisiorondon FragmontlSngon werden, wio in entsprechomloii Untorsuchungon mit andoron Sondon, ontwoder vorwonclp'., 'im dio a-Amylnse-AIIoIo selbst oder als (vorbundono oder nicht-vorbundono) Markör in andoro Eigenschafton (z. B. Rosistonz gegenüber Pathogenen und morphologische Eigenschaften wie z.B. Knollenfarbo) betreffende Kreuzungen zu verfolgen.

Beispiel 29

Kontrollierte Expression andoror Enzyme

a-Amylase-Gene von Kartoffeln worden in oino Entwicklungs- und Gowobe- (Zeil·) spezifischen Art und Woiso wio dio meisten andoren Pflanzengene expriminrt. Dio a-Amylaso-Gen-Expression ist charakteristisch für Gone, die für Enzyme codieren (im Gegensatz zu Strukturproteinon odor Speicherproteinen). Das bedoutot, daß dio Expressionsintonsität von a-Amylaso· Messengor-RNA relativ niodrig, in der Größenordnung von 0,01 % dor Gosamt-Mossenger-RNA in Keimen ist (Boispiol 5). Die Verwendung eines a-Amylaso-Promotors, fusioniert mit Promotor-losen Genon, dio für nicht in Kartoffeln (das gilt obonso für nicht a-Amylase produzierende Zellen) gofundeno odor in geringen, abersuboptimalon Mengen synthotisierto Enzymo codieren, ist ein Vorfahren zur Feineinstellung des Intermediärstoffwechsels und des Stoffwochsels von z.B. Phytohormones In diesem Verfahren wird des Fusionskonstrukt in einem A.tumefaciens-VeW^rzur Prouktion von transgnnon Pflanzon.wie in Beispiel 24, boschriobon, eingofügt.

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Claims (88)

1. DNA-Fragmont, onthaltond oino dor in don Piyiiron 1 bis 5 gozoigton Nuclootid-Soquanzon odor oino Toilsoquonz odor oin Analoyon davon.

2. DNA-Frapnont nach Anspruch I, onthnltond oino Nuclootid-Soquon/, clio boi Nuclootid 541 dor Nuclootio-Roquon? von Figur 1 beginnt, boi Nuclootid 1761 davon indot und oinon Kaitoffol-ci-Amylaso-V jrläufor codiort, oder oino Toilsoquonz odor oin Analoyon davon.

3. DNA-Frigir.oir. noch Anspruch 1, onthaltond oino Nuclootid-Soquonz, dio boi Nuclootid 596 dor Nuclootid-iioquon? von Figur 1 boyinnt, boi Nuclootid 1761 davon ondot und oino K: rtoffol-o-Amylaso codiort, ocior oino Toilsoquonz odor oin Analogon davon.

4. DNA-Fraymont nach Anspruch 1, onthaltond oino Nuclootid-Soquonz, dio boi Nuclootid 2 dor Nuclootid-Soquonz von Figur 2 boginnt, boi Nuclootid 1219 davon ondot und oinon Kartoffola-Amylaso-Vorläufor codiort odor oino Toilsoquonz odor ein Analogon davon.

5. DNA-Fragment nach Anspruch 1, onthaltond oino Nuclootid-Soquonz, dio boi Nuclootid 53 dor Nuclootid-Soquonz von Figur 2 boginnt, boi Nuclootid 1219 davon ondot und oino Kartoffol-a-Amylaso codiort, odor oino Toilsoquonz odor oin Analogon davon.

6. DNA-Fragmont nach Anspruch 1, onthaltond oino Nuclootid-Sequonz, dio boi Nuclootid 6 dor Nuclootid-Soquonz von Figur 3 boginnt, boi Nuclootid 1052 davon ondot und oino partiollo Kartoffol-a-Amylaso codiort, odor oino Toilsoquonz odor oin Analogon davon.

7. DNA-Fragmont nach Anspruch 1, onthaltond oino Nuclootid-Soquonz, dio boi Nuclootid 3 dor Nuclootid-Soquonz von Figur 4 beginnt, boi Nuclootid 647 davon ondot und oino partiollo Kartoffela-Ainylaso codiort, odor eine Toilsequonz odor oin Analogon davon.

8. DNA-Fragmont nach Anspruch 1, das die Nuclootid-Soquonz von Figur 1 enthält und im cDNA-Clon AmyZ3 enthalten ist, der in E. coli K-12 bei dor Deutschon Sammlung von Mikroorganismen (DSM) als DSM 5275 hintorlegt ist, odor eine Toilsoquonz odor oin Analogon davon.

9. DNA-Fragmont nach Anspruch 1, das die Nucleotid-Soquonz von Figur 1 onthält und im cDNA-Clon AmyZ4 enthalten ist, clor in E. coli K-12 boi der DSM als DSM 5276 hintorlegt ist, oder oino Teilsoquonz oder ein Analogon davon.

10. DNA-Fragmont nach Anspruch 1, das die Nucleotid-Soquonz von Figur 2 enthält und im cDNA-Clon AmyZ7 enthalten ist, dor in E. coli K-12 boi dor DSM als DSM 5884 hinterlegt ist, odor eine Teilsequenz oder ein Analogon davon.

11. DNA-Fragment nach Anspruch 1, das dio Nucleotid-Soquonz von Figur 3 onthält und im cDNA-Clon AmyZ1 enthalten ist, dor in E. coli K-12 boi dor DSM als D3M 5882 hinterlogt ist, oder eine Teilsequonz oder oin Analogon davon.

12. DNA-Fragment nach Anspruch 1, das die Nuclootid-Soquenz von Figur 4 enthält und im cDNA-ClonAmyZ6 enthalten ist, der in E. coli K-12 bei der DSM als DSM 5883 hinterlegt ist, oder eine Teilsequenz oder oin Analogon davon.

13. DNA-Fragment nach Anspruch 1, das die Nucleotide 1330 bis 1624 von Figur 1 oder die Nucleotide 387 bis 591 der Nucleotide-Sequenz von Figur 4 enthält.

14. DNA-Fragment einer dicotyledonen Pflanze, das mit einer DNA-Sequenz mit einem der Ansprüche 1 bis 13 hybridisiert und ein Polypeptid mit a-Amylase-Aktivität codiert.

15. DNA-Fragment einer dicotyledonen Pflanze, das mit einer DNA-Sequenz nach einem dor Ansprüche 1 bis 13 unter üblichen Hybridisierungsbodingungen hybridisiert, vorzugsweise unter Hybridisierungsbodingungen von 6x SSC und 67⁰C und Waschbedingungen von 4x SSC und 67 ⁰C.

16. DNA-Fragmont nach Anspruch 14 oder 15, das einen GC-Gehalt im Boreich von etwa 35 bis 50%, vorzugsweise von etwa 40 bis 50%, aufweist.

17. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 16, das ein vollständiges a-Amylase-Gen ist, enthaltend regulatorische Bereiche, Promotor-Bereiche, codierende Bereiche, transkribierte, nicht-codierende Bereiche einschließlich von Introns und Transkriptions-Terminations-Bereichen, oder einen Teil davon.

18. DNA-Fragment nach Anspruch 17, das ein a-Amylase-Pseudogen ist.

19. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis18, dasvoneinerdicotylßdonen Pflanze abgeleitet ist.

20. DNA-Fragment nach Anspruch 19, das von einem Mitglied der Familie Solanaceae, vorzugsweise der Gattung Solanum, vorzugsweise von Solanum tuberosum, abgeleitet ist

21. DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 20, das ein Polypeptid mit ü-Amylase-Aktivität codiert.

22. DNA-Fragment nach oinom der Ansprücho 1 bis 21, eins oino cDNA, oino gonornischo oder synthetische DNA oder eine Kombination du von ist.

23. DNA-Frnomont, das ein Fuslonsprotoin coclioit, enthaltend oin DNA-Frogmont nach oinom dor Ansprücho 1 bis 22 im Losorastor mit mindostons oinom zwoiton DNA-Fragmont, das oin zwoitos Polypoptid odor oinon Toil davon coclioit,

24. DNA-Fragmont nach Anspruch 23, woboi das zwoito DNA -Fi agmont oino Signalsoquonz ist, clio oin prokaryontischos Signalpoptid cocliort.

25. DNA-Fragmont nach oinom dor Ansprücho 1 bir· 24, das oino Markierung tragt.

26. DNA-Fragmont nach Anspruch 25, woboi dio IWrkiorung oin Fluorophor, ein radioaktivos Isotop odor oin Komploxbildnor, vorzugswoiso Biotin, ist.

27. Vorfahren zur Isolierung oinos a-Amylaso-Gon·. odor einer a-Amylaso-cDNA aus oinor genomischon odor cDNA-Gonbank oinos Organismus, vorzugswoiso oinor Pflanze, vorzugswoiso einer dicotylodonon Pflanze, wobei eino Gonbank mit einem donaturierton DNA Fragment nach oinom dor Ansprücho 1 bis 2C odor mit einer RNA-Kopio davon untor für dio Hybridisiorung zwischen dom DNA-Fragnvjnt und der Sonde günstigen Bodingungon hybridisiert wirH und dor hybridisiorondo Clon gewonnen wird, um das α-Amylase-Gon odor dio a-Amylaso-cDNA dos Organismus zu erhalten.

28. Verfahren zur Isolierung eines DNA-Fragments nach einem der Ansprücho 1 bis 21, das dio folgenden Schritte umfaßt:

(a) Herstellung einor cDNA-Gonbank aus einer aus oinom Gowobo einor dicotyledonon Pflanzo isolierten polyA-reichon RNA, vorzugsweise aus einer von einem Gewebe von einor Kartoffolpflanzo isoliertem polyA-roichon RNA in einem Vektor, vorzugsweise in einem lambda-Vektor, vorzugswoiso dem lambda-ZAP-Vektor;

(b) Absuchen der cDNA-Gonbank durch Hybridisierung mit einem Sondenmolokül, enthaltend eine Gorsto-a-Amylase-Gon-Soquenz unter Hybridisierungsbedingungen, bei donon Hybridisierung ohne das Verursachen übermäßiger Hintergrundhybridisierung nachgewiesen werden kann, jedoch gleichzeitig eine schwache Hybridisierung nachgewiesen worden kann; und

(c) Isolierung rekombinanter Clone, die mit dem Sondenmolekül hybridisieren, Erhalten der DNA-Insortion aus den isolierten Clonen und ggf. Herstellung einer Teilsequenz der DNA-Insertion durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym.

29. Vorfahron zur Isolierung eines DNA-Fragmonts, eines Analogons odor oinor Teilsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 21, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Herstellung einer cDNA-Genbank aus einer aus einem Gewebe einer dicotylt.donen Pflanze isolierten pol/A-reichen RNA, vorzugsweise aus einer von einem Gewebe von einer Kartoffolpflanze isolierten polyA-reichen RNA in einem Vektor, vorzugsweise in _ui>-,?ai lambda-Vektor, vorzugsweise dem lambda-ZAP-Vektor;

(b) Absuchen der cDNA-Genbank durch Hybridisierung mit einem Sondenmolekül, enthaltend ein DNA-Fragment nach Anspruch 1; und

(c) Isolierung rekombinanter Clone, die mit dem Sondenmolekül hybridisieren, Erhalten der DNA-Insertion aus den isolierten Clonon, und ggf. Herstellung einer Teilsequenz dor DNA-Insertion durch Spaltung mit einem Restriktionsenzym.

30. Verfahren zur Isolierung eines DNA-Fragments, eines Analogons oder einor Teilsequenu nach einem der Anspiucho 1 bis 21, das die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Herstellung einer genomischen Genbank aus genomischer DNA aus einem Gewebe ei er dicotyledonen Pflanze, vorzugsweise aus dem Gewebe einer Kartoffelpflanze in einem Vektor nach üblichen Verfahren;

(b) Absuchen der genomischon Genbank durch Hybridisierung mit einem Sondonmolekül, enthaltend eine Gewebe a-Amylase-Gen-Sequenz unter Hybridisierungsbedingungen, bei denen Hybridisierung ohne das Verursachen übermäßiger Hintergrundhybridisierung nachgewiesen werden kann, jedoch gleichzeitig eine schwache Hybridisierung nachgewiesen werden konn; und

(c) Isolierung rekombinanter Clone, die mit dem Sondenmolekül hybridisieren, Erhalten der DNA-Insertion aus den isolierten Clonen und gegebenenfalls Herstellung einer Teilsequenz der DNA-Insertion durch Spaltung mit mindestens einem Restriktionserzym.

31. Vorfahren zur Isolierung oinos DNA-Fragmonis, oinos Analogons odor oinor Toilsoquonz nach oinom dor Ansprücho 1 bis 21, das dio folgondon Schritto umfaßt:

(a) Horstollung oinor gonomlschon Gonbank aus gonomischon DNA aus oinom Gowobo oinor dicotylodonon Pflanze, vorzugsweise aus dom Gowobo oiner Kartoftolpflanzo in oinom Voktor nach üblichen Verfahren;

(b) Absuchen dor gonomischon Gonbank durch Hybndisiorung mit oinom Sondonmolokül, enthaltond ein DNA-Fragment nach Anspruch 1, und

(c) Isolierung rekombinanter Clone, die mit dom Sondonmolekül hybridisieren, Erhalten dor DNA-Insortion aus den isolierten Clonen und gogobonenfalls Horstollung oinor Toilsoquonz dor DNA-Insortion durch Spaltung mit mindestens einem Rostriktionsenzym.

32. Vorfahron zur Horstollung oinos DNA-Fragments nach oinom der Ansprücho 1 bis 21, boi dom dio Oligonucleotid-Soquenz des Fragments durch Oligonucloütid-Syntheso aufgobaut wird.

33. Vorfahron zur Herstellung eines DNA-Fragments nach Anspruch 23 odor 24, bei dem ein nach einem der Ansprücho 28 bis 32 erhältliches DNA-Fragment an ein zweitos DNA-Fragmont, vorzugsweise mit einer DNA-Ligase, ligiort wird, das ein zwoitos Polypoptid odor einen Toil davon codiert.

34. DNA-Fragment, das ein zur Hybridisiorung mit einer von oinom DNA-Fragmont nach einom dor Ansprüche 1 bis 24 transkribierten mRNA fähiges mRNA-Molokül codiort, das durch die Hybridisierung dio Translation dor vom DNA-Fragmont nach einem dor Ansprücho 1 bis 24 transkribierten mRNA inhibiert.

35. DNA-Fragment in anti-sonso-Oriontioruny im Verhältnis zu oinom DNA-Fragmont nach oinom dor Ansprücho 1 bis 24, das durch einen Promotor gostouert wird, der dio Bildung oinos an oino von einem DNA-Fragment nach einem der Ansprücho 1 bis 24 transkribierte mRNA hybridisierendes mRNA-Molekül steuern kann.

36. DNA-Fragment nach Anspruch 34 odei M>. Cum, oine anti-AmyZ4- oder anti-AmyZ6-mRNA codiert.

37. Einzelsträngiges DNA- oder RNA-Fragmont, fins im wesentlichen komplementär zu einom der Stränge eines DNA-Fragments nach οίηοι,ι doi Ansprüche 1 bis 24 ist.

38. Genetisches Konstrukt en'haltend:

(1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit

(2) einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 1 bis 24, das das Polypeptid codiert; und

(3) eine Transkriptions-Termination-DNA-Sequonz, dio funktionoll mit dom DNA-Fragment (2) verbunden ist.

39. Genetisches Konstrukt enthaltend:

(1) eino rogulatorische Sequenz, die funktionoll verbunden ist mit

(2) einem DNA-Fragment nach Anspruch 17, das ein a-Amylase-Gen ohne einen Promotor enthält.

40. Genetisches Konstrukt enthaltend:

(1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit

(2) einem DNA-Fragment nach Anspruch 17, enthaltend ein ein a-Amylase-Gen ohne einen Promotor oder eine Transkriptions-Terminations-Sequenz; und

(3) eine Transkriptions-Terminations-DNA-Sequenz, die funktionell mit dem DNA-Fragment (2) verbunden ist.

41. Genetisches Konstrukt enthaltend:

(1) eine regulatorische Sequenz, die funktionell verbunden ist mit

(2) einem DNA-Fragment nach einem der Ansprüche 34 bis 37, das ein zur Inhibition der Translation eines DNA-Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 24 fähiges RNA-Molekül codiert; und

(3) eine Transkriptions-Terminations-DNA-Sequenz, die funktionell mit dem DNA-Fragment (2) verbunden ist.

42. Genetisches Konstrukt nach einem der Anspruch 38 bis 41, in dem die regulatorische Sequenz ein Pflanzenpromotor, vorzugsv. jise ein konstruktiver oder regulierbarer Pflanzenpromotor ist.

43. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 42, in dem der regulierbare Promotor durch mindestens einen Faktor aus der Gruppe von Entwicklungsfaktoren, chemischen Faktoren, physikalischen Faktoren oder physiologischen Faktoren regulierbar ist.

44. Genetisches Konstrukt nach Anspruch 42, in dem der konstitutive Promotor der NOS-Promotor ein Ubiquitin-Promotor oder ein Pflanzenvirus-Promotor, vorzugsweise der CaMV-Promotor, ist,

45. Gondtisches Konstrukt nach Anspruch 42, in dom dor Pflanzenpromotor ein Pflanzon-a-Amylaso-Promotor ist, vorzugsweise ein Kartoffol-a-Amylase-Promotor, oder ein Patatin-Promotor.

46. Genotischos Konstrukt nach oinom der Ansprüche 38 odor 40 bis 45, in dorn dio Transki iptions-Torminations-Sequonz oino Pflanzon-Tronskriptions-Torminations-Soquenz ist.

47. Vektor, dor in oinom Wirtsorganismus ropliziorbar ist und oin DNA-Fragmont nach oinom dor Ansprüche 1 bis 24 odor 34 bis 37 trägt.

48. Vektor, der ein jjonotischos Konstrukt nach oinom dor Ansprüche 38 bis 46 trägt und der zur Einführung dos gonotischon Konstrukts in das Gonom oitior pflenzlichon ZoIIo odor oinor Pflanzo fähig ist, wobei die Pflanzo vorzugswoiso oin Mitgliod dor f-'amilio Solanacoao, vorzugswoiso dor Gattung Solanum, vorzugsweise Solarum tuberosum ist.

49. Voktorsystem, enthaltend mindestens einen Voktor nach Anspruch 48, und das zur Einführung dos genetischen Konstrukts in das Gonom einer Pflanze fähig ist, vorzugswoiso in oin Mitglied dor Familie Solanaceao, vorzugsweise dor Gattung Solanum, vorzugsweise in Solanum tuborosum.

50. Vektorsystem nach Anspruch 49, das ein binäres Voktorsystom ist.

51. Voktorsystem nach Anspruch 49 oder 50, das oino Virulenz-Funktion, die zur Infektion der Pflanze fähig ist, und mindestens einen Randteil einorT-DNA-Sequenz enthält, wobei sich der Randtoil auf domsolben Vektor wie das genetische Konstrukt bafindot.

52. Voktorsystem nach einem dor Ansprüche 49 bis 51, enthaltend ein Agrobacterium tumefacions Tiodor Ri-Plasmid oder oin Agrobactorium rnizogenes Ri-Plasmid.

53. Wii sorganismus, der einen Voktor nach Anspruch 47 odor 48 oder ein Voktorsystem nach einem der Ansprüche 39 bis 46 enthält.

54. Wirtsorganismus nach Anspruch 53, der das inseriorte DNA-Fragmont nach einem der Ansprüche 1 bis 24 oder 34 bis 37 replizieren und/oder oxprimieron kann.

55. Wirtsorganismus, der ein DNA-Fragmont nach oinom der Ansprüche 1 bis 24 odor 34 bis 37 trägt, wobei das DNA-Fragment ein Teil dos Genoms dos Organismus ist.

56. Wirtsorganismus nach Anspruch 55, dor zur Replikation und/oder Expression des insoriorton DNA-Fragments fähig ist.

57. Wirtsorganismus nach einem doi Ansprüche 54 bis 56, der ein Mikroorganismus ist.

58. Wirtsorganismus nach Anspruch 57, der ein Bakterium der Gattung Escherichia, vorzugsweise E. coli, oder der Gattung Bacillus, vorzugsweise B. subtilis, eine Hefe, vorzugsweise der Gattung Saccharomyces, vorzugsweise S. corevisiae, oder ein Pilz, vorzugsweise der Gattung Aspergillus, ist.

59. E. coli K-12, enthaltend das Plasmid pAmyZ3, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummoi DSM 5275.

60. E. coli K-12, enthaltend das Plasmid pAmyZ4, hinterlegt bei der DSM unter dor Hinterlegungsnummer DSM5276.

61. E. coli K-12, enthaltend das Plasmid pAmyZ7, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM5884.

62. E. coli K-12, enthaltend das Plasmid pAmyZI, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 5882.

63. E. coli K-12, enthaltend das Plasmid pAmyZ6, hinterlegt bei der DSM unter der Hinterlegungsnummer DSM 5883.

64. Wirtsorganismus nach einem der Ansprüche 53 bis 56, der eine Zellinie, vorzugsweise eine Pflanzenzellinie, ist.

65. Wirtsorganismus nach einem der Ansprüche E3 bis 56, der eine Pflanze ist.

66. Wirtsorganismus, der zur Infektion einer pflanzlichen Zelle oder einer Pflanze fähig ist, wobei der Wirtsorganismus einen Vektor nach einem der Ansprüche 47 oder 48 oder ein Vektorsystem nach einem der Ansprüche 49 bis 52 trägt.

67. Wirtsorganismus nach Anspruch 66, wobei der Wirtsorganismus ein Mikroorganismus, der vorzugsweise zu einem Agrobacterium spp. gehört, ist.

68. Wirtsorganismus nach Anspruch 67, der ein Agrobacterium tumefaciens-Stamm ist.

69. Verfahren zur Herstellung einer a-Amylase oder eines Polypeptids mit a-Amylase-Aktivität, wobei man die folgenden Schritte durchführt:

(1) Züchtung eines Wirtsorganismus nach einem der Ansprüche 53 bis 68 in einem

Kulturmedium; und
(2 a) Lyse der Wirtsorganismen und Gewinnung der a-Amylase oder des Polypeptids mit

a-Amylase-Aktivität aus dem Lysat; oder
(2 b) Gewinnung der a-Amylase oder des Polypuptids mit α-Amylase-Aktivität aus dem Kulturmedium.

70. Im wosontlichon reinos Polypoptid, das von oinom DNA-Fragment nach einem der Ansprücho 1 bis 24 codiort wird, odor oin Analogon odor oin a-Amylaso-vorwandto3 Fragment davon.

71. Im wesentlicher» reines Polypoptid nach Anspruch 70, das oino dor in don Figuren 1 bis 4 angegebenen Aminosäure-Sequonzon aufwoist, odor oin Anlogon oder Fragment davon.

72. Im wosontlichon roinos Polypoptid nach Anspruch 70 odor 71, das oino α-Amylase-Aktivität aufwoist.

73. Verfahren zur Herstellung einer genetisch modifizierten Pflanze bei dom man oin gonotischos Konstrukt nach oinom dor Ansprücho 39 bis 46 in das Gonom einor pflanzlichon Zelle odor oinor Pflanzo überführt, um ein das Konstrukt enthaltendes gonotischos Matorial zu orhalton, und es anschlioßond ?u vinor gonotisch modifiziorton Pflanzo rogonoriort.

74. Vorfahren ru.oii Vispruch 73, bei dom das gonotischo Konstrukt in oino Pflanzo mit oinom Wirtsorganismus noch oinom dor Ansprücho 66 bis 68 überführt wird.

75. Vorfahren nach Anspruch 73, bei dom das genotischo Konstrukt in die Pflanzo odor oinon Toil davon durch direkte Injektion oder durch Eloktroporation überführt wird.

76. Genetisch modifizierte Pflanzo, erhältlich nach einem Verfahren gemäß oinom der Ansprücho 73 bis 75.

77. Genetisch modifizierte Pflanzo nach Anspruch 76, die in ihrem Genom mindestens ein gonotischos Konstrukt nach Anspruch 41 enthält, wobei die Pflanzo eine reduzierte a-Amylase-Aktivität im Verhältnis iur entsprechenden nicht-modifizierten PfI-nze aufwoist.

78. Genetisch modifizierte Pflanzo nach Anspruch 76, die in ihrem Genom mindestens ein genetisches Konstrukt nach einem dor Ansprücho 38 bis 40 oder 42 bis 46 onthült, wobei die Pflanzo eine erhöhte a-Amylase-Aktivität im Verhältnis zur entsprechenden nicht-modifiziorten Pflanze aufweist.

79. Genetisch modifizierte Pflanze nach Anspruch 76, in der die a-Amylase-Aktivität bei niedrigen Temperaturen regulierbar ist, wobei dio Pflanzo in ihrem Genom mindestens oin genetisches Konstrukt nach Anspruch 46 und einen Promotor enthält, der bei Temperaturen unterhalb von otwa 8⁰C die Transkription des (der) DNA-Fragments(o) aktiviert, das (die) in dem (den) Konstrukt(on) enthalten ist (sind).

80. Gonotisch modifizierte Pflanze nach Anspruch 77 und/oder 79, wobei das genetische Konstrukt im selben Gewebe oder derselben Zolle aktiv ist, wie in dem Gewebe odor der Zelle, in der mindestens ein α-Amylaso-Gen exprimiert wird.

81. Gonetisch modifizierte Pflanze nach einem der Ansprüche 76 bis 80, die eine dicotyledone Pflanze ist.

82. Genetisch modifizierte Pflanze nach Anspruch 81, die zur Familie Solanaceae, vorzugsweise zur Gattung Solanum, gehört und vorzugsweise Solanum tuberosum ist.

83. Genetisch modifizierte Kartoffel, die das Produkt einer gonetisch modifizierten Pflanze nach einem der Ansprüche 76 bis 82 ist.

84. Verfahren zur Quantifizierung des a-Amylase-Messenger-Gehalts eines Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, vorzugsweise einer dicotyledonen Pflanze, wobei eine Nucleinsäureenthaltende Probe aus dem Organismus mit einem denaturierten DNA-Fragment nach einem der Ansprücho 1 bis 26 oder mit einer RNA-Kopie davon, unter für die Hybridisierung zwischen dem denaturierten DNA-Fragment oder der RNA-Kopie und der Nucleinsäure der Probe günstigen Bedingungen hybridisiert wird und die Menge der hybridisierenden Nucleinsäure bestimmt wird.

85. Verfahren zum Nachweis des Vorliogens eines a-Amylase-Gens oder eines Teils davon in einem Organismus, vorzugsweise einer Pflanze, vorzugsweise einer dicotyledonen Pflanze, wobei eine Probe, enthaltend ein DNA-Fragment, das das a-Amylase-Gen oder einen Teil davon enthält, einer Amplifizierung nach der Polymerase-Kettenreaktions-Technik unterworfen wird, und die DNA-Sequenz für die dazu verwendeten Primer aus der DNA-Sequenz eines DNA-Fragments nach einem der Ansprüche 1 bis 24 abgeleitet wird.

86. Verfahren zur Abschätzung der Tendenz von Pflanzenzüchtungsmaterial reduzierende Zucker zu bilden, wobei die Menge von a-Amylase-Messenger(n) oder -Gen(en) in einer Probe der Pflanze bestimmt wird, vorzugsweise mit dem Verfahren nach Anspruch 84, und die Menge mit einem vorher ermittelten Standardwert verglichen wird.

87. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 oder 84 bis 86, bei dem der Organismus eine dicotyledone Pflanze, vorzugsweise Solanum, vorzugsweise Solanum tuberosum oder S. melongena (Aubergine), Lycopersicon, vorzugsweise Lycopersicon esculentum (Tomate), Capsicum, vorzugsweise Capsicum annuum (Pfeffer), Nicotiana, vorzugsweise Nicotiana tabacum (Tabak), Ipomoea, vorzugsweise Ipomoea batatus (Süßkartoffel), Brassica, Medicago, Trifolium spp. (Klee), Glycine max (Sojabohne), Arachis, oder eine Wurzelnutzpflanze ist, vorzugsweise Beta, vorzugsweise Beta vulgaris (Zuckerrübe).

88. Verfahren zur Analyse oinos Orqanismus nach Allulen, dio oin DNA-Fragment nach oinom dor Ansprüche 1 bis 24 oder oin Homolog davon enthalten, bei dem man die Nucloinsäuro dos Organismus mit einem DNA-Fragment nach oinom dor Ansprüche 1 bis 24 hybridisier! und das Hybridisiorungsmustor noch don Grundsätzen dos Rostriktions-Fragmont-Längon-Polymorphismus auswertet.

Hierzu 27 Seiten Zeichnungen