ES2667677T3 - Evento de maíz 3272 y métodos para su detección - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que enlaza una molécula de ADN heterólogo al genoma de la planta de maíz en el evento de maíz 3272, que consiste en al menos una secuencia de nucleótidos de unión del evento de maíz 3272, seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, en donde la secuencia de unión abarca la unión entre el ADN heterólogo que comprende el casete de expresión insertado en el genoma de maíz y el ADN del genoma de maíz que flanquea el sitio de inserción.

Description

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de rigurosidad se pueden ajustar para permitir cierto apareamiento incorrecto en las secuencias, de manera que se detecten menores grados de similitud (sondeo heterólogo). Las secuencias más largas se hibridan específicamente a temperaturas más elevadas. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier::. Nueva York; y Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2, Ausubel et al., Comps., Greene Publishing y Wiley-Interscience: Nueva York (1995), y también Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (5a Ed. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

La especificidad es típicamente la función de los lavados post-hibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la disolución de lavado final. Generalmente, las condiciones de hibridación y de lavado de alta rigurosidad se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC menores que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. La Tm es la temperatura (a un pH y una fuerza iónica definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con una sonda perfectamente coincidente. Típicamente, en “condiciones muy rigurosas” se hibridará una sonda con su subsecuencia diana, pero no con otras secuencias.

Un ejemplo de condiciones de hibridación muy rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern es formamida al 50% con 1 mg de heparina a 42 ºC, llevando a cabo la hibridación durante la noche. Un ejemplo de condiciones de lavado de muy alta rigurosidad es NaCl 0,15M a 72ºC durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado de alta rigurosidad es un lavado 0,2x SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, infra, para una descripción de tampón SSC).

Condiciones de hibridación a modo de ejemplo para la presente invención incluyen la hibridación en SDS al 7%, NaPO4 0,25 M pH 7,2 a 67oC durante la noche, seguido de dos lavados en SDS al 5%, NaPO4 0,20 M pH 7,2 a 65o C durante 30 minutos cada lavado, y dos lavados en SDS al 1% en NaPO4 0,20 M pH7,2 a en 65o durante 30 minutos cada lavado. Un lavado de rigurosidad media a modo de ejemplo para un dúplex de, p. ej., más de 100 nucleótidos, es 1x SSC a 45ºC durante 15 minutos. Un lavado de rigurosidad baja a modo de ejemplo para un dúplex de, p. ej., más de 100 nucleótidos, es 4-6x SSC a 40ºC durante 15 minutos.

Para sondas de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos, condiciones de alta rigurosidad implican típicamente concentraciones de sales de ion Na de menos de aproximadamente 1,0 M, típicamente una concentración de ion Na de aproximadamente 0,01 a 1,0 M (u otras sales) a pH 7,0 a 8,3, y la temperatura es típicamente al menos aproximadamente 30ºC. También se pueden conseguir condiciones muy rigurosas con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida. En general, una relación entre la señal y el ruido de 2x (o superior) respecto a la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular indica la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí en condiciones muy rigurosas siguen siendo sustancialmente idénticos si las proteínas que codifican son sustancialmente idénticas. Esto ocurre, p. ej., cuando se crea una copia de un ácido nucleico utilizando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético.

Los siguientes son conjuntos a modo de ejemplo de condiciones de hibridación/lavado que se pueden utilizar para hibridar secuencias de nucleótidos que son sustancialmente idénticas a las secuencias de nucleótidos de referencia: una secuencia de nucleótidos de referencia se hibrida preferiblemente a la secuencia de nucleótidos de referencia en dodecilsulfato sódico (SDS) al 7% , NaPO40,5 M , EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 2X SSC, SDS al 0,1% a 50°C, más deseablemente en dodecilsulfato sódico (SDS) al 7%, NaPO40,5 M , EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 1X SSC, SDS al 0,1% a 50°C, aún más deseablemente en dodecilsulfato sódico (SDS) al 7% , NaPO40,5 M , EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0,5X SSC, SDS al 0,1% a 50°C, preferiblemente en dodecilsulfato sódico (SDS) al 7%, NaPO40,5 M, EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0,1X SSC, SDS al 0,1% a 50°C, más preferiblemente en dodecilsulfato sódico (SDS) al 7%, NaPO40,5 M , EDTA 1 mM a 50°C con lavado en 0,1X SSC, SDS al 0,1% SDS a 65°C. Las secuencias se pueden detectar utilizando todas las condiciones anteriores. Para los fines de definir la invención, se utilizan las condiciones de alta rigurosidad.

La "transformación" es un proceso para introducir ácidos nucleicos heterólogos en una célula u organismo huésped. En particular, la "transformación" se refiere a la integración estable de una molécula de ADN en el genoma de un organismo de interés.

"Transformado/transgénico/recombinante" se refieren a un organismo huésped, tal como una bacteria o una planta, en el cual se ha introducido una molécula de ácido nucleico heterólogo. La molécula de ácido nucleico se puede integrar de forma estable en el genoma del huésped o la molécula de ácido nucleico también puede estar presente como una molécula extracromosómica. Tal molécula extracromosómica puede autorreplicarse. Se sobreentenderá que las células, los tejidos o las plantas transformados no abarcan únicamente el producto final de un proceso de transformación, sino también la progenie transgénica de éste. Un huésped "no transformado", "no transgénico" o "no recombinante" se refiere a un organismo natural, p. ej., una bacteria o planta, que no contiene la molécula de ácido nucleico heterólogo. Tal como se utiliza en esta memoria, "transgénico" se refiere a una planta, célula vegetal, o multitud de células vegetales estructuradas o no estructuradas que han integrado, mediante técnicas bien conocidas

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Otro aspecto abarca cebadores de secuencia flanqueantes que comprenden al menos 10-15 nucleótidos contiguos de los nucleótidos 322-1879 de SEQ ID NO: 4 (designada arbitrariamente en esta memoria como la secuencia flanqueante 3'), o los complementos de la misma. En un aspecto de este elemento, los cebadores de secuencia flanqueantes se seleccionan del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36 y SEQ ID NO: 42, y los complementos de las mismas.

Otro aspecto abarca un par de cebadores polinucleotídicos que comprenden un primer cebador polinucleotídico y un segundo cebador polinucleotídico que actúan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz 3272 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz 3272, en donde la primera secuencia de cebador es o es complementaria de un genoma de planta de maíz que flanquea el punto de inserción de una secuencia de ADN heteróloga insertada en el genoma de la planta de maíz del evento de maíz 3272, y la segunda secuencia de cebador polinucleotídico es o es complementaria de la secuencia de ADN heteróloga insertada en el genoma de la planta de maíz del evento de maíz 3272.

En un aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de los nucleótidos desde la posición 1-1409 de SEQ ID NO: 3 o complementos de la misma. En un aspecto adicional de este elemento, el primer cebador polinucleotídico comprende la secuencia de nucleótidos recogida en SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 48, o complementos de las mismas. En otro aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de los nucleótidos desde la posición 322-1879 de SEQ ID NO: 4 o complementos de la misma. En otro aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico comprende la secuencia de nucleótidos recogida en SEQ ID NO: 36 o SEQ ID NO: 42, o complementos de las mismas. En aún otro aspecto de este elemento, el segundo cebador polinucleotídico comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de SEQ ID NO: 33, o complementos de la misma. En aún un aspecto adicional de este elemento, el segundo cebador polinucleotídico comprende la secuencia de nucleótidos recogida en SEQ ID NO: 16 a SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 49, o complementos de las mismas.

En otro aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 34 y el segundo cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 21 actúan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz 3272 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz 3272 tal como se describe en el Ejemplo 5. En un aspecto adicional de este elemento, el primer cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 35 y el segundo cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 26 actúan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz 3272 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz 3272 tal como se describe en el Ejemplo 5. En aún otro aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 39 y el segundo cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 40 actúan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz 3272 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz 3272 tal como se describe en el Ejemplo 4. En otro aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 45 y el segundo cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 46 actúan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz 3272 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz 3272 tal como se describe en el Ejemplo 8. En aún otro aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 48 y el segundo cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 49 actúan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz 3272 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz 3272 tal como se describe en el Ejemplo 8.

En otro aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 36 y el segundo cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 27 actúan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz 3272 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz 3272 tal como se describe en el Ejemplo 5. En aún otro aspecto de este elemento, el primer cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 42 y el segundo cebador polinucleotídico recogido en SEQ ID NO: 41 actúan juntos en presencia de un molde de ADN de evento de maíz 3272 en una muestra para producir un amplicón diagnóstico para el evento de maíz 3272 tal como se describe en el Ejemplo 4.

Por supuesto, está dentro de la experiencia en la técnica obtener una secuencia adicional en la secuencia del genoma que flanquea cualquier extremo de las secuencias de ADN heterólogo insertadas para uso como una secuencia de cebador que puede utilizarse en dichos pares de cebadores para amplificar las secuencias que son diagnósticas para el evento 3272. Para los fines de esta divulgación, la frase “fuera de la secuencia del genoma que flanquea cualquier extremo de las secuencias de ADN heterólogo insertadas” se refiere específicamente a un movimiento secuencial hacia fuera de los extremos de las secuencias de ADN heterólogo insertadas, los puntos en los que las secuencias de ADN insertado son adyacentes a la secuencia de ADN genómico nativa, y fuera en el ADN genómico del cromosoma particular en el que se insertaron las secuencias de ADN heterólogo. Preferiblemente, una secuencia de cebador correspondiente o complementaria a una parte de la secuencia de inserción debería cebar la extensión transcripcional de una cadena incipiente de ADN o ARN hacia la unión de la secuencia flanqueante más próxima. Por consiguiente, una secuencia de cebador correspondiente o complementaria a una parte de la secuencia flanqueante genómica debería cebar la extensión transcripcional de una cadena incipiente de ADN o ARN hacia la unión de la secuencia flanqueante más próxima. Una secuencia de cebador puede ser, o puede ser complementaria a una secuencia de ADN heterólogo insertada en el cromosoma de

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Desarrollo de Líneas Endogámicas de Maíz El uso de líneas endogámicas estériles masculinas es solo un factor en la producción de híbridos de maíz. Técnicas de cultivo de plantas conocidas en la técnica y utilizadas en un programa de reproducción de plantas de maíz incluyen, pero no se limitan a, selección recurrente, retrocruzamiento, reproducción de pedigrí, selección mejorada de polimorfismo de longitud de restricción, selección mejorada de marcador genético y transformación. El desarrollo de híbridos de maíz en un programa de reproducción de plantas de maíz requiere, en general, el desarrollo de líneas endogámicas homocigotas, el cruce de estas líneas y la evaluación de los cruces. Se utilizan métodos de reproducción de pedigrí y de reproducción de selección recurrente para desarrollar líneas endogámicas a partir de poblaciones reproductoras. Programas de reproducción de plantas de maíz combinan los fondos genéticos de dos o más líneas endogámicas o diversas otras fuentes de germoplasma en agrupaciones de reproducción a partir de las cuales se desarrollan nuevas líneas endogámicas por auto-fecundación y selección de fenotipos deseados. Las nuevas líneas endogámicas se cruzan con otras líneas endogámicas y los híbridos de estos cruces se evalúan para determinar los que tengan un potencial comercial. La reproducción vegetal y el desarrollo de híbridos, tal como se practican en un programa de reproducción de plantas de maíz son costosos y laboriosos.

La reproducción de pedigrí comienza con el cruce de dos genotipos, cada uno de los cuales puede tener una o más características deseables que están ausentes en el otro o que complementa al otro. Si los dos parentales originales no proporcionan todas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de reproducción. En el método de pedigrí, plantas superiores se auto-fecundan y se seleccionan en generaciones sucesivas. En las generaciones sucesivas la condición heterocigota da paso a líneas homogéneas como resultado de la autopolinización y selección. Típicamente en el método de reproducción de pedigrí se ponen en práctica cinco o más generaciones de auto-fecundación y selección: F1• F2; F2 • F3; F3F4; F4F.5; etc.

La reproducción por selección recurrente, retrocruzamiento por ejemplo, se puede utilizar para mejorar una línea endogámica y un híbrido que se produce utilizando estás líneas endogámicas. El retrocruzamiento se puede utilizar para transferir un rasgo deseable específico desde una línea endogámica o fuente a una línea endogámica que carece de ese rasgo. Esto se puede conseguir, por ejemplo, cruzando primero una línea endogámica superior (parental recurrente) con una línea endogámica donante (parental no recurrente) que porta el o los genes apropiados para el tratado en cuestión. La progenie de este cruce se aparea de nuevo entonces con el parental recurrente superior, seguido de la selección en la progenie resultante del rasgo deseado a transferir desde el parental no recurrente. Después de cinco o más generaciones de retrocruzamiento con selección del rasgo deseado, la progenie será homocigota para loci que controlan la característica que está siendo transferida, pero será como el parental superior para esencialmente todos los otros genes. La última generación de retrocruzamiento se auto-fecunda luego para dar una progenie de reproducción pura para el o los genes que están siendo transferidos. Un híbrido desarrollado a partir de líneas endogámicas que contienen el o los genes transferidos es esencialmente el mismo que un híbrido desarrollado a partir de las mismas líneas endogámicas sin el o los genes transferidos.

Líneas endogámicas de élite, es decir, líneas endogámicas homocigotas, de reproducción pura, también se pueden utilizar como materiales de partida para la reproducción o poblaciones fuente de las cuales se desarrollan otras líneas endogámicas. Estas líneas endogámicas, derivadas de líneas endogámicas de élite, se pueden desarrollar utilizando los métodos de reproducción de pedigrí y de reproducción de selección recurrente anteriormente descritos. Como un ejemplo, cuando se utiliza una reproducción por retrocruzamiento para crear estas líneas derivadas en un programa de reproducción de plantas de maíz, líneas endogámicas de élite se pueden utilizar como una línea parental o material de partida o población fuente y pueden servir como el parental donante o recurrente.

Desarrollo de Híbridos de Maíz Un híbrido de maíz de cruce sencillo resulta del cruce de dos líneas endogámicas, cada una de las cuales tiene un genotipo que complementa el genotipo de la otra. La progenie híbrida de la primera generación se designa F1. En el desarrollo de híbridos comerciales en un programa de reproducción de plantas de maíz, sólo se buscan las plantas híbridas F1. Híbridos F1 preferidos son más vigorosos que sus parentales endogámicos. Este vigor del híbrido, o heterosis, se puede manifestar en muchos rasgos poligénicos, incluyendo el crecimiento vegetativo incrementado y el rendimiento incrementado.

El desarrollo de un híbrido de maíz en un programa de reproducción de plantas de maíz implica tres etapas: (1) la selección de plantas a partir de diversas agrupaciones de germoplasma para cruces de reproducción iniciales; (2) la auto-fecundación de las plantas seleccionadas a partir de los cruces de reproducción para varias generaciones para producir una serie de líneas endogámicas que, aunque diferentes una de otra, se reproducen correctamente y son muy uniformes; y (3) cruce de las líneas endogámicas seleccionadas con diferentes líneas endogámicas para producir la progenie híbrida (F1). Durante el proceso de endogamia en el maíz, disminuye el vigor de las líneas. El vigor se restablece cuando se cruzan dos líneas endogámicas diferentes para producir la progenie híbrida (F1). Una consecuencia importante de la homocigosidad y homogeneidad de las líneas endogámicas es que el híbrido entre un par definido de líneas endogámicas será siempre el mismo. Una vez que se han identificado las líneas endogámicas que dan un híbrido superior, la semilla híbrida se puede reproducir indefinidamente siempre que se mantenga la homogeneidad de los parentales endogámicos.

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Un híbrido de un solo cruce sólo se produce cuando dos líneas endogámicas se cruzan para producir la progenie F1 . Un híbrido de doble cruce se produce a partir de cuatro líneas endogámicas cruzados por pares (A X B y C X D) y entonces los dos híbridos F1 se cruzan de nuevo (A X B) X (C X D). Un híbrido de cruce de tres vías se produce a partir de tres líneas endogámicas, en que dos de las líneas endogámicas se cruzan (A X B) y después el híbrido F1 resultante se cruza con la tercera línea endogámica (A X B) X C. Gran parte del vigor híbrido exhibido por híbridos F1 se pierde en la próxima generación (F2). Por consiguiente, la semilla de híbridos no se utiliza para el material de plantación.

La producción de semillas híbridas requiere la eliminación o inactivación de polen producido por el parental femenino. La separación o inactivación incompleta del polen proporciona el potencial para la auto-polinización. Esta semilla auto-polinizada inadvertidamente puede ser recolectada de manera no intencionada y envasada con semilla híbrida.

Una vez que se ha plantado la semilla, es posible identificar y seleccionar estas plantas auto-polinizadas. Estas plantas auto-polinizadas serán genéticamente equivalentes a la línea endogámica femenina utilizada para producir el híbrido.

Típicamente, estas plantas auto-polinizadas se pueden identificar y seleccionar debido a su vigor disminuido. Las auto-fecundaciones femeninas se identifican por su apariencia menos vigorosa para las características vegetativas y/o reproductoras, que incluyen una planta más corta, un tamaño de espiga pequeño, una forma de espiga y del grano, color de la mazorca u otras características.

La identificación de estas líneas auto-polinizadas también puede realizarse a través de análisis de marcadores moleculares. Véase , "The Identification of Female Selfs in Hybrid Maize: A Comparison Using Electrophoresis and Morphology", Smith, J. S. C. y Wych, R. D., Seed Science and Technology 14, págs. 1-8 (1995),. A través de estas tecnologías, la homocigosidad de la línea auto-polinizada puede verificarse analizando la composición alélica en varios loci a lo largo del genoma. Esos métodos permiten una identificación rápida de la invención divulgada en esta memoria. Véase también "Identification of Atypical Plants in Hybrid Maize Seed by Postcontrol and Electrophoresis" Sarca, V. et al., Probleme de Genetica Teoritica si Aplicata Vol. 20 (1) págs. 29-42.

Como es fácilmente evidente para un experto en la técnica, lo anterior son sólo algunas de las diversas formas en que los endogamias de la presente memoria descriptiva pueden obtenerse por aquellos que buscan introgresar el genotipo transgénico en otras líneas de maíz.. Están disponibles otros medios.

EJEMPLOS

La memoria descriptiva se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos detallados. Estos ejemplos se proporcionan con fines de ilustración. Las técnicas de clonación molecular y de ADN recombinante estándares utilizadas aquí son bien conocidas en la técnica y se describen por Ausubel (comp.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994); J. Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3.ª Ed., Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); y por T.J. Silhavy, M.L. Berman y L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984).

Ejemplo 1 Transformación y Selección del Evento 3272 El evento 3272 se produjo por transformación mediada por Agrobacterium de una línea de maíz endogámico (Zea mays) de propiedad. Embriones inmaduros se transformaron esencialmente según se describe en Negrotto et al. (Plant Cell Reports 19: 798-803, 2000), utilizando un fragmento de ADN del plásmido pNOV7013 (SEQ ID NO: 33). El plásmido pNOV7013 comprende casetes de expresión en tándem. El primer casete de expresión está compuesto por una secuencia promotora de γ-Zeína (Genbank Nº de Acceso X56117) enlazada operativamente a un gen αamilasa amy797E, que está además operativamente enlazado al intrón Nº 9 de Zea maysdel gen fosfoenolpiruvato carboxilasa (Matsuoka et al. 1989, Euro. J. Biochem. 181:593-598), que está enlazado operativamente, además, a a una secuencia de terminación de la transcripción y poliadenilación del extremo 3’ de 35S (Franck et al. 1980, Cell 21:285-294).El segundo casete de expresión está comprendido por un promotor ZmUbiInt de Zea mays (Christensen et al. 1992, Plant Mol. Biol. 18:675-689) operativamente enlazado a una secuencia codificante de pmi (Genbank Nº de Acceso M15380), además, operativamente enlazada a una secuencia de terminador del gen nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (GenBank Nº de Acceso V00087).

Embriones inmaduros se extirparon de espigas de 8 -12 días de edad y se lavaron con medio reciente en la preparación para la transformación. Los embriones se mezclaron con la suspensión de células de Agrobacterium que albergaban el vector de transformación pNOV7013, se agitaron vorticialmente durante 30 segundos y se dejaron incubar durante 5 minutos adicionales. Se aspiró disolución de Agrobacterium en exceso y los embriones se movieron después a placas que contenían un medio de cultivo no selectivo. Los embriones se co-cultivaron con el Agrobacterium restante a 22C durante 2-3 días en la oscuridad. Los embriones se transfirieron a medio de cultivo complementado con cefotaxima (250 mg/ml) y nitrato de plata (1,6 mg/l) y se incubaron en la oscuridad durante 10 días Los embriones que producen callos embriogénicos se transfirieron a un medio de cultivo celular que contenía manosa.

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Plántulas regeneradas fueron sometidas a ensayo mediante análisis de PCR TAQMAN® (véase el Ejemplo 2) en cuanto a la presencia tanto de los genes pmi como amy797E, así como en cuanto a la ausencia del gen de resistencia a los antibióticos espectinomicina (spec). Plantas positivas para ambos transgenes, y negativas para el gen spec se transfirieron al invernadero para la propagación ulterior. Eventos positivos se identificaron y rastrearon utilizando bioensayos de insectos contra el gusano de la raíz del maíz. Eventos insecticidas se caracterizaron por el número de copias mediante el análisis TAQMAN. 3272 se eligió para un análisis adicional basado en tener una única copia de los transgenes, buena expresión de proteína como se identificó por ELISA y buena actividad enzimática.

El T0 3272 se cruzó con líneas de maíz endogámicas NP911Ix y NP2222x, creando poblaciones T1. Las plantas T1 se autopolinizaron para crear la generación BC1, y este proceso se repitió para crear una generación BC3 o BC4, respectivamente. Los ensayos de la progenie de las plantas retrocruzadas se emplearon para identificar familias homocigotas (convertidas). Las endogamias convertidas en 3272 se cruzaron con otras líneas endogámicas elitistas para crear híbridos utilizados en estudios posteriores.

Ejemplo 2 Detección de 3272 por PCR TAQMAN El análisis TAQMAN se llevó a cabo esencialmente como se describe en Ingham et al. (Biotechniques, 31:132-140, 2001). En síntesis, se aisló ADN genómico de hojas de plantas de maíz transgénicas y no transgénicas utilizando el Puregene ® kit de extracción de ADN genómico Puregene® (Gentra Systems, Minneapolis, MN) esencialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, excepto que todas las etapas se llevaron a cabo en 1,2 ml de placas de 96 pocillos El sedimento de ADN secado se resuspendió en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).

Las reacciones por PCR TAQMAN se llevaron a cabo en placas de 96 pocillos. Para el control del gen de maíz endógeno se diseñaron cebadores y sondas específicos para el gen de alcohol deshidrogenasa (adh1) de Zea mays (Genbank nº de acceso AF044295). Se reconocerá por parte de la persona experta que como controles endógenos se pueden utilizar otros genes de maíz. Las reacciones se multiplexaron para amplificar simultáneamente amy797E y adh1 o pmi y adh1. Para cada muestra, se generó una mezcla maestra combinando 20 μL de ADN genómico extraído con 35 μL de 2x TAQMAN Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) complementado con cebadores hasta una concentración final de 900 nM cada uno, sondas hasta una concentración final de 100 nM cada una y agua hasta un volumen final de 70 μL Esta mezcla se distribuyó en tres réplicas de 20 μL cada una en placas de amplificación de 96 pocillos y se sellaron con una película de termosellado ópticamente transparente (Marsh Bio Products). La PCR se realizó en un instrumento ABI Prism 7700 utilizando los siguientes parámetros de amplificación: 2 min a 50oC y 10 min a 95oC, seguido de 35 ciclos de 15 s a 95oC y 1 min a 60oC.

Los resultados del análisis TAQMAN demostraron que el evento 3272 tenía una copia del gen amy797E y una copia del gen pmi.

Ejemplos de combinaciones de secuencias de cebador/sonda adecuadas que se utilizaron son:

Nombre del Cebador

Secuencia del Cebador SEQ ID NO:

synAmyl-directo

5'-CAAGCAGGAGCTCATCAACATG -3’ SEQ ID NO: 7

synAmyl-inverso

5'-GCCCTGTGGTTGATCACGAT -3’ SEQ ID NO: 8

synAmyl-sonda

5'-TCCGCGATGACCTTGATGCCGTA -3’ SEQ ID NO: 9

(marca 5' = FAM, marca 3' = TAMRA)

PMI-directo

5'-CCGGGTGAATCAGCGTTT-3’ SEQ ID NO: 10

PMI-inverso

5'-GCCGTGGCCTTTGACAGT-3’ SEQ ID NO: 11

PMI-sonda

5'-TGCCGCCAACGAATCACCGG-3’ SEQ ID NO: 12

(marca 5' = FAM, marca 3' = TAMRA)

ZmADH-267directo

5’-GAACGTGTGTTGGGTTTGCAT-3’ SEQ ID NO: 13

ZmADH-337 inverso

5'-TCCAGCAATCCTTGCACCTT-3’ SEQ ID NO: 14

ZmADH-316 sonda 5'-TGCAGCCTAACCATGCGCAGGGTA-3’ SEQ ID NO: 15 (marca 5' = TET, marca 3' = TAMRA)

Ejemplo 3. Detección de 3272 por Transferencia Southern ADN genómico utilizado para el análisis southern se aisló a partir del tejido foliar agrupado de diez plantas que representan la generación seis (BC4) de retrocruzamiento de 3272 utilizando esencialmente el método de Thomas et al. (Theor. Appl. Genet., 86:173-180, 1993). All plants used for DNA isolation were individually analyzed using TAQMANPCR (as described in Example 2) to confirm the presence of a single copy of the amy797E gene and the pmi gene. Para los controles segregantes negativos, se aisló ADN del tejido foliar agrupado de cinco plantas que representaban la generación BC4 del evento 3272. Estas plantas segregantes negativas se analizaron individualmente utilizando la PCR TAQMAN y los ensayos fueron negativos en cuanto a la presencia del gen amy797E y el gen pmi, pero fueron, como se esperaba, positivos para el control interno del ensayo, el gen adh del maíz endógeno.

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GenomeWalker™ y un cebador específico para la inserción anidada para la secuencia del límite derecho (5'-CTCCGCTCATGATCAGATTGTCGTTTC-3'; SEQ ID NO: 24) o secuencia del límite izquierdo (5'-TTACTAGATCTGCTAGCCCTGCAGGAAA-3'; SEQ ID NO: 25). Se utilizaron las siguientes condiciones de PCR para las reacciones primaria y secundaria: 94oC, 25 s 72oC, 3 min, 7 veces; 94oC, 25 s; 67oC, 3 min, 32 veces; 67oC, 7 min, 1 vez.

La secuencia flanqueante 5’ se confirmó utilizando un cebador localizado en la región flanqueante 5' (SEQ ID NO: 35) combinado con un cebador de la secuencia de inserción (SEQ ID NO: 26) en una reacción PCR bajo las siguientes condiciones: 95oC durante 5 min, 94oC durante 30 s., 50-60oC durante 30 s durante 35 ciclos, 72oC durante 2 min, 72oC durante10 min y finalizando a 4oC. La secuencia del amplicón resultante se recoge en SEQ ID NO: 3 que comprende la secuencia de unión 5’ recogida en SEQ ID NO: 1. La secuencia flanqueante 5’ comprendida en SEQ ID NO: 3 se recoge en SEQ ID NO: 5.

La secuencia flanqueante 3’ se confirmó utilizando un cebador localizado en la región flanqueante 3' (SEQ ID NO: 36) combinado con un cebador específico para la inserción (SEQ ID NO: 27) en una reacción PCR bajo las siguientes condiciones: 95oC durante 5 min, 94oC durante 30 s., 50-60oC durante 30 s durante 35 ciclos, 72oC durante 2 min, 72oC durante10 min y finalizando a 4oC. La secuencia del amplicón resultante se recoge en SEQ ID NO: 4 que comprende la secuencia de unión 3’ recogida en SEQ ID NO: 2. La secuencia flanqueante 3’ comprendida en SEQ ID NO: 4 se recoge en SEQ ID NO: 6.

Ejemplo 6. Análisis de semillas de plantas de maíz 3272 que expresan la -amilasa Amy797E Se obtuvieron semillas de plantas de maíz 3272 transformadas con pNOV7013 tal como se describe en el Ejemplo

1. La acumulación de almidón en estos granos pareció ser normal, basada en la inspección visual y en la tinción normal del almidón con una solución de yodo antes de cualquier exposición a altas temperaturas. Granos inmaduros se disecaron y endospermos purificados se colocaron individualmente en tubos de microcentrífuga y se sumergieron en 200 l de tampón NaPO4 50 mM . Los tubos se colocaron en un baño de agua a 85oC durante 20 minutos y luego se enfriaron en hielo. Se añadieron veinte microlitros de una solución de yodo al 1% a cada uno de los tubos y se mezclaron. Aproximadamente el 25% de los granos segregados se tiñeron normalmente para el almidón. El 75% restante no se tiñó, lo que indica que el almidón se había degradado en azúcares de bajo peso molecular que no se tiñen con yodo. Se encontró que los granos de 3272 hidrolizaban por sí mismos el almidón de maíz No hubo una reducción detectable en almidón tras la incubación a 37oC.

La expresión de la amilasa se analizó adicionalmente por aislamiento de la fracción de proteína hipertermófila del endosperma seguido de tinción de PAGE/Coomassie. Se observó una banda de proteínas segregante del peso molecular apropiado (50 kD). Estas muestras se someten a un ensayo de -amilasa utilizando amilosa teñida disponible comercialmente (AMYLAZYME, de Megazyme, Irlanda). Los altos niveles de actividad de amilasa hipertermofílica se correlacionaron con la presencia de la proteína de 50 kD.

Granos de las plantas de tipo salvaje o plantas 3272 se calentaron a 100oC durante 1, 2, 3 o 6 horas y después se tiñó para el almidón con una solución de yodo. Poco o nada de almidón se detectó en granos maduros después de 3 o 6 horas, respectivamente. Por lo tanto, el almidón en granos maduros de maíz transgénico que expresa αamilasa hipertermófila que fija como objetivo el retículo endoplásmico se hidrolizó cuando se incubó a alta temperatura.

En otro experimento, se purificó parcialmente el almidón a partir de granos maduros de plantas 3272 que fueron empapados a 50C durante 16 horas se hidrolizó después de calentar a 85C durante 5 minutos. Esto ilustró que la -amilasa dirigida al retículo endoplasmático se une al almidón después de la molienda del grano, y es capaz de hidrolizar el almidón tras el calentamiento. La tinción con yodo indicó que el almidón permanece intacto en semillas maduras después del empapamiento durante 16 horas a 50C.

En otro experimento, se calentaron granos maduros de plantas 3272 a 95C durante 16 horas y luego se secaron. En las semillas que expresan la -amilasa hipertermófila, la hidrólisis del almidón en azúcar dio como resultado un aspecto arrugado después del secado.

Ejemplo 7. Fermentación de granos de plantas de maíz que expresan -amilasa Maíz 3272 transgénico que contiene una -amilasa termoestable se comporta bien en la fermentación sin adición de -amilasa exógena, requiere mucho menos tiempo para la licuefacción y da como resultado una solubilización más completa de almidón. Las fermentaciones a escala de laboratorio se realizaron mediante un protocolo con las siguientes etapas (detalladas a continuación): 1) molienda, 2) análisis de la humedad, 3) preparación de una suspensión que contiene maíz triturado, agua, residuo y -amilasa, 4) licuefacción y 5) sacarificación y fermentación simultáneas (SSF). En este ejemplo, la temperatura y el tiempo de la etapa de licuefacción se variaron como se describe más adelante. Además, el maíz transgénico se licuó con y sin -amilasa exógena y el comportamiento en la producción de etanol se comparó con el maíz de control tratado con -amilasa comercialmente disponible.

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El maíz se secó hasta un 11% de humedad y se almacenó a temperatura ambiente. El contenido de -amilasa de la harina de maíz 3272 era de 95 unidades/g, en que 1 unidad de enzima genera 1 micromol de extremos reductores por min de harina de maíz a 85 C en tampón MES pH 6,0. El maíz de control que se utilizó fue un maíz de tono amarillo que se sabe que se comporta bien en la producción de etanol. 1) Molienda se trituró maíz transgénico (1180 g) en un molino de martillos Perten 3100 equipado con un tamiz de 2,0 mm, generando así harina de maíz transgénica. Se molió maíz de control en el mismo molino después de una limpieza a fondo para evitar la contaminación por el maíz transgénico. 2) Análisis de la humedad: Se pesaron muestras (20 g) de maíz transgénico y de control en pesas de aluminio y se calentaron a 100 C durante 4 h. Las muestras se pesaron de nuevo y el contenido de humedad se calculó a partir de la pérdida de peso. El contenido de humedad de la harina transgénica era de 9,26%; el de la harina de control era de 12,54%. 3) Preparación de suspensiones: La composición de las suspensiones se diseñó para producir un macerado con 36% de sólidos al comienzo de la SSF. Muestras de control se prepararon en frascos de plástico de 100 ml y que contenían 21,50 g de harina de maíz de control, 23 ml de agua desionizada, 6,0 ml de reactivo (8% de sólidos en peso) y 0,30 ml de una -amilasa comercialmente disponible diluida 1/50 con agua. La dosis de -amilasa se eligió como representativa del uso industrial. Cuando se ensayó en las condiciones descritas anteriormente para el ensayo de la -amilasa transgénica, la dosis de -amilasa control era de 2 U/g de harina de maíz. El pH se ajustó a 6,0 mediante la adición de hidróxido de amonio. Se prepararon muestras transgénicas de la misma manera, pero contenían 20 g de harina de maíz debido al menor contenido de humedad de la harina transgénica. Se prepararon suspensiones de harina transgénica con -amilasa a la misma dosis que las muestras de control o sin -amilasa exógena. 4) Licuefacción Los frascos que contenían suspensiones de harina de maíz transgénica se sumergieron en baños de agua a 85 C o 95 C durante tiempos de 5, 15, 30, 45 o 60 min. Las suspensiones de control se incubaron durante 60 min a 85 C. Durante la incubación a alta temperatura, las suspensiones se mezclaron vigorosamente a mano cada 5 min. Después de la etapa de alta temperatura, las suspensiones se enfriaron en hielo. 5) Sacarificación y fermentación simultáneas: La papilla producida por licuefacción se mezcló con glucoamilasa (0,65 ml de una dilución 1/50 de una glucoamilasa L-400 comercialmente disponible), proteasa (0,60 ml de una dilución 1.000 veces de proteasa comercialmente disponible), 0,2 mg de Lactocida y urea (0,85 ml de una dilución de 10 veces de Líquido de Urea al 50%). Se realizó un orificio en la tapa del frasco de 100 ml que contenía la papilla para permitir que el CO2 se ventilara. La papilla se inoculó luego con levadura (1,44 ml) y se incubó en un baño de agua a 90 F. Después de 24 horas de fermentación, la temperatura se redujo a 86 F; a las 48 horas se ajustó a 82 F.

La levadura para la inoculación se propagó preparando una mezcla que contenía levadura (0,12 g) con 70 gramos de maltodextrina, 230 ml de agua, 100 ml de residuo, glucoamilasa (0,88 ml de dilución de 10 veces de una glucoamilasa comercialmente disponible), proteasa (1,76 ml de una dilución de 100 veces de una enzima comercialmente disponible), urea (1,07 gramos), penicilina (0,67 mg) y sulfato de zinc (0,13 g). El cultivo de propagación se inició el día antes de que fuera necesario y se incubó con mezcladura a 90oF.

Se tomaron muestras a las 24, 48 y 72 horas de cada recipiente de fermentación, se filtraron a través de filtros de 0,2 m y se analizaron por HPLC para etanol y azúcares. A las 72 h, las muestras se analizaron en cuanto a sólidos totales disueltos y almidón residual.

El análisis por HPLC se realizó en un sistema de gradiente binario equipado con detector de índice de refracción, calentador de columna y columna Bio-Rad Aminex HPX-87H. El sistema se equilibró con H2SO4 0,005 M en agua a 1 ml/min. La temperatura de la columna era de 50 C. El volumen de inyección de muestra era de 5 l; la elución estaba en el mismo disolvente. La respuesta RI se calibró mediante inyección de patrones conocidos. Etanol y glucosa se midieron ambos en cada inyección.

El almidón residual se midió como sigue. Las muestras y los patrones se secaron a 50°C en una estufa y luego se molieron a la forma de un polvo en un molino de muestra. El polvo (0,2 g) se pesó en un tubo de centrífuga aforado de 15 ml. El polvo se lavó 3 veces con 10 ml de etanol acuoso (80% v/v) agitando en vórtice, seguido de centrifugación y desechando el sobrenadante. Se añadió DMSO (2,0 ml) al sedimento, seguido de 3,0 ml de una alfa-amilasa termoestable (300 unidades) en tampón MOPS. Después de una mezcladura vigorosa, los tubos se incubaron en un baño de agua a 85C durante 60 min. Durante la incubación, los tubos se mezclaron cuatro veces. Las muestras se enfriaron y se añadieron 4,0 ml de tampón acetato sódico (200 mM, pH 4,5) seguido de 0,1 ml de glucoamilasa (20 U). Las muestras se incubaron a 50C durante 2 horas, se mezclaron y luego se centrifugaron durante 5 min a 3.500 rpm. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 μm y se analizó la glucosa por el método de HPLC descrito anteriormente. Se utilizó un tamaño de inyección de 50 l para muestras con bajo contenido de almidón residual (<20% de sólidos).

El evento de maíz 3272 se comportó bien en la fermentación sin -amilasa añadida. El rendimiento de etanol a las 72 horas era esencialmente el mismo con o sin -amilasa exógena. Estos datos también demuestran que se obtiene un alto rendimiento de etanol cuando la temperatura de licuefacción es mayor; la presente enzima expresada en el maíz transgénico tiene actividad a temperaturas más altas que otras enzimas utilizadas comercialmente tales como la -amilasa de Bacillus liquefaciens .

Ejemplo 8. Ensayo TAQMAN Específico para el Evento 3272

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Este ejemplo describe un método TAQMAN PCR cuantitativo en tiempo real específico para el evento para la determinación del contenido relativo del ADN del Evento 3272 al ADN total del maíz en una muestra. El ensayo de PCR se optimizó para el uso en un sistema de detección de la secuencia.ABI Prism® 7900.El equipo que puede ser utilizado en este procedimiento incluye pero no se limita a: Sistema de detección de la secuencia ABI Prism® 7000 (Applied Biosystems Parte Nº 4339940); Software: Sequence Detection System versión 1.1 (Applied Biosystems Parte Nº 4349157); sistema de detección de la secuencia ABIPrismalm 7900HT (Applied Biosystems Parte Nº 4329002 o 4329004); Software: Sequence Detection System versión 2.0 (Applied Biosystems Parte Nº 4329002); Software: Sequence Detection System versión 2.1 (Applied Biosystems Parte Nº 43195666); placas de reacción ópticas de 96 pocillos MicroAmp® (Applied Biosystems Parte Nº N801-0560); MicroAmp® tapas ópticas (8 tapas/tira) (Applied Biosystems Parte Nº N801-0935); cubiertas adhesivas ópticas ABI Prisma® (Applied Biosystems Parte Nº 4311971); kit iniciador de cubiertas adhesivas ópticas ABI Prism® (Applied Biosystems Parte Nº 4313663); almohadillas de compresión de la cubierta ópticas ABI Prism® (Applied Biosystems Parte Nº 4312639).

Para la detección específica del ADN genómico del evento 3272 , se amplificó un fragmento de 94 pb de la región que abarca la unión inserción a planta en el Evento de maíz 3272 utilizando dos cebadores específicos. Los productos de la PCR se midieron durante cada uno de los ciclos (en tiempo real) por medio de una sonda oligonucleotídica específica para la dina marcada con dos colorantes fluorescentes FAM como colorante informador en su extremo 5 y TAMRA como colorante extintor en su extremo 3. Se explota la actividad de 5-nucleasa Taq ADN polimerasa, lo que da como resultado la escisión específica de la sonda, lo que conduce a un aumento de la fluorescencia, que luego se monitoriza.

Para la cuantificación relativa de ADN del Evento 3272 ,un sistema de referencia específico para maíz, que amplifica un fragmento de 136 pb de Alcohol Deshidrogenasa (Adh1), un gen endógeno de maíz, utilizando una par de cebadores específicos para el gen Adh1 y una sonda específica para el gen Adh1 marcada con VIC como un colorante informador en su extremo 5 y TAMRA como un colorante inactivador en su extremo 3 tal como se describe arriba. Ejemplos de combinaciones de secuencias de cebador/sonda adecuadas que se utilizaron en este procedimiento

incluyen:

Nombre del Cebador

Secuencia del Cebador SEQ ID NO:

Es3272 -5’ Directo

5'-CAAGCAGGAGCTCATCAACATG -3’ SEQ ID NO: 45

Es3272 -5’ Inverso

5'-GCCCTGTGGTTGATCACGAT -3’ SEQ ID NO: 46

Es3272 -5’ Sonda

5'-TCCGCGATGACCTTGATGCCGTA -3’ SEQ ID NO: 47

(marca 5' = 6-FAM, marca 3' = TAMRA)

ESPCR0026 F

5'-CATGATGAGTGCGTGATGAGGGCTCTT-3’ SEQ ID NO: 48

ESPCR0004 R

5'-GTATGATCTCGGCATGACTCACCGTGTT-3’ SEQ ID NO: 49

ZmAdh1 Directo

5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3' SEQ ID NO: 50

ZmAdh1 Inverso

5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3' SEQ ID NO: 51

ZmAdh1 sonda

5'-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-3' SEQ ID NO: 52

(marca 5' = VIC, marca 3' = TAMRA)

Para el análisis de muestras de maíz, se utilizaron aproximadamente 250 ng de ADN de molde por reacción.

Todos los reactivos se dejaron descongelar, se mezclaron bien y se almacenaron en hielo Se prepararon dos mezclas de reacción, una para el Evento 3272 PCR y otra para Zea mays Adh1 PCR, . Las mezclas maestras consisten en todos los componentes de la PCR, excepto el molde ADN, en cantidades suficientes para que se realicen todas las reacciones (incluidas las de las soluciones de ADN estándares). Típicamente, se preparó un exceso de cada una de las mezclas maestras para tener en cuenta la pérdida durante la transferencia repetida de líquido.

En las Tablas 1-5 se muestra un listado de reactivos, tampones y soluciones utilizados en este procedimiento. Tabla 1 Lista de reactivos.

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Tabla 2 Stock de ensayo endógeno de 50x Zm Adh1.

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Tabla 3 Stock de ensayo de 50x evento 3272

Tabla 4 Stock de 1000x sulforodamina 101.

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Tabla 5 Complementado 2x Jumpstart Readymix.

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Cuando se preparaba cada una de las mezclas de reacción, los reactivos se añadían típicamente en el orden enumerado en las Tablas 6 y 7. Tabla 6 Preparación de la reacción para el ensayo del gen de referencia Zm Adh1.

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Los resultados del análisis TAQMAN demostraron que el ADN del evento 3272 podría detectarse y cuantificarse selectivamente. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de experiencia de los expertos en la técnica a los que pertenece esta invención.

Claims (1)

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