CN105112537A - 转基因玉米3272双重数字pcr荧光定量检测方法 - Google Patents

转基因玉米3272双重数字pcr荧光定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种针对转基因玉米3272的双重数字PCR荧光定量检测方法，本方法可以直接对待检测样品的基因组中的转基因玉米3272进行定量检测，从而省去了常规PCR方法定量检测中标准曲线绘制步骤以及现有数字PCR检测中的样品前处理步骤，另外，在本方法中，由于转基因成分是通过外源基因拷贝数与内参基因拷贝数的比例计算得到的，因此在同一个反应体系进行双重检测可以提高转基因成分定量检测的稳定性。利用本方法可实现对转基因玉米3272的绝对定量检测，定量检测限可达到0.5％，灵敏度可达到0.1％，能够满足所有转基因成分实际检测的需要。此外，本方法操作简单，灵活性强，是一种转基因绝对定量检测的有效方法。

Description

转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测方法。
背景技术
自1996年首例转基因番茄在美国成功商业化以来，对于转基因作物的研究近二十年来取得了迅速的发展。根据ISAAA统计数据，截至2014年，全球转基因作物的种植面积已经达到1.8亿公顷，比1996年种植面积提高了近100倍，占全球作物种植总面积的3.4％。转基因作物的快速发展不仅为现代农业提供了更加便利的育种方式，也由于其未知的安全隐患引起了各个国家和地区的广泛关注。为此，各国家和地区纷纷建立起转基因成分的标识制度。在全球各国家和地区制定的转基因成分标识制度中，定量标识制度占据较大比重，其中以欧盟和日韩最具代表性。我国在转基因成分标识方面主要采取定性标识制度，由于定性标识制度与定量标识制度在检测技术等方面存在不同，使我国在作物进出口方面容易受到国际标准的制约。为此，我国需要大力发展转基因成分定量检测技术并建立相关定量标识制度。
数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的绝对定量PCR检测方法，是一项检测和定量核酸的新技术，其基本原理是通过将微量样品进行大倍数稀释和分液，直至每个样品中所含有的待测分子数不超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，针对反应结果采用泊松分布(Poissondistribution)公式，便可计算出样本的最初拷贝数或浓度。该技术不依赖于扩增曲线的循环阈值，也无需看家基因和标准曲线，即可实现DNA绝对定量。该技术在基因拷贝数变化分析(copynumbervariation,CNV)(Qinetal.,2008)、遗传突变检测(Yungetal.,2009)、基因分型(Loetal.，2007)、基因定量(Warrenetal.，2010)、单细胞基因表达(Guoetal.,2010)等方面的研究取得了突破性的发展，在临床方面为癌症、肿瘤等疾病检测提供了新的诊断方法。在转基因检测方面，Corbisier等(2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内参基因的拷贝数之比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数字PCR的可靠性。Burns等(2010)评估了数字PCR在转基因检测中检测限(LOD)和定量限(LOQ)，探索了数字PCR在转基因检测方面的可行性和反应条件，表明数字PCR能够对起始模板拷贝数进行绝对定量。然而利用数字PCR对转基因检测的研究还处于起步阶段。现有数字PCR检测方法都需要经过样品前处理过程，在实际检测中，前处理过程往往会导致实验结果产生偏差。因此现有的数字PCR检测方法不适合直接作为转基因成分的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种不需要进行样品前处理步骤的，针对转基因玉米3272的双重数字PCR荧光定量检测方法，可实现对转基因玉米品系3272的绝对定量。
为了实现本发明目的，本发明首先提供用于转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合，所述引物和探针组合为：
外源基因正向引物：5'-TCATCAGACCAGATTCTCTTTTATGG-3'
外源基因反向引物：5'-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'
外源基因探针：5'-FAM-ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG-BHQ1-3'
内参基因adh1-135正向引物：5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3'
内参基因adh1-135反向引物：5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'
内参基因adh1-135探针：5'-VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1-3'。
本发明还提供含有所述引物和探针组合的转基因玉米3272数字PCR双重荧光定量检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。
本发明进一步提供转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以提取的基因组DNA为模板，利用所述的引物和探针组合，进行数字PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物。
其中，数字PCR扩增反应的反应体系以4μl计为：基因组DNA1μl，225nM外源基因正、反向引物各0.04μl，225nM内参基因正、反向引物各0.04μl，50nM外源基因探针0.02μl，50nM内参基因探针0.02μl，2×MasterMix(购自Fluidigm公司)2μl，20×LoadingReagent(购自Fluidigm公司)0.4μl，ddH2O补足至4μl。
数字PCR扩增反应的程序为：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。
前述的方法，步骤3)中检测PCR扩增产物具体如下：在数字PCR扩增反应结束后，记录各反应孔中外源基因和内参基因的荧光信号值，通过泊松分布公式计算各反应孔中外源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的绝对浓度。
本发明是在PCR芯片中进行数字PCR扩增反应。将每个加样孔作为一个整体，加入转基因作物数字PCR扩增体系进行实时荧光扩增，通过监测每个反应孔中的荧光信号值，获得所有反应孔中的总体扩增曲线和热点图。
检测结果的判定按照以下方式进行：
1、在利用数字PCR进行扩增的过程中，阳性孔的判定方法为：出现明显区别于阴性反应孔(阴性反应孔中模板为1μlddH2O)的扩增信号，将该反应孔记为阳性扩增孔；阳性样品的判定方法为：在相同样品的三个平行组内，至少出现一组有阳性扩增孔，则表明检测样品基因组中含有转基因作物成分；
2、在数字PCR扩增结束后，记录每个扩增孔中外源基因和内参基因的亮点数，通过泊松分布公式计算每个孔中外源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的绝对浓度；
3、每个样品设置三个平行组，通过统计分析得到三个平行组内转基因成分浓度的相对标准偏差(RSD)，RSD≤25％表明定量结果有意义；
4、当待测样品反应孔中为阴性结果时，表明未检测到转基因作物成分；当待测样品反应管中为阳性结果时，表明待测样品中含有转基因作物成分。
本发明方法可以直接对待检测样品的基因组中的转基因玉米3272进行定量检测，从而省去了现有的数字PCR方法中的样品前处理步骤，使得检测过程简便易行，避免了前处理步骤对检测结果准确性的不良影响。另外，在本发明方法中，由于转基因成分是通过外源基因拷贝数与内参基因拷贝数的比例计算得到的，因此在同一个反应体系进行双重检测可以提高转基因成分定量检测的稳定性。
利用本发明提供的双重数字PCR荧光定量检测方法和检测试剂盒可以实现对转基因玉米3272的绝对定量检测，本方法定量检测限可达到0.5％，灵敏度可达到0.1％，能够满足转基因成分实际检测的需要。此外，本方法操作简单，灵活性强，是一种转基因绝对定量检测的有效方法。
附图说明
图1为本发明实施例2中转基因玉米3272外源基因引物探针与不同内参基因引物探针组合的扩增效果图；其中，A为与内参基因adh1-70bp组合，B为与内参基因adh1-135bp组合，C为与内参基因hmga-79bp组合，D为与内参基因zssIIb-88bp组合。
图2为本发明实施例2中转基因玉米3272品系特异性检测结果；其中，横坐标为不同转基因玉米品系，纵坐标为利用双重数字PCR法扩增得到的外源基因拷贝数。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1用于转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合的设计
根据转基因玉米3272品系外源基因插入序列及边界序列设计了如下用于转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合(SeqIDNo.1-6)：
外源基因正向引物：5'-TCATCAGACCAGATTCTCTTTTATGG-3'
外源基因反向引物：5'-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'
外源基因探针：5'-FAM-ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG-BHQ1-3'
内参基因adh1-135正向引物：5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3'
内参基因adh1-135反向引物：5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'
内参基因adh1-135探针：5'-VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1-3'。
实施例2转基因玉米3272双重数字PCR定量检测方法的建立
1.1实验材料
本实施例中使用的转基因玉米3272样品及其亲本非转基因样品，转基因玉米品系BT176、MON810、MIR604、MIR162、NK603、MON863均由中国检验检疫科学研究院提供。PCR芯片购自美国Fluidigm公司，型号为48.770DigitalArrayChip；BioMarkHD高通量基因分析系统(BiomarkHDSystem)购自Fluidigm公司。
1.2实验用转基因作物样品基因组DNA提取
1.2实验用转基因作物种子样品基因组DNA提取
(1)将作物种子样品研磨并彻底风干；
(2)将转基因玉米品系与亲本非转基因种子样品进行不同比例的混合，并通过混匀仪器的过夜混匀得到实验用的不同转基因浓度的样品；
(3)用分析天平称取100mg样品，加入400μLAP1缓冲液以及4μL的RNaseA，剧烈震荡混匀后，65℃下水浴20min，期间震荡混匀2-3次；
(4)将上述体系从水浴锅中取出，加入130μLP3缓冲液，混匀置于冰上冰浴5min；
(5)将上述体系从冰上取出，置于离心机中14000rpm离心5min；
(6)将上述体系中的上清液用枪头取出，置于QIAshredderMinispincolumn中，14000rpm离心2min；
(7)将上一步的滤液转入到新的离心管中，加入1.5倍体积的AW1缓冲液，用枪头充分混匀；
(8)将上一步的混合溶液转移至DNeasyMinispincolumn中，每次转移700μL，多出的体系分多次转移，将DNeasyMinispincolumn置于离心机中8000rpm离心1min，离心完成后弃滤液；
(9)将上一步的DNeasyMinispincolumn转移至新的2mL离心管中，加入500μLAW2缓冲液，14000rpm离心1min，弃滤液；
(10)重复步骤8；
(11)将上一步得到的DNeasyMinispincolumn放入新的离心管中，14000rpm离心2min，彻底除去滤膜上的AW2缓冲液，并彻底晾干滤膜；
(12)将50μL无菌去离子水点在滤膜上，充分溶解基因组DNA样品10min，8000rpm离心1min收集滤液。通过紫外分光光度法测定所得基因组DNA的浓度和纯度，将基因组DNA稀释至50ng/μL待用。
1.3数字PCR扩增反应
(1)将蓝色保护膜从PCR芯片上取下，将controllinefluid注入芯片上、下两侧的孔中，置于IFCcontrollerMX中，执行Prime(167×)操作。
(2)数字PCR加样孔中的每个反应体系为4μL，包括基因组DNA1μl，225nM外源基因正、反向引物各0.04μl，225nM内参基因正、反向引物各0.04μl，50nM外源基因探针0.02μl，50nM内参基因探针0.02μl，2×MasterMix(购自Fluidigm公司)2μl，20×LoadingReagent(购自Fluidigm公司)0.4μl，ddH2O补足至4μl。阴性对照孔中以无菌去离子水代替模板。上述引物和探针来自实施例1的引物和探针组合。
(3)将上述体系加入芯片的加样孔中，并在结合孔中加入10μL1×GESampleLoadingReagent，加样过程中不能产生气泡。
(4)上样完成后，将芯片放回Controller中执行Load(167×)操作。Load完毕后除去芯片上的灰尘。
(5)将芯片放入BiomarkHDSystem中，采用FAM-MGB单荧光通道，设置如下反应程序：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。
(6)出现明显区别于阴性反应孔的扩增信号，将该反应孔记为阳性扩增孔；阳性样品的判定方法为：在同一组的三个平行组内，至少出现一个组为阳性扩增孔，则表明检测基因组中含有转基因作物成分。数字PCR扩增曲线图和热点图如图1B所示。
1.4数据分析
数字PCR扩增完成后，所有样品扩增产生的荧光信号被BiomarkHDSystem系统采集。经过系统自动分析，所有Ct值位于25-45之间的反应孔被认为是阳性扩增孔。
通过泊松分布公式计算外源基因与内参基因的实际拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的绝对浓度。
N(内参基因)＝-ln[(N0-X)/N0]×N0
N'(外源基因)＝-ln[(N0-Y)/N0]×N0
上述公式中，N和N'分别为内参基因及外源基因的实际拷贝数，N0为总反应孔数，X与Y分别为内参基因与外源基因的阳性扩增孔数。
转基因成分的绝对浓度＝N'/N×100％
1.5数字PCR扩增结果
由于双重PCR有可能产生引物之间的抑制并导致扩增效率不稳定，因此本实施例首先进行了3272转化事件外源基因引物探针(SeqIDNo.1-3)与不同内参基因引物探针的组合扩增效果。不同的引物探针组合见表1。
扩增结果如图1所示，由图1可以看出，3272外源转化事件引物探针与内参基因adh1-135(即adh1-135bp)引物探针组合效果最佳。
本实施例通过用非转基因玉米与3272品系样品进行不同配比比混合来获取不同相对含量的转基因样品。通过本实验体系的检测，以理论转基因成分质量含量为横坐标，实际检测转基因拷贝数含量(即转基因成分的绝对浓度)为纵坐标建立标准曲线。该标准曲线的参数如表2所示。通过线性回归系数可以看出，本检测体系在0.5％-100％的转基因成分浓度之间存在良好的线性关系，该线性范围可以满足所有转基因成分检测的需要。
1.6双重数字PCR相比于单重数字PCR具有更好的稳定性
为了验证双重数字PCR检测相对于单重数字PCR检测的稳定性，本实施例分别进行了3272品系的单重数字PCR检测和双重数字PCR检测。其中，单重数字PCR检测中仅使用外源基因正、反向引物及探针)(SeqIDNo.1-3)。
检测结果如表3所示。由表3可以看出，相对于单重数字PCR检测而言，双重数字PCR检测体系具有更好的组内稳定性，可以更好的用于转基因成分的定量鉴定。
1.7本方法中定量检测限的确定
根据欧盟的相应规定，将定量方法的定量检测限定义为组内相对偏差(RSD)在25％以内的最低转基因成分浓度。检测结果如表4所示，当转基因成分质量含量在0.5％时，本检测体系可以将组内RSD值控制在25％以内，因此本方法的定量检测限为转基因成分含量0.5％。
1.8双重数字PCR反应体系特异性验证
本实施例中将特异性定义为不能在其他的转基因品系中检测出阳性荧光信号。选取常见的转基因玉米品系BT176、MON810、MIR604、MIR162、NK603、MON863为实验材料。采用双重数字PCR检测方法，验证本检测体系的特异性。检测结果图2所示。
1.9双重数字PCR反应体系灵敏度确定
本实施例中将检测体系的检测限定义为可以稳定检测出转基因成分的转基因含量组。本检测体系的检测结果见表4。对于转基因玉米品系3272而言，转基因成分质量含量为0.1％的实验组可以稳定产生阳性扩增信号，因此本检测体系的检测限为0.1％。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
表43272品系定量检测限的确定
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28.Lun,F.M.etal.MicrofluidicsdigitalPCRrevealsahigherthanexpectedfractionoffetalDNAinmaternalplasma.ClinChem,54,1664-1672(2008).

Claims (8)

1.用于转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合为：
外源基因正向引物：5'-TCATCAGACCAGATTCTCTTTTATGG-3'
外源基因反向引物：5'-CGTTTCCCGCCTTCAGTTTA-3'
外源基因探针：5'-FAM-ACTGCTGACGCGGCCAAACACTG-BHQ1-3'
内参基因adh1-135正向引物：5'-CGTCGTTTCCCATCTCTTCCTCC-3'
内参基因adh1-135反向引物：5'-CCACTCCGAGACCCTCAGTC-3'
内参基因adh1-135探针：5'-VIC-AATCAGGGCTCATTTTCTCGCTCCTCA-BHQ1-3'。
2.含有权利要求1所述引物和探针组合的转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。
4.转基因玉米3272双重数字PCR荧光定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合，进行数字PCR扩增反应；
3)检测PCR扩增产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中数字PCR扩增反应的反应体系以4μl计为：基因组DNA1μl，225nM外源基因正、反向引物各0.04μl，225nM内参基因正、反向引物各0.04μl，50nM外源基因探针0.02μl，50nM内参基因探针0.02μl，2×MasterMix2μl，20×LoadingReagent0.4μl，ddH2O补足至4μl。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行数字PCR扩增反应的程序为：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在PCR芯片中进行数字PCR扩增反应。
8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物具体如下：在数字PCR扩增反应结束后，记录各反应孔中外源基因和内参基因的荧光信号值，通过泊松分布公式计算各反应孔中外源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的绝对浓度。
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