CN117467669A - 香蕉MaFLA27基因及其编码蛋白在植物抗旱中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了香蕉MaFLA27基因及其编码蛋白在植物抗旱中的应用。本发明从‘巴西蕉’中克隆得到了MaFLA27基因，其CDS长750bp，编码249个氨基酸。所述香蕉MaFLA27基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白MaFLA27的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明通过构建MaFLA27基因的超表达载体，并转化拟南芥，筛选获得稳定遗传的过表达MaFLA27的转基因拟南芥，结果发现过表达香蕉MaFLA27基因可以显著提高拟南芥植株的抗旱性，表明香蕉MaFLA27基因与植物抗旱性相关，为植物抗旱育种提供了重要的基因资源。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程及分子生物学技术领域，更具体地，涉及香蕉MaFLA27基因及其编码蛋白在植物抗旱中的应用。
背景技术
类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白(Fasciclin-like arabinogalactan proteins，FLAs)是糖基化程度最高、结构最为复杂的AGP家族的亚家族，其功能主要决定于多糖/糖基(Showalter et al.,2010；He et al.,2019)，含有结构和功能极其复杂的成束蛋白(Fascilin，FAS)结构域的AGPs，通常含有1-2个FAS结构域和1-2个类AGP糖基化区域，既可以和蛋白互作也可以和多糖互作(Johnson et al.,2011)。绝大多数FLA蛋白定位于质膜/细胞壁并拥有N-端信号肽，大部分FLAs还拥有C-端糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)信号肽(Ma et al.,2017；Meng et al.,2020)。由于结构与功能极其复杂及早期技术受限等原因，直到本世纪初才首次成功鉴定出植物的全FLA基因家族，目前已从拟南芥、水稻、小麦(Triticum aestivum)杨树(Populusdeltoides)、簸箕柳(Salix suchowensis)等近10种高等植物中鉴定出FLA家族，基因数量18-49个，物种间及同一植物不同FLAs之间结构差异大(Johnson et al.,2003；MacMillanet al.,2015；He et al.,2019；Meng et al.,2020；Zhang et al.,2023)。
近年来，植物FLA基因在生长发育过程中的功能已逐步得到认识。如拟南芥AtFLA11/12等基因参与纤维的发育，具有改变细胞壁组成成分、影响茎抗弯强度和刚度的功能(Seifert et al.,2014；MacMillan et al.,2015；Cagnola et al.,2018)。敲除杨树中PtFLA6基因导致茎硬度和木质部纤维素木质素的降低，以及参与细胞壁合成的基因的下调(Wang et al.,2015)。此外，FLAs在植物抗逆过程中的功能也有一定研究。例如，Shi等(2003)报道拟南芥盐超敏突变体sos5(AtFLA4突变体)对盐胁迫的敏感性比野生型高，表明AtFLA4基因具有耐盐功能；杨树(Populus trichocarpa)PtFLA6和拟南芥AtFLA11/12具有提高植物抵抗风雪等机械压力的功能(Wang et al.,2015；Ma et al.,2022)。还有研究表明FLAs的表达量在低温、干旱、盐胁迫及病毒等逆境条件下发生改变(翟丽娜等，2014；Zanget al.,2015；Takahashi et al.,2016；Cagnola et al.,2018)。例如，经芜菁花叶病毒(TuMV)，所有NbFLA基因均显著下调，可能在病原侵染过程中可能起到应答作用(Wu etal.,2020)。Miki等(2019)通过对冷驯化和脱驯化期间拟南芥叶片质膜部分进行蛋白质组学研究，成功地鉴定了873个响应冷驯化和脱驯化处理的膜蛋白，其中包括响应低温诱导的蛋白FLAs。然而，由于结构和功能均极为复杂，物种及基因间差异较大，相关研究起步较晚，迄今为止尚未见在香蕉中与植物抗旱功能相关的FLAs的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种香蕉MaFLA27基因及其编码蛋白在调控植物抗旱性中的应用。
本发明的第一个目的在于提供香蕉MaFLA27基因。
本发明的第二个目的在于提供所述香蕉MaFLA27基因的编码蛋白MaFLA27。
本发明的第三个目的在于提供含有所述香蕉MaFLA27基因的重组表达载体。
本发明的第四个目的在于提供含有所述重组表达载体的重组菌。
本发明的第五个目的在于提供所述香蕉MaFLA27基因或其编码蛋白MaFLA27或含有香蕉MaFLA27基因的重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组菌的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案得以实现的：
本发明首先从‘巴西蕉’中克隆得到了MaFLA27基因，其CDS长750bp，编码249个氨基酸。所述香蕉MaFLA27基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白MaFLA27的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供含有所述香蕉MaFLA27基因的重组表达载体。
进一步地，所述重组表达载体为CaMV35S::MaFLA27。
本发明还提供含有所述重组表达载体的重组菌。
进一步地，所述重组菌为大肠杆菌或农杆菌。
本发明进一通过构建MaFLA27基因的超表达载体，并转化拟南芥，筛选获得稳定遗传的过表达MaFLA27的转基因拟南芥，并进行干旱处理，结果发现过表达香蕉MaFLA27基因可以显著提高拟南芥植株的抗旱性。同时可扩展到其它不同的植物中，而不仅限于拟南芥。
因此，本发明还提供所述香蕉MaFLA27基因或其编码蛋白MaFLA27或含有香蕉MaFLA27基因的重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组菌在提高植物抗旱性中的应用。
本发明还提供所述香蕉MaFLA27基因或其编码蛋白MaFLA27或含有香蕉MaFLA27基因的重组表达载体或含有所述重组表达载体的重组菌在培育抗旱性提高的植物新品种的应用。
具体地，为构建MaFLA27基因的超表达载体并转化植物，筛选获得稳定遗传的过表达MaFLA27的转基因植株。
进一步地，所述MaFLA27基因的超表达载体为CaMV35S::MaFLA27。
进一步地，所述植物包括但不限于香蕉或拟南芥。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从‘巴西蕉’中克隆得到了MaFLA27基因，其CDS长750bp，编码249个氨基酸。所述香蕉MaFLA27基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白MaFLA27的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明进一通过构建MaFLA27基因的超表达载体，并转化拟南芥，筛选获得稳定遗传的过表达MaFLA27的转基因拟南芥，干旱处理后显示，过表达香蕉MaFLA27基因可以显著提高拟南芥植株的抗旱性，表明香蕉MaFLA27基因与植物抗旱性相关，为植物抗旱育种提供了重要的基因资源。
附图说明
图1为香蕉(Musa spp.)MaFLA27基因目的片段扩增及菌液PCR检测凝胶电泳图。其中，a：目的片段的PCR扩增；b：菌液PCR检测；泳道M：DL2000marker；泳道1为MaFLA27的PCR扩增目的条带；泳道2-7为MaFLA27菌液PCR条带。菌液PCR检测均使用载体上游引物和基因下游引物。
图2为香蕉(Musa spp.)FLA27基因CDS序列比对。注：A-genome为香蕉A基因组(Musa spp.AA cv.DH Pahang)；BX为‘巴西蕉’(Musa spp.AAA)；CDS编码序列；FLA类成束阿拉伯聚半乳糖蛋白。
图3为GFP空载与MaFLA27在洋葱(Allium cepa)表皮的亚细胞定位。其中，Brightfield：在明场下拍摄；GFP：GFP荧光；Merged：明场和荧光的融合照片，标尺为50μm。
图4为超表达MaFLA27植株与野生型植株干旱处理后表型。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1MaFLA27基因超表达载体构建
一、方法
1、MaFLA27基因目的片段的获得
利用同源重组原理，设计目的片段扩增引物，在引物5’端引入线性化载体末端15～20bp同源序列(引物序列见表1)，利用同源重组将目的片段连接到超表达载体CaMV35S::pCAMBIA3301。以香蕉根、假茎、叶的混合cDNA为模板，采用高保真酶KOD FX Kit进行PCR扩增反应，反应体系配置如下：
PCR扩增反应程序如下：
反应结束后，扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳，确认扩增的目的DNA片段。使用TIANgel Midi Purification Kit(天根，北京)回收纯化目的DNA片段，除去PCR反应液中残留的引物及盐。操作步骤如下：
(1)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。
(2)向胶块中加入等倍体积溶液PN(如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100μL，则加入100μL PN溶液)，50℃水浴放置，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(3)将上一步所得溶液加入到一个吸附柱CA2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(4)向吸附柱CA2中加入600μL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
(5)重复操作步骤4。
(6)将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
(7)将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。洗脱出的DNA于-20℃保存。
表1基因克隆所用引物列表
2、线性化载体
采用XbaⅠ和/>SmaⅠ对CaMV35S::pCAMBIA3301进行双酶切，酶切体系如下：
体系配制完成后，轻轻混匀后短暂离心，进行酶切，程序如下：37℃酶切1h，80℃失活20min。酶切完成后采用1％琼脂糖凝胶进行电泳检测，以未酶切完整质粒作为对照，未酶切完整质粒的迁移率要比酶切后线性化的质粒快。如果酶切完全，后续可直接进行连接。
3、重组载体连接与转化
使用Clone Express⑧IⅡOne Step Cloning Kit(Vazyme，Nanjing,China)进行连接，于冰上配制反应体系，各组分加样量不低于1μL。反应体系如下：
II重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03pmol；最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：
最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol)
最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol)
体系配制完成后，用移液器轻轻吸打混匀(请勿震荡或者涡旋混匀)，短暂离心将反应液收集至管底。置于37℃反应30min。立即置于冰上冷却5min。重组产物可于-20℃存放一周，待需要时解冻转化即可。
4、连接产物的转化与鉴定
(1)将上述10μL冷却反应液，加入100μL DH5α感受态细胞中，用手轻轻拨打离心管壁，混匀，放在冰上30min；
(2)42℃热激45s，立即置于冰上孵育2min；
(3)加入700μL无抗LB液体培养基，180rpm，37℃孵育60min；
(4)将步骤3的菌液5000rpm离心1min，去部分上清后重悬菌液，取100μL菌液在含有50μg/mL Kan的LB固体培养基上均匀涂布，28℃培养箱倒置培14-16h。
(5)挑取单菌落至50μL LB(50μg/mL Kan)液体培养基中，混匀，取2μL进行菌落PCR鉴定，用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
菌液PCR反应体系如下：
质粒提取与测序：将若干阳性单克隆菌液，送到广州擎科生物公司测序，确定正确的超表达重组载体。
二、结果
香蕉基因组网站获取的香蕉A基因组中MaFLA27基因CDS长750bp。本发明仅从‘巴西蕉’中成功获得符合预期长度的MaFLA27目的片段，目的片段的扩增结果见图1a。进一步将目的片段胶回收产物连接到植物表达载体CaMV35S::pCAMBIA3301上，重组转化大肠杆菌，挑取单菌落，使用载体上游引物和基因下游引物进行菌液PCR验证，MaFLA27阳性克隆PCR产物长度在1200bp左右，符合预期的交叉引物之间片段长度(同源引物扩增载体CaMV35S::pCAMBIA3301上游引物到插入位点片段长度与基因的CDS片段长度之和)的大小(图1b)。将阳性克隆菌液送至北京擎科新业生物公司测序，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将测序结果进行序列比对，序列比对结果见图2，显示‘巴西蕉’中MaFLA27的序列与香蕉A基因组公布的CDS序列有11个碱基的不同，比对率为98.53％，翻译为蛋白序列后有8个氨基酸的差异。
实施例2超表达MaFLA27转基因植株的获得
1、重组质粒载体转化农杆菌
采用冻融法将实施例1构建的CaMV35S::MaFLA27重组质粒转入农杆菌GV3101。方法如下：
(1)将农杆菌感受态置于冰上解冻，加入1μL质粒DNA，用手拨打管底混匀，依次于冰上静置5min、液氮中速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；
(2)加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养1-2h；
(3)5000rpm离心1min收菌，弃部分上清，留约100μL上清，轻轻吹打重悬菌体均匀涂布于LB平板(50μg/mL Kan、20μg/mL Rif)上，28℃培养箱倒置培养2-3d。
(4)挑取单菌落，接种于5mL LB液体培养基(50μg/mL Kan、20μg/mL Rif)中，28℃，200rpm过夜摇菌，进行PCR鉴定阳性克隆，保存菌液用于后续实验。
2、花粉管通道法侵染拟南芥
将已转入GV3101载体中的CaMV35S::MaFLA27采用花粉管通道法导入拟南芥，具体方法如下：
(1)吸取已鉴定过的阳性农杆菌菌液到含有抗生素的LB中(50μg/mL Kan+20μg/mLRif)，28℃，220rpm，过夜培养。
(2)吸取上述1mL菌液转接到50mL带有抗生素的LB液体培养基中(50μg/mL Kan+20μg/mL Rif)，28℃，220rpm，扩摇菌液至OD600＝0.8。
(3)菌液转入50mL离心管中，5000rpm，离心10min，弃上清。
(4)用配制好的侵染液(5％的蔗糖溶液+0.3μL/mL silwet L-77)重悬菌体沉淀，混匀。
(5)挑选开花良好的拟南芥植株，初次侵染需把已授粉的果荚剪掉。
(6)将拟南芥花序全部侵入配好的侵染液中，保持50s。
(7)避光培养24h后正常生长条件下培养。
(8)培养约一个月后，收获T0代种子。播种在按照营养土：蛭石：珍珠岩＝5:1:1混合的基质中。
3、转基因植株的筛选
(1)将收获的T0代种子，播种在按照营养土：蛭石：珍珠岩＝5:1:1混合的基质中。
(2)在拟南芥长出两片真叶时，喷洒1/1000的Basta，初步筛选具有载体抗性的阳性植株。根据T5 Direct PCR Kit(Plant)(Tsingke,Beijing,China)说明方法。用打孔器取1-2mm WT及T0代拟南芥植株叶片，加入50μL Lysis A裂解10min，95℃10min，冷却后加入50μL Dilution B，混匀，离心，取上清为模板。进行PCR检测，体系同实施例1步骤4PCR检测部分。检测成阳性结果的植株移栽至新的基质中至种子成熟。
(3)单株收取T1代种子，播种在基质中，喷洒除草剂Basta及PCR鉴定后，挑选比例为3:1的株系移栽到新的基质中至种子成熟。
(4)单株收取T2代种子，播种后鉴定挑选没有分离比的株系移栽到基质中至种子成熟。保留该株系种子，用于后续实验。
实施例3亚细胞定位分析
将MaFLA27基因CDS以HindⅢ和BamH I为酶切位点，构建到CaMV35S::pGreen-GFP载体上，构建方法同实施例2步骤1部分，农杆菌感受态使用GV3101(psoup)，转化方法同实施例2步骤2部分。使用洋葱表皮进行亚细胞定位实验，具体步骤如下：
(1)洋葱表皮细胞的预培养
提前买洋葱放入水中，待其生根后，剥去洋葱外面2层后，用70％乙醇冲洗2-3次，无菌水冲洗2-3次。无菌条件下，取洋葱的鳞茎，将其切成若干个1cm2的小块，用镊子剥取洋葱的内表皮细胞，平铺于1/2MS固体培养基上，28℃预培养24-48h。
(2)农杆菌侵染液制备
将构建好的农杆菌载体菌液按照1:50的比例于LB液体培养基(Kan+Rif)中28℃过夜扩摇后。4000rpm离心10min，弃上清液，再加入新鲜的1/2MS液体培养基(含有150μM的乙酰丁香酮AS)50mL重悬菌体。于28℃放置2h左右，备用。
(3)浸染与共培养
将预培养后的洋葱表皮放入农杆菌侵染液中，28℃，150rpm侵染30min，用无菌水漂洗，吸干洋葱表皮上的菌液后，平铺于含有150μM的乙酰丁香酮AS的1/2MS固体培养基中，28℃暗培养1-2d。
(4)转化结果的观察
将浸染并共培养后的洋葱表皮细胞无菌水清洗后，置于载玻片上，用滤纸用一段吸水，使洋葱表皮细胞发生质壁分离，在正置荧光显微镜(Axio Image D2，ZEISS，Germany)下观察MaFLAs-GFP融合蛋白的荧光信号，GFP荧光激发光波长为480nm，发射光波长为525nm。
ProtComp 9.0预测结果显示MaFLA27定位在细胞膜。而图3显示了在洋葱表皮超表达MaFLA27的结果，显示洋葱表皮细胞质壁分离之后，瞬时超表达pGreen-35S-GFP空载时，GFP荧光均匀分布在洋葱表皮的细胞壁、细胞膜、细胞质及细胞核中，无特异定位；瞬时超表达MaFLA27时，细胞壁、细胞膜和细胞核中均可以观察到荧光信号；表明MaFLA27蛋白定位在细胞壁、细胞膜和细胞核中。
实施例4转MaFLA27基因拟南芥干旱处理及MaFLA27基因的抗旱功能鉴定
1、方法
将野生型及转MaFLA27基因拟南芥在22℃的人工气候室中正常培养4周，光照强度为120μmoL·m-2·s-1，相对湿度：50％-70％，光周期为长日照，即16h光照，8h黑暗。选取长势一致的幼苗，将盆底架空，使培养基质逐渐失水，从而对幼苗造成干旱胁迫。20d后观察叶片的萎焉程度，恢复浇水10d后，观察复水后拟南芥植株的表型。
2、结果
处理结果如图4所示，干旱处理后，野生型植株叶片大部分干枯，超表达株系OE1的大部分叶片干枯，株系OE3和OE11的叶片失水萎蔫，仅部分叶片干枯。恢复供水10d后，野生型叶片几乎全部干枯，没有新叶长出；超表达株系OE1大部分叶片干枯，中心有细小的新叶长出，其他两个超表达株系几乎完全恢复正常生长。野生型植株比转基因拟南芥植株的表型受害更严重。以上结果表明，超表达MaFLA27显著提高了转基因植株的抗旱性，为植物抗旱育种提供了重要的基因资源。
Claims (9)
1.香蕉MaFLA27基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述MaFLA27基因的编码蛋白MaFLA27，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID No.2所示。
3.含有权利要求1所述香蕉MaFLA27基因的重组表达载体。
4.含有权利要求3所述重组表达载体的重组菌。
5.权利要求1所述基因、权利要求2所述编码蛋白、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组菌在提高植物抗旱性中的应用。
6.权利要求1所述基因、权利要求2所述编码蛋白、权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述重组菌在培育抗旱性提高的植物新品种的应用。
7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，构建MaFLA27基因的超表达载体并转化植物，筛选获得稳定遗传的过表达MaFLA27的转基因植株。
8.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述MaFLA27基因的超表达载体为CaMV35S::MaFLA27。
9.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述植物为香蕉或拟南芥。
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