KR100228326B1

KR100228326B1 - 토스포바이러스 rna를 암호화 하는 dna 서열을 포함하는 재조합 dna 구조체, 이 구조체로 형질전환된 식물 및 그 식물의 제조방법

Info

Publication number: KR100228326B1
Application number: KR1019900017762A
Authority: KR
Inventors: 윌리암 골드바흐 로버트; 피터스 디크; 야콥스 루저러스 기엘른 요하네스; 테오로루스 데 이 한 페트루스; 요하네스 쿨 아놀더스; 퀴리너스 죠셉 마리 반 그린스벤 마티너스
Original assignee: 왈터스 몰더스; 노바르티스 시즈 비.브이.
Priority date: 1989-11-03
Filing date: 1990-11-02
Publication date: 1999-12-01
Also published as: EP0426195A1; MY104590A; DE69033830D1; CA2029241A1; DK0426195T3; MA21994A1; HU906519D0; IE903962A1; JPH03228679A; AU646231B2; EP0426195B1; ES2165838T3; IL96203A; KR910009931A; AP166A; ATE207121T1; JP3278151B2; AP9000217A0; DE69033830T2; HUT57265A

Abstract

본 발명은 토스포바이러스의 RNA 서열이나 그것과 관련된 RNA 서열로 전사시키기 위한 DNA 코오딩을 함유한 재조합 DNA 구조물, 토스포바이러스 감염에의 감염 가능성이 감소된 식물로 형질 전환시키기 위한 DNA 구조물의 용도 및 식물 토스포바이러스 질병의 진단 또는 토스포바이러스 분리용 프로브에 관한 것이다.

Description

토스포바이러스 RNA를 암호화 하는 DNA 서열을 포함하는 제조합 DNA 구조체, 이 구조체로 형질전환된 식물 및 그 식물의 제조방법

제1도는 토마토 반점상 조고증 바이러스 구조 절단도이다.

제2도는 TSWV S RNA를 위해 이용된 클로닝 단계를 나타낸 도식이다.

제3도는 TSWV L RNA를 위해 이용 클로닝 단계를 나타낸 도식이다.

제4도는 TSWV S RNA의 서열 및 유전자 구성을 나타내고 있다.

제5도는 S RNA(제5(a)도)와 L RNA(제5(b)도)의 모든 판독 프레임에 대한 번역 개시 코돈 및 종결 코돈의 분포를 나타내며 완전한 막대는 정지 코돈을, 반쪽 막대는 ATG 개시 코돈을 의미한다.

제6도는 TSWV MRNA(제6(a)도)와 L RNA(제6(b)도)의 핵산 서열을 나타내고 있다.

제7도는 적당한 발현 벡터(pZU-A)의 형성에 대한 도식이다.

제8도는 적당한 발현 벡터(pZU-B)의 형성에 대한 도식이다.

제9도는 뉴클레오캡시드 N 단백질 유전자를 함유한 적당한 플라스미드(pTSWV-N)의 형성에 대한 도식이다.

제10도는 뉴클레오캡시드 NSs-단백질 유전자를 함유한 적당한 플라스미드(pTSWV-NSs)의 형성에 대한 도식이다.

제11도는 본 발명에 의한 DNA 구조체인, 식물 형질 전환 벡터 pTSWV-NAB 형성의 예를 나타낸 도식이다.

제12도는 본 발명에 의한 DNA 구조체인 식물 형질 전환 벡터 pTSWV-NmutBB 형성의 예를 나타낸 도식이다.

제13도는 본 발명에 의한 DNA 구조체인, 식물 형질 전환 벡터 pTSWV-NSsAB 형성의 예를 나타낸 도식이다.

제14도는 본 발명에 의한 DNA 구조체인, 식물 형질 전환 벡터 pTSWV-NSsmut BB 형성의 예를 나타낸 도식이다.

제15도는 TSWV S RNA의 “팬-조절” 부위를 나타내고 있다.

제16도는 TSWV S RNA의 헤어핀 구조 부위를 나타내고 있다.

제17도는 예상 식물의 도트 블롯 분석을 나타내고 있다.

본 발명은 토스포바이러스에 대한 감염 가능성을 경감시킨 식물, 이러한 내성을 유발하는데 사용되는 유전 물질, 분리 또는 진단용 프로브 및 상기 식물과 유전 물질 및 프로브의 수득 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 바이러스 감염은 식물의 성장, 형태 및 생산 등에 여러 종류의 유해한 영향을 미친다. 또한 감염된 식물은 다른 식물 병원체 및 해충에 공격 받기가 더 수월해진다. 일반적으로 식물 바이러스의 침투는 곤충이나 균류 전달체에 의해서, 또는 기계적으로 발생한다.

식물 육종 개량자들은 특정한 바이러스 균주에 대해 내성을 갖는 다양한 작물종을 개발하기 위해 끊임없이 노력하고 있다. 종래의 바이러스 내성 유전자는 육종에 의해 야생종으로부터 시판되고 있는 개량종으로 전이시킨다. 기존의 내성을 야생종의 유전자 푸울로부터 배양체로 전이시키는 것은 복잡한 방법으로서, 먼저 내성 유전자(들)은 제공원(공여체) 식물종에서 확인되어야만하며 시판 변종의 완전한 유전자 푸울과 혼합되어야만 한다. 이러한 방식으로 생성된 생성체는 대부분 하나 또는 수개의 바이러스종에 대해서만 활성을 갖는다. 또한 특정한 바이러스종에 대한 내성체가 증식하는 배양체는 작물종내에서 상기 내성체에 대한 유전자 제공원이 결여됨으로써 제한되기도 한다. 식물의 바이러스 질환 영향을 예방하거나 경감시키는 다른 시도는 바이러스 전달체에 대해 작용하는 다른 방법 또는 화학 물질을 사용하며, 그 예로는 살충제, 살균제 또는 우수한 식물 위생상 실시 조건이 있다. 그러나 전달체를 죽임으로써 바이러스 질환에 대항하는 화학 물질의 사용은 정부에 의해 점차 엄격하게 규제되고 있으며 허용되는 화학적 식물-보호제의 범위가 감소되고 있다.

또한, “교차-보호”시스템도 사용할 수 있다. “교차-보호”란 하나의 바이러스 균주로 식물을 감염하여 관련 바이러스 균주의 2차 고도감염에 대해 보호하는 현상을 말한다. 따라서 후자의 방법은 우선적으로 약독성, 바이러스 균주를 사용하여 식물에 감염시키고 동일한 독성 바이러스의 2차 감염을 억제하는 것이다. 그러나 이러한 자연적인 교차-보호시스템의 사용은 몇가지 단점이 있다. 이 방법은 모든 작물에 접종하는 것이 요구되기 때문에 매우 힘들며, 이전의 약독성 균주가 더 독성이 있는 균주로 변이되어 그것에 의해 질병이 야기되는 위험이 따른다. 또한 한식물종에는 약독성인 바이러스가 다른 식물종에는 독성으로 작용할 가능성이 있다.

바이러스를 보호하는 바이러스 피복 단백질이 교차-보호에 중요한 역할을 하며 내재 바이러스와 투여바이러스가 동일하거나 거의 유사한 피복 단백질 구조를 가질 경우 보호가 된다는 사실이 여러 연구로 밝혀졌다.

최근에 유전자 조작 및 식물의 형질 전환 시스템이 개발됨에 따라 바이러스 내성을 산출하는 새로운 방법이 나타났다. 유전공학적 교차 보호는 형태학상 자연적인 교차 보호와 유사하지만 유전자 조작 식물의 게놈으로부터 비루스 피복 단백질의 유전 정보를 발현시킴으로써 수득되는 바이러스 내성 형태이다. 처음으로 유전 공학적으로 바이러스 내성을 유발하는 실험이 비키, 등(1985) 및 아벨, 등에 의해 시행됐다. 이 실험에서 트랜스제닉 식물의 게놈으로부터 담배 반점병 바이러스 균주 U1(TMV-U1) 피복 단백질을 형질 발현함으로써 모든 TMV 균주로 감염된 이후 증상 전개가 지염됨을 밝혔다. 피복-단백질-매개의 보호에 대한 유사한 결과를 앨팔파 반점병 바이러스(AMV), 감자 바이러스 X(PVX) 및 오이 반점병 바이러스(CMV)에 대해서도 얻을 수 있다.

TMV, CMV, AMV 및 PVX 는 상이한 바이러스 그룹에 속하지만, 공통의 구조를 지닌다 : 상기 바이러스에 있어서, 바이러스 RNA는, 각각이지만 동일한 바이러스 피복 단백질로 구성된 바이러스 피복물에 의해 피낭화된 양성쇄 RNA이다.

토스포바이러스는 실질적으로 상기 식물 바이러스와 상이하다. 토스포바이러스의 속은 버니아비리데(Bunyaviridae)에 속한다. 모든 토스포바이러스는 삽주 벌레로 전달된다. 바이러스 입자는 구형(직경 80-120nm)이며 당단백질이 표면에 흩어져서 돌출된 지질외피로 둘러싸인 내부 뉴클레오캡시드를 포함한다. 많은 부분으로 나눠진 게놈은 음성 또는 양극성의 선형 단일쇄 RNA 분자로 구성된다. 상기 RNA 분자의 말단 뉴클레오티드는 다음과 같은 일치(consensus) 서열을 특징으로 한다 : 5'AGAGCAAUX‥‥‥GAUUGCUCU3'(X는 C 또는 U임). 대표적인 토스포바이러스로는 토마토 반점상 조고증 바이러스(TSWV)와 TSWV 아종으로 알려진 봉선화 살생 고리반점 바이러스(INRV)가 있다.

TSWV는 4가지의 상이한 구조 단백질을 포함한다 : 29kd의 내부 뉴클레오캡시드 단백질 N과 막 당단백질인 약 79kd의 G1과 약 58kd의 G2. 또한 약 260kd의 거대 단백질 L 소량이 바이러스 입자에서 발견되었다. TSWV의 게놈은 3개의 선형 단일쇄 RNA분자, 즉 ±2900nt(S RNA), ±5000nt(M RNA) 및 ±7500nt(L RNA)로 구성되며, 각각 뉴틀레오캡시드 단백질과 몇 개의 L 단백질과 강하게 결합되어 원형의 뉴클레오캡시드를 형성한다. TSWV 바이러스의 대부분 특징을 나타내는 구조를 제1도에 제시하였다. 다른 TSWV 특성 및 상기 특성을 근거로 TSWV는 토스포바이러스 그룹의 대표로 분류되었다. 또한 TSWV는 토스포바이러스의 기준형으로 간주된다. 부수적인 증거로서 M RNA 코오딩 유전자를 직, 간접적으로 G₁막 당단백질의 합성과 관련됨이 제시되었다(Verkleij and Peters, 1983). 다른 RNA 분자의 코오딩 특징 및 게놈 RNA의 극성은 본 발명 이전에는 알려지지 않았었다.

전술한 바와 같이, TSWV와 같은 토스포바이러스는 삽주벌레종에 의해 전달된다. TSWV의 벡터는 트리피데계에 속하며 담배 삽주벌레(프랭클리엘라푸스카(Hinds)), 웨스턴 플라우워 삽주벌레(F. occidentalis (Pergande)), 일반꽃 삽주벌레(F. schultzei(Trybom)), 칠리 삽주벌레(Scirtothrips dorsalis (Hood)), 삽주벌레 세토서스(Moulton), 오니온 삽주벌레(T. tabaci(Lindeman)), F. 인톤사 및 T.팔미가 포함된다. 이 바이러스는 유충기에서만 삽주벌레에 의해 수득된다. 유충이 번데기가 되기 이전에 바이러스를 전달하지만 성충은 더 일반적으로 바이러스를 전달한다. 성충은 그것의 생존 주기동안 감염성을 갖는다.

세계적으로 존재하는 TSWV의 분포도는 가장 널리 분포된 식물 바이러스 중 하나가 되도록 한다. 이 바이러스는 시계 전체에 걸쳐 온대, 아열대 및 열대기후권에 널리 존재하며, 50가지 식물계를 대표하는 적어도 370종(단자엽 및 쌍자엽 식물)이 자연적으로 감염된다. TSWV는 곡류 및 온실 작물의 생산에 심각하게 영향을 미친다. TSWV 균주로 식물이 감염되면 일반적으로 발육장애, 고리반점, 암갈색 침몰반점, 줄기황변, 꽃절단, 치사 및 색소병변 및 변형, 황색의 비-치사반점, 녹색반점 또는 전체 식물의 죽음에 이르기까지 한다. 대부분의 숙주는 이러한 증상의 일부만을 나타낸다. TSWV에 의해 야기되는 광범위한 증상은 그 진단이 복잡하며 각 질병이 여러 가지 다른 명칭으로 불리운다. 또한 동일한 식물종의 TSWV 증상은 식물의 연령, 생존 주기중 감염 시간, 영양상태 및 환경조건, 특히 온도에 따라 결정된다.

TSWV는 수년 동안 공지되어 왔으며, 널리 분포하고 곡류 및 온실 작물에 있어서 경제적으로 중요한 질환을 일으킴에도 불구하고 TSWV 내성 유전자에 대한 제공원을 확인하기 위해 제한된 진전이 이루어졌다. 변이유발원 TSWV 내성은 리코페리슨 페루비아넘에서 확인되었으나 이 내성은 배양토마토에는 전달되지 않으며 다른 곡류에 대하여 내성 제공원으로 확인되지는 않았다. TSWV 균주에 의한 손상을 방지하기 위해 자연적인 교차-보호 시스템을 사용하는 것은 잘 공지되지 않았으며, 제한적인 양성 반응이 토마토와 상치에 대해서 보고되어 왔다.

따라서 유전자 조작으로 식물유전자 푸울(pool)에 토스포바이러스 감염에 대한 내성을 제공하는 유전 정보를 도입하는 것은 육종자와 생산자에게 토스포바이러스 질환을 예방하는 새로운 방법을 제공한다.

본 발명의 하기 a), b) 및 c)로의 전사를 암호하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 구조체를 제공하며, DNA는 식물의 프로모터 발현 조절 하에 작용하며 터미네이터 기능도 갖는다 :

a) 토스포바이러스의 RNA 서열 또는 그와 상동한 RNA 서열 ;

b) 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물(즉, 동일한 아미노산이나 종결 시그날에 상용하는 코돈)로 치환된 토스포바이러스 단백질 또는 그 일부를 암호하는 a)의 RNA 서열, 또는 그와 상동한 RNA 서열, 또는

c) a) 또는 b)에 의한 RNA 서열과 상보성이 있는 RNA 서열.

전술한 a), b) 및 c)에 규정된 DNA 서열은 편의상 이하에서는 “TSWV 관련 DNA 서열”로 정의한다. 본 발명에 의한 TSWV 관련 DNA 서열은, 필요하다면, 변이주로 변형시키거나 부위-특이적(site-directed) 변이유발 등 당업계에 공지된 방법을 사용하여 유도되는 TSWV 관련 DNA 서열과 상동한 서열로 변형시킬 수 있다. 상기 변이주 또는 변형된 코딩 서열은 본 발명의 정신 및 영역 내에 존재한다.

토스포바이러스의 RNA 서열은 S, M 또는 L RNA쇄의 서열을 말하며, 특히 S 또는 L RNA 서열, 바람직하게는 토스포바이러스의 S RNA 쇄의 서열을 말한다.

토스포바이러스의 RNA 서열과 상동한 RNA서열이란 많은 뉴클레오티드가 결실되거나 및/또는 부가되었지만 적당한 하이브리드화 조건 하에서 토스포바이러스의 RNA 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 하이브리드될 수 있는 토스포바이러스 RNA 서열을 말한다. 본 발명의 목적을 실행하기 위한 적당한 하이브리드화 조건은 42℃에서 16시간 동안 완충액(5×표준생리 식염수 시트레이트(SSC), 0.5% SDS, 5× 덴하르트 용액, 50% 포름아미드 및 100㎍/ml 운반 DNA(이하, 완충액으로 정의됨))중에 배양한 후, 매회 약 1시간 동안 1×SSC와 0.1% SDS를 함유한 완충액으로 65℃에서 3회 세척하는 것을 포함한다.

본 발명을 실시하기에 바람직한 하이브리드화 조건은 49℃에서 16시간 동안 완충액 중에서 배양하고 0.1×SSC와 0.1% SDS를 함유한 완충액으로 55℃에서 매회 약 1시간 동안 3회 세척한다. 가장 바람직하게는, 55℃에서 16시간 동안 완충액 중에서 배양하고 0.1×SSC와 0.1% SDS를 함유한 완충액으로 65℃에서 매회 약 1시간 동안 3회 세척한다.

TSWV 관련 DNA 서열의 길이는 진행되는 전략에 따라서 결정되며, 이하 자세히 설명하였다. 일반적으로, TSWV 관련 DNA 서열은 적어도 20, 적당하게는 50 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용하는 프로모터는 전사 개시 부위로부터 상부의 뉴클레오티드 서열을 말하며 mRNA의 리더(leader) 서열에 대한 코오딩 부위를 포함하여 전사에 요구되는 모든 조절 부위를 포함한다(리더 서열은 리보좀 결합 부위를 포함하며 AUG 개시 코돈에서 번역을 시작함).

본 발명의 DNA 구조체에 사용하기에 적당한 프로모터의 예는 바이러스, 균류, 박테리아, 동물 및 식물 유도된, 식물 세포에서 작용하는 프로모터를 포함한다. 이 프로모터는 지속적으로 또는 시차적으로 DNA를 발현할 수도 있다. 시차적으로 DNA 발현을 조절하는 프로모터의 예로 적당한 것은 질병 벡터(예, 삽주벌레)의 의해 유도될 수 있는 프로모터이며 예컨대, 상처 유도성 프로모터이다. 사용 프로모터는 형질 전환 식물의 토스포바이러스 감염도를 경감시키는데 필요한 RNA 양을 생성하는데 충분한 속도로 TSWV 관련 DNA 서열을 발현시킬 수 있어야 한다. 전사되어야 할 RNA 양은 관련된 식물의 종류에 따라 변한다. 특히 바람직한 프로모터는 꽃양배추 반점 바이러스 35S(CaMV 35S) 프로모터, 그것의 유도체, 및 상처가 난 후 질병 벡터(예, 삽주벌레)에 의해 유도되는 프로모터(예, 상처 유도 프로모터)이다.

본 명세서에서 사용되는 터미네이터는 전사의 종결을 신호하는 전사 단위의 말단에 있는 DNA 서열을 의미한다. 터미네이터는 폴리아데닐화 시그날을 포함하며, 1차 전사체의 3'-말단에 폴리아데닐화 서열의 첨가를 야기하는 DNA 3'-비번역 서열이다. 식물 세포에 있어서 활성인 터미네이터는 공지되었으며 문헌에도 기재되어 있다. 이것은 예컨대, 박테리아, 균류, 바이러스, 동물 및 식물에서 분리된다. 특히 본 발명의 DNA 구조체에 사용하기에 적당한 터미네이터의 예는 A. 튜메파시엔스의 노팔린 신타제(systhase) 터미네이터, CaMV의 35S 터미네이터 및 지아 메이스(Zea mays)의 제인 터미네이터를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어에 따르면, RNA 서열은 그것이 적당한 하이브리드화 조건(전술한 바와 같음)하에서 염기쌍 법칙에 의하여 다른 RNA와 수소 결합 복합체를 형성할 수 있다면 그 다른 RNA 서열에 상보적이다.

본 발명은 또한 본 DNA 구조체를 식물에 도입할 수 있는 벡터를 제공하며 상기 벡터를 생성하는 방법도 제공한다.

벡터란 DNA 단편이 숙주 유기체 내에 통합될 수 있도록 하는 운반체를 의미한다.

식물이란 광범위한 의미로 쓰이며, 원형질, 식물세포, 종자, 묘목등 미분화의 식물 원료뿐만 아니라 분화된 식물을 의미하며, 이것은 적당한 조건하에서 성장 식물, 그것의 자손 및 절단체와 과일 등 그것의 일부로 성장할 수 있다.

또한 본 발명은 본 발명의 DNA 구조체를 게놈내에 포함하는 식물 및 상기 식물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 식물들은 토스포바이러스에 의해 유도되는 질병에 걸릴 가능성이 경감하며 전술한 이전의 방법에 의해 수득되는 식물의 제한 및 단점을 갖지 않는다.

TSWV와 같은 토스포바이러스에 걸리기 쉬운 식물의 예는, 제한되지는 않지만, 아거라텀, 알팔파, 비름과, 안티이리넘, 아퀼레지아, 오우베르긴, 연근, 베고니아, 광엽콩, 브로콜리, 브루셀 스프라우트, 양배추, 꽃양배추, 셀러리, 치커리, 크리산테멈, 시너라리아, 클로버, 코스모스, 광저기, 오이, 시클라멘, 디알리아, 다투라, 델 피니엄, 꽃상치, 메론, 메셈브리안테멈, 양파, 파파야, 완두, 땅꽁, 후추, 페투니아, 파인애플, 감자, 앵초속, 세인트폴리아, 잇꽃, 샐피글로시스, 스냅콩, 대두, 시금치 호박, 사탕무우, 해바라기, 타켓츠, 담배, 토마토, 베어베나, 빈카, 물메론, 지니아가 포함된다. 본 발명은 특히 본 발명의 DNA 구조체를 게놈에 포함한 상기 식물에 관한 것이다.

TSWV는 토스포바이러스의 기준형이기 때문에, 토스포바이러스의 구체적인 특징을 TSWV를 예로서 사용하여 이하에 설명하였다.

S, M 및 L RNA는 단일쇄의 RNA 분자이다. S RNA는 약 2,900 뉴클레오티드 길이이며 2개의 유전자를 포함하는데, 하나는 바이러스 방향(viral sense)으로 비구조 단백질(NSs)를 코오딩하며, 다른 하나는 바이러스 상보성 방향으로 뉴클레오캡시드 단백질(N)을 코오딩한다.

NSs- 및 N-유전자 사이의 부위는 헤어핀 구조로 겹쳐진다. S RNA의 5' 및 3'-말단 서열은 서로 하이브리드되어 첫 번째 뉴클레오티드가 상기 S RNA 쇄의 마지막 뉴클레오티드에 반대( 및 상보적)가 되도록 할 수 있다. 두 RNA 말단을 하이브리드 함으로써 수득한 이중-가닥 구조를 이하에서는 편의상 “팬-조절”(pan-handle)이라 칭한다.

M RNA 쇄는 약 5000 뉴클레오티드를 갖는다. 이것은 바이러스에 상보성 방향으로 하나의 긴 오픈 리딩 프레임을 포함하며, 이는 소포체 상에 위치한 폴리좀에서 번역되며 초기 폴리펩타이드 쇄는 번역과 함께 절단되어 스파이크 단백질 G₁과 G₂를 각각 형성한다. S RNA와 유사하게 M RNA 쇄의 말단은 서로 상보적이며 유사하게 하이브리드 되어 “팬-조절”을 형성한다.

L RNA 쇄는 약 7500 뉴클레오티드 가지며 바이러스 상보성 방향의 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 이 오픈 리딩 프레임은 예상 분자량이 약 260kd인 바이러스 전사 효소를 코오딩하는 유전자에 해당될 가능성이 가장 크다. 일부 변이주에서는 야생형인 완전한 길이의 L RNA 뿐만 아니라 짧아진 L RNA 분자도 발견되었다. 그러한 짧아진 L RNA는 특징적인 말단의 뉴클레오티드 서열을 언제나 포함하며 따라서 “팬-조절”구조를 형성할 수 있다. 또한 이것은 뉴클레오캡시드 단백질로 피낭화되며 바이러스 입자에 포함된다. 이것의 존재는 증상의 전개를 억제하여 심각한 유해 작용을 경감시킨다. 따라서, 짧아진 L RNA 분자는 결합 간섭(DI) RNAs로 간주되며, 이 용어는 본 기술에 숙련된 자들에게 공지되어 있다.

본 발명의 바람직한 구체적 예는 “팬-조절”의 토스포바이러스-RNA 서열이나 그것과 상동한 토스포바이러스-RNA로의 전사를 암호하는 본 발명의 DNA 구조체에 관한 것이다.

또 다른 예는 바이러스 상보성 방향의(즉, 음성 극성을 지님) 오픈 리딩 프레임의 토스포바이러스-RNA 서열이나 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물로 대체된 상응하는 RNA 서열, 또는 그것과 상동한 RNA 서열로의 전사를 암호하는 본 발명의 DNA 구조체에 관한 것이다.

또 다른 바람직한 예는 헤어핀 구조의 토스포바이러스-RNA 서열이나 그것과 상동한 RNA 서열로의 전사를 암호하는 본 발명의 DNA 구조체에 관한 것이다.

바람직하게는 전술한 토스포바이러스-RNA 서열은 적어도 20개, 더 바람직하게는 적어도 50개의 뉴클레오티드를 갖는다.

본 발명에 사용하기에 적당한 DNA 구조체의 예는 하기 i) 내지 xxix)로의 전사를 암호하는 TSWV 관련 DNA 서열(참고, S RNA 뉴클레오티드 서열 : 제4도, M RNA 뉴클레오티드 서열 : 제6(a)도, 및 L RNA 뉴클레오티드 서열 : 제6(b)도)을 포함한다 :

ⅰ) 뉴클레오티드 서열 1 내지 2915의 S RNA ;

ⅱ) 뉴클레오티드 서열 89 내지 1483의 S RNA ;

ⅲ) S RNA 헤어핀 ;

ⅳ) S RNA “팬-조절” ;

ⅴ) 뉴클레오티드 서열 2763 내지 1987의 S RNA ;

ⅵ) 뉴클레오티드 서열 4462 내지 1의 L RNA ;

ⅶ) 뉴클레오티드 서열 41 내지 2 의 L RNA ;

ⅷ) 뉴클레오티드 서열 3980 내지 46의 L RNA ;

ⅸ) 뉴클레오티드 서열(6706 + n) 내지 (4462 + n)의 L RNA ; n은 제6(b)도에 제시한 바대로 뉴클레오티드 4462(U)와 그 이후에 확인된 뉴클레오티드(C)사이의 갭에 있는 뉴클레오티드 수이다.

x) 뉴클레오티드 서열(6706 + n) 내지 (6016 + n)의 L RNA ; n은 전술한 바와 같음.

xi) L RNA “팬-조절”;

xii) 뉴클레오티드 서열 1987 내지 2763의 S RNA에 상보적인 RNA 서열 ;

xiii) 뉴클레오티드 서열 89 내지 1483의 S RNA에 상보적인 RNA 서열 ;

xiv) 뉴클레오티드 서열 1 내지 4462의 L RNA에 상보적인 RNA 서열 ;

xv) 뉴클레오티드 서열 2 내지 41의 L RNA에 상보적인 RNA 서열 ;

xvi) 뉴클레오티드 서열 46 내지 3980의 L RNA에 상보적인 RNA 서열 ;

xvii) 뉴클레오티드 서열 (4462 + n) 내지 (6706 + n)의 L RNA에 상보적인 RNA 서열 ;

n은 전술한 바와 같음.

xviii) 뉴클레오티드 서열(6016 + n) 내지 (6706 + n)의 L RNA에 상보적인 RNA 서열 ;

n은 전술한 바와 같음.

xix) 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물에 의해 대체된 뉴클레오티드 서열 89 내지 1483의 S RNA ;

xx) 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물에 의해 대체된 뉴클레오티드 서열 2763 내지 1987의 S RNA ;

xxi) 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물에 의해 대체된 뉴클레오티드 서열 3980 내지 236의 L RNA ;

xxii) 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물에 의해 대체된 뉴클레오티드 서열 4462 내지 236의 L RNA ;

xxiii) 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물에 의해 대체된 뉴클레오티드 서열 (6672 + n) 내지 (4462 + n)의 L RNA ;

xxiv) 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물에 의해 대체된 뉴클레오티드 서열 (6706 + n) 내지 (6016 + n)의 L RNA ;

xxv) 뉴클레오티드 서열(m-574) 내지 m의 M RNA ; m은 M RNA의 총 뉴클레오티드 수를 의미함.

xxvi) 뉴클레오티드 서열(m-574) 내지 m의 M RNA에 상보적인 RNA 서열 ;

m은 전술한 바와 같음.

xxvii) 전술한 I) 내지 xviii), xxv) 또는 xxvi)하에 정의된 뉴클레오티드 서열과 상동한 RNA 서열 ;

xxviii) 하나 이상의 코돈이 그것의 동의물에 의해 대체된 뉴클레오티드 서열(m-26) 내지 (m-574)의 M RNA ;

xxix) 전술한 i) 내지 xxviii)하에 정의된 서열의 단편.

바람직한 TSWV 관련 DNA 서열은 전술한 ii), iii), iv), v), viii), ix) 또는 xi)에 따른 RNA 서열이나 그것과 상동한 RNA 서열, 또는 적어도 20개, 더 바람직하게는 최소한 50개 뉴클레오티드를 포함한 그것의 단편물로의 전사를 암호한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체적인 예에 의하면 본 발명의 DNA 구조체는 각각 바이러스 S, M 또는 L RNA 더 바람직하게는 S 또는 L RNA, 특히 S RNA의 5' 및 3' 말단 서열의 배합물로의 전사를 암호하는 TSWV 관련 DNA 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 TSWV와 같은 토스포바이러스로 감염된 것으로 예상되는 식물을 진단하기 위한 프로브를 제공한다. 상기 프로브는 TSWV와 같은 토스포바이러스의 RNA 서열에 상보적인 표지된 올리고뉴클레오티드(RNA 또는 DNA) 서열을 포함한다. ('상보적'의 정의는 전술한 내용을 참고할 것). 프로브를 사용한 적당한 진단 방법 및 바람직한 서열의 길이는 당업계에 공지되어 있다. 적당한 프로브는 TSWV와 같은 토스포바이러스의 RNA 서열에 상보적인 적어도 15개, 바람직하게는 30개 이상, 더 바람직하게는 400 내지 600 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것이 용이하다.

본 발명의 프로브는, 질병의 증상이 완전히 나타나기 전에, 진단을 위해 감염된 식물에서 토스포바이러스 RNA 또는 그들의 일부를 확인할 수 있다는 점에서 유용하다.

또한 본 발명은 식물에 있어서 도트-블롯형 분석에서 본 발명의 프로브를 사용하여 토스포바이러스 복제형을 검출하는 것을 포함한, 토스포바이러스 감염을 결정하는 진단법을 제공한다.

당 기술 분야에 숙련된 자들은, 본 발명의 프로브를 사용하여 토스포바이러스의 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열을 포함한 키메릭(Chimeric) 유전자를 형성하고 사용할 수 있다.

본 발명의 DNA 구조체는 적당한 발현 벡터내에 TSWV 관련 DNA 서열을 삽입함으로써 수득할 수 있으며, 이것은 식물에서의 프로모터 작용의 발현 조절하에 도입되며 터미네이터에 의해 전사가 종결된다.

본 명세서에서 사용되는 적당한 발현 벡터는 식물 세포에서 작용하는 프로모터와 터미네이터를 함유한 벡터를 의미한다.

적당한 발현 벡터에 TSWV 관련 DNA를 삽입하는 것은 공지된 방법으로 시행할 수 있다. 적당한 방법은 이하 실시예를 통해 설명하고 있다.

마찬가지로, 적당한 발현 벡터의 형성은 이하 공지된 방법으로 시행된다.

본 발명에 따른 식물은 하기 a) 내지 c)에 의해 수득된다.

a) 본발명의 DNA구조체를 식물 세포의 게놈에 삽입하고 ;

b) 형질 전환 세포를 수득하며 ; 및

c) 형질 전환된 세포로부터 유전적으로 형질 전환된 식물을 재생시킨다.

본 발명의 DNA 벡터는 TSWV 감염이 되기 쉬운 식물의 게놈에 삽입할 수 있다. 상기 식물 형질 전환은 식물의 형질 전환 방법으로 공지된 기법을 사용하여 수행하며, 식물 형질 전환법의 예로는 아그로박테리움 투메파시엔스, 에이, 리조겐즈에서 유도된 Ti 플라스미드 또는 그것의 변형물에 관련된 식물 형질 전환기법, 분리된 식물 세포 또는 조직화된 식물 구조의 DNA 형질 전환 또는 일렉트로포레이션, DNA 전달을 위한 마이크로-투사체의 사용, 형질 전환 벡터로서 레이저 시스템, 리포좀, 또는 바이러스나 화분의 이용 등과 같은 공지된 방법이 있다.

본 발명의 식물은 노던(Nothern) 분석법, 써던(Southern) 분석법, PCR 법 및/또는 면역학적 방법 등 공지된 방법으로 TSWV 관련 DNA 서열의 발현을 모니터 한다. 본 발명의 식물은 질병의 증상이 접종한 TSWV 농도와 비례하는 범위의 농도로 TSWV에 노출시키는 실험으로 TSWV 감염 가능성이 감소되는 것을 입증하였다.

TSWV 접종에 적당한 방법은 공지되었으며 특히 적당한 전달체를 사용하는 기계적 접종을 포함한다.

본 발명의 식물은 또한 본 발명의 방법으로 수득한 식물을 다른 식물과 교차시킴으로써 본 발명의 DNA 구조체를 게놈에 갖는 식물을 생산할 수 있다.

본 발명의 이하의 비-제한적인 실시예와 첨부한 도면으로 설명하고 있다. 제4도에서, 상응하는 RNA 뉴클레오티드 서열 아래에 비구조 단백질 NSs(89-1483)의 아미노산 서열, 뉴클레오캡시드 단백질 N(2763-1987)의 아미노산 서열을 나타내고 있다.

S RNA 또는 그것과 상동한 RNA 서열의 헤어핀 구조 서열로의 전사를 암호하는 바람직한 TSWV 관련 DNA 서열의 적당한 예는 S RNA의 1583-1708 뉴클레오티드 서열, 1709-1835 뉴클레오티드 서열, S RNA의 1583-1835 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 상동한 서열을 암호하는 서열이다.

S RNA 또는 그것과 상동한 RNA 서열의 “팬-조절”부위의 서열로의 전사를 암호하는 바람직한 TSWV 관련 DNA 서열의 예는 S RNA의 1-70 및 2850-2916 뉴클레오티드 서열 또는 그것과 상동한 서열을 암호하는 서열의 배합물이다.

L RNA 또는 그것과 상동한 RNA 서열의 “팬-조절”부위로의 전사를 암호하는 TSWV 관련 DNA 서열의 적당한 예는 바이러스 L RNA의 5'-말단으로부터 첫 번째 80개, 특히 65개 뉴클레오티드 및 3'말단으로부터 마지막 80개, 특히 65개 뉴클레오티드 또는 그것과 상동한 서열 또는 그들의 유도체를 암호하는 배합물이다.

본 발명의 다른 목적, 구성 효과는 이하 실시예로 명백해질 것이다.

참고문헌은 첫 번째 저자의 이름으로 약칭했으며, 완전한 참고문헌은 후에 기재하였다.

[재료 및 방법]

본 명세서에서 제시된 모든 TSWV RNA 관련 서열은 통일성을 위해 DNA 서열로 기재된다. 당업자는 이것이 편의를 위한 것임을 이해할 것이다.

식물 형질전환 연구에서 사용되는 니코티아나 타바콤 및 페투니아 하이브리다의 배양체를 일반온실 조건하에 키운다. 무균의 식물 재료를 적당한 식물 호르몬과 당 농축물을 함유한 표준 MS 배지(무라시기 및 스쿡, 1962)에서 증식시킨다.

이.콜리 박테리아 표준 LB-배지중에서 37℃의 회전 진탕기상에서 증식시킨다. 아그로박테리움 투메파시엔스를 0.1% 글루코즈가 보충된 MinA 배지에서 28℃에서 증식시킨다(오우스벨등., 1987).

모든 클로닝 방법에 있어서, 이.콜리 균주 JM83(F, △(lac-pro), ara, rpsL, ø 80, dlac ZM 15)를 재조합 플라스미드에 대한 수용체로 사용한다.

양쪽성 벡터는 플라스미드 pRK2013을 함유한(피가스키 및 헬링스키, 1979) 이.콜리 HB101을 헬퍼(halper) 균주로 사용하여 표준 3중 부모계 교배로, Ti-플라미드 vir 부위를 함유한 균주인 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 LBA 4404, (호크마, 등., 1983)에 접합된다. 적당한 아그로벡테리움 투메파시엔스 수용체는 리팜피신(50㎍/ml)과 가나마이신(50㎍/ml)을 함유한 배지상에서 선별된다.

벡터 pUC19(야니쉬-페론등., 1985), p블루스크립트(스트레트 유전자), pBIN19(베반등., 1984) 또는 유도체에의 단편의 클로닝, DNA 의 제한효소 분석, 이.콜리 수용체 균주 형질전환, 대량 및 소량의 플라스미드 DNA의 분리, 닉-트랜슬레이션, 시험관내 전사, DNA 서열 결정, 써던 블롯팅 및 DNA 겔 전기영동을 표준 방법에 따라 시행했다(메니아티스, 등.., 1982 ; 오스벨 등., 1987).

[실시예 1]

[TSWV 입자와 그것의 유전 물질의 분리]

토마토에서 분리한 브라질리안인 토마토 반점상 조고증 바이러스균주 CPNH1를 접목시켜서 토마토에서 유지시킨다. 타스, 등(1977)에 의해 기술된 바와 같이 기계적으로 접촉한 후, 전체적으로 감염된 니코티아나 러스티가 잎으로부터 바이러스를 정제한다. 이 분리 과정에 사용된 모든 물질은 4℃로 유지하는 것이 필수적이다. 접종 12일후에 100g의 감염된 잎을 모아서 웨어링 혼합기내의 5부피 추출 완충액(0.1M NaH₂PO₄, 0.01 M Na₂SO₃pH 7)중에서 저속으로 5-10초간 간다. 치즈 클로스(cheesecloth)로 현탁액을 여과하고 여과물을 10분동안 16,000×g로 원심분리한다. 얻어진 펠렛을 3부피의 재현탁 완충액(0.01M NaH₂PO₄, 0.01 M Na₂SO₃, pH 7)중에 재현탁한다. 4℃에서 서서히 교반하면서 펠렛을 녹이고, 10분동안 12,500×g로 원심분리한 후 펠렛을 버리고 상충액을 20분 동안 50,000×g로 다시 원심분리 한다. 펠렛을 0.2부피의 재현탁 완충액(0.01M NaH₂PO₄, 0.01 M Na₂SO₃, pH 7)중에 재현탁시키고 30분동안 얼음상에 정치한다. 비-감염된 니코티아나 러스티카의 물질에 대해 토끼에서 생성된 항혈청을 용액에 첨가하고 1시간동안 서서히 교반하고 10분동안 16,000×g에서 원심분리하여 비-바이러스성 복합체를 펠릿화하였다. 맑은 상층액을 재현탁완충액(0.01M NaH₂PO₄, 0.01 M Na₂SO₃, pH 7)중의 선형 5-40% 슈크로즈 크레디언트에 가하고 45분동안 95,000×g로 회전시키고, TSWV 바이러스를 함유한 젖빛 밴드를 주사기로 조심스럽게 수거하고 재현탁 완충액으로 4번 희석하였다. 세척한 바이러스를 1.5시간동안 21,000×g로 원심분리하여 펠렛화하고 1부피의 재현탁 완충액에 재현탁시킨다. 일반적으로 100g의 잎이 약 0.5mg의 TSWV 바이러스를 산출한다. TSWV RNA를 SDS-페놀 추출이후 에탄올 침전을 함으로써 정제 바이러스로부터 바람직하게 회수한다. 1mg TSWV로부터 1-5㎍의 RNA가 추출된다. 분리한 RNA 분자의 완전한 정도를 아가로즈겔상에서 전기영동하여 분석했다. 3가지 상이한 RNA 분자는 대략 2900 뉴클레오티드(S RNA), 5000 뉴클레오티드(M RNA) 및 7500 뉴클레오티드(L RNA)로 각각 확인된다.

[실시예 2]

[TSWV 바이러스 RNA의 3'말단서열 결정]

직접 RNA를 서열분석하기 위해 베르클리, 등(1983)에 의한 방법으로 TSWV RNA를 정제된 뉴클레오캡시드로부터 추출한다. 접종 12일 후 100g의 감염된 잎을 수집하고 웨어링 혼합기내 4부피의 TAS-E 완충액(0.01M EDTA, 0.01M Na₂SO₃, 0.1% 시스테인, 0.1M Tris, pH 8.0)중에서 저속으로 5-10초간 간다. 이 현탁액을 치즈 클로스로 여과하고, 1,1000×g로 10분간 원심분리했다. 뉴클레오캡시드를 66,000×g 30분간 원심분리함으로써 상층액으로부터 회수한다. 펠렛을 1부피의 TAS-R 완충액(1% 노니데트 NP-40, 0.01M EDTA, 0.01M Na₂SO₃, 0.1% 시스테인, 0.01M 글리신, 0.01M TRIS, pH 7.9)중에 조심스럽게 교반함으로써 용해시킨다. 16,000×g로 10분간 원심분리하면 상충액이 맑아진다. 1시간동안 105,000×g로 30% 슈크로스 큐숀을 거쳐 침강시킴으로써 투명한 상층액으로부터 미정제 뉴클레오캡시드를 수거한다. 뉴클레오캡시드 펠렛을 400㎕의 0.01M Na-시트레이트(pH 6.5)에 재현탁시키고, 20-40% 슈크로즈(0.01M Na-시트레이트, pH 6.5중)에 층을 형성하고 2시간동안 280,000×g로 회전시킨다. 3개의 상이한 젖빛 밴드(각각, L, M 및 S 뉴클레이캡시드)를 분리수거한다. TSWV RNA를 SDS-페놀추출이후 에탄올 침전으로 정제 뉴클레오캡시드로부터 우선적으로 회수한다. 일반적으로 100㎕의 RNA는 100g의 감염된 잎으로부터 수득된다. 각 TSWV RNA의 3'-말단을 RNA 리가제와 5'-[³²P]pCp를 사용하여 표지화한다. 상기의 말단-표지 RNA 분자를 낮은 겔화 온도의 아가로즈겔상에서 분리한다(웰스랜더, 1979), 클럭-반 하스터와 비솝(1980) 및 클럭-반 하스터 등(1982)에 의해 기술된 효소법을 사용하여 S 및 M RNA 둘다의 3'- 및 5'말단의 30 말단 뉴클레오티드를 결정한다.

3'-말단에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 시판제품(Applied Biosystems)을 사용하여 합성하며 역전사 효소를 이용한 디데옥시-시퀀싱하는데 사용한다.

[실시예 3]

[TSWV 유전물질의 cDNA 클로닝]

S 및 L RNA의 3'-말단에 상보적인 뉴클레오티드는 첫 번째 cDNA 쇄 합성을 프라임하는데 사용한다. 상기의 프라이머를 이용하여, TSWV RNA에 대한 DNA의 이중쇄를 갑러 및 호프만(1983)에 의한 방법으로 합성한다. 두가지 상이한 접근법을 사용하여 TSWV 바이러스 RNA에 대한 cDNA클론을 생성한다. 1차 클론은 단일쇄의 송아지 흉선 DNA단편을 사용하여 TSWV RNA를 무작위로 프라임하고 첫 번째 및 두 번째 쇄 cDNA합성을 함으로써 수득한다. cDNA는 T4-DNA 폴리머라제를 사용하여 블런트(blunt) 말단을 만들고 T4 리가제로 pUC19의 SmaI부위에 결찰시킨다. 일련의 2차 TSWV cDNA클론을 TSWV RNA의 3'-말단의 20개 뉴클레오티드에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 첫 번째 DNA 쇄 합성을 프라임함으로써 수득한다. 두 번째 쇄를 합성한 후, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 블런트 말단을 산출하고 인산화된 EcoRI 링커를 훈, 등의 방법(1985)에 의해 cDNA 말단에 결찰시킨다. EcoRI으로 상기 cDNA 분자를 절단한 후, cDNA 단편을 람다 gt10의 EcoRI부위에 결찰시킨다. 바이러스 삽입물을 함유한 상기 두가지 cDNA 클론을 그룬스타인 및 호그네스(1975)에 의해 제시된 콜로니 하이브리드화 방법으로 [³²P]-표지화되고, 무작위로 프라임된 첫 번째 쇄 cDNA를 프로브로 사용하여 선별한다. 겹친 cDNA 셋트를 써던 분석법으로 선별한 후, 제한지도를 구성하기 위하여, S(제2도) 및 L RNA(제3도)의 cDNA 유도된 서열을 근거로 플라스미드 및/또는 파지워킹(walking)을 실시한다.

[실시예 4]

[TSWV S, M 및 L RNA의 서열 결정]

S RNA의 서열을 결정하기 위하여 4개의 선택된 cDNA 클론을 M13mp18에 서브클론시켜서, 전술한 바와 같이 플라스미드 pS614, pS608, pS520 및 pS514를 산출한다. 상기 클론을 야니쉬 페론, 등의 표준 프로토콜(1985)을 사용하여 양방향으로 서열화한다. S RNA 3'-말단의 뉴클레오티드 서열은 합성 올리고뉴클레오티드S1(5' d(GAGCAATCGTGTCAATTTTG))의 프라이머 연장에 의해 결정하며, 이것은 3'-말단의 20개 뉴클레오티드에 상보적이다. 바이러스 S RNA의 5'-말단으로부터 30 내지 50개의 뉴클레오티드와 상보적인 2차 합성 올리고뉴클레오티드 S3는 프라이머 연장에 의해 S RNA의 5'-말단 서열을 확인하는데 사용한다. TSWV S RNA로부터 얻은 서열 데이터(2916nt)는 제4도에 요약하였다.

바이러스쇄와 바이러스 상보성 쇄 상의 6가지 상이한 리딩 프레임의 컴퓨터 시뮬레이트된 번역은 2개의 예상 오픈리딩 프레임의 존재를 밝힌다(참고, 제5(a)도). 바이러스 쇄상에서 오픈 리딩 프레임은 89위치에서 개시하며 1483 위치에서(UAA 정지코돈) 종결되며 분자량 52.4kd의 464 아미노산으로 구성된 단백질을 암호화하는 하는 것이 가능하다. 이 단백질은 비-구조 단백질인 것 같으며, 임시로 NSs로 명명한다. 다른 오픈 리딩 프레임은 2763 내지 1987 위치의 바이러스 상보성쇄 상에 위치하며, 분자량 28.8kd인 258 아미노산길이의 폴리펩타이드를 암호화한다. 이 오픈리딩 프레임은 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 N을 암호하는 것이 가능하다.

상기 가정을 확인하기 위하여 정제된 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 조성을 결정하고 서열 데이터로 추정되는 조성과 비교한다. 또한 추정 뉴클레오캡시드를 암호화하는 N 단백질 유전자를 pBluescript에 삽입한다.

T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 N 단백질 유전자를 시험관내에서 전사시킨다. 시험관내에서 합성된 전사체를 시험관의 토끼 망적혈구 분해물 시스템의 [³⁵S] 표지 메티오닌(NEN) 존자하에서 번역시킨다. 정제된 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체를 사용한 경우, 기술된 방법에 따라 (반 그린스벤, 등, 1986) 천연 뉴클레오캡시드 단백질과 동일한 분자량을 갖는 단백질을 방사능있는 합성 단백질에서 침전시킬 수 있다. 이것은 N 단백질 유전자가 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질을 암호함을 나타낸다. 제5(a)도에서는 S RNA의 바이러스쇄와 상보성 바이러스쇄의 코오딩 능력이 각각 NSs와 N 단백질로 나타나며, 이 두 유전자는 서브게놈 mRNAs로부터 형질 발현됨을 보여주고 있다. 따라서, 바이러스 RNA가 양방향성 유전자 배열을 갖는 독특한 상황이 발생한다. 이 S RNA 서열의 다른 중요한 특징은 일명 “팬조절″구조를 형성할수 있는 상보성 말단 반복체가 존재한다는 점이다. 이러한 구조는 바이러스 RNA의 복제 및 전사에 중요한 역할을 한다. 다른 추정 조절부는 S RNA의 유전자 사이의 헤어핀 구조이며 이것은 각각 mRNA에 대한 전사 종결 시그날을 포함하는 것 같다.

TSWV M 및 L RNA의 뉴클레오티드 서열은 S RNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 이용한 동일한 단계 및 방법을 사용하여 밝혀졌다. 제3도는 L RNA 유도된 겹친 cDNA 클론을 위한 클로닝 단계를 보여주고 있다. 요약한 TSWV M 및 L RNA의 서열 데이터는 각각 제6(a)도와 제6(b)도에 제시하였다. 컴퓨터 시뮬레이트된 번역은 상기 바이러스 L RNA가 그것의 3'-말단으로부터의 34 뉴클레오티드에서 개시하여 5'-말단으로부터의 236 뉴클레오티드에서 정지하는 하나의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 음성 극성임을 제시한다(제5(a)도). 상기의 오픈 리딩 프레임을 함유한 mRNA(바이러스 L RNA에 상보적임)은 바이러스 전사효소로 번역될 가능성이 크다.

[실시예 5]

[효소 발현 벡터 pZU-AN의 합성]

35S 꽃양배추 반점 비루스(CaMV) 프로모터 단편을 재조합 플라스미드 pZ027로부터 분리하며, 상기 플라스미드는 pUC19의 유도체로서 CaMV 균주 Cabb-S의 35S 프로모터와 444bp HincⅡ-HphⅠ 부위를 HindⅢ-PatⅠ 단편으로 수반한다(프랭크, 등, 1980). CaMV 균주의 뉴클레오티드 서열은 다른 균주와 매우 유사하다. 35S 프로모터 단편을 472bp의 EcoRI-PstⅠ단편으로 pZO27로부터 절단해내며, 이것은 다음 부위를 포함한다 ; 폴리링커 부위의 일부, 437bp의 비-전사부위, 전사개시부위 및 7bp의 비-번역 리더 부위(임의의 35S 번역 개시체는 포함하지 않음) 이러한 35S 프로모터 단편을 T4 리가제를 사용하여 EcoRI-PstⅠ 선형 pZO008에 결찰시킨다. 플라스미드 pZO008은 노팔린 신타제(NOS) 터미네이터로서 270bP PstⅠ-HindⅢ 단편을 수반한다. 수득한 재조합 플라스미드 pZU-A는 35S 프로모터, 특정 PstⅠ 부위 및 NOS 터미네이터를 수반한다(제7도). 식물 발현 벡터 pZU-A 에서의 35S프로모터로 사용되는 서열은 다음과 같다 :

벡터 pZU-A에 있는 NOS 터미네이터의 완전한 서열은 다음과 같다 :

[실시예 6]

[발현 벡터 pZU-B의 형성]

재조합 플라스미드 pZO347은 CaMV 균주 Cabb-S의 35S 프로모터 단편문(HincⅡ 단편물) 426bp가 Ω-부위로 불리는 담배 반점병 바이러스의 비-번역 리더 부위의 67bp가 단편물에 결합된 496bp BamHI-SmaⅠ 단편을 수반하는 pBluescript 유도체이다. 이것은 TMV의 미번역 리더와 CaMV의 프로모터 사이에 완전한 전사 융합을 갖는 키메릭 프로모터를 산출한다. 시험관내에서 TMV의 본래 위치를 변이 유발 반응함으로써 ATG 개시코돈이 SmaⅠ 부위로 변이된다.

플라스미드 pZO008은 260bp PstⅠ-HindⅢ 단편으로 노팔린 신타제(NOS) 터미네이터를 수반한다. PstⅠ-HindⅢ 단편을 pZO008로부터 절단하고 T4 리가제를 사용하여 PstⅠ-HindⅢ 선형 pZO347로 결찰시킨다. 수득한 재조합 플라스미드 pZU-B는 또 다른 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터 pZU-B에서 사용되는 이 35S-Ω 프로모터 서열은 다음과 같다 :

수득합 재조합 플라스미드 pZU-B은 35S HincⅡ-TMVΩ 융합물(35S-Ω), 특정 SmaⅠ 및 PstⅠ 부위 및 NOS 터미네이터를 포함한다(제8도). 이 발현 벡터는 발현 시킬 유전자를 키메릭 프로모터 35S-Ω의 하부에 번역 융합시키는데 바람직하게 사용된다.

[실시예 7]

[TSWV-N 단백질 유전자의 서브 클로닝]

TSWV-N 단백질 코오딩 서열은 cDNA 클론 pS614와 pS520 융합에 의해 수득된다(참고, 제2도). cDNA클론 pS520을 EcoRI-HindⅢ 이중 절단하고 TSWV-N 단백질 유전자의 3'-말단을 함유한 단편을 전기영동으로 분리하고 DEAE막을 사용하여 겔로부터 정제하며(NA-45, Schleicher and Schiill) EcoRI-HindⅢ 선형 pBluescript(Stratagene)에 클론시키면 재조합 플라스미드 pS520E/H를 산출한다. TSWV-N 단백질의 단편을 함유한 5'-말단을 EcoRI으로 pS614에서 절단한다. 이 단편을 전기 영동으로 분리하고 DEAE 막(NA-45, Schleicher and Schiill)을 사용하여 겔에서 정제하고 EcoRI선형 pS520E/H에 클론시켜서 재조합 플라스미드 pTSWV-N3을 산출한다. TSWV-N 유전자 함유 플라스미드 pTSWV-N3를 PvuⅡ로 절단하여 선형화했다. PstⅠ 링커 5'd(CCTGCAGG)를 T4 리가제로 선형 DNA의 블론트 말단에 결찰시킨다. 그후, DNA를 PstⅠ으로 절단하고 TSWV-N 단백질을 함유한 단편을 전기영동하여 분리하고 겔에서 절취한다. TSWV-N 단백질 유전자 함유 단편을 pBluescript(Stratagene)과 같은 PstⅠ 선형 벡터에 결찰시켜 재조합 플라스미드 pTSWV-N을 산출한다(제9도). 제한효소 부위를 첨가하면 또 다른 플라스미드 형성이 용이해진다(또한, 제한되지는 않지만 부위-특이적 변이유발반응에 의해서나 다른 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 결찰시키는 등 여러 방법으로 부위를 첨가할 수 있으며, 이 방법들은 당업자들에게 공지되어 있다).

[실시예 8]

[TSWV S RNA의 TSWV 비-구조 단백질 유전자(NSs-유전자)의 서브 클로닝]

비-구조 단백질 NSs의 서열을 cDNA 클론 pS514로부터 분리한다. NSs-단백질 유전자는 EcoRI 단편에 존재한다. cDNA 클론 pS514를 EcoRI으로 절단하고 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 블런트 말단을 산출한다. NSs유전자 함유 단편을 아가로즈 겔 전기영동으로 분리하고 겔에서 절취한다. T4 폴리머라제를 사용하여 NSs-단백질 유전자를 함유한 블런트-말단 단편에 합성 PstⅠ 링커(5'd(CCTGCAGG)-3')을 결찰시켰다. PstⅠ으로 절단한 후, NSs-단백질 유전자 함유 단편을 PstⅠ 선형 pBluescript에 결찰시켜서 재조합 플라스미드 pTSWV-NSs를 산출한다(제10도).

[실시예 9]

[TSWV 서열을 함유한 식물 형질전환 백터의 형성]

[실시예 9A]

[pZU-A에서 N-단백질 유전자의 형성]

35S 프로모터에 의해 개시되어 NOS 터미네이터에 의해 종결되는 N 단백질 유전자를 함유하는 식물 형질전환 벡터를 산출하기 위하여, pTSWV-N의 PstⅠ 단편을 분리하고 PstⅠ 선형 pZU-A에 삽입함으로써 키메릭 유전자 카세트 벡터 PTSWV-NA를 산출한다. 35S 프로모터, N-단백질 유전자 및 NOS 터미네이터를 함유한 카세트를 XbaⅠ으로 절단하여 pTSWV-NA로부터 절취하고, 배반, 등(1984)에 의해 개발된 양쪽성 형질전환 벡터인 pBIN19의 특정한 XbaⅠ에 결찰시킨다. 수득한 플라스미드 pTSWV-NAB(제11도)는 공지된 방법을 사용하여 식물 형질전환 실험을 하는데 사용한다.

[실시예 9B]

[pZU-B에서 N-단백질 형성]

N 단백질 유전자로부터의 ATG 개시코돈을 35S-Ω프로모터의 TMV 미번역리더 3'-말단에 직접 융합시키기 위해 N 유전자의 개시코돈을 변이시켜야만 한다. 부위-특이적 변이유발 반응을 사용하여 pTSWV-N의 서열 5'd(ACGATCATCATGTCT)를 5'd(ACGATATCATGTCT)로 변이시킴으로서 EcoRV-부위(N-유전자의 ATG 개시코돈에 바로 인접한 5'd(GATATC))를 산출한다. 산출한 재조합 플라스미드는 pTSWV-Nmut로 명한다. 변이된 N 단백질 유전자는 EcoRV-PstⅠ으로 절단하여 상기 플라스미드에서 절취한다. 이 단편물을 분리하고 SmaⅠ-PstⅠ선형 pZU-B에 삽입하면 재조합 플라스미드 pTSWV-NmutB가 산출된다.

35S-Ω프로모터, 변이 N 유전자 및 NOS 터미네이터를 함유한 키메릭 카세트를 BamHI/XbaⅠ으로 절단하여 플라스미드 pTSWV-NmutB에서 절취한다. 분리한 키메릭 유전자 카세트를 BamHI/XbaⅠ 선형 pBIN19로 삽입하여 양쪽성 형질전환 벡터 pTSWV-NmutBB를 산출한다. 수득한 플라스미드 pTSWV-NmutBB(제12도)를 공지된 방법을 사용하여 식물 형질전환 실험에 사용한다.

[실시예 9C]

[pZU-A에 NSs-단백질 유전자 형성]

35S 프로모터에 의해 개시되어 NOS 터미네이트에 의해 종결되는 NSs-단백질 유전자를 함유하는 식물형질전환 벡터를 산출하기 위하여, pTSWV-NSs의 PstⅠ 단편을 분리하고 PstⅠ 선형 pZU-B에 삽입함으로써 키메릭 유전자 카세트 벡터 pTSWV-NsA를 산출한다. 35S 프로모터, NSs-단백질 유전자 및 NOS 터미네이터를 함유한 카세트를 EcoRI과 XbaⅠ으로 절단하여 pTSWV-NsA로부터 절취하고 EcoRI-XbaⅠ 선형 pBIN19에 결찰시킨다. 수득한 플라스미드 pTSWV-NsAB(제13도)는 공지된 방법을 사용하여 식물 형질전환 실험을 하는데 사용한다.

[실시예 9D]

[pZU-B에서 NSs-단백질 유전자 형성]

N 단백질 유전자로부터의 ATG 개시코돈을 35S-Ω프로모터의 TMV 리더 3'-말단에 직접 융합시킨 융합물을 제조하기 위하여, NSs 유전자의 개시코돈을 변이시켜야만한다. 공지된 방법은 부위-특이적 변이유발 반응을 사용하여, 서열 5'd(AACCATAATGTCT)를 5'd(AACATATGTCT)로 변이시킴으로서 NdeⅠ부위(NSs-단백질 유전자의 ATG 개시코돈을 포함하는 5'd(CATATG))를 산출한다 : 산출한 플라스미드는 pTSWV-NSsmut로 명한다. 플라스미드 pTSWV-NSsmut를 NdeⅠ으로 선형화한 후 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 블러트 말단을 산출한다. 상기의 선형 DNA를 PstⅠ으로 절단하고 변이된 NSs 유전자를 함유한 단편물을 분리하며 SmaⅠ-PstⅠ 선형화 pZU-B로 삽입하면 재조합 플라스미드 pTSWV-NsmutB가 산출된다. 35S-Ω프로모터, 변이 NSs 단백질 유전자 및 Nos 터미네이터를 함유한 키메릭 카세트를 BamHI/XbaⅠ으로 절단하여 플라스미드 pTSWV-NsmutB에서 절취한다. 분리한 키메릭 유전자 카세트를 BamHI/XbaⅠ 선형 pBIN19로 삽입하여 양쪽성 형질전환 벡터 pTSWV-NsmutBB를 산출한다. 수득한 플라스미드 pTSWV-NsmutBB(제14도)를 공지된 방법을 사용하여 식물 형질전환 실험에 사용한다.

[실시예 9E]

[pZU-A 및 pZU-B에서 5' 및 3'-말단의 “팬-조절”형성]

DNA 분석 프로그램은 바이러스 TSWV S RNA에 있어서 “팬-조절” 루프를 배치하는데 사용한다. 가장 강력하게 검출되는 “팬-조절” 루프는 바이러스 S RNA의 5'-말단(1 내지 70)의 첫 번째 70개 뉴클레오티드와 3'말단(2850 내지 2916)의 마지막 67개 뉴클레오티드를 포함한다(제15도). 바이러스 S RNA에 있어서 “팬-조절”루프를 함유한 DNA 서열은 다음과 같다 :

및

DAN 분석 프로그램은 바이러스 TSWV L RNA에 있어서, “팬-조절”루프를 배치하는데 사용된다. 검출되는 강력한 “팬-조절”루프는 바이러스 L RNA의 5'말단(2 내지 80)의 처음 80개의 뉴클레오티드와 3'-말단의 마지막 80개 뉴클레오티드를 포함한다. 바이러스 L RNA에 있는 “팬-조절”루프를 함유한 DNA 서열은 다음과 같다.

및

상기 부위는 시판용 DNA 서열기로 합성되며 적당한 링커 서열이 첨가된다. S 및 L RNA의 “팬-조절”벡터의 형성은 각각 pTSWV-termS 및 pTSWV-termL을 생성한다. 적당한 제한효소 배합을 사용하여, 상기의 단편을 CaMV 35S 프로모터와 pZU-A의 NOS 터미네이터 사이에 삽입하여 키메릭 카세트를 산출한다 : pTSWV-termSA, pTSWV-termLA, pTSWV-termSB 및 pTSWV-termLB 그후 상기 카세트를 적당한 제한효소 배합을 사용하여 양쪽성 형질전환 벡터 pBIN19에 전이시켜서 다음 플라스미드를 산출한다 : pTSWV-termSAB, pTSWV-termLAB, pTSWV-termSBB 및 pTSWV-termLBB. 또한 전술한 것보다 더큰 3'- 및 5'-말단을 함유한 “팬-조절” 구조체를 고안하는 것이 가능하며, 식물에 있어서 상기의 재조합 유전자로부터 산출된 전사체의 안정도를 향상시키기 위하여 다른 DNA 서열로 분리될 수 있다. 모든 “팬-조절”구조체는 단축된 토스포바이러스 RNA와 유사하며, 따라서 결함 간섭 RNAs로 간주될 수 있다.

[실시예 9F]

[pZU-A 및 pZU-B에서 TSWV S RNA 헤어 핀 부위를 함유한 구조체]

DNA 분석 프로그램을 사용하여 바이러스 TSWV S RNA에 헤어 핀 루우프를 배치하는데 사용한다. 검출되는 강력한 헤어 핀 루우프는 뉴클레오티드 1592에서 개시되어 1834에서 종결된다(제16도). 헤어 핀 루우프를 포함한 서열은 다음과 같다 :

헤어핀 부위를 수반하는 526bp의 HindⅢ 단편을 pS514로부터 분리한다. 아가로즈겔에서 상기 단편을 절취한 후 T4 폴리머라제로 처리하여 블런트 말단을 산출한다. 다음 단계에서 PstⅠ링커를 상기 블런트 말단에 결찰시키고 PstⅠ으로 절단한 후 단편을 PstⅠ 선형화 pZU-A에 클론하여 재조합 플라스미드 pTSWV-HpSA를 산출한다. 플라스미드 pTSWV-HpSA를 HindⅢ로 절단하고 키메릭 유전자를 함유한 단편을 아가로즈 겔에서 절취하고 HindⅢ 선형화 pBIN19에 결찰시켜서 형질전환 벡터 pTSWV-HpSAB를 산출한다.

또한, pS514의 HindⅢ 단편을 T4 DNA 폴리머라제로 처리하여 블런트 말단을 산출한 후 발현 벡터 pZU-B의 SmaⅠ 부위에 클론시켜서 재조합 플라스미드 pTSWV-HpSB를 산출한다. 플라스미드 pTSWV-HpSB를 HindⅢ로 절단하고 키메릭 유전자를 함유한 단편을 아가로즈겔에서 절취하여 XbaⅠ 선형화 pBIN19에 결찰시켜서 형질전환 벡터 pTSWV-HpSBB를 산출한다.

(당업자들은 작용에 변화없이 다른 단편들을 전술한 바와 같이 헤어 핀 부위를 함유한 TSWV S RNA의 cDNA 클론으로부터 분리할 수 있다는 것을 명백히 알고 있으며, 또한 헤어 핀 부위를 함유한 단편은 DNA-합성기로 합성될 수 있다)

[실시예 10]

[양쪽성 벡터의 식물 재료에의 형질전환]

식물물질에 양쪽성 벡터를 전이시키는 방법은 이미 기존하며 당업자들에게 잘 알려져 있다. 사용하는 아그로박테리아 균주의 종류, 실험 물질의 제공원 종류, 사용한 식물종 뿐만 아니라 배양기에 따른 재생 시스템의 종류에 따라 방법이 변형될 수 있다.

전술한 양쪽성 식물 형질전환 벡터는 이하의 방법에 따라 식물 형질전환 실험에 사용한다. 형성된 양쪽성 벡터를 수용체인 아그로박테리움 투메퍼시언스 균주에 삼중-부모계 교배에 의해 전이시킨 후, 수용체 균주로 구조체가 적당히 전이되었는지를 확인하기 위해 경접합 개체를 써던 분석하고, 선택된 아그로박테리움 투메파시엔스로 실험 물질을 접종하고 공배양하고 적당한 항생제를 사용하여 아그로박테리움 투메파시엔스를 선택적으로 죽이고, 가나마이신을 함유한 선택배지상에서 증식시켜 형질전환 세포를 선별하고 발아-유도배지로 조직을 전이하고, 선별된 발아체를 뿌리 유도 배지로 전이하고, 토양에 묘목을 옮기며, 유전자 전이 식물로부터 분리된 총 DNA를 써던 분석하여 구조체의 본래 상태를 분석하고, 노던 분석법 및/또는 효소 분석법 및 단백질의 웨스턴 블롯 분석법으로 삽입된 키메릭 유전자의 적당한 기능을 분석한다.

[실시예 11]

[식물세포에서 TSWV RNA 서열의 발현]

하기한 프로토콜을 사용하여 재생 식물의 잎에서 RNA를 추출한다. 액체 질소내에서 200mg의 잎물질을 미세한 분말로 분쇄한다. 80㎕의 RNA 추출완충액(100mM Tris-HCI(pH 8.0), 500mM, NaCL, 2mM EDTA, 200mM β-메르캡토 에탄올, 0.4% SDS)을 첨가하고 균질액을 페놀로 추출하며, 알코올 침전법으로 핵산을 회수한다. 0.5ml의 10mM Tri-HCL(pH 8.0), 1mM EDTA에 핵산을 재현탁시키고, 최종 농도 2M로 LiCl를 첨가하며, 최고 4시간동안 얼음위에 방치한 후 원심분리하여 RNA를 수거한다. 400㎕의 10mM Tri-HCL(pH 8.0), 1mM EDTA중에 재현탁시키고 알코올로 침전시키며, 최종적으로 50㎕의 10mM Tri-HCL(pH 8.0), 1mM EDTA중에 재현탁시킨다. 글리옥살/아가로즈 겔 상에서 RNA를 분리하고 반 그린스벤, 등(1986)에 의해 기술된 Genescreen에 블롯팅하였다. TSWV 바이러스 RNA는 [³²P], [³⁵S]로 표지된 RNA 프로브 또는 비-방사능 표지법을 사용하여 검출한다. 상기의 노던 분석법을 근거로, 재생된 식물이 키메릭 TSWV 유전자를 어느 정도 발현하는지 결정한다.

TSWV 단백질 유전자를 함유한 키메릭 구조체로 형질전환된 식물로 웨스턴 블롯 분석을 하였다. 형질전환된 식물의 잎을 렘리(1970)에 의한 완충액중에서 분쇄함으로써 단백질을 추출한다. 50㎍의 단백질을 렘리(1970)에 의해 기술된 바와 같이 12.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 처리하였다. 분리한 단백질을 토우빈, (1979)에 의해 기술된 바와 같이 전기영동에 의해 니트로셀룰로즈에 전이하였다.

전이된 단백질은 토우빈, 등(1979)에 의해 기술된 정제 TSWV 뉴클레오캡시드에 대한 항혈청과 반응시킨다. 웨스턴 분석 결과를 근거로, 삽입된 키메릭 유전자에 의해 암호된 TSWV 단백질을 형질전환된 식물이 포함한다는 것을 결정한다.

[실시예 12]

[TSWV 감염에 대한 식물의 내성]

형질전환된 식물이 병원체에 의해 감염되는 것을 방지하기 위하여 표준의 검역 조건하에 온실에서 성장시킨다. 형질전환제는 자가-수분작용을 하며 종자가 배양된다. 자손식물은 삽입 유전자의 분리에 대해 분석한 후 기계적인 접종으로 TSWV로 감염시킨다. TSWV로 전체적으로 감염된 식물조직을 5부피의 얼음-냉각 접종 완충액(1% Na₂SO₃로 보충한 10mM 인산염 완충액)중에서 분쇄하여 약 5주된 묘목의 최초로 완전히 큰 잎 2개의 탄화규소 분말의 존재하에 문지른다. 접종 식물은 접종 후 3주동안 증상의 진전을 모니터한다.

TSWV 관련 DNA 서열을 함유한 식물은 증상 진전을 지연함으로써 예시화한 바와 같이 TSWV 감연 가능성을 감소시키는 것으로 나타났으며, 그 반면 미형질전환 대조 식물은 접종후 7일 이내에 전체적으로 심각한 TSWV 증상을 나타낸다.

[실시예 13]

[진단 목적용 합성 뉴클레오티드의 사용]

다음과 같은 방법으로 예상식물의 잎에서 RNA를 추출한다 : 바람직하게는 질병의 증상을 나타내는 1g을 3ml의 100mM Tris-Hcl, 50mM EDTA, 1.5NaCl 및 2% CTAB(pH 8.0)중에서 분쇄한다. 그후 1ml의 균질액을 클로로포름으로 추출하고 10분간 65℃에서 배양한다. 무기층을 수거하고 페놀/클로로포름(1 : 1)로 추출한후, 클로로포름으로 마지막 추출을 한다. 최종 농도가 2M이 되도록 LiCl를 첨가하여 RNA를 총 핵산을 포함한 무기층에서 분리해낸다. 이 준비물을 1시간 동안 4℃에서 배양한 후, 핵산을 원심분리하여 수거한다. 핵산 펠렛을 25㎕의 1mM TriS-HCl, 1mM EDTA(pH 8.0)중에 재현탁시킨다. 핵산을 표준 알코올 침전법으로 회수한다. 핵산 펠렛을 25㎕의 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH 8.0)중에 재현탁시킨다.

1㎕의 정제된 RNA를 나일론 블롯팅 막(예, Hybond-N, Amersham, UK)에 점적한다. 식물에 있어서 TSWV의 존재를 바이러스에서 분리한 서열의 일부(들)을 사용하는 표준 하이브리드법으로 검출하며, 바람직하게는 프로브로서 공지된 서열 정보를 근거로 합성 올리고머를 고안함으로써 검출한다(또한, TSWV 게놈의 부위를 시험관에서 전사한 것은 질병식물에 있어서 TSWV 관련 RNA를 검출하는데 사용된다) 질병식물로부터 RNA 물질을 함유한 도트에 하이브리드가 나타나는 것으로써 진단한다.

본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 토양에서 선택한 바이러스 감염으로 추정되는 12가지 후추식물(A1-D3)로부터 RNA를 분리한다. 유사하게 3가지 TSWV 접종 담배 식물(E1-E3) 및 3가지 비-접종 담배 식물(F1-F3)로부터 추출한다. 각 식물로부터 1㎕의 RNA 샘플을 하이본드 막상에 점적한다. 이 필터를 표준 조건하에서 방사능 표지로 α-[³²P]UTP와 T3 폴리머라제를 사용한 cDNA 클론 pS614에서 합성한 시험관내 전사체와 하이브리드시킨다. 대조군인 비-감염식물(F1-F3)는 시그날이 나타나지 않았으며, 대조군인 TSWV 감염식물(E1-E3)는 강한 시그날이 나타난 반면, 추정 후추 식물은 약 내지 강의 강도로 시그날이 모두 나타났다(제17도).

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Claims

식물체내에서 작동하는 프로모터 및 터미네이터의 발현 조절하에 있고 하기의 RNA 서열(a), 또는(b) 또는 (c)를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 구조체 : (a) 토스포바이러스(tospoviral) 서열인 I) 제4도의 S RNA 뉴클레오티드 서열번호 1 내지 2915, ii) 제4도의 S RNA 뉴클레오티드 서열번호 2763 내지 1987, 및 iii) 제6(b)도의 L RNA 서열로 구성된 군에서 선택된 RNA서열 : 또는 (b) 하나이상의 코돈이 이들의 동의코돈(즉, 동일한 아미노산이나 종결시그날에 상응하는 코돈)으로 치환된, 토스포바이러스 단백질을 암호화하는 (a)에 따른 RNA 서열, 이의 일부분 또는 이들의 상동성 RNA 서열 : 또는 (c) (a) 또는 (b)에 따른 RNA 서열에 상보적인 RNA 서열(상기에서, S RNA, L RNA 및 M RNA 서열은 발명의 상세한 설명에서 정의한 바와 같다).
제1항에 있어서, 상동성 RNA 서열이 20개 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 DNA 구조체.
제1항에 있어서, 프로모터가 바이러스, 진균(fungal), 세균(bacterial), 동물 또는 식물에서 유래하고 식물세포에서 작용하는 프로모터인 DNA 구조체.
제1항에 있어서, 터미네이터가 바이럿, 진균(fungal), 세균(bacterial), 동물 또는 식물에서 유래하고 식물세포에서 작용하는 터미네이터인 DNA 구조체.
(a) 제1항의 DNA 구조체를 식물세포의 게놈에 삽입하고, (b) 형질전환된 세포를 수득한 후, (c) 형질전환된 세포로부터 유전적으로 형질전환된 식물을 재생시키는 단계를 포함하는 제1항의 DNA 구조체를 게놈내에 함유하고 있는 식물을 제조하는 방법.
제5항에 있어서, (d) 상기 형질전환된 식물을 번식시키는 단계를 더 포함하는 방법.