HU218417B - Eljárás csökkentett fertőzésérzékenységű növények kifejlesztésére - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya rekombináns DNS-szerkezet, amely olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után az alábbi RNS-szekvenciákat eredményezi: a) tospovírus-RNS-szekvencia vagy ezzelhomológ szekvencia, b) olyan a) szerinti tospovírus-RNS-szekvencia,amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával (vagyis azonosaminosavat vagy lánclezáró szignált kódoló kodonnal) vanhelyettesítve, ennek egy része vagy ezzel homológ szekvencia, vagy c)az a) vagy b) szerinti szekvenciával komplementer RNS-szekvencia, ésamely DNS a kifejeződés során növényben működőképes promoter ésterminátor által szabályozható. ŕ

Description

A találmány tospovírus-fertőzéssel szemben kevésbé érzékeny növényekre, az említett tolerancia kialakítására alkalmas genetikai anyagra, valamint az adott növény és genetikai anyag izolálására, kimutatására és előállítására alkalmas mintára vonatkozik.

A vírusos fertőzések általában különböző károsodásokat okoznak a növények fejlődésében, morfológiájában és termésében. A vírusos fertőzés ezenkívül gyakran fokozza a fertőzött növény érzékenységét más növénypatogénekkel és betegségekkel szemben. A növényi vírusok általában rovarok vagy gombák által, vagy mechanikusan teijednek.

A növénynemesítők folyamatosan törekednek olyan növényfajták kifejlesztésére, amelyek elviselik vagy ellenállnak a különböző vírustörzseknek. A vírussal szembeni rezisztenciáért felelős géneket a vad típusú növényekről a kereskedelmi fajtákra általában nemesítéssel viszik át. Egy meglévő rezisztenciának a vad típus génállományából a kultúrnövénybe történő átvitele fáradságos folyamat, amelynek során a rezisztenciáért felelős gént vagy géneket először azonosítani kell a donomövényben, majd az elválasztott rezisztenciáért felelős gént egyesítik a kereskedelmi fajta teljes génállományával. Az így kialakított rezisztencia vagy tolerancia gyakran csak egy vagy néhány adott vírustörzzsel szemben aktív. Egy adott vírustörzzsel szemben rezisztens kultúrnövény kinemesítését gyakran gátolja az adott növényfajtához tartozó megfelelő géndonor hiánya. A vírusos fertőzés hatása megelőzhető vagy csökkenthető továbbá vegyszerek vagy más, a vírusvektor ellen ható módszerek, például inszekticidek, fungicidek vagy megfelelő növényélettani körülmények alkalmazásával. A vektor elpusztításával működő vírusos betegségek elleni vegyszerek alkalmazását a kormányok egyre szigorúbb előírásokkal szabályozzák, ami csökkenti a növénytermesztők által felhasználható kémiai növényvédő szerek skáláját.

Alternatív megoldásként alkalmazható az úgynevezett „keresztvédelem” módszere. A keresztvédelem egy olyan tulajdonság, amelyben a növény egy adott vírustöizzsel történő megfertőzése megvédi a növényt egy másik, rokon vírustörzs fertőzésétől. Ez a módszer magában foglalja azt a változatot is, amelynek során a növényt legyengített életképességű vírustörzzsel fertőzik, és ezzel akadályozzák meg az azonos vírus virulens törzsének fertőzését. A természetes keresztvédelem-rendszer azonban egy sor hátránnyal rendelkezik. A megoldás nagyon munkaigényes, mivel minden növényt inokulálni kell, és ezenkívül magában foglalja azt a veszélyt, hogy a legyengített életképességű törzs mutációval virulens törzzsé alakul, és így önmaga váltja ki a betegséget. Lehetséges az is, hogy az egyik növényfajta vonatkozásában legyengített életképességűnek minősülő vírustörzs virulens törzsnek minősül egy másik növényfajtában.

Számos kísérlet utal arra, hogy a védelmet biztosító vírus burokfehérjéje jelentős szerepet játszik a keresztvédelemben, és a védelem akkor biztosítható, ha a bent lévő vírus és fertőző vírus azonos vagy közeli rokonságban lévő burokfehérje-szerkezettel rendelkezik.

A géntechnológia és növényi transzformálás legutóbbi fejlődése lehetővé tette új módszerek kidolgozását vírusrezisztencia kialakításához. A genetikailag kialakított keresztvédelem olyan vírusrezisztenciát alakít ki, amely fenotípusosan megközelíti a természetes keresztvédelmet, de a genetikailag manipulált növény genomjában megtalálható vírus-burokfehérjére vonatkozó genetikai információ kifejeződése által jelenik meg. Vírusrezisztencia genetikai kialakítását sikeresen először Beachy és munkatársai (1985) és Ábel és munkatársai (1986) hajtották végre. Kimutatták, hogy a dohány-mozaik vírus U1-törzs (TMV-U1) burokfehéijegén egy transzgén növény genomjából történő kifejezése késlelteti a tetszőleges TMV-törzs által okozott fertőzés szimptómái kialakulását. Hasonló eredménnyel alakítottak ki burokfehérje által közvetített védelmet az alfalfa-mozaikvírus (AMV), burgonya-X-vírus (PVX) és uborka-mozaikvírus (CMV) vonatkozásában.

Bár a TMV, CMV, AMV és PVX különböző víruscsoportokhoz tartoznak, közös vonásuk, hogy a vírusRNS egy pozitív szálú RNS, amely egy sor különálló, de azonos burokfehétje által kialakított burokba van bezárva.

A tospovírus lényegileg eltér ezektől a növényvírusoktól. A tospovírus a Bunyaviridae nembe tartozik. A tospovírusokat rojtos szárnyú rovarok, thripszek közvetítik. A vírus részecskéi gömb alakúak (80-120 nm átmérő), és glikoprotein felületi nyúlványokkal telehintett lipidburokkal körülvett belső nukleotid tokot tartalmaz. A több részből álló genom negatív vagy kettős polaritású, lineáris, egyszálú RNS-molekulákat tartalmaz. Az RNS-molekulák terminális nukleotidjait az alábbi együttműködő szekvencia jellemzi:

5’ AGAGCAAUX........GAUUGCUCU 3’, ahol

X jelentése C vagy U.

A tospovírusok tipikus képviselői a paradicsom foltos hervadásvírus (TSWV) és a nebáncsvirág üszkös foltvírus, a TSWV altípusa.

A TSWV-vírus négy különböző szerkezeti fehérjét tartalmaz, egy belső 29 kd nukleotid tokfehérjét (N) és két membrán-glikoproteint: G1 mintegy 78 kd és G2 mintegy 58 kd. Emellett kis mennyiségben egy, mintegy 260 kd nagyméretű fehérje (L) mutatható ki a vírusrészecskék között. A TSWV genomja három lineáris egyszálú RNS-molekulából áll, ±2900 nt S RNS, ±5000 nt M RNS és ±7500 nt L RNS, amelyek szorosan kapcsolódnak a nukleotid tokfehérjéhez és az L-fehéqe néhány kópiájához, amellyel kör alakú nukleotid tokot képeznek. Egy vázlatos szerkezetet, amely a TSWV-vírus legtöbb tulajdonságát bemutatja, az 1. ábrában adunk meg. A fenti és más tulajdonságok alapján a TSWV a tospovírusok reprezentáns képviselőjének minősül. Egyes másodlagos megfigyelésekből arra lehet következtetni, hogy az M RNS által kódolt gén közvetlenül vagy közvetve részt vesz a G1 membrán glikoprotein-szintézisében (Verkleij és Peters, 1983). A többi RNS-molekula kódolótulajdonsága és a genom RNS-polaritása korábban ismeretlen volt.

Mint fent említettük, a tospovírusokat, így a TSWV-t bizonyos rojtos szárnyú rovarok, thripszek közvetítik.

HU 218 417 Β

A TSWV vektora a Tripidae családba tartozik, példaként említhető a Frankliniella fusca, F. occidentalis, F. Schultzei, Scirtothrips dorsalis, Thrips setosus, T. tabaci, F. intonsa és T. palmi. A thripszek a vírust csak lárvaállapotban veszik fel, és a lárva a vírus átvitelére csak bebábozódás előtt képes. A vírus átvitelét gyakran a kifejlett egyedek végzik. Ezek a kifejlett egyedek teljes életükben fertőzőképesek maradnak.

A TSWV valamennyi kontinensen elterjedt, így az egyik legszélesebb körben elterjedt növényvírus képezik. A vírus megtalálható a mérsékelt, szubtropikus és tropikus éghajlati öv alatt is. A vírus legalább 370 növényfajt, ezen belül 50 növénycsaládot képes fertőzni, ahol a növények köre kiterjed az egy- és kétszikű növényekre is. A TSWV gyakran támadja meg a takarmánynövényeket és a dísznövényeket. A TSWV-törzs által fertőzött növényen elsatnyulás, gyűrű alakú foltok, sötét bíborbama, besüllyedt foltok, szárbamulás, virágtörés, üszkös és pigmentsérülés és elszíneződés, sárga és nem üszkös foltosság, valamint zöld mozaikbetegség jelentkezik, vagy a növény teljes egészében elpusztul. A legtöbb gazda a szimptómáknak csak egy részét mutatja. A TSWV által okozott szimptómák széles köre nehezíti a diagnózist, és egy sor, egymástól eltérő névvel jelzett külön betegséget okoz. Ugyanazon a növényfajtán jelentkező TSWV-szimptómák is változhatnak a növény korától, a növény életciklusán belüli fertőzési időponttól, a tápanyag mennyiségétől és a környezeti körülményektől, elsősorban a hőmérséklettől függően.

Bár a TSWV évek óta ismert, széles körben elterjedt, és a kultúrnövényekben és dísznövényekben gazdasági jelentőséggel bíró betegségeket okoz, csak korlátozott mértékben kutatták a TSWV-rezisztenciáért felelős géneket. Egy multigén-TSWV-toleranciát azonosítottak a Lycopersicon peruvianumban, de ezt a rezisztenciát még nem vitték át a termesztett paradicsomfajtákba, és nem azonosítottak más növényfajtákhoz alkalmazható rezisztenciaforrást sem. A természetes keresztvédelemrendszer alkalmazását a különböző TSWV-törzsek legyengítésére részleteiben nem írták le, csak néhány pozitív eredményről számoltak be a paradicsom és a saláta vonatkozásában.

A tospovírus-fertőzéssel szembeni rezisztenciát biztosító géninformáció géntechnológiai úton növényi génállományba történő bevitele tehát növénynemesítők és növénytermesztők számára új eljárást biztosít a tospovírus által okozott betegségek legyőzéséhez.

A találmány tárgya tehát rekombináns DNS-szerkezet, amely olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után az alábbi RNS-szekvenciákat eredményezi :

a) tospovírus-RNS-szekvencia vagy ezzel homológ szekvencia,

b) olyan a) szerinti tospovírus-RNS-szekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával (vagyis azonos aminosavat vagy lánclezáró szignált kódoló kodonnal) van helyettesítve, ennek egy része vagy ezzel homológ szekvencia, vagy

c) az a) vagy b) szerinti szekvenciával komplementer RNS-szekvencia, és amely DNS a kifejeződés során növényben működőképes promoter és terminátor által szabályozható.

A fenti a), b) és c) pontokkal definiált DNS-szekvenciát a továbbiakban TSWV-re vonatkozó DNSszekvenciának nevezzük. A találmány szerinti, TSWVre vonatkozó DNS-szekvencia kívánt esetben szakember számára ismert módon, például helyspecifikus mutációval módosítható, amelynek során az eredeti szekvenciával homológ mutánsokat, vagy módosított szekvenciák keletkeznek. Ezek a mutánsok vagy módosított szekvenciák az oltalmi körbe tartoznak.

A tospovírus-RNS-szekvencia kifejezés a tospovírus S, M vagy L RNS-szálának, előnyösen az S vagy L RNS-szálnak, elsősorban az S RNS-szálnak a szekvenciáját jelenti.

A tospovírus-RNS-szekvenciával homológ RNSszekvencia kifejezés olyan tospovírus-RNS-szekvenciát jelent, amelyben egyes nukleotidok ki vannak iktatva és/vagy be vannak építve, de megfelelő hibridizációs körülmények között továbbra is hibridizálható a tospovírus-RNS-szekvenciával komplementer nukleotid szekvenciával. A találmány keretein belül a megfelelő hibridizációs körülmények 16 órán keresztül 42 °C hőmérsékleten 5 χ standard nátrium-citrát (SSC), 0,5 tömeg% nátrium-dodecil-szulfát (SDS), 5 χ Denhardt-oldat, 50 tömeg% formamid és 100 pg/ml hordozó DNS-összetételűpufferrendszerben (a továbbiakban: pufferrendszer) végzett inkubálást, és ezt követően 65 °C hőmérsékleten háromszor 1 órán keresztül 1 xSSC és 0,1 tömeg% SDS összetételű pufferrel végzett mosást jelent.

A hibridizálást előnyösen 49 °C hőmérsékleten 16 órán keresztül pufferrendszerben végzett inkubálással és 55 °C hőmérsékleten háromszor 1 órán keresztül 0,1 χ SSC és 0,1 tömeg% SDS összetételű pufferrendszerben végzett mosással, különösen előnyösen 55 °C hőmérsékleten 16 órán keresztül pufferrendszerben végzett inkubálással és 65 °C hőmérsékleten háromszor 1 órán keresztül 0,1 χ SSC és 0,1 tömeg% SDS összetételű pufferben végzett mosással végezzük.

A TSWV-re vonatkozó DNS-szekvencia hossza, mint ez a leírásból később kiderül, a választott munkamódszertől függ. A TSWV-re vonatkozó DNS-szekvencia általában legalább 20 nukleotidot, előnyösen 50 vagy több nukleotidot tartalmaz.

A promoter kifejezés a transzkripciós starthelytől felfelé elhelyezkedő nukleotidszekvenciára vonatkozik, amely tartalmazza az átíráshoz szükséges valamennyi szabályozószakaszt, és az M RNS-leaderszekvenciáját (ahol a leaderszekvencia tartalmazza a riboszomális megkötőhelyet, és az AUG startkodonnál megkezdi a fordítást).

A találmány szerinti, DNS-szerkezetben promoterként alkalmazható vírusból, gombából, baktériumból származó, valamint állati vagy növényi eredetű promoter, amely növényi sejtben működőképes. A promoter a DNS-t alkotó módon vagy megkülönböztető módon fejezi ki. A DNS-t megkülönböztető módon kifejező promoterekre példaként említhető a betegségvekto3

HU 218 417 Β rok, így a thripszek által indukált promoter, például az úgynevezett seb által indukált promoter. Figyelembe kell venni, hogy az alkalmazott promoter olyan mértékben fokozza a TSWV-re vonatkozó DNS-szekvencia kifejezését, hogy az a transzformált növény tospovírusérzékenységét megfelelő mértékben csökkentő RNSmennyiséget termeljen. Az RNS szükséges mennyisége a növény típusától függ. Promoterként előnyösen alkalmazható a karfíol-mozaikvírus 35S (CaMV 35S) promoter, ennek származékai, valamint a betegségvektor, például thripsz által okozott sebben indukált promoter.

A terminátor kifejezés az átírásegység végén elhelyezkedő DNS-szekvenciát jelenti, amely jelzi az átírás befejezését. A terminátor egy le nem fordított DNS-3’ szekvencia, amely olyan poliadenilezőszignált tartalmaz, amely az elsődlegesen átírt szekvencia 3’ végén poliadenilezőszekvencia hozzáépítését váltja ki. A növényi sejtekben működőképes terminátorok ismertek, és az irodalomban megtalálhatók. Ilyenek izolálhatok például baktériumokból, gombákból, vírusokból, állatokból és növényekből. A találmány szerinti DNS-szerkezetben előnyösen alkalmazható terminátorra példaként említhető az A. tumefaciens nopalin-szintáz terminátora, a CaMV 35S terminátora és a Zea mays zein terminátora.

A leírásban alkalmazott terminológia értelmében egy RNS-szekvencia akkor komplementer egy másik RNSszekvenciával, ha azzal megfelelő hibridizációs körülmények (lásd fent) között a bázispárosítás szabályainak megfelelően hidrogénhíd-kötésű komplexet képez.

A találmány kiterjed a találmány szerinti DNS-szerkezet növénybe történő bevitelére alkalmas vektorra és annak előállítására is.

Vektor alatt olyan hordozót értünk, amely alkalmas DNS-fragmenseknek valamely gazdaszervezetbe történő bevitelére.

A találmány keretein belül a növény kifejezést széles értelemben alkalmazzuk, és így jelent különálló növényeket, valamint elkülönítés nélküli növényi anyagot, így protoplasztot, növényi sejtet, magot és csíranövényt, amely megfelelő körülmények között érett növénnyé fejleszthető, valamint ezek utódját és részeit, így levágott részeit és gyümölcsét.

A találmány kiterjed továbbá a genomjában találmány szerinti DNS-szerkezetet tartalmazó növényre, valamint ennek előállítására.

A találmány szerinti növény mérsékelten érzékeny a tospovírus által kiváltott betegségekkel szemben, és mentes a fent ismertetett klasszikus eljárásokkal nyert növények hátrányaitól és korlátozásaitól.

A tospovírussal, így a TSWV-vel szemben érzékeny növényekre példaként említhető az Ageratum, lucerna, Amaranthus, Anthirrhinum, Aquilegia, padlizsán, répa, begónia, disznóbab, brokkoli, kelbimbó, káposzta, karfiol, zeller, cikória, Chrysanthemum, Cineraria, lóhere, Cosmos, tehénborsó, uborka, ciklámen, dália, Datura, Delphinium, endívia, gerbera, gladiólusz, gloxínia, tök, földimogyoró, Hippeastrum, Impatiens, saláta, dinnye, Mesembryanthemum, hagyma, papaya, borsó, mogyoró, bors, petúnia, ananász, burgonya, primula, Saint Paulia, pórsáfrány, Salpiglossis, futóbab, szójabab, spenót, tök, cukorrépa, napraforgó, Tagetes, dohány, paradicsom, Verbene, Vinca, görögdinnye és Zinnia. A találmány előnyösen olyan, fent felsorolt növényekre vonatkozik, amelyek a genomban találmány szerinti DNS-szerkezetet hordoznak.

Mivel a TSWV a tospovírusok jellemző típusát képviseli, a tospovírusokat a továbbiakban példaként a TSWV alkalmazásával mutatjuk be.

Az S, M és L RNS egyszálú RNS-molekulák. Az S RNS mintegy 2900 nukleotid hosszú és két gént tartalmaz. Az egyik egy nem szerkezeti fehérjét (NSs) kódol vírusértelemben, a másik a nukleotidot beburkoló fehérjét (N) kódolja víruskomplementer értelemben. Az Nss- és az N-gén közötti szakasz hajtűszerkezetté hajtogatható. Az S RNS-5’ és 3’ terminusa egymással hibridizálható, mivel az S RNS-lánc első nukleotidja ellentétes (és komplementer) az utolsó nukleotiddal. A két RNS-vég hibridizálásával kapott, kétszálú szerkezetet a továbbiakban „serpenyőnyéf’-szerkezetnek nevezzük.

Az M RNS mintegy 5000 nukleotidból áll, és egy hosszú, nyílt leolvasókeretet tartalmaz víruskomplementer értelemben. Ez a nyílt leolvasókeret az endoplazmatikus retikulumon elhelyezkedő poliszómákon fordítódik le, ahol a keletkező polipeptidlánc a lefordítással egyidejűleg hasad, és így Gl és G2 tüskefehéijéket képez. Az S RNS-hez hasonlóan az M RNS végei is komplementerek egymáshoz, és hasonlóképpen „serpenyőnyéf’-szerkezetté hibridizálódnak.

Az L RNS mintegy 7500 nukleotidból áll, és egy nyílt leolvasókeretet tartamaz víruskomplementer értelemben. Ez a nyílt leolvasókeret feltehetően azonos a becslések szerint mintegy 260 kd móltömegű vírustranszkriptázt kódoló génnel. Néhány mutáns törzsben a vad típusú, teljes hosszúságú R RNS mellett rövidített láncú L RNS-molekulák is kimutathatók. Ezek a rövid L RNS-molekulák is megőrzik azonban a jellemző terminális nukleotidszekvenciákat, és így képesek a „serpenyŐnyéf’-szerkezet kialakítására. Ezeket szintén bezárja a nukleotid-tokfehérje, és megtalálhatók a vírusrészecskékben. Ezek jelenléte lefékezi a szimptómák kialakulását, és így kevésbé súlyos károsodást okoznak. Ezek a rövidített L RNS-molekulák tehát hiányosan közbeavatkozó (defective interfering, Dl) RNS-molekuláknak tekinthetők.

Előnyös az a találmány szerinti DNS-szerkezet, amely olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után „serpenyőnyél” tospovírus-RNS-szekvenciát vagy ezzel homológ szekvenciát eredményez.

Előnyös továbbá az a találmány szerinti DNS-szerkezet, amely olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után víruskomplementer értelemben (vagyis negatív polaritással) nyílt leolvasókeret-tospovírusRNS-szekvenciát, vagy ennek olyan származékát, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, vagy ennek homológját eredményezi.

Előnyös továbbá az a találmány szerinti DNS-szerkezet, amely olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után hajtű-tospovírus-RNS-szekvenciát vagy ezzel homológ szekvenciát eredményez.

HU 218 417 Β

A fent említett tospovírus-RNS-szekvencia előnyösen legalább 20 nukleotidot, különösen előnyösen legalább 50 nukleotidot tartalmaz.

A találmány értelmében alkalmazható DNS-szerkezetre példaként említhető az olyan TSWV-re vonatkozó DNS-szekvencia, amely a kódok átírása után az alábbi RNS-szekvenciákat eredményezi (hivatkozunk a 4. ábrára az S RNS-nukleotidszekvencia vonatkozásában, a 6A. ábrára az M RNS-nukleotidszekvencia vonatkozásában és a 6B. ábrára az L RNS-nukleotidszekvencia vonatkozásában):

i) 1-2915 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, ii) 89-1483 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, iii) S RNS hajtűszekvenciája iv) S RNS „serpenyőnyél”-szekvenciája,

v) 2763 és 1987 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, vi) 4462 és 1 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, vii) 41 és 2 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, viii) 3980 és 46 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, ix) (6706+n) és (4462+n) közötti L RNS-nukleotidszekvencia, ahol n a 4462 nukleotid (U) és az ezt követő, azonosított nukleotid (C) közötti hiányos szakasz nukleotidjainak száma (6B. ábra),

x) (6706+n) és (6016+n) közötti L RNS-nukleotidszekvencia, ahol n jelentése a fenti, xi) L RNS „serpenyőnyél”-szekvenciája, xii) az 1987 és 2763 közötti S RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xiii) a 89 és 1483 közötti S RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xiv) az 1 és 4462 közötti L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xv) a 2 és 41 közötti L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xvi) a 46 és 3980 közötti L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xvii) a (4462+n) és (6706+n) között L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, ahol n jelentése a fenti, xviii) a (6016+n) és (6706+n) közötti L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, ahol n jelentése a fenti, xix) olyan 89 és 1483 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, xx) olyan 2763 és 1987 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, xxi) olyan 3980 és 236 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, xxii) olyan 4462 és 236 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, xxiii) olyan (6672+n) és (4462+n) között L RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, ahol n jelentése a fenti, xxiv) olyan (6706+n) és (6016+n) közötti L RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, ahol n jelentése a fenti, xxv) (m-574) és m közötti M RNS-nukleotidszekvencia, ahol m jelentése az M RNS össznukleotidjainak száma, xxvi) az (m-574) és m közötti M RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, ahol m jelentése a fenti, xxvii) az i)—xviii), xxv) vagy xxvi) szerinti nukleotidszekvenciával homológ RNS-szekvencia, xxviii) olyan (m-26) és (m-574) közötti M RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, ahol m jelentése a fenti, xxix) az i)-xxviii) szerinti szekvenciák fragmense. Előnyösek azok a TSWV-re vonatkozó DNS-szekvenciák, amelyek a kódok átírása után ii), iii), iv), v), viii), ix) vagy xi) pont szerinti RNS-szekvenciát, ezzel homológ szekvenciát vagy ezek legalább 20 nukleotidot, előnyösen legalább 50 nukleotidot tartalmazó fragmensét eredményezik.

Előnyös, találmány szerinti DNS-szerkezetek továbbá azok a TSWV-re vonatkozó DNS-szekvenciák, amelyek a kódok átírása után 5’ és 3’ végükön egyesített vírus S, M vagy L RNS-t, előnyösen S vagy L RNS-t, elsősorban S RNS-t eredményeznek.

A találmány tárgya továbbá minta növényeknél feltételezett tospovírus-, így TSWV-fertőzés diagnosztizálására, amely a tospovírus, így TSWV RNS-szekvenciával komplementer jelölt oligonukleotid szekvenciát (RNSvagy DNS-szekvenciát) tartalmaz (ahol a komplementer kifejezést a fenti értelmezésben alkalmazzuk). A mintában jelen lévő szekvencia kívánt hossza és a minta diagnosztikai célra történő felhasználása szakember számára ismert. Előnyösen alkalmazható az a minta, amely legalább 15 nukleotidból, előnyösen legalább 30 nukleotidból, különösen előnyösen mintegy 400-600 nukleotidból álló, és a tospovírus, így a TSWV valamely RNSszekvenciájával komplementer szekvenciát tartalmaz.

A találmány szerinti minta előnyösen alkalmazható tospovírus-RNS vagy annak egy részének fertőzött növényi anyagban történő azonosítására, például a betegségnek a szimptómák teljes kifejlődése előtt történő kimutatása céljából.

A találmány tehát kiterjed a tospovírus-fertőzés növényben történő diagnosztizálására, amelynek során a tospovírus replikációs formáit a találmány szerinti mintával detektáljuk egy pont-folt típusú vizsgálatban.

A találmány szerinti minta felhasználható továbbá a tospovírus-RNS-szekvenciának megfelelő DNS-szekvenciát tartalmazó kimér gén előállítására és felhasználására.

A találmány szerinti DNS-szerkezet előállítása során előnyösen úgy járunk el, hogy a TSWV-re vonatkozó DNS-szekvenciát megfelelő kifejezővektorba visszük be, úgy, hogy a kifejezés növényben működőképes promoter által szabályozható, és az átírás terminátor által lezárható legyen.

A megfelelő kifejezővektor kifejezés olyan vektorra vonatkozik, amely növényi sejtben működőképes promotert és terminátort tartalmaz.

HU 218 417 Β

A TSWV-re vonatkozó DNS-szekvenciának a megfelelő kifejezővektorba történő beépítését önmagában ismert módon végezzük. Az előnyösen alkalmazható eljárásokat a példákban mutatjuk be.

Hasonlóképpen, a megfelelő kifejező vektor önmagában módon előállítható.

A találmány szerinti növény előállítása során előnyösen úgy járunk el, hogy

a) növényi sejt genomjába 1. igénypont szerinti DNS-szerkezetet viszünk be,

b) transzformált sejtet állítunk elő,

c) a transzformált sejtből genetikailag transzformáit növényt regenerálunk.

A találmány szerinti DNS-vektor TSWV-fertőzésre érzékeny növények növényi genomjába beépíthető. A növény transzformálását ismert módon végezzük. A növény transzformálása előnyösen megvalósítható az Agrobacterium tumefaciensből, az A. rhizogenesből vagy ezek módosulataiból származó Ti-plazmiddal, csupasz-DNS-transzformálással, vagy izolált növényi sejtek vagy szervek elektroporációjával, DNS szállítására alkalmas mikroeszközökkel, valamint transzformációs vektorként lézerrendszer, liposzóma, vírus vagy virágpor felhasználásával.

A találmány szerinti növényben a TSWV-re vonatkozó DNS-szekvencia kifejeződése ismert módszerekkel, például Northem-analízissel, Southem-analízissel, PCR-technikával és/vagy immunológiai vizsgálattal kimutatható. A találmány szerinti növények csökkentett mértékben érzékenyek a TSWV-fertőzésre, ami különböző vizsgálatokkal kimutatható, amelynek során a növényt TSWV-vel inokuláljuk, előnyösen olyan koncentrációban, ahol a betegség szimptómái lineáris összefüggést mutatnak a vírus koncentrációjával.

A TSWV-vel történő inokulálás ismert módon megvalósítható, amelynek során előnyösen alkalmazható a mechanikai inokulálás és a megfelelő vektorral végzett inokulálás.

A találmány szerinti növények előállíthatók továbbá, ha valamely, találmány szerint előállított növényt más növénnyel keresztezünk úgy, hogy növényi genomjában találmány szerinti DNS-szerkezetet tartalmazó növényt kapjunk.

A találmányt közelebbről az alábbi ábrákkal és példákkal illusztráljuk anélkül, hogy az oltalmi kör az ábrákra vagy példákra korlátozódna.

Az 1. ábra a paradicsom foltoshervadás-vírus szerkezetét mutatja felülnézetben.

A 2. ábra a TSWV S RNS-nél alkalmazható klónozási eljárás vázlatát mutatja.

A 3. ábra a TSWV L RNS-nél alkalmazható klónozási eljárás vázlatát mutatja.

A 4. ábra a TSWV S RNS-szekvenciáját és genomszerkezetét mutatja. Az NSs nemszerkezetifehéije-aminosavszekvenciája (89-1483) a megfelelő RNS-nukleotidszekvencia felett, az N nukleotidtok fehéije-aminosavszekvenciája (2763-1987) a megfelelő RNS-nukleotidszekvencia alatt található.

Az 5. ábra az S RNS (5A. ábra) és az L RNS (5B. ábra) leolvasókereteire vonatkozó transzlációs iniciátor, és terminátorkodonok eloszlását mutatja. Az egész vonal a stopkodont, a fél vonal az ATG startkodont jelöli.

A 6. ábra a TSVW M RNS (6A. ábra) és L RNS (6B. ábra) nukleotidszekvenciáját mutatja a fent részletezett módon.

A 7. ábra megfelelő kifejezővektor (pZU-A) előállításának vázlatos menete.

A 8. ábra megfelelő kifejezővektor (pZU-B) előállításának vázlatos menete.

A 9. ábra az N nukleotidtok fehérjegént tartalmazó, megfelelő plazmid, (pTSWV-N) előállításának vázlatos menete.

A 10. ábra az NSs nukleotidtok fehérjegént tartalmazó, megfelelő plazmid, (pTSWV-NSs) előállításának vázlatos menete.

A 11. ábra a találmány szerinti DNS-szerkezetű pTSWV-NAB vektor növénybe történő transzformálásának vázlatos menete.

A 12. ábra a találmány szerinti DNS-szerkezetű pTSWV-Nmut BB vektor növénybe történő transzformálásának vázlatos menete.

A 13. ábra a találmány szerinti DNS-szerkezetű pTSWV-NSsAB vektor növénybe történő transzformálásának vázlatos menete.

A 14. ábra a találmány szerinti DNS-szerkezetű pTSWV-NSsmut BB vektor növénybe történő transzformálásának vázlatos menete.

A 15. ábra a TSWV S RNS „serpenyőnyél”-szakaszát mutatja.

A 16. ábra a TSWV S RNS haj tűszakaszát mutatja.

A 17. ábra a fertőzésgyanús növény pont-folt analízisét mutatja.

A kódok átírása után az S RNS hajtűszekvenciáját vagy ezzel homológ szekvenciát eredményező, előnyös TSWV-re vonatkozó DNS-szekvenciára példaként említhető az olyan DNS-szekvencia, amely a kódok átírása után az S RNS 1583-1708 nukleotidszekvenciáját, az S RNS 1709-1835 nukleotidszekvenciáját, az S RNS 1583-1835 nukleotidszekvenciáját vagy ezekkel homológ szekvenciát eredményez.

A kódok átírása után S RNS-„serpenyőnyél”-szakaszt vagy ezzel homológ szekvenciát eredményező TSWV-re vonatkozó DNS-szekvenciaként előnyösen alkalmazható az a DNS-szekvencia, amely a kódok átírása után az S RNS 1-70 és 2850-2916 szekvenciáját vagy ezzel homológ szekvenciát eredményez.

A kódok átírása után az L RNS „serpenyőnyél”szakaszát vagy ezzel homológ szekvenciát eredményező TSWV-re vonatkozó DNS-szekvenciára példaként említhető az a DNS-szekvencia, amely a kódok átírása után az L RNS 5’ végének első 80, előnyösen első 65 nukleotidját és az L RNS 3’ végének utolsó 80, előnyösen utolsó 65 nukleoptidját vagy ezzel homológ szekvenciát eredményez.

A találmány további részleteit és előnyös megvalósítási módjait a következő példákban adjuk meg. Az idézett irodalmaknál az első szerző nevét adjuk meg, a teljes irodalmi hivatkozást a példák után soroljuk fel.

HU 218 417 Β

A példákban a TSWV-RNS-származékszekvenciákat az összhang érdekében DNS-szekvenciaként adjuk meg. Szakember számára ez jól értelmezhető, és a megértés egyszerűsítését szolgálja.

A növényi transzformáláshoz alkalmazott Nicotiana tabacum és Petúnia hybrida növényeket standard üvegházi körülmények között termesztjük. A steril növényrészeket megfelelő fitohormonokat és szacharózkoncentrátumot tartalmazó, standard MS-közegen (Murashige és Skoog, 1962) tenyésztjük.

Az E. coli baktériumot forgó edényekben 37 °C hőmérsékleten, standard LB-közegen, az Agrobacterium tumefaciens törzset 0,1 tömeg% glükózzal kiegészített MinA-közegen (Ausubel és munkatársai, 1987) 28 °C hőmérsékleten tenyésztjük.

A klónozáshoz a rekombináns plazmid gazdasejtjeként E. coli JM83 törzset [F-, delta(lac-pro), ara, rpsL, 080, dlacZM15] alkalmazunk.

A binervektorokat Ti plazmid virszakaszt tartalmazó Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 törzshöz (Hoekama és munkatársai, 1983) kapcsoljuk a háromszoros leszármaztatás módszerével, amelyhez segédtörzsként pRK2013 plazmidot tartalmazó E. coli HB101 törzset (Figurski és Helinski, 1979) alkalmazunk. A megfelelő Agrobacterium tumefaciens gazdasejteket 50 pg/ml rifampicint és 50 pg/ml kanamicint tartalmazó közegen szelektáljuk.

A fragmensek pUC 19-vektorba (Yanish-Perron és munkatársai, 1985) pBluescript-vektorba (Stratagene), pBIN 19-vektorba (Bevan és munkatársai, 1984) vagy ezek származékaiba történő klónozását, a DNS-restrikciós enzim analízisét, az E. coli törzs transzformálását, a plazmid-DNS kisméretű és nagyméretű izolálását, a nick-transzlációt, az in vitro átírást, a DNS-szekvenálást, a Southem-foltanalízist és a DNS-gélelektroforézist a szokásos módon (Maniatis és munkatársai, 1982; Ausubel és munkatársai, 1987) végezzük.

1. példa

TSWV-részecskék és ezekben lévő genetikai anyag izolálása

A Brazíliában paradicsomról izolált paradicsom foltoshervadás-vírus CPNH1 törzset paradicsomba történő beoltással tartjuk fenn. A vírust rendszeresen fertőzött Nicotiana rustica-levelekről mechanikai inokulálás (Tas és munkatársai, 1977) után tisztítjuk. Lényeges, hogy az izolálási folyamat során alkalmazott anyagokat 4 °C hőmérsékleten tartsuk: 12 nappal az inokulálás után 100 g fertőzött levelet gyűjtünk be, és egy Waring típusú keverőben 5 térfogatrész extrakciós pufferben (0,1 mol/1 NaH₂PO₄, 0,01 mol/1 Na₂SO₃, pH=7) alacsony ülepedési sebességnél 5-10 másodpercen keresztül őröljük. A szuszpenziót fátyolszöveten leszűrjük, és a szűrletet 10 percen keresztül 16 000 g értéken centrifugáljuk. A kapott pelletet 3 térfogatrész szuszpendáló pufferben (0,01 mol/1 NaH₂PO₄, 0,01 mol/1 Na₂SO₃, pH=7) szuszpendáljuk. A pelletet 4 °C hőmérsékleten óvatosan kevertetve oldjuk. Ezután 10 percen keresztül 12 500 g értéken centrifugáljuk, a pelletet eldobjuk, és a felülúszót további 20 percen keresztül 50 000 g értéken centrifugáljuk. A pelletet 0,2 térfogatrész szuszpenziós pufferben (0,01 mol/1 NaH₂PO₄, 0,01 mol/1 Na₂SO₃, pH=7) szuszpendáljuk, és 30 percen keresztül jégen tároljuk. Fertőzésmentes Nicotiana rustica-val nyúlban indukált antiszérumot adunk az oldathoz, 1 órán keresztül óvatosan kevertetjük, majd a nemvírus komplexet 10 percen keresztül 16 000 g értéken centrifugálva kicsapjuk. A tiszta felülúszót szuszpenziós pufferben (0,01 mol/1 NaH₂PO₄, 0,01 mol/1 Na₂SO₃, pH=7) felvett, 5-40 tömeg% lineáris szacharózgradiensre visszük, és 45 percen keresztül 95 000 g értéken centrifugáljuk. A TSWV-vírust tartalmazó opálos sávot óvatosan egy fecskendővel összegyűjtjük, és négyszeres térfogatú szuszpenziós pufferrel hígítjuk. Mosás után 1,5 órán keresztül 21 000 g értéken centrifugálva ülepítjük, majd 1 térfogatrész szuszpenziós pufferben szuszpendáljuk. 100 g növényi anyagból általában 0,5 mg TSWV-vírust kapunk. A TSWV-RNS-t a tisztított víruskészítményből előnyösen SDS fenolextrakcióval tárjuk fel, majd etanollal kicsapjuk. 1 mg TSWV-ből 1-5 pg RNS extrahálható. Az izolált RNSmolekulák épségét agarózgélen végzett elektroforézissel ellenőrizzük. Három különálló RNS-molekulát tudunk azonosítani 2900 nukleotid (S RNS), 5000 nukleotid (M RNS) és 7500 nukleotid (L RNS) látszólagos méretnél.

2. példa

A TSWV-vírus RNS 3 ’ végének szekvenálása A közvetlen RNS-szekvenáláshoz a tisztított nukleotidtokból TSWV-RNS-t extrahálunk (Verkleij és munkatársai, 1983). 12 nappal az inokulálás után 100 g fertőzött levelet begyűjtünk, és 4 térfogatrész TAS-E pufferben (0,01 mol/1 EDTA, 0,01 mol/1 Na₂SO₃,0,1 tömeg⁰/» cisztein, 0,1 mol/1 trisz, pH = 8,0) Waring-keverőben, 5-10 másodpercen keresztül, alacsony ülepedési sebesség mellett a szuszpenziót fátyolszöveten szűrjük, és 10 percen keresztül 1100 g értéken centrifugáljuk. A nukleotidtokot a felülúszóból 30 percen keresztül 66 000 g értéken végzett centrifugálással izoláljuk. A pelletet óvatosan 1 térfogatrész TAS-R pufferben (1 tömeg% Nonidet NP-40, 0,01 mol/1 EDTA, 0,01 mol/1 Na₂SO₃, 0,1 tömeg% cisztein, 0,01 mol/1 glicin, 0,01 mol/1 trisz, pH=7,9) szuszpendáljuk. A pelletet 4 °C hőmérsékleten óvatosan 30 percen keresztül kevertetve oldjuk. A felülúszót 10 percen keresztül 16 000 g értéken centrifugáljuk. A nyers nukleotidtokot a tiszta felülúszóból 30 tömeg% szacharózbetéten 1 órán keresztül 105 000 g értéken végzett centrifugálással ülepítjük. A nukleotidtok pelletet 400 pl 0,01 mol/1 nátrium-citrát-oldatban (pH=6,5), 20-40 tömeg% szacharózoldatra (0,01 mol/1 nátrium-citrátban felvéve, pH=6,5) rétegezve szuszpendáljuk, és 2 órán keresztül 280 000 g értéken centrifugáljuk. A három különböző opálos sávot, amely az L, M és S nukleotidtoknak felel meg, külön-külön összegyűjtjük. A TSWV-RNS-t előnyösen a tisztított nukleotidtok-készítményből SDS fenolextrakcióval tárjuk fel, és etanollal kicsapjuk. Általában 100 pg RNS állítható elő 100 g fertőzött levélből. A külön-külön kinyert TSWV-RNS-ek 3’ végét RNS7

HU 218 417 Β ligázzal és 5’-(³²P)pCP segítségével megjelöljük. A végén megjelölt RNS-molekulákat alacsony olvadáspontú agarózgélen (Wieslander, 1979) elválasztjuk. Az S és M RNS 3’ és 5’ végén található 30 terminális nukleotidot enzimes módszerrel (Clerx-Van Haaster és Bishop, 1980; Clerx-Van Haaster és munkatársai, 1982) határozzuk meg.

A 3’ véggel komplementer szintetikus oligonukleotidot állítunk elő szokásos módszerrel (Applied Biosystems), és reverz transzkriptázzal didezoximódszerrel szekvenáljuk.

3. példa

A TSWVgenetikai anyag cDNS-klónozása

Az S és L RNS 3’ végével komplementer oligonukleotidokat alkalmazunk az első szál cDNS-szintézisének megindításához. Ezekkel a primerekkel a TSWVRNS-re vonatkozó kettős szálú DNS-t szintetizálunk (Gubler és Hoffman, 1983). A TSWV-RNS-molekulák cDNS-klónjainak előállításához két különböző eljárást alkalmazunk. Az első klónsorozatban véletlenszerűen indítjuk a TSWV-RNS-t fragmentált egyszálú borjútímusz-DNS segítségével, majd egy első és egy második cDNS-szálat szintetizálunk. A cDNS-t T4 DNSpolimeráz segítségével tompa végűvé alakítjuk, és T4 ligázzal a pUC19 plazmid Smal helyére ligáljuk. A TSWV-cDNS-klónok második sorozatát úgy állítjuk elő, hogy a TSWV-RNS-molekulák 3’ végi 20 terminális nukleotidjával komplementer oligonukleotidokkal egyszálú DNS-szintézisét indítjuk meg. Ezután előállítjuk a második szálat, majd T4 DNS-polimerázzal tompa végűvé alakítjuk, és a cDSN végéhez foszforilezett EcoRI-linkert ligálunk (Huynh és munkatársai, 1985). Ezeket a cDNS-molekulákat EcoRI-gyel hasítva, a cDNS-ffagmenseket lambda gtlO EcoRI helyére ligáljuk. A vírusos inszertet tartalmazó mindkét sorozatbeli cDNS-klónokat mintaként ³²P-vel jelölt, véletlenszerűen indított, egyszálú cDNS-t alkalmazva telephibridizálással (Grunstein és Hogness, 1975) szelektáljuk. Az átfedő cDNS-klónokat Southem-analízissel szelektáljuk, majd plazmiddal és/vagy fággal kapcsolva az S RNS-ből (2. ábra) és az L RNS-ből (3. ábra) származó cDNS-szekvencia alapján megszerkesztjük a restrikciós térképeket.

4. példa

TSWV S, M és L RNS-szekvenálása

Az S RNS-szekvenciájának meghatározásához négy szelektált cDNS-klónt M13mpl8-ba szubklónozunk, és pS614, pS608, pS520 és pS514 plazmidokat kapunk (lásd fent és 2. ábra). Ezeket a kiónokat mindkét irányból szokásos módon szekvenáljuk (Yanish, Perron és munkatársai, 1985). Az S RNS 3’ végének nukleotidszekvenciáját az Sl szintetikus oligonukleotid [5’ d(GAGCAATCGTGTCAATTTTG)] primer meghosszabbításával határozzuk meg, amely komplementer a 3’ vég 20 nukleotidjával. Egy másik S3 szintetikus oligonukleotidot, amely komplementer a vírus S RNS 5’ végének 30-50 nukleotidjával, használunk az S RNS 5’ terminális szekvenciájának primer meghosszabbítással történő meghatározásához. A TSWV S RNS (2916 nt) szekvenciaadatait a 4. ábrán adjuk meg.

A vírusszálon és a vírussal komplementer szálon lévő hat különböző leolvasókeret komputerrel szimulált transzlációja két feltételezett nyílt leolvasókeret jelenlétére utal (lásd 5A. ábra). A vírusszálon egy nyílt leolvasókeret található, amely a 89 pozícióban indul, és az 1483 pozícióban található UAA stopkodonnál végződik, és amely feltehetően 52,4 kd móltömegű és 464 aminosavból álló fehérjét kódol. Ez a fehérje nagy valószínűséggel valamely nemszerkezeti fehérje, és próbaképpen az NSs jelet kapja. A másik nyílt leolvasókeret a víruskomplementer szálon a 2763-1987 pozícióban helyezkedik el, és 28,8 kd móltömegű és 258 aminosavból álló polipeptidet kódol. Ez a nyílt leolvasókeret feltehetően az N vírus nukleotidtok-fehérjét kódolja.

A feltételezés igazolására meghatározzuk a tisztított nukleotidtok-fehérje aminosav-összetételét, és összehasonlítjuk a szekvenciaadatokból levezethető összetétellel. Emellett a feltételezett N nukleotidtok-fehérjét kódoló gént pBluescript-plazmidba építjük be. T7 RNS-polimeráz segítségével az N fehérjegént in vitro körülmények között átírjuk. Ezt az in vitro szintetizált átírást ezután egy in vitro nyúlretikulocita-lizátumba (New England Nuclear, NEN) fordítjuk le [³⁵S] jelölésű metionin (NEN) jelenlétében. A szintetizált radioaktív fehérjék közül kicsapható egy olyan fehérje, amelynek móltömege azonos a természetes nukleotidtok-fehérje móltömegével. A kicsapást tisztított nukleotidtok-fehérjével szemben termelt antitesttel végezzük (Van Grinsven és munkatársai, 1986). Ez arra utal, hogy az N fehérjegén a vírus-nukleotidtok fehérjéjét kódolja. Az 5A. ábra a vírus és a víruskomplementer szál S RNS-kódolókapacitását mutatja, külön megjelölve az NSs és az N fehérjegént, ahol mindkét gént szubgenomiális M RNS-molekulák fejeznek ki. így az a különleges helyzet állt elő, hogy egy növényi vírus-RNS kétirányú génelrendeződést mutat. Az S RNS-szekvencia másik fontos jellemzője a komplementer terminális ismétlődő részek jelenléte, ami lehetővé teszi az úgynevezett „serpenyőnyéf’-szerkezet kialakítását. Ez a szerkezet fontos szerepet játszik a vírus RNS-replikálásában és -átírásában. Egy másik feltételezett szabályozóelem az S RNS intergén szakaszában található hajtűszerkezet, amely az N és Nss fehérjéket kódoló mindkét szubgenomiális M RNS vonatkozásában tartalmazza a transzkripciós terminátorszignálokat.

A TSWV M és L RNS-nukleotidszekvenciáját az S RNS-nukleotidszekvenciájának meghatározásával azonos módon és eljárással határozzuk meg. A 3. ábra mutatja az L RNS-ből származó átfedő cDNS-klónok klónozási eljárását. A TSWV M és L RNS-szekvencia adatait a 6A. és 6B. ábra mutatja. A komputerrel szimulált transzláció szerint ez a vírus L RNS negatív polaritású, és egy nyílt leolvasókeretet tartalmaz, amely a vírus RNS 3’ végétől számított 34. nukleotidnál indul, és a vírus 5’ végétől számított 236. nukleotidnál végződik (5B. ábra). A fenti nyílt leolvasókeretet tartalmazó

HU 218 417 Β mRNS (amely komplementer a vírus L RNS-hez) feltehetően vírustranszkriptázzá fordítódik le.

5. példa pZU-A kifejezővektor előállítása A 35S karfiol-mozaikvírus (CaMV) promoter fragmenst a rekombináns pZO27 plazmidból izoláljuk, amely a pUC19 származéka, 444 bp HindlII-PstI fragmensként a CaMV Cabb-S törzsből (Franck és munkatársai, 1980) származó 35S promoter HindlII-Hphl sza- 10 kaszát hordozza. A különböző CaMV törzsek nukleotidszekvenciája nagyon hasonló. A 35S promoter fragmenst a pZO27 plazmidból egy 472 bp EcoRI-PstI fragmens formájában vágjuk ki, amely tartalmazza a polilinker szakasz egy részét, a 437 bp nem átírt szakaszt, a transzkripciós iniciátor helyett a 7 bp nem lefordított leaderszakaszt, de nem tartalmaz 35S transzlációs 5 iniciátort. Ezt a 35S promoter fragmenst T4 ligáz segítségével EcoRl-Pstl-gyel linearizált pZ0008 plazmidba ligáljuk. Ez a pZO008 plazmid egy 270 bp PstI-Hindlll fragmensként nopalin-szintáz (NOS) terminátort hordoz. A kapott pZU-A rekombináns plazmid hordozza a 35S promotert, az egyetlen PstI helyet és a NOS terminátort (7. ábra). A pZU-A növényi kifejezővektorban alkalmazott 35S promoter szekvenciája a következő:

101

151

201

251

301

351

401

AAGCTTCTAG

CCAAGAATAT

TTTCAACAAA

TATCTGTCAC

AATGCCATCA

GACAGTGGTC

AGAAGACGTT

CCACTGACGT

TCCTCTATAT

AGATCCGTCA

CAAAGATACA

GGGTAATATC

TTCATCAAAA

TTGCGATAAA

CCAAAGATGG

CCAACCACGT

AAGGGATGAC

AAGGAAGTTC

ACATGGTGGA

GTCTCAGAAG

CGGAAACCTC

GGACAGTAGA

GGAAAGGCTA

ACCCCCACCC

CTTCAAAGCA

GCACAATCCC

ATTTCATTGG

GCACGACACT

ACCAAAGGGC

CTCGGATTCC

AAAGGAAGGT

TCGTTCAAGA

ACGAGGAGCA

AGTGGATTGA

ACTATCCTTC

AGAGGACCCT

CTCGTCTACT

TATTGAGACT

ATTGCCCAGC

GGCACCTACA

TGCCTCTGCC

TCGTGGAAAA

TGTGATATCT

GCAAGACCCT

GCAG

A pZU-A vektorban alkalmazott NOS terminátor 25 teljes szekvenciája a következő:

101

151

201

251

CTGCAGATCG TTCAAACATT TGGCAATAAA GTTTCTTAAG ATTGAATCCT GTTGCCGGTC TTGCGATGAT TATCATATAA TTTCTGTTGA ATTACGTTAA GCATGTAATA ATTAACATGT AATGCATGAC GTTATTTATG AGATGGGTTT TTATGATTAG AGTCCCGCAA TTATACATTT AATACGCGAT AGAAAACAAA ATATAGCGCG CAACCTAGGA TAAATTATCG CGCGCGGTGT CATCTATGTT ACTAGATCTC TAGAAAGCTT

6. példa pZU-B kifejezővektor előállítása A pZO347 rekombináns plazmid egy pBluescriptszármazék, amely a CaMV Cabb-S törzs 426 bp 35S promoter fragmensét (HincII-fragmens) tartalmazó 496 bp BamHI-Smal fragmenst hordoz. Ezt a plazmidot dohány-mozaikvírus le nem fordított leaderszakaszának 67 bp fragmenséhez, az úgynevezett ómegaszakaszhoz kapcsoljuk. így egy kimér promotert kapunk, amely a CaMV promoter és a TMV le nem fordított leaderszakasz teljes transzkripciós fúzióját tártál- 45 mázzá. In vitro mutációval a TMV ATG startkodon eredeti pozícióját Smal helyre változtatjuk.

A pZO008 plazmid nopalin-szintáz (NOS) terminátort hordoz egy 260 bp Pstl-HindlII fragmens formájában. A Pstl-HindlII fragmenst kihasítjuk a pZO008 plazmidból, és T4 ligáz segítségével Pstl-HindlII enzimmel linearizált pZO347 rekombináns plazmidba ligáljuk. A kapott pZU-B rekombináns plazmid egy másik növényi kifejezővektor. A pZU-B növényi kifejezővektorban alkalmazott 35S ómega promoter szekvenciája a következő:

101

151

201

251

301

351

401

GGATCCGGAA CATGGTGGAG CACGACACGC TTGTCTACTC CAAAAATATC AAAGATACAG TCTCAGAAGA CCAAAGGGCA ATTGAGACTT TTCAACAAAG TTATTGTGAA GATAGTGGAA AAGGAAGGTG GCTCCTACAA ATGCCATCAT TGCGATAAAG GAAAGGCCAT CGTTGAAGAT GCCTCTGCCG ACAGTGGTCC CAAAGATGGA CCCCCACCCA CGAGGAGCAT CGTGGAAAAA GAAGACGTTC CAACCACGTC TTCAAAGCAA GTGGATTGAT GTGATATCTC CACTGACGTA AGGGATGACG CACAATCCCA CTATCCTTCG CAAGACCCTT CCTCTATATA AGGAAGTTCA TTTCATTTGG AGAGGACTTT TTACAACAAT TACCAACAAC AACAAACAAC AAACAACATT ACAATTACTA TTTACAATTA CCCGGG.

A kapott pZU-B rekombináns plazmid 35S HincII-TMV ómegafúziót (35S-ómega), egyetlen Smal és PstI helyet és NOS terminátort tartalmaz (8. ábra). Ez a kifejező vektor előnyösen alkalmazható a 35S ómega kimér promotertől lefelé elhelyezkedő kife60 jezendő gén transzlációs fúziójához.

HU 218 417 Β

7. példa

A TSWV-Nfehérjegén szubklónozása A TSWV-N fehérjekódoló szekvenciát a pS614 és pS520 cDNS-klónok fúziójával kapjuk (2. ábra). A pS520 cDNS-klónt EcoRI és HindlII enzimmel hasítjuk, és a TSWV-N fehérjegén 3’ végét tartalmazó fragmenst elektroforetikusan elválasztjuk, és a gélről DEAE membránnal (NA-45, Schleicher és Schüll) tisztítjuk, majd EcoRI és HindlII enzimmel linearizált pBluescript-plazmidba (Stratagene) klónozzuk, így pS520E/H rekombináns plazmidot kapunk. A pS614 cDNS-klónból EcoRI enzimmel kihasítjuk a TSWV-N fehérje 5’ végét tartalmazó fragmenst. Ezt a fragmenst elektroforetikusan elválasztjuk, és a gélről DEAE membránnal (NA-45, Schleicher és Schüll) tisztítjuk, majd EcoRI enzimmel linearizált pS520E/H plazmidba klónozzuk, így pTSWV-N3 rekombináns plazmidot kapunk. A TSWV-N gént tartalmazó pTSWV-N3 plazmidot PvuII enzimmel linearizáljuk. A linearizált DNS tompa végéhez T4 ligázzal 5’ d(CCTGCAGG) PstI linkért ligálunk. Ezután a DNS-t PstI enzimmel emésztjük, és a TSWV-N fehérjeszekvenciát tartalmazó fragmenst elektroforetikusan elválasztjuk, és a gélről lehasítjuk. A TSWV-N fehérjegént tartalmazó fragmenst PstI enzimmel linearizált vektorba, így pBluescript-vektorba (Stratagene) ligáljuk, és így pTSWV-N rekombináns plazmidot (9. ábra) kapunk. Az így kialakított restrikciós helyek elősegítik további plazmidok előállítását. (Alternatív módon eljárhatunk úgy is, hogy a restrikciós helyeket helyspecifikus mutációval vagy más szintetikus oligonukleotid linkerrel történő ligálással alakítjuk ki. Ezek a módszerek szakember számára ismertek.)

8. példa

A TSWV S RNS-TSWV nemszerkezeti fehérje génjének (NSs gén) szubklónozása Az NSs nemszerkezeti fehérje szekvenciáját a pS514 cDNS-klónból izoláljuk. Az NSs fehérjegén az EcoRI fragmensben helyezkedik el. A pS514 cDNSklónt EcoRI enzimmel hasítjuk, majd T4 DNS-polimerázzal kezelve tompa véget alakítunk ki. Az NSs gént tartalmazó fragmenst agarózgélen elektroforetikusan elválasztjuk, és a gélről lehasítjuk. Az NSs fehérjegént tartalmazó, tompa végű fragmenshez T4 polimerázzal szintetikus PstI linkért [5’ d(CCTGCAGG)-3’] kapcsolunk. PstI enzimmel végzett hasítás után az NSs fehérjegént tartalmazó fragmenst PstI enzimmel linearizált pBluescript-plazmidba ligáljuk, és így pTSWV-NSs rekombináns plazmidot (10. ábra) kapunk.

9. példa

TSWV-szekvenciát tartalmazó növényi transzformációs vektor előállítása

9A. példa

Nfehérjegén-szerkezet pZU—A plazmidban 35S promoter által szabályozott és NOS terminátor által lezárt N fehérjegént tartalmazó növényi transzformációs vektor előállításához izoláljuk a pTSWV-N plazmid PstI fragmensét, és PstI enzimmel linearizált pZU-A plazmidba visszük be. így pTSWV-NA kimér gén kazettavektort kapunk. A 35S promotert, az N fehérjegént és a NOS terminátort tartalmazó kazettát Xbal enzimmel kihasítjuk a pTSWV-NA vektorból, és a pBIN19 biner transzformációs vektor (Bevan és munkatársai, 1984) egyetlen Xbal helyére ligáljuk. A kapott pTSWV-NAB plazmid (11. ábra) önmagában ismert módon növény transzformálására felhasználható.

9B. példa

N fehérjeszerkezet pZU-B plazmidban

Egy olyan fúzió előállításához, amelyben az N fehérjegén ATG startkodonja közvetlenül az 35S ómega promoter TMV le nem fordított leaderjének 3’ végéhez kapcsolódik, mutáljuk az N gén startkodonját. Helyspecifikus mutációval a pTSWV-N plazmid 5’ d(ACGATCATCATGTCT) szekvenciáját 5’ d(ACGATATCATGTCT) szekvenciává mutáljuk, és így egy 5’ d(GATATC) EcoRV hasítóhelyet alakítunk ki közvetlen az N gén ATG startkodonja előtt. A kapott rekombináns plazmid a pTSWV-Nmut jelet kapta. A mutált N fehérjegént EcoRV és PstI enzimmel végzett emésztéssel kihasítjuk a plazmidból. A fragmenst izoláljuk, és Smal és PstI enzimmel linearizált pZU-B plazmidba építjük be: pTSWV-NmutB rekombináns plazmidot kapunk. A 35S ómega promotert, a mutált N gént és a NOS terminátort tartalmazó kimérkazettát BamHI és Xbal enzimmel végzett emésztéssel kihasítjuk a pTSWV-NmutB plazmidból. Az izolált kimér gén kazettát BamHI és Xbal enzimmel linearizált pBIN19 plazmidba építjük be, és így pTSWV-NmutBB biner transzformációs vektort (12. ábra) kapunk, amely önmagában ismert módon növény transzformálásához felhasználható.

9C. példa

NSs fehérjegén-szerkezet pZU-A plazmidban 35S promoter által szabályozott és NOS terminátor által lezárt NSs fehéijegént tartalmazó növényi transzformációs vektor előállításához izoláljuk a pTSWV-NSs plazmid PstI fragmensét, és PstI enzimmel linearizált pZU-B plazmidba visszük be, amelynek során pTSWV-NsA kimér kazettavektort kapunk. A 35S promotert, az NSs fehérjegént és a NOS terminátort tartalmazó kazettát EcoRI és Xbal enzimmel végzett emésztéssel kihasítjuk a pTSWV-NsA plazmidból, és EcoRI és Xbal enzimmel linearizált pBIN19 plazmidba ligáljuk· A kapott pTSWV-NsAB plazmid (13. ábra) önmagában ismert módon növények transzformálásához alkalmazható.

9D. példa

NSs fehérje-génszerkezet pZU-B plazmidban Egy olyan fúzió előállításához, amelyben az NSs fehérje ATG startkodonja közvetlenül a 35S ómega promoter TMV leaderszekvenciájának 3’ végéhez kapcsolódik, mutáljuk az NSs gén startkodonját. Helyspecifikus mutációval ismert módon az 5’ d(AACCATAATGTCT) szekvenciát 5’ d(AACCATATGTCT) szek10

HU 218 417 Β venciává mutáljuk, és így az 5’ d(CATATG) szakaszon egy olyan Ndel helyet alakítunk ki, amely tartalmazza az NSs fehérjegén ATG startkodonját. A kapott plazmid a pTSWV-NSsmut jelet kapja. Ezt a plazmidot Ndel enzimmel linearizáljuk, majd T4 DNS-polimerázzal végeket alakítunk ki. A linearizált DNS-t PstI enzimmel emésztjük, és a mutált NSs gént tartalmazó fragmenst izoláljuk és Smal és PstI enzimmel linearizált pZU-B plazmidba visszük be, amelynek során pTSWV-NSsmutB rekombináns plazmidot kapunk.

A 35S ómega promotert, a mutált NSs fehéijegént és NOS terminátort tartalmazó kimérkazettát BamHI és Xbal enzimmel végzett emésztéssel lehasítjuk a pTSWV-NSsmutB plazmidból. Az izolált kimér génkazettát BamHI és Xbal enzimmel linearizált

AGAGCAATTG TGTCAGAATT TTGTTCATAA TCAAACCTCA CTTAGAAAAT 51 CACAATACTG TAATAAGAAC és

2850 GTTCTTAATG TGATGATTTG TAAGACTGAG TGTTAAGGTA TGAACACAAA 2900 ATTGACACGA TTGCTCT

Egy DNS-analizáló programmal meghatározzuk a a vírus L RNS 3’ végének utolsó 80 nukleotidját tartal„serpenyőnyél”-hurok elhelyezkedését a vírus TSWV mázzá. A vírus L RNS-ben lévő fenti „serpenyőnyél”L RNS-ben. A detektált, erős „serpenyőnyél”-hurok a 25 hurkot az alábbi DNS-szekvencia tartalmazza: vírus L RNS 5’ végének (1-80) első 80 nukleotidját és

AGAGCAATCA GGTACAACTA AAACATATAA CCTCTCCACA GCCAGACTTT 51 ACAAATTACA TAAGAATTCC CTCCAGTGAA és

AAAGTGGTTC CATTTTCTAT TAATTTTTGT ATTTTCTGGA TGTTCATGTT TGCTTAAAAT CGTTGTTACC TGATTGCTCT pBIN19 plazmidba visszük be, és így pTSWV-NSsmutBB biner transzformációs vektort (14. ábra) kapunk, amely önmagában ismert módon növények transzformálásához felhasználható.

9E. példa

5’ és 3’ terminális „serpenyőnyél”-szerkezet pZU-A és pZU-B plazmidban Egy DNS-analizáló programmal azonosítjuk a „ser10 penyőnyéf’-hurkot a TSWV S RNS-ben. A detektált erősebb „serpenyőnyél”-hurok tartalmazza a vírus S RNS 5’ végének (1-70) első 70 nukleotidját, és a vírus S RNS 3’ végének (2850-2916) utolsó 67 nukleotidját (15. ábra). A vírus S RNS fenti „serpenyőnyél”15 hurokját az alábbi DNS-szekvencia tartalmazza:

Ezeket a szakaszokat szokásos DNS-szintetizátorban szintetizáljuk, és megfelelő linkerszekvenciákkal kapcsoljuk. Az előállított S és L RNS „serpenyőnyél”vektor a pTSWV-termS és pTSWV-termL jelet kapja. Megfelelő restrikciósenzim-kombinációk alkalmazásával ezeket a fragmenseket beépítjük a pZU-A plazmidban található CaMV 35S promoter és a NOS terminátor közé, vagy a pZU-B plazmidban található 35S ómega promoter és NOS terminátor közé. így pTSWV-termSA, pTSWV-termLA, pTSWV-termSB és pTSWV-termLB kimérkazettákat kapunk. Ezeket a kazettákat megfelelő enzimkombinációkkal beépítjük a pBIN19 biner transzformációs vektorba, és így pTSWV-termSAB, pTSWV-termLAB, pTSWV-termSBB és pTSWV-termLBB plazmidokat kapunk. Lehetőség van olyan, 3’ és 5’ végeket tartalmazó „serpenyőnyéf’-szerkezet előállítására is, amely nagyobb, mint a fent ismertetett szerkezet, vagy a rekombináns gének által növényben termelt kópiák stabilitásának növelésére további DNS-szekvenciákkal van szétválasztva. Valamennyi „serpenyőnyéf’-szerkezet megközelíti a rövidített tospovírus-RNS-t, a TSWV R RNS-molekulákat, és így hiányosan közbeavatkozó RNS-nek minősülnek.

9F. példa

TSfVV S RNS-hajtűszerkezet pZU-A és pZU-B plazmidban

Egy DNS-analizáló programmal meghatározzuk a hajtűhurok elhelyezkedését a vírus-TSWV S RNS-ben. A detektált, erős hurok az 1592 nukleotidnál indul, és az 1834 nukleotidnál fejeződik be (16. ábra). Ezt a hajtűhurkot az alábbi szekvencia tartalmazza:

TAGTAGAAAC 51 AAATAAAATC 101 AACCAAAAAG 151 TTGTTTTTTG 201 TATTTTTATT

251 TTA

CATAAAAACA

AAAAAATGAA

ACCCGAAAGG

TTTTTTGTTT

TTATTTTTAT

AAAAATAAAA

ATAAAAACAA

GACCAATTTG

TTTATTTTTT

TTTATTTATT

ATGAAAATAA

CAAAAAATTA

GCCAAATTTG

ATTTTATTTT

TTTTGTTTTC

AATTAAAATA

AAAAACGAAA

GGTTTTGTTT

TATTTTATTT

GTTGTTTTTG

A pS514 plazmidból HindlII enzimmel 526 bp méretű és a fenti hajtűszakaszt hordozó fragmenst izolá- θθ lünk. Ezt a fragmenst lehasítjuk az agarózgélről, majd T4 polimeráz segítségével tompa végeket alakítunk ki.

HU 218 417 Β

Ezután Pstl linkereket Egálunk a tompa végekhez, majd Pstl enzimmel emésztjük, és Pstl enzimmel linearizált pZU-A plazmidba klónozzuk. így pTSWV-HpSA rekombináns plazmidot kapunk. Ezt HindlII enzimmel emésztjük, és a kimérgént tartalmazó fragmenst lehasítjuk az agarózgélről, majd HindlII enzimmel linearizált pBIN19 plazmidba ligáljuk. így pTSWV-HpSAB transzformációs vektort kapunk.

Eljárhatunk úgy is, hogy a pS514 plazmid HindlII ffagmensét T4 DNS-polimerázzal kezelve tompa végeket alakítunk ki, majd a pZU-B kifejezővektor Smal helyére klónozzuk. így pTSWV-HpSB rekombináns plazmidot kapunk. Ezt HindlII enzimmel emésztjük, a kimérgént tartalmazó fragmenst lehasítjuk az agarózgélről, és Xbal enzimmel linearizált pBIN19 plazmidba ligáljuk. így pTSWV-HpSBB transzformációs vektort kapunk.

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a hajtúszakaszt tartalmazó TSWV S RNS DNS-kiónjaiból további fragmensek izolálhatok, illetve a hajtűszakasz DNSszintetizátorban is előállítható.

10. példa

Biner vektor transzformálása növényi anyagba

A biner vektorokat ismert módon visszük be a növényi anyagba. A megvalósítási mód körülményeit például az alkalmazott Agrobacterium törzs, a növényi anyag eredete, valamint a tenyésztés és a növényfajta által meghatározott regenerációs rendszer határozza meg.

A fent ismertetett biner növényi transzformációs vektorokat például az alábbi eljárással transzformáljuk. A kapott biner vektort háromszülős leszármaztatással Agrobacterium tumefaciens akceptortörzsbe transzformáljuk, a transzformálás eredményét Southem-analízissel ellenőrizzük, a steril növényi anyagot Agrobacterium tumefaciens törzzsel inokuláljuk és tenyésztjük, az Agrobacterium tumefaciens törzset megfelelő antibiotikummal szelektíven elpusztítjuk, a transzformált sejteket kanamicint tartalmazó szelektív közegen történő tenyésztéssel szelektáljuk, a szövetet sarjadzást elősegítő közegre visszük, a szelektált hajtásokat gyökeresedést elősegítő közegre visszük, a növénykéket talajba elültetjük, a transzgén növénytől vett összes DNS Southem-analízisével ellenőrizzük a szerkezet épségét, Northem-analízissel ellenőrizzük a beépített kimérgén megfelelő funkcióját és/vagy enzimvizsgálattal vagy Westem-foltanalízissel ellenőrizzük a fehérje megfelelő funkcióját.

11. példa

TSWV-RNS-szekvenciák kifejezése növényi sejtekben

Regenerált növények leveléből RNS-t extrahálunk az alábbi eljárással:

200 mg növényi levelet folyékony nitrogénben finom porrá őriünk. Hozzáadunk 800 μΐ RNS-extrakciós puffért [100 mmol/1 trisz-HCl (pH=8,0), 500 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 EDTA, 200 mmol/1 béta-merkaptoetanol és 0,4 tömeg% SDS], és a homogenizátumot fenollal extraháljuk. A nukleinsavat alkohollal kicsapjuk.

Ezután 0,5 ml 10 mmol/1 trisz-HCl (pH = 8,0) és mmol/1 EDTA-elegyben szuszpendáljuk, 2 mol/1 végső koncentrációig lítium-kloridot adunk hozzá, és órán keresztül jégen tartjuk. Ezután az RNS-t centrifugálással összegyűjtjük, 400 pl 10 mmol/1 trisz-HCl (pH=8,0) és 1 mmol/1 EDTA-elegyben szuszpendáljuk, alkohollal kicsapjuk, 50 μΐ 10 mmol/1 trisz-HCl (pH=8,0) és 1 mmol/1 EDTA-elegyben szuszpendáljuk. Ezután glioxál/agarózgélen elválasztjuk, és Genescreen-módszerrel (Grinsven és munkatársai, 1986) analizáljuk. A TSWV vírus-RNS-t ³²P-vel és 35S-sel jelölt DNS- vagy RNS-mintákkal vagy más, nem radioaktív jelölésű módszerrel detektáljuk. Northem-analízissel ellenőrizzük, hogy a regenerált növény milyen mértékben fejezi ki a kimér TSWV-gént.

A TSWV-fehérjegént tartalmazó kimérszerkezettel transzformált növényeken Westem-foltanalízist is végzünk. A transzformált növények leveléből a fehérjét őrléssel pufferben (Laemmli, 1970) extraháljuk. 50 pg fehérjén elektroforézisvizsgálatot végzünk 12,5 tömeg% SDS poliakrilamid gélen (Laemmli, 1970). Az elválasztott fehérjéket elektroforetikusan nitrocellulózra visszük (Towbin és munkatársai, 1979). Az átvitt fehérjéket tisztított TSWV-nukleotidtokkal szemben képzett antiszérummal reagáltatjuk (Towbin és munkatársai, 1979). A Westem-analízis eredménye egyértelműen igazolja, hogy a transzformált növény tartalmazza a beépített kimérgén által kódolt TSWVfehérjét.

12. példa

Növényrezisztencia TSWV-fertőzéssel szemben

A transzformált növényeket üvegházban termesztjük standard karantén körülmények között a patogénfertőzés megelőzésre érdekében. A transzformált növényeken önbeporzást végzünk, és a magokat begyűjtjük. Az utódnövényeken analizáljuk a beépített gén kiválasztódását, és mechanikai inokulációval TSWV-vei fertőzzük. A TSWV-vel rendszeresen fertőzött növények szövetét 5 térfogatrész jéghideg inokulációs pufferben (10 mmol/1 foszfátpuffer és 1 tömeg% Na₂SO₃) őröljük, és szilícium-karbid-por jelenlétében a mintegy hetes hajtások első két, teljesen kifejlett levelére dörzsöljük. Az inokulált növényeket 3 héten keresztül vizsgáljuk.

A TSWV-re vonatkozó DNS-szekvenciát tartalmazó növények kevésbé érzékenyek a TSWV-fertőzésre, mivel a szimptómák később fejlődnek ki, míg a transzformálatlan kontrollnövények súlyos TSWV-szimptómákat mutatnak az inokulálástól számított 7 napon belül.

13. példa

Szintetikus oligonukleotidek alkalmazása diagnosztikai célból

A fertőzésgyanús növények leveléből RNS-t extrahálunk az alábbi eljárással:

g levélanyagot, előnyösen a betegség szimptómáit mutató levélből 3 ml 100 mmol/1 trisz-HCl, 50 mmol/1

HU 218 417 Β

EDTA, 1,5 mol/1 NaCl és 2 tömeg% CTAT (pH=8,0) elegyben őrölünk. Ezután 1 ml homogenizátumot kloroformmal extrahálunk, és 65 °C hőmérsékleten 10 percen keresztül inkubáljuk. A szervetlen fázist összegyűjtjük, és fenol/kloroform 1:1 eleggyel extraháljuk, majd kloroformmal kirázzuk. A szervetlen fázisból izolált ribonukleinsavhoz 2 mol/1 végső koncentrációban lítiumkloridot adunk. A készítményt 4 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül inkubáljuk, majd a ribonukleinsavat centrifugáljuk. A pelletet 25 pl 10 mmol/1 trisz-HCl, 1 mmol/1 EDTA (pH=8,0) elegyben szuszpendáljuk, majd a ribonukleinsavat standard körülmények között alkohollal kicsapjuk. A ribonukleinsav-pelletet 25 pl 10 mmol/1 trisz-HCl és 1 mmol/1 EDTA (pH=8,0) elegyben szuszpendáljuk.

pl tisztított ribonukleinsavat foltanalízisre alkalmas műanyag membránra (Hybond-N, Amersham, Nagy-Britannia) viszünk. A TSWV növényben történő jelenlétét standard hibridizálással detektáljuk, amelynek során mintaként a vírusból izolált szekvencia tetszőleges részét vagy a megadott szekvenciainformáció alapján előállított szintetikus oligomert alkalmazunk. (Eljárhatunk úgy is, hogy a TSWV-genom in vitro átírt szakaszait alkalmazzuk a TSWV-re vonatkozó RNSszekvenciáknak a fertőzött növényben történő kimutatására.) A fertőzött növényt a belőle származó RNS-anyagot tartalmazó folton bekövetkező hibridizálás alapján diagnosztizáljuk.

A fent leírt módon RNS-t izolálunk 12 olyan borsnövényből (A1-D3), amelyről feltételezhető, hogy az élettérben vírusfertőzést szenvedett. Emellett RNS-t extrahálunk három, TSWV-vel fertőzött dohánynövényből (E1-E3), és három, nem inokulált dohánynövényből (F1-F3). Minden növényről egy 1 pl-es RNSmintát viszünk Hybond-membránra. A szűrőt standard körülmények között a pS614 plazmidból származó cDNS-klónból T3 polimerázzal és alfa-[³²P]UTP radioaktív jelöléssel in vitro átírással szintetizált mintával szintetizáljuk. A fertőzésmentes kontrollnövények (F1F3) nem adnak jelet, a fertőzött kontrollnövények (E1-E3) erős jelet adnak, míg a fertőzésgyanús borsnövények gyenge és erős közötti intenzitású jelet adnak (17. ábra).

Irodalmi hivatkozások:

Abe P. P., Nelson, R. S., De B, Hoffmann, N., Rogers,

S. G., Fraley, R. T., and Beachy, R. N. (1986):

Delay of disease development in transgenic plants that express the tobacco mosaic vírus coat protein gene. Science 232, 738-743.

Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D.

D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. (1987):

Current protocols in molecular biology. Green

Publishing Associates and Wiley Intersciences,

New York, Chichester, Brisbane, Toronto and

Singapore.

Beachy, R. N., Fraley, R. T. and Rogers, S. G.,

EP 0 223 452: Protection of plants against viral infection. Monsanto Company & Washington University.

Bevan, M. (1984): Binary Agrobacterium vectors fór plánt transformation. Nucl. Acids. Rés. 12,

8711-8721.

Clerx-Van Haaster, C. M. and Bishop, D. H. L, (1980): Analysis of the 3’-terminal RNA sequences of Snowshoe hare and Lacrosse Bunyaviruses. Virolology 105, 564-574.

Clerx-Van Haaster, C. M., Clerx, J. P. M., Ushijima, H. Akashi, H., Fuller, F. and Bishop, D. H. L. (1982): Analysis of the 3’-terminal RNA sequences of Bunyaviruses and Nairoviruses (Bunyaviridae): evidence of end sequence generic differences within the vírus family. J. Gén. Virol. 61,289-292.

Figurski, D., Helinski, D. R. (1979): Replication of an origin containing a detivative of plasmid RK₂ dependent on a plasmid function provided in trans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76; 1648-1652.

Franck, A., Guilley, H., Jonard, G. Richards, K. and Hirth, L. (1980): Cell. 21, 285-294.

Grunstein, J. M. and Hogness, D. S. (1975): Colony hybridization: a method fór the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961-3965.

Gubler U. Hoffman, B. J. (1983): A simple and very efficient method fór generating cDNA libraries. Gene 25,263-269.

Hoekema, A. Hirsch, P. R. Hooykaas, P. J. J., Schilperoort, R. A. (1983): A binary vector system based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Natúré 303: 179-180.

Huynh, Τ. H., Young, R. A. and Davis, R. W. (1985): Construction and screening cDNA libraries in lambda gtlO and lambda gtll. In: DNA cloning techniques: a practical approach. (Glover, D., ed.) IRL Press, Oxford, pp. 49-78.

Laemmli, U. K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Natúré 244, 29-30.

Maniatis T., Fritsch, E. F., Sambrook J. (1982): Molecular cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Murashige. T., Skoog, F. (1962): A revised médium fór rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plánt. 15: 473-497.

Tas, P. W. L., Boerjan, M. L. and Peters, D. (1977): The structural proteins of tomato spotted with vírus. J. Gén. Virol 36, 81-91.

Towbin, H., Stachelin T. and Gordon, J. (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose: procedure and somé applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.

Van Grinsven M. Q. J. M., Gielen, J. J. L., Zethof, J. L. A., Nijcamp H. J. J. and Kool, A. J. (1986): Transcriptional and posttranscriptional regulation of chloroplast gene expression in Petúnia hybrida. Theor Appl. Gén 73, 94-101.

Verkleij. F. N. and Peters, D. (1983): Characterization of a defective form of tomato spotted wilt vírus. J. Gén. Virol. 64., 677-686.

HU 218 417 Β

Wieslander, R. (1979): A simple method to recover intact high molecular weight RNA and DNA after electrophoretic separation in low gelling temperatűre agarose gels. Anal. Biochem, 98., 305-309.

Yanish-Perron C., Vieira J. and Messing, J. (1985): Improved M13 phage cloning vectors and hőst strains: nucleotide sequence of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33,103-119.

Claims (13)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Rekombináns DNS-szerkezetek, amelyek egy, legalább 20 nukleotidból álló DNS-szekvenciát tartalmaznak, azzal jellemezve, hogy ez a kódok átírása után az alábbi RNS-szekvenciákat eredményezi:

   a) tospovírus-RNS-szekvencia vagy ezzel homológ szekvencia,

   b) olyan a) szerinti tospovírus-RNS-szekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával (vagyis azonos aminosavat vagy lánclezáró szignált kódoló kodonnal) van helyettesítve, ennek egy része vagy ezzel homológ szekvencia, vagy

   c) az a) vagy b) szerinti szekvenciával komplementer RNS-szekvencia, és amely DNS a kifejeződés során növényben működőképes promoter és terminátor által szabályozható.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után az alábbi RNS-szekvenciát eredményezi:

   i) 1-2915 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, ii) 89-1483 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, iii) S RNS hajtószekvenciája, iv) S RNS „serpenyőnyéf’-szekvenciája,

   v) 2763 és 1987 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, vi) 4462 és 1 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, vii) 41 és 2 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, viii) 3980 és 46 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, ix) (6706+n) és (4462+n) közötti L RNS-nukleotidszekvencia, ahol n a 4462 nukleotid (U) és az ezt követő azonosított nukleotid (C) közötti hiányos szakasz nukleotidjainak száma (6B. ábra),

   x) (6706+n) és (6016+n) közötti L RNS-nukleotidszekvencia, ahol a jelentése a fenti, xi) L RNS „serpenyőnyéf’-szekvenciája, xii) az 1987 és 2763 közötti S RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xiii) a 89 és 1483 közötti S RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xiv) az 1 és 4462 közötti L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xv) a 2 és 41 közötti L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xvi) a 46 és 3980 közötti L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, xvii) a (4462+n) és (6706+n) között L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, ahol n jelentése a fenti, xviii) a (6016+n) és (6706+n) közötti L RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, ahol n jelentése a fenti, xix) olyan 89 és 1483 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, xx) olyan 2763 és 1987 közötti S RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, xxi) olyan 3980 és 236 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, xxii) olyan 4462 és 236 közötti L RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, xxiii) olyan (6672+n) és (4462+n) közötti L RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, ahol n jelentése a fenti, xxiv) olyan (6706+n) és (6016+n) közötti L RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, ahol n jelentése a fenti, xxv) (m-574) és m közötti M RNS-nukleotidszekvencia, ahol m jelentése az M RNS össznukleotidjainak száma, xxvi) az (m-574) és m közötti M RNS-nukleotidszekvenciával komplementer RNS-szekvencia, ahol m jelentése a fenti, xxvii) az i)—xviii), xxv) vagy xxvi) szerinti nukleotid szekvenciával homológ RNS-szekvencia, xxviii) olyan (m-26) és (m-574) közötti M RNS-nukleotidszekvencia, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, ahol m jelentése a fenti, xxix) az 1)—xxviii) szerinti szekvenciák fragmense.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti DNS-szerkezet, azzaljellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után „serpenyőnyéf’-tospovírus- RNS-szekvenciát vagy ezzel homológ szekvenciát eredményez.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után vírusban komplementer értelmű, nyílt leolvasókeret-tospovírus-RNS-szekvenciát, vagy ennek olyan változatát, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, vagy ennek homológ szekvenciáját eredményezi.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után hajtű-tospovírus-RNS-szekvenciát vagy ennek homológját eredményezi.
6. 6. Az 1-5. igénypontok szerinti DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után tospovirus-RNS-szekvenciát vagy ennek olyan változatát, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, vagy ennek legalább 20 nukleotidban homológ szekvenciáját eredményezi.
7. 7. A 6. igénypont szerinti DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a

   HU 218 417 Β kódok átírása után tospovírus-RNS-szekvenciát vagy ennek olyan változatát, amelyben egy vagy több kodon a megfelelő szinonimával van helyettesítve, vagy ennek legalább 50 nukleotidban homológ szekvenciáját eredményezi. 5
8. 8. Az 1. igénypont szerinti DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, amely a kódok átírása után vírus S vagy L RNS 5 ’n és 3 ’ terminális részének kombinációját eredményezi.
9. 9. Az 1-8. igénypontok szerinti DNS-szerkezet, az- 10 zal jellemezve, hogy promoterként vírusból, gombából, baktériumból származó vagy állati vagy növényi eredetű és növényben működőképes promotert tartalmaz.
10. 10. A 9. igénypont szerinti DNS-szerkezet, azzal jellemezve, hogy terminátorként vírusból, gombából vagy 15 baktériumból származó vagy állati vagy növényi eredetű és növényben működőképes terminátort tartalmaz.
11. 11. Növény, azzal jellemezve, hogy genomjában az 1-10. igénypontok szerinti DNS-szerkezetet tartalmaz.
12. 12. Minta, azzal jellemezve, hogy a tospovírus RNS-szekvenciájával komplementer egyes vagy kettős szálú oligonukleotidszekvenciát tartalmaz, amely 400-600 nukleotidból áll.
13. 13. Eljárás all. igénypont szerinti növények előállítására, azzal jellemezve, hogy

    a) növényi sejt genomjába 1. igénypont szerinti DNS-szerkezetet viszünk be,

    b) transzformált sejtet állítunk elő,

    c) a transzformált sejtből genetikailag transzformáit növényt regenerálunk.