ITMI20061950A1 - Effetto antimetastatico in condizioni patologiche delle cellule umane - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
"Effetto antimetastatico in condizioni patologiche delle cellule umane."
La presente invenzione riguarda in generale metodi per controllare malattie capaci di compromettere ia vita, associate ad anomala proliferazione e migrazione cellulare, come il cancro, somministrando dosi terapeutiche efficaci di lisozima umano ricombinante (RHL), ottenuto da ingegneria genetica, ad un soggetto nel quale sia necessario indurre un'attività antimetastatica. L'invenzione riguarda inoltre i metodi per indurre detta attività antimetastatica somministrando un qualsiasi altro sale, accettabile dal punto di vista farmaceutico, di lisozima umano ricombinante oppure una loro miscela.
Il lisozima umano è presente nel latte materno umano e così pure nella maggior parte delle secrezioni della superficie epiteliale quali lacrime, secrezioni naso-gastriche, saliva, muco bronchiale e cervicale. Nel corpo umano il lisozima agisce da barriera protettiva nei confronti di agenti ambientali e, ciò facendo, contribuisce a prevenire le infezioni. Molte proprietà del lisozima umano sono state descritte e ben evidenziate nella letteratura internazionale, quali quella antibatterica (agisce rompendo alcuni legami della parete cellulare batterica), antifungina ed antivirale. Il lisozima agisce anche in sinergia con altri peptidi, quali la lattoferrina, potenziando l'attività di entrambe le proteine. Questa sostanza peptidica gioca un importante ruolo nel corpo e rafforza in modo sostanziale la salute umana, come ad esempio lo stato di salute del tratto gastrointestinale (trattamento della diarrea acuta con la dieta), la prevenzione ed il trattamento di infezioni topiche e di molte altre funzioni che sono state pubblicate in migliaia di articoli. Alcune delle più recenti pubblicazioni sono elencate di seguito: Elison, R.T. et al., J; of Clin. Inv., 88(4): 1080-91 (1991); Humphey B.D. et ai., J. of Nutrition, 132: 1214-18 (2002); Huang J. Et al., Mol. Breeding, 10(1-2): 83-94 (2002); Procter V.A. et al., CRC Criticai Reviews in Food Science and Nutrition, 26(4): 359-95 (1988).
Nonostante dette proprietà generali e significative funzioni, l'uso medicinale di lisozima umano negli scorsi anni è stato di frequente trascurato dai clinici e dai luminari della medicina.
Un altro ostacolo ad un suo impiego più diffuso deriva dalla difficoltà di ottenere lisozima umano in quantitativi sufficienti alle necessità. Perciò lisozimi ottenuti da altre specie animali, anche se presentano un'omologia molto bassa rispetto al lisozima umano, sono stati comunque introdotti nel corso della seconda metà del secolo scorso come prodotti farmaceutici o integratori alimentari, come ad esempio il lisozima di albume di uovo di gallina (HEL), probabilmente per la notevole disponibilità e per il prezzo moderato. Le applicazioni medicamentose e nutrizionali di HEL si erano rivolte in via principale a migliorare le condizioni di salute generale e ad alleviare le conseguenze negative di alcune condizioni patologiche oppure di Infezioni virali, ma spesso con risultati alterni od anche contrastanti.
Maggiori quantità di proteine ricombinanti, e fra queste lisozima umano completamente libero da infezioni o da contaminanti tossici con una capacità di espressione vantaggiosa dal punto di vista economico di circa 1,0 % (10 g/Kg), sono state rese maggiormente disponibili nel corso di questi ultimi anni con l'avvento delle nuove tecnologie ricombinanti. Pertanto gli attuali inventori si sono dimostrati sempre più interessati ad esplorare metodi innovativi di applicazioni medicinali del lisozima umano ricombinante prodotto da ingegneria genetica.
Queste tecnologie sono divenute disponibili a partire dall'anno 2002, come illustrato nel brevetto U.S. 6,642,437, con la produzione di proteine dai semi delle piante. La pubblicazione WO 02/064750 riguarda l'espressione di lisozima umano in chicchi di riso maturi trasformati utilizzando il codone ottimizzato del gene strutturale del lisozima umano. Le pubblicazioni WO 01/83792 e WO 02/064814 riguardano alimenti e additivi alimentari contenenti una o più proteine del latte prodotte nei semi di una pianta transgenica ed il metodo per generarla, ciò con l'obiettivo di ottenere una migliore formulazione per neonati già contenente nella composizione detto supplemento nutrizionale. Con maggiore successo la pubblicazione WO 05/017168 illustra un seme monocotiledone transgenico maturo che produce, per estrazione in mezzo acquoso dai semi raccolti, una frazione proteica solubile totale contenente almeno il 3,0 %, come peso totale proteico, di una proteina di latte umano, selezionata fra il gruppo comprendente lattoferrina, lisozima, lattoferricina, lattoaderina, kappa-caseina, aptocorrina, lattoperossidasi, alfa-lattoalbumina, beta-lattoglobulina, alfacaseina, beta-caseina ed alfa-1-antitripsina; ed una composizione di proteina del latte costituita da una frazione totale di proteina solubile, allo stato secco, per l'utilizzo come supplemento nutrizionale per cibo da consumare oppure mangimi.
In aggiunta alle precedenti citazioni, il lisozima umano ricombinante può essere anche ottenuto da cellule-ospite geneticamente modificate, già note in letteratura, quali microrganismi procarioti come Escherichia coli oppure Bacillus subtilis oppure cellule eucariotiche come lieviti od anche cellule di mammifero. Metodi per produrre detto lisozima umano ricombinante sono descritti anche nei brevetti EP1111054 (equivalente a US 6,660,512), EP1111058 (equivalente a US 6,528,297), EP1111059 (equivalente a US 6,436,688) ed EP 1111060 (equivalente a US 6,743,617).
Pertanto, oggigiorno sono noti in letteratura dei metodi per produrre, isolare e purificare iisozima umano ricombinante, utilizzando diverse tecniche, ma le sue applicazioni sono state fino ad ora limitate in modo sostanziale al campo nutrizionale. Nonostante il lisozima umano ricombinante si sia rivelato circa 4 volte per mg più attivo di HEL nel provocare la lisi di Micrococcus lysodeikticus e di Escherichia coli, non si sono registrati dei sostanziali progressi, quali nuovi metodi oppure impieghi al di fuori di quelli già ben noti ad un esperto del settore. Infatti, quei metodi ed impieghi già ben noti non fanno parte della materia rivendicata nell'attuale invenzione.
Pertanto, il principale scopo della presente invenzione è al contrario quello di fornire nuovi impieghi medicinali e metodi terapeutici per dosi terapeutiche efficaci di composizioni medicinali contenenti RHL ottenuto da ingegneria genetica. In modo sorprendente, tale obiettivo è stato raggiunto dal momento che gli autori hanno trovato che RHL induce un notevole effetto antimetastatico, che rappresenta un utile metodo per trattare nell 'uomo gravi malattie associate ad anomala proliferazione e migrazione cellulare, ivi compreso il cancro, somministrando dosi terapeutiche efficaci di detto peptide ad un soggetto che ne abbia necessità. Infatti, gli autori hanno osservato in modo sorprendente che in modo del tutto inatteso, in aggiunta al suo ben noto effetto proteolitico antibatterico, il lisozima umano ricombinante induce in modo sperimentale un'imprevista moderata attività antiproliferativa ma un effetto antimetastatico del tutto imprevedibile nei riguardi di un'anomala proliferazione e migrazione cellulare.
Descrizione dell'invenzione
Una prima attuazione della presente invenzione riguarda pertanto i metodi per controllare malattie capaci di compromettere la vita, associate ad anomala proliferazione e migrazione di cellule, somministrando dosi terapeutiche efficaci di RHL, ottenuto da ingegneria genetica, ad un soggetto nel quale sia necessario indurre una consistente attività antimetastatica.
Una seconda attuazione dell'invenzione riguarda anche i metodi per indurre i citati effetti antiproliferativi ed antimetastatici somministrando un sale di addizione, accettabile dal punto di vista farmaceutico, di detto peptide oppure una loro miscela.
In un'ulteriore attuazione, l'invenzione si riferisce a dosi terapeutiche efficaci di RHL utili per produrre un effetto antimetastatico sull'anomala proliferazione di cellule e sul loro processo di migrazione che, come nel caso del cancro, coinvolge un soggetto umano che richiede tale trattamento medicinale. In un'altra attuazione preferita l'invenzione si riferisce a dosi terapeutiche efficaci di RHL ed eventualmente in associazione con un altro ingrediente attivo capace di esercitare un effetto complementare, coadiuvante o sinergico sull'anomala proliferazione e/o migrazione di cellule.
In un'altra attuazione preferita l'invenzione riguarda una dose terapeutica efficace di RHL, formulata assieme ad un veicolo accettabile dal punto di vista farmaceutico oppure ad un supporto adatto per preparare la composizione medicinale più adeguata e stabile da essere usata per detti usi medicinali.
In un'attuazione ancor più preferita, l'invenzione si riferisce all'uso di RHL per la produzione di un medicamento per il trattamento in un soggetto umano di una malattia associata ad un'anomala proliferazione e migrazione delle cellule, quale il cancro.
Infatti, come sarà in seguito illustrato negli esempi, gli autori hanno trovato in modo inaspettato e sorprendente che RHL induce su cellule anomale, trasferite in modo sperimentale su modelli animali, non solo un'inibizione sulla proliferazione superiore ai controlli, ma anche una ragguardevole riduzione della migrazione cellulare (metastasi).
Pertanto, la presente invenzione riguarda l'uso del lisozima umano ricombinante nella preparazione di un medicamento per indurre effetti antiproliferativi e/o antimigratori su cellule anomale. Inoltre, la presente invenzione si riferisce anche all'uso del lisozima umano ricombinante nella preparazione di un medicamento per il controllo di malattie capaci di compromettere la vita, associate ad un'anomala proliferazione e/o migrazione cellulare, come la metastasi da cancro.
Il meccanismo di azione di RHL è tuttora poco chiaro, essendo ancora oggetto di ricerca da parte degli autori. Un'ipotesi è che RHL possa stimolare la produzione o indurre più alti livelli plasmatici di una o più specifiche citochine antiproliferative, quali il Fattore di Necrosi Tumorale-α (TNF-α) e/o simili o di una o più interleuchine e/o simili, inibendo perciò la velocità di replicazione ma più in particolare la migrazione della cellula tumorale.
Gli autori hanno trovato in modo inaspettato e sorprendente che la somministrazione orale di dosi terapeutiche efficaci di RHL può indurre un favorevole e significativo aumento piasmatico di TNF-α libero circolante e che al suo effetto potrebbe essere probabilmente dovuta l'inibizione specifica sull'anomala proliferazione cellulare. Più precisamente, nello stato proliferativo iniziale, come nel caso di un impianto di un cancro indotto in modo sperimentale, gli autori hanno trovato questa attività inattesa, che non è invece presente in modo evidenziabile nel gruppo degli animali trattati in parallelo con HEL.
Un'altra ipotesi degli autori è che la somministrazione orale di RHL possa in qualche modo stimolare i Toll-Like Receptors (TLR) di recente descritti nelle più note pubblicazioni mediche. Infatti, nove recettori, con differenti e specifiche funzioni miste, sono stati recentemente trovati e descritti: Napolitani G. et al., Nat. Immunol., 6(8): 769-76 (2005), Bottino C. et al., Mol. Immunol., 41:569-75 (2004); Takeda K. Et al., J. Derm. Se. (Review), 34: 73-82 (2004); Vogel S.N. et al., Mol. Inerventions (Review), 3 (8): 466-477 (2003). Pertanto, RHL oppure i suoi frammenti oppure i peptidoglicani batterici o le particelle virali potrebbero stimolare direttamente i recettori specifici per il cancro oppure indirettamente, attraverso gli altri recettori specifici per le infezioni batteriche o virali.
In modo del tutto sorprendente gli autori hanno anche notato che la somministrazione orale di RHL abbassa anche i livelli plasmatici di alcuni marcatori aspecifici, quali l'acido sialico (totale), la prolattina e la leptina.
La presente invenzione riguarda anche dosi terapeutiche efficaci di RHL o di suoi sali farmaceuticamente compatibili in una composizione farmaceutica oppure in un medicinale. Il preparato medicinale contenente RHL può essere una qualsiasi preparazione adatta per ia somministrazione orale, come compresse, a rilascio immediato o prolungato, capsule, pillole, granulato, polvere, sciroppo, sospensione, emulsione ed assimilati, tutti preparati secondo tecniche generali ben note ad un esperto del settore. Pertanto, le suddette composizioni orali di RHL possono inoltre contenere alternativamente uno o più composti o materiali farmaceutici compatibili quali diluenti, riempitivi, lubrificanti, eccipienti, solventi, leganti, stabilizzanti, ammassanti ed assimilati. I diluenti che possono essere usati nelle composizioni dei preparati dell'invenzione comprendono, senza rappresentare alcun tipo di limitazione, fosfato bicalcico, solfato di calcio, lattosio, cellulosa microcristallina, caolino, mannitolo, saccarosio, destrosio, cloruro di sodio, amido e per compresse a rilascio prolungato idrossipropilmetilcellulosa (HPMC), gomma lacca e simili. I leganti che possono essere usati nelle composizioni per granulazione ad umido comprendono, senza costituirne limitazione, amido, gelatina, gomme naturali e sintetiche, povidone, alginato di sodio, glicoli polietilenici e simili e per compressione diretta includono, senza costituire limitazione, cellulosa microcristallina, lattosio anidro ed essiccato, amido, fosfato bicalcico e simili.
Possono anche essere utilizzati ammassanti quali saccarosio, glucosio, destrosio e lattosio e simili. Gomme naturali e sintetiche che possono essere usate nelle composizioni includono ma non si limitano ad alginato di sodio, siliato di magnesio e alluminio, carbossimetilcellulosa, metilcellulosa, povidone.
Gli stabilizzanti utilizzati possono comprendere, ma non si limitano, polisaccaridi quali gomma di acacia, agar, acido alginico, gomma guar e gomma tragacanta, ed i disintegranti comprendono croscarmelloso sodico tipo A ed altri amidi e derivati della cellulosa idrosolubili e similari.
I lubrificanti, agenti di scorrevolezza ed antiaderenti che possono essere usati comprendono, senza costituire una limitazione, stearati metallici (magnesio, calcio e zinco), acido stearico, oli vegetali idrogenati, talco, amido di mais, glicoli polietilenici, silici micronizzate e similari. Possono anche essere usati surfattanti quali laurilsolfato di sodio e dioctilsulfosuccinato di sodio (DDS).
La dose orale unitaria contiene di preferenza da 20 a 80 % di RHL, più preferibilmente da 40 a 60 % di principio attivo. RHL può essere usato in un modo pressoché simile ad altri noti agenti antitumorali per il trattamento di varie condizioni patologiche. Per il lisozima umano ricombinante, la dose da somministrare, la frequenza del dosaggio, la dose giornaliera totale, la durata del trattamento possono variare in modo apprezzabile per ciascun soggetto, in relazione a via di somministrazione prescelta, tipo di tumore, età e peso corporeo del ricevente, velocità di escrezione, associazione con altri farmaci, e condizioni generali del paziente sottoposto alla terapia.
Di conseguenza, il dosaggio da somministrare non è soggetto a vincoli prestabiliti, ma sarà di solito quella quantità efficace per ottenere gli effetti farmacologici e terapeutici desiderati.
Pertanto, le concentrazioni terapeutiche ottimali di RHL saranno meglio determinate ed adattate attraverso la pratica clinica sperimentale di routine nei pazienti affetti dalle differenti patologie da trattare. Infatti, un oncologo esperto in materia di trattamento del cancro sarà in grado di verificare, senza un'eccessiva sperimentazione, protocolli appropriati per la somministrazione efficace di RHL, facendo riferimento a studi già pubblicati su composti che hanno mostrato proprietà antitumorali ed antimetastatiche, ed in seguito di adattare il regime di dosaggio in relazione ai risultati terapeutici raggiunti. Tuttavia il seguente dosaggio ed il regime posologico sono qui riportati a titolo di esempio, come guida non vincolante. I dosaggi ed il regime posologico di somministrazione di RHL, oppure di un suo sale farmaceuticamente accettabile, oppure di un'associazione degli stessi, potranno variare in funzione della forma farmaceutica del dosaggio, via di somministrazione, condizione da trattare e particolari del soggetto da trattare e così via.
In relazione alla presente invenzione, RHL può essere utilizzato di preferenza per via orale. Le dosi terapeutiche efficaci di RHL possono meglio variare ed essere somministrate in uno schema da 5 mg a 200 mg al giorno per Kg di peso corporeo, di preferenza da 15 a 100 mg al giorno per Kg di peso corporeo, meglio se da 25 a 50 mg al giorno per Kg di peso corporeo. La dose terapeutica efficace richiesta giornalmente può essere somministrata suddivisa in una o più porzioni, in relazione alla dose unitaria farmaceutica disponibile. Qualora la gravità della patologia lo richieda, RHL può anche essere somministrato per via parenterale. In tal caso RHL è in genere somministrato con uno schema di dosaggio variabile da 2 mg a 100 mg al giorno per Kg di peso corporeo, di preferenza da 5 a 50 mg al giorno per Kg di peso corporeo, meglio se da 10 a 20 mg al giorno per Kg di peso corporeo. La dose giornaliera per via parenterale può anche essere somministrata suddivisa in una o più porzioni. Una composizione contenente RHL è di preferenza dispensata in una dose farmaceutica unitaria per semplificare la sua somministrazione e per ottenere l'uniformità della dose dispensata. Di conseguenza, ciascuna dose unitaria solida da somministrare per via orale può contenere una quantità di RHL variabile da 50 mg a 1000 mg, di preferenza da 200 a 500 mg. Nel caso di forme orali liquide, ie unità di dose sopra indicate sono disciolte in un volume multiplo di 1,0 ml di solvente, quale 5,0 oppure 10,0 mi o multipli di essi. I volumi da somministrare per ciascuna dose possono in seguito essere esattamente misurati usando quei dispositivi correntemente disponibili.
La dose unitaria parenterale di RHL può contenere una quantità da 100 mg a 1500 mg, di preferenza da 200 mg a 1000 mg. L'unità di dose parenterale può contenere RHL in soluzione oppure come polvere liofilizzata da sciogliere al momento dell'uso nella quantità prescritta di solvente adeguato.
Le dosi farmaceutiche unitarie di RHL sopra indicate sono prodotte con tecniche convenzionali già note ad un esperto del settore e sono altresì descritte in modo completo in pubblicazioni specializzate, quale "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20. th Edition, 2000.
In considerazione dell'attività inibitoria sulla proliferazione e migrazione cellulare, comprovata sperimentalmente, RHL risulta particolarmente utile per la preparazione di una composizione farmaceutica per trattare una varietà correlata di malattie in diverse condizioni. A questo riguardo, "trattamento" oppure "trattare" indicano entrambe i trattamenti terapeutici e profilattici. Pertanto, RHL può essere utilizzato per preparare una composizione farmaceutica per trattare gli stadi iniziali di una malattia, oppure anche prima del suo insorgere iniziale, oppure dopo la rapida progressione, includendo le metastasi. I termini "trattamento" e "trattare" sono usati per designare in particolare una riduzione dello stato di malessere nel paziente, quale una riduzione della velocità di proliferazione cellulare, una distruzione delle cellule malate proliferanti, una riduzione della massa tumorale oppure della grandezza del tumore, un ritardo nella progressione del tumore, una riduzione del numero e dimensione delle metastasi, così pure una completa soppressione del tumore. Il cancro è il tipico esempio di malattia associata ad un'anomala proliferazione e migrazione cellulare. L'uso di lisozima umano ricombinante risulta particolarmente idoneo per trattare il cancro, quali tumori solidi oppure tumori linfoidi. Esempi specifici delle condizioni patologiche dianzi citate comprendono cancro alla mammella, cancro all'ovaio, cancro alla prostata, cancro alla vescica, cancro al polmone, cancro alla testa ed al collo, linfoma non-Hodgkin's, melanoma, cancro al colon, cancro al pancreas ed al fegato, ed altri simili e le loro relative metastasi.
L'invenzione è ulteriormente descritta per una migliore comprensione nei successivi Esempi, che non devono essere considerati limitativi della sostanza e delle rivendicazioni di codesta invenzione.
ESEMPIO 1
Effetti del lisozima umano ricombinante (RHL) somministrato per via orale sulla crescita del tumore e sullo sviluppo di metastasi del carcinoma sperimentale nel topo.
a) Stato dell'arte
Un numero di evidenze scientifiche avvallano la modulazione della risposta immunitaria di GALT (Gut Associated Lymphoid Tissues) ed anche l'ipotesi che vi sia un coinvolgimento di meccanismi immunologici citochino-dipendenti per l'attivazione di alcuni recettori recentemente scoperti, quali i Toll-Like Receptors (TLR’s) dei linfociti (Li L, Inflammation & Allergy, 2004, 3, 81-86; Vogel S.N. et al., Molecular Interventions, 2003, 3, 466-477), e che quindi tutto ciò possa rappresentare un sistema idoneo per trattare patologie sistemiche correlate alla proliferazione ed alla migrazione cellulare anomala.
b) Scopo dello studio
L'obiettivo del presente studio di ricerca riguardava la determinazione in vivo degli effetti di RHL dell'invenzione sulla crescita del tumore e sullo sviluppo di metastasi nel modello murino di carcinoma sperimentale. RHL è stato somministrato oralmente per 14 giorni consecutivi, mescolato a cibo in polvere. L'effetto di RHL è stato confrontato con quello del lisozima di albume di uovo di gallina (HEL) disponibile in commercio.
c) Sostanze e dosi somministrate
RHL (Lotto P-0056) usato per lo studio sperimentale è stato acquistato da Ventria Bioscience Ine. (Sacramento, CA, U.S.A.). HEL, estratto dall'albume di uovo di gallina, utilizzato come prodotto di riferimento per la ricerca, era normalmente disponibile sul mercato (SPA Società Prodotti Antibiotici S.p.A., Milano, Italia). Lo studio di ricerca nel topo è stato realizzato da un'Organizzazione di Ricerca a Contratto (CRO), specializzata ed indipendente, per conto ed in conformità con le istruzioni impartite dal richiedente.
RHL (Lotto P-0056) è stato somministrato a tre livelli di dosaggio di 25 mg/Kg/giorno (RHL25), 50 mg/Kg/giorno (RHL50) e 100 mg/Kg/giorno (RHL100), mentre HEL è stato somministrato al dosaggio di 100 mg/Kg/giorno (HEL100). Tutti le sostanze sono state aggiunte alla razione giornaliera di cibo in polvere per 14 giorni consecutivi. Il consumo di cibo è stato calcolato separatamente ed il cibo con il farmaco veniva rinnovato ogni giorno. La quantità di cibo scartata dagli animali incideva sul dosaggio giornaliero per meno del 10,0 %.
d) Modello animale
I topi femmine CBA di 17-18 g di peso corporeo usati per il test sono stati forniti da HARLAN Italy Srl, S. Pietro al Natisone (UD), Italia. Agli animali é stato consentito mangiare cibo in polvere per 7 giorni prima dell'esperimento. Gli animali sono stati mantenuti in conformità alle procedure convenzionali (con acqua di rubinetto ad libitum) in adeguati stabulari per animali presso il Dipartimento di Scienze Biomediche dell'Università di Trieste, che erano stati in parte affittati per questo scopo dalla CRO designata.
e) Modello di tumore solido
La linea di carcinoma mammario murino (MCa) utilizzata nel presente lavoro era derivata da un tumore solido spontaneo di topi femmine CBA, successivamente isolato e stabilizzato al Rudjer Boskovic Institute, Zagabria, Croazia. La linea cellulare tumorale in uso presso la Fondazione Callerio Onlus, Trieste, Italia è stata conservata in contenitori criogeni in azoto liquido, in fiale criogene contenenti 10<7>cellule vitali di una sospensione di cellule individuali proveniente da tumori primari alla terza generazione di trapianto.
Il tumore è stato cresciuto in vivo dopo impianto intramuscolare (i.m.) nel polpaccio della zampa posteriore sinistra di topi femmina CBA del contenuto di una fiala di cellule di MCa provenienti dal contenitore criogeno. Il tumore di due topi è stato prelevato dalle zampe dopo 14 giorni (circa 2 g di massa tumorale), ed una sospensione di cellule individuali è stata preparata ed è stata reimpiantata in 4 topi femmina CBA che fungevano da donatori per la riproduzione del tumore a scopi sperimentali. Il tumore, prelevato dai topi in condizioni di sterilità (gli animali sono stati uccisi per dislocazione cervicale, l'area di sviluppo tumorale è stata disinfettata con un'idonea soluzione e gli animali sono stati posti in contenitori sterili), è stato raggruppato, dissezionato con le forbici, sospeso di nuovo in una soluzione salina di tampone fosfato (PBS) di Dulbecco (pH 7.4) contenente Ca<2+>e Mg<2+>e filtrato su di un doppio strato di garza sterile per rimuovere i residui di tessuto. La sospensione cellulare è stata poi centrifugata a 250 x g a 0-4°C per 10 minuti; il supernatante è stato eliminato mentre il substrato lamellare è stato sospeso di nuovo in un uguale volume di PBS, e sono state determinate la concentrazione cellulare e la vitalità con il test di esclusione del trypan blue con camera di Biirker.
Le cellule vitali sono state infine diluite fino ad avere 1,0 x 10<6>cellule/0,05 ml PBS.
Per l'esperimento, sono state impiantate 10<6>cellule vitali di carcinoma MCa di una sospensione cellulare ottenuta dal tumore primario prelevato dai 4 donatori CBA per via i.m. nel polpaccio della zampa posteriore sinistra di 110 topi CBA.
f) Protocollo sperimentale
I tumori primari sono stati impiantati per via i.m. il giorno 0 (3 febbraio 2005). I topi sono stati poi randomizzati in gruppi per la prova (Tabella n. 1). Il protocollo contemplava quattro gruppi di trattamento ed un gruppo di controllo.
La crescita del tumore primario è stata valutata al giorno 7 (10 febbraio 2005), al giorno 9 (12 febbraio 2005), al giorno 11 (14 febbraio 2005), al giorno 13 (16 febbraio 2005), al giorno 15 (18 febbraio 2005) ed al giorno 18 (21 febbraio 2005). Le misurazioni dei due assi ortogonali del tumore sono state fatte per mezzo di un calibro. Il peso del tumore primario è stato calcolato con la formula: (π/6) x a<2>x b, dove a e b sono rispettivamente gli assi ortogonali minore e maggiore, e sottraendo al risultato il peso della zampa posteriore sana (che corrispondeva a circa 100 mg). Il numero ed il peso delle metastasi al polmone sono stati valutati al giorno 20 (23 febbraio 2005) dopo il sacrificio degli animali per dislocazione cervicale. Le metastasi al polmone sono state contate e misurate al giorno 20 (23 febbraio 2005) per mezzo di uno stereo-microscopio a bassa potenza dotato di una griglia graduata. Il peso delle metastasi è stato determinato con la formula: (π/6) x a<2>x b, dove a e b sono rispettivamente gli assi ortogonali minore e maggiore.
Il peso delle milze di tre animali per gruppo scelti casualmente è stato misurato al giorno 20 (23 febbraio 2005) dopo avere sacrificato gli animali per dislocazione cervicale. Le gabbie contenenti gli animali sono state controllate ogni giorno per prevenire uno stato di sofferenza eccessivo dei topi con tumore.
Tabella 1
Rappresentazione degli schemi di trattamento del protocollo sperimentale.
Gruppi Dose di lisozima mg/Kg/giorno
Controlli
HEL 100 100
RHL 100 100
RHL 50 50
RHL 25 25
g) Tabulazione e risultati
I risultati ottenuti per i parametri considerati sono riassunti nelle successive Tabelle:
Tabella 2
Morte degli animali durante il trattamento (giorno 0 - giorno 20).
E' stato riportato il numero di animali vivi per ciascun gruppo, a partire dal giorno deirimpianto del tumore (giorno 0) fino al giorno del sacrificio (giorno 20). Il numero totale di animali che sono morti prima del termine dell'esperimento è stato di 13/44.
Tabella 3
Variazioni del peso corporeo (in g) tra il giorno 0 (giorno dell'impianto del tumore) ed il giorno 20 (termine dell'esperimento e valutazione delle metastasi).
Le variazioni di peso sono state calcolate secondo la formula: {[(Gruppo X p.m. al giorno 20 / Gruppo X p.m. al giorno 0) / (Gruppo Y p.m. al giorno 20 / Gruppo Y p.m. al giorno 0)] *100} -100
dove p.m. = peso medio
Tabella 4
Effetto sulla crescita del tumore primario (in mg).
Tabella 5
Effetto sulla formazione di metastasi al polmone.
Tabella 6
Pesi della milza (in g) il giorno del sacrificio (giorno 20).
h) Riassunto del risultato e delle conclusioni
h.1) Effetti sulla crescita del tumore primario
h.1.1) Riassunto dei risultati
• Il trattamento orale di topi affetti da carcinoma mammario MCa con lisozima umano ricombinante (RHL) alle dosi di 100, 50 e 25 mg/kg/giorno non presenta risultati significativi sulla crescita del tumore primario.
• Anche il lisozima di albume di uovo di gallina (HEL) alla dose di 100 mg/kg/giorno non è efficace sulla crescita del tumore primario (p<0,05 rispetto ai controlli non trattati).
h.2) Effetti sullo sviluppo di metastasi
h.2.1) Riassunto dei risultati
• RHL, alle dosi di 100, 50 e 25 mg/kg/giorno, riduce in modo significativo la media totale della massa metastatica al polmone (p<0,05 - p<0,01 rispetto ai controlli non trattati) in modo dose-dipendente.
• HEL, a 100 mg/kg/giorno, non è attivo né sulla crescita delle metastasi né sul loro numero.
h.3) Conclusioni
• RHL non ha mostrato effetti antitumorali sul carcinoma mammario MCa nel sito de! tumore primario.
• RHL riduce in modo significativo la media complessiva della massa metastatica al polmone.
• L'efficacia di RHL sullo sviluppo di metastasi è dipendente dalla dose somministrata nell'intervallo di dosi da 25 a 100 nng/kg/giorno.
ESEMPIO 2
Preparazione di 100.000 compresse contenenti 500 mg di lisozima umano ricombinante.
Ciascuna compressa contiene:
Ingredienti Quantità (per compressa) Lisozima umano ricombinante 500 mg
Cellulosa microcristallina 250 mg
Stearato di magnesio 25 mg
Biossido di silicio 15 mg
Peso totale 790 mg
Il processo di produzione è stato effettuato per compressione diretta della miscela di polvere secondo operazioni per preparare compresse ben note ad un esperto del settore, utilizzando stanze ed attrezzature adeguate per questo genere di produzione. Per ottenere le compresse desiderate, gli ingredienti necessari per produrre 100.000 compresse di RHL sono stati pesati e sottoposti a compressione diretta secondo tecniche note ad un esperto del settore. Sono state così ottenute 96.280 compresse biconvesse. Resa: 96,28 %.
ESEMPIO 3
Preparazione di 1.000 fiale iniettabili (10,0 mi) contenenti 300 mg/ml di lisozima umano ricombinante (come sale cloridrato).
Ciascuna fiala da 10,0 ml contiene:
Ingredienti Quantità (per fiala da 10.0 ml) Lisozima umano ricombinante 3000 mg
(come sale cloridrato)
Cloruro di sodio 800 mg
Acqua per preparazioni parenterali q. b. a 10,0 ml Il processo di produzione è stato effettuato secondo operazioni per preparare fiale ad uso parenterale ben note ad un esperto del settore, utilizzando stanze ed attrezzature adeguate per questo genere di produzione. Per ottenere le fiale desiderate, gli ingredienti necessari per produrre 1.000 fiale da 10,0 mi sono stati pesati e sottoposti alla lavorazione industriale secondo le tecniche note ad un esperto del settore. Sono state così ottenute 834 fiale da 10,0 mi di soluzione. Resa: 83,4 %.
Nonostante codesta invenzione sia stata descritta con una dettagliata esposizione ed esempi, con il proposito di una maggiore chiarezza e comprensione, è ovvio che certe modifiche e cambiamenti possono essere apportati nell'ambito delle rivendicazioni formulate.
Claims (13)
- RIVENDICAZIONI 1. L'uso dì lisozima umano ricombinante nella preparazione di un medicamento per indurre effetti antiproliferativi e/o antimigratori in cellule anomale.
- 2. L'uso di lisozima umano ricombinante nella preparazione di un medicamento secondo la rivendicazione 1, per il controllo di malattie capaci di compromettere la vita, associate ad un'anomala proliferazione e/o migrazione cellulare, come metastasi del cancro.
- 3. L'uso di lisozima umano ricombinante nella preparazione di un medicamento secondo la rivendicazione 1 o 2, nel quale il lisozima umano ricombinante è ottenuto o con una tecnica di DNA ricombinante per produrre proteine in semi di piante, come ad esempio in chicchi di riso maturi trasformati utilizzando il codone ottimizzato del gene strutturale del lisozima umano, oppure con una tecnica di fermentazione dove un microrganismo selezionato è stato geneticamente modificato con un costrutto genico per ottenere lisozima umano.
- 4. L'uso dì lisozima umano ricombinante nella preparazione di un medicamento secondo la rivendicazione 1 o 2, nel quale il lisozima umano ricombinante è ottenuto da cellule-ospite geneticamente modificate, quali microrganismi procarioti oppure cellule eucariotiche come lieviti cellule di mammifero.
- 5. L'uso di lisozima umano ricombinante secondo le rivendicazioni da 1 a 4, nel quale il lisozima umano ricombinante comprende anche un suo sale farmaceuticamente accettabile o una miscela degli stessi.
- 6. L'uso di lisozima umano ricombinante secondo le rivendicazioni precedenti nel quale il medicamento comprende una quantità terapeutica efficace di lisozima umano ricombinante, e nel quale la dose terapeutica efficace di lisozima umano ricombinante per somministrazione orale varia da 5 mg a 200 mg/Kg di peso corporeo al giorno, di preferenza da 15 mg a 100 mg/Kg di peso corporeo al giorno.
- 7. L'uso di lisozima umano ricombinante secondo la rivendicazione 6, nel quale la dose terapeutica efficace di lisozima umano ricombinante meglio varia di preferenza da 25 mg a 50 mg/Kg al giorno.
- 8. L'uso di lisozìma umano ricombinante secondo le rivendicazioni precedenti nel quale il medicamento comprende una quantità terapeutica efficace di lisozima umano ricombinante, e nel quale la dose terapeutica efficace di lisozima umano ricombinante per somministrazione parenterale varia da 2 mg a 100 mg/Kg di peso corporeo al giorno, di preferenza da 5 mg a 50 mg/Kg di peso corporeo al giorno.
- 9. L'uso di lisozima umano ricombinante secondo la rivendicazione 8, nel quale la dose terapeutica efficace di lisozima umano ricombinante meglio varia di preferenza da 10 mg a 20 mg/Kg al giorno.
- 10. L'uso di lisozima umano ricombinante secondo ciascuna delle rivendicazioni precedenti, nel quale il medicamento comprende inoltre opzionalmente uno o più composti o sostanze farmaceutiche accettabili.
- 11. L'uso di lisozima umano ricombinante secondo la rivendicazione 10, nel quale uno o più composti o sostanze farmaceutici accettabili sono opzionalmente costituiti da ingredienti attivi che esercitano un effetto complementare, adiuvante e/o sinergico sulle cellule anomale, e/o uno o più veicoli farmaceutici accettabili e/o supporti idonei per la sua somministrazione orale e parenterale.
- 12. Un metodo per indurre un effetto antiproliferativo ed antimigratorio sulle cellule anomale, come metastasi del cancro, somministrando una quantità terapeutica efficace di lisozima umano ricombinante ad un individuo umano che richieda di tale trattamento medicinale.
- 13. Un metodo per trattare malattie capaci di compromettere la vita, associate ad un'anomala proliferazione e migrazione cellulare, come metastasi del cancro, somministrando dosi terapeutiche efficaci di lisozima umano ricombinante ad un individuo umano che richieda di tale trattamento medicinale.
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