TWI785268B - 用於治療癌症的自然殺手細胞與環磷醯胺的組合 - Google Patents

Abstract

一種癌症（如乳癌，例如三陰性乳癌）組合療法，包含環磷醯胺（CTX）化合物及自然殺手（NK）細胞。本文亦提供使用環磷醯胺化合物及NK細胞組合療法，用以誘發免疫記憶及/或降低腫瘤復發風險的方法。

Description

用於治療癌症的自然殺手細胞與環磷醯胺的組合

申請案相關文獻

本申請案主張2018年8月29日提交的美國專利臨時申請案第62/724,338號之權利，該臨時申請案全文內容以引用方式併入本文中。

自然殺手（NK）細胞在抗腫瘤免疫上扮演要角。人類及小鼠體內的NK細胞一旦發育不良或功能不彰，便會導致腫瘤發生機率提高，而當小鼠的內源性NK細胞負向調節功能減弱，其身體的抗癌活性便會增強。見Imaiet al. ,Lancet ,356 (9244):1795-1799 (2000)；Paolinoet al. ,Nature , 507(7493):508-512 (2014)；及Waldhaueret al. ,Oncogene , 27(45):5932-5943 (2008)。目前已發現，胃腸道基質瘤病患之IFN-γ及腫瘤內NK細胞的生成量與病患存活率呈正相關。見Menardet al. ,Cancer Res , 69(8):3563-3569 (2009)；Rusakiewiczet al. ,Cancer Res , 73(12):3499-3510 (2013)；及Waldmannet al. ,J Investig Dermatol Symp Proc , 16(1):S28-30 (2013)。乳癌病患的NK細胞活化相關的分子表現量提高，則病患預後情況更理想。見Asciertoet al. ,J Transl Med ., 12;11:145 (2013)。

NK細胞能透過NK受體辨識癌細胞，藉此啟動NK細胞活化程序。見Vivieret al. ,Science , 331(6013):44-49 (2011)。經活化的NK細胞不僅能透過穿孔素（perforin）/顆粒溶解酶（granzyme）、TRAIL或Fas配體（Fas ligand）直接殺死癌細胞，也會製造細胞激素及趨化激素（chemokines）誘發第一型免疫反應（包括誘發T_H 1 細胞、CD8⁺ 胞殺型T細胞及第一型巨噬細胞），而啟動有效的抗腫瘤免疫功能。見Mocikatet al. ,Immunity , 19(4):561-569 (2003)。NK細胞製造之IFN-γ，是第一型T細胞及巨噬細胞反應的關鍵誘發者。NK細胞辨識癌細胞後，能立刻被活化而快速發動效應功能。

基於體內NK細胞在抗腫瘤免疫功能中扮演重要角色，研究者測試以過繼NK細胞轉移（adoptive NK cell transfer）治療癌症（見Guillereyet al. ,Nature immunology 2016, 17(9):1025-1036）。發現僅過繼異體NK細胞轉移對特定類型的骨髓性白血病有療效。見Geller et al., Immunotherapy 2011, 3(12):1445-1459；及Moretta et al., L,  Blood 2011, 117(3):764-771)；而以過繼自體NK細胞轉移治療固態瘤則效果不彰。見Burns et al., Bone marrow transplantation, 32(2):177-186 (2003)；Parkhurstet al. ,Clin Cancer Res , 17(19):6287-6297 (2011)；及Sakamoto et al., Journal of translational medicine, 13:277 (2015)。

因此，開發提升過繼自體NK細胞轉移療效的治療方法，相當重要。

本揭露係（至少部分）基於以下非預期的發現：環磷醯胺（CTX）化合物可提升自然殺手（NK）細胞抑制腫瘤生長及/或復發的功效，此結果見於同源常位三陰性乳癌（TNBC）的老鼠模型。相較於僅使用CTX或NK細胞的單一療法，CTX化合物及NK細胞的組合療法提高罹患腫瘤小鼠及切除腫瘤小鼠的長期存活率。此外，組合療法能誘發免疫記憶，清除再次接種的相同腫瘤細胞，顯示預防腫瘤復發的可能。

因此，根據本揭露之一態樣，提供一種治療癌症的方法，其包含：(a) 對有需要的受試者施予具有效量的環磷醯胺（CTX）化合物（如CTX、馬磷醯胺(mafosfamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)或曲磷胺(trofosfamide)或前述之醫藥上可接受的鹽類）；及(b) 對有需要的受試者施予具有效量的NK細胞。在某些具體實施例中，NK細胞於執行步驟(b)前可於活體外（ex vivo ）情形下暴露於IL-15及/或IL-12。

在某些實例中，步驟(a)可包含至少兩劑CTX化合物，且可每隔4-8天（如每隔6天）對受試者連續施予兩劑CTX化合物。在一選擇性或另外之情形，步驟(b)可包含至少兩劑NK細胞。

在某些具體實施例中，步驟(a)的CTX化合物至少一劑可於步驟(b)前施予受試者。在某些實例中，步驟(a)的CTX化合物全部劑量皆可於步驟(b)前施予受試者。另外，可選擇於施予NK細胞之前或之後對受試者施予CTX化合物。

在其他具體實施例中，步驟(b)的NK細胞至少一劑可於步驟(a)前施予受試者。在某些實例中，步驟(b)的NK細胞全部劑量皆可於步驟(a)前施予受試者。另外，可選擇於施予CTX化合物之前或之後對受試者施予NK細胞。

在某些具體實施例中，受試者為人類病患，該病患罹患癌症、疑似罹患癌症或有罹患癌症的風險，舉例而言，該癌症為固態癌症或血液型態癌症。範例固態癌症包括但不限於乳癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰臟癌或膀胱癌。在某一實例中，該固態癌症為乳癌，或選擇性地為三陰性乳癌。範例血液型態癌症包括白血病、淋巴癌或多發性骨髓瘤。在某些具體實施例中，受試者已接受腫瘤切除術。

在某些具體實施例中，CTX化合物及NK細胞組合使用時，兩者的有效量有效降低癌症復發的風險。

根據本揭露另一態樣，提供一種誘發保護性免疫記憶以抑制腫瘤復發及/或降低腫瘤復發的風險的方法，該方法包含：(a)向有需要的受試者施予具有效量的環磷醯胺（CTX）化合物，如環磷醯胺；及(b)向受試者施予具有效量的NK細胞。在某些實例中，受試者為罹患腫瘤的人類病患。該腫瘤病患可能已接受過抗腫瘤療法。

本文揭露的方法任何一者中，NK細胞可來自於自體。或者，NK細胞亦可來自於異體。在其他具體實施例中，NK細胞可來自NK細胞株、由多能型幹細胞分化，或由經誘發的多能型幹細胞分化。

又，本文提供一種用於治療癌症的套組，其包含(i) 環磷醯胺（CTX）化合物，如環磷醯胺；及(ii) NK細胞。在某些具體實施例中，NK細胞於活體外（ex vivo ）情形下已暴露於IL-15及IL-12。

在本揭露的申請專利範圍中，亦包括用於治療癌症的醫藥組合物（如本文所描述的醫藥組合物），其中該等醫藥組合物包含本文所揭露的CTX化合物，及本文所揭露的NK細胞（如共同或分別調配），以及使用CTX化合物及NK細胞製造癌症治療藥物。

本案所請發明一或多個具體實施例將於下文詳述。本案所請發明的其他特徵或優點，在參照附圖、多個具體實施例內容及所附請求項後將會變得明顯。

本揭露係（至少部分）基於以下非預期的發現：如同源常位三陰性乳癌的動物模型所示，環磷醯胺（CTX）化合物及自然殺手（NK）細胞的組合療法可根除約75%的罹患腫瘤小鼠或切除腫瘤小鼠體內的腫瘤，亦可誘發免疫保護力，預防腫瘤復發。

雖然NK細胞在抗腫瘤免疫功能中扮演重要角色，但過繼自體NK細胞轉移的臨床療效有限，僅過繼異體NK細胞轉移對特定類型的骨髓性白血病產生療效。其中一個可能的原因為，腫瘤微環境（TME）抑制了NK細胞的抗腫瘤活性。具體而言，腫瘤細胞及腫瘤內髓系細胞、基質細胞及內皮細胞會生成抑制因子，並抑制NK細胞功能。見Hasmimet al. ,Front Immunol , 6:482 (2015)。因此，開發能在抑制免疫功能的腫瘤微環境下控制NK細胞抗腫瘤活性的方法，對開發有效癌症免疫療法會具有相當助益。

本文的某些具體實施例中，提供可應對前述限制的方法及套組。本文所揭露的方法，係包含組合使用NK細胞及環磷醯胺（CTX）化合物治療癌症。本文所提供的實驗數據顯示，CTX化合物可減少腫瘤微環境中的免疫抑制情形，以促進NK細胞的抗腫瘤效果。在不囿於特定理論的情形下，CTX化合物除可誘發癌症細胞的免疫性死亡，亦可去除免疫抑制細胞，並誘發細菌自腸道轉移至二級淋巴組織，可藉此增強抗腫瘤免疫反應。因此，在降低腫瘤微環境中的免疫抑制後，新生免疫細胞在轉移NK細胞生成之IFN-γ影響下，誘發有效的抗腫瘤第一型免疫反應。

如下所述，可自兩面向評估療效，即小鼠被植入原發性腫瘤的存活情形和再接種相同腫瘤細胞後的存活情形。在第二種情形中，小鼠已形成免疫記憶，可預防腫瘤復發或降低腫瘤復發的風險。將兩種情形的存活率相乘，可獲得治癒率估計值。僅使用NK細胞的單一療法療效偏弱；相較之下，僅使用CTX的單一療法療效較高。意外的是，使用NK細胞及CTX化合物組合療法時，可使約75%的罹患腫瘤小鼠或切除腫瘤小鼠體內產生保護性免疫記憶，並使小鼠長期存活。組合療法的治癒率估計值高出任一種單一療法。EO771乳癌細胞株係三陰性，帶有p53 變異，且會自發性轉移。見Johnstoneet al. ,Disease models & mechanisms , 8(3):237-251 (2015)；及Ewenset al. ,Anticancer research , 25(6b):3905-3915 (2005)。56-71%的TNBC患者體內的p53呈陽性，且存活率較p53^- 癌症患者更差。見Kimet al. ,Annals of surgical oncology 23(11):3524-3530 (2016)；及Pan et al., PLoS ONE 12(2) (2017)。如本文所述，NK細胞及CTX的組合療法對此侵略性（aggressive）乳癌模型具有相當療效。

因此，本文描述自然殺手（NK）細胞及環磷醯胺化合物，其用途如治療癌症及/或降低癌症復發風險，以及包含NK細胞及環磷醯胺化合物的套組。 自然殺手（ NK ）細胞

根據本揭露之一態樣，提供自然殺手（NK）細胞及環磷醯胺（或其衍生物），如用於過繼細胞轉移療法。

NK細胞為與先天免疫相關的胞殺性淋巴細胞，其特徵為不需事先活化即可殺死目標細胞（如腫瘤細胞、遭病毒感染細胞及細菌細胞）。合適的NK細胞可取自任何物種，包括哺乳類動物（如人類、小鼠、大鼠、狗及羊）。對受試者實施含NK細胞的過繼細胞轉移療法時，可挑選NK細胞的來源以使發炎反應盡可能不被誘發（如宿主對抗移植物疾病）。舉例而言，NK細胞可源於自體，即由被施予NK細胞的受試者身上取得。另，NK細胞亦可源於異體（如源於屬同物種的捐贈者）且其人類白血球抗原（HLA）類型與NK細胞受試者相同。在某些具體實施例中，NK細胞為取自人類捐贈者的人類NK細胞，該捐贈者的人類白血球抗原與NK細胞受試者相符。

另外，NK細胞亦可取自細胞株（如NK-92）。在某些具體實施例中，NK細胞可具有抗原呈現細胞（APC）特性及/或功能。任何NK細胞皆可衍生自多功能幹細胞。另外，NK細胞亦可衍生自經誘發的多功能幹細胞。

本揭露的NK細胞亦可於活體外（ex vivo ）擴增（如在對受試者施予NK細胞前擴增）。在某些實例中，NK細胞暴露於細胞激素，包括但不限於IL-15及IL-12。NK細胞可暴露於至少一種（如至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或至少十種）細胞激素。使用兩種或多種細胞激素時，可依序（按任何順序）或同時使用。於活體外培養NK細胞的範例方法見實例6。

舉例而言，可採用傳統方法，搭配IL-15及IL-12將NK細胞於活體外擴增並活化。見如Fehnigeret al. ,Journal of immunology , 162(8):4511-4520 (1999)。IL-15可支持NK細胞生長及存活，而IL-15及IL-12皆可藉調增細胞毒性及IFN-γ生成量來刺激NK細胞的第一型免疫功能。在不囿於特定理論的情形下，新生NK細胞在前述兩種細胞激素中進行活體外擴增時，可使NK細胞功能調整為第一型免疫反應驅動物。

IL-15為四α螺旋束的細胞激素家族成員，且與促進B細胞、T細胞及自然殺手細胞分化及增殖有關（見如Mishra et al., Clin Cancer Res., 20(8):2044-50, 2014)）。人類IL-15的胺基酸序列於基因銀行中的存取號碼為NP_751915.1。

IL-12為介白素12細胞激素家族成員，該家族包含IL-12、IL-23、IL-27及IL-35。此細胞激素由兩個次單元組成。IL-12係一種異源二聚體，由IL-12 α次單元（IL-12 p35）及IL-12 β次單元（IL-12 p40）組成。在人體中，各次單元由不同的基因編碼而成。舉例而言，人類IL-12 α次單元（如基因銀行存取號碼NP_000873.2、NP_001341511.1及NP_001341512.1）係由IL12A 基因編碼而成，而人類IL-12 β次單元（NP_002178.2）係由IL12B 基因編碼而成。 環磷醯胺（ CTX ）化合物

如本文所述，環磷醯胺（CTX）化合物（如CTX、其醫藥上可接受鹽類或酯類或其衍生物）可用於增強過繼NK細胞轉移療法的療效。環磷醯胺化合物為DNA交聯劑，可被新陳代謝為磷醯胺氮芥（phosphoramide mustard）。結構上，環磷醯胺化合物包含具化學式I的核心結構：

化學式 I，可被選擇性取代

應了解，本揭露亦涵蓋環磷醯胺衍生物（如預先活化的環磷醯胺類似物）及其醫藥上可接受鹽類或酯類。舉例而言，化學式I的一或多個位置可被修飾（如藉由取代或添加官能基）。非限制性的官能基實例包括烴鏈（如被取代或未被取代的烷基、烯基或炔基）、苯環、胺基、醇、醚、鹵代烷烴、巰、醛、酮、酯、羧酸及醯胺。舉例而言，在化學式I中，任一碳原子皆可被官能基修飾、胺基中的氫可被官能基取代、氯可被任一鹵素取代，包括但不限於氟及碘。環磷醯胺、其醫藥上可接受的鹽類及其衍生物，可使用常規方法合成。見Takamizawaet al. , J Med Chem. 1975 Apr;18(4):376-83。範例環磷醯胺衍生物包括馬磷醯胺、異環磷醯胺及曲磷胺。

本文所述的CTX化合物，合於描述者可包含一或多個非對稱中心，因此具有多種異構物，如鏡像異構物及/或非鏡像異構物。舉例而言，本文所述的化合物可為獨立鏡像異構物、非鏡像異構物或幾何異構物的形式，或可為立體異構物混合物的形式，包括外消旋混合物，以及富含一或多個立體異構物的混合物。將異構物自混合物中分離時，可透過技術領域中具通常知識者的習知技術，包括手性高壓液相層析法（HPLC）及手性鹽類的生成及結晶化；或較佳的異構物可透過非對稱合成製備。見如Jacqueset al. ,Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981)；Wilenet al. ,Tetrahedron 33:2725 (1977)；Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw–Hill, NY, 1962)；及Wilen,Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)。本揭露另外涵蓋本文所述的化合物，該等化合物為實質上不包含其他異構物的單獨異構物，或可為多種異構物的混合物。

在某些實例中，本文所述方法中使用的CTX化合物可為(R)-異構物。另外，CTX化合物可為(S)-異構物。在某些實例中，CTX化合物可為(R)及(S)異構物。

化學元素按Handbook of Chemistry and Physics , 75th Ed.封面內頁的元素週期表（CAS版本）界定，而特定官能基原則上按本文說明界定。另外，有機化學的一般原則及特定官能基團和反應性，皆如以下文獻所述：Thomas Sorrell,Organic Chemistry , University Science Books, Sausalito, 1999；Smith and March,March’s Advanced Organic Chemistry , 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations , VCH Publishers, Inc., New York, 1989；及Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis , 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987。

本文所述的化合物可包含一或多個非對稱中心，因此具有多種異構物，如鏡像異構物及/或非鏡像異構物。舉例而言，本文所述的化合物可為獨立鏡像異構物、非鏡像異構物或幾何異構物的形式，或可為立體異構物混合物的形式，包括外消旋混合物，以及在一或多個立體異構物中濃縮的混合物。將異構物自混合物中分離時，可透過技術領域中具通常知識者的習知技術，包括手性高壓液相層析法（HPLC）及手性鹽類的生成及結晶化；或較佳的異構物可透過非對稱合成製備。見如Jacqueset al. ,Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981)；Wilenet al. ,Tetrahedron 33:2725 (1977)；Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw–Hill, NY, 1962)；及Wilen,Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972)。本發明另外涵蓋本文所述的化合物，該等化合物為實質上不包含其他異構物的單獨異構物，或可為多種異構物的混合物。 醫藥組合物

在某些具體實施例中，本揭露提供醫藥組合物，其包含如本文所揭露的CTX化合物（如CTX），及/或如本文所揭露的NK細胞，以及醫藥上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

「醫藥上可接受」的載體、稀釋劑或賦形劑，包括無菌且非熱原的載體、稀釋劑或賦形劑。合適的醫藥載體、稀釋劑及賦形劑皆屬習知技術。所謂的「可接受」載體，意指載體必須與抑制劑相容，但又對接受者無害。

與本揭露組合物相關的「醫藥上可接受」一詞，係指前述組合物的分子結構及其他成分是生理上可耐受的，且施予哺乳類動物（如人類）時通常不會引發不良反應。較佳地，本文所使用的「醫藥上可接受」一詞，係指經聯邦或州政府主管機關核准，或根據《美國藥典》（U.S. Pharmacopeia）或其他廣受認可的藥典，能施予哺乳類動物（尤其人類）。「可接受」一詞，係指載體與組合物活性成分（如CTX化合物及/或NK細胞）相容，且不會對被施予組合物的受試者造成負面效果。本案所述方法所使用的任何醫藥組合物，皆可包含具凍乾或水溶液型態的醫藥上可接受載體、賦形劑或安定劑。

醫藥上可接受載體，包括緩衝劑，係本發明所屬領域習知技術，且可包含磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑；低分子量多肽；蛋白質，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；胺基酸；疏水性聚合物；單醣；雙醣；及其他碳水化合物；金屬複合物；及/或非離子性界面活性劑。見如Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover。

包含任何本文所述CTX化合物及/或NK細胞任一者之醫藥組合物，可藉習知技術中的任何給藥途徑施予，如腸外、口服、口腔內、舌下、外用或吸入式給藥途徑，醫藥製劑含活性成分，且該醫藥製劑可選擇性地為無毒性的有機或無機的酸或鹼、額外鹽類，具有醫藥上可接受的劑型。在某些具體實施例中，給藥途徑為口服給藥，且調製為口服製劑。

在某些具體實施例中，醫藥組合物或製劑係藉由腸外途徑給藥，如靜脈內、動脈內、肌肉內、皮下或腹膜內給藥。在某些具體實施例中，包含NK細胞的組合物可調製為靜脈內注射製劑。

適用腸外給藥的製劑，包括水溶液及非水溶液形式的無菌注射液，可包含抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及可搭配受試者血液使製劑呈等張的溶質；及水溶液及非水溶液形式的無菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑。水溶液可經適當調配為緩衝劑（較佳地調製為pH 3至9）。在無菌情形下，可使用技術領域中具通常知識者習知的標準技術輕易完成合適的腸外製劑。

在某些具體實施例中，醫藥組合物或製劑適合透過口服、口腔內或舌下給藥途徑給藥，如具備藥錠、膠囊、卵形栓劑、酏劑、溶液或懸浮液的形式，包含增味劑或著色劑，以達需立即、延後或經調控釋放藥劑的目的。

合適的藥錠可包含賦形劑，如微晶體纖維素、乳糖、檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸氫鈣及甘胺酸；崩散劑，如澱粉（較佳地為玉米、馬鈴薯或樹薯澱粉）、羧甲基澱粉鈉、交聯羧甲基纖維素鈉及特定複合矽酸鹽；及顆粒黏結劑，如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙甲纖維素、羥丙基纖維素、蔗糖、明膠及阿拉伯膠。另外，潤滑劑可包括如硬脂酸鎂、硬脂酸、甘油二十二酸酯（glyceryl behenate）及滑石。

類似的固態組合物亦可作為明膠膠囊中的填充劑使用。在此情形下，較佳的賦形劑包括乳糖、澱粉、纖維素、乳糖（milk sugar）或高分子量聚乙二醇。若欲調製為水溶液形式的懸浮液及/或酏劑，可將本案所述化合物與多種甜味劑或增味劑、著色物質或染劑、乳化劑及/或懸浮劑以及稀釋劑結合，稀釋劑包括水、乙醇、乙二醇及甘油及前述之組合。

在某些具體實施例中，醫藥組合物或製劑適合透過鼻腔內或吸入途徑給藥，如乾粉吸入劑，或裝於高壓罐、幫浦、噴霧器或霧化器中並搭配合適推進劑的噴劑，推進劑可包括二氟二氯甲烷、三氟氯甲烷、四氟二氯乙烷、氫氟烷烴、二氧化碳或其他合適氣體。就高壓噴劑而言，單位劑量可藉安裝閥門並計算噴霧量決定。高壓罐、幫浦、噴霧器或霧化器可包含活性化合物的溶液或懸浮液，如使用乙醇及推進劑混合物作為溶劑，其中亦可包含潤滑劑。用於吸入器或吹入器的膠囊及芯（如明膠製成的芯），可包含抑制劑粉末混合物及合適的鹼粉，如乳糖或澱粉。

在某些具體實施例中，包含CTX化合物的醫藥組合物或製劑適合透過外用途徑施予受試者。抑制劑可藉由外用途徑給藥，具有乳液、溶液、乳霜、軟膏或敷粉形式，或藉由穿皮途徑給藥，如使用皮膚貼片。就皮膚外敷途徑而言，抑制劑可調製為包含活性化合物的合適軟膏，其懸浮或溶於如以下一或多種物質的混合物：礦物油、液態礦脂、白礦脂、乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蠟及水。包含CTX化合物的醫藥組合物或製劑亦可調製為合適的乳液或乳霜，其懸浮或溶於如以下一或多種物質的混合物：礦物油、山梨醇單油酸酯、聚乙二醇、液態石蠟、聚山梨醇酯60（polysorbate 60）、十六烷基酯蠟（cetyl esters wax）、鯨蠟硬脂醇（cetearyl alcohol）、2-辛基十二醇（2-octyldodecanol）、苯甲醇及水。適用口腔內局部給藥途徑的製劑，包括包含該活性成分的口含錠；包含該活性成分及惰性基質（如明膠及甘油，或蔗糖及阿拉伯膠）的喉片；及包含該活性成分及合適液態載體的漱口水。

製劑可以單劑量或多劑量容器盛裝，如密封安瓿或小瓶，且可貯存於凍乾狀態下，使用前僅須添加無菌液態載體即可。 治療用途

本揭露亦提供治療癌症的組合療法，其中含CTX化合物（如CTX）及本文揭露的NK細胞。可同時或依序（任何順序皆可）施予需要治療的受試者CTX化合物及NK細胞。

實施本文所述的療法時，可對需要藉適當途徑（如靜脈內注射NK細胞及/或以口服途徑施予CTX化合物）接受治療的受試者施予本文所述的具有效量之環磷醯胺化合物及具有效量的NK細胞。給藥前，環磷醯胺化合物及/或NK細胞可與醫藥上可接受的載體混合，以形成醫藥組合物，該組合物亦包含於本揭露的申請專利範圍中。如上所述，NK細胞可於活體外（如暴露於細胞激素中，包括但不限於IL-12及IL-15）擴增。

NK細胞可自受試者自體移植，即NK細胞取自需要治療的受試者體內。相較於施予非自體移植細胞，施予受試者自體移植細胞可使NK細胞被排斥的情形減少。NK細胞亦可為異體移植細胞，即NK細胞取自第一名受試者體內，選擇性暴露於細胞激素中（如IL-12及IL-15），並施予不同於第一名受試者但屬相同物種的第二名受試者。舉例而言，異體移植NK細胞可取自人類捐贈者，並施予不同於捐贈者的人類受贈者。NK細胞亦可取自本文所述的體外（in vitro ）細胞培養基。

待治療的受試者可為哺乳類動物（如人類、小鼠、豬、牛、大鼠、狗、兔子、山羊、綿羊或猴子）。受試者可罹患癌症、疑似罹患癌症或具罹癌風險。示例性癌症包括固態瘤（如乳癌）及血液型態癌症。乳癌種類可為三陰性乳癌。示例性血液型態癌症包括但不限於白血病、淋巴癌（如非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)及何杰金氏淋巴瘤）、布凱特氏淋巴瘤（Burkitt's lymphoma）、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、T細胞白血病（蕈狀肉芽腫）及多發性骨髓瘤。示例性固態瘤包括但不限於神經母細胞瘤（neuroblastoma）、視網膜母細胞瘤（retinoblastoma）、乳癌及卵巢癌。在某些實例中，待治療的受試者罹患癌症，且曾接受癌症療法。舉例而言，受試者曾切除一或多個腫瘤（即接受切除術）。

在某些具體實施例中，受試者可為罹患癌症且先前接受過抗癌療法的人類。抗癌療法的非限制性實例包括化學療法、免疫療法、放射療法、手術或本文所揭露的組合療法。先前接受過的抗癌療法可為已結束，亦可為仍在進行中。在某些具體實施例中，人類病患接受先前療法後可呈現腫瘤緩解狀態（完全緩解或部分緩解）。

環磷醯胺化合物及NK細胞可依序（任何順序皆可）施予受試者。本文所使用的「組合療法」一詞，包括但不限於依序施予所提及的成分（如NK細胞及環磷醯胺）。舉例而言，可於施予NK細胞前施予環磷醯胺化合物（如至少6小時、至少12小時、至少1日、至少3日、至少5日、至少7日前）。可施予受試者多於一劑（至少2劑、至少3劑、至少4劑、至少5劑或至少10劑）的NK細胞。輪流施予環磷醯胺化合物及NK細胞亦涵蓋於本揭露申請專利範圍中。

施予受試者CTX化合物的劑量可由許多因素決定，包括受試者的身高及體重、一般或其他健康狀況，及受試者所罹患的癌症或狀況類型。明確的劑量及給藥時程可由醫師決定。CTX化合物可經由多種途徑施予受試者，依劑量、所治療狀況及使用目的而定。舉例而言，CTX化合物可藉靜脈內注射（IV）或口服途徑（如藥錠形式）施予，選擇性於飯後施予。CTX化合物亦可藉由肌肉內注射（IM）途徑、或腹部黏膜注射（腹膜內）或肺部黏膜注射（肺膜內）途徑施予。

NK細胞可經由合適途徑施予受試者一或多次，如經由靜脈內注射。在某些實例中，可對受試者（如人類受試者）注射治療上有效劑量的NK細胞進行治療，劑量為每體重公斤10⁵ 至10¹⁰ 個或更多細胞（細胞數/kg）。可於病患耐受範圍內反覆進行注射，直到預期反應發生為止。合適的注射劑量及時程依病患而定，但可由病患的主治醫師決定。一般而言，初始劑量為大約10⁶ 細胞數/kg，或增加至10⁸ 或更高細胞數/kg。

對受試者施予環磷醯胺化合物及NK細胞可預防腫瘤生長、抑制腫瘤生長及/或誘發腫瘤退化。舉例而言，對受試者施予環磷醯胺化合物及NK細胞可使腫瘤尺寸（如腫瘤體積）縮小至少10%（如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少80%或至少90%）。

相較於未接受環磷醯胺化合物及NK細胞的受試者，接受組合療法的受試者可存活較久。相較於未給予治療組，施予環磷醯胺化合物及NK細胞組合可使風險比小於1。舉例而言，組合的風險比可小於0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1。風險比數據的非限制性實例如表1及表3所示。

在某些實例中，施予環磷醯胺化合物及NK細胞可誘發過繼免疫反應，抑制腫瘤復發。舉例而言，施予環磷醯胺化合物及NK細胞可誘發過繼免疫反應，抑制特定型態的腫瘤（如固態瘤，例如乳癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤或胰臟癌；或血液型態癌症，例如本發明所屬技術領域中習知及/或本文揭露的類型）。如上所述，乳癌包括三陰性乳癌。使用環磷醯胺化合物及NK細胞治療可降低癌症復發風險。舉例而言，環磷醯胺化合物及NK細胞的組合療法可提高無病存活機率（如5年無病存活機率或10年無病存活機率）。無病存活機率可提高至少10%（如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%）。

本文揭露的CTX化合物及NK細胞可與其他癌症療法搭配使用，包括化學療法、手術、放射線、基因療法、標靶藥物等。其他有效製劑及療法可見於Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.；Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.；Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY；Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J。

在某些實例中，環磷醯胺化合物及NK細胞於實施腫瘤切除術（如於罹患乳癌的受試者體內）前施予。在某些實例中，環磷醯胺化合物及NK細胞於實施腫瘤切除術後施予。

本文所使用的「有效量」一詞，係指能對受試者產生療效的每一活性製劑劑量，該活性製劑可單獨使用，或搭配一或多種活性製劑。技術領域中具通常知識者皆習知，有效量會因待治療狀況、狀況嚴重度、病患參數（如年齡、身體狀況、身材、性別、體重）、治療持續時間、給藥途徑、賦形劑使用情形、搭配其他活性製劑使用情形，以及其他醫療從業人員熟知的因素等條件變化。給藥劑量依待治療受試者狀況而定，包括如個體免疫系統產生細胞免疫反應的能力。活性製劑的精確給藥量，依醫事人員的判斷而定。不過，本發明技術領域具通常知識者即可輕易判斷合適劑量範圍。

本文所使用的「治療」一詞，係指將包括一或多種活性製劑的組合物用於或施予罹患目標疾病、罹患目標疾病症狀或具罹患目標疾病體質的受試者，以治癒、治療、減輕、緩解、改變、調整、改善、提升或影響疾病病況、疾病症狀或罹患疾病的體質。 治療用套組

本揭露亦提供用於本文所述任何癌症的套組。本文所述的治療用套組可包括一或多個容器，其中包含(i) 環磷醯胺化合物（如CTX）及(ii) NK細胞，可於活體外使用細胞激素（如IL-12及IL-15）培養之。環磷醯胺化合物及/或NK細胞可於醫藥上可接受載體中調製。套組可進一步包含IL-12及IL-15。

在某些具體實施例中，套組可另外包含使用本文所述方法中的環磷醯胺化合物及NK細胞的指示。該等指示可包含對受試者施予NK細胞、環磷醯胺化合物或含NK細胞及環磷醯胺化合物的醫藥組合物的說明，以在受試者體內產生療效。該套組可進一步包含選擇適合接受治療受試者的說明，選擇係基於受試者是否需要治療。在某些具體實施例中，該等指示包含對需要治療的受試者施予環磷醯胺化合物、NK細胞或含NK細胞及環磷醯胺化合物的醫藥組合物的說明。

關於使用環磷醯胺化合物、NK細胞或含本文所述NK細胞及環磷醯胺化合物的指示，一般包括目標療法的劑量、給藥時程、給藥途徑等資訊。容器可為單位製劑、散裝（如多劑包裝）或次單元劑量。本揭露套組提供的指示，一般書寫於標籤或仿單上。根據標籤或仿單說明，醫藥組合物係用於治療、延緩及/或減輕受試者體內的疾病或異常。

本文提供的套組具有合適包裝。合適包裝包括但不限於小瓶、瓶、罐、軟質包裝等。於設想範圍內，亦包括與特定裝置搭配使用的包裝，如吸入器、鼻腔給藥裝置或注射裝置。套組可具有無菌輸液座（舉例而言，包裝可為靜脈輸液袋，或含皮下注射針可穿刺瓶塞的小瓶）。包裝亦可具有無菌輸液座。NK細胞及環磷醯胺化合物可被視為活性製劑。

套組亦可提供額外內容物，如緩衝液及解釋性資訊。一般而言，該套組包含容器以及位在容器上或與容器相關聯的標籤或仿單。在某些具體實施例中，本揭露提供包含上述套組內容物的製造物。 一般技術

除非另有說明，本發明將採取傳統分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生化學及免疫學技術，以上皆為本發明所屬技術領域之習知技術。見Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al., eds., 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)。無須贅述，一般認為本發明技術領域具通常知識者可基於以上說明，將本發明功效發揮至極致。因此，以下特定具體實施例可被理解為僅具示例性，且不以任何方式限縮本揭露後續內容。本文的所有參考文獻，皆基於本文所述的目的或標的，以引用方式併入本文中。實例 實例 1 ：使用 CTX 治療 EO771 腫瘤小鼠的療效

使用同源常位EO771三陰性乳癌（TNBC）小鼠模型（見Johnstoneet al. ,Disease models & mechanisms , 8(3):237-251 (2015)）評估活體內（in vivo ）療效。器材與方法 小鼠

C57BL/6JNarl雌小鼠購自台灣國家實驗研究院國家實驗動物中心，並飼養於中央研究院分子生物研究所的動物房中，且於無病原體條件下飼養。實驗使用8至12週齡的小鼠。 細胞株及細胞培養

在完全培養基（RPMI 1640 Gibco）中培養EO771 TNBC細胞株（CH3 BioSystems），培養基添加20 mM pH7.2 HEPES（Sigma-Aldrich）、10%胎牛血清（FBS；HyClone）及1%青黴素及鏈黴素（PS；Gibco）。B16-F10黑色素瘤由Dr. Roffler, Steve R.提供（中央研究院生物醫學科學研究所，台灣）並培養於完全培養基中（DMEM(Gibco)，添加10% FBS (HyClone)及1% PS (Gibco)）。於37°C保溫箱中以5% CO₂ 培養腫瘤細胞。 製備小鼠 NK 細胞

骨髓（BM）細胞取自脛骨及股骨。使用ACK裂解緩衝液（0.15 M NH₄ Cl、10mM NaHCO₃ 、1mM 乙二胺四乙酸二鈉(disodium EDTA) (pH 7.4)）裂解紅血球。於含重組小鼠IL-15的10% FBS RPMI培養基中，培養BM細胞7天，並於細胞採集前16小時加入IL-12。使用對CD19、H57、NK1.1、CD11c及B220具特異性的抗體替採集到的BM細胞染色，並使用FACSAriaII SORP（BD Biosciences；中央研究院分子生物研究所FACS Core）針對CD11c⁺ B220⁺ NK細胞替BM細胞分類 腫瘤模型及治療方式

EO771細胞株取自C57BL/6小鼠的原發性髓狀乳腺腫瘤。將EO771細胞注射入C57BL/6JNarl雌小鼠的第4 乳腺脂肪墊，以建立同源常位TNBC模型。在腫瘤細胞模型中，替每隻小鼠接種0.5 x 10⁶ 個細胞，並於21天後進行第一次CTX腹膜內注射。6天後，再進行第二次CTX注射。於第二次注射約24小時後，將分類後的CD11c⁺ B220⁺ NK細胞經靜脈內途徑轉移，並於3～4天後進行另一次NK細胞轉移。在腫瘤切除模型中，替每隻小鼠接種0.3 x 10⁶ 個EO771細胞，並於21天後切除腫瘤及引流淋巴結。實施腫瘤模型中的切除術48小時後，開始進行CTX/NK治療。經皮下途徑替小鼠接種B16-F10黑色素瘤細胞（0.075 x 10⁶ 細胞數/每小鼠），進行前述再接種程序。觀察小鼠的存活情形、體重及腫瘤體積。 統計分析

使用GraphPad Prism 7進行Kaplan-Meier存活分析，並使用時序檢驗判定顯著性。使用Cox風險比例模型分析風險比率及交互作用[24]。p值 ≤ 0.05時具統計顯著性（*p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001、****p ≤ 0.0001）。結果

針對腫瘤小鼠分別施予一次及兩次環磷醯胺（CTX）治療，並比較兩種治療的效果，以開發有效療法。於接種腫瘤後第21天施予CTX。針對接受兩次CTX治療的組別，於第一次治療後第6天進行第二次CTX注射。被施予磷酸鹽緩衝生理食鹽水（PBS）的組別作為負控制組。

被施予磷酸鹽緩衝生理食鹽水的小鼠全數死亡，存活日數的中位數為53天。另一方面，接受一次CTX治療的8隻小鼠、接受兩次CTX治療的8隻小鼠中，各有1隻及5隻小鼠存活至少120天，見第1A圖。實驗結果顯示CTX能有效治療TNBC，且多次給藥（如每次間隔6天）的療效更佳。

後續實驗皆施予兩次CTX（每次間隔6天），每劑注射劑量為125 mg/kg及150 mg/kg。結果顯示，劑量150 mg/kg組的存活率由11%顯著提高為62%，見第1B圖。基於以上數據，再以劑量150 mg/kg、每次間隔6天施予兩次CTX治療，利用過繼NK細胞轉移測試組合療法。實例 2 ： CTX 及 NK 細胞療法能協同提升 EO771 腫瘤小鼠的存活分析

在完成實例1所述的檢驗後，首先測定CTX單一療法、NK細胞單一療法，或CTX及NK細胞組合療法對EO771腫瘤小鼠的療效。腫瘤接種後第21天開始實施前述療法。接受NK細胞單一療法的小鼠全數死亡，其存活率中位數與負控制組（PBS）近似，見第2圖。另一方面，接受CTX單一療法、CTX加NK細胞組合療法的組別中，各有62%及80%存活至少120天，見第2圖。

Cox風險比例模型的分析結果顯示，相較於PBS組，CTX單一療法組及CTX/NK細胞組合療法組的風險比率顯著較低。而相較於CTX單一療法組，組合療法組的療效更顯著。實驗數據結果如表1所示。此外，CTX及NK細胞組合療法具有相乘交互作用，其風險比率為0.353（p = 0.028），顯示使用CTX及NK細胞治療腫瘤小鼠時會產生協同效果，能幫助小鼠長期存活，如EO771 TNBC模型所示。表 1 ：相較未接受治療的 EO771 腫瘤小鼠組別，接受 CTX 療法、 NK 細胞療法、 CTX/NK 細胞療法組別的風險比率（ HR ）數據

帶瘤模型	無批次調整	衰弱調整	集群調整
療法	HR (95% CI)	P值	HR (95% CI)	P值	HR (95% CI)	P值
無治療	參照組	-	參照組	-	參照組	-
CTX	0.024 (0.012, 0.051)	> 0.001	0.02 (0.009, 0.044)	> 0.001	0.024 (0.009, 0.006)	> 0.001
NK	1.362 (0.829, 2.240)	0.223	1.209 (0.605, 2.414)	0.59	1.362 (0.644, 2.881)	0.419
CTX+NK	0.012 (0.005, 0.031)	> 0.001	0.009 (0.003, 0.024)	> 0.001	0.012 (0.005, 0.029)	> 0.001
CTX	參照組	-	參照組	-	參照組	-
CTX+NK	0.481 (0.219, 1.055)	0.0677	0.445 (0.201, 0.986)	0.0462	0.481 (0.284, 0.814)	0.00644

因此，相較於使用CTX單一療法，使用CTX/NK細胞組合療法治療腫瘤的療效更顯著。CTX/NK細胞組合療法在腫瘤小鼠體內具有相乘交互作用，顯示兩種治療劑之間具有協同作用。此外，CTX單一療法及CTX/NK細胞組合療法能提升腫瘤小鼠的存活率，而NK細胞單一療法則否。實例 3 ： CTX 及 NK 細胞組合療法能誘發 EO771 腫瘤小鼠的保護性免疫記憶

癌症復發是治療癌症時的一大挑戰。為判定CTX/NK細胞組合療法是否避免或降低癌症復發風險，實驗使用同樣的癌症腫瘤細胞，對罹患原發腫瘤後仍存活的小鼠進行再接種，以模擬癌症復發。本實例使用的試驗如實例1所述。

結果顯示，CTX/NK細胞組合療法組別及CTX單一療法組別接受EO771再接種後，存活至少120天的比例各為100%及90%，至於年齡相仿、接種EO771細胞的空白小鼠，則於接受癌症再接種後70天死亡，見第3圖。以上結果顯示，同時使用CTX及NK細胞治療原發腫瘤可誘發小鼠體內的免疫記憶，避免腫瘤復發。

在罹患腫瘤小鼠模型中，CTX及NK細胞組合療法治療原發腫瘤的療效較CTX單一療法佳，但再接種同樣的腫瘤細胞後，使用兩種療法誘發的保護能力相近。治癒率計算方式為原發腫瘤存活率乘上再接種存活率。如表2所示，CTX/NK細胞組合療法的治癒率為80%，而CTX單一療法的治癒率為56%。表 2 ：腫瘤小鼠接受治療後的原發腫瘤存活率、 EO771 再 接種存活率及免疫保護治癒率估計值

腫 瘤小鼠	原發腫瘤存活率 1 % ( 存活數 / 總數 )	EO771 再接種後存活率 % ( 存活數 / 總數 )	免疫保護治癒率估計值 2 (%)
療法
NK	0 (0/34)	N/A	N/A
CTX	62 (46/74)	90 (26/29)	56
CTX+NK	80 (31/39)	100 (20/20)	80

¹ 初次接種腫瘤小鼠於治療後的存活率² 免疫保護治癒率估計值：原發腫瘤存活率乘以EO771再接種後的存活率

施予過繼NK細胞轉移及CTX組合療法時，兩者於EO771腫瘤小鼠體內表現出協同抗癌效果，治癒率估計達83%。實驗結果亦顯示，CTX/NK細胞組合療法及CTX單一療法能誘發免疫記憶，於罹患腫瘤條件下預防腫瘤復發。實例 4 ： CTX 單一療法及 CTX/NK 細胞組合療法對於 EO771 腫瘤切除小鼠存活的療效相近

接著，於EO771腫瘤切除小鼠模型中測定CTX單一療法及CTX/NK細胞組合療法的療效，該模型模擬腫瘤經手術切除的病患。本實例使用的試驗如實例1所述。

接種腫瘤後第21天進行腫瘤及引流淋巴結切除術，並於切除手術後第2天開始單獨施予CTX或CTX加NK細胞。未接受手術或治療（PBS控制組）的小鼠皆死亡，存活天數中位數為51天；僅接受切除術的小鼠存活比例為18%，存活天數中位數為68天，見第4圖。腫瘤切除小鼠體內，NK細胞及CTX單一療法可分別使存活率提升至35%及86%，見第4圖。相較於純CTX，CTX及NK細胞組合療法並未進一步提升存活率，見第4圖。Cox風險比例模型分析顯示，相較僅接受切除組別，CTX單一療法及CTX/NK細胞組合療法可顯著降低風險比率，而CTX單一療法及CTX/NK細胞組合療法之間並無顯著差異，見表3。表 3 ：相較僅接受切除術的 EO771 腫瘤切除小鼠組，接受 CTX 療法、 NK 細胞療法、 CTX/NK 細胞療法組別的風險比率（ HR ）數據

腫瘤切除模型	無批次調整	衰弱調整	集群調整
療法	HR (95% CI)	P值	HR (95% CI)	P值	HR (95% CI)	P值
無治療	參照組	-	參照組	-	參照組	-
CTX	0.086 (0.040, 0.186)	> 0.001	0.083 (0.036, 0.192)	> 0.001	0.086 (0.037, 0.201)	> 0.001
NK	0.706 (0.405, 1.233)	0.222	0.7 (0.354, 1.385)	0.31	0.706 (0.497, 1.042)	0.0799
CTX+NK	0.058 (0.014, 0.244)	> 0.001	0.061 (0.014, 0.270)	> 0.001	0.058 (0.014, 0.242)	> 0.001
CTX	參照組	-	參照組	-	參照組	-
CTX+NK	0.685 (0.145, 3.210)	0.628	0.732 (0.150, 3.587)	0.701	0.682 (0.127, 3.656)	0.655

綜上所述，單純施予CTX或同時施用CTX及NK細胞，皆可提升腫瘤切除小鼠存活率。以上數據顯示，實施CTX單一療法及CTX/NK細胞組合療法時，對腫瘤切除小鼠原發腫瘤存活率的療效皆相當高。實例 5 ： NK 細胞治療增強 EO771 腫瘤切除小鼠體內的腫瘤專一性免疫記憶

實施實例1中的試驗後，本實例將測定CTX單一療法及CTX/NK細胞組合療法是否能於腫瘤切除條件下誘發免疫記憶。對罹患原發EO771腫瘤後仍存活的小鼠進行EO771細胞再接種。CTX組的存活率為30%，而NK細胞組的存活率則為67%，見第5圖。CTX及NK細胞的組合能帶來最佳保護效果，小鼠存活率為83%，見第5圖。另一方面，接受B16F10再接種的小鼠在接受原發EO771腫瘤療法後仍全數死亡。基於EO771原發及再接種存活率，以NK、CTX及CTX+NK療法治療腫瘤切除小鼠的治癒率估計值分別為23%、26%及75%。見表4。表 4 ： EO771 腫瘤小鼠接受治療後的原發腫瘤存活率、 EO771 再接種無腫瘤率及免疫保護治癒率估計值

腫瘤 切除 小鼠	原發腫瘤存活率 1 % ( 存活數 / 總數 )	EO771 再接種後存活率 % ( 存活數 / 總數 )	免疫保護治癒率估計值 2 (%)
療法
NK	35 (10/29)	67 (6/9)	23
CTX	86 (49/57)	30 (7/23)	26
CTX+NK	90 (18/20)	83 (15/18)	75

¹ 初次接種腫瘤小鼠於治療後的存活率² 免疫保護治癒率估計值：原發腫瘤存活率乘以EO771再接種後的存活率

施予CTX及NK細胞組合療法時，治癒率估計達75%，顯著高出其他單一療法的療效。CTX/NK細胞組合療法能誘發腫瘤專一性保護，於罹患腫瘤條件下預防腫瘤復發。其他具體實施例

本文揭露的所有特徵可結合為任何組合。本文揭露的各項特徵，可由其他具備同樣、對等或類似目的之特徵代換。因此，除非另有說明，本文揭露的各項特徵僅為一系列對等或類似的基本特徵之範例。

根據以上說明，本發明所屬技術領域中具通常知識者可輕易掌握本發明的主要特徵，且在不背離本發明的精神及申請專利範圍之情形下，可對本發明進行各種變化及修飾，以使本發明滿足特定用途及條件。因此，其他具體實施例亦涵蓋於本發明申請專利範圍之中。均等物

本文已詳述數個本發明的具體實施例，但對技術領域中具通常知識者而言，其他用於實施該功能及/或取得結果及/或本文所述的一或多個優點所使用的各種方法及/或結構，皆為易於思及。各個變化及/或修飾，皆被認定為涵蓋於本文所述發明具體實施例的範圍中。更一般而言，本發明技術領域中具通常知識者可輕易了解，本文所述的所有參數、維度、材料及組態皆為示例性，且實際的參數、維度、材料及/或組態皆取決於本發明教示的特定應用方式。技術領域中具通常知識者將了解，本發明特定具體實施例的均等物，或能確保不使用過度的實驗方法確認均等物。因此應了解，前述具體實施例的描述僅為示例性，在不超出申請專利範圍及均等物範圍的情況下，本發明具體實施例可不以本發明說明書及申請專利範圍描述的方法實施，而可改用以其他方式實施。本揭露具體實施例係與本文所述的各項特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法有關。此外，在前述特徵、系統、物件、材料、套組及/或方法皆非互斥的情形下，其中任何兩項或兩項以上的組合皆不超出本揭露的發明申請專利範圍。

本文使用的所有定義，皆應被認為涵蓋字典定義、以引用方式併入文件中的定義，及/或所定義詞彙的一般意義。

本文揭露的所有文獻、專利及專利申請案，皆依標的分別以引用方式併入本文中，在某些情形下，引用內容可涵蓋整份文件。

除非另有相反解釋，本文說明書及申請專利範圍所使用的「一」、「一個」等不定冠詞應被理解為「至少一個」。

本文說明書及申請專利範圍所使用的「及/或」 一詞，應被理解為互相結合元件的「其一或兩者」，即在某些情形下互相結合、某些情形下分離的元件。以「及/或」列舉的多個元件應以相同方式解釋，即「一或多個」互相結合的元件。除特別以「及/或」一詞標示出的元件外，其他元件可選擇性存在，無論是否與特別標示出的元件有關。因此，作為一非限制性實例，當「A及/或B」一詞與開放性敘述（如「包含」）共同使用時，該詞在某一具體實施例中可僅指A（選擇性包括B以外的其他元件）；在另一具體實施例中，可僅指B（選擇性包括A以外的其他元件）；在又另一具體實施例中，可指A及B（選擇性包括其他元件）；以及其他情形。

本文說明書及申請專利範圍所使用的「或」一詞，應被理解為具有與前述的「及/或」相同的定義。舉例而言，區分清單中各項目時，「或」或「及/或」應被解釋為具涵括性，即包括許多元件或一系列元件其中的至少一個或一個以上，及選擇性包括未列出的其他元件。僅明白做出相反解釋的其他詞彙，如「僅一者」或「特定一者」或申請專利範圍中的「由...組成」，係指包括許多或一系列元件中的特定一者。一般而言，本文所使用的「或」一詞，在置於「兩者之一」、「其中一者」、「僅一者」或「特定一者」等排他性用語後方時，僅應解釋為彼此互斥的選項（即「一者或另一者，但非兩者」）。申請專利範圍中使用的「本質上由...組成」一詞，應具備專利法中代表的一般意義。

本文說明書及申請專利範圍所使用、用來指涉一或多個元件列表的「至少一者」一詞，應被理解為自該一或多個元件中的任一者或多個中選出的至少一個元件，且不排除列表中元件的任何排列組合。此定義同時允許元件選擇性存在，而不限於「至少一者」列表中特別標示出的元件，無論該選擇性存在元件是否與特別標示出的元件有關。因此，作為一非限制性實例，當「A及B其中至少一者」（或相當於「A或B其中至少一者」，或相當於「A及/或B其中至少一者」），在某一具體實施例中可指至少一個A且不含B，選擇性包括一個以上的A（且選擇性包括B以外的其他元件）；在另一具體實施例中，可指至少一個B且不含A，選擇性包括一個以上的B（且選擇性包括A以外的其他元件）；在又另一具體實施例中，可指至少一個A及至少一個B，且選擇性包括一個以上的A或B（且選擇性包括其他元件）；以及其他情形。

亦應了解的是，除非清楚做出相反解釋，本文中任何包括多於一個階段或步驟的方法，其中階段或步驟的順序不限於該方法所述的階段或步驟順序。

第 1A 至1B 圖 為一系列圖表，繪示使用環磷醯胺（CTX）治療EO771腫瘤小鼠的療效。第1A圖顯示以每劑150 mg/kg注射一或兩次CTX的EO771腫瘤小鼠的存活分析。第1B圖顯示以每劑125或150 mg/kg注射兩次CTX的EO771腫瘤小鼠的存活分析。每個實驗組的小鼠數據，係經由二到六次獨立實驗所取得整理而成。****p ≤  0.0001（時序檢驗 (Log-rank test)）。

第 2 圖 繪示CTX及NK細胞協同提升EO771腫瘤小鼠的存活率。自小鼠被植入腫瘤後第21日起，以PBS、NK細胞、CTX或CTX加NK細胞治療EO771腫瘤小鼠，並觀察小鼠存活情形。每組的數據係由二到六次獨立實驗所取得整理而成。****p ≤  0.0001（時序檢驗）。

第 3 圖 繪示CTX及NK細胞組合療法能誘發EO771腫瘤小鼠的免疫記憶。腫瘤小鼠被植入原發性EO771腫瘤後成功存活，接著使用EO771細胞對小鼠再接種（rechallenge）腫瘤，並分析其存活情形。將EO771細胞植入年齡相同的空白（naïve）小鼠作為控制組。數據係由二到五次獨立實驗所取得整理而成。****p ≤  0.0001（時序檢驗）。

第 4 圖 繪示對於EO771腫瘤切除小鼠，CTX及CTX加NK細胞療法具有使小鼠存活的類似效果。將小鼠於原位植入EO771細胞。其中一組小鼠未接受治療（PBS組）。其他小鼠則於21日後接受腫瘤及引流淋巴結切除手術。接著，腫瘤切除小鼠不接受進一步療法（僅接受切除手術）或以CTX或/及NK細胞治療。針對各組小鼠進行Kaplan-Meier 存活分析。每組數據係由二到七次獨立實驗所取得整理而成。****p ≤  0.0001（時序檢驗）。

第 5 圖 繪示NK細胞療法能增強EO771腫瘤切除小鼠體內具腫瘤特異性的免疫記憶。EO771腫瘤切除小鼠經治療後成功存活者，再次接種EO771細胞，並分析其存活情形。將年齡相同的空白小鼠植入EO771細胞作為控制組。數據係由二到五次獨立實驗所取得整理而成。****p ≤  0.0001及**p ≤  0.01（時序檢驗）。

Claims (21)

1. 一種組合用於製備治療癌症的套組的用途，其中該組合包含環磷醯胺(CTX)化合物及自然殺手(NK)細胞且不包含IL-2，且該套組施予方式包含：a.對有需要的受試者施予具有效量的該CTX化合物；及b.對該有需要的受試者施予具有效量的該NK細胞，其中，該癌症為固態癌症或血液型態癌症，其中，步驟(a)的該CTX化合物係於步驟(b)前至少6小時施予該受試者。
2. 如請求項1所述的用途，其中該CTX化合物為環磷醯胺、馬磷醯胺(mafosfamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)或曲磷胺(trofosfamide)，或其醫藥上可接受的鹽類。
3. 如請求項1或2所述的用途，其中步驟(a)包含至少兩劑之該CTX化合物，及/或步驟(b)包含至少兩劑之該NK細胞。
4. 如請求項3中所述的用途，其中步驟(a)包含至少兩劑之該CTX化合物，且其中每隔至少4-8天，對該受試者施予連續兩劑之該CTX化合物。
5. 如請求項4中所述的用途，其中每隔6天，對該受試者施予連續兩劑之該CTX化合物。
6. 如請求項1或2所述的用途，其中該受試者為人類病患，該病患罹患癌症、疑似罹患癌症或有罹患癌症的風險。
7. 如請求項1或2所述的用途，其中該固態癌症為乳癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰臟癌或膀胱癌。
8. 如請求項7所述的用途，其中該固態癌症為三陰性乳癌(TNBC)。
9. 如請求項1或2所述的用途，其中該血液型態癌症為白血病、淋 巴癌或多發性骨髓瘤。
10. 如請求項1或2所述的用途，其中該受試者已接受腫瘤切除術。
11. 如請求項1或2所述的用途，其中該CTX化合物及該NK細胞的劑量有效降低癌症復發的風險。
12. 如請求項1或2所述的用途，其中該等NK細胞在步驟(b)前於活體外(ex vivo)已暴露於IL-15及IL-12。
13. 一種組合用於製備誘發保護性免疫記憶以抑制腫瘤復發及/或降低腫瘤復發的風險的套組的用途，其中該組合包含環磷醯胺(CTX)化合物及自然殺手(NK)細胞且不包含IL-2，且該套組施予方式包含：a.對有需要的受試者施予具有效量的該CTX化合物；及b.對該有需要的受試者施予具有效量的該NK細胞，其中，該腫瘤為固態癌症或血液型態癌症，其中，步驟(a)的該CTX化合物係於步驟(b)前至少6小時施予該受試者。
14. 如請求項13所述的用途，其中該CTX化合物為環磷醯胺、馬磷醯胺(mafosfamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)或曲磷胺(trofosfamide)，或其醫藥上可接受的鹽類。
15. 如請求項13或14所述的用途，其中該受試者為罹患腫瘤的人類病患。
16. 如請求項15所述的用途，其中該人類病患接受過抗腫瘤療法。
17. 如請求項1或13所述的用途，其中該等NK細胞源於自體或異體。
18. 如請求項1或13所述的用途，其中該等NK細胞來自NK細胞株、由多能型幹細胞分化，或由經誘發的多能型幹細胞分化。
19. 一種用於治療癌症的套組，包含(i)環磷醯胺(CTX)化合物；及 (ii)自然殺手(NK)細胞，但不包含IL-2，其中，該癌症為固態癌症或血液型態癌症，且該CTX化合物係於施予該NK細胞前至少6小時施予受試者。
20. 如請求項19所述的套組，其中該等NK細胞於活體外(ex vivo)已暴露於IL-15及IL-12。
21. 如請求項19或20所述的套組，其中該CTX化合物為環磷醯胺、馬磷醯胺(mafosfamide)、異環磷醯胺(ifosfamide)或曲磷胺(trofosfamide)，或其醫藥上可接受的鹽類。

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