DK175492B1 - Fremstilling af thrombininhibitorer - Google Patents

Description

DK 175492 B1

Den foreliggende opfindelse vedrører rekombinant DNA-teknologiområdet og angår en fremgangsmåde til fremstilling af gensplejsede gærceller, de gensplejsede gærceller, hybridvektorer, som bærer et gen for desulphatohirudin, og frem-5 gangsmåder til fremstilling af gærcellerne og hybridvektorerne .

4

Hirudin er et antikoagulationsmiddel, som naturligt forekommer i medicinske blodigler (Hirudo medicinales).

10 Hirudin er ikke en enkelt proteinforbindelse, men består af mindst tre komponenter, som betegnes hirudinvariant 1 (HV1), hirudinvariant 2 (HV2), jf. beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 158.564, og g "des-(Val)2-hirudin" (jf. beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 158.986. Varianterne afviger fra hinanden i strukturmæssig henseende ved et antal aminosyrer (især er den N-terminale sekvens i HV1 Val-Val-Tyr, i HV2 Ile-Thr-Tyr og i "des-(Val)2_birudin 20 Thr-Tyr), men har alle en samling hydrofobe aminosyrer ved N-terminalen og en samling polære aminosyrer ved C-terminalen, en tyrosinrest (Tyr^3) som sulfatmonoester, tre disulfidbroer og antikoagulationsvirkning. 1 2 3 4 5 6 2

Hirudin, som har en K^-værdi (kompleks dissociations 3 konstant) på 6 x 10“H M, er den kraftigste kendte 4 thrombininhibitor og er karakteriseret ved en specifik 5 affinitet til thrombin. Andre enzymer i blodkoagulations- 6 processen inhiberes ikke af hirudin. I modsætning til heparin, som er det foretrukne antikoagulationsmiddel ved konventionel antikoagulationsterapi, har hirudin direkte inhiberende virkning på thrombin, og i modsætning til heparin virker det ikke gennem anti thrombin III. Den enéste farmakologisk påviselige virkning af renset hirudin er inhibering af blodkoaguleringen og profylaksen af thrombose. Ved intravenøs indgift til hunde er der selv

I DK 175492 B1 I

1 2 i

I ved udsædvanligt høje doser ikke konstateret nogen I

I virkning på hjertefrekvensen, åndedrættet, blodtrykket, I

I thrombocyttallet, fibrinogen og hæmoglobin. Ved forsøg med I

I 5 rotter, svin og hunde er det påvist, at hirudin er I

I virksomt ved eksperimentel thrombosis (fremkaldt enten ved I

I stasis eller ved injektion af thrombin), ved endotoxin- I

I chock samt ved DIC (dissemineret intravaskulær I

I koagulation). Ved alle direkte sammenligningsforsøg har I

I 10 hirudin vist sig at være bedre end heparin, endvidere har

I hirudin en yderst lav toksicitet, er ikke antigent og I

I udviser en næsten fuldstændig clearance via nyrerne i en I

I biologisk aktiv form. I

I Selv om hirudin har været kendt i lang tid, har det endnu I

I 15 ikke opnået den brede terapeutiske anvendelse, som man med I

I rette kunne forvente på grund af dets fremragende

I biologiske egenskaber. Det yderst begrænsede I

I tilgængelighed er en alvorlig ulempe, som står i vejen for I

I dets udstrakte anvendelse i medicinen. Hidtil har det kun I

I 20 været muligt at fremstille hirudinpræparater ud fra dyrt I

I og vanskeligt tilgængeligt naturmateriale (ekstrakter fra H

I medicinske blodigler), som er kostbart og vanskeligt at

I udvinde, og som kræver tidsrøvende og dyre isolerings- og I

I rensningsmetoder, jf. P. Walsmann et al., Pharmazie 36, I

I 25 653 (1981) og beskrivelsen til europæisk patentansøgning I

I nr. 158.986. I betragtning af den relativt lange sekvens I

I på 65 aminosyrer synes den konventionelle peptidsyntese af I

I økonomiske årsager heller ikke at kunne føre til et I

I resultat. Det er derfor nødvendigt at anvende nye I

I 30 fremgangsmåder til fremstilling af passende mængder H

I hirudin, som muliggør detaljeret klinisk afprøvning af I

I dets terapeutiske potentiale og dets brede terapeutisk I

I anvendelse ved antikoagulationsterapi. H

I Sådanne fremgangsmåder kan især udvikles ved hjælp af I

I 35 rekombinant DNA-teknologi. Ved hjælp af denne teknologi I

3 DK 175492 B1 er det muligt at fremstille de mest forskellige,, fysiologisk aktive polypeptider ved dyrkning af tilsvarende genetisk modificerede værtsorganismer. Det 5 skal i denne forbindelse nævnes, at hirudin formentlig fremstilles af medicinske blodigler via en desulfato-hirudinpræcurser, som sulfateret posttranslationelt. Det antages, at andre værter end medicinske blodigler mangler det secifikke sul fa tover føringsenzymsys tein og derfor vil 10 danne desulfatohirudiner i stedet for hirudiner. Den biologiske virkning forringes imidlertid ikke ved fraværelsen af sulfatgruppen, hvilket er påvist ved hjælp af desulfatohirudinproteinet fremstillet ved enzymatisk fjernelse af sulfatgruppen fra phe no1hydroxygruppen i 15 Tyr63-resten i det tilsvarende hirudinprotein, jf. beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 142.860.

I den offentliggjorte beskrivelse til europæisk patentansøgning nr. 158.564 beskrives fremstillingen af desulfatohirudinvarianter 1 og 2 og analoge deraf ved 20 hjælp af Escherichia coli-celler transformeret med piasmider, som indeholder strukturgenerne for de pågældende desulfatohirudiner. Antikoagulations- aktiviteten målt i celleekstrakter fra dyrkede Escherichia coli-celler og udtrykt som antithrombinenheder ("ATU") 25 udgør 3000-4000 ATU/ODgøø/l kultur, som svarer til en koncentration på 0,2 mg hirudin/OD/1, baseret på en anslået specifik aktivitet på 15000-20000 ATU/mg for rent hirudin.

Antagelig skyldes det ringe udbytte af hirudinvirkning 30 udvundet fra transformerede Escherichia coli-celler en akkumulering af størsteparten af hirudinproteinet i en inaktiv form i cytoplasmaet som følge af forkert foldning af molekylet. Den korrekte foldning afhænger af dannelsen af tre disulfidbroer i hirudinmolekylet, som er afgørende 35 for enzymaktivit, jf. den ovenfor omtalte artikel af

I DK 175492 B1 I

I 4 I

I P. Walsmarm et al. andre naturligt udskilte I

I pattedyrproteiner, såsom bovint væksthormon, human I

I vævspiasminogenaktivator og humant γ-interferon er I

I 5 ligeledes stort set inaktive, når de dannes og akkumuleres I

I 1 mikroorganismernes cytoplasmer, jf. R.A. Smith et al., I

I Science 229, 1219 (1985). Det er klart, at sekretionsvejen I

I kan favorisere dannelsen af disulfidbindinger, da de I

I fleste proteiner, som indeholder disulfidbroer, er I

I 10 extracellulære. Der er andre forhold, som gør sekretion I

I yderst fordelagtig: I

I Udskilte proteiner er sædvanligvis lettere at påvise og at I

I rense end intracellulært akkumulerede produkter, I

I udskillelse af ønskede produkter i mediet gør det I

I 15 overflødigt at oplukke værtsorganismerne for at udvinde I

I produktet, I

I nogle heterologe proteiner kan have en toksisk virkning på I

I værtsorganismen. Når de er udskilt er der mindre I

I sandsynlighed for, at de griber ind i de normale I

I 20 cellefunktioner, I

I der er mindre sandsynlighed for, at udskilte proteiner I

I spaltes af proteolytiske enzymer end intracellulært I

I akkumulerede proteiner, som angribes af disse enzymer ved I

I nedbrydning af cellerne. I

I 25 De fleste udskilte proteiner er Indkodet 1 DNA'et som I

præproteiner med et signalpeptid som en vedhæftet I

aminoterminalforlængelse af den modne aminosyresekvens. I

Signalpeptidet spiller en afgørende rolle under I

cotranslationel indsætning af proteinet i membranerne i I

30 det endoplasmatiske reticulum (ER), en signalpeptidase I

spalter signalpeptidet på et tidligt stadium på den I

luminale side af ER'et. Yderligere transport til den ydre I

cellemembran involverer Golgi og sekretionsvesikier. I

Proteinet udskilles enten til det periplasmatiske rum, I

35 f.eks. sur phosphatase, invertase) eller til I

dyrkningsmediet (f.eks. α-faktor, dræbertoxin). I

5 DK 175492 B1

Da alle eukatyoter synes at have mekanismerne for ekspressionen af genetisk information og til sortering af de udtrykte proteiner, forløber ekspressionen af 5 eukaryotiske gener- med større effektivitet i en eukaryotisk vært end i Escherichia coli. Blandt de eukaryotiske organismer er gær den, som er lettest at håndtere og at dyrke. En række heterologe^proteiner er med godt resultat blevet udtrykt i gær. Det har imidlertid 10 endnu ikke været muligt at fastlægge essentielle træk ved protein, bortset fra et vedhæftet signalpeptid, som tillader effektiv udskillelse til mediet. Det er derfor ikke muligt at foretage pålidelige forudsigelser med hensyn til den eventuelle udskillelse af et protein. Selv 15 om således 90% af total glucoamylase dannet af transformeret går (indeholdende den genetiske information for præglucoamylase) er udskilt til mediet (PCT-ansøgning nr. 84/2921), og høje koncentrationer af epidermal vækstfaktor (EGF) er påvist i mediet fra dyrket gær 20 indeholdende EGF-genet med det påhæftede α-faktorsignalpeptid (beskrivelsen til europæisk

patentansøgning nr. 116.201), er der kun påvist små mængder eller spor af (3-endorphin (α-faktorsignalpeptid, PCT-ansøgning nr. 84/4330), leucocytinterferon A

25 (invertaseslgnalpeptid, europæisk patentansøgning nr.

127.304), humant or-interferon, humant serumalbumin, bovint interferon al og a2, vævsplasminogenaktivator, rennin og human insulinagtig vækstfaktor (a-faktorsignalpeptid, europæisk patentansøgning nr. 123.544), leucocytinterferon 30 D og A, y-interferon og humant væksthormon (MGH) (henholdsvis interferon og MGH-signalpeptider, europæisk patentansøgning nr. 88.632) i mediet, og der er ikke iagttaget sekretion af Pseudomonas carboxypeptidase G2(CPG2) [G2(CPG2) signalpeptid, europæisk patentansøgning 35 nr. 121.352] og vævsplasminogenaktivator (PH05-signal-peptid, europæisk patentansøgning nr. 143.081) fra transformeret gær.

I DK 175492 B1 I

I 6 I

I Det er således Ikke muligt at forudsige, om et givet I

I protein med et vedhæftet signalpeptid udskilles af gær, og

I hvorvidt dette sker afhænger først og fremmest af det I

I 5 valgte protein. I

I Det har derfor været usikkert, om et udvalgt protein,

I f.eks. hirudin, med et vedhæftet signalpeptid ville blive I

I udskilt, i det mindste i en vis grad, af transformerede I

I værtsorganismer, såsom gær. I

I 10 Det har overraskende vist sig, at proteiner med I

I hirudinaktivitet udskilles i mediet af eukaryotiske I

I værtsorganismer, der indeholder et DNA omfattende en I

I DNA-sekvens, der indkoder et signalpeptid "upstream" for I

I og i aflæsningsstrukturer (reading frame) med I

I 15 strukturgenet for desulfatohirudin, I

I Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe en I

I fremgangsmåde til fremstilling og udskillelse af proteiner I

I med hirudinaktivitet i en eukaryotisk værtsorganisme. Det I

I er tillige formålet med opfindelsen at tilvejebringe I

I 20 hybridvektorer, som indeholder en DNA-sekvens, der I

I indkoder et signalpeptid upstream for og i aflæsnings- I

I strukturer med strukturgenet for desulfatohirudin, samt I

I eukaryotiske værtsorganismer transformeret med I

I hybridvektorerne. I

I 25 1. Fremgangsmåde til fremstilling af desulfatohirudin. I

I Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af de- I

I sulfatohirudin, ved hvilken man under passende næringsbe- I

I tingelser dyrker gærværtsceller transformeret med en hy- I

I bridvektor indeholdende ét eller flere DNA-inserter, som I

I 30 hver indeholder en gærekspressionskontrolsekvens, et DNA- I

I segment bestående af en første DNA-sekvens, der koder for I

I gær-PH05- eller -invertase-signalpeptidet, opstrøms for og I

7 DK 175492 B1 i læseramme med en anden DNA-sekvens, som koder for modent desulfatohirudin', hvilket DNA-segment er under transskriptionskontrol af den nævnte ekspressionskontrolselvens, og en DNA-sekvens, som indeholder gærtransskriptionsstopsigna-5 ler, og isolerer desulfatohirudin fra dyrkningsmediet.

Udtrykket "DNA-sekvens, som koder for modent desulfatohirudin" , skal omfatte alle strukturgener, der koder for modne poteiner med hirudinaktivitet, som vides at eksistere i og/eller kan isoleres fra iglegenomet, såsom strukturgenerne for modne desulfatohirudinvarianter HVl, HV2, PA og for des-( Val ^-desulfatohirudin, medmindre sidstnævnte blot er et artefakt at ekspressionen af HVl-genet. Udtrykket "modent desulfatohirudin" omfatter ^ desulf atohirudiner, som ikke indeholder præ- og prosekvenser.

Med "proteiner med hirudinaktivitet" skal forstås de proteiner opnpået fra de udskilte værtsceller, som har en thrombininhiberende virkning og giver en positiv reaktion med antihirudin-antistoffer , og som har primærstruktur som et desulfatohirudin samt modificerede, såsom sulfaterede, derivater deraf, f.eks. de tilsvarende hirudiner, og afkortede derivater deraf, såsom 25 desulf atohirudiner, som mangler en til syv aminosyrer ved C-terminalen.

Sådanne proteiner er især sådanne med formlerne 30 X Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys

Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys

Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val Thr Gly

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe

Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin I (I)

R

I DK 175492 B1 I

I I

I hvori X betyder dipeptidresten Val-Val-(HVl) eller I

I Thr(Des-(Val)2-hirudin), og X betyder phenolhydroxygruppen I

I i Tyr eller en gruppe med formlen -OSO3H, og de derivater, I

I som mangler den C-terminale aminosyre Gin, det C-terminale I

I 5 dipeptid -Leu-Gln, det C-terminale tripeptid I

I -Tyr(R)-Leu-Gln eller det C-terminale tetrapeptid I

I -Glu-Tyr(R)-Leu-Gln, eller I

I 10 Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys I

I Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys I

I Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Val Thr Gly I

I Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe I

I Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin I

I 5 i <n> I

I 20 I

I (HV2), hvori R har de ovenfor angivne betydninger, eller

I en anden hirudinvariant med betegnelsen hirudin PA,. som I

dannes af igler (J. Dodt, Thesis, Mfinchens universitet, I

DE, 1984), og som har formlen I

25 I

(III) I

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys I

Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys I

30 I

Ile Leu Gly Ser Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Val Thr Gly

Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe I

Glu Pro Ile Pro Glu Asp Ala Tyr Asp Glu I

R I 1 9 DK 175492 B1 (PA), hvori R har de ovenfor angivne betydninger.

Det foretrukne protein med hirudinaktivitet er et protein med formlen I, hvori X betyder resten Val-Val, og R 5 betyder phenolhydroxygruppen i Tyr, samt de derivater deraf, som er afkortede ved C-terminalen med 1-7, især 1-4 aminosyrer.

Egnede gærværtsceller er især celler af Saccharomyces cere-10 visiae.

Gærværtscellerne, som indeholder de ovenfor omtalte DNA-sekvenser, dyrkes under anvendelse af kendte fremgangsmåde.

15 Transformerede gærstammer dyrkes ifølge opfindelsen således i et flydende medium, som indeholder assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske salte.

Der kan anvendes forskellige carbonkilder. Som eksempler på 20 foretrukne carbonkilder kan nævnes assimilerbare kulhydrater, såsom glucose, maltose, mannitol og lactose, eller et acetat, som kan anvendes alene eller i egnede blandinger.

Egnede nitrogenkilder omfatter f.eks. aminosyrer, f.eks. casaminosyrer, peptider og proteiner samt deres nedbryd-25 ningsprodukter, såsom trypton, pepton eller kødekstrakt, endvidere gærekstrakt, maltekstrakt, majsstøbevand, samt airanniumsalte, såsom ammoniumchlorid, ammoniumsulfat eller ammoniumnitrat, som kan anvendes alene eller i egnede blandinger. Anvendelige uorganiske salte omfatter f.eks. sulfa-30 ter chlorider, phosphater og carbonater af natrium, kalium, magnesium og calcium. Desuden kan dyrkningsmediet indeholde vækstfremmende stoffer, som f.eks. sporeelementer, såsom jern, zink, mangan og lignende, eller individuelle aminosyrer.

I DK 175492 B1 I 10 I Gærceller transformeret med piasmider, som kopierer

I autonomt, f.eks. plasmider indeholdende gær 2p-plasmid-DNA

I (infra), har i varierende grad tendens til at miste det I indforte hybridplasma. Af denne årsag skal sådanne I 5 gærceller dyrkes under selektive betingelser, dvs.

I betingelser, som kræver ekspressionen af et plasmidkodende I gen for vækst. De fleste selektive markører, som anvendes I for tiden, og som forekommer i hybridvektoreme ifølge I opfindelsen (infra), er gener, som koder for enzymer for I 10 aminosyrer eller purinbiosyntese. Dette gør det I nødvendigt, at anvende syntetiske minimalmedier, som mangler den tilsvarende aminosyre eller purinbase.

Imidlertid kan nogle gener, som frembringer resistens over I for et passende biocid, lige så godt anvendes, f.eks.

I 15 gener, som bibringer resistens over for cycloheximid, over for aminoglycosid G 418, over for et tungmetal eller lignende. Gærceller transformeret med vektorer, som

indeholder intibiotiske resistensgener, dyrkes i komplekse I

I medier, der indeholder det tilsvarende antibiotikum,hvorved I

20 der opnås større væksthastigheder og højere celletæthed. I

I Gærceller transformeret med DNA integreret i kromosomerne I

I kræver ikke selektive vækstbetingelser. Disse I

transformerede celler er tilstrækkeligt stabile til I

I 25 opnåelse af vækst uden selektionstryk. Disse celler dyrkes I

fordelagtigt i komplekse medier. I

I Gærceller, som indeholder hybridpi asmider med en I

I konstitutiv promotor, f.eks. ADHI, GAPDH, udtrykker I

I 30 desulfatohirudingenet kontrolleret af promotoren uden I

I induktion. Hvis desulfatohirudingenet imidlertid er under I

kontrol af en reguleret promotor, f.eks. PGK eller PH05, I

I skal dyrkningsmediets sammensætning tilpasses til opnåelse I

I maksimale koncentrationer af mRNA-transkriptor, dvs. at I

I 35 når PHO5-promotoren anvendes, skal vækstmediet indeholde I

I en lav koncentration af uorganisk phosphat for tilkobling I

I (derepression) af denne promotor. I

ii DK 175492 B1

Dyrkningen gennemføres under anvendelse af konventionel dyrkningsteknik. Dyrkningsbetingelserne, såsom temperatur, mediets pH-værdi og fermenteringstiden, vælges på en sådan måde, at der opnås maksimale koncentrationer af 5 desulfatohirudin. En valgt gærstamme dyrkes fortrinsvis under aerobe betingelser i submers kultur med rystning eller omrøring ved en temperatur på fra ce. 25 til ca.

35eC, fortrinsvis ved ca. 30eC, ved en pH-værdi på 4-8, f.eks. ved en pH-værdi på ca. 7, i et tidsrum på fra ca. 4 10 til ca. 20 timer, fortrinsvis til der er opnået maksimale udbytter af proteinerne.

Det har overraskende vist sig, at uanset den anvendte gærvært og det anvendte signalpeptid udskilles 15 størsteparten af de producerede hirudinforbindelser til kulturmediet, hvorimod kun en mindre del forbliver bundet i celler. Det nøjagtige forhold (udskilte forbindelser /cellebundne forbindelser) afhænger af fermenterings-betingelserne og den anvendte udvindingsproces.

20 Almindeligvis er forholdet ca. 1:9 eller derover. Følgelig er udskilt hirudin altid stærkt dominerende.

Hirudinforbindelseme kan isoleres fra dyrkningsmediet på konventionel måde. Eksempelvis består det første trin 25 sædvanligvis i adskillelse af cellerne fra dyrkningsvæsken ved centrifugering. Den dannede supernatant kan opkoncentreres md hensyn til hirudinforbindelser ved behandling med polyethylenimin til fjernelse af størsteparten af det ikke-proteinholdige materiale, og 30 fældning af proteinerne ved mætning af opløsningen med ammoniumsulfat eller med trichloreddikesyre. Såfremt der forekommer værtsproteiner kan disse også fældes ved syrning med eddikesyre, f.eks. 0,l%*s, pH 4-5). En yderligere koncentrering af hirudinforbindelseme kan 35 opnås ved ekstraktion af den eddikesure supernatant med n-butanol. Andre rensningstrin indbefatter f.eks.

afsaltning, kromatografiske processer, såsom - — —i

I DK 175492 B1 I

I 12 I

I ionbytterkromatograf I, gelfiltreringskromatografi, I

fordelingskromatografi, HPLC, HPLC med omvendt fase og I

I lignende. Adskillelsen af blandingens bestanddele kan også I

I gennemføres ved dialyse, efter ladning ved gelelektro- I

I forese eller bærefri elektroforese, efter molekyl- I

5 I

størrelse ved hjælp af en egnet "Sepbadex”®-søjle, ved I

affinitetskromatografi, f.eks. antistoffer, især I

I monoklonale antistoffer, eller med thrombin koblet til en I

I egnet bærer til affinetetskromatografi eller ved andre I

fremgangsmåder, især fremgangsmåder kendt fra littera- I

I turen. I

I Det har overraskende vist sig, at bortset fra desulfatohi- I

I rudinforbindelserne svarende til "DNA-sekvensen, som koder I

I for modent desulfatohirudin" kan der isoleres nogle andre I

I 15 I

desulfatohirudinforbindelser fra dyrkningsvæsken, som |

I afviger fra de forventede forbindelser ved at mangle 1-4 I

I aminosyrer ved C-terminalen. Dyrkning af gærceller, som I

I bærer genet, der koder for desulfatohirudinvariant HV 1, I

I giver således denne variant samt, i lavere udbytter, I

I 20 I

desulfatohirudinforbindelser, som mangler den C-terminale

I aminosyre Gin [ Des-(Gln^5)-desulfatohirudin ], den I

I C-terminale dipeptidrest - Leu-Gin [Des-(Leu^^, Gln^S)- I

I desulfatohirudin], den C-terminale tripeptidrest -Tyr-Leu- I

I Gin [Des-(Tyr63, Leu^^, Gln®^)-desulfatohirudin ] og den I

I 2^ C-terminale tetrapeptidrest -Glu-Tyr-Leu-Gln [Des-(Glu62. I

I Tyr^3f Leu^4f Gln^^)-desulfatohirudin ]. Disse forbindelser I

I kan være dannet ved (partiel) proteolytisk spaltning af I

I det primære ekspressionsprodukt desulf atohirudin og er I

I blevet påvist i alle dyrkningsvæsker uanset den anvendte ! I

I 30 gærvært og de anvendte fermeteringsbetingelser. I

I Til påvisning af hirudinaktivtet kan anvendes testen med I

I anti-hirudin- eller anti-desulfatohirudin-antistoffer I

I (f.eks. monoklonale antistoffer opnået fra I

35 I

hybridomaceller), thrombintesten [M.U. Bergmeyer

I (redaktør), Methods in Enzymatic Analysis, bind II, s. I

I 314-316, Verlag Chemie, Weinheim, DE, 1983 ] eller blodkoa- I

I gulationstesten [F. Markwardt et al., Thromb. Haemost. 47, I

I 26 (1982) ]. I

13 DK 175492 B1

De transformerede gærværtsceller ifølge opfindelsen kan fremstilles ved anvendelse af rekombinant DNA-teknik, som omfatter fremstilling af en DNA-konstruktion indeholdende en 5 gærekspress ionskontrol sekvens, et DNA-segment, beståen de af en første DNA-sekvens, der koder for et signalpeptid "upstream'’ for og i afæsninsstruktur med en anden DNA-sekvens, som kode for moden desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transskriptionskontol af 10 ekspressionskontrolsekvensen, og en DNA-sekvens inde holdende gærtransskriptionsstopsignaler, fremstilling af en hybridvektor indeholdende denne DNA-konstruktion transformering af egnede gærværtsceller med den dannede 15 hybridvektor og selektering af transformerede værtsceller fra ikke-transformerede værtsceller.

2. DNA-konstruktloner indeholdende kodningsområderne for 20 et signalpeptid og for desulfatohirudin

Opfindelsen angår en DNA-konstruktion indeholdende en gærekspressionskontrolsekvens, et DNA-segment bestående af en første DNA-sekvens, som indkoder et signalpeptid ”up-25 stream” for i aflæsningsstruktur med en anden DNA-sekvens, der koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transskriptionskontrol af ekspressionskontrolsekvensen, og en DNA-sekvens, der indeholder gaertransskriptionsstopsignaler.

30

Der kan anvendes adskillige gærekspressionskontrolsekvenser til regulering af ekspressionen af DNA-sekvenserne, der· koder for signalpeptidet og desulfatohirudin. Der anvendes især ekspressionskontrolsekvenser fra stærkt udtrykte gener fra værten, som skal transformeres.

I DK 175492 B1 I

I 14 I

I Ekspressionskontrolsekvenser for gær er afledt af det geno- I

I matiske DNA fra gær, især fra Saccharomyces cerevisiae. I

I Fortrinsvis anvendes ekspressionskontrolsekvensen fra et I

I stærkt udtrykt gærgen til ekspression af desulfathohirudin. I

I 5 Der kan således anvendes promotoren fra TrPl-genet. ADHI- I

I genet eller ADHII-genet, sur phosphatase {PH05)-genet, iso- I

I cytochrom c-genet eller en promotor fra enolase-, glyceral- I

I dehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)-, 3-phosphoglycer- I

I aldehyd-3-(PGK)-, hexokinase-, pyruvatdecarboxylase-, phos- I

I 10 phofructokinade-,glucose-6-phosphatisomerase-, 3-phospho- I

I glyceratmutase-, pyruvatkinase-, triosephosphatisomerase-, I

I phosphoglucoisomerase-, og glucokinasegenerne eller en pro- I

I motor fra gærsparringspheromongeneme, som koder for a- I

I eller a-faktoren. Det er også muligt at anvende hybridpro- I

I 15 motorer indeholdende ’'upstream" aktiverings sekvens er (UAS) I

I fra et gærgen og "downstream" promotorelementer indeholden- I

I de en funktionel TATA-bos fra et andet gærgen, f.eks. I

I hybridpromotor indeholdende en eller flere UAS fra gær I

I PH05-genet og "downstream” promotorelementer indeholdende I

I 20 øn funktionel TATA-box fra gær GAPDH-genet. Foretrukne I

I vektorer ifølge den foreliggende opfindelse indeholder I

I promotorer med transskriptionskontrol. Promotorer af denne

I type, f.eks. promotoren for PH05- og GAPDH-geneme, kan I

I tilkobles eller frakobles ved at variere vækstbetingel- I

I 25 serne. Eksempelvis kan PH05-promotoren frakobles I

I (repressed) eller tilkobles (derepressed) efter ønske ved I

I blot at forøge eller sænke koncentrationen af uorganisk I

I phosphat i mediet. En anden foretrukken promotor ifølge I

I opfindelsen er promotoren for GAPDH-genet, især et I

I funktionelt fragment deraf, som starter ved nucleotid -300 I

I til -180, især ved nucleotid -263 eller -199, og som ender I

I ved nucleotid -5 i GAPDH-genet. I

I 35 Signalsekvenser ifølge opfindelsen er de sekvenser i gær I

I PH05-genet, som koder for et signalpeptid med formlen I

15 DK 175492 B1

Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala, og for gærinvertasegenet, som koder for et signalpeptid g med formlen

Met Leu Leu Gin Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala DNA-sekvensen, som koder for modent desulfatohirudin, er specielt valgt blandt strukturgenerne for desulfatohiru-diner anført ovenfor. Den foretrukne DNA-sekvens koder for desulfatohirudinvariant 1 (HV1) og har formlen

15 GTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA

TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAG

AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTC

20

TGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAA

ACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTT

GAAATCCCGGAAGAATACCTGCAG 25 CTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTC.

En DNA-sekvens, som indeholder gærtransskriptionstionsstop-signaler, er fortrinsvis 3’-flankeringssekvensen i et gærgen, som indeholder korrekte signaler for transskriptions-30 stop og polyadenylering. Egnede 3'-flankeringssekvenser er f.eks. sekvenser af det gen, der naturligt er bundet til den anvendte ekspresionssekvens. Når der anvendes gær som værtsorganisme, er de foretrukne flankeringssekvenser sådanne fra gær PH05-gnet. Fortrinsvis indeholder gærkon-35 struktionen ifølge opfindelsen ved begge ender syntetiske deoxynucleotid-linkere, som tillader indsætning og kloning af konstruktionen i en kloningsvektor.

I DK 175492 B1 I

I 16 I

I Gærekspressionskontrolsekvensen, DNA-sekvensen, som koder I

I for signalpeptidet, DNA-sekvensen, som koder for modent de- I

sulfatohirudin, og gærtransskriptionsstopsignaler er opera- I

I belt bundet til hinanden, dvs. de er sammenstillet på en I

I 5 sådan måde, at deres normale funktioner er bevaret. Række- I

I følgen er således sådan, at ekspressionskontrolsekvensen I

I udover korrekt ekspression af signalpeptid-desulfatohiru- I

I dinkomplekset, transskriptionsstopsignalerne udover korrekt I

I afslutning af transskription og polyadenylering, og signal- I

10 sekvensen er bundet til desulfatohirudingenet på en sådan I

I måde, at der optræder udskillelse af desulfatohirudin. Hvis I

I ekspressionskontrolsekvensen og signalsekvensen derfor er I

I afledt af forskellige gener, er ekspressionskontrolsekven- I

I sen fortrinsvis knyttet til signalsekvensen mellem hoved I

I 15 mRNA-starten og ATG'en for genet, der er naturligt bundet I

I til ekspressionskontrolsekvensen. Signalsekvensen bor have I

I dets egen ATG til translationsstart. Bindingen mellem disse I

I sekvenser gennemføres fortrinsvis ved hjælp af syntetiske I

I oligodeoxynucleotidlinkere, som kan bære genkendelsesse- I

I 20 kvensen for endonuclease. På den anden side er den sidste I

I kodon i signalsekvensen bundet direkte til den første kodon I

I i genet for desulfatohirudin. I

I DNA-konstruktionerne ifølge opfindelsen kan fremstilles un-

I 25 der anvendelse af kendte fremgangsmåder, f.eks. ved binding I

I af gærekspressionskontrolsekvens, et DNA-segment bestående I

I af en første DNA-sekvens, der koder for et signalpeptid I

I "upstream" for og i aflæsningsstruktur med en anden DNA- I

I sekvens, der koder desulfatohirudin, og en anden DNA- I

I 30 sekvens indeholdende gærtransskriptionsstopsignaler i den I

I forudbestemte rækkefølge. I

I Sammenbinding af de forskellige DNA-sekvenser til dannelse

af DNA-konstruktionen ifølge opfindelsen kan gennemføres H

35 ved såkaldt "kortende"-ligering eller over egnede fælles I

restriktionssteder eller syntetiske linkermolekyler, idet I

17 DK 175492 B1 der skal tages særligt omsorg for opnåelse af en korrekt sammenbinding, således at disse DNA-sekvensers normale funktioner opretholdes. Signalsekvensen og desulfatohiru-dingenet kan således sammenbindes ved ligering af korte 5 ender. En anden metode til dannelse af den korrekte samling af signalsekvensen og desulfatohirudingenet består * eventuelt i restriktion af signalsekvensen nær dens 3*-ende og desulfatohirudingenet nær dets 5'-ende, således at hvert sekvens mangler et forudbestemt antal basepar.

10 Der kan derefter konstrueres en syntetisk oligodeoxynucleotidlinker på en sådan måde, at når den spaltede signalsekvens og det spaltede desulfatohirudingen samles ved hjælp af forbindelsesoligodeoxynucleotidet, gendannes de manalende basepar, og desulfatohirudingenet 15 er i korrekt aflæsningsranune i forhold til signalsekvensen.

DNA-sekvensen, som koder for desulfatohirudin, kan

isoleres fra genomisk igle-DNA, eller der dannes et 20 komplementært, dobbeltstrenget desulfatohirudin-DNA

(desulfatohirudin ds cDNA) ud fra desulfatohirudin mRNA, eller der dannes et gen, som koder for aminosyresekvensen i desulfatohirudin, ved hjælp af kemiske og enzymatiske processer.

25

Genomisk desulfatohirudin DNA og desulfatohirudin ds cDNA opnås f.eks. under anvendelse af i og for sig kendte fremgangsmåder. F.eks. kan genomisk desulfatohirudin DNA opnås fra en iglegenbank, som indeholder desulfato-30 hirudingenet, ved at klone igle DNA-fragmenterne i mikroorganisme og identificerer kloner, som indeholder desulfatohirudin DNA, f.eks. ved kolonihybridisering under anvendelse af et radioaktivt mærket desulfatohirudin-DNA specifikt oligodeoxynucleotid, som indeholder mindst 35 15 fortrinsvis 15-30, deoxynucleotider. De dannede DNA- fragmenter indeholder i reglen foruden desulf atohirudingenet andre uønskede DNA-best anddele, som kan fjernes ved behandling med egnede exo- eller endonucleaser.

I DK 175492 B1 I

I 18 I

I Dobbeltstrenget desulfatohirudin cDNA kan eksempelvis I

I fremstilles ved at Isolere mRNA fra egnede Igleceller, der I

I fortrinsvis er Induceret til dannelse af hirudin, I

I koncentrering af desulfatohirudin mRNA'et i den fremkomne I

H

I 5 mRNA-blanding på i og for sig kendt måde, anvendelse af I

I dette mRNA som en skabelon for fremstillingen af I

I enkeltstrenget cDNA, syntetisering af ds cDNA ud fra dette I

I ved hjælp af en RNA-afhængig DNA-polymerase, og kloning af I

I sidstnævnte i en egnet vektor. Kloner, som indeholder I

I iq desulfatohirudin cDNA identificeres eksempelvis på den I

I ovenfor bkrevne måde ved kolonihybridisering under I

I anvendelse af et radioaktivt mærket, desulfatohirudin I

I DNA-specifikt oligodeoxynucleotid. I

I 15 Desulfatohirudingenet kan også fremstilles ved kemisk I

I syntese. Denne er karakteriseret ved, at segmenter af den I

I kodende streng og af den komplementære streng af genet I

I syntetiseres kemisk, og dannede segmenter omdannes I

I enzymatisk til et strukturgen for desulfatohirudin. I

I 20 I

I Den kemiske syntese af DNA er velkendt og gennemføres I

I under anvendelse af konventionel teknik. Hensigtsmæssige I

I teknikker er omtalt i en oversigtsartkel af S. A. Narang, I

I Tetrahedron 39, 3 (1983). Især kan fremgangsmåderne omtalt I

I 25 i beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 146.785 I

I anvendes. I

I På analog måde kan signalsekvensen fremstilles ved kemisk I

I syntese, eller den isoleres fra kromosomalt DNA ved gær. I

19 DK 175492 B1 3. Hybridvektorer indeholdende DNA-konstruktioner med kodningsområderne for et signalpeptid og for desul-fatohirudin 5 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes desuden en hybridvektor indeholdende et eller flere DNA-inserter, som hver indeholder en gærekspressionskontrolsekvens, et DNA-segment bestående af en første DNA-sekvens, der koder for et gær-PH05- eller inverlasesignalpeptidet opstrøms for 10 og i aflæsningsramme med en anden DNA-sekvens, der koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transskriptionskontrol af ekspressionskontrolsekvensen, og en DNA-sekvens indeholdende gærtransskriptionsstopsignaler.

15

Opfindelsen angår også især hybridplasmider, som foruden ekspressionskontrolsekvensen, det ovenfor omtalte DNA-segment og sekvensen indeholdende transskriptionsstopsignaler indeholder yderligere DNA-sekvenser, som ikke er 20 essentielle eller mindre betydningsfulde for promotorens funktion, dvs. for ekspressionen af desulfatohirudingenet, men som udfører vigtige funktioner, f.eks. propageringen af cellerne transformeret med hybridpiasmiderne. De yderligere DNA-sekvenser kan være afledt af prokaryotiske 25 og/eller gærceller og kan omfatte kromosomale og/eller eks-trakromasomale DNA-sekvenser. Eksempelvis kan de yderligere DNA-sekvenser stamme (eller bestå af) plasmid DNA, såsom bakteriel eller eukaryotisk plasmid DNA, virus DNA og/eller kromasomal DNA, såsom bakteriel, gær eller gærkromasomal 30 DNA. Foretrukne hydridplasmider indeholder yderligere DNa-sekvenser afled af bakterieplasmider, især Escherichia co- li-plasmid pBR322 eller beslægtede plasmider, bakteriofag γ, gær 2μ og eller gærkromasomal DNA.

I DK 175492 B1 I

I 20 I

I I de foretrukne hybridpiasmider ifølge opfindelsen bærer I

I de yderligere DNA-sekvenser et gærreplikationsområde og en I

I selektiv genetisk markør for gær. Hybridpiasmider, som I

I indeholder et gærreplikationsområde, f.eks. et autonomt I

I 5 kopierende segment(ars), opretholdes ekstrakromasomalt i I

I gærcellerne efter transformation og kopieres autonomt I

I efter mitose.Hybridplasmider, som indeholder sekvenser, I

I der er homologe til gær-2μ-plasmid DNA, kan også anvendes. I

I Disse hybridplasmider vil ved rekombination blive integre- I

I 10 ret i 2μ-plasmideΓ, der allerede forekommer i cellen, I

I eller de vil blive kopieret autonomt. I

I Hvad angår den selektive gen-markør for gær, kan der I

I anvendes et vilkårligt markørgen, som letter selektionen I

I 15 af transformanter som følge af den fænotypiske ekspression I

I af markøren. Egnede markører for gær især sådanne, som I

I udtrykker antibiotisk resistens eller, i tilfælde af I

I auxotrope gærmutanter, gener, som kompletterer I

I værtslæsioner. Tilsvarende gener bibringer eksempelvis I

I 20 resistens overfor antibiotikumet cycloheximid eller I

I tilvejebringer prototrofi i en auxotrop gærmutant, f.eks. I

I URA1-, URA3-, ARG4-, LEU2-, HIS4-, HIS3-, TRP5- eller I

I TRPl-genet. I

I 25 Det er en fordel, at de yderligere DNA-sekvenser, som I

I findes i hybridplasmideme ifølge opfindelsen, også I

I indeholder et replikationsområde og en selektiv genetisk I

I markør for en bakterievært, især Escherichia colie. Der er I

I fordele forbundet med tilstedeværelsen af et Escherichia I

I 30 coli-replikationsområde og en Escherichia coli-markør i et I

I gærhybridplasmid. For det første kan der opnås store I

I mængder hybridplasmid DNA ved vækst og forstærkning i I

I Escherichia coli, og for det andet gennemføres dannelsen I

I af hybridplasmider hensigtsmæssigt i Escherichia coli I

I 35 under anvendelse af alle dele af kloningsteknologien I

I baseret på Escherichia coli. Escherichia coli-plasmider, I

I såsom pBR322 og lignende, indeholder såvel Escherichia I

21 DK 175492 B1 coli-replikationsområde og Escherichia coli genetiske markører, som tilvejrbringer resistens mod antibiotika, f.eks. tetracyclin og ampicillin, og anvendes fordelagtigt som en del af gærhybridvektorerne.

5

De yderligere DNA-sekvenser, der eksempelvis indeholder replikat ionsområde og genmarkører for gær og en bakterievært (se ovenfor), betegnes i det følgende som "vektor DNA", som sammen med den ovenfor beskrevne 10 DNA-konstruktion, dér bl.a. indeholder ekspressionskontrolsekvensen og desulfatohirudingenet, danner et hybridplasmid ifølge opfindelsen.

Hybridvektoreme ifølge opfindelsen kan indeholde en eller 15 flere DNA-inserter, som hver for sig bl.a. indeholder igærekspressionskontrolsekvensen, DNA-sekvensen, som koder for signalpeptidet, og DNA-sekvensen, der koder for modent desulfatohirudin. Hvis hybridvektorerne indeholder flere DNA-inserter, fortrinsvis 2-4 DNA-inserter, kan disse 20 forekomme i et tandemarrangement eller på forskellige steder i hybridvektoren. Foretrukne hybridvektorer indeholder en DNA-insert eller DNA-inserter i tandemarrangement. DNA-inserterne forekommer specielt i den såkaldte "hoved mod hale”-orientering. -25

Hybridvektorerne ifølge opfindelsen fremstilles under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Fremgangsmåden til fremstilling af hybridvektorerne omfatter indføring af en eller flere DNA-konstruktioner indeholdende en gærekspres-30 sionskontrolsekvens, et DNA-segment bestående af en første DNA-sekvens. som koder for et signalpeptid opstrøms for og i aflæsningsramme med en anden DNA-sekvens, der koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transskriptionskontrol af ekspressionskontrolsekvensen, og 35 en DNA-sekvens indeholdende gærtransskriptionsstopsignaler som sådan eller indføring af komponenterne af DNA-

I DK 175492 B1 I

1 22 I

I konstruktionerne efter hinanden i den forudbestemte orden i I

I et vektor-DNA. I

I Konstruktionen af hybridplasmiderne ifølge opfindelsen I

I 5 gennemføres under anvendelse af konventionel ligerings- I

I teknik. Komponenterne i piasmiderne sammenbindes ved hjælp I

I af fælles restriktionssteder og/eller ved hjælp af synte- I

I tiske linkermolekyler og/eller ved hjælp af såkaldt I

I "kortende"-ligering. I

I 10 I

I De lineære DNA-verktorer ifølge opfindelsen svarer i alt I

I væsentligt til DNA-konstruktionerne anført i par. 2 og I

I fremstilles på analog måde. I

I 15 4. Transformerede qærværtsceller I

I Et andet aspekt af opfindelsen omfatter gærværtsceller I

I transformeret med en hybridvektor med et eller flere DNA- I

I inserter, som hver især indeholder en gærekspressionskon- I

I 20 trolsekvens, et DNA-segment bestående af en første DNA- I

I sekvens, som koder for et signalpeptid opstrøms for i af- I

I læsningsramme med en anden DNA-sekvens, der koder for mo- I

I dent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under trans- I

I skriptionskontrol af ekspressionskontrolsekvensen, og en I

I 25 DNA-sekvens ineholdende gærtransskriptionsstopsignaler, og I

I mutanter deraf. I

I Egnede værtceller omfatter arter af slægterne Kluyveromy- I

I ces, Candida, Pichia, Yarrowia, Saccharoxnyces, Schizosac- I

I 30 charomyces, Torulopsis og beslægtede slægter, jf. J. Lod- I

I der, The Yeasfcs, Amsterdam 1971, især stammer af Saccha- I

I romyces cerevisiae. I

I Fremgangsmåden til fremstilling af de transformerede gær- I

I 35 værtsceller omfatter transformering af gærværtsceller med I

I en hybridvektor med et eller flere DNA-inserter, som hver I

I for sig indeholder en gærekspressionskontrolsekvens, et I

23 DK 175492 B1 DNA-segment bestående af en første DNA-sekvens, der koder for et signalpeptid opstrøms for i aflæsningsramme med en anden DNA-sekvens, der koder for modent desulfatohirudin, hvilket DNA-segment er under transskriptionskontrol af eks-5 presionskontrolsekvensen, og en DNA-sekvens, som indeholder gærtransskriptionsstopsignaler.

Transformering af gærværtscellen gennemføres under anvendelse af kendte fremgangsmåder. Eksempelvis kan transforme-10 ringen af gær med hybridvektorerne gennemfors under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Hinnen et al., jf.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1929 (1978). Denne fremgangsmåde kan opdeles i tre trin: 15 (1) Fjernelse af gærcellevæggen eller dele deraf under anvendelse af forskellige glucosidasepræparater, såsom snegletarmsaft, f.eks. "Glusulase"® eller "Helicase"®, eller enzymblandinger opnået fra mikroorganismer, f.eks. "Zymolase"®, i osmotisk stabiliseret opløsninger, f.eks.

20 1 M sorbitol. 1 2

Behandling af de "nøgne" gærceller (sfæroplaster) med DNA-vektoren i nærværelse af PEG (polyethylenglycol) og Ca2+-ioner.

25 2

Regenerering af cellevæggen og selektion af de transformerede celler på et fast agarlag. Denne regenerering gennemføres hensigtsmæssigt ved indlejring af sfæroplasteme i agar. Eksempelvis blandes smeltet agar 30 (ca. 50°C) med sfæroplasterne. Ved afkøling af opløsningen til gærdyrkningstemperaturer (ca. 30eC) dannes der et fast lag. Dette agarlag skal forhindre hurtig diffusion og tab af vigtige makromolekyler fra sfæroplasteme og derved lette regeneringen af cellevæggen. Imidlertid kan 35 regenereringen af cellevæggen også opnås (men med lavere effektivitet) ved udpladning af sfæroplasteme på overfladen af præformede agarlag.

I DK 175492 B1 I

I 24 I

I Regenereringsagaren fremstilles fortrinsvis på en sådan I

I måde, der tillader regenerering og udvælgelse af I

I transformerede celler på samme tid. Da gærgener, som koder I

I for enzymer ved biosyntetisk aminosyresyntese, I

I 5 sædvanligvis anvendes som selektive markører (jf. I

I ovenfor), gennemføres regenereringen fortrinsvis i I

I gærminimalmediumagar. Når der kræves en meget høj I

I regenereringsgrad er følgende totrinsmetode imidlertid I

I fordelagtig: (1) regenerering af cellevæggen i et rigt I

I 10 komplekst medium, og (2) udvælgelse af de transformerede I

I celler ved kopiudpladning af cellelaget på selektive agar- I

I plader. I

I Opfindelsen angår især DNA-konstruktionerne indeholdende I

I 15 desulfatohirudingenet, hybridvektorerne, den transformerede I

I gærcelle samt fremgangsmåder til deres fremstilling tillige I

I med fremgangsmåder til fremstilling af desulfatohirudin som I

I beskrevet i eksemplerne. I

I 20 Opfindelsen forklares nærmere i det følgende under I

I henvisning til tegningén, hvor I

I fig. 1 og 2 er skematiske diagrammer, som viser konstruk- I

I tionen af piasmider pML300 og pML305, I

I fig. 3 viser konstruktionen af plasmid pHRil48 indehol- I

I 25 dende trp-promotoren, I

I fig. 4 viser konstruktionen af ekspressionsplasmid I

I PML310, I

I fig. 5 viser skematisk isoleringen af et DNA-fragment, I

I som koder for modent desulfatohirudin, I

I 3Q fig. 6 viser skematisk konstruktionen af et ekspres- I

I sionsplasmid til udskillelse af desulfatohirudin, I

I fig. 7 viser skematisk konstruktionen af et ekspres- I

I sionsplasmid til ekstracellulær ekspression af I

I desulfatohirudin, I

I 35 I

25 DK 175492 B1 fig. 8 viser DNA-sekvensen af BamHI-Sall-restriktions-fragmentet af PH05 inklusive PH05-promotorområ-det, 5 fig. 9 viser DNA-sekvensen for promotorområdet i GAPDH-genet, fig. 10 viser skematisk konstruktionen af plasmid pGAPDH-EL, fig. 11 viser sekvenserne for GAPDH-promotorfragmenterne 10 i piasraiderne pGAPDH-FL og pGAPDH-EL, I fig. 12 viser konstruktionen af plasmid pJDB207/PH05- I (Eco)-HIR, I fig. 13 viser konstruktionen af plasmid pJDB207/PAPEL- I HIR((UAS1 + UAS2), I 15 fig. 14 viser konstruktionen af pismid pJDB207/[ GAPEL- I HIR ]D og I fig. 15 viser skematisk konstruktionen af plasmid I pJDB207/GAPFL-I-HIR.

I På tegningen anvendes følgende forkortelser: I 20 p = promotor, SS = signalsekvens, t = terminator og L = I linker.

I Opfindelsen forklares nærmere i de efterfølgende I eksempler.

I I eksemplerne anvendes følgende forkortelser:

I 25 TNE opløsning indeholdende 100 mM NaCl, 50 mM

I tris.HCl pH 7,5 og 5 mM EDTA

I SDS natriumdodecylsulfat I EDTA ethylendiamintetraeddikesyre I DTT 1,4-dithiothreitol (1,4-d±mercapto-2,3-butan- 30 diol) BSA okseserumalbumin

EtBr ethidiumbromid

I DK 175492 B1 I

I 26 I

I tris tris-(hydroxymethyl)-aminomethan I

I tris.HCl tris-monohydrochlorid I

I

I Eksempel 1 I

I 5 Fremstilling af beskyttet nucleosid-polystyren-harpiks I

I MHT-0-T-0-C0CH,CH,C0-NHCH,_./ _(p) I

I 222 I

I 750 mg ravsyreanhydrid og 910 mg 4-dimethylaminopyridin I

I sættes til 2,57 g (5 mmol) 5*-(4-methoxytrityl)-thymidin I

I (MMT-Q-T-OH) i 20 ml absolut pyridin, og hele blandingen I

I henstår ved stuetemperatur i 16 timer. Efter koncentre- I

10 ring af pyridinopløsningen optages remanensen i 200 ml I

I ethylacetat, hvorpå der ekstraheres to gange ved rystning I

I med 200 ml 0,1 M phosphatpuffer pr. gang med tilsætning af I

I 10 ml mættet natriumohloridopløsning, opløsningen vaskes I

I atter med mættet natriumohloridopløsning, tørres og I

I 15 koncentreres, hvorpå der dråbevis tilsættes hexan. Det I

I udfældede produkt Isoleres og tritureres to gange med I

I ether, hvorpå det opløses i 300 ml ethylacetat, og der I

I ekstraheres med udrystning ved 0°C med 180 ml 0,1 Μ I

I kaliumhydrogensulfatopløsning med pH 2,5. Efter vaskning I

20 to gange med vand tørres ethylacetatopløsningen med I

I natriumsulfat og filtreres, hvorpå der tilsættes 0,5 ml I

pyridin, og hele blandingen koncentreres og fortyndes I

I derpå ved dråbevis tilsætning af hexan. Det udfældede I

I ravsyrederivat frafiltreres. I

I 25 1,0 g af denne forbindelse opløses sammen med 190 mg I

I N-hydroxysuccinimid i 4 ml ethylacetat og 2 ml I

I dimethylformamid, og der tilsættes 370 mg N,N’-dicyclohex- I

I ylcarbodiimid ved 0eC. Efter henstand natten over i et I

I køleskab frafiltreres det ^N’-dicyclohexylurinstof, fil- I

2 7 DK 175492 B1 tratet fortyndes med ethylacetat, ekstraheres med kold 1 M natriumhydrogencarbonatopløsning og vand, tørres og koncentreres til tørhed ved inddampning i vakuum.

5 Remanensen kromatograferes med ethylacetat på silicagel.

TLC: Rf 0,45 i dichlormethan/methanol (9:1).

100 mg af denne N-succinimidoylravsyreester omrøres i 20 timer med 1 g aminomethylpolystyren (aminindhold 110 /tmol/g) i 2 ml dichlormethan og 4 ml dimethyl formamid.

10 Polymerharpiksen frafiltreres og ekstraheres ved vaskning med dimethyl formamid, methanol, dichlormethan og methanol.

Efter tørring acetyleres de ureagerede aminogrupper ved omrøring af harpiksen i 6 ml pyridin med 1 ml eddikesyreanhydrid og 100 mg 4-dimethyl aminopyr i din i 30 15 minutter. Polymerharpiksen ekstraheres ved vaskning med dichlormethan, dimethylformamid, methanol og dichlormethan og tørres til konstant vægt. Den spektroskopiske methoxy-trityl (MMT)-bestemmelse giver et indhold på 57 jimol/g.

Eksempel 2 20 Analogt med den ovenfor i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde fremstilles nedenstående beskyttede nucleo-sid/polystyrenharpiks • · MMT-0-Glb-0C0CH_CH?C0NHCH~—r \_(P) \_/ ud fra 5'-(4-methoxytrityl)-N-isobutyryl-deoxyguanosin med et indhold på 32 /imol/g.

I DK 175492 B1 I

I 28 I

I Eksempel 3 I

I Fremstilling af trinucleotidet I

I o I

I I

MMT-0--T-O-P — 0--CH2CH2CN I

I )-./ \ I

I I

I C1 I

I -i 3 I

I a) Fremstilling af dinucleotidet I

I 5 7,73 g (15 mmol) 5’-(4-methoxytrityl)-thymidun I

I (MMT-O-T-OH) koncentrres to gange ved inddampning med I

I absolut pyridin. Remanensen opløses i 20 ml absolut I

I tetrahydrofuran, og opløsningen sættes dråbevis til 80 ml I

I 0,2 M opløsning af 2-chlorphenyl-di-(1-benzotriazolyl)- I

I 10 phosphat i tetrahydrofuran under omrøring og under ude-

I lukkelse af fugtighed, og reaktionsblandingen omrøres il I

I time ved stuetemperatur. Den dannede opløsning af 2-chlor-

I phenyl-l-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'- I

I phosphat opdeles i tre portioner. I

I 15 a) Hydrolyse til triethylammonium-2-chlorphenyl-5* - I

I (4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat: I

I 100 ml 0,5 M triethylammoniumhydrogencarbonatopløsning I

I sættes til en 1/3 af den ovenfor fremstillede opløsning af I

I 2-chlorphenyl-l-benzotriazolyl-5'-(4-methoxytrityl)- I

I 20 thymidin-3'-phosphat under afkøling. Efter 15 minutters I

I forløb fetages ekstraktion med dichlormethan. Dichlor- I

I methanopløsningen vaskes med vand og koncentreres, hvorpå I

I der dråbevis tilsættes petroleumsether. Det dannede bund- H

29 DK 175492 B1 fald frafiltreres med sugning, ekstraheres ved vaskning med ether/petroleumsether (1:1) og tørres 1 vakuum. TLC:

Rf 0,35 i dichlormethan/methanol/vand (75:22:3).

5 /5) Esterifikation til 2-cyanoethyl-2-chlorphenyl-5'- (4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat og fjernelse af 4-methoxytritylbeskyttelsesgruppen: 1,3 ml 2-cyanoethanol og 2 ral pyridin sættes til 1/3 af opløsningen af 2-chlorphenyl-l-benzotriazolyl-5'-(4-10 methoxytrity1)-thymidin-3'-phosphat. Blandingen henstår natten over ved stuetemperatur. Opløsningsmidlerne afdestilleres i vakuum, og remanensen opløses i ethylacetat og ekstraheres gentagne gange ved udrystning med 0,1 M phosphatpuffer med pH 7 og med vand. Den 15 organiske fase tørres og koncentreres, hvorpå den dråbevis sættes til hexan. Bundfaldet frafiltreres, opløses i 50 ml dichlormethan/methanol (7:3), hvorpå der ved 0°C tilsættes en opløsning af 3,8 g p-toluensulfonsyre-monohydrat i 75 ml dichlormethan/methanol (7:3). Efter 2 timers forløb 20 fortyndes reaktionsopløsningen med dichlormethan, hvorpå den ekstraheres ved udrystning med kold natriumhydrogen-carbonatopløsning. Den organiske fase koncentreres, og der tilsættes hexan. Det udfældede 2-cyanoethyl-2-chlorphenyl-thymidin-3'-phosphat kromatograferes på silicagel med 25 dichlormethan/methanol (96:4). TLC: Rf 0,45 i dichlormethan/methanol (9:1).

7) Kondensation til 5,-(4-methoxytrityl)-3,-cyanoethyl-bis-thymidin-dinuc1eotid: 2,2 g 2-cyanoethyl-2-chlorphenyl-thymidin-3'-phosphat 30 afvandes ved to ganges koncentrering ved inddampning med absolut pyridin, og produktet opløses i 20 ml absolut tetrahydrofuran, hvorpå opløsningen sættes til den resterende 1/3 af opløsningen af 2-chlorphenyl-l-benzotri-

I DK 175492 B1 I

I 30 I

I azolyl-5’-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'-phosphat. Efter 18 I

timers forløb ved stuetemperatur sættes 10 ml vand og 200 I

I ml ethylacetat til reaktionsopløsningen under afkøling med I

I 5 is. Den organiske fase vaskes gentagne gange med natrium- I

I hydrogencarbonatopløsning og vand, tørres med I

I natriumsulfat og koncentreres til et lille rumfang. I

I Dinucleotidet, som er beskyttet i phosphatdelen og ved 5'- I

og 3'-enden, udfældes ved dråbevis tilsætning til I

I 10 ether/hexan (1:1). TLC: Rf 0,48 i dichlormethan/methanol I

I (9:1). I

I b) Fremstilling af trinucleotidet I

I 1,17 g (1 nunol) af det ovenfor fremstillede helt I

I beskyttede dinucleotid opløses i 30 ml dichlormethan/meth- I

I 15 anol (7:3), hvorpå der under afkøling med is tilsættes en I

I opløsning af 1,9 g p-toluensulfonsyre-monohydrat i 20 ml I

I dichlormethan/methanol (7:3). Efter 2 timers forløb I

I tilsættes en iskold natriumhydrogencarbonatopløsning, og I

I der foretages ekstraktion med dichlormethan. Den organiske I

I 20 fase tørres, koncentreres og sættes dråbevis til hexan. I

I Det udfældede rå dinucleotid med en fri 5'-hydroxygruppe I

I kromatograferes på silicagel med en gradient på 2-8% I

I methanol i dichlormethan. TLC: Rf 0,33 i dichlor- I

I methan/methanol (9:1). I

I 25 850 mg af dette 5'-hydroxy-dinucleotid og 1,06 g triethyl- I

I ammonium-2-chlorphenyl-5'-(4-methoxytrityl)-thymidin-3'- I

I phosphat (se afsnit a)a)) koncentreres to gange ved ind- I

I dampning med pyridin, hvorefter remanensen opløses i 10 ml I

I absolut pyridin, og der tilsættes 560 mg 1-mesitylen- I

I 30 sulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazol (MSNT). Efter 2 timers I

I forløb tilsættes 2 ml iskoldt vand, og efter yderligere 1 I

I time foretages ekstraktion med dichlormethan. Den I

I organiske fase vaskes med mættet natriumhydrogencarbonat- I

I opløsning og vand, tørres og koncentreres, hvorpå der til- I

31 DK 175492 B1 sættes ether. Det udfældede trlnucleotld renses ved kromatografi på silicagel. Rf 0,45 i dichlor-methan/methanol (9:1).

5 Eksempel 4

Analogt med den ovenfor i eksempel 3 beskrevne fremgangsmåde fremstilles følgende beskyttede trlnucleotlder med den almene formel

O 0 O

MMT—0_B*—0—P—0—B2— O—P—O—B^— 0-P——OCi^Ci^CN

is\ \=./ \_/ \=/

Cl' C\ Cl som forkortes Følgende forkortelser anvendes for 10 nucleosldeme B*, B^, B^: A = N-benzoyl-deoxyadenosln C = N-benzoyl-deoxycytidin G - N-isobutyryl-deoxyguanosin T = thymidin

I DK 175492 B1 I

I 32 I

I Forbindelse Rfa) Forbindelse Rfa) I

I TTT M5 ATG 0,48 I

I TTC 0,55 ACT '0,53 I

I TCT °*46 ACC 0,48 I

I TAC 0,56 ATT 0,55 I

I TGC °»44 ACA 0,53 I

I TAG °)60 AAC 0,46 I

I TGT °»42 AAA 0,51 I

I TGA 0,44 AGT 0,45 I

I CTT °>53 AGG 0,38 I

I CTG °>46 GTT 0,45 I

I CCT °>45 GTC 0^44 I

I CCC °J59 GTG 0,35 I

I CCG °>47 GCA 0,49 I

I CCA °951 GCG 0,48 I

I ^"A7· 0,55 GAT 0,44 I

I CAC °»51 GAC 0^48 I

I CGC 0)« GAG 0,48 I

I CGA °>3S ' GAA 0,50 I

I CAG °>44 GGC 0,42 I

I CGG n 50 I

I °>38' GGT 0.46 I

I CGT π /q I

I D>49 GGG 0,35 I

I GGA 0,44 I

I a) Tyndtlagskroraatografi på silicagel i dichlor- I

I methan/methanol (9:1). I

I 5 Eksempel 5

I Fremstilling af DNA-fragmentet med en længde på 67 baser I

fra base nr. 96 til base nr. 162 i DNA-strengen 96/97 I

a) Fjernelse af 2-cyanoethylbeskyttelsesgruppen fra tri-

nucleotiderne I

10 10 /mol af trinucleotiderne fra eksempel 3 eller 4 opløses

under udelukkelse af fugtighed i 60 μΐ pyridin/acetoni- I

33 DK 175492 B1 tril/triethylamin (1:1:1). Efter 1 time ved stuetemperatur tisættes dråbevis 0,7 ml peroxidfri ether, og bundfaldet fracentrifugeres. Det rå triethylammoniumsalt opløses i 50 5 μΐ pyridin, og der fældes atter med 0,5 ml ether, fracentrifugeres og tørres i højvakuum i 15 timer.

b) Kobling af de partielt beskyttede trinucleotlder med oligonucleotldkæden bundet til polystyrenharpiks

Alle operationerne gennemføres under udelukkelse af 10 fugtighed i en reaktionsbeholder med et rumfang på 220 μΐ med mikroprocessorreguleret tilsætning af opløsningsmiddel og reagens. 13 mg (0,74 μπιοί) af thymidin/polystyren-harpiksen fra eksempel 1 anbringes i reaktionsbeholderen og underkastes følgende operationer: 15 1. Methylenchlorid, 2 ml/min., 4 min.

2. Methylenchlorid/isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2 min.

3. Zinkbromid 1 M og 1,2,4-triazol 0,02 M i methylenchlorid/isopropanol (85:15), 2 ml/min., 2-3,5 min.

4. Methylenchlorid/isopropanol (85:15), 2 ml/min., 4 min.

20 5. Triethylammoniumacetat 0,5 M i DMF, 2 ml/min., 5 min.

6. Pyridin tørret med molekylsigte, 2 ml/min., 3 min.

7. Tetrahydrofuran (peroxidfri, tørret med molekylsigte), ' ·'- ’ i 2 ml/min., 3 min.

8^ Nitrogenstrøm, 10 min.

25 9. Injektion af 10 μπιοί trinucleotid GTC (trimethylam- moniumsalt fra afsnit a)) og 8,9 mg (30 μπιοί) 1-mesi-tylensulfonyl-3-nitro-l,2,4-triazol (MSNT) opløst i 150 μΐ pyridin.

10. 45®C, 20 min.

30 11. Pyridin, 2 ml/min., 4 min.

12. Eddikesyreanhydrid 5% og 4-dimethylaminopyridin 2,5% i pyridin, 2 ml/min., 4 min.

13. Pyridin, 2 ml/min., 4 min.

14. Pyridin/isopropanol (1:1), 2 ml/min., 3 min.

I DK 175492 B1 I

I 34 I

I Alle 14 operationer gentages 21 gange, men i den 9. I

I operation anvendes i stedet for GCT de følgende trinucleo- I

I tider i form af deres triethylammoniumsalte (afsnit a)) i I

I 5 den angivne rækkefølge: GCA, ACC, G AA, CCC, TAC, AGG, TGA,

I CGC, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, , I

I GGG, CCT, CAT. Det gennemsnitlige koblingsudbytte er 97%. I

I Slutproduktet har følgende struktur:

I MMT - CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT ACCGGTG AAGGT ACCCC- I

I 10 GAAACCGCAG-TCT-polystyren I

I c) Fjernelse af DNA-fragmentet fra bæreren og fjernelse

I af beskyttelsesgrupperne I

I 40,0 mg (ca. 0,60 /unol) DNA-synteseharpiks 96/67 holdes I

I ved 50°C i 3 timer ved stuetemperatur i 12 timer med 66 mg I

I 15 (0,40 mmol) o-nitrobenzaldoxim og 50 μΐ (0,40 mmol) I

I 1,l>3,3-tetramethylguanidin i 400 μΐ 95%'s pyridin. Efter I

I fjernelse af pyridinet ved gennembobling af nitrogen I

I sættes 1,6 ml 33%'s ammoniakvand til remanensen, og hele I

I blandingen holdes i 24 timer ved 50eC i en lukket I

I 20 beholder. I

I Den flydende fase isoleres, ammoniakken fjernes i vakuum, I

I og der vaskes med 3 x 3 ml peroxidfri diethylether. Efter I

I fjernelse af bestanddele med lav molekylvægt på en "Biogel I

I P6"-søjle (100-200 mesh, 3x66 cm, 0,01 M trimethylam- I

I 25 moniumhydrogencarbonat pH 7,5, 1,5 ml/rain.), isoleres 285 I

I ODs (260 nm) DMA. I

I 1 alt 60 ODs fraskilles på en HPLC-søjle (PRP-l/Hamilton, I

I 250 x 4,6 mm). Gradient (opløsning A: 0,05 Μ I

I triethylammoniumacetat pH 7,0, opløsning B: opløsning A: I

I 30 acetonitril 1:1): 30% B i A 60% B i A i 20 minutter ved I

I 50*C og 2 ml/min. Den lipofile hovedtop (retentionstid ca. I

I 14 minutter) opsamles, koncentreres over en "DE52"-cellu- I

35 DK 175492 B1 losesøjle (Whatman), elueres og fældes med ethanol. Til fjernelse af 4-methoxytritylbeskyttelsesgruppen opløses bundfaldet i 50 μΐ eddikesyre/H20 (4:1), og opløsningen 5 holdes ved stuetemperatur i 45 minutter. Reaktionsproduktet lyofiliseres, fældes med ethanol og renses ved elektroforetisk adskillelse på en 8%'s polyacrylamidgel (7 M urinstof). Båndet svarende til den ønskede DNA-stør-relse skæres ud, og produktet elektroeleueres, koncehtre-10 res over "DE52”-cellulose, og DNA 96/97 med følgende struktur 5' -CATCCTGGCTTCTGACCGTGAAAAAAACCAGTCCCTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCG CAGTCT-3' fældes med ethanol.

Eksempel 6

Analogt med den ovenfor i eksempel 5 beskrevne fremgangs-15 måde fremstilles nedenstående DNA-fragmenter (5'-3'): 1/58 CTGGAATTCATCGTTCTTTACACCCACTCCACCGAATCTCGTCAGAACCTGTGCCTGT 46/64 komplementær CACAACCCAGGATGCATTTCTTACCCTCACCCCAAACGTTACAACCTTCCCACACGCACAGGTT 154/64 komplementær

CAGGAICCTACTGCAGGTATTCTXCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG

Eksempel 7

Phosphorylering af fragmenterne 1/58, 46/64 komplementær, 96/67 og 154/65 komplementær

Phosphoryl er ingen og den radioaktive mærkning ved 20 5' -enderne foretages en [ 7~32p jatp og T4 polynucleotid- I DK 175492 B1 I 36

I kinase (Boehringer) som beskrevet i Molecular Cloning, A

I laboratory Manual (udg. T. Maniatis et al.)# Cold Spring I Harbor Lab., 1982, side 125.

I 5 Eksempel 8 I

I Polymerisation til dobbelstreng II (fragment Fq i desul- I

I fatohlrudin HV1-genet) I

50 pmol kinasebehandlet fragment 96/67 og 50 pmol I

I kinasebehandlet fragment 154/64 opløses i 24 μΐ vand, I

I 10 opløsningen opvarmes til 90°C i 3 minutter, hvorpå den I

I afkøles til 12°C i løbet af 5 minutter. Efter tilsætning I

I af 4 μΐ endo-R-puffer (0,1 molær tris-HCl pH 7,5, 66 mM I

MgCl2, 66 mM Ø-mercaptoethanol, 0,6 M NaCl), 10 μΐ deoxy- I

I nucleosidtriphosphatblanding (dATP, dCTP, dGTP, TTP, alle I

I 15 2xl0“3 molær, indstillet med NH3 til pH 7,0) og 2 μΐ (10 I

I enheder) DNA-polymerase I, foretages Klenow-fragment I

I (Boehringer) inkubation i 30 minutter ved 12eC. Reaktionen I

afbrydes ved opvarmning til 90eC i 3 minutter, og I

I blandingen opbevares ved -80°C, indtil den skal viderefor- I

I 20 arbejdes. I

I På samme måde som beskrevet ovenfor omsættes de kinasebe- I

I handlede fragmenter 1/58 og 46/64 til dannelse af dobbelt- I

I streng I (fragment ) af desulfatohirudingenet). I

I Dobbelstrengene I og II har følgende strukturer: I

I Dobbeltstreng I I

I ctccaattcatcgttgtttacacccactccacccaatctcgtcacaacctctccctgtcccaaccttc I

I gaccttaagtaccaacaaatgiggctgacgtggcttagaccagtcttggacaccgacacgcttccaag I

I taacgtttccggtcacggtaacaaatgcatcctcggttctg I

I ATTCCAAACCCCAGTCCCATTGTTtACGIAGCACCCAACAC I

37 DK 175492 B1

Dobbeltstreng II

CATCCTCCGTTCTGACCCTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTCAAGCTACCCCGAAACCGCAGTCTC

gtacgacccaagactgccactttttttcgtcacgcaatggccacttccatggggctttgccgtcagag

ACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG

TGTTGCTCCCACTGAAGCTTCTXTAGGGCCTTCTrATGGACGrCATCCTAGGAC

Fremstillingen af fragmenterne og F2 af desulfatohiru-dingenet illustreres i nedenstående skema 1.

!

I DK 175492 B1 I

I 38 I

I Skema 1: Fremstilling af fragmenterne Ft og F? af desulfa- I

I tphirudingenet HV1 og af Fi-F? DNA I

I 1/58 96/67 I

I : 46/64 154/64 I

I T.-polynucleotid- T4-polynucleotid- I

I kinase kinase I

I annelering I annelering I

I -Γτπτπ -Qmn_ I

I IDWA polymerase I ]DNA polymerase I I

I {(Klenov), dJfTPa {(Klenov), dNTP» I

I Π i II ri I i i [ 111 i 11111IIIHIIT1 I ΙΙΙΊΓΙΠΤΙΤΠΤΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΙΊ I

Ir r t r i

EcoRI EcoRII EcoRII BæaHI

I Fragment F. Fragment Fj I

I I (subkloiiing) I (s'ubkloning) I

I {EcoRII {EcoRII I

I t inimnnuniirm- nmnimimimin I

I I I I

I EcoRI EcoRII EcoRII BaaHI

I annelering I

I DNA ligase I

I ΪΊ m ΓΠ ΓΠ'ΠΤΠΊ 11 u M m m m m η i il 11 n 11 n iTTTTl I

It t t I

I EcoRI EcoRII BaaHI

I F1-F2~DNA (desulfatohirudingen) I

39 DK 175492 B1

Eksempel 9

Polymerisation og ligering af fragmenterne 1/58, kinasebe- handlet 46/64, kinasebehandlet 96/67 og 154/64, fremstil-

5 ling af desulfatohirudin HVl-genet I

50 pmol af hvert af fragmenterne 1/58, kinasebehandlet I

46/64, kinasebehandlet 96/67 og 154/64 opløses i 48 μΐ I

van, opløsningen opvarmes i 3 minutter til 90eC, hvorpå I

den afkøles i løbet af 5 minutter til 12eC. Efter tilsæt- I

I 10 ning af 8 μΐ endo-R-puffer (se eksempel 8), 20 μΐ deoxy- I

I nucleosidtriphosphatblånding (dATP, dCTP, dGTF, TTP, i I

I hvert tilfælde 0,002 molær, indstillet til pH 7,0 med NH3) I

I og 2 /ti (10 enheder) DNA-polymerase I foretages I

I Klenow-fragment (Boehringer) inkubering i 30 minutter ved I

I 15 12®C. Reaktionen afbrydes ved opvarmning i 3 minutter ved I

I 90°C, og DNA'et isoleres efter ekstraktion med I

I phenol/chloroform vd fældning med ethanol. Den fremkomne I

I DNA-blanding opløses i 100 μΐ ligase/puf fer (66 mM I

I tris.HCl pH 7,5, 6,6 mM MgCl2# 10 mM dithiothreitol, 5 mM I

I 20 ATP), der tilsættes 50 enheder (2 /ti) T4 DNA-ligase I

I (Biolabs), og blandingen inkuberes i 20 timer ved 20eC. I

I Reaktionen afbrydes ved opvarmning i 5 minutter til 70eC, I

I og DNA'et isoleres ved fældning med ethanol efter I

I ekstraktion med phenol/chloroform. Efter adskillelse af I

I 25 blandingen på en 8%*s polyacrylamidgel (denaturering) ved I

I elektroforese, elektroelueres ligeringsproduktet med 217 I

I basepar, hvorpå det koncentreres på en "DE52"-cellulose- I

I søjle, hvorpå det efter eluering isoleres ved fældning med I

I ethanol. I

I 30 Desulfatohirudingenet har følgende struktur: I ctcgaattcatggttgtttacacccactgcacccaatctgctcagaacctctccctctgcgaagct

I CACCTTAACTACCAACAAATGTGCCTCACGTCGCTTAGACCAGTCTTCCACACCGACACCCTTCCA

i---

I DK 175492 B1 I

I 40 I

I TCTAACGTTTCCCCTCACCGTAACAAATGCATCCTGCCTTCTCACGCTCAAAAAAACCAGTCCCTT I

I AGATTCCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACCTAGCACCCAAGACTCCCACTTTTTTTGGTCACCCAA I

I ACCGCTGAAGGTACCCCGAAACCCCACTCTCACAACGACGCTGACTTCCAACAAATCCCGCAACAA I

I TCGCCACTTCCATCCGGCVTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACtGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT I

I TACCTGCACTACGATCCTG * I

I ATGCACCTCATCCTACCAC I

I Fremstillingen af desulfatohirudingenet ud fra de fire I

I fragmenter illustreres i nedenstående skema 2: I

I Skema 2: Fremstilling af hirudingenet ud fra de fire I

I 5 syntetiske fragmenter I

I 1/58 96/67 I

I Ub/bU Ϊ5Α/64 I

I IT4 polynucleotid-kinase I

I * annelering I

I πτπ ΠΤΠ—:—οιπ_ I

I Idna polymerase I (Klenow) I

I JdNTPs

I ΓΠΙΠΤΠΙΊΙΙΙΙΊΙΙΙΙΙΙΙΠΠΊ ΓΠΊΊ I mil m Hil 111 ΠΊΠΓΓΤΓΠΤπ I

I |t^ DNA ligase I

I Mil n U11 n n 11 Η 11II11 m I ΓΙI H IH 11111ΓΊΤΠ ΓΙ11' II < 11ΤΓI IH I H t I

l i ri

I EeoRI BaaHt I

I Fl"F2 DNA I

I (desulfatohirudingen) I

41 I

DK 175492 B1 I

Eksempel 10 I

Konstruktion af plasmidet pML 300 indeholdende Fi-DNA'et 1 I

desulfatohirudin HVl-genet (fig. 1) I

5 a) Fremstilling af den linerlserede vektor I

pBR322/EcorRI/PvuII I

5 μg pBR322 plasmid-DNA spaltes med 5 enheder PvuII-re- I

striktionsehdonuclease (Biolabs) i 200 ml af en opløsning I

af 100 /tg/ral gelatine i 1 time ved 37eC. Derpå indstilles I

10 denne opløsning til 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, I

og DNA'et spaltes med 30 enheder EcoRI-restriktionsendonu- I

clease (Biolabs) i 2 timer ved 37°C. Derpå indstilles I

opløsningen ti 50 mM tris.HCl pH 8, hvorpå den ved en DNA- I

I koncentration på 10 /ig//il inkuberes med 2 enheder alkalisk I

I 15 kalvemavephosphatase (Boehringer) i 30 minutter ved 37°C. I

I Enzymet inaktiveres ved opvarmning af opløsningen i 60 I

I minutter ved 65°C. Derpå standardiseres opløsningen med I

I TNE, ekstraheres roed 1 rumfang phenol og chloroform, og I

I det spaltede DNA fældes med 2 rumfang alkohol ved -20*C I

I 20 natten over. I

I Vektoren (pBR322/EcoRI/PvuII, 2297 basepar) udskåret fra I

I pBR322-DNA'et isoleres fra det lille DNA-fragment (2067 I

I basepar) ved gelelektroforese på 1%'s lavtsmeltende I

I agarose (Biorad) i tris-acetat-EDTA-puffer pH 8. Efter I

I 25 farvning af DNA'et i agarosegelen med EtBr udskæres det I

I område af gelen, som indeholder DNA-båndet med I pBR322/EcoRI/PvuII-vektoren (* 2297 basepar), og det I smeltes i 10 minutter ved 65°C. 20 rumfang TNE sættes til I denne DNA-opløsning, DNA'et renses i overensstemmelse med I 30 Mueller et al., [J. Mol. Biol. 124, 343, (1978)] ved I "DE52"“kromatografi, ekstraheres med phenol/chioroform, I hvorpå DNA'et fældes med alkohol ved -20eC natten over.

I DNA-bundfaldet opløses i 50 μΐ 0,01 M tris.HCl (pH 8),

I DK 175492 B1 I

I 42 I

I 0,1 M EDTA og opbevares ved -20eC til videre brug. Der I

I opnås 1,4 μg (3,2 pmol ender) DNA. I

I b) Fremstilling af F-j-DNA/EooRI I

H

5 24 ng (1,3 pmol ender) kemisk fremstillet F^-DNA (se I

I eksempel 8) spaltes med 5 enheder EcoRI-restriktionsendo- I

I nuclease (Biolabs).i 50 μΐ 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 50 mM I

I NaCl og 100 /ig/ml gelatine i 30 minutter ved 37°C. I

I Derefter tilsættes 0,06 μς (0,14 pmol ender) af den linea- I

I 10 riserede vektor pBR322/EcoRI/PvuII (eksempel 10a) til I

I opløsningen. Efter 10 minutter inaktiveres enzymet ved I

I opvarmning til 65®C, og opløsningen standardiseres med TNE I

I og ekstraheres med phenol/chloroform. DNA'et udfældes med I

I alkohol. Det udfældede DNA opbevares under alkohol ved I

I 15 -20eC til videre brug. I

I c) Ligering af pBR322/EcoRX/PvuII-vektor-DNA med Fi- I

I DNA/EcoRI og konstruktion af plasmid pML300 I

I DNA-bundfaldet fremstillet i eksempel 10b) som indeholder I

I de to omtalte DNA-fragmenter, opløses i 20 μΐ af en I

I 20 opløsning af 50 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM I

I DTT, 0,5 mM ATP og 100 /ig/l gelatine, og opløsningen I

I behandles i 3. timer ved 15eC med 25 enheder/μΐ T4 I

I DNA-ligase (Biolabs). På denne måde opnås rekombinantplas- I

I midet pML300, som indeholder F^-DNA'et, i opløsningen, I

25 d) Transformation af Escherichia coli HN101 med plasmid I

PML300 I

Escherichia coli HBlOl-celleme forbehandles med calcium, I

som er nødvendigt for transformeringen, som beskrevet I

Mandel et al., jf. J. Mol. Biol. 53, 159 (1970). I

43 DK 175492 B1

Den ovenfor under c) fremstillede opløsning, som indeholder rekombinantplasmid pML300, opvarmes til 65eC i 10 minutter til inaktivering af T4 DNA-ligasen, hvorpå den 5 afkøles til 37eC. 10 μΐ af denne reaktionsblanding sættes til 150 μΐ calciumbehandlede Escherichia coli HBlOl-celler i 10 mM MgCl2 og 10 mM tris.HCl (pH 7,5) i et samlet rumfang på 200 μΐ.

Derpå afkøles denne blanding i is i 30 minutter, hvorpå 10 den opvarmes i 2 minutter til 42*C, hvorefter den henstår i 50 minutter i 1 ml L-mediiim (se eksempel 18) ved 37eC. Derefter foretages udpladning af blandingen i lige store portioner på 0,2 ml på 5 agarplader (McConkey agar, Difco), som indeholder 60 #<g/ml ampicillin (Serva).

15 Agarpladerne holdes ved 37eC i 16-18 timer. Der opnås 484 ampicillinresistente kolonier af den transformerede Escherichia coli HB101.

e) Screening for kolonierne, som indeholder Fi-DNA

470 transformerede kolonier (se eksempel lOd) aftrykkes på 20 nitrocellulosefilter B85 (Schleicher og Schull). Kolonierne lyseres, og deres denaturerede DNA fikseres på filteret i overensstemmelse med M. Grunstein og D. S. Hogness, jf. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961 (1979). Derefter foretages praehybridisering af filtrene i 20 ml 25 (pr. filter) 4 x SET (opløsning af 30 mM tris.HCl (pH 8), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA), 0,1% (v/r) "Ficoll" 400 (Pharmacia), 0,5% SDS, 50 μg/tal denatureret kalvethymus DNA i 4 timer ved 64#C. Derefter behandles nitrocellulosefiltrene i 20 ml (pr. filter) af 5 x SET 30 (v/r) "Ficoll” 400, 0,2% SDS og 50 μg/ml denatureret kalvethymus DNA i 16 timer ved 64°C med den 3%> radioaktivt mærkede probe (ca. 10^-10^ Cerencov cpm pr. filter). Oligonucleotidet 46/64 komplementær (se eksempel 6) anvendes som probe.

I DK 175492 B1 I

I I

I Derpå vaskes filtrene to gange i 2 x SET, 0,2% SDS ved I

I stuetemperatur, derefter to gange i 2 x SET, 0,5% SDS ved I

I 60°C (først i 30 minutter, derpå i 60 minutter). Filtrene I

I 5 tørres derpå mellem 3 MM papir (Whatman) og anbringes ved -I

I -80'C på en røntgenfilm (Fuji) med en forstærkerskærm I

I (llford) i 1-2 dage. I

I Det dannede autoradiogram viser 71 positive kolonier I

I (kloner), som kan anvendes til det videre arbejde, og en I

I 10 af disse betegnes pML300. I

I Eksempel 11 I

I Konstruktion af plasmid pML305, som indeholder F-y-DNA'et I

I af desulfatohirudin HVl-genet (fig. 2) I

I a) Fremstilling af llneariseret vektor pBR322/BamHI/NruI I

I 15 5 pg pBR322 plasmid DNA spaltes med 30 enheder I

I BamHl-restriktionsendonuclease i 30 minutter ved 37eC i en I

I opløsning af 100 mM NaCl, 6 mM tris.HCl (7,9), 6 mM MgCl2 I

I og 100 fig/ml gelatine. 15 enheder PvuII-restriktionsendo- I

I nuclease sættes derpå til opløsnignen, hvorpå der spaltes I

I 20 i 2 timer ved 37*C. I

I Reaktionsblandingen opvarmes til 70°C i 10 minutter til I

I inaktivering af enzymet. Derefter adskilles de to I

I DNA-fragmenter fra hinanden ved gelelektroforese på 1% I

I lavtsmeltende agarose i tris-acetat-EDTA-puffer, pH 8 (se I

I 25 eksempel 10a). I

I DNA-båndet med pBR322 BamHI/PvuII-vektoren (2672 basepar) I

I udskæres, smeltes og renses i overensstemmelse med H

I fremgangsmåden ifølge Mueller et al. (se ovenfor) ved I

I "DE52"-kromatografi. Der fås 0,75 μg (1,5 pmol ender) DNA. I

DK 175492 B1 I

45 I

b) Fremstilling af F?-DNA/BamHI I

25 /ig (1,3 pmol ender) kemisk syntetiseret F2-DNA I

(eksempel 8) spaltes med 16 enheder BamHI-restriktions- I

5 endonuclease (Biolabs) i 20 μΐ 150 mM NaCl, 6 mM tris.HCl I

(pH 79), 6 mM MgCl2 og 100 ^g/ml gelatine i 30 minutter I

ved 37eC. Til opløsningen sættes derpå 60 ng (96 nmol I

ender) af den linariserede vektor pBR322/BamHI/PvuII I

(eksempel 11a), hvorpå hele opløsningen standardiseres med I

10 TNE og ekstraherres med phenol/chloroform, og DNA'et I

fældes med 2 rumfang alkohol. Det udfældede DNA opbevares I

under alkohol ved -20eC, indtil det skal anvendes. I

c) Liqering af pBR322/BamHI/PvuII-vektor DNA med F?- I

DNA/BamHI og konstruktion af plasmid pML305 I

15 Det udfældede DNA fremstillet ovenfor i eksempel 11b), som I

indeholder de to anførte DNA-fragmenter, opløses i 20 /ti I

af en opløsning af 50 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, I

10 mM DTT, 0,5 mM ATP og 100 /ig/ml gelatine og behandles I

med 15 enheder/μΐ T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15eC i 3 20 timer. På denne måde fås rekombinantplasmid pML305, som indeholder F2-DNA, i opløsningen.

d) Transformering af Escherichia coli HB101 med plasmid PML305

Transformeringen af de calciumbehandlede Escherichia coli 25 HBlOl-celler gennemføres på samme måde som beskrevet ovenfor i eksempel lOd). Der anvendes 10 μΐ af den reaktionsblanding, som er dannet i eksempel 11c). Der opnås 313 ampicillinresistente kolonier.

e) Screening for kolonier, som indeholder Fg-DNA

30 65 transformerede kolonier (eksempel lid) undersøges for F2-DNA under anvendelse af den i eksempel lOe) beskrevne I DK 175492 B1

I 46 I

fremgangsmåde. Oligonucleotidet 154/64 komplementær (se I

I eksempel 6) anvendes som radioaktiv probe. Der opnås to I

I positive kolonier i autoradiogrammet, hvoraf den ene I

I 5 betegnes pML305. I

I Eksempel 12 I

I Karakterisering af kloner pML305 og pML305 I

I DNA'erne fra rekombinantplasmider pML300 og pML305 I

I isoleres i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge I

I 10 Ish-Horowitzz [Molecular Cloning, A laboratory Manual (ed. I

I T. Maniatis et al.), Cold Soring Harbor Lab., 1982, s. I

I 368 ]. Nucleotidsekvensen i Fi~DNA og F2-DNA-inserterne I

I bestemmes i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge I

I Maxam o gilbert [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 I

I 15 (1977), se også Meth. Enzym. 65, 499 (1980)]. I

I Til dette formål spaltes 10 μg plasmid DNA fra pML300 med I

I EcoRI-restriktionsendonuclease og 10 μg plasmid DNA af I

I pML305 med BamHI-restriktionsendonuclease, og de I

I lineariserede DNA'er isoleres ved geleluering fra I

I 20 agarosegel [se eksempel 10)]. Derefter spaltes de I

I Isolerede DNA'er med alkalisk phosphatase og I

I kromatograferes over ''DE52" (se eksempel 11a). DNA'erne I

I mærkes derpå radioaktivt ved 5'-enden med [ γ~32ρ ]atp I

I (specifik aktivitet 5000 Ci/mmol, Amersham) og T4 I

I 25 polynucleotidkinase (P-L-Biochemicals). I

I De radioaktivt mærkede DNA'er spaltes derpå med en anden I

I restriktionsendonuclease (EcoRlI). De dannede I

I DNA-fragmenter isoleres ved geleluering fra agarose. I I

I tilfælde af pML300 bestemmes nucleotidsekvensen for F^-DNA

I 30 derpå ud fra EcoRII-EcoRI*-fragmentet (ca. 109 basepar), I

I og i tilfælde af pML300 bestemmes nucleotidsekvensen for I

I F2-DNA i EcoRII-BamHl*-fragmentet (ca. 122 basepar). I

47 DK 175492 B1 (* angiver den DNA-ende, som er radioaktivt mærket).

Nucleotidsekvenserne, som bestemmes for F^-DNA og F2”DNA, er identiske med de i eksempel 6 viste.

5 Eksempel 13

Konstruktion af ekspressionsplasmid PML310 a) Konstruktion af lineariseret vektor pHRi!48/EcoRI/

BamHl, som indeholder trp-promotor-operatoren (flg.

3 og fig. 4) 10 A. Konstruktion af plasmid p!59 10 μg plasmid pBRH-fcrp [ DE-OS 3.111.405] spaltes med 50 enheder EcoRl (Biolabs) i 60 minutter ved 37°C, hvorefter spaltningsblandingen efter phenolekstraktion fraktioneres på en saccharosedensitetsgradient (5-23%) i 50 mM tris.HCl 15 (pH 8,0), 1 mM EDTA i en TST41 (Kontron AG) rotor. Centrifugeringen varer 14 timer ved 40.000 o/m ved 15°C.

0,3 ml fraktioner udtages med en ISCO-gradientkollektor i en mængde på 1 ml/min. Fraktionerne, som indeholder det mindre fragment, samles, opløsningen standardiseres med 20 TNE, og der foretages fældning med 2 rumfang ethanol ved -20eC. Efter centrifugering i en Eppendorf centrifuge opløses DNA'et i 100 /zl 10 mM tris.HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA. 5 μς af dette DNA-fragment spaltes med 5 enheder BG1II (Biolabs) i 60 minutter ved 37*C.

25 Reaktionsblandingen ekstraheres med phenol og chloroform, og DNA'et inkuberes med 2 rumfang ethanol ved -80°C i 10 minutter. DNA'et isoleres ved centrifugering, og opløses atter i 50 μΐ 50 mM tris.HCl (pH 8,0). 2μ1 af denne opløsning udtages (0,2 μg DNA) og inkuberes ved en 30 DNA-koncentration på 10 ng/μΐ i 50 mM tris.HCl (pH 8,0) med 1 enhed alkalisk kalvemavephosphatase (Boehringer) j

I DK 175492 B1 I

I 48 I

I i 30 minutter ved 37*C. Enzymet inaktiveres ved opvarmning I

I af opløsningen i 60 minutter ved 65°C. 0,04 /tg DNA udtages I

I og inkuberes 5' -terminalt med 10 /tCi [ γ-~32ρ ]-ατρ (5000 I

I 5 Ci/mmol, Amersham) og 5 enheder T4 polynucleotidkinase I

I (P-L Biochemicals) i et reaktionsrumfang på 20 /ti i 50 mM I

I tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2 og 5 mM DTT i 30 minutter I

I ved 37*C. Den radioaktive prøve blandes med den I

I ikke-mærkede prøve (se ovenfor), og DNA-fragmenterne I

I 10 fraktioneres ved hjælp af en 5-23% I

I saccharosedensitetsgradient i 50 mM tris.HCl (pH 8,0), 1 I

I mM EDTA i en TST60 rotor. Centrifugeringen gennemføres i 5 I

I timer ved 60.000 o/m ved 15*C. Der udtages fraktioner på I

I 0,2 ml. Radioaktiviteten af hver enkelt fraktion bestemmes I

I 15 ved måling af Cerencov-strålingen, og fragmenterne identi- I

I ficeres derved. De ønskede fraktioner, som indeholder det I

I lille DNA-fragment, samles, DNA-'et fældes med 2 rumfang I

I ethanol, hvorpå det centrifugeres og opløses igen i 20 /il I

I 10 mM tris.HCl pH 7,5, 0,5 mM EDTA. I

I 20 Det 32p_mærjcec3e EcoRI-BgIII DNA-fragment spaltes delvis I

I med 0,2 enheder Taql (Biolabs) i et rumfang på 50 /ti i 10 I

I minutter ved 37°C. Reaktionsblandingen indstilles på 0,2% I

I SDS, 10% glycerol, 10 mM EDTA, 0,05% bromphenol-blåt, og I

I DNA-fragmenterne adskilles på en 6%'s polyacrylamidgel i I

I 25 tris-borat-EDTA [A.C. Peacock et al.. Biochemistry 6, 1818 I

I (1967) ]. Båndet indeholdende den ønskede EcoRI-Tagl (det I

I største delfragment) identificeres på autoradiogrammet. I

I Dette fragment (L. se fig. 3) ekstraheres fra gelen og I

I renses [W. Muller et al., supra], hvorpå det opløses i 10 I

I 30 μΐ 10 mM tris.HCl pH 7,5, 1 mM EDTA. I

I Der anvendes som acceptor plasmid pBR322, som spaltes med I

I Clal og EcoRI: 2 /tg pBR322 spaltes med 4 enheder Clal I

(Biolabs) i et reaktionsrumfang på 20 /ti i 60 minutter ved I

37®C. Proteinet ekstraheres med phenol, hvorpå DNA'et I

35 fældes med 2 rumfang ethanol ved -80eC i 10 mnutter. I

DNA'et samles ved centrifugering, hvorpå det spaltes med I

49 DK 175492 B1 10 enheder EcoRI (Biolabs) i 30 minutter ved 37#C i et reaktionsrumfang på 20 μΐ. Derpå sættes 2 rumfang 0,1 M tris.HCl (pH 8,7) til opløsnignen, og hele blandingen 5 inkuberes med 1 enhed alkalisk kalvephosphatase (Boehringer) ved 37eC i 30 minutter. Derefter inaktiveres phosphatasen ved inkubering ved 65eC i 60 minutter. 100 ng af acceptorplasmidet inkuberes med 5 μΐ fragment L-DNA i et reaktionsrumfang på 15 μΐ i 10 mM MgCl2, 20 mM tris-HCl 10 (pH 7,8), 10 mM DTT, 0,5 mM ATP med 30 enheder pr. μΐ reaktionsrumfang T4 DNA-ligase (Biolabs) i 2 timer.

5 μΐ af denne opløsning sættes til en blanding, som indeholder 150 ml Escherichia coli HBlOl-celler behandlet med calciumchlorid (se ovenfor) i 10 mM MgCl2, 10 mM CaCl2 15 og 10 mM tris.HCl (pH 7,5) i et samlet rumfang på 200 μΐ. Blandingen afkøles i 20 minutter i is, opvarmes i 1 minut ved 42®C og inkuberes i 10 minutter ved 20eC. Der tilsættes 1 ml tryptonmedium [tryptommediet indeholder 10 g bacto-trypton (Difco), 1 g gærekstrakt (Difco), 1 g 20 glucose, 8 g NaCl og 294 mg CaCl2*2H20 ill destilleret vand ], og blandingen inkuberes i 30 minutter ved 37®C under omrøring med 300 o/m. Blandingen udplades på to agarplader (McConkey-agar, Difco, 0,6 ml/plade), tilsat 50 /ig/ml ampicillin (Sigma). Pladerne inkuberes i fra 12 til 25 17 timer ved 37'C.

Plasmid DNA'et fra 10 forskellige kolonier isoleres på følgende måde:

Kolonierne anvendes som ovenfor til inokulerlng af 10 ml tryptonmedium tilsat 50 /ig/ml ampicillin i 25 ml 30 Erlenmeyer-kolbe. Kulturerne omrøres i fra 15 til 18 timer ved 37"C med 300 o/m. Celerne høstes ved centrifugering (Sorval, HS-4 rotor, 10 minutter ved 4000 o/m, 4eC). Der opnås ca. 0,1 g celler, som resuspenderes i 1 ml 50 mM tris-HCl (pH 8,0). Der tilsættes 0,25 ml lysozymopløsning

I DK 175492 B1 I

I 50 I

I [10 mg/ml i 50 mM tris.HCl (pH 8,0), lysozym markedsføres I

I af Sigma ], og efter inkubering i 10 minutter ved 0°C I

I tilsættes 0,15 ml 0,5 mM EDTA (pH 7,5). Efter yderligere I

I 5 10 minutter ved 0°C tilsættes 2% "Triton" %-100 (Merck). I

I Efter 30 minutter ved 0eC centrifugeres prøven i 30 I

I minutter ved 15.000 o/m og 4°C i en Sorval SA-600 rotor. I

I Supernatanten deproteineres med 1 rumfang phenol (mættet I

I med TNE). Faserne adskilles ved centrifugering (Sorval I

I 10 HB-4 rotor) i 10 minutter ved 5000 o/m og 4eC. Den øvre I

I fase ekstraheres to gange med 1 rumfang chloroform.' I

I Pankreatisk RNAse A (Sigma, 10 mg/ml i TNE forvarmet i 10 I

I minutter ved 85°C) tilsættes til en slutkoncentraiton på I

I 25 μg/ml, og blandingen inkuberes i 40 minutter ved 37*C. I

I 15 Derefter indstilles opløsningen med 1 M NaCl og 10% I

I polyethylenglycol 6000 (Fluka, behandlet i 20 minutter ved I

I 120°C i en autoklave), og der inkuberes i 2 timer ved I

I -10eC. Bundfaldet isoleres i en Sorval HB-4 rotor (20 I

I minutter ved 10.000 o/m, 0eC) og opløses atter i 100 μΐ I

I 20 TNE. DNA-opløsningen ekstraheres med 1 rumfang phenol, og I

I DNA’et fældes med 2 rumfang ethanol i 10 minutter ved I

I -80DC. Bundfaldet isoleres ved centrifugering i en I

I Eppendorfcentrifuge og DNA'et opløses atter i 20 ftl 10 mM I

I tris.HCl (pH 7,5) og 0,5 mM EDTA. Der opnås 8-10 μς I

I 25 plasmid DNA fra en 10 ml kultur. I

I Plasmid DNA'eme analyseres efter spaltning med følgende I

I restriktionsenzymer: I

I 0,5 /ig plasmid DNA spaltes med Hpal (Biolabs) og med Hpal I

I (Biolabs) og EcoRI (Biolabs) med Clal (Biolabs) i I

I 30 overensstemmelse med standardmetoder under anvendelse af I

I enzymfabrikantens forskrifter. DNA'eme fraktioneres på en I

I 1% agarosegel i 40 mM tris.acetat (pH 7,8), 1 mM EDTA og I

I 0,5 pg/ml ethidiumbromid. De ønskede plasmider indeholder I

I et Hpal-site og efter spaltning i 3 timer fås foruden det H

I 35 store DNA-fragment to mindre fragmenter, som er større end I

I det lille EcoRl-Clal-fragment af pBR322. Et af disse plas- I

51 DK 175492 B1 mider betegnes pl59 (se fig. 3).

B. Konstruktion af plasmid pHR1145

2 /tg pl59 DNA spaltes med 10 enheder EcoRl (Biolabs) i 30 5 minutter ved 37®C. DNA*et ekstraheres med phenol, fældes med ethanol, hvorpå det efter centrifugering opløses i 10 μΐ 10 mM tris.HCl (7,5), 0,5 mM EDTA. DNA'et spaltet med EcoRl behandles derefter med 5 enheder DNA polymerase (Kl enow- fragment) (Boehringer) i 10 mM MgCl2, 10 mM 10 β -mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 0,1 mM dATP (P+L

Biochemicals), 0,1 mM dTTP (P+L Biochemicals) i 15 minutter ved 12eC. Derefter inaktiveres polymerasen ved inkubering ved 85eC i 5 minutter. Reaktionsblandingen fortyndes i 20 mM tris.HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 10 mM 15 DTT,,,, 0,5 mM ATP (Sigma) ved en faktor 10 og inkuberes med 30 enheder T4 DNA ligase pr. μΐ reaktionsblanding i 1 time ved 15°C.

50 ng af DNA'et transformeres i Escherichia coli (på samme måde som beskrevet ovenfor) og udplades på McConkey-20 agarplader tilsat 50 /tg/ml ampicillin.

Plasmid DNA'erne fra 10 forskellige kolonier isoleres på den ovenfor beskrevne måde. Plasmid DNA'erne analyseres ved spaltning med EcoRl. De ønskede plasmider er EcoRI-resistente. Analysen gennemføres på samme måde som 25 beskrevet ovenfor. Et af de ønskede plasmider betegnes HRil45 (fig. 3).

C. Konstruktion af plasmid pHRi!48 2 /tg pHRil45-DNA behandles med 5 enheder Clal (Boehringer) i 60 minutter ved 37eC, hvorpå der deproteineres ved 30 phenolekstraktion. DNA’et fældes med ethanol, hvorpå det opløses i 20 μΐ 10 mM tris.HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. De udragende ender udfyldes som beskrevet ovenfor med DNA-

52 I

DK 175492 B1 I

polymerase I (Klenow-fragment), bortset fra at dATP og I

dTTP ombyttes med dCTP (P&L Biochemical s) og dGTP (P&L I

Biochemicals). Polymerasen inaktiveres ved inkubation ved I

5 85°C i 5 minuter. 2 rumfang 0,1 M tris.HCl (pH 8,7) sættes I

til reaktionsblandingen, som inkuberes med 0,5 enheder I

kalvephosphatase (Boehringer) i 30 minutter ved 37eC. I

Reaktionsblandingen deproteineres ved ekstraktion med I

phenol. DNA’et fældes med ethanol og opløses i 8 /il 10 mM I

10 tris.HCl (pH 7,5), 0,5 mM EDTA. I

En kemisk syntetiseret DNA linker med formlen I

5'-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3' I

phosphoryleres ved 5'-enden ved inkubering af 8 pmol af I

linkeren med μΟΙ [γ-32Ρ ]-ATP (5500 Ci.mmol-1, Amersham) i I

15 et reaktionsrumfang på 8 μΐ, som indeholder 0,1 mM rATP I

(Sigma), 50 mM tris.HCl (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT og I

2 enheder T4 polynucleotidkinase (P&L Biochemicals) i 30 I

minutter ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved afkøling til I

-80"C. I 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Den radioaktivt mærkede linker behandles derpå med 1 |ig I

2

Clal og phosphatase og ligeres med pHRil45-DNA (se oven- I

3

for) i et reaktionsrumfang på 20 μΐ, som indeholder 0,5 mM

4

rATP (Sigma), 10 mM DTT (Calbiochem), 20 mM tris.HCl (pH I

5

7.8) , 1 mM MgCl2 og 800 enheder T4 DNA ligase (Biolabs). I

6

Inkuberingen gennemføres i 2 timer ved 15°C. Ligasen I

7

inaktiveres ved inkubering ved 85®C i 10 minutter. Derpå I

8

tilsættes 2 rumfang vand, natriumchloridkoncentrationen I

9

indstilles på 10 mM, og i løbet af 30 minutter ved 37®C I

10

tilsættes 20 enheder Kpnl (Biolabs). Efter ekstraktion med I

11 phenol og chloroform fraktioneres blandingen på en 0,9%

lavtsmeltende agarosegel (Biorad) i 40 mM tris.acetat (pH

7.8) , 1 mM EDTA og 0,5 /tg/ml ethidiumbromid. Båndet, I

synliggjort ved UV-bestråling, som har samme mobilitet som I

53 DK 175492 B1 et markør DNA af samme størrelse, udskæres med en skalpel.

Denne del af gelen smeltes i 5 minutter ved 65eC, hvorpå den afkøles til 37“C. Der opnås et rum,fang på ca. 20 μΐ.

5 5 μΐ af denne Opløsning udtages og inkuberes i 12 timer ved 15°C med 400 enheder T4 ligase (Biolabs) i et reaktionsrumfang på 10 μΐ, som er blevet indstillet til 0,5 mM ATP, 10 mM DTT, 10 mM MgCl2, 20 mM tris.HCl (7,8).

1/10 rumfang af en opløsning med 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 10 100 mM CaCl2 og 100 mM MgCl2 sættes til ligaseblandingen (størknet ved 15eC), og den samlede blanding inkuberes ved 55°C i 5 minutter. Derefter anvendes opløsningen til at transformere calciumbehandlede Escherichia coli HBlOl-cel-ler på den ovenfor beskrevne måde. Der foretages 15 udpladning på McConkey-agarpiader tilsat 50 #ig/ml ampicillin.

Plasmid DNA'erne fra 10 forskellige kolonier isoleres på den ovenfor beskrevne måde, og DNA'et underkastes følgende restriktionsenzymanalyser: 0,5 jig plasmid DNA spaltes

20 først med Kpnl (Biolabs), derpå med Ncol (Biolabs) og til sidst med EcoRl (Biolabs) i overensstemmelse med enzymproducentens instruktioner. Spaltningsprodukterne fraktioneres på 1%'s agarosegeler i 40 mM tris.acetat (pH

7,8), 1 mM EDTA, 0,5 pg/ml ethidiumbromid. Alle plasmider 25 udviser som ønsket et af disse enzymspaltningssteder. Et plasmid betegnes HRil48.

Plasmidet HRil48 indeholder en tryptophanpromotoroperator og et ribosomalt bindingssted op til og inklusive AT6. Hirudin og også andre heterologe gener kan kobles direkte 30 ved hjælp af EcoRl, Ncol, Kpnl siteme, der forekommer én gang i plasmidet. Endvidere muliggør denne konstruktion direkte kobling og ekspression af heterologe gener uden at ATG’en, som er nødvendig for starten af translationen, skal være til stede på det tilsvarende gel. Dette kan let 35 opnås ved spaltning med Ncol og opfyldning af de udragende ender med DNA-polymerase I på den ovenfor beskrevne måde

I DK 175492 B1 I

I 54 I

I eller ved spaltning med Kpnl og fjernelse af de udragenden I

I ender med nuclease S]_. Plasmidet HR1148 er således et I

I , ekspressionspiasmid med bred anvendelse. I

I 5 D. Fremstilling af den linearlserede vektor pHR1148/ I

I EcoRI/BamHI I

I 5 #ig plasmid DNA fra pHR1148 spaltes med restriktionsendo- I

I nucleaseme EcoRI og BamHI. Den udskårne vektor I

I pHRil48/EcoRI/BamHI isoleres ved hjælp af densitetsgra- I

I 10 dientcentrifugering. I

I b> Fremstilling af Ft-DNA/EcoRI/EcoRII og F?-DNÅ/BamHI/ I

I EcoRII I

I I) Fremstilling af Fi-DNA/EcoRI/EcoRII I

I 5μg plasmid DNA fra pML300 spaltes først med 10 enheder I

I 15 EcoRI-restriktionsendocnuclease i 50 μΐ af en opløsning af I

I 100 mM tris.HCl (pH 7,5), 50 aM NaCl og 100 jtg/ml gelatine I

I il time ved 37eC. En alikvot (0,5 /ig) af dette linearise-

I rede plasmid DNA/EcoRl isoleres ved geleluering fra en I

I agarosegel (jf. eksempel 10a)), og mærket radioaktivt med I

I 20 [γ“32ρjatp (jf. eksempel 12). Størsteparten af plasmid I

I DNA/EcoRI blandes derpå med dette radioaktivt mærkede DNA, I

I spaltes med EcoRlI-restriktionsendonuclease, og I

I EcoRIX-EcoRI* DNA-fragmentet (109 basepar) adskilles ved I

I gelelektroforese på 8%'s polyacrylamid. 200 μg I

I 25 Fi-DNA/EcoR*/EcoRII isoleres ved geleluering. I

I II) Fremstilling af Fy-DNA/BamHI/EcoRII I

I 5 |ig plasmid DNA fra pML305 spaltes med 10 enheder I

I BamHI-restriktionsendonuclease. En alikvot (0,5 /ig) af I

I dette lineariserede plasmid DNA/BamHI isoleres ved gel- I

I 30 eluering fra en agarosegel (jf. eksempel 10a)) og mærkets I

55 DK 175492 B1 radioaktivt med [ y-32P ] (se eksempel 12). Hovedparten af plasmidet DNA/BamHI blandes derpå med dette radioaktivt mærkede DNA, hvorpå der spaltes med EcoRII-restriktionsen-5 donuclease,, og EcoRII/BamHI* DNA-fragmentet (122 basepar) isoleres ved gelelektroforese på en 8%'s polyacrylamid.

- Der isoleres 250 pg F2“DNA/BamHI*/EcoRII.

c) Ligering af Fi-DNA med F?-DNA og konstruktion af ekspressionspi asmidet pML310 10 10 ng (473 nmol ender) Fi-DNA/EcoRI/EcoRII og 9 ng (495 nrool ender) F2-DNA/BamHI/EcoRII behandles i et rumfang på 20 μΐ med T4 DNA-ligase på samme måde som allerede beskrevet ovenfor i eksempel 10c). Derefter ekstraheres blandingen med phenol/choroform, og DNA'et fældes med 15 alkohol. DNA-bundfaldet opløses derpå som beskrevet i eksempel 10c) og spaltes med EcoRI og BamHl-restriktionsendonuclease.Opløsningen standardiseres derpå med TNE, og der tilsættes 30 ng (50 nmol ender) af vektoren DNA pHRil48/EcoRI/BamHI (jf. eksempel 13aD).

20 Derefter ekstraheres opløsningen igen med phenol/chloroform, og DNA’et fældes med alkohol. Den udfældede DNA-blanding behandles på samme måde som angivet i eksempel 10c) med T4 DNA-ligase (Biolabs). På denne måde dannes i opløsningen et rekombinantp 1 asmid, der som insert 25 indeholder F1-F2-DNA (desulfatohirudingen).

d) Transformering af Escherichia coli HB101 med plasmid PML310

Transformeringen af ' Escherichia coli HBlOl-celler behandlet md calcium gennemføres på samme måde som 30 beskrevet i eksempel 10b). 10μ1 af den i eksempel 13c) opnåede reaktionsblanding anvendes. Der opnås 420 ampicillinresistente kolonier.

56 I

DK 175492 B1 I

e) Screening for kolonier, som indeholder Fi-F?-DNA I

18 transformerede kolonier (eksempel 13d) undersøges for I

deres F1-F2-DNA-indhold på den i eksempel lOe) beskrevne I

5 måde. En blanding af oligodeoxynucleotiderne beskrevet i I

eksempel 5 og 6 anvendes som radioaktiv probe. I I

autoradiogrammet konstateres 12 positive kolonier, hvoraf I

de 5 betegnes pML310, pML311, pML312, pML313 og pML314. I

Eksempel 14 I

10 Karakterisering af klonen pMl.310 I

Karakteriseringen af Fi-F2~DNA-sekvensen i rekombinant- I

plasmidet pML310 gennemføres ved sekvensbestemmelse af I

Fi-F2“DNA’et i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge I

Max am og Gilbert (supra) på den i eksempel 12 beskrevne I

15 måde. 10 μg plasmid DNA undersøges. Nucleotidsekvensen i I

Fi-F2-DNA er identisk med den, som er beskrevet for det

syntetiske desulfatohirudingen. I

Eksempel 15

Ekspression af desulfatohirudln HV1 i gær I

20 Det kemisk syntetiserede gen for hirudin forstærkes som et I

206 bp EcoRI-BamHI-insert i plasmid pML310 (se eksempel I

14). Genet udskæres fra plasmidet og udtrykkes i gær under I

kontrol af den repressible PHO5-promotor. Konstruktionen

indbefatter 541 bp PH05-promotorsekvensen og den I

25 fuldstændige PH05-signalsekvens (51 nucleotider, som I

koder for 17 aminosyrer) som beskrevet i beskrivelsen til I

europæisk patentansøgning nr. 143.081. Denne sekvens I

fusioneres i struktur til den modne kodningssekvens for

hirudin, der starter med kodonen for valin som NHtø-termi- I

30 nalaminosyren fra naturligt modens hirudin. Hirudingenet I

57 DK 175492 B1 flankeres ved dets 3' -ende med et DNA-fragment, der tilvejebringer PH05-transskriptionsstopsignaleme.

Vektordelen af ekspressionsplasmidet indeholder gær 2μ-5 sekvenser, gær LEU2-genet for selektion i gær og ampicil-linresistensgenet og Escherichia coli replikationsoriginet for selektion og forstærkning i Escherichia coli. Metoden er illustreret i fig. 5, 6 og 7.

Regulering af nucleotidsekvensen ved 5* enden i desulfato-10 hirudinqenet

Nucleotidsekvensen, som koder for desulfatohirudin, starter med GTT, som står for NH2“terminalvalin i det færdige genprodukt. Med henblik på hensigtsmæssig underkloning og ekspression i Escherichia coli er 15 kodningssekvensen blevet forlænget ved 5' -enden med 8 nucleotider inklusive et EcoRI-restriktionssted og en ATG-startkodon. Af hensyn til den nøjagtige i struktur-sammensmeltning af hirudinkodningssekvensen til sekvensen, som koder for PH05-signalpeptidet, må disse 20 yderligere nucleotider fjernes. Dette opnås ved omdannelse af EcoRI-restriktionsstedet til et såkaldt "flush"-endested, addering af et syntetisk oligonucleotid indeholdende et Hgal-genkendelsessted i en sådan stilling, at efterfølgende spaltning med Hgal optræder umiddelbart 25 "upstream" for GTT-kodonen.

Indføring af et Hgal-restriktionssted foran desulfatohiru-dingenet (se fig. 5) 8 /tg plasmid pML310 (se eksmepel 13c) spaltes fuldstændigt med restriktionsendonuclease EcoRI. DNA'et (pML310/EcoRI) 30 ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med ethanol.

51-udhængende ender fjernes med nuclease Si· 4 pg pML3l0/

EcoRI-DNA spaltes i 100 μΐ 250 mM NaCl, 1 mM ZnS04, 30 mM natriumacetat pH 4,6 og 20 enheder/ml nuclease (Sigma) i 45 minutter ved 37°C.

I DK 175492 B1 I

I 58 I

I DNA'et ekstraheres med phenol/chloroform og fældes med I

I ethanol. DNA’et (pML310/EcoRI/Si) resuspenderes i 100 μΐ I

I 50 mM trls.HCl pH 8,0 og inkuberes med 2 enhder alkalisk I

I 5 kalvemavephosphatase (CIAP, Boehringer) i 1 time ved 37eC. I

I Enzymet inaktiveres ved 65°C i 1,5 timer. I

I NaCl-koncentrationen i inkubationsblandingen indstilles på I

I 150 mM. Desphosphorylerede DNA (pML310/EcoRI/Si/CIAP) I

I renses ved adsorption på en "DE52" (Whatman)-ionbytter- I

I 10 søjle i en puffer med lavt saltindhold (150 mM NaCl, 10 mM I

I tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA), hvorpå der elueres med en I

I pufferopløsning med højt saltindhold (1,5 M NaCl, 10 mM I

I tris.HCl pH 8,0, 1 mM EDTA). DNA’et fældes med ethanol og I

I resuspenderes i H2O i en koncentration på 0,8 mg/ml. I

I 15 Et oligonucleotid med formlen I

I 5'-AGCGTCGACGCT-3’ I

I syntetiseres ved hjælp af phosphotriestermetoden, jf. I

I Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981). I

I ' Oligonucleotidets sekvens indeholder selvkomplementært I

I i 20 genkendelsesstedet -GAC6C- for restriktionsendonuclease I

I Hgal. Annelering af to enkeltstrenge fører til en dobbelt- I

I strenget DNA linker på 12 basepar. I 1

1,2 pg af det syntetiske enkeltstrengede oligodeoxynucleo- I

I tid phosphoryleres i 10 μΐ 60 mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM I

I 25 Mgcl2, 5 mM DTT, 30 /iCi [ γ"32ρ ]atp (3000 Ci-mmol-1, I

I Amersham) og 6 enheder T4 polynucleotid kinase I

I (Boehringer) i 30 minutter ved 37eC, hvorefter der I

I behandles i 15 minutter ved 37eC i nærværelse af 0,5 mM I

I ATP. Blandingen inkuberes yderligere i 10 minutter ved I

I 30 75eC for at inaktivere enzymet, hvorpå den henstår til I

I afkøling til stuetemperatur til annelering. I

59 DK 175492 B1 0/6 μg (170 pinol) af det linker DNA blandes med 24 μg (1,75 pmol ender) pML3l0/EcoRI/Si/CIAP og ligeres i 20 μΐ 60 mM tris.HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM 5 DTT, 3,5 mM ATP, 800 enheder T4 DNA ligase (Biolabs) i 20 timer ved 15eC. Ligasen inaktiveres ved 85°C i 10 minutter, og overskud af iinkermolekyler fjernes ved fældning af DNA’et i nærværelse af 10 mM EDTA pH 7,5, 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanl. Efter 10 30 minutter ved stuetemperatur samles DNA'et ved centri fugering, resuspenderes i 45 μΐ ligeringsblanding (beskrevet ovenfor, hvorpå der ligeres i 6 timer ved 15#C til dannelse af cirkulært DNA.

Alikvoter på 1 /il og 3 μΐ af ligeringsblandingen sættes 15 til 100 μΐ calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia coli HBlOl-celler (fremstillet i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge D. Hanahan [ J. Biol. Chem.

166. 557 (1983)]. Cellerne henstilles på is i 30 minutter, hvorefter der inkuberes i 3 minutter ved 42*C, afkøles på 20 is i 2 minutter og inkuberes i 1 time ved 37eC i 400 fil SOC-medium. Cellerne koncentreres til et rumfang på 100 /il og udplades på LB agarplader indeholdende 50 /ig/ml ampicillin. 1 transformerede ampR-kolonier dyrkes hver for sig i 25 LB-medium indeholdende 100 /ig/ml ampicillin. Plasmid DNA fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge D.S. Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, 193 (1981)].

Tilstedeværelsen af den syntetiske oligonucleotidlinker bekræftes ved DNA-sekvensering under anvendelse af et 30 enkeltstrenget DNA-fragment som primer, der hybridiserer til den kodende streng i hirudin. En klon, som indeholder linker DNA1et i den rigtige stilling foran hirudingenet betegnes pML310L.

DK 175492 B1 I

60 B

Eksempel 16 I

Fusion af PH05-signalsekvensen og desulfatohirudinstruk- I

turgenet I

5 a) Isolering af 0,2 kb desulfatohlrudin-fragmentet I

(fig. 5) fl

12 mg plasmid pML310L spaltes fuldstændigt med restrik- I

tionsendonucleaserne BamHI og Pvul. Efter ekstraktion af H

DNA'et med phenol/chloroform og fældning med ethanol H

10 adskilles de to restriktionsfragmenter på en 1,2%' s I

agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. Det ethidium- I

bromidfarvede 0,84 kb PvuI-BamHl-fragment isoleres i en H

gelskive. DNA'et elektroelueres i et dialysebad fyldt med H

3 ml 0,2 x TBE-puffer. Den lukkede pose neddyppes i TBE- I

15 puffer pH 8,3 (90 mM tris-base, 90 mM borsyre, 2,5 mM I

EDTA). Efter 30 minutter ved 100 mA vendes strømretningen I

i 45 sekunder til fjernelse af DNA'et fra dialysemembra- I

nen. Pufferen, som omgiver gelskiven i dialyseposen,

udtages, indstilles til 150 mM NaCl og ledes gennem "DE52" I

20 (Whatman)-ionbyttersøjle. DNA'et elueres med en puffer med H

stort saltindhold (1,5 M NaCl, 10 mM tris.HCl pH 8,0, 1 mM I

EDTA), fældes med ethanol og genopløses i vand i en I

koncentration på 0,1 mg/ml. I

0,84 kb Pvul-BamHI-fragmentet af pML310L spaltes I

25 yderligere med restriktionsendonuclease Hgal. Denne I

spaltning frrembringer et 198 bp Hgal-BamHI-fragment, som I

indeholder den fuldstændige kodningssekvens for modent H

desulfatohlrudin. Yderligere spaltning med Alul berører H

ikke 198 bp Hgal-BamHI-fragmentet men fjerner et andet H

30 Hgal-fragment af lignende størrelse. H

0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet isoleres fra de andre H

fragmenter på en 1,5% agarosegel i TBE-puffer og isoleres H

ved elektroeluering (som beskrevet ovenfor). DNA'et ren- H

61 DK 175492 B1 ses ved ionbytterkromatografi på "DE52" og fældning med ethanol. DNA'et resuspenderes i vand ved en koncentration på 30 mg/ml (0,2 pmol/jil).

5 b) Isolering af PH05-promotorområdet med en del af PH05-slgnalsekvensen (fig. 6)

Plasmid p31/PH05-TPA18 (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081) har PH05-promotoren og PH05-signalsekvensen fusioneret i struktur til et fremmedt 10 strukturgen (t-PA). Et 584 . bp BamHI-Ball-fragment indeholder PH05-promotoren og hele PH05-signalsekvensen bortset fra 8 nucleotider ved 3'-enden.

8 μg p31/PH05-TPAl8 DNA spaltes med restriktionsendonu-clease Ball (16 timer ved 37*C). DNA’et renses ved 15 phenol/chloroform-ekstraktion og ethanolfældning.

DNA’et resuspenderes i vand ved en koncentration på 0,7 mg/ml.

Den korrekte forbindelse mellem PH05-signalsekvensen og kodningsområdet for desulfatohirudin tilvejebringes ved 20 hjælp af en syntetisk linker med formlen (1) 5’-CCAATGCA-3' (2) 3’-GGTTACGTCAACA-5'

Otte nucleotider ved 5'-enden af linkeren (5’-CCAATGCA) repræsenterer en del af PH05-signalsekvensen fra Ball-ste-25 det til indvirkningsstedet. De 5' udragende fem nucleotider i oligonucleotidet (2) passer i Hgal-spalt-ningsstedet ved 5’-enden af desulfatohirudinkodningsse-kvensen.

I DK 175492 B1 I

I 62 I

I De individuelle enkeltstrengede oligonucleotider (1) og I

I (1) fremstilles ved hjælp af phosphotriestermetoden I

I (Itakura et al., se ovenfor). 1,1 pg og 1,8 μg af I

I 5 henholdsvis nucleotiderne (1) og (2) phosphoryleres hver I

I for sig ved deres 5'-ender, blandes i ækvimolære mængder I

I og anelleres som beskrevet i eksempel 15. I

I 1,3 /tg (200 pmol) af det phosphorylerede, dobbeltstrengede I

I linker-DNA ligeres til 7 μg (1,8 pmol) Ball-spaltet I

I 10 p31/Pho5-TPA18 i 40 μΐ 60 mM TriS’HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, I

I 3,5 mM ATP, 5 mM DTT og 1400 enheder T4 DNA-ligase I

I (Biolabs) ved 15eC i 16 timer. Ligasen inaktiveres i 10 I

I minutter ved 85°C. Overskud af linkerne fjernes ved I

I fældning af DNA’et i nærværelse af 10 mM EDTA, 300 mM I

I 15 natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol. DNA'et I

I resuspenderes og spaltes yderligere ved I

I restriktionsendonuclease BanvHI. Efter ekstraktion I

I afDNA'et med phenol/chloroform og fældning med ethanol I

I adskilles de to restriktionsfragmenter på en 1,2%'s I

I 20 agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 0,6 I

I kb-fragmentet isoleres fra gien. DNA'et elektroelueres og I

I renses yderligere ved ionbytterkromatografi på "DE52" og I

I ved ethanolfældning. 0,6 kb BamHI-Hgal DNA-fragmentet I

I resuspenderes i vand til en koncentration på 40 μg/ml. I

I 25 c) Isolering af pJDB207 gærvektorfragment (Fig. 6) I

I 9 /*g plasmid pJDB207R/PHO5-TPA (12-2) DNA, jf. I

I beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 143.081, I

I spaltes med restriktionsendenuklease BamHI. Efter I

I fuldstændig spaltning ekstraheres DNA'et med I

I 30 phenol/chloroform, hvorpå det fældes med ethanol. DNA'et I

I resuspenderes i 50 mM Tris»HCl pH 8,0 til en koncentration I

I på 0,1 mg/ml og spaltes med 7 enheder alkalisk I

I kalvemavephosphatase i 1 time ved 37°C. Phosphatasen I

I inaktiveres i 1,5 timer ved 65eC, og DNA’et I

63 DK 175492 B1 renses ved ionbytterkromatografi på "DE52" (se eksempel 15) og ethanolfældning. Det 6,8 kb store BamHI-fragment isoleres på en 1,2%'s agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer 5 pH 8,3. DNA'et elektroelueres og renses ved ionbytterkromatografi på "DE52" og ethanolfældning. DNA'et opløses i vand til en koncentration på 0,4 mg/ml (0,1 pmol/μ1), d) Ligering af PH05-propotorfragmentet og desulfato-10 hirudinstrukturgenet til pJDB207-gærvektorfragmen-tet (fig. 6)_ pJDB207-gærvektoren, PH05-promotorfragmentet med pH05-signalsekvensen og desulfatohirudinstrukturgenet isoleres alle som DNA-fragmenter (se eksempel 16 a-c), som 15 ligeres til dannelse af et ekspressionsplasmid.

0,3 pmol af 0,6 BamHI-Hg-al-fragmentet af p31/PH05-TPA18 og 0,3 pmol af 0,2 kb Hgal-BamHI-fragmentet af pML310L ligeres til 0,1 pmol af et 6,8 kb BamHI-fragment af PJDB207R/PH05-TPA (12-2) i 10 μΐ 60 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 20 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enbeder T4 DNA-ligase i 20 timer ved 15eC.

En alikvot på 1 μΐ af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ transformationskompetente Escherichia coli HBlOl-celler fremstillet i overensstemmelse med Hanahan (se ovenfor).

25 Der anvendes også den der beskrevne transformationsmetode.

Celler udplades på LB-agarplader indeholdende 50 μg/ml ampicillin. 1 ampR-kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium med 100 μg/ml ampicillin. Plasmid-DNA analyseres med hensyn til 30 størrelse og orientering af den indsatte del ved spalt-

I DK 175492 B1 I

I 64 I

I ning med restriktionsendonuclease Pstl. En enkelt klon med I

I den korrekte orientering af den Indsatte del betegnes I

I PJDB207/PH05-HIR. I

I 5 Eksempel 17. I

I Transformering af Saccharomyces cerevlseae-stamme GRF18 I

I Plasmid pJDB207/PH05-HIR Indføres i Saccharomyces I

I cerevisiae-stamme GRF18 (ar,his3-ll, his3-15, leu2-3, I

I leu2-112, can1*) under anvendelse af tranformationsmetoden I

I 10 beskrevet af Hinnen et al. (se ovenfor). 5 plasmld-DNA I

I sættes til 100 /il sfæroplastsuspension, og blandingen I

I behandles med polyethylenglycol. Sfæroplasterne blandes I

I med 10 ml regenereringsagar og udplades på I

I gærminlmalplader uden leucin. I

I 15 En enkelt transformeret gærkoloni udtages og dyrkes i I

I gærminimalmedium uden leucin. Kolonien betegnes I

I Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/FH05-HIR. I

I Eksempel 18.

I Dyrkning af Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PH05- I

I 20 HIR I

I Celler af Saccharomyces cerevisiae GRF18(pJDB207/PH05-HIR I

I omrøres i 20 ml gærminimalmedium (Difco Yeast Nitrogen I

I Base uden aminosyrer ved tilsætning af 2% glucose og 20 I

I mg/1 L-histidin) ved 30eC, og dyrkningen gennemføres til I

I 25 en celletæthed på 3 x 10? celler/ml. Cellerne vaskes i I

I 0,9%' s NaCl-opløsning, hvorpå de anvendes til inokulering I

I af 50 ml-kulturer i lav-Pi-minimalmedium. I

I Lav-Pi-minimalmedium fremstilles svarende til I

I sammensætningen af Difco Yeast Nitrogen Base-medium (uden H

I 30 aminosyrer), men indeholder 0,03 g/1 KH2PO4, 1 g/1 KC1 og I

65 DK 175492 B1 10 g/1 L-asparagin istedet for (NH4)2S04, 2% glucose og 1 g/1 L-histidin. Kulturerne lnokuleres op til en celletæthed på 4 x 10^ celler/ml og omrøres ved 30°C i op 5 til 42 timer med 200 omdrejninger pr. minut.

Eksempel 19.

Isolering af desulfatohirudinforbindelserne fra Saccharo-myces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PH05-HIR

a) Isolering af desulfatohirudinforbindelser fra dyrk-10 ningsmedium A. Koncentrering af hirudlnforbindelser på en RP-Cl8-sø.1le

Efter en fermenteringstid på henholdsvis 18 timer, 26 timer . og 42 timer udtages 10 prøver af 10 ml fra dyrkningsmediet, og prøverne opkoncentreres med hensyn til 15 proteiner ved af saltning og koncentrering på en "Bond Elut C-18 "-søjle (1 ml, Analytichem International). Når prøverne er sat til søjlen og væsken er fjernet i vakuum, vaskes søjlen med 2x1, 5 ml-acetonitril (9:1)-0,1% trifluoreddikesyre (9:1). Hirudlnforbindelser elueres fra 20 søjlen med vand-acetonitril-0,1% trifluoreddikesyre (6:4).

2 ml eluat koncentreres i et vakuumkoncentreringsapparatur (Speed Vac concentrator, Savant) til et slutrumfang på 400 μΐ. Hirudinforbindelserne identificeres ved hjælp af HPLC-analyse, ved sammenligning med autentisk 25 desulfatohirudin og ved hjælp af thrombininhiberings-analysen. Prøverne indeholder ca. 0,2-2 μg/ml hirudlnforbindelser.

B. Ionbytterkromatografi på en søjle af "DEAE"-cellulose.

1 liter dyrkningsmedium høstes efter en fermenteringstid 30 på 42 timer, hvorpå det centrifugeres. Supernatanten sættes på en anionbyttersøjle med "DE53”-cellulose

I DK 175492 B1 I

I 66 I

I (Whatman) ved pH 7,5 [betingelser: søjle 2,5 x 15,5 cm (76 I

I ml), elueringspuffer A: 20 mM ammoniumacetat, 100 mM NaCl, I

I pH 7,5, elueringspuf fer B: 20 mM ammoniumacetat, 4 mM I

I 5 NaCl, pH 5,0, gennemstrømning: 66 ml/time ]. Søjlen vaskes I

I med 228 ml puffer A, hvorpå den elueres med en lineær I

I saltgradient af 228 ml af henholdsvis puffer A og puffer I

I B. Der opsamles fraktioner på 22 ml. Hirudinforbindelser

I elueres i fraktioner 71-74 (88 ml) og identificeres ved I

I 10 hjælp af thrombininhiberingsprøven. De aktive fraktioner I

I dialyseres natten over ved 4°C mod 29 mM ammoniumacetat.

I Derefter lyofiliseres alikvoter to gange. Lyofilisaterne I

I indeholder desulfatohirudinforbindelser, hvilke bestemmes I

I ved HPLC med omvendt fase. I

I 15 C. Gelfiltrering på "Sephadex"® G50 og afsluttende rens-

I ning ved hjælp af HPLC I

I Hovedfraktionen (80 ml eluat), som er aktiv i I

I thrombininhiberingstesten, dialyseres natten over ved 4eC I

I mod 20 mM ammoniumacetat pH 7,5, hvorefter den H

I 20 koncentreres under anvendelse af en rotationsfordamper ved

I 35°C til et slutrumfang på 5 ml. I

I Den dannede klare vandige opløsning sættes til en søjle af I

I "Sephadex"® G50 fine med et søjlerumfang på 160 ml, idet I

I søjlen (2,5 x 64 cm, Biorad) er forækvilibreret med 5%'s

I 25 eddikesyre. Hovedaktiviteten indeholdt i 50 ml eluat I

I (fraktioner 5-7, strømning 50 ml/time, 25 I

I minutter/fraktion) koncentreres under anvendelse af en I

I rotationsinddamper, hvorpå der foretages en adskillelse I

I ved hjælp af HPLC med omvendt fase. En alikvot på 500 μΐ I

I 30 af de enkelte fraktioner koncentreres 10 gange under I

I anvendelse af et vakuumkoncentreringsapparatur ("Speed I

I vac", Savant), og der foretages undersøgelse ved hjælp af H

I HPLC med omvendt fase for indhold af desulfatohirudin- I

I forbindelser. Opløsningerne indeholder desulfatohirudin- I

67 DK 175492 B1 forbindelser. Fraktion 6 (18 ml) indeholder den procentvis mindste del af sekundære komponenter og renses yderligere ved hjælp af semipræparativ HPLC med omvendt fase.

5 Forsøgsbetingelser: Vydac 218 TP 510 RP-HPLC-søjle, 10 x 250 mm, alikvote portioner af fraktion 6 (200 μΐ koncentreret 10 gange= pr. separation, AUFS 0,5 ved 220 nm, flow-rate: 2 ml/minut, elueringsmiddel: A: 0,1% trichloreddikesyre, B: acetonitril/vand 8:1 + 0,07% 10 trifluoreddikesyre, 1 minut 16% B, derefter forøgelse i løbet af 40 minutter til 64% B. De dannede fraktioner fortyndes i forholdet 1:1 med vand og lyofiliseres. Remanensen består af rene desulfatohirudinforbindelser.

b) Isolering af desulfatohirudinforbindelser fra celle-15 ekstrakter af Saccharomyces cerevlsiae GRF18/pJDB207/ PH05-HIR

Cellerne nedbrydes på sædvanlig måde, se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 100.561. Supematanten behandles med 2%'s eddikesyre og centrifugeres (12.000 20 omdrejninger pr. minut, 10eC). Der tilsættes ammoniak til en slut-pH-værdi på 7,5, og den svagt uklare opløsning (50 ml) behandles yderligere som beskrevet ovenfor (se eksempel 19a). Hirudinforbindelserne identificeres på samme mde som beskrevet ovenfor, dvs. ved hjælp af 25 thrombininhiberingsanalysen og ved hjælp af HPLC med omvendt fase.

Eksempel 20.

Analyse af produktblandingen fra fermenteringen af Saccharomyces cerevesiae GRF18pJDB207/PH05-HlR 1 a) 2 ml-portioner af supematanten fremstillet som beskrevet ovenfor (se eksempel 19b) tørres på et såkaldt

I DK 175492 B1 I

I 68 I

I "Speed Vac"-koncentreringsapparat under højvakuum. I I Prøverne opløses hver for sig i 100 μΐ vand og under I I kastes HPLC-analyse (forsøgsbetingelser nr. 1, se · I I 5 nedenfor). De enkelte fraktioners thrombininhibering I I afprøves. Fraktionerne med en retentionstid på 16,5 I I minutter og 17,7 minutter viser thrombininhibering. I I Forholdet (ekspressionsudbytte) mellem disse to fraktioner I I er omtrentlig 4:1. Ifølge aminosyresammensætningen er I I 10 disse fraktioner desulfatohirudlner. I

I b) Fraktionerne, som er aktive ved thrombininhibe- I I , ringstesten, og som er opnået som beskrevet i eksempel I I 19a), underkastes HPLC-analyse under to forskellige sæt I betingelser. I

I 15 Forsøgsforbindelser nr. 1: "Nucleosil" (MN) C18, 5 μτα I I RP-HPCL-søjle, 4,6 x 120 mm: 50 μΐ hirudinforbindelser pr. I I adskillelse, att. 6 ved 214 nm, flow-rate 1,2 ml/minut, I I elueringsmiddel: A: 0,1% trifluoreddikesyre, B: I I acetonitril/vand 8:2 med 0,08% trifluoreddikesyre, 2 I I 20 minutter, 16% B, derefter stigning i løbet af 50 minutter I I til 64% B, modtryk: 66 bar. I

I Forsøgsbetingelser nr. 2: Som ovenfor bortset fra gradient I I 2 minutter 20% B, derefter stigning i løbet af 40 minutter I I til 80% B. I

I 25 Der udtages fraktioner med 1 minuts mellemrum (i alt 45), I I og fraktionerne underkastes thrombininhiberingstesten. I I Fraktionerne 17-19 viser sig at være aktive. Desuden I I bestemmes aminosyresammensætningen, N-afslutningen og I I N-terminalsekvensen for de aktive hirodinforbindelser i I I 30 fraktionerne 17 og 18. En fraktion (17) sammenlignes I I endvidere med autentisk desulfatohirudin, som opnås ved at I I omsætte naturligt hirudin fra igler med enzymet aryl- I

DK 175492 B1 '69 sulfatase. Tesultaterne er anført i nedenstående tabel 1:

Tabel 1 ---1-

Fraktion ketentionstid Retentionstid . Thrombin (min.) (min.) ... | inhiberinc .i __betingelse nr. 1 betingelse nr, 2 _(%)_

Fr. 17 16,5 13,7 96

Fr. 18 . 17,7 14,7 86

Fr. 19 18,7 - 78 autentisk 16, 5 13,6 86.

desulpha- tohirudin_______

Forholdet mellem udbytter i fraktion 17 og 18 er igen ca.

5 4:1.

c) Alikvoter på 200 ml af supernatanten fremstillet som ovenfor, se eksempel 19a) underkastes HPLC-analyse (betingelser nr. 3, se nedenfor) og FPLC-adskillelse (betingelser nr. 4). De enkelte fraktioners 10 thrombininhibering afprøves. Fraktionerne med en retentionstid på 8,0 minutter (top 1), 11.1 minut (top 2) og 12,1 minut (top 3) har en kraftig thrombininhibering. Forholdet (ekspressionsudbytte) mellem disse tre forbindelser er ca. 1:4:1. Ifølge HPLC-analyse er 15 forbindelser svarende til top 2 og 3 identisk med hirudinforbindelserne beskrevert i eksempel 20b) (fraktionerne 17 og 18). Resultaterne er anført i tabel 2:

I DK 175492 B1 I

I 70 I

I Tabel 2. I

I Frak- Retentionstid Retentionstid Retentionstid [cl NaCl I

I tion (min) (min) (min) betingelse I

I betingelse nr. 1 te tingelse nr. 2 betingelse nr.3'7 nr. 4 I

I Top 1 14,0 11,6 8,0 365 mM I

I Top 2 16,5 13.7 11,1 340 mM I

I (Fr.17) I

I Top 3 17,7 14,7 12,1 360 mM I

I (Fr.lB)

I Forsøgsbeingelser nr. 3: Vydac 218 TP-B5 RP-HPLC-søjle, I

I 4,0 x 120 mm, 15 jig hirudinforbindelse pr. adskillelse,

I 5 att. 7 ved 214 run, flow-rate 1,2 ml/minut, elueringsmiddel I

I A: 0,1% trifluoreddikesyre, B: acetonitril med 0,08% I

I trifluoreddikesyre, 2 minutter 16% B, derefter forøgelse I

I af 20 minutter til 40% B, modtryk 80 bar. I

I Forsøgsbetingelser nr. 4: Pharmacia Mono Q FPLC-anion- I

I 10 byttersøjle, 5,0 x 50 mm, 15 μg hirudinforbindelse pr.

I adskillelse, AUFS 0,01 ved 280 nm, flow-rate 1,0 ml/minut, I gradientelueringspuffer A: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, puffer

I B: puffer A og 1 M NaCl pH 7,5, 9 minutter 15% B, derefter I

I stigning i løbet af 21 minutter til 70% B. I

I 15 Eksempel 21. I

I Karakterisering af desulfatohirudinførbindelser fra I

I fermenteringen af stammen Saccharomyces cerevisiae I

I GRF18/PJDB207/PHQ5-HIR

I I overensstemmelse med HPLC-analysen er I

I 20 hirudinforbindelser i fraktione 17 (eller top 1) og 18 I

I (eller top 2) isoleret fra mediet (se eksempel 20, tabel 1 I

I og 2) identiske med de tilsvarende forbindelser isoleret 71 DK 175492 B1 fra celleekstrakterne (intracellulære hirudinforbin-delser). Disse forbindelser samt forbindelsen 1 top 3 (se tabel 2) er karakteriseret på følgende måde: 5 a) Bestemmelse af aminosyresammensætningen

Ca. 2,6 μg af den rene hirudinforbindelse hydrolyseres i 24 tmer med 6 N saltsyre ved 110eC, hvorpå der analyseres som beskrevet af Chang et al. [DABS-C1 method, Methods in Enzymology 91, 41 (1983)]. Hydrolysatet har følgende 10 sammensætning:

Top 1 (se tabel 2)

Aminosyre Hydrolysat . Aminosyre Hydrolysat

Asp 9,2 (9) Ile 2,1 (2)

Thr 4,1 (4) Leu 3,3 (3)

Ser 4,0 (4) Tyr 1,9 (2)

Glu " 12,4 (12) Phe 1,2 (1)

Pro 3,1 (3) His 1,0 (1)

Gly 9,0 (9) Lys 3,1 (3)

Val 3,4 (4) Met O (0)

Cystin 2,5 (3) Total (63)

Top 2 (fraktion 17, se tabel 1 og 2)

Aminosyre Hydrolysat Aminosyre Hydrolysat.

Asp 9,9 (9) He 2,1 (2)

Thr 4,0 (4) Leu 4,4 (4)

Ser 3,9 (4) Tyr 1,2 (2)

Glu 12,8 (13) Phe 1,2 Π)

Pro 3,1 (3) His 1,2 (1>

Gly 9 ! (9) Lys 2,9 {3)

Val 37 (4) Met O (0)

Cystine 2,8 (3) Total (65)

I DK 175492 B1 I

72 I

I Top 3 (fraktion 18, se tabel 1 og 2) I

I Aminosyre Hydrolysat Aminosyre Hydrolysat I

I Asp 10,0 (9) Ile 1,9 (2) I

I Thr 3,9 (4) Leu 3,3 (4) I

I Ser 4,1 (4) Tyr 1,8 (2) I

I Glu 12,5 (12) Phe 1,1 (D I

I Pro 3,1 (3) His .1,0 (1) I

I Gly 8,7 O) Lys 2,8 (3) I

I Val 3,1 (4) Met 0 (0) I

I Cystin 2,4 (3) Total (64) I

I b) partiel sekvensanalyse I

I 18 /tg (2,5 nmol) af den rene hirudinforbindelse I

5 underkastes en konventionel sekvensanalyse ifølge Edman, I

og de N-terminale phenylthiohydantoin-(PTH)-aminosyrer I

bestemmes ved hjælp af RP-HPLC. I

Resultater I

Top 2 (fraktion 17, se tabel 1 og 2) I

Periode 1 5 ^ ® I

Aminosyre Val Val Tyr Thr Asp n.d. Thr Glu Ser Gly I

Periode 11 15 I

Aminosyre Gin Asn Leu n.d# Leu n.d. Glu Gly Ser I

Periode 20 25 I

Aminosyre Asn Val n.d. Gly n.d, Gly Asn Lys n.d. I

Periode 29 35 I

Aminosyre ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn I

I DK 175492 B1 I 73 I Periode 38 40 45 I Aminosyre n.d. n.d. Val Thr Gly Glu Gly Pro Lys I Periode 48 50 I Aminosyre Pro n.d. Ser n.d.

I (n.d. = ikke bestemt) I Top 1 (se tabel 2) I Sekvens fra periode 1 til periode 29 som ovenfor.

I 5 Top 3 (fraktion 18, se tabel 1 og 2) I Sekvens for periode 1 til periode 27 som ovenfor.

I De N-terminale sekvenser i de undersøgte biosyntetiske I hirudinforbindelser er således identiske med sekvenserne I hos autentisk hirudin.

I 10 C. C-terminalanalyse

Hirudinforbindelserne spaltes med carboxypeptidase Y, og den frigjorte aminosyre bestemmes i aminosyreanalysa-toren, jf. J.Y.Chang, R. Knedel, D.G. Braun, Biochem J.

199, 547.

15 Resultater

Top 1 (se tabel 2) C-terminale aminosyrer: -Glu-Tyr

Top 2 (fraktion 17, se tabel 1 og 2) C-terminale aminosyrer: -Glu-Tyr-Leu-Gln I DK 175492 B1 I 74 I Top 3 (fraktion 18, se tabel 1 og 2) I C-terminale aminosyrer: -Glu-Tyr-Leu I d) Tilsyneladende molekylevægte I 5 Desulfatohirudinforbindelserne (30 /tg) analyseres på en I SDS-urinstofgel [SUDS-gel, se Kyte et al., Anal. Biochem.

I 133, 515 (1983)]. inden farvning med coomassieblåt I foretages fiksering med 12%'s trifluoreddikesyre. Der iagttages et enkelt bånd svarende til en tilsyneladende I 10 målekylvægt på mellem 6000 og 7000 Dalton.

H e) Molekylvægtsbestemmelse ved hjalp af FAB-MS

Desulfatohirudinforbindelserne underkastes såkaldt "fast atom bombardment positive ion mass spectrometry" (FAB-MS).

Apparatur: ZAB-HF-massespektrometer fra VG-Analytical 15 Ltd., Manchester, matrix: thioglycerol, xenon-bombarde- ment, ion-energi 10 KeV, ekstern kalibreing: CS26J25 (molekylvægt: 6887,9) og 0328^27 (7147.76).

Resultater

Top 1 (se tabel 2) 20 Sumformel: C276421N77°107S6 H molekylvægt (beregnet): 6722,23 I molekylvægt (fundet): 6719,3

Top 2 (fraktion 17, se tabel 1 og 2)

Sumformel: C287H440N80°110S6 25 molekylvægt (beregnet): 6963,518 molekylvægt (fundet): 6963,44 I DK 175492 B1 I 75 I Molekylvægten er et gennemsnit af to forskellige målinger.

I Top 3 (fraktion 18, se tabel 1 og 2) I . Sumformel: C282H432N78°108S6 I 5 molekylvægt (beregnet): 6835,39 I molekylvægt (fundet): 6832,9 I Baseret på de forelagte data er forbindelsen i top 1 I desulfatohirudin (1-63), forbindelsen i top 2 er identisk I med autentisk desulfatohirudin (1-65), og forbindelsen i I 10 top 3 er hidtil ukendt desulfatohirudin (1-64).

I f) Humane thrombin-hirudin-dissociationskonstanter I Dissociationskonstanterne Kp for de humane thrombin- I desulfatohirudinkomplekser bestemmes i overensstemmelse I med femgangsmåden ifølge S.R. Stone og J. Hofsteenge, I 15 [Biochemistry 25, 4622-4628 (1986)] og er anført i den I efterfølgende tabel. Tabellen indeholder også de I specifikke aktiviteter (udtrykt i ATU/mg) for de tre I opnåede desulfatohirudinforbindelser.

KD[MJ Specifik aktivi- 20 tet [ATU/mg ] Gær-desulfatohirudin (1-65) 2,9 x 10-^3 11000 Gær-desulfatohirudin (1-64) 3,9 x 10~13 9600 Gær-desulfatohirudin (1-63) 3,0 x 10“13 8900 g) Andre desulfatohirudinforbindelser opnået fra 25 transformeret gær

Blandingen af desulfatohirudinforbindelser, opnået ved fermentering og rensning som beskrevet i eksempel 19, adskilles yderligere og karakteriseres detaljeret.

I DK 175492 B1 I 76 I Den semipræparative adskillelse på "Vydac 218 TP 510"

I RP-HPLC-søjlen giver foruden de ovenfor beskrevne I

I desulfatohirudinforbindelser (se eksempel 21e) I

5 desulfatohirudinlignende forbindelser, som elueres fra I

I søjlen ved en retentionstid på 8,1 minut. I

I Dette materiale karakteriseres ved såkaldt "fast atom bombardment mass spectrometry" (FAB-MS) og aminosyre-

I analyse, partiel sekvensbes teinmel se og C-terminal- I

I 10 analyse. I

FAB-MS viser, at materialet er en blanding to forbindelser

I med en molekylvægt på henholdsvis 6429,5 og 6556,8. I

Aminosyre sammensætningen er som følger: I

Aminosyre Hydrolysat Amino syre Hydrolysat I

I ASX 8,9 (9) Ile 2,1 (2) I Thr 3,7 (4) Leu 3,6 (3)

Ser 4,1 (4) Tyr 0,9 (1)

Glx 10,7 (11) Phe 1,1 (1) I Pro 3,2 (3) His 1,2 (1) I Gly 9,7 (9) Lys 3,2 (3) I Val ‘ 3,3 (4) Met O (0) I Cystin 3,3 (3) Total (61) I Partiel sekvensanalyse (N-terminal) I 15 Periode 123

Aminosyre Val Val Tyr C-terminalanalyse (se eksempel 21c) I 59 60 61 62 C-terminale aminosyrer -Ile-Pro-Glu-(Glu) I DK 175492 B1 I 77 I På grundlag af disse baser består blanding af I desulfatohlrudln (1-61) og desulfatohirudin (1-62).

I Eksempel 22.

I 5 Ekspression af desulfatohirudlnforblndelser 1 gær I Indeholdende et desulfatohirudlngen uden signalsekvens I (fig. 7).

I a) Isolering af pJDB207-vektorfragmentet I 6 |ig af plasmidet pJDB207/IF(or-3) (jf. beskrivelsen til I 10 europæisk patentansøgning nr. 100.561) spaltes I fuldstændigt med restriktionsendonucleasen BamHI. De I dannede DNA-fragmenter (6,85 kb og 1,15 kb) fældes med I ethanol og optages i 400 /il 50 mM Tris-HCl pH 8,0. Der I tilsættes 4,5 enheder kalvemavephosphatase (Boehringer, I 15 Mannheim). Blandingen inkuberes i 1 time ved 37eC, I hvorefter phosphatasen inaktiveres ved 65°C i 1,5 timer.

I Opløsningen indstilles til 150 mM NaCl, hvorpå den sættes I på en "DE52" (Whatman)-anionbyttersøjle (rumfang 100 μΐ), som forinden er blevet ækvilibreret med 10 mM Tris*HCl pH 20 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA. Efter en vaskeproces med den samme puffer elueres DNA'et med 400 μΐ 1,5 M NaCl, 10 mM Tris'HCl pH 7,5, 1 mM EDTA og fældes med ethanol. Det store 6,85 kb BamHI-fragment adskilles fra det lille fragment på en 1,2%’s agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer 25 pH 8,3.

b) Isolering af 534 bp PH05-promotorfragmentet 6 /tg af plasmidet p31/R (se beskrivelsen til den

europæiske patentansøgning nr. 100.561) spaltes med I

restriktionsendonucleaserne EcoRI og BamHI. De fremkomne I

30 tre DNA-fragmenter adskilles på en 1,2%'s agarosegel i I

tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 534 bp BamHI-EcoRI-frag- I

I DK 175492 B1 I 78 I mentet isoleres. Det indeholder PH05-promotoren inklusive I tr anskriptionsstartstedeme.

I c) Isolering af et 206 bp DNA-fragment med sekvensen, som I 5 koder for desulfatohirudin I 9 fig af plasmidet pML310 (se eksempel 13c) spaltes I fuldstændigt med reatriktionsenzymerne BamHI og EcoRI. De I dannede to DNA-fragmenter adskilles på en 1,2%'s agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 206 bp 10 EcoRI-BamHI-fragmentet isoleres.

d) Ligering af DNA-fragmenterne

De tre DNA-fragmenter omtalt i afsnit a-c ovenfor udvindes fra agarosegelblokke ved elektroeluering, renses over "DE52" (Whatman)-anionbyttere, fældes med ethanol og 15 resuspenderes i vand.

0,1 pmol (0,45 μg) af 6,85 kb BamHI-vektorfragmentet, 0,3

pmol (0,1 μ9) af 534 bp BamHI-EcoRI

PH05-promotorfragmentet og 0,25 pmol (34 ng) af 206 bp

EcoRI-BamHI-fragmentet fra pML310 ligeres i 15 μΐ 60 mM

20 Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP med 600 enheder T4 DNA-ligase (Biolabs) ved 15eC i 16 timer.

24 transformerede ampR-kolonier dyrkes hver for sig en H LB-medium med 100 μg/ml ampicillin. Plasmid-DNA isoleres i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Holmes et al.

25 (se ovenfor) og analyseres ved hjælp af en

HindiII-EcoRI-dobbeltspaltning. Forekomsten af et omtrentligt 600 bp stort EcoRI-Hindlll-fragment indicerer, at PH05-promotor-hirudin-DNA-fragmentet i den pågældende H klon er i den rigtige orientering i forhold til 30 transkriptionsstopsignaler på vektoren. Som forventet har I ca. 50% af klonerne den korrekte orientering af den ind- 79 DK 175492 B1 satte del. En af disse kloner betegnes pJDB207R/PH05-HIR.

e) Transformering af Saccharomyces cerevisiae GRF18

Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (a, his3-ll, 5 his3-15, leu2-3, leu2-112, canR transformeres med plasmidet pJDB207R/PH05-HIR i overensstemmelse med fremgangsmåden iølge Hinnen et al. (se ovenfor). Udvælgelsen af transformerede gærceller gennemføres på agarplader med gærminimalmedium uden leucin. En 10 transformeret gærkoloni isoleres og betegnes Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-HIR.

f) Dyrkning af Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/

PH05-HIR

Celler af Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PH05-HIR 15 omrøres i 20 ml gærminimalmedium (Difco Yeast Nitrogen Base uden aminosyre tilsat 2% glucose og 20 mg/1 L-histidin) ved 30°C til en celletæthed på 3 x 10 ? celler/ml. Cellerne vaskes i 0,9% NaCl-opløsning, hvorpå de anvendes til inokulering af 50 ml-kulturer i lavt 20 P^-minimalmedium. Lavt P^-minimalmedium fremstilles svarende til sammensætningen af Difco Yeast Nitrogen Basemedium uden aminosyre) men indeholder 0,03 g/1 KH2PO4, 1 g/l KC1 og 10 g/1 L-asparagin i stedet for ammoniumsulfat, 2% glucose og 1 g/1 L-histidin. Kulturerne inokuleres op 25 til en celletæthed på 4 x 10^ celler/ml og omrøres ved 30°C i 42 timer med 200 omdrejninger pr. minut.

g) Analyse af produktblandingen fra fermenteringen af Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207R/PH05-HIR

Cellerne (se eksempel 22f) nedbrydes på sædvanlig måde (se 30 f.eks. beskrivelsen til europæisk patentansægning nr. 100.561). Supernatanten behandlet med 1,5%'s eddikesyre I DK 175492 B1 i I 80 I centrifugeres, og portioner på 2 ml af den klare opløsning I tørres i et "Speed Vac" koncentreringsapparatur og i I højvakuum. Prøverne opløses hver for sig i 100 μΐ vand og I 5 underkastes HPLC-analyse (betingelser som i eksempel 20).

I De enkelte fraktioners thrombnininhibering afprøves.

I Fraktionen med en retentionstid på 16,5 minutter har I thrombininhiberingsaktivitet. Ifølge aminosyresammen- sætningen er denne fraktion desulfatohirudin. På basis af 10 HPLC-analyse er koncentrationen ca. 10 jtg/1 dyrkningsvæske. Der kan ikke påvises hirudin i mediet.

Udbytterne af intracellulær og ekstracellulær hirudinaktivitet opnået fra gærstammer indeholdende I desulfatohirudingenet md eller uden en påhæftet 15 signalsekvens er anført i tabel 3. Hirudinaktiviteten er H målt ved hjælp af thrombininhiberingsprøven.

I Tabel 3.

Saccharomyces PH05-signal- hirudinaktivitet {μg/l) cerevisiae sekvens kultur- celle- total H 20 GRF18/plasmid_medium ekstrakt_ PJDB207/ I PH05-HIR + 6 x 103 <1 x ΙΟ3 7·103 I pJDB207R/ ingen på- PH05-HIR - visning 10 10

I 25 Eksempel 23. I

Konstruktion af PH05-promotorsletninger I

I a) Bal31-spaltning I

I Rekombinantfag M13mp9/PH05 Bam-Sal indeholdende I

BamHI-Sall-fragmentet af PH05 vist i fig. 8 anvendes som I

I 30 kilde for PH05-promotoren (se beskrivelsen til suropæisk I

81 DK 175492 B1 patentansøgning nr.143.081.

20 jig fag-DNA (RF: replikativ form) spaltes med restriktionsendonuclease Sall, hvorved der fås et lineært 5 DNA på ca. 9 kb. Efter ekstraktion med phenol/chloroform fældes DNA'et med ethanol. DNA*et resuspenderes i 10 mM Tris pH 8,0 ved en koncentration på 0,5 ftg/ml. 16 μg Sall-spaltet DNA spaltes med 2 enheder exonuclease Bal31 (BRL) i 100 μΐ 20 mM Tris pH 8,0, 199 mM NaCl, 12 raM

10 MgCl2, 12 mM CaCl2 og 1 mM EDTA. Alikvoter på 2 μg DNA

udtages efter henholdsvis 1, 2, 3, 4, 5 og 6 minutters inkubering ved 30°C og blandes straks med 50 μΐ phenol og 60 μΐ TNE. Efter ekstraktion med phenol/chloroform og ethanol fældning resuspenderes DNA'et i 10 mM Tris pH 8,0 15 ved en koncentration på 100 μg/ml. Til analyse af graden af exonucleolytisk spaltning med Ba31 spaltes 0,5 μg DNA udtaget på de anførte tidspunkter med endonuclease NamHI, og der analyseres på en 1,5%'s agarosegel i Tris-borat-puffer pH 8,3 (90 mM Tris*HCl pH 8,3, 90 mM borsyre, 2,5 20 mM EDTA). I gennemsnit er 100 bp fjernet fra hver ende af fragmentet pr. minut Bal31-spaltning.

b) Addition af EcoRI-linkere til Bal31-behandlet DNA

To a260-enheder af EcoRI-linkere (5’-GGAATTCC-3', BRL) resuspenderes i 250 μΐ 10 mM Tris Ph 8, 1 mM EDTA. 2 ug 25 EcoRI-linkere kinasebehandles i 75 μΐ 60 mM Tris Ph 7,5, 10 mM MgCl2, 15 mm DDT, 10 μΜ ATP og 33 enheder T4 polynucleotid kinase (Boehringer). Efter 1 time ved 37*C henstilles blandingen til afkøling til stuetemperatur, hvorefter den opbevares ved -20DC. 1

De anellerede, dobbeltstrengede EcoRI-linkere ligeres ved deres korte ender til de med Bal31 behandlede DNA-fragmenter. Et halvt mikrogram Bal31-behandlet DNA (se esempel 23a) inkuberes i 16 timer ved stuetemperatur med

I DK 175492 B1 I

I 82 I

I et 50-dobbelt overskud af kinasebehandlede EcoRI-linkere i I

I 20 μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP I

I og 600 enheder T4 DNA-ligase (Biolabs). Efter inaktivering I

I 5 af T4-DNA-ligasen (10 minutter ved 65®C) spaltes I

I overskuddet af EcoRI-linkere med 50 enheder EcoRI I

I (Boehringer) i et rumfang på 50 μΐ. DNA'et ekstraheres med I

I phenol/chloroform, fældes med ethanol og resuspenderes i I

I 10 mM Tris, 1 mM EDTA (=TE). Derefter spaltes DNA'et med 5 I

I 10 enheder BamHI (Biolabs), og blandingen sættes til en I

I 1,5%'s lavtsmeltende agarosegel (Sigma) i Tris-boratpuffer I

I (se ovenfor). Båndene farves med ethidiumbromid og gøres I

I synlige ved belysning med langbølget ultraviolet lys ved I

I 366 nm. De brede diffuse båndmønstre mellem ca. 100 bp til I

I 15 600 bp udskæres af gelen, og DNA'et ekstraheres på I

I følgende måde. Agarosestykket smeltes ved 65eC, indstilles I

I til 100 mM NaCl og inkuberes ved 65eC i 20 minutter. Der I

I tilsættes 1 rumfang phenol (ækvilibreret med 10 mM I

I Tris*HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl). Den vandige fase I

I 20 reekstraheres to gange med phenol og en gang med I

I chloroform. DNA'et fældes med to 2,5 rumfang kold absolut I

I ethanol og samles ved centrifugering. DNA-kuglen vaskes I

I med kold 80%'s ethanol, hvorpå den tørres i vakuum. DNA'et I

I resuspenderes i 10 μ1 TE. I

I 25 c) Ligering til M13mp9 I

I 3 pg RF af M13mp9 spaltes med 15 enheder EcoRI (Biolabs) I

I og 15 enheder BamHI (Boehringer) i et rumfang på 50 μΐ. I

I Efter phenolekstraktion og ethanolfældning resuspenderes I

I DNA'et i 50 μΐ TE. 5 μΐ skåret vektor-DNA (ca. 200 mg) I

I 30 blandes md 10 μΐ af de ovenfor anførte prøver (DNA-frag- I

I menter fremkommet ved forskellige Bal31-spaltninger som I

I beskrevet i eksempel 23b) og ligeres i et samlet rumfang I

I på 20 μΐ i nærværelse af 60 mM Tris/HCl pH 7,5, 6 mM I

I MgCl2» 10 mM DTT, 1 mM ATP og 200 enheder T4 DNA-ligase i I

I 35 15 timer. Trasduktion af kompetente celler er af stammen I

DK 175492 Bl 83

Escherichia coli JM101 gennemføres i overensstemmelse med håndbogen "M13 cloning and sequencing system" udgivet af New England Biolabs. Fager fra et antal hvide plak dyrkes 5 og aalyseres med hensyn til størrelsen af de indsatte DNA-dele ved spaltning med restriktionsenzymer EcoRl og BamHI.

d) Bestemmelse af Bal31-sletningsendepunkter ved hjælp af Sanger-sekvensering (sletninger fra Sall-stedet) 10 Sekvenseringen gennemføres under anvendelse af dideoxy-DNA-sekvenseringssystemet ifølge Sanger et al.

[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1977)] som beskrevet i den ovenfor omtalte håndbog. Sletningsendepunkterne er anført i det følgende: 15 Klon Position af sidste nucleotid i PH05-sekvensen (se fig. 8) A -502 B -471 C -422 D -400 E -392 F -369 G -350 H -328 I -300 K -283 L -255 M -226 N -211 O -187 P -111 Q - 88 R - 57 S - 33 I DK 175492 B1

I 84 I

I e) Bestemmelse af Bal31-sletningsendepunkter ved hjælp af I Sanger-sekvensering (sletninger fra BamHI-stedet)

Der foretages et lignende sæt Bal31-sletninger som I

I 5 beskrevet under a-c, idet dog M13mp9 PH05 Bam-Sal spaltes I

I med BamHI. De Bal31-spaltede molekyler skæres med EcoRI og I

I Sall, og de dannede fragmenter klones i M13mp9 spaltet med I

I EcoRI og Sall. Sletningsendepunkterne er anført nedenfor: I

I Klon Position af sidste nucleotid i I

I 10 PH05-sekvensen (se fig. 8) I

I A' -24 I

I B> ~35 I

I C' -41 I

I D* -48 I

I Ε» -74 I

I F* -69 I

I G' -93 I

I H' -97 I

I 1' -124 I

I K’ -162 I

I L’ -174 I

I M' -252 I

I Ν’ -277 . I

I O' -306 I

I P' -332 I

I Q' -346 I

I R' -361 I

I S' -382 I

I Τ' -393 I

I f) Konstruktion af indre PH05-promotorsletninqer I

I Bal31-sletningssættet beskrevet under d) fremkalder et I

I såkaldt "venstre arm" PH05-promotorfragment, som ender med I

DK 175492 B1 85 et EcoRI-sted, og Bal31-sletningssættet beskrevet under e) danner et såkaldt "højre arm" PH05-promotorfragment, som ender md et EcoRI-sted. Ved kombination af "vantre arme" 5 og "højre arme" fra forskellige positioner dannes indre sletninger, som indeholder et EcoRI-linkersegment på stedet for det slettede DNA. De enkelte indre sletninger konstrueres ved at skære "venstre armene" og "højre armene" fra M13mp9-derivaterne med restriktions-10 endonucleaser EcoRI og BamHI (venstre arme) eller EcoRI og Sall (højre arme) og at isolere de tilsvarende fragmenter ved hjælp af elektroforese på blød agarosegel som beskrevet under b). Ækvimolære mængder "ventre arme", "højre arme" og 200 ng BamHI og Sall spaltet M13mp9 15 vektor-DNA ligeres som beskrevet under c). Efter transduktion ti Escherichia coli JM101 udtages hvide plak, og RF produceres og analyseres ved hjælp af restriktionsanalyse (BamHI, Sall, EcoRI). Nedenstående arme kombineres til dannelse af specifikke indre 20 sletninger (angående nummerering af nucleotideme henvises til fig. 8): !

I DK 175492 B1 I

I 86 I

I "Venstre "Højre Antal slettede I

I arm" arm" Sletning Fra - til nucleotider I

I A Τ’ Δ 7 -501 to -394 108 I

I B Τ' Δ 8 -470 to -394 77 I

I c Τ' Δ 9 -421 to -394 28 I

I D S* Δ10 -399 to -383 17 . I

I E R' Δ11 -391 to -362 30 I

I F Q' Δ12 -368 to -347 22 I

I G P' Δ13 -349 to -333 17 I

I HO' Δ14 -327 to -307 21 I

I I Ν' Δ15 -299 to -278 . 22 I

I KM' Δ16 -282 to -263 20 I

I L L' Δ17 -254 to -175 80 I

I M L' Δ18 -225 to -175 51 I

I N L' Δ19 -210 to -175 36 I

I 0 L' Δ20 -186 to -175 12 I

I OK' Δ21 -186 to -163 24 I

I 0 1' Δ22 -186 to -125 62 I

I OH' Δ23 -186 to - 98 89 I

I P Η' Δ24 -110 to - 98 13 I

I P G* Δ25 -110 to - 94 17 I

I p F' Δ26 -110 to - 90 21 I

I q E' Δ27 - 87 to - 75 13 I

I R D' Δ28 - 56 to - 49 8 I

I R C Δ29 - 56 to - 42 15 I

I R B' Δ30 - 56 to - 36. 21 I

I S A’ Δ31 - 32 to - 25 8 I

I g) In vivo-analyse af de indre sletninger i PHOS-promo- I

I toren I

I De forskellige sletninger beskrevet i eksempel 23f) klones I

I 5 i plasmid pJDB207/PH05 [R. Haguenauer-Tsapis og H. Hinnen, I

87 DK 175492 B1

Molecular and Cellular Biology, 4^_ 2668-2675 (1984)] ved at erstatte vildtype PH05 Bam-Sal-fragmentet med den slettede udgave. Efter transformation af gærstaxnme 5 Saccharomyces cerevisiae AH216 (se beskrivelsen til europæisk patentansægning ne. 143.081) bestemmes sur phosphataseaktivit som beskrevet af Toh-e et al. [J. Bacteriol. 113. 727 (1973) ]. Sletninger Δ11 og Δ12 viser en ca. tidobbelt reduktion af i PH05-aktivitet og 10 fastlægger et såkaldt "upstream" område ("upstream activation site", UAS), som er essentielt for PH05-ekspression. En lignende formindskende virkning iagttages for sletningen Δ17 (ca. femdobbelt formindskelse) og for TATA box-sletninger Δ23-Δ26 (ca. 30 15 ganges reduktion). Alle andre sletninger viser aktiviteter på omtrentlig vildtypeniveau. Disse resultater indicerer, at der findes tre områder med essentiel information for PH05-ekspression på følgende positioner: 1. mellem position -340 og -383 (UAS1) 20 2. mellem position -225 og -263 (UAS2) 3. mellem position -87 og -125 (TATA box) DNA-fragmenterne indeholdende UA$1 eller UAS2 eller UAS1 og UAS2 fra PH05 kan fremstilles ud fra rekombinant fag M13mp9/PH05 Bam-Sal (se ovenfor) ved spaltning med 25 passende restriktionsendonucleaser. UAS1 er indeholdt i et 268 bp BamHI-Clal-fragment med formlen GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTT ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAG GTAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGT TTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAA TTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT,

I DK 175492 B1 I

I 88 I

UAS2 er indeholdt i et 100 bp Clal-BstEII-fragment med I

I formlen I

I CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTTATGATTCTGGTCCC I

I TGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG I

I og både UAS1 og UAS2 findes i 368 bp GamHI-BstEIl-fragmen- I

I 5 tet med formlen I

I GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTT I

I ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGG I

I TAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGT I

I TTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATT I

I GAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAG I

I ACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG. I

I Eksempel 24. I

I Ekspression af desulfatohirudin under konstrol af en I

I fusioneret PH05 - GAPDH-hybridpromotor I

Resultaterne i eksempel 23 gør området omkring position I

10 -365 [UAS1(PH05)] og et andet område omkring position -180 I

[UAS2(PH05) ] i PH05-genet til mulige kandidater for UAS I

med regulerende funktioner. UAS1(PH05) er indeholdt i et I

268 bp BamHI-Clal-fragment, hvorimod både UAS1(PH05) og I

UAS2(PH05) er indeholdt i et 368 bp BamHI-BstEII-fragment. I

15 Disse to fragmenter fusioneres hver for sig til to I

forskellige GAPDH "downstream"-promotorelementer, som I

indbefatter TATA boxen og transkriptionsstartsteder for I

GAPDH. I

a) Konstruktion af et gsrgenbibliotek I

20 30 μς gær-DNA med total høj molekylvægt [M.V. Olsen et I

al., J.Mol.Biol. 132, 387 (1979)] fra vildtype I

89 DK 175492 B1

Saccharomyces cerevisiae-stamme S288C inkuberes i 30 minutter ved 37*C med 2 enhedser EcoRI-methylase (New England Biolabs) i 250 μΐ EcoRI-methyleringspuffer som 5 anbefalet af leverandøren. DNA fældes med ethanol, resuspenderes i 500 μΐ 25 mM Tris*HCl pH 8,5, 2 mM MgCl2 (EcoRI*puffer) CH. Meyer, FEBS lett. 90^ 341 (1979)] og spaltes med EcoRI (Boehringer), indtil størrelsesfordelingen af DNA-fragmenterne har et maksimum i området 10 30-50 kb (en Xhol-spaltning af XDNA giver passende 33 kb

og 17 kb markører. Gær-DNA'et spaltet under EcoRI*betingelser fraktioneres med hensyn til størrelse på e saccharosegradient (5-20% saccharose i 10 mM Tris*HCi pH

7,5, 1 mM EDTA) i 6 timer ved 38.000 omdrejninger pr.

15 minut i en SW40-rotor. Tredive fraktioner på hver 0,4 ml udtages fra toppen af gradienten. Fraktion 16 indeholder DNA-fragmenter med en størrelse på 30-40 kb. DNA’et i denne fraktion (3 Mg) fældes med ethanol og ligeres i 16 timer ved 15eC i et samlet rumfang på 15 μΐ til 1 /*g 20 cosmidvektor pYcl [B. Hohn et al. i "Genetic Engineering", bind 2, side 169, New York 1980] lineariseres med EcoRI. Ligeringen gennemføres med 300 enheder T4 DNA-ligase (New England Biolabs) under anvendelse af puffersystemet beskrevet af leverandøren. DNA’et indføres in vitro i 25 bakteriofag λ [B.Hohn i "Methods in Enzymology", bind 68, side 299, New York 1979 ], og de samlede fager anvendes til at transducere Escherichia coli-stamme HB101 (rj|, mj|, leu®, pro®, recA). Effektiviteten af transduceringen er ca. 5000 ampicillin-resistente kolonier pr. Mg 30 pYcl-vektor. 3000 ampR-kolonier udtages og dyrkes hver for sig i hullerne i en mikrotiterplade i LB-medium [ 10 g Bacto-trypton (Difco), 5g Bacto-gærekstrakt (Difco), 10 g NaCl ] indeholdende 100 M9/ml ampicillin.

b) Isolering af gær-GAPDH-qenet 35 det ovenfor beskrevne genbibliotek screenes med et synte-

I DK 175492 B1 I

I 90 I

I tisk oligonucleotid [fremstillet under anvendelse af I

I phosphotriestermetoden: K. Itakura et al., J.Am.Chem.Soc. I

I 97, 7327 (1975, J.F.M. de Rooij et al., Reel. Trav. Chim. I

I 5 Pays-Bas 98, 537 (1971)] med følgende struktur: I

I 5'-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3'. 10 μg af oligonucleotidet I

I kinasebehandles under anvendelse af 10 /ti γ-^ρ-^ΤΡ (3000 I

I Ci/mmol, 10 vCi/μΐ Amerham) med T4 polynucleotidkinase I

I (Boehringer) i et samlet rumfang på 50 μΐ som beskrevet af I

I 10 Maniatis et al. ["Molecular Cloning", Cold spring Harbor I

I Lab., 1982, side 125]. Der foretages kolonihybridisering I

I som beskrevet af den samme forfatter (side 312). Positive I

I kloner påvises ved hjælp at auroradiografi under I

I anvendelse af Kodak X-5-røntgenfilm. Plasmid-DNA-isolering I

I 15 giver en hybridklon, som indeholder et 2100 bp I

I HindllI-fragment, der koder ofr GAPDH [J.P. Holland et I

I al., J.Biol.Chem. 254, 9839 (1979)]. Det endelige bevis I

I for ægtheden af det klonede DNA opnås ved I

I DNA-sekvenseringsforsøg under anvendelse af ovennævnte I

I 20 oligonucleotid i kombination med dideoxysekven- I

I seringsmetoden beskrevet af G.F. Hong [Bioscience Reports I

I 1, 243 (1981)] for dobbeltstrenget DNA. Det klonede I

I GAPDH-gen (se fig. 9) har samme sekvens som pgap491 I

I publiceret af Holland et al. [J. Biol. Chem. 255, 2596 I

I 25 (1980)]. I

I c) Fremstilling af GAPDH "downstream"-promotorelementer I

I (se fig. 10) I

I 649 bp Tagl-fragmentet, som indeholder position -27 til I

I -675 fra ATG'et i GAPDH-genet (se fiog. 9) isoleres ved I

I 30 spaltning af ovennævnte hybridplasmid med Tagl (New I

I England Biolabs), adskillelse af DNA-fragmenterne på en I

I 1,2% blød agarosegel og ekstraktion af DNA'et med varm I

I phenol (se eksempel 23). Kloning af Tagl-fragmentet I

I foretages i i Clal-stedet i pBR322: 1 μg pBR322 spaltes I

I 35 med tre enheder Clal (New England Biolabs) som beskrevet 91 DK 175492 B1 af leverandøren. 300 ng af den phenolbehandlede og skårne vektor ligeres til ca. 300 ng insert-DNA (649 bp Taq-fragment) under anvendelse 200 enheder T4 DNA-ligase i 5 et samlet rumfang på 20 μΐ (se eksempel 23b). Transformationen foretages til Escherichia coli HB101 for ampicillinresistens, og der fremstilles plasmid-DNA og analyseres ved restriktionsanalyse [Taql, Dr al ].

Orienteringen af Taql-fragmentet foretages under 10 anvendelse af restriktionsendonuclease Dral i kombination med BamHI-stedet i piasmiderne, og der vælges et plasmid, som har Taql-stedet i position -675 tæt ved HindiII-stedet i pBR322. Dette plasmid med betegnelsen pBR322/GAPDH lineariseres underanvendelse BamHI (New England Biolabs), 15 og der foretages en spaltning med Bal31 som beskrevet i eksempel 23, idet der dog anvendes Bglll-linkere (5'-CAGATCTG-3, New England Biolabs), og det spaltede plasmid bringes direkte på cirkelform ved en koncentration på 5 μg/ml i et samlet rumfang på 20 μΐ. Størrelsen af det 20 med Bal31 afkortede Taql-fragment bestemmes ved restriktionsanalyse (under anvendelse Bglll og Hindlll).

Der udvælges to kloner, som indeholder DNA-fragmenter, der strækker sig henholdsvis ca. 200 bp og 265 bp fra ATG'et "upstream" til GAPDH-promotoren. Begge fragmenter 25 indeholder den formodede TATA box ved ca. -140 bp. Disse kloner indeholder stadig replikationsområdet i den pBR322-afledte del af DNA'et og betegnes henholdsvis pGAPDH-F og pGAPDH-E.

d) Kombination af "downstream” GAPDH-promotorelementet med 30 UAS1 (PH05) for PH05 og proteinkodningsområdet for de-sulfatohirudin I) GAPDH-elementet

For at forlænge GAPDH-promotorelementet fra Taql-stedet ved position -27 til en position umiddelbart nær ved

92 | I

ATG'et i GAPDH-genet fremstilles to syntetiske I

komplementære oligonucleotider med følgende struktur: I

DK 175492 B1 I

5' CGAATAAACACACATAAATAAAG 3' I

3' TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTAA 5' I

Disse oligonucleotider tilvejebringer en ægte I

5 GAPDH-promotorsekvens fra position -26 til position -5 med , I

dannelsen af et terminalt EcoRI-sted. 2 μ$ af de to I

Bal31-isolater fra eksempel 25c) (plasmider pGAPDH-E og I

-F) spaltes med 6 enheder Tagl i 50 μΐ, og den fremkomne I

blanding phenolbehandles, fældes med ethanol, og det I

10 fældede produkt resuspenderes i 10 /il vand. De syntetiske I

oligonucleotider anelleres ved blanding af 2 μΐ af hver I

enkeltstreng i 100 μΐ af en opløsning indeholdende 10 mM I

Tris’HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, opvarmning i 3 I

minutter til 90°C og langsom afkøling af opløsningen til I

15 stuetemperatur (i løbet af ca. 3 timer). 1 μg af hver af de Taql-spaltede plasmider blandes med ca. et tyvedobbelt molært overskud af de anellerede oligonucleotider i et

rumfang på 20 μΐ i ca. 18 timer under anvendelse af ca. I

800 enheder T4 DNA-ligase. Hele blandingen spaltes med 3 j I

20 enheder Bglll (New England Biolabs), og DNA-fragmenterne j I

adskilles på en 1,5%'s blød agarosegel. ! I

Bglll-EcoRI-fragmenterne på henholdsvis ca. 200 bp og ca. ' I

265 bp udskæres af gelen, ekstraheres og fældes med I

ethanol. I 1 2 3 4 5 6

Plasmid pGAPDH-E spaltes med Bglll og EcoRI, og det store H

2

fragment (ca. 3,5 kb) isoleres. Dette fragment anvendes I

3

som vektor til at klone 265 bp og 200 bp Bglll-EcoRI- I

4

fragmenterne under anvendelse af de ovenfor beskrevne I

5

ligerings-, transformering- og plasmidisoleringsbetin- I

6

gelser. De dannede plasmider betegnes pGAPDH-EL og I

pGAPDH-FL. DNA-sekvenserne i Bglll-EcoRI-fragmenterne I

93 DK 175492 B1 klonet i plasmider pGAPDH-EL og pGAPDH-FL er vist i fig.

11. Fragmenternes nøjagtige størrelse er henholdsvis 266 bp og 201 bp.

5 II) Det UAS1 (PH05)-regulatoriske element 3 μg plasmid p31/Y (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 100.561) spaltes med 6 enheder Clal (New England Biolabs). De skrå 3'-ender udfyldes under anvendelse af Klenow-fragmentet af Escherichia coli 10 DNA-polymerasé I (Bethesda Research Laboratories) i overensstemmelse med Maniatis (se ovenfor). Bglll-linkere (5*-CAGATCTG-3') tilsættes som beskrevet i eksempel 23.

DNA'et spaltes med Sall og Bglll (New England Biolabs), og blandingen fraktioneres på en 1%'s blød agarosedel. 540 15 bp-fragmentet udskæres af gelen, behandles med phenol og fældes med ethanol som beskrevet ovenfor.

III) DNA'et, som koder for desulfatohirudln

Konstruktion af plasmid pJDB207/PH05(Eco)-HIR (se fig.

12).

20 Til hensigtsmæssig samling af UAS(PH05)-GAPDH-hybridpro-motorel ententerne md kodningsområdet i desulfatohirudin inklusive PH05-signalsekvensen (som i plasmid pJDB207/PH05-HIR indføres et EcoRI-restriktionssted i det 5'-ikke-translaterede område mellem mRNA-startstederne og 25 ATG'et i kodningsområdet. 1 μg plasmid pJDB207/PH05-HIR (sé eksempel 16d) spaltes med restriktionsendonuclease Dral (Boehringer). De dannede fire fragmenter adskilles på en 0,8%'s agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 4,2 kp DNA-fragmentet 30 isoleres fra gelen, elektroelueres og fældes med ethanol.

I DK 175492 B1

I 94 I

I DNA'et resuspenderes i vand i en koncentration på 0,6 I

I mg/ml. I

I To syntetiske oligonucleotider med formlerne I

I 5 5 *-AATTCGATTACCAATGTTT-3 * I

3'- GCTAATGGTTACAAA-5' - I

I (henholdsvis 2,3 jig og 2,9 /ig) kinasebehandles hver for . I

I sig i 20 μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 0,5 I

M mM ATP og 20 enheder T4-polynucleotidkinase (Boehringer). I

I 10 Efter 45 minutter ved 37*C hældes de to I

I reaktionsblandinger sammen, blandingen opvarmes i 10 I

M minutter til 75eC, hvorpå den henstår til afkøling til I

I stuetemperatur. Den anellerede oligonucleotidlinker I

I opbevares ved -20eC. I

I 15 6,5 pg (2,3 pmol) af 4,2 kb Dral DNA-fragmentet inkuberes I

I i 16 timer ved 15eC ved et 70-dobbelt overskud af den I

I kinasebehandlede og anellerede oligonucleotidlinker i 50 I

I fil 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 3,5 mM ATP og I

I BOO enheder T4-DNA-ligase (Biolabs). Efter inaktivering af I

I 20 T4-DNA-ligasen i 10 minutter ved 85°C fjernes overskud af I

I linkere ved fældning af DNA'et i nærværelse af 10 mM EDTA, I

I 300 mM natriumacetat pH 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol. I

I DNA'et spaltes med EcoHl og Hindlll. De dannede fragmenter I

I adskilles på en 1%'s agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer I

I 25 pH 8,3. 643 bp-fragmentet udvindes fra gelen ved elektro- I

I eluering og fældning med ethanol. DNA'et resuspenderes i I

I en koncentration på 0,1 pmol/μΐ. EcoRI-Hindlll-fragmentet I

I indeholder PH05-signalsekvensen, kodningssekvensen for I

I desulfatohirudin og PH05-transkriptionsterminatoren. I

I 30 534 bp-PH05-promotorfragmentet isoleres fra plasmid p31/R I

I (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. I

I 100.561). I

95 DK 175492 B1 10 μg p31/R spaltes med restriktionsendonucleaser EcoRI og BamHI. De dannede tre fragmenter adskilles på en 0,6%'s lavtsmeltende agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3.

5 Et 534 bp BamHI-EcoRI-fragment isoleres, og det indeholder PH05-promotoren inklusive mRNA-startstederne.

Vektorfragmentet isoleres fra plasmid pJDB207/PHO5-HIR (se eksempel 16s). 6 μg af dette plasmid spaltes med BamHI og Hindlll. Det store 6,5 kb BamHI-HindiII-fragment adskilles 10 fra det lille fragment på en 0,6%’s lavtsmeltende agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3.

Tre DNA-fragmenter beskrevet ovenfor med de egnede klæbrige ender ligeres ved følgende reaktion: 0,2 pmol (70 ng) af 534 bp BamHI-EcoRI PH05-promotorfragmetet, 0,2 pmol 15 (85 ng) af 643 bp EcoRI-Hindlll-fragmentet (hirudinkod- ningssekvens) og 0,1 pmol (0,4 μg) af 6,5 kbBamHI-

Hindlll-vektorfragmentet ligeres i 10 μΐ 60 mM Tris pH

7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheder T4-DNA-ligase i 6 timer ved 15eC. En alikvot 20 af ligeringsblandingen på 1 μΐ sættes til 100 μΐ calciumbehandlede transformationskompetente Escherichia coli HBlOl-celler.

12 transformerede ampR-kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin. Pladmid-DNA 25 fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåde ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, (1981) 193] og analyseres ved restriktionsspaltninger med EcoRI og BamHI.

En klon med de forventede restriktionsfragmenter isoleres og betegnes pJDB207/PH05(Eco)-HIR.

30 IV) Liqering af UAS1(PH05)-GAPDH-hybridpromotorerne til proteinkodningsområdet for desulfatohirudln 1 μg plasmid pJDB207(PH05(Eco)-HIR (se eksempel 24 dill)

DK 175492 B1 I

96 I

spaltes med EcoRI og Hindlll. DNA-fragmenterne adskilles I

på en l$'s agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 643 I

bp-fragmentet isoleres fra gelen, hvorpå det I

5 elektroelueres og fældes med ethanol. DNA'et resuspenderes I

i vand ved en koncentration på 0,1 pmol/μΐ. I

6 μg plasmid pJDB207/PH05-HIR spaltes fuldstændigt med I

restriktionsendonucleaser HindiII og Sall. Det store 6,3 I

kb-fragment (vektordel) isoleres ved elektroforese på en I

10 blød agarosegel, phenolekstraktion og fældning med ethanol. I

Vektor-DNA-fragmentet resuspenderes i vand til en I

koncentration på 0,05 pmol/μΐ. I

10 μg plasmid pGAPDH-EL (se eksempel 24dl) spaltes med I

Bglll og EcoRI. 266 bg Bgllll-EcoRI-fragmentet isoleres på I

15 en 1,2%'s agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3, I

hvorpå det elektroelueres fra gelen og fældes med ethanol. I

DNA'et resuspenderes i vand til en koncentration på 0,3 I

pmol/μΐ. I

0,3 pmol 548 bp Salll-BgIII-fragmentet indeholdende I

20 UAS1 (PH05) (eksempel 24dII), 0,3 pmol af 266 bp I

Bgl 11-EcoRI-fragmentet af pGAPDH-EL, 0,3 pmol af 643 bp I

EcoRI-Hindlll-fragmentet af pJDB207/PH05(Eco)-HIR og 0,12 I

pmol af 6,3 kb SalI-HindlII-vektorfragmentet ligeres i 20 I

μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og I

25 400 eheder T4-DNA-ligase (Biolabs) i. 6 timer ved 15°C. I

Alikvoter på 1 μΐ og 3 μΐ af ligeringsblandingen sættes I

til 10 μΐ calciumbehandlede Escherichia coli HBlOl-celler. I

Plasmidisoleringen fra ampR-kolonier og restriktion- I

sanalyse md Sall, Bglll, EcoRI og Hindlll gennemføres som I

30 beskrevet ovenfor (se eksempel 24dIII). Der udvælges en I

positiv klon, som betegnes pJDB207/PAPFL-HIR(UASl). I

Der foretages en analog konstruktion med 201 bp Bglll- I

EcoRI-fragmentet isoleres fra pGAPDH-FL. Et udvalgt I

plasmid betegnes pJDB207/PAPFL-HIR5UASl). I

97 DK 175492 B1 V) Digering af UAS1 (PHQ5)-UAS2(PH05)-GAPDH-hybridpromo-toerne til proteinkodnlngsområdet for desulfato-hirudin (se fiq. 13) 5 3 ug af hver af plasmiderne pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) og pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) spaltes med Bglll. Efter ekstraktion med phenol og fældning med ethanol udfyldes de 3'-forskudte ender af DNA'et ved en reaktion med Escherichia coli-DNA-polymerase (Klenow-fragment, Bethesda 10 Research Laboratories) i overensstemmelse roed fremgangsmåde ifølge Maniatis et al. (se ovenfor). Enzymet inaktiveres ved 70eC i 10 minutter. DNA'erne spaltes yderligere med Sall, og de store 7,2 kb-fragmenter isoleres ved elektroforese på en blød agarosegel, 15 ekstraktion med phenol og fældning med ethanol. De enkelte fragmenter resuspenderes i H2O ved en koncentration på 0,05 pmol/øl. Fragmenterne indeholder hirudinkodnings-området, størsteparten af vektor sekvenserne og det ene af de to forskellige GAPDH-promotorelementer isoleret fra 20 pGAPDH-EL eller pGAPDH-FL.

Plasmid p31/Y (se beskrivelsen til europæisk patentansøgning nr. 100.561) spaltes med BstEII, inkuberes med Escherichia coli-DNA-polymerase (Klenow-fragment) som beskrevet ovenfor og spaltes med Sall. 649 bp-fragmentet 25 isoleres på en blød agarosegel og udvindes ved phenolekstraktion og fældning med ethanol.

0,3 pmol af 549 bp-fragmentet af p31/Y indeholdende UASl-UAS2(PH05-promotorelementet og 0,15 pmol af det ene af de to 7,2 kb-fragmenter ligeres og transformeres til 30 Escherichia coli HB101 som beskrevet ovenfor. Der fremstilles plasmider ud fra aropR-kolonier, som analyseres ved restriktionsspaltninger. Enkeltkloner udtages, og deres plasmid-DNA'er betegnes

DK 175492 B1 I

H

98 I

pJDB207/PAPEL-HIR(UASl + UAS2) og I

pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2). ; I

i I

Eksempel 25 I

5 GAPDH-promotorelementer fusioneret til proteinkodnings- I

sekvensen for desulfatohlrudin I

To GAPDH-promotorelementer af forskellig længde (som ι I

beskrevet i eksempel 24d I) ligeres til proteinkod- I

ningsområdet fr desulfatohlrudin indeholdende I

10 PH05-signalsekvensen. I

De to elementer (henholdsvis 266 bp og 201 bp) indeholder I

GAPDH TATA-boxen, mRNA-startstederne og et AT-rigt 5'-ikke I

translateret område. Nucleotidsekvensen for begge I

elementer er vist i fig. 10. I

15 3' -enderne af elementerne er begge ved position -5 fra

ATG'et for GAPDH-genet efterfulgt af et I

EcoRI-genkendelsessted (se oligonucleotidlinker indført i I

eksempel 24d I), og 5'-enderne er ved henholdsvis position I

-198 og -263 fra ATG'et med Bglll-linkere tilsat ved disse I

20 positioner. I

BglII-EcoRI-promotorfragmenterne ligeres til et I

EcoRI-Hindlll-fragment med sekvenser, som koder for I

PH05-signalsekvensen og desulfatohirudin og til et I

Hindlll-BamHI-vektorfragment. ! I

99 DK 175492 B1 på 0,05 pmol/jil.

0,3 pmol af 266 bp Bglll-EcoRI-fragmentet af pGAPDH-EL (eksempel 24d IV), 0,3 pmol af 643 bp EcoRI-Hindlll-5 fragmentet af pJDB207/PH05(Eco)-HIR (eksempel 24d III) og 0,1 pmol af 6,5 kb HindiII-BamHI-vektorfragmentet ligeres i 10 μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheder T4-DNA-ligase (Biolabs) i 6 timer ved 15eC.

1 μΐ af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ 10 calciumbehandlede Escherichia coli HB101-celler. Plasmidisolering fra ampR-kolonier og restriktionsanalyse med EcoRI gennemføres som beskrevet i eksempel 24d III.

Der udvælges en positiv klon. Dens plasmid-DNA betegnes PJDB207/GAPEL-HIR.

15 Der foretages en analog konstruktion med 201 bp Bgllll-EcoRI-fragmentet isoleret fra pGAPDH-FL. Plasmid-DNA'et fra en udvalgt klon betegnes pJDB207/GAPFL-HIR.

Eksempel 26.

Konstruktion af ekspressionspiasmider med tandeninserter 20 af kodningssekvensen for udskilt desulfatohirudin (se fig.

14)

De følgende konstruktioner indeholder et DNA-fragment duplikeret i et tandem-hoved-til-hale-arrangement. Det duplikerede fragment indeholder GAPDH-promotoren eller en 25 hybrid PH05-GAPDH-promotor (som beskrevet i henholdsvis eksempel 2 og 25), PH05-signalsekvensen, kodningssekvensen for desulfatohirudin og PH05-transkriptionsterminatoren.

7 /tg plasmid pJDB207/GAPEL-HIR spaltes med restriktions-endonuclease HindiII. De skrå 3'-ender udfyldes ved en 30 reaktion med Escherichia coli-DNA-polymerase I (Klenow-

I DK 175492 B1 I

I 100 I

I fragment, Bethesda Research Labnoratory) i I

I overensstemmelse med fremgangsmåden Ifølge Maniatis (se I

I ovenfor). 1,85 /tg Sall-linker 5' -GGTCGACC-3' (biolabs) I

I 5 kinasebehandles i 50 ml 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 I

I mM DTT, 0,5 mM ATP og 50 enheder T4 polynucleotid-kinase I

I (Boehringer). efter 45 minutter ved 3®C opvarmes I

I blandingen i 10 minutter ved 75eC, hvorefter den henstår I

I til stuetemperatur. 7 μg (1,5 pmol) lineariseret plasmid I

I 10 pJDB pJDB207/GAPEL-HIR med Hindlll-stedeme omdannet til I

I korte ender (se ovenfor) inkuberes i 16 timer ved 15°C med I

I et 80-dobbelt overskud af kinasebehandlede og aneilerede I

I Sal-linkere i 30/tl 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM I

I DTT, 3,5 mM ATP og 800 enheder T4-DNA-ligase (Biolabs). I

I 15 Efter inaktivering af T4-DNA-ligasen ved 75eC i 10 I

I minutter fjernes overskud af linkerne ved fældning af I

I DNA'et i nærværelse af 10 mM EDTA, 300 mM natriumacetat pH I

I 6,0 og 0,54 rumfang isopropanol. DNA'et spaltes med Sall. I

I De dannede fragmenter adskilles på en 1%'s agarosegel i I

I 20 tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. 1,1 kb Sall-fragmentet I

I udvindes fra gelen ved elektroeluering, ekstraktion med I

I phenol og fældning med ethanol. DNA'et resuspenderes til I

I en koncentration på 0,1 pmol/μΐ. I

I 5 /tg plasmid pJDB207/GAPEL-HIR spaltes fuldstændigt med I

I 25 Sall. Efter ekstraktion med phenol og fældning med ethanol I

I resuspenderes DNA’et i 100 /ti 50 mM Tris pH 8,0. Der I

tilsættes 4,6 enheder alkalisk kalvemavephosphatase I

(Boehringer). Efter 1 time ved 37eC inaktiveres I

phosphatasen i nærværelse af 100 mM NaCl, 5 mM EDTA og I

30 0,5% SDS i 15 minutter ved 68°C. DNA-opløsningen sættes I

til et 100 /il lag "DE52" (Whatman) anionbytter I

ækvilibreret med 10 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl og 1 mM I

EDTA. Efter vaskning af søjlen med den samme puffer I

elueres DNA'et med 400 /ti 1,5 M NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 1 I

35 mM EDTA, hvorpå det fældes med ethanol. Lineariseret I

101 DK 175492 B1 plasmid isoleres fra ikke-spaltet DNA på en 0,6%'s agarosegel i tris-acetat-puffer. Det lineære 7,3 kb DNA-fragment udtages fra gelen, elektroelueres, 5 ekstraheres med phenol og fældes med ethanol, hvorpå det resuspenderes til en koncentration på 0,1 pmol/jtl.

0,2 pmol af 1,1 kb Sall-fragmentet og 0,1 pmol af den lineariserede vektor ligeres i 10 μΐ 60 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 200 enheder T4 DNA-ligase 10 i 16 timer ved 15eC. En alikvot på 1 μΐ af ligeringsblandingen sættes til 100 μΐ calciumbehandlede, transformationskompetente Escherichia coli HBlOl-celler.

24 transformerede ampR-kolonier dyrkes hver for sig i LB-medium indeholdende 100 /tg/ml ampicillin. Plasmid-DNA 15 fremstilles i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Holmes et al. [Anal. Biochem. 114, (1981) 193] og analyseres ved hjælp af EcoRI-restriktionsspaltning. en klon med de forventede restriktionsfragmenter isoleres og betegnes pJDB207/[GAPEL-HIR ]D.

20 Analoge konstruktioner gennemføres med piasmiderne pJDB207/GAPFL-HIR og pJDB207/PAPFL/HIR(UASl + UAS2). Det dannede plasmid-DNA fra hver af de udvalgte kloner betegnes pJDB207/[ GAPFL-HIR]D og pJDB207/[ PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2 ]D.

25 Eksempel 27.

Konstruktion af et ekspressionsplasmid med fire inserter af den kodende sekvens af udskilt desulfatohirudin

Fire kopier af et DNA-fragment indeholdende en GAPDH-promotor, PH05-signalsekvensen, kodningssekvensen 30 for desulfatohirudin og PH05-transkriptionsterminatoren indsættes i gærekspressionsvektoren i et tandem-hoved-

I DK 175492 B1 ! I

I 102 ; I

I mod-hale-arrangement. I

I 10 μg plasmid pJDB207[ GAPFL-HIR p (se eksempel 26) spaltes I

I med Sall. De klæbrige ender i det dannede lineære fragment I

I 5 udfyldes ved en reaktion med Escherichia coli-DNA- I

I polymerase I (Klenow-fragment, BRL) i overensstemmelse med I

I femgangsmåde ifølge Maniatis et al. (se ovenfor). 0,94/ig I

I HindiII-linker [5'-CAAGCTTG-3', Biolabs] behandles med I

I kinase, selvanelleres og ligeres til det lineariserede I

I 10 plasmid pJDB207/[ GAPFL-HIR p med Sall-stederne omdannet I

I til korte ender (se ovenfor. Linkerligering og I

I isopropanolfældning fretages som beskrevet i eksempel 26. I

I Derefter spaltes DNA’et med Hindlll, og det dannede 2,2 I

kb-fragment isoleres ved elektroeluering, phenol- I

I 15 ekstraktion og ethanolfældning. DNA'et resuspenderes til I

I en koncentration på 0,1 pmol/μΐ. I

I 5 fig plasmid pJDB207/[ GAPFL-HIR p spaltes fuldstændigt med I

I Hindlll. DNA'et dephosphoryleres med alkalisk I

I kalvemavephosphatase (Boehringer), renses ved I

I 20 ionkromatografi på "DE52n og isoleres fra en 0,6%'s I

I agarosegel ved elektroeluering under anvendelse af den i I

I eksempel 26 beskrevne fremgangsmåde. I

I 0,2 pmol af 2,2 kb Hindlll-fragmentet og 0,1 pmol af den I

I lineariserede vektor ligeres (se ovenfor). En alikvot af I

I 25 ligeringsblandingen på 1 μΐ sættes til 100 μΐ I

I calciumbehandlede, transormationskompetente Escherichia I

I coli HBlOl-celler. I

I 12 transformerede, ampR-kolonier dyrkes hver for sig i I

I LB-medium indeholdende 100 μg/ml ampicillin. Plasraid-DNA I

I 30 fremstilles og analyseres ved dobbeltspaltninger med Sall, I

I Xbal og Aval, Xbal og ved spaltning med BamHI. Et 1,1 kb I

I BamHI-bindingsfragment indicerer, at inserten foreligger i I

I et hoved-mod-hale-arrangement med hensyn til de to ko- I

103 DK 175492 B1 pier, som allerede findes på plasmidet. en klon med denne orientering af insertet betegnes pJDB207/[ GAPFL-HIR ]T.

Eksempel 28.

5 Konstruktion af en gaerekspressionsvektor indeholdende PHO5-promotoren, invertaseslgnalsekvensen og desulfato-hirudinkodningsomr&det A) Fremstilling af oligodeoxyrlbonucleotider til inver-tasesignalsekvens 10 fireoligodeoxyribonucleotider: 1-1, I“2, 1-3 og 1-4 syntetiseres ved hjælp af et DNA-syntetiseringsapparatur (model 380B Applied Biosystems). Efter deblokering renses de syntetiske fragmenter på en 12%'s polyacrylamidgel indeholdende 8 M urinstof. Saltfri rene oligodeoxyribo-15 nueleotider udvindes under anvendelse af Sep. Pak (Waters Associates). Disse fragmenter udgør en dobbeltstreng, som koder for invertasesignalsekvensen med de ofte anvendte gærcodoner.

Hindlll

EcoRI MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 5' AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3' 1-2 3 ' GTACGAAAACGTTCGAAAGGAAAAGGAAAACCGAC 5'

AlaGlyPheAlaAlaLysIleSerAla 1-3 5 ' GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3* 1-4 3 ' CAAAACGTCGGTTTTATAGACGTAGAATCGCAGAGCT 5'

Hg a I_

Xhol

I DK 175492 B1 I

I 104 I

B) underkloning af invertasesignalsekvensen I

a) Fremstilling af vektor I

1,5 jig p31R/SS-TPAA2 (se beskrivelsen til europæisk I

I 5 patentansøgning nr. 143.081) spaltes med 10 enheder EcoRl I

I (Boehringer) i 50 μΐ 10 mM Tris*HCl pH 7,5, 6 mM MgCl2, I

I 100 mM NaCl, 6 mM mercaptoethanol i 1 time ved 37eC. Efter I

I tilsætning af 1 jil 2,5 H NaCl, tilsættes 10 enheder Xhol I

I (Boehringer), og der inkuberes ved 37*C 1 1 time. 4,2 I

I 10 kb-vektor isoleres på en 0,8%’s præparativ agarosegel. I

I Gelskiven oerføres til et "Micro Colloidor"-rør (Sartorius I

I GmbH), dækkes med 200 μΐ TE og elektroelueres I

I (elektroforese ved 90 mA i 50 minutter). TE-opløsningen I

opsamles, og der fældes i 2m5 rumfang absolut ethanol I

I 15 efter tilsætning af 0,1 rumfang 10 x TNE. DNA-kuglen I

I vaskes med kold 80%’s ethanol og tørres i vakuum. DNA’et I

I resuspenderes i 6 /il TE (40 pmol/μΐ). I

I b) Anellering af oligodeoxynucleotider (1-1, 1-2, 1-3, I

I 1-4), kinasebehandling og ligering med vektor I

I .. 20 En opløsning indeholdende 10 pmol af hver af de fire I

I deoxynucleotider i 10 μΐ 0,5 M Tris*HCl pH 8 inkuberes ved I

I 95°C i 5 minutter på et vandbad. Vandbadet afkøles I

I langsomt til 30°C i løbet af 5 timer. Til den anellerede I

I blanding sættes 2 μΐ af hvert af 0,1 M MgCl2, 0,1 M NaCl, I

25 30 mM DTT, 4 mM ATP og 8 enheder (1 μΐ) polynucleotid- I

kinase (Boehringer). Kinasebehandlingen gennemføres ved I

I 37eC i 1 time. De anellerede, kinasebehandlede oligodeoxy- I

I ribonucleotider og 60 pmol af den med EcoRl-Xhol-skårne I

I vektor (1,5 μΐ) ligeres med 400 enheder (1 /il) T4 I

I 30 DNA-ligase (Biolabs) ved 14eC i 17 timer. Reaktionen I

I afbrydes ved inkubering ved 65eC i 10 minutter. 10 μΐ af I

I denne ligeringsblanding anvendes til transformering af I

I Escherichia coli HB101 Ca++-celler [M. Dagert og S.D. I

105 DK 175492 B1

Ehrlich, Gene 56, ]. 20 ainpR-kolonier udtages. DNA

fremstilles under anvendelse af den såkaldte "quick isolation procedure" [D.S. <Holmes og M. Quigley, Anal.

5 Biochem. 114, 193-197 (1981)]. DNA spaltes med EcoRI og

Hhol, mærkes radioaktivt ved EcoRI-enden og analyseres på en 6%'s polyacrylamidgel indeholdende 8 M urinstof under anvendelse af readioaktivt mærket pBR322 Haelll-skåret DNA som markør. Bånd med den korrekte størrelse iagttages for 10 DNA udvundet fra alle de tyve kloner. En klon dyrkes i 100 ml LB-medium indeholdende 100 /ig/ml ampicillin. Plasmid-DNA isoleres og betegnes p31RIT-12.

C) Samling af GAPFL-promotorelementet med invertasesignal-sekvensen 15 5 μg plasmid-p31RIT-12 spaltes fuldstændigt med Sall og

EcoRI. Det store 3,3 kb Sall-EcoRI-fragment isoleres på en 0,6%'s agarosegel i tris-acetat-puffer pH 8,2. DNA'et elektroelueres fra gelen, phenolekstraheres og fældes med ethanol. 10 μg plasmid-pJDB207/GAPFL-HIR (se eksempel 25) 20 spaltes med Sall og EcoRI. 477 bp Sall-EcoRI-fragmentet isoleres på en 0,8%’s agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH 8,3. DNA*et elektroelueres, ekstraheres med phenol og fældes med ethanol. De to isolerede DNA-fragmenter ligeres. En alikvot af ligeringsblandingen anvenhdes til 25 at transformere kompentente Escherichia coli HB101-celler. AmpR-kolonier dyrkes, og plasmid-DNA'et analyseres ved dobbeltspaltning med Hindlll, Sall. Et plasmid med det korrekte insert betegnes p31/GAPFL-IT.

D) Konstruktion af plasmid-pJDB207/GAPFL-I-HIR (se fig.

30 15 1 vi plasmid-p31/GAPFL-IT spaltes fuldstændigt med Pstl og Sall. Dette dannede 676 bp-fragment isoleres på en

I DK 175492 B1 I

I 106 I

I 10%’s præparativ agarosegel i tris-borat-EDTA-puffer pH I

I 8,3. DNA'et elektroelueres, renses ved ionbytter- I

I kromatografi på "DE52", fældes med ethanol og I

I 5 resuspenderes i puffer anbefalet til Hgal-spaltninger i en I

I koncentration på 0,1 pg/μΐ. Sal-Pstl-DNA-fragmentet I

I splates partielt med.Hagl i nærværelse af 0,5 enheder/μg I

I DNA i 60 minutter ved 37eC. Reaktionen afbrydes ved I

I tilsætning af EDTA til en s lutkoncentration på 10 mM. 534 I

I 10 bp-Sall-Hgal-fragmentet isoleres på en 1%’s præparativ I

I agarosegel. DNA'et elektroelueres fra gelen, renses ved I

I kromatografi på ,,OE52", . fældes med ethanol og I

I resuspenderes i vand til en koncentration på 0,1 pmol/μΐ. I

I 10 ^g plasmid-pJDB207/PH05-HIR (se eksmepel 16) spaltes I

I 15 med Ball og Hindlll. Det dannede 587 bp Ball-Hindlll- I

I fragment isoleres på en præparativ 1%'s agarosegel. I

I DNA'et elektroelueres, fældes med ethanol og spaltes I

I yderligere med HinfI. I

I 1,3 /tg (160 pmol) af hvert af nedenstående oligodeoxy- I

I 20 nucleotider I

I 51-CTGCAGTTGTTTACACCGACTGCACCG-3 * I

I 31-CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTA-5' I

kinasebehandles og anelleres som beskrevet i eksempel 24d I

I 111. 0,6 μρ (1,6 pmol) af det Hinfl-spaltede I

I Ball-Hindlll-fragment (se ovenfor) og 160 pmol af den I

I kionasebehandlede og anellerede linker ligeres i 16 timer I

I 25 ved 15°C i 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl ^ 5 mM DTT, I

I 3,5 mM ATP og 400 enheder T4 DNA-ligase. Efter 10 minutter I

I ved 85 *C fjernes overskud af linkere ved I

I isopropanolfældning af DNAfet (se eksempel 24d III). 584 I

I bp Hgal-HindiII-fragmentet isoleres på en 1%’s præparativ I

I 30 agarosegel. De elektroeluerede, rensede og ethanolfældede I

107 DK 175492 B1 DNA resuspenderes i vand til en koncentration på 0,1 pmol//il.

5 μg pJDB207/PH05-HIR spaltes med Hindlll og Sall, og det 5 store 6,2 kb-fragment isoleres.

0,2 pmol af 534 bp Sall-Hgal-fragmentet,

0,2 pmol af 584 bp Hgal-Hindlll-fragmentet og 0,1 pmol af 6,2 kb Sal I-Hindi I Ivektorf ragment et ligeres i 5 timer ved 15°C i 10 /il 10 mM Tris -HC1 pH 7,5, 10 mM

10 MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP og 400 enheder T4-DNA-ligase. en alikvot på 1 μΐ af ligeringsblandingen anvendes til transformeringen af kompentente Escherichia coli HBlOl-celler.

24 transformerede ampicillinresistente kolonier dyrkes 15 hver for sig i LB-mediura indeholdende 100 /ig/ml ampicillin. Plasmid-DNA fremstilles og analyseres ved dobbeltspaltning med Hindlll, Sall. En enkelt klon med det korrekte restriktionsmønster isoleres og betegnes PJDB207/GAPFL-I-HIR. Identiteten af 20 invertasesignalsekvensen og den korrekte fusion med hirudinkodningssekvensen bekræftes ved nucleotidsekvensering.

Eksempel 29 a) Transformation af Sccharomyces cerevisiae GRF18 25 Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 (ar, his3-ll, his3-15, leu2-3, leu2-112, can1*) transformeres med piasmiderne

DK 175492 B1 I

108 I

pJDB207/PAPEL-HIR(OASl)/ I

pJDB207/PAPFL-HlR(UASl), I

pJDB207/TAPEL-HIR(UAS1 + UAS2), I

pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2), . I

pJDB207/GAPEL-HIR, I

pJDB207/GAPFL-HIR, I

pJDB207/[GAPEL-HIR]D, I

pJDB207/[GAPFL-HIR]D, I

pJDB207/[PAPFL-HIR(UASl + UAS2)]D, I

pJDB207/[GAPFL-HIR]T, I

pJDB207/GAPFL-I-HIR I

under transformationsmetoden beskrevet af Hinnen et al. I

[ Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75, 1929 (1978)]. Transformerede I

gærceller slekteres på gærminimalmedieplader, som mangler I

5 leucin. Enkelte transformerede gærkolonier isoleres og I

betegnes som følger: I

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl), I

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207//PAPFL-HlR(DASl) , I

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/PAPEL-HIR(UASl+UAS2), I

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/TAPFL-HIR(UASl+UAS2) , I

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPEL-HIR, I

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/'pJDB207/'GAPFL-HIR, I

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D, I

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/[GAPFL-HIR]D, I

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/[PAPFL-HIR(UAS1+UAS2)]D, I

Saccharomyces cerevisiae GRFl8/pJDB207/[GAPFL-HIR]T, I

Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR. I

b) Fermentering af transformanterne I

Celler af Saccharomyces cerevisiae GRF18-transformanterne I

dyrkes separat i 10 ml gærminimalmedium (Difco Yeast I

109 DK 175492 B1

Nitrogen Base uden aminosyrer tilsat 2% glucose og 20 mg/1 L-histidin) i en 50 ml-Erlenmeyer-kolbe med rystning ved 30*C i 24 timer til en tæthed på 3 x 10 7-celler/ml.

5 Gærtransformanter indeholdende plasmider med en hybrid PH05-GAPDH-promotor kræver undertrykkelse af promotoren til ekspression af desulfatohirudin. Cellerne vaskes i 0,9%'s natriumchloridopløsning og anvendes til at inokulere 50 ml af et lavt Pi-minimalmedium fremstillet i 10 overensstemmelse md recepten for Difco Yeast Nitrogen Base-mediet (uden aminosyrer), men indeholdende 0,03 g/1 10 g/1 L-asparagin i stedet for (NH4)2S04, 2% glucose og 1 g/1 L-histidin. Kulturerne inokuleres op til en celletæthed på 4 x 10^ celler/ml og omrøres ved 30®C i 15 op til 24 timer med 200 omdrejnnger pr. minut. Der opnmås sluttætheder på 1 x 10^ celler/ml.

Gærtransformanter indeholdende plasmider med GAPDH-promo-toren udtrykker i væsentlig grad desulfatohirudin. Celler dyrkes i et komplekst medium bestående af følgende 20 bestanddele, hvor mængderne anført i parentes er udtrykt i g/liter: pepton (5), gærekstrakt (10), glucose (20), saccharose (40), ammoniumsulfat (3), KH2PO4 (2), MgS04 (0,5), NaCl (0,1), CaCl2 (0,1), biotin (10 jtg/1). Der opnås ca. 1 x 10^ celler/ml efter 48 timers inkubering ved 25 30eC og 200 omdrejnnger pr. minut.

Mængderne af desulfatohirudin (bestemt ved thrombininhi-beringsanalysen) udskilt af nogle repræsentative transformerede gærstammer er anført i nedenstående tabel.

DK 175492 B1 I

110 I

Stamme Udskilt Høsttids- I

Saccharomyces cerevisiae GRF18/ hirudin punkt I

(mg/1) (timer) I

5 pJDB207/PAPFL-HIR(UASl) 7 24 I

pJDB207/PAPFL-HIR(UAS1 + UAS2) 8 24

pJDB207/GAPFJ>HIR 41 48 I

pJDB207/GAPEL-HIR 35 48 I

pJDB207/[ GAPFL-HIR ]D 39 48 I

10 pJDB207/[GAPEL-HIRp 31 48 I

Det konstateres endvidere at mindst 90% af desulfato- I

hirudinforbindelserne udtrykt af gærtransformanterne I

udskilles ti dyrkningsmediet. For at bestemme fordelingen I

af desulfatohirudin i dyrkningsvæsken og i cellernes indre I

15 som en funktion af høsttidspunktet, foretages fermentering I

i en 3 liter MBR-bioreaktor (MBR Bioreactor AG, Wetzikon, I

Switzerland). Stammen Saccharomyces cerevisiae I

GRF18/PJDB207/GAPFL-HIR til 3 liter komplekst medium (se I

ovenfor), og der inkuberes til 30eC med en omrørings- I

20 hastighed på 500 omdrejninger pr. minut og en beluftning I

på 200 1/time. Der opnås en sluttæthed på 5 x 10^ I

celler/ml. Der udtages prøver efter henholdsvis 18, 24 og I

42 timers forløb, og der foretages bestemmelse af I

desulfatohirudinindholdet i dyrkningsvæsken og i cellernes I

25 indre (efter nedbrydning, se eksempel 22) ved hjælp af I

thrombininhiberingsanalysen og ved HPLC. I

111 DK 175492 B1

Tid (h) Desulfatohirudin (mg/1)

_thrombininhibering HPLC

Kulturvæske '18 60 78 5 celleindre 18 7 <1 kulturvæske 24 70 70 celleindre 24 9 <1 kulturvæske 42 110 105 celleindre 42 9 <1 10 Eksempel 30.

Dyrkning af transformanter i 300 1-målestok a) InOkuleringsperiode en række agarskrårør inokuleres fra en dybfrossen ampul, som indeholder celler af stamme Saccharomyces cerevisiae 15 GRF18/PJDB207/GAPFL-HIR. Et eller flere agarskrårør inkuberes i 3-5 dage ved 28-30eC. Indholdet af et enkelt agarskrårør inokuleres sterilt til en enkelt 500 ml-Erlenmeyer-koble uden prelplader indeholdende 100 ml forkulturmedium. Kolberne rystes på et roterende rystebord 20 med en vandring på 50 mm og 250 omdrejninger/minut ved en inkuberingstemperatur på 28eC. Efter 48 timers forløb inokuleres 2% (r/r) af indholdet af disse kolber (1.

forkultur) sterilt til 2 liter-Erlenmeyer-kolber i i indeholdende 60 ml forkulturmdeium. Disse kolber (2.

25 forkultur) rstes i 48 timer ved 28°C på et rystebord med 120 omdrejninger /minut og et udslag på 50 mm. Indholdet af en af 2. forkulturflaskerne (2% r/r) sættes sterilt til en 50 liter rustfri stålfermenteringsbeholder indeholdende 30 lter forkulturmedium (anlægsforkultur). Fermenterings- 30 betingelserne for anlægsforkulturen er som følger: 600 omdrejninger/minut (enkelt seksbladet turbineomrører, diameter 115 mm), fire prelplader, overtryk 0,3 bar, beluftning 1 liter luft pr. liter medium pr. minut,

I DK 175492 B1 I

I 112 I

I temperatur 28eC, varighed 48 timer. I

I Agarmediet og forkulturmediet er ens bortset fra I

I tilstedeværelsen eller mangelen på agar. Det samme I

I 5 forkulturmedium anvendes til alle forkulturstadier. I

I Forkulturmediet har følgende sammensætning (g/1): I

I Gærnitrogenbase (Difco) 8,4 I

I L-asparagin*K20 11,6 I

I L-histidin 1,0 I

I 10 glucose (steriliseret I

I separat) 2,0 I

I Agarmediet har samme sammensætning som forkulturmediet I

I plus 20 g agarpr. liter. I

I b) Produktionsfermentering (300 liter-målestok) I

I 15 5% (r/r, 15 liter) af den dyrkede anlægsforkultur sættes I

I steril til en 600 liter-fermenteringsbeholder indeholdende I

I 300 liter steril fermenteringsproduktionsmedium. Fermen- I

I teringsbetingelserne for 300 liter-produktionsmediet er I

I som følger: 450 omdrejninger pr. minut (enkelt seksbladet I

I 20 omrører, diameter 230 mm), fire prelplader, overtryk 0,3 I

I bar, luftgenneledning 0-9 timer, 0,25 liter luft pr. liter I

I medium pr. minut, 9 timers høs: 1 liter luft pr. liter I

I medium pr. minut, temperatur 28°C, varighed 24-48 timer. I

I 0°600 15-20. Udbytte: 15-25 mg/l (testmetoder: HPLC og I

I 25 thrombintest). I

I Sammensætning af produktionsmediet (g/i): I

I Pepton 5 I

I gærekstrakt 10 I

I saccharose 40 I

113 DK 175492 B1 (NH4)2S04 6

MgS04*7H20 1

NaCl 0,1 5 KH2P04 2

CaCl2·2H20 0,013 pH inden sterilisering _ 6,0 antiskummiddel: UCON LB 625 efter behov.

Eksempel 31 10 Isolering af desulfatohirudin fra 300 liter-kulturvæsken

Kulturvæsken (se eksempel 30) med en pH-værdi på 3,3 afkøles til 17eC. Cellerne isoleres ved hjælp af et "SA-14" slamfjerningsappartur fra Westfalia (400-600 1/time). Det tykke slam kastes bort. Den svagt uklare 15 supernatant filtreres gennem en række "Skan"-filterpatroner (første: porebredde 5 μία, anden: porebredde 1 μια, tredje: porebredde 0,22 /im), indstilles på pH-værdien 7,5 med NaOH og sættes på en "DEAE"-anionbyttersøjle.

Søjlen vaskes med natriumacetatopløsning (20 mM, pH 4,5) 20 og elueres med natriumacetatopløsning (20 mM, pH 3,1). Opløsningen (15 liter) indstilles på pH-værdien 7,5 med NaOH og koncentreres til et slutrumfang på 1,8 liter i et cirkulerende inddampningsapparatur. Et rumfang på 1 liter sættes til en "Sephadex"® G25-søjle (søjlerumfang 8 25 liter, søjlen er ækvilibreret med vand). fraktioner indeholdende desulfatohirudin identificeres ved hjælp af HPLC. Desulfatohirudinfraktionen (2,5 liter) koncentreres på et roterende inddampningsapparatur i højvakuum til et slutrumfang på 200 ml og lyofiliseres. 1 2 g af råmaterialet opløses i 50 ml vand, opløsningen indstilles på pH 7,5 med NaOH og sættes på en "Q Sepharose"-hurtigflow-søjle (lagrumfang: 200 ml). Søjlen

I DK 175492 B1 I

I 114 I

I vaskes med ammoniumformiatopløsning (100 mM, pH 3,9). Der I

I udtages 25 ml-fraktioner, som analyseres for I

I desulfatohirudin ved hjælp af HPLC. Fraktioner I

I 5 Indeholdende desulfatohirudin (1-65) hældes sammen (125 I

I ml) og koncentreres på et rotationsinddampningsapparatur i I

I høj vakuum til et slutrumfang på 10 ml. Den koncentrerede I

I opløsning sættes på en "Sephadex"® G-25-søjle (Amicon, I

I søjlen er ækvilibreret med vand) til afsaltning. Den I

I io fremkomne klare opløsning (25 ml) lyofiliseres. Det I

I fremkomne faste stof består af rent desulfatohirudin. I

I Eksempel 32, I

I Konstruktion af plasmid pJDB207/PH05-EGL I

I Nucleotidsekvensen, som koder for eglin C, som er et I

I i5 polypeptid på 70 aminosyrer fra igler, er blevet I

I syntetiseret in vitro, underklonet og udtrykt i I

I Escherichia coli som beskrevet i beskrivelsen til I

I europæisk patentansøgning nr. 146.785. Den nøjagtige i I

I strukturfusion af eglin-kodningssekvensen til I

I 20 kodningssekvensen for PH05-signalpeptidet opnås på I

I fuldstændig samme måde som beskrevet for hirudin i I

I eksempel 15 og 16. En enkelt klon med den korrekte I

I orientering af insertet i vektoren betegnes I

I pJDB207/PH05-EGL. Saccharomyces cerevisiae-stamme GRF18 og I

I 25 transformeres på sædvanlig måde. Transformanter selekteres I

I og dyrkes som beskrevet i eksempel 29. Der kan ikke I

I påvises eglin C i kulturvæsken. I

Claims (2)

1. EcoRI spaltning I

1. Bgl II spaltning l.BstE II spaltning

2. Klenow DNA polymerase 2.Klenow DNA polymer ase

3 Sal I spaltning 3 Sal I spaltning i,.isolering af 7,2kb A.isolering af 649bp fragment fragment ' _ /Hind ΠΙ UAS1+UAS2 EcoR I f^^BamH I f From HIR\i Sol BomHI [BstEII] V ' kort ende y iBgl II] Sal I kort ende ligering transformation « ,Hind III EwR I^^^iwBamHI EcoR l H[jj\ l 7.8 kb Π _ DT \\ /T^EcoRI ^5—^NBstEII/BglIll f ^BamH I Sol I pJDB207/ PAPEL-HIR (UASHUAS2) DK 175492 B1 I jhitfl £2 KONSTRUKTION AF PLASMID pJDB207/PH05 (Eco) -HIR I _^ /HindlH I terminator ff I if 7.6kb }1 HIR η ,Γ^Ζ^==ίί^ν'θΓαΙ I p31/R Dral^N^ \ promotor BamHI pJD B207/PH05-HIR

1. Hind III spaltning 1. Sal I spaltning I

2. Klenow DNA polymerase 2. alkalisk phosphatase I

3. Sal I linker ligering 3 isolering af lineært I I 4, Sal I spaltning fragment I I 5.isolering af l,lkb I I fragment lineært plasmid DNA I I _p ssil i i I I JT^r i i I I I EcoR I BamH I Sal I I I ligering I I transformation I I I i I - Hind III r ητ I I V-^/EcoR I I “Vi mi I I EcoR 1 I I ^j^^ncoR 1 I I Sal I I I pJ0B207/[GAPEl-HIR] 0 I -ΜΠΒ113 KONSTRUKTION AF PLASMID pJDB207/PAPEL-HIR(UASl+UftS2) DK 175492 B1 /Hindi Hind III EcoR I ^^=rVBomH 1 LEU27/7.7kb HIRVl (( 1vU-BamH I FcoRI-4 SSJI I 3kb JPtcoRI 1coK 1 GAPEl/mEcoR I W P/^BstE II ompRN^|J^Bgl „

7 S ΛΒοηιΗΙ Sall BamHI SalI p3|/Y pJ0B207/PAPEL“ HIRIUAS1)

2. BamHI spaltning _ I 3.isolering af 534¾) I.Dral spaltning iBamHI spaltning I fragment 2;isolering af 2Hind III spaltning I 4,2kb fragment 3lsolering af 3.1inker ligering ^,5kb fragment ii.EcoRI spaltning I 5HindIII spaltning I promotor ^Isolering af | I -j 643bp fragment I BamHI EcoRI KindDI I ^SS n , terminator Sx Η it ^ I BamHI I ligering I HindDI I I terminator I r n t /'✓^F^^^BamHl I EcoRI 2ii η fim Λ hir i 7Gkb 1 EcoRI R SS>7 EcoRI pJ0B207/PH05IEco|-HIR I \ promotor I BamHI I DK 175492 B1 ffjgtll SEKVENSER AF BgllX-EcoRI FRAGMENTER FRA PLASMIDER pGAPDH-FL OG pGAPDH-EL INDEHOLDENDE EN DEL AF GAPDH PROMOTOREN . v a. pGAPDH-FL f>' -CATC TGCTCAAAAA AAAGGTTCAA ACCAGTTCCC TGAAATTATT CCCCTACTTG ACTAATAAGT ATATAAACAC GGTAGGTATT CATTCTAATT CTCTAAATCT ATTTCTTAAA CTTCTTAAAT TCTACTTTTA TAGTTAGTCT TTTTTTTACT TTTAAAACAC CAAGAACTTA GTTTCGAATA AACACACATA AATAAAG-3' b. pGAPDH-EL 5 *-GATCTGCGC ATGTATCTAT CTCATTTTCT TACACCTTCT ATTACCTTCT GCTCTCTCTG ATTTGGAAAA AGCTGAAAAA AAAGGTTGAA ACCACTTCCC TGAAATTATT CCCCTACTTG ACTAATAAGT ATATAAACAC CGTAGGTATT GATTCTAATT CTCTAAATCT ATTTCTTAAA CTTCTTAAAT TCTACTTTTA TAGTTAGTCT TTTTTTTAGT TTTAAAACAC CAAGAACTTA CTTTCGAATA AACACACATA AATAAAG-3*