HU209146B - Method for producing desulphato-hydrudine - Google Patents

Method for producing desulphato-hydrudine Download PDF

Info

Publication number
HU209146B
HU209146B HU865177A HU517786A HU209146B HU 209146 B HU209146 B HU 209146B HU 865177 A HU865177 A HU 865177A HU 517786 A HU517786 A HU 517786A HU 209146 B HU209146 B HU 209146B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
hirudin
gly
desulfato
glu
Prior art date
Application number
HU865177A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT42523A (en
Inventor
Jutta Heim
Walter Maerki
Bernd Meyhack
Original Assignee
Ucp Gen Pharma Ag
Ciba Geigy Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB858530631A external-priority patent/GB8530631D0/en
Application filed by Ucp Gen Pharma Ag, Ciba Geigy Ag filed Critical Ucp Gen Pharma Ag
Publication of HUT42523A publication Critical patent/HUT42523A/hu
Publication of HU209146B publication Critical patent/HU209146B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2428—Glucan 1,4-alpha-glucosidase (3.2.1.3), i.e. glucoamylase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

A találmány a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia területére vonatkozik, és tárgya eljárás a deszulfato-hirudin trombin inhibitor előállítására, genetikailag átalakított élesztő sejtekkel.
A hirudin egy antikoaguláns, amely a természetben a piócában (Hirudo medicinalis) található meg. A hirudin nem egyetlen protein-fajta, hanem legalább három komponensből áll, amelyeket hirudin 1 variánsnak (HV1), hirudin 2 variánsnak (HV2) (lásd a 158564 lajstromszámú európai szabadalmi bejelentést) és „dez-(Val)2-hirudin”-nak neveznek (lásd a 158986 lajstromszámú európai szabadalmi bejelentést). A variánsok egymástól szerkezetükben különböznek, amely különbözőség az aminosavak számában adódik (részletesebben, a HV1 N-terminális szekvenciája Val-ValTyr, a HV2 variánsé Ile-Thr-Tyr, és a „dez-(Val)2-hirudin”-é Thr-Tyr), ugyanakkor az N-terminális végen hidrofób aminosavak, a C-terminális végen pedig poláris aminosavak halmozódnak fel; a tirozin-csoport (Tyr63) szulfát-monoészter alakjában van jelen, a molekulában három diszulfid-híd észlelhető, és az antikoaguláns aktivitás mindháromnál jelentkezik.
A 6x1 Cf11 M Kj-értékkel jellemzett (a komplex disszociációs állandója) hirudin a legerősebb ismert trombin inhibitor, specifikus affinitása van a trombinhoz. A véralvadási kaszkád egyéb enzimeit a hirudin nem gátolja. A heparinnal ellentétben, amely egyébként a konvencionális véralvadás-gátló terápia kedvelt antikoagulánsa, a hirudin gátló hatását direkt a trombinon fejti ki, és szemben a heparinnal nem az antitrombin ΙΠ-on keresztül hat. A tisztított hirudin farmakológiailag kimutatható egyetlen hatása a véralvadás gátlása és a trombózis megelőzése. Nincs hatással a szívműködésre, légzésre, vérnyomásra, a trombociták számára, a fibrinogén és a hemoglobin kutyáknak való intravénás adagolás után is, még nagy dózisokat követően is jelen vannak. Patkányokban, sertésekben és kutyákban végzett vizsgálatok szerint a hirudin hatásos a kísérleti trombózisra (amelyet pangással indukálunk vagy trombint injektálva váltunk ki), hatásos továbbá endotoxin okozta sokkban, és ugyancsak hatásos DIC (elterjedt intravaszkuláris koaguláció) esetén. Bármilyen közvetlen összehasonlító vizsgálatot végeztek, a hirudin előnyösebbnek bizonyult a heparinnál. Ezenfelül, a hirudin extrémen alacsony toxicitású, nem antigén, és a veséken át teljes mértékben kiürül, biológiailag aktív alakban.
Bár régóta ismerik, a hirudint nem használják széleskörűen a terápiában, ahogy az elvárható lenne, kiemelkedő biológiai tulajdonságai alapján. Hozzáférhetősége limitált, és ez gyógyszerként való széles körű felhasználásának egy komoly akadálya. Mind ez ideig a hirudin-készítményeket természetes anyagból (pióca extraktumokból) állították elő; ez drága és nehézkes, az izolálása és tisztítása időigényes és drága [Walsmann és munkatársai, Pharmazie, 36, 653 (1981); 158986 lajstromszámú európai szabadalmi bejelentés]. Viszonylag hosszú, 65 aminosavból álló szekvenciájának szintézise a konvencionális peptid-szintézissel gazdaságossági okokból kevéssé reményteljes. Ezért új módszereket kell találnunk megfelelő mennyiségű hirudin előállítására, amelyek lehetővé teszik terápiás felhasználhatóságának vizsgálatát klinikumban és széles körű terápiás használhatóságát a véralvadás-gátló terápiában.
Ilyen módszereket ajánlanak a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiák. Ezen a módon lehetséges a legváltozatosabb élettani szempontból aktív polipeptidek előállítása a megfelelő, genetikailag módosított mikroorganizmus tenyésztésével. Ebben az értelemben meggondoltuk, hogy a hirudin a piócában egy deszulfato-hirudin prekurzoron át képződik, és ez a transzlációt követően szulfatálódik. Várható, hogy a piócától különböző gazda nem rendelkezik specifikus, szulfátcsoportot felvivő enzimrendszerrel; így deszulfato-hirudinok fognak keletkezni a hirudinok helyett. Ugyanakkor, a biológiai aktivitás nem sérül a szulfátcsoport hiánya miatt, amit olyan kísérletek bizonyítanak, ahol a megfelelő hirudin fehérje tirozin (63) fenolos hidroxilcsoportjáról enzimatikusan eltávolították a szulfátcsoportot, és így deszulfato-hirudin fehérjét kaptak (142860 lajstromszámú európai szabadalmi bejelentés).
A 158564 lajstromszámú európai szabadalmi bejelentés szerint E. coli sejtek tenyésztésével állítják elő a deszulfato-hirudin 1 és 2 variánsokat, és ezek analógjait; az E. coli sejteket a megfelelő deszulfato-hirudinok struktúrgénjét tartalmazó plazmidokkal transzformálták. A tenyésztett E. coli sejtek sejtextraktumaiban mért antikoaguláns aktivitást anti-trombin egységként (ATU) adják meg, ez 3000-4000 ATU/OD^l tenyészet. Ez megfelel 0,2 mg hirudin/OD/l-nek (a számítást becsült specifikus aktivitásra nézve végezték, ami 15 000^20 000 ATU/mg tiszta hirudin).
A transzformált E. coli sejtekkel kapott, viszonylag gyenge hirudin-aktivitás valószínűleg annak tulajdonítható, hogy a hirudin fehérje legnagyobb része inaktív alakban akkumulálódik a citoplazmában, a molekula helytelen felcsavarodása miatt. A megfelelő felcsavarodás függ a hirudin molekulán belül kialakuló három diszulfid-híd jelenlététől, ezek alapve, tő fontosságúak az enzim aktivitása szempontjából (lásd Walsmann és munkatársai, mint előbb). Más, természetesen szekretált emlős proteinek, mint például a szarvasmarha növekedési hormon, az emberi szöveti plazminogén aktivátor és a humán gamma-interferon hasonlóképpen inaktívak a termelés után, és a mikoorganizmusok citoplazmájában halmozódnak fel [lásd Smith és munkatársai, Science, 229, 1219 (1985)]. Úgy tűnik, hogy a szekréciós metabolizraus előnyben részesíti a diszulfid kémiai kötések kialakítását, mivel a legtöbb, diszulfid-hidakat tartalmazó protein extracelluláris. Több más tulajdonság miatt is előnyös a szekretálódás:
a szekretálódó proteineket általában könnyebb kimutatni és tisztítani, mint az intracellulárisan felhalmozódó termékeket;
a kívánt termékek szekretálódása a táptalajba nem teszi szükségessé a gazda mikroorganizmus feltárását a termék kinyerése érdekében;
HU 209 146 Β egyes heterológ (idegen) proteinek toxikusak a gazdasejtre. Ha szekretálódnak, kevésbé valószínű, hogy hatnak a normális sejtfunkciókra;
A szekretált proteineket a proteolitikus enzimek kevésbé emésztik, mint a sejten belül felhalmozódott proteineket, ugyanakkor ezek az enzimek a sejtek feltárásakor hatnak.
A legtöbb szekretált protein a dezoxi-ribonukleinsavon preproteinként van kódolva, ami azt jelenti, hogy az amino-terminális végen az érett aminosavszekvencia egy úgynevezett szignálpeptiddel meghosszabbodik. A szignálpeptid alapvető fontosságú szerepet játszik abban, hogy transzlációkor a protein az endoplazmatikus retikulum membránjába beépüljön. Egy szignálpeptidáz lehasítja a szignálpeptidet az endoplazmatikus retikulumba való beépüléskor. A külső sejtmembránba való transzportálódásban szerepet játszik a Golgi-rendszer és a szekretációs hordozók. A protein vagy a periplazmatikus térbe (például a savas foszfatáz, invertáz), vagy a táptalajba kerül (például az α-faktor, toxinok).
Mivel az összes eukarióta rendelkezik a genetikai információ kifejezésének mechanizmusával, és a kifejeződő proteinek rövidítésével, az eukarióta gének kifejezése nagyobb hatékonysággal következik be eukarióta gazdasejtben, mint E. coli-ban. Az eukarióta organizmusok között az élesztő a legkönnyebben kezelhető és tenyészthető. Több heterológ (idegen) proteint fejeztek ki sikeresen élesztőben. Ugyanakkor, eddig nem volt lehetséges egy protein összes eszenciális tulajdonságát meghatároznunk, amely hozzásegíti a terméket a táptalajba való szekretáláshoz, kivéve a szignálpeptid jelenlétében szükségességét. így nem vagyunk képesek reális jóslatot megfogalmazni, hogy vajon egy protein szekretálódni fog-e, vagy sem. Például, a pre-glükoamiláz gént tartalmazó transzformált élesztő által termelt glükoamiláz 90%-a kikerül a táptalajba (PCT szabadalmi leírás, sorszáma: 84/2921), és nagy mennyiségű epidermális növekedési faktor (EGF) található az EGF gént az ά-faktor szignálpeptiddel együtt hordozó élesztősejt tenyészetében (116201 lajstromszámú európai szabadalmi leírás), az alábbi proteinekből csak igen kis mennyiséget sikerült kimutatni a táptalajban: β-endorfin (α-faktor szignálpeptid, PCT szabadalmi leírás, sorszáma: 84/4330), leukocita A interferon (invertáz szingálpeptid, 127 304 lajstromszámú európai szabadalmi leírás), humán gamma-interferon, humán szérum albumin, szarvasmarha interferon-α 1 és α 2, szöveti plazminogén aktivátor, rennin és humán inzulinszerű növekedési faktor (α-faktor szignálpeptid, 123 544 lajstromszámú európai szabadalmi leírás), leukocita D interferon és A interferon, gammainterferon, továbbá humán növekedési hormon (interferon és humán növekedési hormon szignálpeptidek, 88 632 lajstromszámú európai szabadalmi leírás).
A Pseudomonas karboxi-peptidáz G2(CPG2) [G2(CPG2) szignálpeptid, 121352 lajstromszámú európai szabadalmi leírás], továbbá a szöveti plazminogén aktivátor (PHO5 szignálpeptid, 143081 lajstromszámú európai szabadalmi leírás) nyomait sem találták meg a transzformált élesztő tenyészetében.
így bizonytalan volt, hogy egy szelektált protein, például a hirudin, amely kiterjedt szignálpeptid-résszel rendelkezik, legalább bizonyos fokig szekretálódik-e a transzformált gazdasejtből, például élesztőből.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a deszulfato-hirudin élesztő gazdasejtek által szekretálható a táptalajba, legalábbis abban az esetben, ha ezek olyan dezoxiribonukleinsav szekvenciát hordoznak, amely egy szignálpeptidet kódol a deszulfato-hirudin struktúrgén szempontjából 5’-irányban, és ezzel leolvasási fázisban.
A találmány tárgya eljárás deszulfato-hirudin előállítására és szekretálására élesztő gazdasejttel.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük az eljárást.
1. A deszulfato-hirudin előállítása
A találmány szerint úgy járunk el, hogy megfelelő táptalajon egy élesztő sejtet tenyésztünk, amelyet egy vagy több, a következő összetételű dezoxi-ribonukleinsav inszentumot (a továbbiakban inszent) tartalmazó hibrid vektorral transzformálunk: élesztő expressziós szabályozó szekvencia; egy első dezoxi-ribonukleinsav szekvencia és egy második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát hordozó dezoxi-ribonukleinsav szegmens, ahol az első szekvencia egy élesztő PH05 vagy invertáz szignálpeptidet kódol, és 5’irányban, továbbá leolvasási fázisban helyezkedik el a második szenvenciával, amely viszont az érett deszulfato-hirudint határozza meg, amely utóbbi szegmens az említett expressziós kontroll szekvencia transzkripciós kontrollja alatt áll, végül egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely élesztő transzkripciós terminációs jeleket hordoz; és a táptalajból izoláljuk a deszulfato-hirudint.
A „dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely érett deszulfato-hirudint határoz meg” meghatározás alatt az összes olyan struktúrgént értjük, amely hirudin aktivitással rendelkező érett proteineket kódol, és amelyek ismereteink szerint - jelen vannak és/vagy izolálhatok a piócagenomban, illetve genomból. Ilyenek például az érett deszulfato-hirudin variánsok (HV1, HV2, Pa) és a dez-(Val)2-deszulfato-hirudin struktúrgénjei, eltekintve az utóbbitól, ha ez a HV1 gén hibás kifejlődéséből adódó termék. Az „érett deszulfato-hirudin” meghatározás alatt pre- és pro-szekvenciákat nem tartalmazó deszulfato-hirudinokat értünk. A hirudin-PA ismert hirudin-variáns, amely a következőkben bemutatott (III) képlettel írható le.
A deszulfato-hirudin meghatározás alatt azokat a proteineket értjük, amelyek szekretáló gazdasejtből származnak, trombin-gátló hatással rendelkeznek, és pozitív reakciót adnak anti-hirudin antitestekkel, és a deszulfato-hirudin primer struktúrájával rendelkeznek. Ideértjük azonban ezek módosított, például szulfátéit származékait is, például a megfelelő hirudinokat, ezek rövidített származékait, mint például azokat a deszulfato-hirudinokat, amelyeknek C-terminális végéről 1-7 aminosav hiányzik. A fenti proteinek alapjában véve az alábbi, (I) képletű proteinek:
HU 209 146 Β
X Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin
Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn
Ilu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin
Asn Leu Cys Gly Asn Lys Cys Cys Val Thr Gly Asp Gly Asp Phe
R ahol X egy dipeptid-csoport; Val-Val- (HV1) vagy Thr csoport [Dez-(Val2)-hirudin], és ahol R a tirozin fenolos hidroxilcsoportja vagy egy -O-SO3H csoport, idetartoznak azok a származékok is, ahol az (I) képleten megadott szekvencia C-terminális végéről hiányzik az Gin jellel jelzett aminosav, a glutamin, vagy a C-terminális dipeptid, a -Leu-Gln, vagy hiányzik a C-terminális végről az alábbi tripeptid:
-Tyr(R)-Leu-GIn, vagy az alábbi tetrapeptid; -Glu-Tyr(R)-Leu-Gln, idetartoznak az alábbi, (II) képletű peptidek:
Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Val Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin
I
R (HV2), ahol R az előzőekben megadott jelentésű, vagy sity of Munich, NSZK, 1984), és amelyek a (III) képidetartoznak a hirudin PA névvel jelzett hirudin varián- lettel jellemezhetők:
sok, amelyeket a pióca termel (Dodt, Thesis, UniverIle Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Val Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe
Glu Pro Ile Pro Glu Asp Alá Tyr Asp Glu
R ahol R az előzőekben megadott jelentésű.
Előnyös deszulfato-hirudin az az (I) képletű vegyü- 35 let, amelyben X Val-Val-csoport, továbbá, ahol R a tirozin fenolos hidroxilcsoportját jelenti; előnyös tulajdonságúak továbbá ennek olyan származékai is, amelyekről hiányzik a C-terminális vég 1-7, előnyösen 1-4 aminosava.
Előnyös gazdasejt az élesztő, mint például a Saccharomyces cerevisiae. A találmány szerinti eljárásban ezért legelőnyösebben Saccharomyces cerevisiae törzseket használunk.
Az élesztőt, amely a fenti dezoxi-ribonukleinsav 45 szekvenciákat tartalmazza, ismert módon tenyésztjük.
A találmány szerint a transzformált élesztőtörzseket folyékony halmazállapotú táptalajban, felhasználható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajon tenyésztjük.
Szén-forrásként különböző vegyületeket használhatunk. Előnyös szénforrások a hasznosítható szénhidrátok, például a glükóz, maltóz, mannit vagy laktóz, egy acetát, például nátrium-acetát, amelyet önmagában vagy megfelelő keverékben adagolunk. Nitrogénfonásként előnyösen például aminosavakat, például kazaminsavakat, peptideket és proteineket, vagy ezek hidrolizált termékeit használjuk, például triptont, peptont vagy húskivonatokat, továbbá például élesztőkivonatot, malátakivonatot, kukoricalekvárt, vagy például ammóniumsókat, például ammónium-kloridot, ammónium-szulfátot vagy ammónium-nitrátot, amelyeket önmagukban vagy megfelelő keverékben adagolunk. Szervetlen sóként például nátrium-, kálium-, magnézium- vagy kalcium-szulfátokat, kloridokat, foszfátokat és karbonátokat adagolunk. A táptalajba 40 növekedést elősegítő anyagokat is tehetünk. Ilyen növekedést elősegítő anyagok például a nyomelemek, például a vas, cink, mangán és mások, de adagolhatunk bizonyos aminosavakat is.
. Az autonóm replikáló plazmidokat, például a két mikronos plazmid dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó élesztősejtek transzformáció után elveszthetik a beépített hibrid plazmidot. Ez okból ezeket az élesztősejteket szelektív körülmények között kell növesztenünk, azaz olyan körülmények között, amelyeknél növeke50 déskor a plazmidon kódolt génnek ki kell fejeződnie. A jelenleg használt legtöbb szelektív marker a találmány szerinti hibrid vektorokban az aminosav vagy purin bioszintéziskor szereplő enzimeket kódoló gének. Ezért a megfelelő aminosavban vagy purin bázis55 bán hiányos, szintetikus minimál táptalajt kell használnunk. Használhatunk azonban egy adott biocid anyaggal szembeni rezitenciát meghatározó gént is (például cikloheximiddel vagy az amino-glükozid G 418 antibiotikummal, nehézfémekkel vagy hasonlókkal szembe60 ni rezisztenciát meghatározó géneket. Az antibiotikum
HU 209 146 Β rezisztenciát hordozó vektorral transzformált élesztősejtek a megfelelő antibiotikum jelenlétében komplex táptalajon gyorsabban nőnek, és nagyobb sejtdenzitást érhetünk el.
A dezoxi-ribonukleinsavval transzformált élesztősejtek egy részében a dezoxi-ribonukleinsav beépül a kromoszómába, ezek nem igénylik a szelektív növekedési körülményeket. Ezek a transzformált sejtek megfelelően stabilak, szelektív nyomás nélkül is növekszenek. Az ilyen típusú sejtek komplex táptalajon nagymértékben növekednek.
A konstitutív promotert (például ADHI, GAPDH) hordozó hibrid plazmidokat tartalmazó élesztősejtek az adott promoter szabályozása alatt indukció nélkül kifejezik a deszulfato-hirudin gént. Ugyanakkor, ha a deszulfato-hirudin gén egy reguláit promoter (például PGK vagy PHO5) szabályozása alatt áll, a növesztésre használt táptalaj összetételét úgy választjuk meg, hogy a hírvivő ribonukleinsav másolatok száma maximális legyen; azaz, ha PHO5 promoter van jelen, úgy a növesztésre használt táptalaj kis koncentrációban szervetlen foszfátot kell hogy tartalmazzon a promoter derepressziójára.
A tenyésztést ismert technikákat használva végezzük. A tenyésztés körülményeit, például a hőmérsékletet, a táptalaj pH-ját, és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy minél több deszulfato-hirudin keletkezzen. Egy adott élesztőtörzset levegőztetett fermentációs körülmények között, süllyesztett fermentációval, rázott tenyészetben vagy kevertetett tenyészlében növesztjük 25 °C és 35 °C, előnyösen 30 °C hőmérsékleten, 4 és 8 közötti pH-η, például 7-es pH-n, 4-20 órán át, előnyösen addig, míg maximális mennyiségű-protein keletkezik.
Meglepő módon azt találtuk, hogy a gazda mikroorganizmustól és a használt szignál peptidtől függetlenül, a termelt hirudin-vegyületek legnagyobb része szekretálódik a táptalajba, a sejten belül csak egy kis rész marad. A pontos arány (kiválasztott vegyület/sejtben maradó termék) függ a fermentációs körülményektől és az izolálásra használt eljárástól. Az arány általában 9:1 vagy ennél több. Ennek megfelelően, a kiválasztott hirudin mindig erősen dominál.
A deszulfato-hirudint a tenyészetből ismert módszerekkel izoláljuk. Például úgy járunk el, hogy első lépésként elkülönítjük a sejteket a fermentléből, centrifugálással. A kapott felülúszó deszulfato-hirudin tartalmát növelhetjük úgy, hogy azt polietilén-iminnel kezeljük, amikopja, nem fehérjetermészetű anyagok nagy része eltávolítható, amiután az oldatot ammónium-szulfáttal telítve, vagy triklór-ecetsavval kezelve kicsapjuk a proteint. A sejtből származó proteinek, ha egyáltalán jelen vannak, szintén kicsaphatok ecetsavas savanyítással, amit például 0,1% ecetsav-adagolással érünk el (pH- 4-5). A deszulfato-hirudin további tisztítását érhetjük el akkor, ha az ecetsavas felülúszót n-butanollal extraháljuk. Használhatunk más tisztítási lépéseket is, például kisózást, kromatográfiát, mint például ioncserés kromatográfiát, gélfiltrációs kromatográfiát, megoszlásos kromatográfiát, nagynyomású folyadék-kromatográfiát, fordított fázisú nagynyomású folyadék-kromatográfiát stb. Az elegy összetevőinek elkülönítését elősegíthetjük dialízissel, gél-elektroforézissel, hordozó-mentes elektroforézissel, a molekulanagyságtól függő, megfelelő Sephadex-kromatográfiával, affinitás-kromatográfiával, például antitesteket használva (különösen előnyös, ha monoklónozott antitesteket alkalmazunk), de végezhetjük az elkülönítést megfelelő hordozóanyaghoz kapcsolt trombínnal végzett affinitás-kromatográfiával, vagy más, az irodalomból ismert módszerekkel.
Úgy találtuk, hogy meglepő módon az érett deszulfato-hirudinnak megfelelő dezoxi-ribonukleinsav szekvencia által meghatározott hirudin-vegyületeken kívül a fermentléből olyan, a várt vegyületektől különböző, más deszulfato-hirudinok is izolálhatok, amelyekben
1-4 aminosav hiányzik a protein C-terminális végéről, így a deszulfato-hirudin HV1 variánst kódoló gént hordozó élesztősejteket tenyésztve, kisebb mennyiségben az alábbi deszulfato-hirudin vegyületeket is izolálhatjuk: olyan deszulfato-hirudinok, amelyeknek C-terminális végéről hiányzik a glutamin [dez-(Gln65)-deszulfato-hirudin], a C-terminális dipeptid hiányzik, ez a Leu-GIn-fdez-ÍLeu64, Gln65)-deszulfato-hirudin], olyan is jelen van a tenyészetben, amelynek C-termínális végéről egy tripeptid-csoport hiányzik, ez a Tyr-LeuGln-[dez-(Tyr63, Leu64, Gln65)-deszulfato-hirudin]; végül olyan is jelen van, amelynek C-terminális végéről az alábbi tetrapeptid-csoport hiányzik: Glu-Tyr-LeuGln-[dez-(Glu62, Tyi63, Leu64, Gln65)-deszulfato-hirudin]. Ezek a vegyületek valószínűleg (részleges) proteolitikus bomlás útján keletkeznek, amikor az elsődlegesen kifejeződő deszulfato-hirudin termék hasad. E vegyületeket az összes tenyészetben identifikáltuk, függetlenül a használt élesztő gazdasejttől és az alkalmazott fermentációs körülményektől.
A dez-(Gln65)-deszulfato-hirudin, a dez(Tyr63, Leu64, Gln65)-deszulfato-hirudin és a dez-(Glu62, Tyr63, Leu64, Gln65)-deszulfato-hirudin új vegyület, és a jelen találmány oltalmi köréhez tartozik.
A deszulfato-hirudin kimutatására az alábbi módszereket használjuk: anti-deszulfato-hirudin antitestekkel való vizsgálat (például hibridóma sejtekből nyert monoklonális antitestek), trombin teszt [Bergmeyer, Methods in Enzymatic Analysis, II. kötet, 314— 316. oldal, Verlag Chemie, Weinheim, NSZK (1983)], vagy a vérkoagulációs vizsgálat [Markwardt és munkatársai, Thromb. Haemost., 47, 226 (1982)].
A találmány szerinti eljárással előállított deszulfato-hirudin ismert módon különböző hirudin-vegyületekké alakítható át.
így például, az (I)-(III) képletű vegyületek, ahol R a tirozin fenolos hidroxilcsoportját jelenti, szulfátionokkal, például dinátrium-szulfáttal és tirozin-szulfotranszferáz enzimmel (amelyet például pióca sejtekből lehet izolálni) olyan (I)-(III) képletű vegyületekké alakíthatók át, amelyekben az R -OS03H-csoportot jelent.
A találmány szerinti eljárással előállított deszulfato-hirudin vegyület, például a deszulfato-hirudin HV1
HU 209 146 Β variáns átalakítható olyan származékká, amely C-terminális végén 1-7 aminosavat elveszített. Az aminosavak például megfelelő karboxi-peptidázzal, például karboxi-peptidáz Y enzimmel hasíthatok le.
A találmány szerinti transzformált élesztő gazdaorganizmus előállítására úgy járunk el, hogy rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákat használva olyan dezoxi-ribonukleinsav molekulát állítunk elő, amely tartalmaz egy élesztő expressziós kontroll szekvenciát; tartalmaz egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szegmenst, amely egy második dezoxiribonukleinsav szekvenciával leolvasási fázisban és attól 5’-irányban elhelyezkedő és egy szignál pepiidet meghatározó első dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát hordoz, ahol a második dezoxi-ribonukleinsav szekvencia az érett deszulfato-hirudint határozza meg, és amely az adott expressziós szabályozó szekvencia transzkripciós kontrollja alatt áll, tartalmaz továbbá egy élesztő transzkripciós terminációs jelet hordozó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát; a fenti dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát hordozó hibrid vektort készítünk;
az előállított hibrid vektorral egy élesztő gazdasejtet transzformálunk, végül a nem transzformált gazdasejtek közül szelektáljuk a transzformáltakat.
2. A szignál peptid és a deszulfato-hirudin kódoló tartományait tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav szekvencia előállítása
A találmány szerinti eljárásban szükséges egy olyan dezoxi-ribonukleinsav, amely tartalmaz egy élesztő expressziós szabályozó szekvenciát, egy olyan második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát, amely meghatározza az érett deszulfato-hirudint, és egy, egy szignálpeptidet leíró és a második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciával leolvasási fázisban lévő első dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát, továbbá az adott expressziós szabályozó-szekvencia transzkripciós kontrollja alá rendeli az adott második dezoxi-ribonukleinsav szegmenst, továbbá a dezoxi-ribonukleinsav molekula egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát tartalmaz, amely élesztő transzkripciós terminációs jeleket hordoz.
Szignálpeptidet és deszulfato-hirudint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák expressziós regulációjára több expressziós szabályozó-szekvenciát használhatunk. Különösen a transzformálandó gazdasejt erőteljesen kifejezett génjeit tartalmazó expressziós kontroli-szekvenciákat használunk.
A találmány szerinti eljárás során az expressziós szabályozó-szekvenciák az élesztő, előnyösen a Saccharomyces cerevisiae kromoszomális dezoxi-ribonukleinsavából származnak. Előnyösen a deszulfatohirudin kifejezésére aktívan kifejeződő élesztő gén szabályozó-szekvenciáját használjuk. így használhatjuk a TRP1 gén, az ADHI vagy ADHII gén, a savas foszfatáz (PHO5) gén, az izocitokróm C géz promoterét, vagy egy enoláz promotert, használhatjuk továbbá az alábbi enzimek promoterét: gliceraldehid-3-foszfátdehidrogénáz (GAPDH), 3-foszfo-glicerát-kináz (PGK), hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfo-fruktokináz, glükóz-6-foszfát-izomeráz, 3-foszfo-glicerátmutáz, piruvát-kináz, triózfoszfát-izomeráz, foszfoglükóz-izomeráz vagy glükokináz, használhatunk továbbá élesztő fermon gén promotert, amely gén az avagy α-faktort kódolja. Használhatunk hibrid promotereket is, amelyek 5’-irányban aktivációs szekvenciákat hordoznak (UAS), és 3’-irányban pedig promoter elemeket, amelyek egy másik élesztő gén funkcionális TATA-boxát is tartalmazzák. Ilyen hibrid promoter lehet az UAS-szekvenciát (szekvenciákat) is tartalmazó PHO5 gén, a 3’-irányban elhelyezkedő és a GAPDH és TATA-boxát is tartalmazó promoter szekvencia. A találmány szerinti eljárásban használt előnyös vektorok transzkripciós kontrollal együtt tartalmaznak promotereket. Ilyen típusú promoterek például a PHO5 gén és a PHO5-GAPDH hibrid promoterek, amelyek ki- és bekapcsolhatók a tenyésztés körülményeitől függően. A PHO5 promoter például represszálható és derepresszálható a táptalajban lévő szervetlen foszfátion koncentrációjának növelésével vagy csökkentésével.
A találmány szerinti eljárásban továbbá előnyösen használhatjuk a GAPDH gén promoterét, különösen annak egy olyan funkcionális fragmensét, amely a 300. nukleotidtól a 180. nukleotidig terjed (mínusz irányban), különösen előnyösen azonban a-263. vagy -199. nukleotidnál kezdődő, és a GAPDH gén -5. nukleotidjánál végződő szekvencia.
A találmány szerinti eljárásban használt szignál pepiidet („szignál szekvencia”) meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvencia élesztő génből származik, amely közönséges körülmények között szekretálódó polipeptidet kódol. Előnyösen szignál szekvenciák például a pióca genomból származó hirudin szignál szekvencia, élesztő szignál szekvenciák, például az élesztő invertáz, a-faktor, α-faktor, feromon peptidáz, „killer” toxin vagy represszálható savas foszfatáz (PHO5) gének szignál- és prepro-szekvenciái, továbbá például az Aspergillus awamori glükomiláz enzim szignál szekvenciája. Készíthetünk fuzionált szignál szekvenciákat úgy, hogy egy, a használt promoterhez természetesen kötődő gén esetleg jelen levő szignál szekvenciájának egy részét ligáljuk a hirudin szignál szekvencia egy részével. Azok a kombinációk előnyösek, amelyek a szignál szekvencia és az érett deszulfato-hirudin aminosav szekvenciája között pontos hasítást tesznek lehetővé. Használhatunk ezenkívül olyan szekvenciákat is, amelyek például pro- vagy tér(spacer)-szekvenciák; azaz, amelyek hordozhatnak vagy nem hordoznak specifikus szignál jeleket, ezek használatakor elősegíthetjük a prekurzor molekulák pontos képződését. Fuzionált proteineket előállíthatunk sejten belül más módon is, például köztes szignál jeleket alkalmazva, amelyek megfelelő érési folyamatot tesznek lehetővé in vivő vagy in vitro. így például, az élesző Golgi membránjaiban lévő endopeptidáz enzim' által felismert Lys-Arg csoport leírható szignál jelekkel. A találmány szerinti eljárásban előnyösen olyan szignál szekvenciákat használunk, mint például az élesztő PHO5 génje által kódolt szignál peptid. Ennek szekvenciája a következő:
HU 209 146 Β
Met Phe Lys Ser Val Val Tyr Ser Ile Leu Alá Alá Ser Leu Alá Asn Alá.
Előnyös az élesztő invertáz gén is, amely az alábbi képletű szignál peptidet kódolja:
Met Leu Leu Gin Alá Phe Leu Phe Leu Leu Alá Gly Phe Alá Alá Lys Ile Ser Alá.
Az érett deszulfato-hirudint kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvencia a deszulfato-hirudinok (lásd előbb) struktúrgénjeiből választható ki. A deszulfatohirudin 1 (HV1) variáns előnyös dezoxi-ribonukleinsav szekvenciája a következő:
GTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT
CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA
TCTAACGTTTGCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAG
AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTC
TGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAA
ACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTT
GAAATCCCGGAAGAATACCTGCAG
CTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTC.
Élesztő transzkripciós terminációs jeleket hordozó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciaként egy élesztő gén 3’-részen fekvő szekvenciáját alkalmazzuk, amely transzkripciós terminációra és poliadenilezésre megfelelő szignál jeleket tartalmaz. A megfelelő 3’-részen levő szekvenciák például azok, amelyekben a gén természetesen kapcsolódik egy expressziós szabályozó szekvenciához. Előnyös például az élesző PHO5 génje. A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsav készítményt előnyösen mindkét végén olyan szintetikusan előállított dezoxi-nukleotid linker szekvenciákkal látjuk el, amelyek lehetővé teszik a termék beépítését és klónozását egy klónozó vektorba.
Az élesztő expressziós szabályozó szekvenciát, a • szignál peptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szakaszt, az érett deszulfato-hirudint kódoló szekvenciát és az élesztő transzkripciós terminációs jeleket úgy kapcsoljuk egymáshoz, hogy azok megtartsák működőképességüket. Úgy rendezzük el őket, hogy az expressziós szabályozó szekvencia a szignál peptid-deszulfato-hirudin génkomplex megfelelő kifejeződését lehetővé tegye, a transzkripciós terminációs szignáloknál a transzkripció és a poliadenilezés megfelelően leálljon, és a szignál szekvencia úgy kapcsolódjon a deszulfato-hirudin génhez, hogy a deszulfato-hirudin szekretálódása bekövetkezzen. így, ha az expressziós szabályozó szekvencia és a szignál szekvencia különböző génekből ered, az expressziós szabályozó szekvenciát előnyösen úgy kapcsoljuk a szignál szekvenciához, hogy az a major hírvivő ribonukleinsav start jel és az expressziós szabályozó szekvenciához természetesen kapcsolódó ATG gén közé essen. A szignál szekvenciának saját ATG kodonnal kell rendelkeznie ahhoz, hogy a transzláció iniciációja bekövetkezzen. A fenti szekvenciák kapcsolását előnyösen szintetikus oligo-dezoxi-nukleotid linkerekkel vitelezzük ki, ezek hordozhatnak endonukleáz által felismerhető szekvenciát. Másrészről, a szignál szekvencia utolsó kodonját közvetlenül kapcsoljuk a deszulfato-hirudin gén első kodonjához.
A találmány szerinti dezoxi-ribonukleinsavakat ismert módon állíthatjuk elő, például úgy, hogy egy élesztő expressziós szabályozó szekvenciát, egy második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciától 5’-irányba eső és leolvasási fázisban levő, szignál peptidet kódoló dezoxi-ribonukleinsavat, egy második, a deszulfato-hirudint kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát és élesztő transzkripciós terminációs jeleket hordozó dezoxi-ribonukleinsav szakaszt összekapcsolunk úgy, hogy a dezoxi-ribonukleinsav megfelelő expressziója és a termelt deszulfato-hirudin szekretálódása bekövetkezzen az élesztő gazdasejtben.
A találmány szerinti eljárásban felhasznált dezoxiribonukleinsav előállítása érdekében a különböző dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák kapcsolását tompa vég ligációval vagy megfelelő restrikciós helyeket igénybevéve, esetleg szintetikus linker molekulákat használva végezzük, miközben különleges figyelmet szentelünk a megfelelő kapcsolódásra úgy, hogy az adott dezoxi-ribonukleinsav szekvenciák normális funkciója megmaradjon. így, a szignál szekvencia és a deszulfato-hirudin gén tompa vég ligációval fuzionálható. Korrekt kapcsolódást kapunk a szignál szekvencia és a deszulfato-hirudin gén között akkor is, ha a szignál szekvenciát 3’-végénél és a deszulfato-hirudin gént 5’végénél hasítjuk, amiután mindegyik szekvencia egy előre meghatározott számú bázispárban hiányos. Ezután szintetikus oligo-dezoxi-nukleotid linker készíthető úgy, hogyha ezt hozzákapcsoljuk a hiányos szignál szekvenciához és a hiányos deszulfato-hirudin génhez, akkor a hiányzó bázispárok kiegészülnek, és a deszulfato-hirudin gén megfelelő leolvasási fázisban a szig- % nál szekvenciához kötődik.
A deszulfato-hirudint kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvencia a pióca genomiális dezoxi-ribonukleinsavából izolálható, vagy a deszulfato-hirudin hírvivő ribonukleinsavából komplementér kétszálú deszulfatohirudin dezoxi-ribonukleinsav (deszulfato-hirudin kétszálú cDNS; ds cDNS) készíthető. Előállítható a deszulfato-hirudin aminosav-szekvenciáját meghatározó gén kémiai vagy enzimatikus úton is.
A genomiális deszulfato-hirudin dezoxi-ribonukle7
HU 209 146 Β insav és a deszulfato-hirudin és cDNS például ismert módon állítható elő. Például úgy járunk el, hogy a deszulfato-hirudin gént tartalmazó pióca génbankból izoláljuk a genomiális deszulfato-hirudin dezoxi-ribonukleinsavat úgy, hogy a pióca dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket egy mikroorganizmusba klónozzuk, és azokat a kiónokat, amelyek deszulfato-hirudin dezoxiribonukleinsavat tartalmaznak, például telephibridizációval azonosítjuk. A telephibridizációt radioaktívan jelzett olyan deszulfato-hirudin dezoxi-ribonukleinsav specifikus oligo-dezoxi-ribonukleotiddal végezzük, amely legalább 15, előnyösen 15-30 dezoxi-nukleotidot tartalmaz. A kapott dezoxi-ribonukleinsav fragmensek a deszulfato-hirudin génen kívül szabály szerint más, nem-kívánatos dezoxi-ribonukleinsavakat is tartalmaznak, amelyeket megfelelő oxo- vagy endonukleázos kezeléssel eltávolíthatunk.
A kétszálú deszulfato-hirudin cDNS molekulát például úgy állíthatjuk elő, hogy megfelelő piócasejtekből hírvivő ribonukleinsavat izolálunk, amelyet előnyösen indukálunk hirudin szintézisére. A kapott hírvivő ribonukleinsav-elegyben ismert módon feldúsítjuk a deszulfato-hirudin hírvivő ribonukleinsavat, majd ezt az mRNS-t templátként használjuk fel az egyszálú cDNS előállítására. Ribonukleinsav-depedens dezoxi-ribonukleinsav polimeráz segítségével ebből ds cDNS-t szintetizálunk, majd ez utóbbit egy megfelelő vektor dezoxi-ribonukleinsavba klónozzuk. A deszulfato-hirudin cDNS-t tartalmazó kiónokat például a fenti módon megadottak szerint telephibridizációval azonosítjuk radioaktívan jelzett, deszulfato-hirudin dezoxi-ribonukleinsavra specifikus oligo-dezoxi-nukleotiddal.
Előállíthatjuk a deszulfato-hirudin gént kémiai szintézissel is. Ekkor a kódoló szegmenst és a komplementer szálat kémiai úton állítjuk elő, és a kapott szegmenseket enzimatikusan alakítjuk át a deszulfatohirudin struktúrgénjévé.
A dezoxi-ribonukleinsav kémiai szintézise jól ismert az irodalomban, és ismert módszerekkel végezzük. Megfelelő technikákat közöl Narang [Tetrahedron, 39, 3 (1983)]. Előnyösen használhatjuk például a 146785 számú európai szabadalmi leírásban megadott módszereket, amelyeket a jelen leírásban referencia irodalomként kezelünk.
Ugyancsak előállíthatjuk kémiai szintézissel a szignál szekvenciát is, de izolálhatjuk ezt egy megfelelő élesztő sejt kromoszomális dezoxi-ribonukleinsavából is.
3. A deszulfato-hirudin és egy szignál peptid kódoló régióit tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav hibrid vektor előállítása
A találmány szerinti eljárás keretében egy olyan hibrid vektort állítunk elő, amely egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav inszertet tartalmaz, amely áll élesztő expressziós szabályozó szekvenciából, egy második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciával leolvasási fázisban levő, és attól 5’-irányban elhelyezkedő szignálpeptidet meghatározó első dezoxi-ribonukleinsav szekvenciából, és egy fenti második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciából, amely az érett deszulfato-hirudint határozza meg, és amely szegmens és adott expressziós szabályozó-szekvencia transzkripciós kontrollja alatt áll, továbbá élesztő transzkripciós terminációs jeleket hordozó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciából.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott hibrid vektorokat hibridplazmidok és lineáris dezoxi-ribonukleinsav vektorok közül választjuk ki, majd tovább-szelektáljuk annak megfelelően, hogy élesztő gazdasejtet akarunk transzformálni.
A találmány szerinti eljárásban egy olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav vektor is szerepel, amelynek egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav inszertje tartalmaz egy élesztő expressziós szabályozó-szekvenciát, egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szegmenst, amely áll egy, a második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciával leolvasási fázisban lévő és attól 5’-irányba eső, egy szignálpeptidet leíró első dezoxi-ribonukleinsav szekvenciából, az adott második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciából, amely az érett deszulfato-hirudint kódolja, és amely dezoxi-ribonukleinsav szegmens az adott expressziós szabályozó-szekvencia transzkripciós kontrollja alatt áll. A dezoxi-ribonukleinsav szekvencia tartalmaz továbbá élesztő transzkripciós terminációs jeleket; az említett expressziós szabályozó-szekvencia és a transzkripciós terminációs jeleket hordozó rész azonos élesztő génből származik. Részletesebben, a találmány szerint olyan lineáris dezoxi-ribonukleinsav vektort alkalmazunk, amely áll az élesztő PHO5 promoteréből, a fenti dezoxi-ribonukleinsav szegmensből, és a PHO5 3’ túlnyúló régiójából.
A 3’ és 5’ homológ szegély-szekvenciák folytán a teljes lineáris dezoxi-ribonukleinsav vektor, beleértve a szignálpeptidet és a deszulfato-hirudint leíró régiókat, stabilan integrálódik az élesztő kromoszómájába, azaz PHO5 promoter és a PHO5 gén 3’ rész-szekvenciája esetén az élesztő II kromoszóma PHO5 lókuszába.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott hibrid vektorok egy vagy több olyan dezoxi-ribonukleinsav inszertet tartalmaznak, amelyek hordozzák az expressziós szabályozó szekvenciát, szignál pepiidet kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát és egy olyan szekvenciát, amely érett deszulfato-hirudint határoz meg. Ha a hibrid vektor többszörös dezoxi-ribonukleinsav inszertet tartalmaz, előnyösen 2-4 inszertet, úgy ezek tandem elrendeződésben, vagy a hibrid vektor különböző helyein helyezkedhetnek el. Az előnyös hibrid vektorok egy dezoxi-ribonukleinsav inszertet, vagy tandem elrendezésben több inszertet tartalmaznak. A dezoxi-ribonukleinsav inszertek elsősorban úgy rendeződnek el, hogy a különböző részek eleje és vége kapcsolódik.
A hibrid vektorok előállítása során egy vagy több, alábbi szekvenciákat tartalmazó dezoxi-ribonukleinsavat kapcsolunk: élesztő expressziós szabályozó szekvencia, egy második, érett deszulfato-hirudint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciával leolvasási fázisban levő és 5’-irányban elhelyezkedő, szignálpeptidet kódoló első dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav szegmens, ahol a szegmens az adott expressziós szabályozó-szekvencia
HU 209 146 Β transzkripciós kontrollja alatt áll, továbbá egy dezoxiribonukleinsav szekvencia, amely élesztő transzkripciós terminációs jeleket tartalmaz. A fenti szekvenciákat egymás után előre meghatározott sorrendben vektor dezoxi-ribonukleinsavba építjük be.
A találmány szerinti lineáris dezoxi-ribonukleinsav vektorok részletes ismertetését a példákban adjuk meg.
4. Transzformált élesztő gazdasejt
A találmány szerint olyan transzformált élesztő gazdasejtet alkalmazunk, amelyet az alábbi szekvenciákat tartalmazó hibridvektorral transzformáltunk: egy vagy több olyan dezoxi-ribonukleinsav inszert, amely egy élesztő expressziós szabályozó-szekvenciát, egy dezoxi-ribonukleinsav szegmenst, amely hordoz egy második, és az érett deszulfato-hirudint kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvenciától 5’-irányba eső, és azzal leolvasási fázisban levő, szignálpeptidet meghatározó első dezoxi-ribonukleinsavat, ahol a dezoxi-ribonukleinsav szegmens az adott expressziós szabályozó-szekvencia transzkripciós kontrollja alatt áll, továbbá egy dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely élesztő transzkripciós terminációs jeleket hordoz.
Előnyös gazdasejtek különösen az alábbi élesztők: Kluyveromyces, Candida, Pichia, Yarrowia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis és a rokon genusok [Lodder, The Yeasts, Amsterdam (1971)], különösen a Saccharomyces cervisiae törzsek.
Az élesztő gazdasejtek közül szelektáljuk azt a transzformált élesztő gazdasejtet, amelyet az alábbi szekvenciákat tartalmazó hibridplazmiddal transzformáltunk, és amelyekben az egyes dezoxi-ribonukleinsav inszertek egy vagy több példányban vannak jelen: élesztő expressziós szabályozó-szekvencia, egy második, az érett deszulfato-hirudint kódoló dezoxi-ribonukleinsav szekvenciától 5’-irányba eső, és azzal leolvasási fázisban levő első, egy szignálpeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely dezoxiribonukleinsav szegmens az adott expressziós szabályozó-szekvencia kontrollja alatt áll, továbbá egy dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely élesztő transzkripciós terminációs jeleket hordoz. Ideértjük azokat az élesztő gazdasejt transzformációkat is, amelyek az adott dezoxi-ribonukleinsav inszertet (inszerteket) stabilan integrálódott formában hordozzák a kromoszómában.
A fenti transzformált élesztő gazdasejtek előállítására úgy . járunk el, hogy élesztő gazdasejteket transzformálunk egy olyan hibrid vektorral, amely egy vagy több, alábbi szekvenciákat hordozó dezoxi-ribonukleinsav inszertet tartalmaz: egy élesztő expressziós szabályozó-szekvencia, egy második, az érett deszulfato-hirudint kódoló, és attól 5’-irányba eső és avval leolvasási fázisban levő, egy szignálpeptidet meghatározó első dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav szegmens, amely szegmens az adott expressziós szabályozó szekvencia transzkripciós kontrollja alatt áll, továbbá egy olyan dezoxi-ribonukleinsav szekvencia, amely élesztő transzkripciós terminációs szignálokat tartalmaz.
Az élesztő gazdasejtek hibridvektorokkal való transzformációját például Hinnen és munkatársai szerint végezzük [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75,1929 (1978)]. Ez a módszer három lépésből áll:
1. különböző glükozidázokkal, például csigabél enzimekkel (például Glusulase® vagy Helicase®), vagy mikroorganizmusokból nyert enzimkeverékekkel (például Zymolyase®) eltávolítjuk az élesztő sejtfalát vagy annak egy részét, ozmotikusán stabilizált oldatokban (például 1 mólos szorbit-oldatban).
2. Az úgynevezett „meztelen” élesztő sejteket (szferoplasztokat) dezoxi-ribonukleinsav vektorral elegyítjük PEG (polietilén-glikol) és kalcium-ionok jelenlétében.
3. Regeneráljuk a sejtfalat, és szelektáljuk a transzformáit sejteket agamai készült szilárd halmazállapotú táptalajon. A regenerálást ismert módon végezzük úgy, hogy a szferoplasztokat szélesztjük az agaron. Például úgy járunk el, hogy a körülbelül 50 °C hőmérsékletű felolvasztott agart összekeverjük a szferoplasztokkal. Kihűlést követően az élesztőt megfelelő hőmérsékleten (például 30 °C-on) növesztjük, a szilárd halmazállapotú rétegen. Az agar réteg megakadályozza a gyors diffúziót, és az eszenciális makromolekulák kijutását a szferoplasztokból, és ezzel elősegíti a sejtfal regenerálódását. Regenerálhatjuk a sejtfalat azonban (bár kisebb hatékonysággal) úgy is, hogy a szferoplasztokat egy előre elkészített agar-réteg felületére juttatjuk.
Előnyösen a regenerálásra szolgáló agart úgy készítjük, hogy az egyidejűleg lehetővé tegye a transzformáit sejtek regenerálását és szelekcióját is. Mivel szelektív markerként (lásd előbb) olyan élesztő géneket használunk, amelyek aminosav-bioszintézisben részt vevő enzimeket kódolnak, a regenerációt előnyösen élesztő minimál táptalajban végezzük. Ha nagy hatékonyságú regenerációra van szükségünk, úgy a következő két lépést iktatjuk be:
1. A sejtfal regenerálása táptalajban gazdag komplex médiumban; és
2. a transzformált sejtek szelektálása replikázással, szelektív agar lemezeken.
Ha a fentiekben ismertetett dezoxi-ribonukleinsav vektort használjuk az élesztő gazdasejtek transzformálására, úgy a transzformálást előnyösen egy olyan második vektor jelenlétében végezzük, amely élesztő szempontjából szelektív markert hordoz. Ez az együttes transzformáció elősegíti azon sejtek felhalmozódását, amelyek a direkt szelektálásra alkalmatlan dezoxiribonukleinsavat felvették. Mivel a kompetens sejtek? bármilyen típusú dezoxi-ribonukleinsavat nagy %-ban felvesznek, a szelektív vektort hordozó sejtek további (esetünkben a fenti lineáris dezoxi-ribonukleinsav vektort) dezoxi-ribonukleinsavat is hordoznak.
A transzformált élesztő gazdaorganizmusok, előnyösen a transzformált élesztősejtek, amelyek tartalmazzák a deszulfato-hirudin gént hordozó lineáris dezoxi-ribonukleinsav vektort kromoszómájukban integrálva, a deszulfato-hirudin termelés növelésére mutációval vagy ismert módon végzett szelekcióval tovább9
HU 209 146 Β fejleszthetők. A mutációt például ultraibolya fénnyel való besugárzással, vagy megfelelő kémiai reagenssel váltjuk ki. Különösen előnyös, ha proteáz hiányos élesztő mutánst állítunk elő; így elkerüljük a termelt deszulfato-hirudin proteolitikus degradálódását a sejten belül. Megfelelő mutánsokat szelektálhatunk és izolálhatunk az ismert módszereket használva.
A találmány tárgya tehát eljárás deszulfato-hirudin előállítására, és izolálására.
A következőkben a mellékelt ábrákra hivatkozva részletesen ismertetjük a találmány különböző kiviteli változatait. A mellékelt ábrák a következők: az 1. és 2. ábrán sematikusan mutatjuk be az ML300 és
ML305 jelű plazmidok előállítását; a 3. ábrán a trp promotert hordozó pHRil48 előállítását mutatjuk be;
a 4. ábrán látjuk az ML310 expressziós plazmid előállításának módját;
az 5. ábrán sematikusan szemléltetjük az érett deszulfato-hirudint kódoló dezoxi-ribonukleinsav fragmens izolálását;
a 6. ábrán sematikusan szemléltetjük a deszulfato-hirudin szekretálására használható expressziós plazmid előállítását;
a 7. ábrán látjuk a deszulfato-hirudin intracelluláris expressziójára használt expressziós plazmid előállítását;
a 8. ábrán mutatjuk be a pHO5 promoter régiót hordozó pHO5 fragmens BamHI-Sall restrikciós fragmensének képét;
a 9. ábrán látjuk a GAPDH gén promoter régiójának dezoxi-ribonukleinsav szekvenciáját;
a 10. ábrán sematikusan mutatjuk be a GAPDH-EL . plazmid előállítását;
all. ábra mutatja a GAPDH-FL és GAPDH-EL plazmidokban jelen levő GAPDH promoter fragmens szekvenciáját;
a 12. ábrán mutatjuk be a JDB207/PHO5(Eco)-HIR plazmid előállítását;
a 13. ábrán sematikusan szemléltetjük a JDB207/PAPEL-HIR(UAS1 + UAS2) plazmid előállítását;
a 14. ábrán látjuk a JDB207/[GAPEL-HIR]D plazmid előállítását; és a 15. ábrán szemléltetjük a JDB207/GAPFL-I-HIR plazmid előállítását.
Az ábrákon az alábbi rövidítéseket használjuk: p: promoter, SS: szignál szekvencia, t: terminátor, L: linker. ‘/q _
A következőkben példákkal szemléltetjük a találmány szerinti eljárást. A példák szemléltetőek, és a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.
A példákban az alábbi rövidítéseket használjuk: TNE 100 mmól nátrium-kloridot, 50 mmól triszhidro-kloridot, pH=7,5 és 5 mmól EDTA-t tartalmazó oldat,
SDS nátrium-dodecil-szulfát,
EDTA etilén-diamin-tetraecetsav,
DTT 1,4-ditio-treitol (1,4-dimerkapto-2,3 -butándiol),
BSA borjúszérum albumin,
EtBr etídium-bromid, trisz trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán, trisz-hidroklorid trisz-monohidro-klorid.
1. példa
A védett nukleozid-polisztirol gyanta előállítása ml abszolút piridinben 2,57 g (5 mmól) 5’-(4-metoxi-tritil)-timidint oldunk, majd 750 mg borkősav-anhidridet és 910 mg 4-dimetil-amino-piridint adunk az oldathoz, majd 16 órán át szobahőmérsékleten tartjuk az elegyet. A (IV) képletű vegyület előállítására a továbbiakban úgy járunk el, hogy a piridin-oldatot töményítjük, 200 ml etil-acetátban felvesszük, kétszer rázás közben 200 ml 0,1 mólos foszfát-pufferral extraháljuk, mindkét esetben 10 ml telített, vizes nátrium-klorid-oldatot adagolunk. Az extraktumot telített, vizes nátrium-klorid-oldattal mossuk, vízmentesítjük, töményítjük, és cseppenként hexánt adagolunk hozzá. A kivált terméket elkülönítjük és éterrel kétszer mossuk, ezután 300 ml etil-acetátban oldjuk, és rázás közben 0 °C hőmérsékleten 180 ml pH=2,5, 0,1 mólos kálium-biszulfit-oldattal extraháljuk. Kétszer vízben mossuk az oldatot, az etil-acetátos oldatot ezután nátrium-szulfáttal vízmentesítjük, szűrjük, 0,5 ml piridint adunk hozzá, és az egész oldatot töményítjük, majd cseppenként adagolt hexánnal hígítjuk. A kivált savszármazékot szűréssel elkülönítjük.
g előállított terméket 100 mg N-hidroxi-szukcinimiddel 4 ml etil-acetát és 2 ml dimetil-formamid elegyében oldjuk, és az oldathoz 0 °C hőmérsékleten 370 mg N,N’-diciklohexil-karbodiimidet adunk. Egy éjszakán át hűtőszobában hagyjuk állni az elegyet, a kivált Ν,Ν’-diciklohexil-karbamidot szűréssel elkülönítjük, a szűrletet etil-acetáttal hígítjuk, 0,1 mólos nátrium-bikarbonát-oldattal és vízzel extraháljuk, vízmentesítjük és csökkentett térben desztillálva szárazra pároljuk. A desztillációs maradékot szilikagélen etilacetáttal kromatografáljuk. A vékonyréteg-kromatográfiás Rf-érték 0,45 diklór-metán és metanol 9:1 arányú kifejlesztő elegyet használva.
100 mg N-szukcinimidoil borostyánkősav-észtert 20 órán át 1 g amino-metil-polisztirénnel (amin-tartalom: 110 gmól/g) keverünk 2 ml diklór-metán és 4 ml dimetil-formamid elegyében. A polimer gyantát kiszűrjük, és dimetil-formamiddal, metanollal, diklórmetánnal és metanollal extrahálva mossuk. Szárítást követően a nem reagált aminocsoportokat acetilezzük úgy, hogy a gyantát 6 ml piridin és 1 ml ecetsav-anhidrid elegyében 100 mg 4-dimetil-amino-piridin jelenlétében 30 percen át keverjük. A polimer gyantát diklórmetánnal, dimetil-formamiddal, metanollal és diklórmetánnal mossuk, és addig szárítjuk, míg tömege nem változik. A spektroszkopikus metoxi-tritil-meghatározás eredménye: 57 pmól/g.
2. példa
Az (V) képletű védett nukleozid/polisztirén gyantát állítjuk elő az 1. példában megadott módon.
Az előállítást 5’-(4-metoxi-tritil)-N-izobutiril-dezoxi-guanozinból végezzük. Feltöltés: 32 pmól/g.
HU 209 146 Β
3. példa
A (VI) képletű trinukleotid szintézise
a) A dinukleotid szintézise
7,73 g (15 mmól) 5’-(4-metoxi-tritil)-timidint (MNT-O-T-OH) kétszer vízmentes piridinnel desztillálunk és töményítünk. A desztillációs maradékot 20 ml vízmentes tetrahidro-furánhoz adjuk, és keverés közben tetrahidro-furánban 80 ml 0,2 mólos 2-klór-fenildi-(l-benzo-tri-azolil)-foszfátot adagolunk. Az adagolás közben eltávolítjuk a nedvességet, és a reakcióelegyet 1 órán át keverjük szobahőmérsékleten. A kapott oldatot, amely 2-klór-fenil-l-benzotriazolil-5’-(4metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfátot tartalmaz, ezután három részre osztjuk.
A) Hidrolízis trietil-ammónium-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’ -foszfáttá:
A fentiek alapján készült oldat harmadához 100 ml 0,5 mólos trietil-ammónium-bikarbonát-oldatot adunk, miközben hűtjük az elegyet. 15 percen át diklór-metánnal extrahálunk. A diklór-metános oldatot vízzel mossuk, töményítjük, és ezután cseppenként petrolétert adagolunk. A kivált csapadékot szűréssel elkülönítjük, éter és petroléter 1:1 arányú elegyével extraháljuk, majd a mosást követően csökkentett nyomású térben szárítjuk.
A vékonyréteg-kromatográfiás Rrérték: 0,35; a futtatást diklór-metán, metanol és víz 75:22:3 arányú elegyével végezve.
B) Észterezés 2-ciano-etil-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’ -foszfáttá és a 4-metoxi-tritil-védöcsoport eltávolítása:
A 2-klór-fenil-1 -benzotriazolil-5 ’-(4-metoxi-tritil)timidin-3’-foszfát-oldatunk harmadához 1,3 ml 2-cia• no-etanolt és 2 ml piridint adunk. Egy éjszakán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni az elegyet. Az oldószereket csökkentett nyomású térben desztillálva eltávolítjuk, és a desztillációs maradékot etil-acetátban oldjuk, majd rázás közben extraháljuk, 0,1 mólos pH=7 foszfát-pufferrel, majd vízzel. Vízmentesítjük a szerves oldószeres fázist, töményítjük, és cseppenként hexánhoz adjuk. Szűréssel eltávolítjuk a csapadékot, diklórmetán és metanol 7:3 arányú elegyének 50 ml-ében oldjuk 0 °C hőmérsékleten, majd ezután 75 ml diklórmetán és metanol 7:3 arányú elegyében oldott 3,8 g p-toluol-szulfonsav-monohidrátot adunk hozzá. 2 óra múlva diklór-metánnal hígítjuk a reakcióelegyet, és ezután rázással hideg nátrium-bikarbonát-oldattal extraháljuk. A szerves oldószeres fázist töményítjük, és hexánt adunk hozzá. A kivált 2-ciano-etil-2-klór-feniltimidin-3’-foszfát csapadékot szilikagélből készült oszlopon kromatografáljuk, az eluálást diklór-metán és metanol 96:4 arányú elegyével végezzük.
A termék vékonyréteg-kromatográfiás Rrértéke: 0,45, a futtatást diklór-metán és metanol 9:1 arányú elegyével végezve.
C) 5’-(4-Metoxi-tritil)-3’-ciano-etil-bisz-timidin-dinukleotiddá való kondenzálása:
2,2 g 2-ciano-etil-2-klór-fenil-timidin-3’-foszfátot vízmentesítünk úgy, hogy kétszer koncentráljuk abszolút piridin jelenlétében desztillálva, a terméket 20 ml vízmentes tetrahidro-furánban oldjuk, és ezt az oldatot hozzáadjuk a 2-kIór-fenil-l-benzotriazolil-5’-(4-metoxi-tritil)-timidin-3’-foszfát-oldatunk utolsó harmadához. 18 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk állni a reakcióelegyet, majd 10 ml vizet és 200 ml etil-acetátot adunk a reakcióelegyhez, hűtés közben. A hűtést jégfürdővel biztosítjuk. A szerves oldószeres fázist nátrium-bikarbonát-oldattal és vízzel többször mossuk, nátrium-szulfáttal vízmentesítjük, és a lehető legkisebb térfogatra töményítjük. Az 5’ - és 3’-végen védett foszfátcsoportot tartalmazó dinukleotidot úgy csapjuk ki, hogy cseppenként éter és hexán 1:1 arányú elegyét adagoljuk. A termék vékonyréteg-kromatográfiás Rfértéke 0,48, a futtatást diklór-metán és metanol 9:1 arányú elegyével végezve.
b) A trinukleotid szintézise
1,17 g (1 mmól) fentiek szerint előállított, teljesen védett dinukleotid 30 ml diklór-metán és metanol 7:3, arányú elegyéből készült elegyben oldjuk, és jégfürdőben 1,9 g, diklór-metán és metanol 7:3 arányú elegyének 20 ml-ében oldott p-toluol-szulfonsav-monohidrátot adunk hozzá. 2 óra múlva jéghideg nátrium-bikarbonát-oldatot adagolunk, és diklór-metánnal extrahálunk. A szerves oldószeres fázist vízmentesítjük, töményítjük, és cseppenként hexánhoz adjuk. A kivált nyers dinukleotidot (5’-hidroxil-csoportja szabad) szilikagéloszlopon kromatografáljuk, az eluálást 2-8% metanolt tartalmazó diklór-metán gradienssel végezzük.
A termék vékonyréteg-kromatográfiás Rf-értéke: 0,33, a futtatást diklór-metán és metanol 9:1 arányú elegyével végezve.
850 mg így előállított 5’-hidroxi-dinukleotidot és 1,06 g trietil-ammónium-2-klór-fenil-5’-(4-metoxi-tritil)-timídin-3 ’-foszfátot [lásd a) pont A) pontja] kétszer koncentrálunk piridinnel desztillálva, majd 10 ml vízmentes piridinben oldjuk, és 560 mg 1-mezitilén-szulfonil-3’-nitro-l,2,4-triazolt adagolunk. 2 óra múlva 2 ml jéghideg vizet adunk az elegyhez, majd további 1 óra múlva diklór-metánnal extrahálunk. A szerves oldószeres fázist telített, vizes nátrium-bikarbonát-oldattal és vízzel extraháljuk, vízmentesítjük, töményítjük és étert adunk hozzá. A kivált trinukleotidot szilikagél-oszlopon kromatografálva tisztítjuk.
Az előállított termék Rf-értéke: 0,45, a kifejlesztést diklór-metán és metanol 9:1 arányú elegyével végezve.
4. példa
Á 3. példában megadottak analógiájára a (VII) képletű védett trinukleotidokat állítjuk elő. A nukleozidokat B ’B2B3 jellel jelöljük. A nukleozidokra vonatkozóan az alábbi rövidítéseket használjuk:
A N-benzoil-dezoxi-adenozin,
C N-benzoil-dezoxi-citidin,
G 'N-izobutiril-dezoxi-guanozin,
T timidin.
Az alábbi táblázatban megadjuk az egyes vegyületek szilikagél vékonyréteg-kromatográfiás Rrértékét, a futtatást diklór-metán és metanol 9:1 arányú elegyével végezve.
HU 209 146 Β
Táblázat
Vegyület Rf Vegyület Rf
TTT 0,45 ATG 0,48
TTC 0,55 ACT 0,53
TCT 0,46 ACC 0,48
TAC 0,56 ATT 0,55
TGC 0,44 ACA 0,53
TAG 0,60 AAC 0,46
TGT 0,42 AAA 0,51
TGA 0,44 AGT 0,45
CTT 0,53 AGG 0,38
CTG 0,46 GTT 0,45
CCT 0,45 GTC 0,44
CCC 0,59 GTG 0,35
CCG 0,47 GCA 0,49
CCA 0,51 GCG 0,48
CAT 0,55 GAT 0,44
CAC 0,51 GAC 0,48
CGC 0,46 GAG 0,48
CGA 0,38 GAA 0,50
CAG 0,44 GGC 0,42
CGG 0,38 GGT 0,46
CGT 0,49 GGG 0,35
GGA 0,44
5. példa
A 96/97 dezoxi-ribonukleinsav szál 96. bázisától a
162. bázisig terjedő, 67 bázishosszúságú dezoxi-ribonukleinsav fragmens szintézise
a) A trinukleotidok 2-ciano-etil-védőcsoportjának eltá- 40 volítása
A 3. vagy 4. példában megadottak szerint előállított trinukleotid 10 pmólját 60 μΐ, vízmentes piridin, acetonitril, trietil-amin 1:1:1 arányú elegyében oldjuk.
órán át szobahőmérsékleten tartjuk az oldatot, majd 45 cseppenként 0,7 ml peroxid-mentes étert adunk hozzá, a kivált csapadékot centrifugálással eltávolítjuk. A nyers trietil-ammónium-sót 50 μΐ piridinben oldjuk, és
0,5 ml éterrel újra kicsapjuk, a csapadékot centrifugálással elkülönítjük, és 15 órán át csökkentett nyomású térben szárítjuk.
b) A részlegesen védett trinukleotidok kapcsolása a polisztirol gyantához kötött oligonukleotid lánchoz Az összes reakciót 220 μΐ kapacitású reakcióedényben végezzük, a víz teljes kizárásával, egy mikroprocesszorral szabályozható oldószer és reagens adagoló rendszert használva. A reakcióedénybe 13 mg (0,74 μιηόΐ), az 1. példában megadottak szerint előállított timidin/polisztirol gyantát helyezünk, majd a következő műveleti lépéseket végezzük el:
1. metilén-klorid, 2 ml/perc, 4 perc.
2. Metilén-klorid/izopropanol (85:15), 2 ml/perc, perc.
3.1 mólos cink-bromid és metilén-klorid és izopropanol 85:15 arányú elegyében oldott, 0,02 mól
1,2,4-triazol, 2 ml/perc, 2-3,5 perc.
4. Metilén-klorid és izopropanol 85:15 arányú elegye, 2 ml/perc, 4 perc.
5. Dimetil-formamiddal készült, 0,5 mólos trietil-ammónium-acetát, 2 ml/perc, 5 perc.
6. Molekulaszűrővel szárított piridin, 2 ml/perc, perc.
7. Tetrahidro-furán (peroxid-mentes, molekulaszűrővel kezelt, és vízmentes), 2 ml/perc, 3 perc.
8. Nitrogénáram, 10 perc.
9.10 μπιόΐ GTC trinukleotid [az a) pont szerint készült trimetil-ammónium-só] és 150 μΐ piridinben oldott, 8,9 mg (30 μιηόΐ) l-mezitilén-szulfonil-3nitro-l,2,4-triazol.
10.45 ’C, 20 perc.
11. Piridin, 2 ml/perc, 4 perc.
12.5% ecetsav-anhidrid és piridinben oldott, 2,5% 4dimetil-amino-piridin, 2 ml/perc, 4 perc.
13. Piridin, 2 ml/perc, 4 perc.
14. Piridin és izopropanol 1:1 arányú elegye, 2 ml/perc, 3 perc.
Mind a 14 lépést 21-szer megismételjük, de a 9. lépésben a GTC helyett sorrendben az alábbi trietilammónium-sóként létező trinukleotidokat adagoljuk: GCA, ACC, GAA, CCC, TAC, AGG, TGA, CGC, TAC, CGT, GTG, CCA, AAA, AAA, TGA, CGG, TGA, TTC, GGG, CCT, CAT.
A kapcsolás után a hozam: 97%. A végtermék a következő szerkezetű:
MMT-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCCTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAG
TCT-polisztirol.
c) A dezoxi-ribonukleinsav jragmens eltávolítása a hordozóról, és a védőcsoportök lehasítása 40,0 mg (körülbelül 0,60 μιηόΐ) dezoxi-ribonukle- 55 insav szintézis 96/97 jelű gyantát 3 órán át 50 ’C hőmérsékleten tartunk, majd 12 órán át szobahőmérsékleten 66 mg (0,4 mmól) orto-nitro-benzaldoximmal és 50 μΐ (0,4 mmól) 1,1,3,3-tetrametil-guanidinnal reagáltatunk 400 μΐ 95%-os piridinben. A piridint nitrogénárammal eltávolítjuk, és a termékhez
1,6 ml vizes, 33%-os ammónia-oldatot adunk, majd 24 órán át 50 ’C hőmérsékleten tartjuk az elegyet egy zárt tartályban.
Az elkülönült, folyékony fázist csökkentett nyomású térben ammónia-mentesítjük, és háromszor 3 ml peroxid-mentes dietil-éterrel mossuk. Biogel P6 60 oszlopon (100-200 mesh, 3x66 cm, 0,01 mólos tri12
HU 209 146 Β metil-ammónium-bikarbonát, pH = 7,5, 1,5 ml/perc) eltávolítjuk az alacsony molekulatömegű összetevőket, majd izoláljuk a dezoxi-ribonukleinsavat (285 OD, 260 nm).
OD-nyi mennyiséget HPLC oszlopon (PRP4/Hamilton, 250x4,6 mm) elkülönítünk. Gradiensként 30% B-oldatot használunk A-oldattal készítve, és 60% B-oldatot A-oldattal készítve. Az A-oldat öszszetétele a következő: 0,05 mól trietil-ammónium-acetát, pH=7,0. A B-oldat összetétele: A-oldat és acetonitril 1:1 arányú elegye. Az eluálást 20 percen át végezzük 50 °C hőmérsékleten, 2 ml/perc sebességgel. A lipofil fő csúcs (retenciós idő: 14 perc) oldatait összegyűjtjük, DE52 cellulózzal (Whatman) töményítjük, eluáljuk az oszlopról, és etanollal kicsapjuk. A 4-metoxi-tritil-védőcsoport hasítására a csapadékot ecetsav és víz 4:1 arányú elegyének 50 μΐ-ében oldjuk, az oldatot 45 percen át szobahőmérsékleten tartjuk. Fagyasztva szárítjuk a reakcióterméket, etanollal kicsapjuk, és tisztítás céljából 8% poliakril-amidot tartalmazó gélen (7 mól karbamid) elektroforetikusan elkülönítjük. A kívánt dezoxi-ribonukleinsavnak megfelelő csí10 kot kivágjuk, a terméket elektroeluáljuk, DE52 cellulóz felett töményítjük, amiután megkapjuk az alábbi szerkezetű, 96/97 dezoxi-ribonukleinsav terméket:
5’-CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTC
T-3’.
A terméket etanollal csapjuk ki. fragmenseket állítjuk elő az 5. példában megadottak szerint eljárva:
6. példa
A következő, 5’-3’-irányú dezoxi-ribonukleinsav
1/58
CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGT
46/64 komplementer
CAGAACCCAGGATGCATTTGTTACCCTGACCGCAAACGTTAGAACCTTCGCACAGGCACAGGTT
154/64 komplementer
CAGCATCCTACTGCAGGTATTCTTCCGGGATTTCTTCGAAGTCACCGTCGTTGTGAGACTGCGG
7. példa
Az 1/58, 46164 komplementer, 96167 és 154/65 komplementer fragmensekfoszforilezése A foszforilezést és az 5’-végek radioaktív jelzését [gamma32P]ATP és T4 polinukleotid kináz (Boehringer) enzimet használva az alábbi irodalomban megadottak szerint végezzük: Molecular Cloning, A laboratory Manual (Maniatis és munkatársai), Cold Spring HarborLab. (1982), 125. oldal.
8. példa
AII. duplex (a deszulfato-hirudin HV1 gén F2fragmense) előállítása polimerizálással pl vízben 50-50 pmól kinázzal kezelt 96/67 és kinázzal kezelt 154/64 fragmenst oldunk, az oldatot 90 °C hőmérsékleten tartjuk 30 percen át, majd 5 perc alatt 12 °C hőmérsékletre hűtjük.
μΐ alábbi összetételű endo-R puffért adagolunk: 0,1 mólos trisz-hidro-klorid-oldat,-.pH=7,5, mM magnézium-klorid, mM β-merkapto-etanol,
0,6 M nátrium-klorid.
Az elegyhez 10 pl dezoxi-nukleozid-trifoszfát-elegyet (dATP, dCTP, dGTP, TTP, 2xl0’3 mól, az oldatok pH-ját ammónium-oldattal 7,0-re állítjuk be), 2 pl (10 egység) dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I, Klenow-fragmenst (Boehringer) adagolunk, és 30 percen át 12 °C hőmérsékleten inkubálunk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy az elegyet 90 °C hőmérsékleten tartjuk , 3 percen át, ezután -80 °C hőmérsékleten tároljuk, további felhasználásig.
A fentiekhez hasonlóan eljárva, az 1/58 és 46/64 kinázzal kezelt fragmenseket reagáltatjuk, és duplexszé (duplex I, a deszulfato-hirudin gén F! fragmense).
A duplex I és II az alábbi szerkezetű:
Az első sémán a deszulfato-hirudin gén Fj és F2 fragmenseinek előállítását mutatjuk be:
Duplex I
CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGTTC
GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCAAG
TAACGTTTGCGCTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTG
ATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGAC
HU 209 146 Β
Duplex Π
CATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTTACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTC
GTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAATGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAG
ACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAATACCTGCAGTAGGATCCTG
TGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTTATGGACGTCATCCTAGGAC
9. példa
Az 1/58, a kinázzal kezelt 46164, a kinázzal kezelt 10 96167 és a 154164 fragmensek polimerizálása és ligálása; a deszulfato-hirudin HV1 gén előállítása 50-50 pmól 1/58, kinázzal kezelt 46/64, kinázzal kezelt 96/67 és 154/64 fragmenst oldunk egyenként, μΐ vízben, az oldatot 3 percen át 90 °C hőmérsékle- 15 ten tartjuk, majd 5 percen belül 12 °C hőmérsékletre hűtjük. 8 μΐ endo-R puffért (lásd a 8. példát) adagolunk, majd 20 μΐ dezoxi-nukleotid trifoszfát elegyet (dATP, dCTP, dGTP, TTP, 0,002 mól minden esetben, az oldat pH-ját vizes ammónia-oldattal 7,0-re állítjuk 20 be) és 2 μΐ (10 egység) dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I, Klenow-fragmenst (Boehringer). 30 percen át 12 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. A reakció leállítására 3 percen át 90 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavat fenol 25 és kloroform elegyével való extrakciót követően etanolos kicsapással izoláljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsav elegyet 100 μΐ ligáz-pufferben oldjuk, ennek összetétele a következő:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5,
6,6 mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
5mMATP, egység (2 μΐ) T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs).
órán át 20 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. A reakció leállítására 5 percen át 70 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, fenol és kloroform elegyével extraháljuk, majd a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. 8% poliakril-amid gélen elkülönítjük az elegy alkotórészeit, és elektroforézis után a 217 bázispárt tartalmazó ligációs terméket elektroeluáljuk, DE52 cellulóz oszlopon töményítjük, és eluálást követően etanollal kicsapjuk.
A deszulfato-hirudin gén szerkezete a következő:
CTGGAATTCATGGTTGTTTACACCGACTGCACCGAATCTGGTCAGAACCTGTGCCTGTGCGAAGGT
GACCTTAAGTACCAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTAGACCAGTCTTGGACACGGACACGCTTCCA
TCTAACGTTTCCGGTCAGGGTAACAAATGCATCCTGGGTTCTGACGGTGAAAAAAACCAGTGCGTT
AGATTGCAAACGCCAGTCCCATTGTTTACGTAGGACCCAAGACTGCCACTTTTTTTGGTCACGCAA
ACCGGTGAAGGTACCCCGAAACCGCAGTCTCACAACGACGGTGACTTCGAAGAAATCCCGGAAGAA
TGGCCACTTCCATGGGGCTTTGGCGTCAGAGTGTTGCTGCCACTGAAGCTTCTTTAGGGCCTTCTT
TACCTGCAGTAGGATCCTG
ATGGACGTCATCCTAGGAC
A 2. sémán bemutatjuk a deszulfato-hirudin gén előállítását a négy fragmensből.
10. példa
A deszulfato-hirudin HV1 gén F\-dezoxi-ribonukleinsavát tartalmazó ML 300 plazmid előállítása (lásd 1. ábra)
a) A linearizált pBR322/EcoRI/PvuII vektor előállítása μg pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 5 egység PvuII restrikciós endonukleázzal (Biolabs) emésztünk 200 μΐ 100 μg/ml zselatint tartalmazó oldatban 1 órán át 37 °C hőmérsékleten. Ezután az oldat végkoncentrációját az alábbi vegyületekre nézve az alábbi értékre állítjuk be:
trisz-hidro-klorid (pH = 7,5); 50 mM, nátrium-klorid: 50 mM.
A dezoxi-ribonukleinsavat 30 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) kezeljük, 2 órán át 37 °C hőmérsékleten. Ezután az alábbi végkoncentrációkat állítjuk be:
mM trisz-hidro-klorid (pH = 8), és μg/μl dezoxi-ribonukleinsav.
Az elegyet 2 egység alkalikus borjú foszfatázzal (Boehringer) inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 30 percen át. Az enzim inaktiválására ezután 60 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet. Az oldathoz 20 μΐ TNE-t adunk, a kapott oldatot 1 térfogat fenollal és kloroformmal extraháljuk, és az emésztett dezoxí-ribonukleinsavat 2 térfogat etanollal -20 °C-on egy éjszakán át kicsapjuk.
A pBR322 dezoxi-ribonukleinsavból kihasadt vektort (pBR322/EcoRI/PvuII, 2297 bázispár) elkülönítjük a 2067 bázispárból álló kis dezoxi-ribonukleinsav fragmenstől, az elkülönítést 1% alacsony olvadáspontú agarózzal (Biorad) végzett gél-elektroforézissel foganatosítjuk. A gél-elektroforéziskor pH = 8 trisz-acetátetilén-diamin-tetraecetsav-puffert használunk. Etídium-bromiddal festjük az agaróz gélen lévő dezoxi-ribonukleinsavat, a pBR322/EcoRI/PvuII vektort (2297 bázispár) tartalmazó csíkot kivágjuk a gélből, és
HU 209 146 Β percen át 65 ’C hőmérsékleten tartva felolvasztjuk. Ehhez a dezoxi-ribonukleinsav-oldathoz 20 térfogat TNE-t adunk, és a dezoxi-ribonukleinsavat Mueller és munkatársai szerint tisztítjuk [J. Mól. Bioi., 124, 343 (1978)]. A tisztítást DE-52 kromatográfiával, fenol és kloroformos extrakcióval végezzük, a dezoxi-ribonukleinsavat alkohollal csapjuk ki úgy, hogy az elegyet egy éjszakán át -20 ’C hőmérsékleten tartjuk. A dezoxi-ribonukleinsav csapadékot 50 μΐ alábbi összetételű elegyben oldjuk:
0,01 M trisz-hidro-klorid (pH=8),
0,1 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
Az oldatot -20 °C hőmérsékleten tároljuk, felhasználásig.
Ily módon 1,4 pg (=3,2 pmól, végekre számítva) dezoxi-ribonukleinsavat kapunk.
b) Az ff-dezoxi-ribonukleinsav/EcoRI előállítása ng (=1,3 pmól, végekre számítva) kémiailag szintetizált Fi-dezoxi-ribonukleinsavat (lásd 8. példa) emésztünk 5 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) 50 pl, az alábbi összetételű reakcióelegyben, 30 percen át, 37 ’C hőmérsékleten:
100 mM trisz-hidro-klorid (pH = 7,5), mM nátrium-klorid, és 100 pg/ml zselatin.
Ezután 0,06 pg (=0,14 pmól, végekre számítva), a 10a példában megadottak szerint előállított, linearizált pBR322/EcoRI/PvuII vektort adagolunk az oldathoz. Az enzimet 65 ’C hőmérsékleten 10 percen át inaktiváljuk, és az oldatot TNE-t adagolva sztenderdizáljuk. Ezután fenol és kloroform elegyével extrahálunk. A dezoxi-ribonukleinsavat alkohollal csapjuk ki.
A kivált dezoxi-ribonukleinsavat alkohol alatt tartjuk -20 ’C hőmérsékleten, míg felhasználjuk.
c) A pBR322IEcoRllPvulI vektor dezoxi-ribonukleinsav kapcsolása az F \-dezoxi-ribonukleinsav!EcoRI fragmenssel és a pML300 jelű plazmid előállítása A 10. példa b) pontjában megadottak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav csapadék tartalmazza a fenti két dezoxi-ribonukleinsav fragmenst. A csapadékot 20 pl alábbi összetételű oldatban oldjuk:
mM trisz-hidro-klorid (pH = 7,8), mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
0,5 mM adenozin-trifoszfát,
100 pg/l zselatin.
Az elegyhez 25 egység/pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimet (Biolabs) adunk, és 3 órán át 15 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. így megkapjuk az Frdezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó rekombináns plazmidot (pML300).
d) Az E. coli HB101 transzformálása a pML300 plazmáddal
Az E. coli HB101 sejteket a transzformáció előtt szükség szerint kalciumionokkal kezeljük, ahogy azt Mandel és munkatársai megadják [J. Mól. Bioi., 53, 159 (1970)].
A c) pontban megadottak szerint előállított, és a rekombináns pML300 plazmidot tartalmazó oldatot 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk a T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz inaktiválására, majd 37 ’C-ra hűtjük. 10 pl reakcióelegyet adunk 150 pl, 10 mmól magnézium-kloridot és 10 mmól trisz-hidro-kloridot (pH=7,5) tartalmazó, összesen 200 pl térfogatú, 150 pl kalciumkezelt E. coli HB101 sejtszuszpenzióhoz. Ezután jégfürdőben 30 percen át hűtjük az elegyet, 2 percen át 42 ’C hőmérsékletre hevítjük, és ezután 50 percen át 1 ml Ltáptalajban hagyjuk állni 37 ’C hőmérsékleten (lásd a 18. példát). Az elegyet inkubálás után 0,2 ml alikvotonként 5 agarlemezre szélesztjük (McConkey Agar, Difco), amely 60 pg/ml ampicillint (Serva) tartalmaz. Az agartenyészeteket 16-18 órán át 37 ’C hőmérsékleten tartjuk, így 484 ampicillinre rezisztens transzformáns E. coli HB101 telephez jutunk.
e) Az F^dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó telepek kiválasztása
A 10. példa d) pontjában megadottak szerint kapott, transzformált telepek közül 470-et nitrocellulóz B85 szűrőre (Schleicher és Schull) nyomunk. Grunstein és Hogness [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72 , 3961 (1979)] szerint lizáljuk a telepeket, és denaturált dezoxi-ribonukleinsavukat fixáljuk a szűrőn. Ezután prehibridizáljuk a szűrőket úgy, hogy szűrőnként 20 ml 4xSET oldatban 0,1 tömeg% Ficoll 400 (Pharmacia), 0,5% nátrium-dodecil-szulfáttal és 50 pg/ml denaturált borjú timusz dezoxi-ribonukleinsavval kezelünk 4 órán át 64 ’C hőmérsékleten. A 4xSET-oldat összetétele a következő:
mM trisz-hidro-klorid (pH=8),
150 mM nátrium-klorid, mM etilén-diamin-tetraecetsav.
A nitrocellulóz szűrőket ezután az alábbi vegyületekkel, illetve oldatokkal kezeljük, szűrőként 20 ml-rel:
5xSET,
Ficoll 400,
0,2% nátrium-dodecil-szulfát, és pg/ml denaturált borjú timusz dezoxi-ribonukleinsav.
A kezelést 16 órán át 64 ’C hőmérsékleten végezzük, P32 radioaktívan jelzett próba jelenlétében (103104 Cerenov beütés/perc/szűrő). Próbaként a 6. példában megadott 46/64 komplementer oligonukleotidot használjuk.
- Ezután kétszer 2xSET, 0,2% nátrium-dodecil-szulfát eleggyel szobahőmérsékleten mossuk a szűrőket, a mosást 60 ’C hőmérsékleten 2xSET, 0,5% nátrium-dodecil-szulfát eleggyel megismételjük (először 30 percen át, majd 60 percen át kezelünk). A szűrőket 3 MM papírok között (Whatman) szárítjuk, és -80 ’C hőmérsékleten X-sugárzásra érzékeny filmre (Fuji) helyezzük, intenzifikáló szűrőt használva (Ilford), az előhívást 1-2 napon át végezzük.
A kapott autoradiogram 71 pozitív klón jelenlétére utal, ezeket tovább vizsgáljuk, egyiküket pML300 jellel jelöljük.
11. példa
A deszulfato-hirudin HV1 gén F^-dezoxi-ribonukleinsavát tartalmazó pML305 jelű plazmid előállítása (lásd a 2. ábrát)
HU 209 146 Β
a) A linearizált pBR322IBamHllNruI vektor előállítása pg pBR322 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 30 egység BamHI restrikciós endonukleázzal kezelünk 30 percen át, 37 °C hőmérsékleten, az alábbi összetételű reakcióelegyben:
100 mM nátrium-klorid, mM trisz-hidro-klorid (pH=7,9), mM magnézium-klorid,
100 pg/ml zselatin.
Ezután 15 egység PvuII restrikciós endonukleázt adunk az elegyhez, és 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 10 percen át 70 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, az enzim inaktiválására. Ezután gélelektroforézissel elválasztjuk egymástól a két dezoxiribonukleinsav fragmenst. Az elektroforézist 1% alacsony olvadáspontú agarózzal készült gélen végezzük, pH=8, trisz-acetát-EDTA pufferban [lásd a 10. példa
a) pontját].
A pBR322 BamHI/PvuII vektornak (2672 bázispár) megfelelő dezoxi-ribonukleinsav csíkot kivágjuk, a gélt felolvasztjuk, és Mueller és munkatársai (lásd előbb) szerint tisztítjuk DE-52 kromatográfiával. így 0,75 pg (1,5 pmól, végekre számítva) dezoxi-ribonukleinsavat kapunk.
b) Az Fy-dezoxi-ribonukleinsaviBamHI előállítása pg (1,3 pmól, végekre számítva) kémiailag szintetizált F2-dezoxi-ribonukleinsavat (lásd a 8. példát) 16 egység BamHI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) kezelünk, 20 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:
150 mM nátrium-klorid, mM trisz-hidro-klorid (pH = 7,9), mM magnézium-klorid, és
100 pg/ml zselatin.
A kezelést 30 percen át végezzük, 37 °C hőmérsékleten.
Ezután 60 ng (96 nmól, végekre számítva), all. példa a) pontja szerint előállított, linearizált pBR322/BamHI/PvuII vektor dezoxi-ribonukleinsavat adunk az elegyhez, az egész oldatot TNE-vel sztenderdizáljuk, fenol és kloroform elegyével extraháljuk. Végül két térfogat alkohollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat.
A kivált csapadékot alkohol alatt tároljuk -20 °C hőmérsékleten, felhasználásig.
c) A pBR322IBamHIIPvuII vektor dezoxi-ribonukleinsav kapcsolása az F^-dezoxi-ribonukleinsavIBamHl fragmenssel, és a pML305 jelű plazmid előállítása
All. példa b) pontjában megadottak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav csapadék tartalmazza a két fenti dezoxi-ribonukleinsav fragmenst. A csapadékot 20 pl alábbi összetételű oldatban oldjuk:
mM trisz-hidro-klorid (pH = 7,8), mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
0,5 mM adenozin-trifoszfát, és 100 pg/ml zselatin.
Az oldathoz 15 egység/pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimet (Biolabs) adunk, és 3 órán át 15 °C hőmérsékleten ligálunk. így megkapjuk az F2-dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó rekombináns pML305 plazmidot.
d) Az E. coli HB101 transzformálása a pML305 plazmiddal
A kalciumionokkal kezelt E. coli HB101 sejtek transzformálását a 10. példa d) pontjában megadottak szerint végezzük. All. példa c) pontjában megadottak szerint kapott 10 pl térfogatú reakcióelegyet használjuk. így 313 ampicillinre rezisztens telepet kapunk.
e) Az. F2-dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó telepek ke resése
All. példa d) pontjában megadottak szerint kapott telepek közül 65-öt vizsgálunk az F2-dezoxi-ribonukleinsav jelenlétére, a 10. példa e) pontjában megadottak szerint. Radioaktív próbaként a 154/64 komplementer oligonukleotidot (lásd a 6. példát) használjuk. Az autoradiogramon két pozitív telep képét látjuk, az egyiket pML305 jellel jelöljük.
12. példa
A pML300 és a pML305 kiónok jellemzése
A pML300 és a pML305 rekombináns plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat Ish-Horowitz (Molecular Cloning, A Laboratory Manual) szerint izoláljuk [Maniatis és munkatársai, Cold Spring Harbor Láb., 368. (1982)]. Az Fr és F2-dezoxi-ribonukleinsavak nukleotid szekvenciáját Maxam és Gilbert módszere szerint bizonyítjuk [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560. (1977)]; lásd továbbá Meth. Enzym., 65,499. (1980)].
Mindegyik esetben 10 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk (pML300 dezoxi-ribonukleinsav), és EcoRI restrikciós endonukleázzal hasítjuk. 10 pg pML305 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat pedig BamHI restrikciós endonukleázzal hasítunk, és a linearizált dezoxi-ribonukleinsavakat agaróz gélről gél-elúcióval izoláljuk [lásd a 10. példa a) pontját]. Ezután az izolált dezoxi-ribonukleinsavakat alkalikus foszfatázzal kezeljük, és DE-52 gyantán kromatografáljuk [lásd all. példa a) pontját]. A dezoxi-ribonukleinsavakat 5’-végükön [gamma~32P]ATP-vel radioaktívan jelezzük (specifikus aktivitás 5000 Ci/mmól, Amersham), majd T4 polinukleotid kinázzal (P-L-Biochemicals) kezelünk.
A radioaktívan jelzett dezoxi-ribonukleinsavakat ezután egy második restrikciós endonukleázzal hasítjuk (EcoRII). A kapott dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket agaróz gélről gél-elúcióval izoláljuk. A pML300 esetén az Fj-dezoxi-ribonukleinsav nukleotid szekvenciáját az EcoRII-EcoRI fragmens vizsgálatával határozzuk meg (a fragmens 109 bázispárból áll), az F2-dezoxi-ribonukleínsav szekvenciáját a pML300 plazmidban pedig az EcoRII-BamHI fragmens vizsgálatával (122 bázispár) adjuk meg.
A fragmensek természetesen a szál végén radioaktívan jelzettek.
Az F,-dezoxi-ribonukleinsav és az F2-dezoxi-ribonukleinsav meghatározott nukleotid szekvenciája azonos a 8. példában megadottal.
13. példa
A pML310 expressziós plazmid előállítása a) A trp promoter-operátor rendszert tartalmazó, linea16
HU 209 146 Β rizált pHRil48/EcoRl/BamHI vektor előállítása (lásd a 3. és 4. ábrát)
A) A pl59 plazmid előállítása pg pBRH^ (DE-OS 3111405) plazmidot 50 egység EcoRI (Biolabs) enzimmel kezelünk 60 percen át, 37 ’C hőmérsékleten. Az elegyet fenollal extraháljuk, majd szacharóz sűrűségi gradiensen (5-23%) frakcionáljuk TST41 (Kontron AG) rotorban. A szacharózt az alábbi elegyben oldjuk:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, mM etién-diamin-tetraecetsav.
A centrifugálást 14 órán át végezzük, percenként 40000-et forduló rotorban, 15 ’C hőmérsékleten. ISCO gradiens gyűjtővel 0,3 ml térfogatú frakciókat szedünk, 1 ml/perc sebességgel. A kisebb fragmenst tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, TNE adagolásával sztenderdizáljuk az oldatot, és 2 térfogat etanollal -20 ’C hőmérsékleten kicsapjuk a terméket. Eppendorf centrifugában centrifugáljuk a dezoxi-ribonukleinsavakat, majd 100 μΐ alábbi összetételű elegyben oldjuk:
mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5,
0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
pg dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 5 egység BglII enzimmel (Biolabs) hasítunk, 60 percen át, 37 °C hőmérsékleten. Fenollal és kloroformmal extraháljuk a reakcióelegyet, és a dezoxi-ribonukleinsavat 2 egység etanollal kicsapjuk, -80 ’C hőmérsékleten (10 perc). Centrifugálással összegyűjtjük a dezoxi-ribonukleinsavat, 50 pl alábbi összetételű elegyben újra feloldjuk:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 8,0.
μΐ oldatot (0,2 pg dezoxi-ribonukleinsav) elkülönítünk, és 10 ng/μΐ koncentrációban, 50 mmólos triszhidro-klorid (pH = 8,0) oldatban 1 egység alkalikus foszfatázzal inkubáljuk 30 percen át, 37 ’C hőmérsékleten. Az enzim inaktiválására 60 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk az oldatot. 0,04 pg dezoxi-ribonukleinsavat elkülönítünk, és 5’-terminális végén 10 pCi (gamma_32P)-adenozin-trifoszfáttal (5000 Ci/mmól, Amersham) jelzünk. 5 egység T4 polinukleotid kináz (P-L-Biochemicals) jelenlétében, 20 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:
mM trisz-hidro-klorid (pH=9,5), mM magnézium-klorid, és 5 mM ditio-treitol.
Az inkubálást 30 percen át végezzük 37 ’C hőmérsékleten. A radioaktív mintát nem jelzett mintával (lásd előbb) keverjük, és a dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 5-23 %-os szacharóz sűrűségi gradiensen frakcionáljuk, TST60 rotorban, és az alábbi összetételű elegyben:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, mM etilén-diamin-tetraecetsav.
A centrifugálást 5 órán át percenként 60000-et forduló rotorban végezzük, 15 ’C hőmérsékleten. 0,2 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. Mindegyik frakció radioaktivitását meghatározzuk úgy, hogy mérjük a Cerencov-sugárzást, ezzel azonosítva a fragmenseket. A szükséges frakciók tartalmazzák a kisméretű dezoxi-ribonukleinsav fragmenst, ezeket egyesítjük, a dezoxiribonukleinsavat 2 térfogat etanollal kicsapjuk, majd centrifugálást követően 20 pl alábbi összetételű elegyben újra feloldjuk:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5,
0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
A 32P-jeIzett EcoRI-BglII dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 0,2 egység TAql enzimmel (Biolabs) részlegesen hasítjuk, 50 pl térfogatú reakcióelegyben, 10 percen át, 37 ’C hőmérsékleten. A reakcióelegy az alábbi összetételű:
0,2% nátrium-dodecil-szulfát,
10,0% glicerin,
10,0 mM etilén-diamin-tetraecetsav,
0,05% brómfenol-kék.
A dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen trisz-borát-etilén-diamintetraecetsav elegyben elektroforézist végezve elkülönítjük (Peacock és munkatársai, Biochemistry, 6,1818, 1967). A szükséges EcoRI-Taql legnagyobb részlegesen emésztett fragmenst tartalmazó csíkot az autoradiogramon azonosítjuk. Ezt a fragmenst (lásd 3. ábra) extraháljuk a gélről, és tisztítjuk (lásd Miller és munkatársai, mint előbb), majd 10 pl alábbi összetételű elegyben feloldjuk:
mM trisz-hidrogén-klorid, pH=7,5, mM etilén-diamin-tetraecetsav.
A kísérletek során pBR322 plazmidot használunk akceptorként, amelyet Clal és EcoRI restrikciós endonukleázokkal kezelünk. 2 pg pBR322 plazmidot 4 egység Clal (Biolabs) enzimmel hasítunk 20 pl reakcióelegyben, 60 percen át, 37 ’C hőmérsékleten. A proteint fenollal extraháljuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat 2 térfogat etanollal -80 ’C hőmérsékleten 10 percen át kicsapjuk. Centrifugálással összegyűjtjük a dezoxi-ribonukleinsavat, és ezután 10 egység EcorI (Biolabs) enzimmel hasítjuk 30 percen át, 37 °C hőmérsékleten, 20 pl térfogatú reakcióelegyben.
Ezután 2 térfogat 0,1 M trisz-hidro-klorid (pH = 8,7) oldatot adunk az elegyhez, és az egészet 1 egység alkalikus foszfatázzal (Boehringer) inkubáljuk 37 ’C hőmérsékleten, 30 percen át. A foszfatáz inaktiválására 65 ’C-on inkubálunk, 60 percen át. 100 ng akceptor plazmidot inkubálunk 5 pl L-dezoxiribonukleinsav fragmenssel, 15 pl reakcióelegyben, amelynek összetétele a következő:
mM magnézium-klorid, mM trisz-hidro-klorid, pH=7,8, mM ditio-treitol, és 0,5 mM adenozin-trifoszfát.
Az inkubálást 30 egység/pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs) jelenlétében végezzük 2 órán át.
pl fenti reakcióelegyet adunk 150 ml E. coli HB101 tenyészethez, amelyet előzőleg kalcium-kloriddal kezeltünk (lásd előbb), és amelyet az alábbi összetételű, összesen 200 pl térfogatú elegyben szuszpendálunk: >
mM magnézium-klorid, mM kalcium-klorid, és mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5.
percen át jégfürdőn tartjuk az elegyet, 1 percig
HU 209 146 Β ’C hőmérsékleten, végül 10 percen át 20 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 1 ml tripton táptalajt adunk a szuszpenzióhoz, és 30 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, miközben percenként 300-at forduló keverővei keverjük. A tripton táptalaj összetétele a következő:
g bakto-tripton (Difco), g élesztő-kivonat (Difco),
I g glükóz, g nátrium-klorid, és
294 mg kalcium-klorid (2 H2O), továbbá
II desztillált víz.
Az elegyet két agarlemezre szélesztjük (McConkey Agar, Difco; 0,6 ml/lemez), a táptalajhoz előzőleg 50 pg/ml ampicillint adunk (Sigma). A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, 12-17 órán át.
különböző telepből izoláljuk a plazmid dezoxiribonukleinsavat. Az alábbiak szerint járunk el:
A telepekkel 10 ml tripton táptalajt oltunk, amely táptalajba 50 pg/ml ampicillint mértünk be. A tenyésztést 25 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban végezzük. 15-18 órán át 37 °C hőmérsékleten tenyésztünk, percenként 300-at forduló rázóasztalon. Centrifugálással (Sorval, HS-4 rotor, 10 perc, 4000 fordulat/perc, 4 ’C) elkülönítjük a sejteket. Körülbelül 0,1 g sejtet kapunk, amit 1 ml 50 mM trisz-hidro-klorid (pH = 8,0) oldatban szuszpendálunk. 0,25 ml lizozimoldatot adagolunk, és 10 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubálunk. A lizozim-oldat 10 mg/ml lizozimot tartalmaz, 50 mM trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, oldatban. Ezután 0,15 ml 0,5 mM, pH = 7,5, etilén-diamintetraecetsav-oldatot adagolunk. 10 percen át 0 ’C hőmérsékleten inkubálunk, majd 60 pl 2%-os Triton X100 (Merck) oldatot mérünk az elegyhez. 30 percen át 0 ’C hőmérsékleten tartjuk a mintákat, majd 30 percen át, percenként 15 000-et forduló rotorban (Sorval SA600 rotor) centrifugálunk 4 ’C hőmérsékleten. A felülúszót 1 térfogat fenollal (TNE-vel telítve) proteinmentesítjük. Centrifugálással (Sorval HB-4 rotor) elkülönítjük a fázisokat. A centrifugálást 10 percen át 4 ’C hőmérsékleten végezzük, percenként 5000-et forduló rotorban. A felső fázist kétszer 1 térfogat kloroformmal extraháljuk. 25 pg/ml végkoncentrációig pankreász ribonukleáz A enzimet (Sigma; 10 mg/ml-es TNE-vel készült oldat, amit 10 percen át 85 ’C hőmérsékleten előmelegítettünk) adagolunk, és 40 percen át 37 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. Ezután 1 mól nátrium-kloridot és 10% polietilén-glikol 6000et (Fluka, 20 percen át 120 ’C hőmérsékleten autoklávozva) adagolunk, majd 2 órán át -10 ^C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. A csapadékot Sorval HB-4 rotorban centrifugálva összegyűjtjük, a centrifugálást 20 percen át végezzük 0 ’C hőmérsékleten, 10000 fordulat/perc fordulatszám mellett. A terméket 100 pl TNE-ben oldjuk. A dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot 1 térfogat fenollal extraháljuk, és ezután a dezoxi-ribonukleinsavat 2 térfogat etanollal kicsapjuk, a szuszpenziót 10 percen át -80 ’C hőmérsékleten hagyjuk állni. Eppendorf centrifugában centrifugálva összegyűjtjük a csapadékot, és a dezoxi-ribonukleinsavat 10 mM trisz-hidro-klorid (pH = 7,5) és 0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav elegyének 20 pl-ében ismét feloldjuk. 10 ml tenyészetből így 8-10 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat kapunk,
A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a következő restrikciós enzimekkel emésztjük, és emésztés után analizáljuk:
Mindegyik esetben 0,5 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Hpal, EcoRI, Clal (Biolabs) enzimekkel hasítunk, a sztenderd utasításoknak megfelelően, amit az enzimet előállító ad. A dezoxi-ribonukleinsavakat 1% agarózt tartalmazó gélen 40 mM trisz-acetát (pH = 7,8), mM etilén-diamin-tetraecetsav és 0,5 pg/ml etídiumbromid jelenlétében frakcionáljuk. A szükséges plazmidok 1 Hpal restrikciós helyet tartalmaznak, és három emésztést követően a nagy dezoxi-ribonukleinsav fragmensen kívül két kisebb fragmensre hasadnak, amelyek nagyobbak, mint a pBR322 kis EcoRI-Clal fragmense. Egy ilyen plazmidot p 159 jellel jelölünk (lásd a 3. ábrát).
B) A pHRil45 plazmid előállítása pg pl59 dezoxi-ribonukleinsavat 10 egység EcorI (Biolabs) restrikciós endonukleázzal emésztünk 30 percen át, 37 ’C hőmérsékleten. Fenollal extraháljuk a dezoxi-ribonukleinsavat, etanollal kicsapjuk, és centrifugálást követően az alábbi elegy 10 pl-ében oldjuk:
mM trisz-hidrogén-klorid (pH=7,5),
0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
Az EcoRI enzimmel emésztett dezoxi-ribonukleinsavat ezután 10 pl, alábbi összetételű reakcióelegyben kezelünk:
mM magnézium-klorid, mM β-merkapto-etanol, mM nátrium-klorid,
0,1 mM dATP (P. és L. Biochemicals),
0,1 mM dTTP (P. és L. Biochemicals).
A reakciót 15 percen át végezzük 12 ’C hőmérsékleten. Ezután 5 percen át 85 ’C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, a polimeráz inaktiválására. A reakcióelegyet tízszeresére hígítjuk, az alábbi összetételű eleggyel:
mM trisz-hidro-klorid, pH=7,8, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
0,5 mM adenozin-trifoszfát (Sigma).
Az elegyet 30 egység/pl reakcióelegy T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal egészítjük ki, és egy órán át 15 ’C hőmérsékleten inkubáljuk.
ng dezoxi-ribonukleinsavval E. coli sejteket transzformálunk, az előzőekben megadottak szerint eljárva. A transzformációs elegyet McConkey-táptalajon szélesztjük, a táptalaj 50 pg/ml ampicillint tartalmaz.
különböző telepből plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, az előzőekben megadott módon. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavakat EcoRI emésztéssel analizáljuk. A számunkra hasznos plazmidok EcoRI enzimmel nem hasadnak. Az analízist az előzőekben megadott módon végezzük. Az egyik plazmidot HRÍ145 jellel jelöljük (lásd a 3. ábrát).
HU 209 146 Β
C) A pHRU48 plazmid előállítása pg pHRil45 dezoxi-ribonukleinsavat 5 egység
Clal (Boehringer) enzimmel kezeljük 60 percen át, 37 ’C hőmérsékleten, majd fenolos extrakcióval proteinmentesítünk. A dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, és ezután 20 μΐ alábbi összetételű elegyben oldjuk:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5,
0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
A túlnyúló végeket a fentiek szerint eljárva, dezoxiribonukleinsav polimerázl (Klenow-fragmens) enzimmel feltöltjük, az előzőekben megadottaktól eltérően azonban a dATP és dTTP helyett dCTP és dGTP nukleotidot adagolunk (P. és L. Biochemicals). A polimeráz inaktiválására 5 percen át 85 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet. Ezután 2 térfogat 0,1 M trisz-hidrokloridot (pH = 8,7) adagolunk, és 30 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 0,5 egység borjú foszfatáz (Boehringer) jelenlétében. Fenolos extrakcióval proteinmentesítjük az elegyet. A dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, és 8 μΐ alábbi összetételű elegyben feloldjuk:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5,
0,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
5’-végein foszforilezzük az alábbi szekvenciájú, kémiailag szintetizált dezoxi-ribonukleinsav linker:
5i’-GAATTCCATGGTACCATGGAATTC-3.
Úgy járunk el, hogy 8 pmól linkért inkubálunk 5 pCi (gamma32P)-adenozin-trifoszfáttal (5500 cix mmól-1, Amersham) 8 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben:
0,1 mM rATP (Sigma), mM trisz-hidro-klorid, pH = 9,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, és egység T4 polinukleotid kináz (P. és L. Biochemicals).
A reakciót 30 percen át 37 °C hőmérsékleten végezzük. A reakció leállítására az elegyet -80 ’C hőmérsékletre hűtjük.
Ezután 1 pg Clal restrikciós endonukleázzal és foszfatázzal kezeljük a radioaktívan jelzett linkért, majd kapcsoljuk a pHRil45 dezoxi-ribonukleinsavval (lásd előbb) 20 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:
0,5 mM rATP (Sigma), mM ditio-treitol (Calbiochem), mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,8, mM magnézium-klorid, és 800 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz. (Biolabs)
Az inkubációt 15 °C hőmérsékleten végezzük 2 órán át. A ligáz inaktiválására 10 percen át 85 °C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet. Ezután 2 térfogat vizet adagolunk, és az elegy nátrium-klorid koncentrációját 10 manóira állítjuk be, majd 30 perc alatt 37 ’C hőmérsékleten tartva az elegyet, 20 egység KpnI restrikciós enzimet (Biolabs) adagolunk.
Az elegyet fenollal és kloroformmal extraháljuk, majd 0,9% agarózt tartalmazó, alacsony olvadáspontú gélen (Biorad) frakcionáljuk, 40 mM trisz-acetát (pH=7,8), 1 mM etilén-dimain-tetraecetsav és
0,5 mikrogramm/ml etídium-bromid összetételű eleggyel. Az ultraibolya fényben látható csík hasonló mobilitású, mint a marker dezoxi-ribonukleinsav, ezt kivágjuk a gélből. Ennek egy részét 5 percen át 65 ’C hőmérsékleten felolvasztjuk, majd 37 °C-ra hűtjük. így 20 pl oldatot kapunk. Az oldat 5 pl-ét elkülönítjük, és 12 órán át 15 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, 400 egység T4 ligáz (Biolabs) jelenlétében, 10 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:
0,5 mM adenozin-trifoszfát, mM ditio-treitol, mM magnézium-klorid, mM trisz-hidro-klorid, pH=7,8.
A ligáz elegyhez 1/10 térfogatnyi, alábbi összetételű oldatot adunk:
100 mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5,
100 mM kalcium-klorid, és
100 mM magnézium-klorid.
A 15 ’C-on megszilárduló elegyet 5 percen át 65 ’C hőmérsékleten tartjuk. Ezzel az oldattal az előzőek szerint eljárva transzformálunk kalciumionokkal kezelt E. coli HB101 sejteket. A transzformánsokat 50 pg/ml ampicillint tartalmazó McConkey-agar lemezeken szélesztjük.
különböző telepből izolálunk plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, az izolálást az előzőekben megadottak szerint végezzük. A dezoxi-ribonukleinsavakat az alábbi restrikciós enzimekkel analizáljuk:
Minden esetben 0,5 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat hasítunk KpnI, Ncol és EcoRI (Biolabs) restrikciós endonukleázokkal, az előállító instrukciói szerint végezve az emésztést. A hasított terméket 1% agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk, 40 mM triszacetát, pH = 7,8, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav és 0,5 pg/ml etídium-bromid összetételű eleggyel. Mindegyik plazmid tartalmaz a fenti enzimek által hasítható egy helyet. Az egyik plazmidot HRÍ148 jellel jelöltük.
A HRÍ148 plazmid tartalmaz egy triptofán promoter-operátor rendszert, és egy riboszóma kötőhelyet, amely az ATG kodonig tart, és azt is magában foglalja. Hirudin és más heterológ géneket kapcsolhatunk a plazmidba közvetlenül EcoRI, Ncol, KpnI helyeket használva, amelyek egyszer fordulnak elő a plazmidban. Ezenkívül, a plazmid lehetővé teszi heterológ gének közvetlen kapcsolását és kifejezését anélkül, hogy ATG jelenléte ebben szükséges lenne a transzláció iniciálásához. Ha Ncol enzimmel hasítunk, és a túlnyúló végeket dezoxi-ribonukleinsav polimerázl enzimmel az előzőekben megadott módon feltöltjük, vagy KpnI enzimmel hasítunk, és Sí nukleázzal eltávolítjuk a túlnyúló végeket, úgy elérjük célunkat. A HRÍ148 plazmid ezért egy expressziós plazmid, amelyet széleskörűen felhasználhatunk.
D) A pHRil48IEcoRIIBamHI linearizált vektor előállítása pg pHRil48 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal kezelünk. A pHRil48/EcoRI/BamHI hasított vektort sűrűségi gradiens centrifugálással izoláljuk.
HU 209 146 Β
b) Az F ^dezoxi-ribonukleinsav/EcoRI/EcoRÍI és az F2dezoxi-ribonukleinsav/BamHI/EcoRIl előállítása
I. Az F\-DNSIEcoRI/EcoRIl előállítása
A pML300 plazmid dezoxi-ribonukleinsav 5 pg-ját először 10 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük 50 pl alábbi összetételű oldatban:
100 mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM nátrium-klorid, és
100 pg/ml zselatin.
Az emésztést 1 órán át végezzük 37 °C hőmérsékleten. 0,5 pg linearizált plazmid dezoxi-ribonukleinsav/EcoRI fragmenst tartalmazó alikvot mintát izolálunk agaróz gélről, gél-elúcióval [lásd 10. példa a) pontját] és radioaktívan jelezzük (gamma_32P)-adenozin-trifoszfáttal (lásd a 12. példát). A plazmid DNS/EcoRI nagy részét ezután keverjük ezzel a radioaktívan jelzett dezoxi-ribonukleinsavval. EcoRIl restrikciós endonukleázzal emésztjük, és az EcoRIIEcoRI* dezoxi-ribonukleinsav fragmenst (109 bázispárból áll) 8% poliakril-amidot tartalmazó gélről elektroforézissel különítjük el. A gél-eluáláskor 200 pg Fr DNS/EcoRI*/EcoRII terméket kapunk.
II. Az F2-DNS/BamHI/EcoRII előállítása
ApML305 dezoxi-ribonukleinsav 5 pg-ját 10 egység
BamHI restrikciós endonukleázzal kezeljük. A linearizált plazmid dezoxi-ribonukleinsav/BamHI 0,5 pg-ját agaróz gélről eluálva izoláljuk [lásd a 10. példa a) pontját], és (gamma_32P)-ATP jelenlétében radioaktívan jelezzük (lásd a 12. példában megadottakat). A plazmid dezoxi-ribonukleinsav/BamHI legnagyobb részét evvel a radioaktívan jelzett dezoxi-ribonukleinsavval keverjük, EcoRIl restrikciós endonukleázzal emésztjük, és az EcoRII-BamHI* 122 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 8% poliakril-amidot tartalmazó gélről elektroforézissel elkülönítjük. így 250 pg F2-dezoxi-ribonukleinsav/BamHI*/EcoRII fragmenst kapunk.
c) Az F\-DNS ligálása az F2-DNSfragmenssel, és a pML310 expressziós plazmid előállítása ng (473 nmól végekre számítva) F,-DNS/ EcoRI/EcoRII és 9 ng (495 nmól, végekre számítva) F2DNS/BamHI/EcoRII fragmenst kezelünk 20 pl reakcióelegyben, T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal, a 10. példa
c) pontjában megadottak szerint eljárva. Az elegyet ezután fenol és kloroform elegyével extraháljuk, majd a dezoxi-ribonukleinsavat alkohollal kicsapjuk. A dezoxiribonukleinsav csapadékot a 10. példa c) pontjában megadottak szerint oldjuk, és EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázzal emésztjük. Az oldatot ezután TNE-oldattal sztenderdizáljuk, és 30 ng (50 nmól, végekre számítva) pHRil48/EcoRI/BamHI vektor dezoxi-ribonukleinsavat (lásd 13. példa aD) adagolunk. Az elegyet fenollal és kloroformmal ismét extraháljuk, majd alkohollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. A kicsapott dezoxi-ribonukleinsav elegyet a 10. példa c) pontjában megadottak szerint T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal (Biolabs) kezeljük. így az oldatban olyan rekombináns plazmid jön létre, amely tartalmazza az F1-F2-dezoxi-ribonukleinsavat, azaz a deszulfato-hirudin gént.
d) Az E. coli HB101 transzformálása a pML310 plazmáddal
Az E. coli HB101 sejtek transzformálását kalciumionos kezelést követően a 10. példa d) pontjában megadottak szerint végezzük. A 13. példa c) pontjában megadottak szerint előállított 10 pl térfogatú reakcióelegyet használjuk. A transzformáció után 420 amplicillinre rezisztens telepet kapunk.
e) Az F\-F2-dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó telepek keresése
A 13. példa d) pontjában elvégzett kísérlet után kapott 18 transzformált telepet vizsgáljuk az FrF2-dezoxi-ribonukleinsav jelenlétére. A vizsgálatot a 10. példa e) pontjában megadottak szerint végezzük. Radioaktív próbaként az 5. és 6. példákban megadottak szerint előállított oligo-dezoxi-nukleotid-keveréket használjuk. Az autoradiogramon 12 pozitív telepet látunk, ezek közül ötöt az alábbi jelekkel jelölünk: pML310, pML311, pML312, pML313, pML314.
14. példa
A pML310 klón jellemzése
A pML310 rekombináns plazmidban lévő F,-F2dezoxi-ribonukleinsav szekvencia jellemzését a szekvencia nukleotid sorrendjének megállapításával végezzük, Maxam és Gilbert (lásd előbb) szerint, és a 12. példában megadottakat ismételve végezzük. 10 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat vizsgálunk. Az Fr F2-dezoxi-ribonukleinsav nukleotid szekvenciája azonos a szintetikus deszulfato-hirudin génre leírt szekvenciával.
75. példa
A deszulfato-hirudin HV1 kifejezése élesztőben
A kémiailag szintetizált hirudin gén a pML310 plazmidban 206 bázispárból álló EcoRI-BamHI inszertként sokszorozódik (lásd a 14. példát). A gént kivágjuk a pML310 plazmidból, és élesztőben fejezzük ki a represszálható PHO5 promoter szabályozás alatt. A konstrukció magában foglalja az 541 bázispárból álló PHO5 promoter szekvenciát, és a teljes PHO5 szignál szekvenciát (17 aminosavat meghatározó 51 nukleotid), ahogy azt a 143081 sorszámú európai szabadalmi bejelentésben megtaláljuk. Ez a szekvencia fázisban kapcsolódik a hirudint meghatározó szekvenciához, amely az érett hirudin amino-terminális aminosavának, a valinnak a kodonjával kezdődik. A hirudin gén a 3’-végen egy dezoxi-ribonukleinsav fragmenssel kapcsolódik, ez biztosítja a PHO5 transzkripciós terminációs jeleit. Az expressziós plazmid vektor része tartalmazza az élesztő 2 p-os szekvenciáját, az élesztőben való szelekciót lehetővé tevő LEU2 gént, és az ampicillin rezisztencia génen kívül E. coli sejtekben való sokszorozódást és szelekciót lehetővé tevő E. coli replikációs origót.
Az eljárást az 5., 6. és 7. ábrákon mutatjuk be.
A deszulfato-hirudin gén 5’-végén levő nukleotid szekvencia megváltoztatása
A deszulfato-hirudint meghatározó nukleotid szekvencia GTT kodonnal kezdődik, ami a végtermék amino-terminális valinját határozza meg. E. coliban való gyors szubklónozás és kifejezés érdekében az 5’-végen
HU 209 146 Β a kódoló szekvenciát nyolc olyan nukleotiddal hoszszabbítjuk meg, amely EcoRI restrikciós helyet és egy ATG iniciációs kodont tartalmaz. A PHO5 szignál peptidet meghatározó, és a hirudint leíró szekvencia leolvasási fázisban való pontos fúziója érdekében ezeket a nukleotidokat el kell távolítani. Ezt úgy érjük el, hogy az EcoRI restrikciós helyet egy túlnyúló véggé alakítjuk át, és beépítünk egy olyan Hgal endonukleáz által felismerhető restrikciós helyet, amely használatakor a hasadás közvetlenül a GTT kodon mellett 5’irányban következik be.
A Hgal restrikciós hely beépítése a deszulfato-hirudin gén elé (lásd az 5. ábrát) pg, a 13. példa c) pontja szerint előállított pML310 plazmidot teljesen emésztünk EcoRI restrikciós endonukleázzal. A pML310/EcorI dezoxi-ribonukleinsavat fenollal és kloroformmal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. Az 5’-túInyúló végeket S| nukleázzal eltávolítjuk. Ezt úgy végezzük, hogy 4 pg pML310/EcorI dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl alábbi összetételű elegyben 20 E/ml S, nukleázzal (Sigma) kezelünk 45 percen át, 37 °C hőmérsékleten:
250 mM nátrium-klorid, mM cink-szulfát, és mM nátrium-acetát, pH = 4,6.
A dezoxi-ribonukleinsavat fenol és kloroform oldószerekkel extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A pML310/EcoRI/Si dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl 50 mM trisz-hidro-kloridot (pH=8,0) tartalmazó oldatban szuszpendáljuk, és 2 egység borjú alkalikus foszfatázzal (CIAP, Boehringer) kezeljük 1 órán át, 37 °C hőmérsékleten. Az enzimet 65 °C hőmérsékleten inkubálva, inaktiváljuk. Az inkubációt 1,5 órán át végezzük.
A-z inkubációs elegyben a nátrium-klorid koncentrációját 150 mM-ra állítjuk be. A defoszforilezett (pML310/EcoRI/Si/CIAP) plazmid dezoxi-ribonukleinsavat úgy tisztítjuk, hogy DE52 (Whatman) ioncserélő gyantán adszorbeáljuk, alacsony sókoncentrációjú pufferben (150 mM nátrium-klorid, 10 mM trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav), és ezután magas só-koncentrációjú oldattal eluáljuk (1,5 M nátrium-klorid, 10 mM trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, 1 mM etilén-diamintetraecetsav). A dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, és vízben szuszpendálva 0,8 mg/ml töménységű oldatot készítünk.
Az alábbi oligo-nukleotidot készítjük el:
5’-AGCGTCGACGCT-3’.
Az oligo-nukíeotidot a foszfo-triészter módszerrel állítjuk elő [Itakura és munkatársai, J. Am. Chem. Soc., 103, 706 (1981)]. Az önmagával komplementer oligo-nukleotid tartalmazza a Hgal restrikciós endonukleáz-GACGC-restrikciós felismerő helyét, A két egyszálú szakasz hasításával 12 bázispárból álló kétszálú dezoxi-ribonukleinsav linker molekulát kapunk.
1,2 pg szintetikus, egyszálú oligo-dezoxi-nukleotidot foszforilezünk 10 pl, 6 egység T4 polinukleotid-kinázt (Boehringer) alábbi összetételű elegyben:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM magnézium-diklorid, mM ditio-treitol, pCi (lambda~32P)-adenozin-trifoszfát (3000 Ci xmmóT1), (Amersham).
percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd 15 percen át 37 °C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást 0,5 mmól adenozin-trifoszfát jelenlétében. Ezután 75 °C-on inkubáljuk az elegyet 10 percen át, az enzim inaktiválására, majd fokozatosan szobahőmérsékletre hűtjük.
0,6 pg (170 pmól) P32-jelzett linker dezoxi-ribonukleinsavat keverünk 2,4 pg (1,75 pmól, végekre számítva) pMUlO/EcoRI/Sj/CIAP dezoxi-ribonukleinsavval, és 20 pl alábbi összetételű elegyben ligálunk 20 órán át, 15 °C hőmérsékleten:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
3,5 mM adenozin-trifoszfát, és
800 egység T4-dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs).
A ligázt 85 °C hőmérsékleten 10 percen át inaktiváljuk, és a fölös linker molekulákat a dezoxi-ribonukleinsav kicsapásával távolítjuk el. A kicsapást az alábbi összetételű elegyben végezzük:
mM etilén-diamin-tetraecetsav, pH=7,5,
300 mM nátrium-acetát, pH = 6,0,
0,54 térfogat izopropanolban.
percen át szobahőmérsékleten tárolva az elegyet, a dezoxi-ribonukleinsav kiválik; ezt 45 pl fentiekben megadott összetételű ligációs elegyben szuszpendálunk, és kör alakú dezoxi-ribonukleinsav kialakítására 6 órán át 15 °C hőmérsékleten ligálunk.
A ligációs elegy 1 és 3 pl térfogatú alikvotjait 100 pl kalcium-ionokkal előkezelt transzformációra kompetens E. coli HB101 sejtekhez adjuk. A sejteket Hanahan szerint [J. Bioi. Chem. 166, 557 (1983)] állítjuk elő. A sejteket 30 percen át jégfürdőn tartjuk, majd 30 percen át 42 °C-on inkubáljuk, végül 2 percen át újra jégfürdőn tároljuk azokat, és ezután 1 órán át 37 °C hőmérsékleten, 400 pl SOC táptalajban inkubáljuk. A sejteket 100 pl térfogatra koncentráljuk, és 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB agar lemezeken szélesztjük.
A SOC táptalajt a következők szerint állítjuk elő: 20 g triptont, 5 g élesztőkivonatot, 0,584 g NaCl-t és 0,18 g KCl-t vízzel 1 literre töltünk fel és az elegyet 20 percen át 120,5 °C-on autoklávozunk. Ezután hozzáadunk 10 ml sterilre szűrt 1 mM MgCl2x6 H2O-t és 10 ml sterilre szűrt 1 mM SO4x7 H2O-t. Az oldat pHját 6,8-re állítjuk be. 1 liter ilyen oldathoz (SOB táptalaj) 10 ml sterilre szűrt 2 M glukóz-oldatot adunk (SOC táptalaj).
transzformált ampR telepet egyenként felnövesztünk 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban. A sejtekből izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat,1 Holmes és munkatársai szerint [Anal. Biochem., 114, 193 (1981)]. A szintetikus oligo-nukleotid jelenlétét dezoxi-ribonukleinsav szekvenálással bizonyítjuk, primerként olyan egyszálú dezoxi-ribonukleinsav fragmenst használunk, amely hibridizálódik a hirudint
HU 209 146 Β meghatározó szálhoz. A dezoxi-ribonukleinsav linkért és előtte a hirudin gént megfelelő pozícióban hordozó kiónt pML310L jellel jelöljük.
16. példa
A PHO5 szignálszekvencia és a deszulfato-hirudin struktúrgén fúziója
a) A 0,2 kb nagyságú deszulfato-hirudin fragmens izolálása (lásd az 5. ábrát) gg pML310L plazmidot BamHI és Pvul restrikciós endonukleázokkal teljesen emésztünk. A dezoxi-ribonukleinsavat fenollal és kloroformmal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk, és ezután 1,2% agarózt tartalmazó gélen elkülönítjük a két restrikciós fragmenst, 8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav pufferban. Az etídium-bromiddal megfestett, 0,84 kb nagyságú PvulBamHI fragmenst géllel izoláljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat dialíziszsákba elektroeluáljuk, a zsákba 3 ml 0,2xTBE puffért teszünk. A zárt zsákocskát az alábbi összetételű, 8,3 pH-jú ΊΒΕ pufferba merítjük:
mM trisz-bázis, mM bórsav, és
2.5 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
percen át 10 mA áramerősséggel elektroeluálunk, a polaritást 45 másodpercig megfordítjuk, amikor a dezoxi-ribonukleinsav a dialízis membránról felszabadul. A dialíziszsákban lévő géldarabot körülvevő puffért elkülönítjük, nátrium-klorid koncentrációját 150 mM-ra állítjuk be, és DE52 (Whatman) ioncserélő oszlopon engedjük át. Az alábbi összetételű, magas sótartalmú pufferral eluáljuk a dezoxi-ribonukleinsavat:
1.5 M nátrium-klorid,
10,0 mM trisz-hidro-klorid, pH = 8,0,
1,0 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
A terméket etanollal kicsapjuk, és vízzel 0,1 mg/ml töménységű oldatot készítünk.
A pML310L PvuI-BamHI 0,84 kb nagyságú fragmensét Hgal restrikciós endonukleázzal tovább emésztjük. Az emésztés után egy 198 bázispárból álló Hgal-BamHI fragmeshez jutunk, amely tartalmazza az érett deszulfato-hirudin teljes kódoló szekvenciáját. Ha Alul enzimmel tovább emésztjük a fragmenst, a 198 bázispárból álló Hgal-BamHI fragmens érintetlen marad, de egy másik Hgal fragmens, amely azonos nagyságú, kihasad.
A 0,2 kb nagyságú Hgal-BamHI fragmenst elkülönítjük a többitől, a szeparálást 1,5% agarózt tartalmazó gélen végezzük, TBE-pufferben, elektro-elúcióval (lásd előbb). A dezoxi-ribonukleinsavat DE52 ioncserélő kromatográfiával és etanolos kicsapással tisztítjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat vízben oldva 30 pg/ml (0,2 pmól/μΐ) töménységű oldatot készítünk.
b) A PHO5 szignálszekvenciát részben tartalmazó
PHO5 promoter régió (lásd a 6. ábrát) izolálása
A p31/PHO5-TPA18 plazmid (lásd a 143 081 számú európai szabadalmi bejelentést) rendelkezik a PHO5 promoterrel, és egy idegen struktúrgénnel (t-PA) leolvasási fázisban fuzionált PHO5 szignál szekvenciával. Az 584 bázispárból álló BamHI-Ball fragmens tartalmazza a HP05 promotert, és a 3’-végen levő 8 nukleotid kivételével a PHO5 szignál szekvenciát.
pg p31/PHO5-TPA18 dezoxi-ribonukleinsavat Ball restrikciós endonukleázzal emésztünk 16 órán át, 37 °C hőmérsékleten. A dezoxi-ribonukleinsavat fenollal és kloroformmal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat vízben szuszpendálva 0,7 mg/ml töménységű oldatot állítunk elő.
A PHO5 szignál szekvencia és a deszulfato-hirudin gént meghatározó régió pontos kapcsolását egy alábbi szintetikus linkerrel biztosítjuk:
(1) 5’-CCAATGCA-3’ (2) 3’-GGTTACGTCAACA-5’A linker 5’-végén lévő 8 nukleotid (5’-CCAATGCA) képviseli a PHO5 szignál szekvencia egy részét a Ball helytől a végéig. Az 5’-helyen túlnyúló, a (2) oligonukleotidjából származó bázisok a deszulfato-hirudint leíró szekvencia 5’-végén kialakítanak egy Hgal hasítási helyet.
Az egyszálú (1) és (2) oligonukleotidokat Itakura és munkatársai (lásd előbb) foszfo-triészter módszerével állítjuk elő. 1,1 pg, illetve 1,8 pg (1) és (2) oligonukleotidokat egyenként foszforilezünk 5’-végükön, ekvimoláris mennyiségeket keverünk, és a 15. példában megadottak szerint eljárva összekapcsoljuk őket.
1,3 pg (200 pmól) foszforilezett, kétszálú linker dezoxi-ribonukleinsavat kapcsolunk 7 pg (1,8 pmól) Ball enzimmel hasított p31/PHO5-TPA18 dezoxi-ribonukleinsavval, 40 pl alábbi összetételű elegyben, 15 °C hőmérsékleten, 16 órán át:
mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5, mM magnézium-klorid,
3,5 mM adenozin-trifoszfát,
5,0 mM ditio-treitol, és
1400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs).
A ligáz inaktiválására 10 percen át 85 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. A fölös linkerek eltávolítására 10 mmól etilén-diamin-tetraecetsav, 300 mmól nátrium-acetát (pH=6,0) és 0,54 térfogat izopropanol jelenlétében kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. A terméket szuszpendáljuk, és BamHI restrikciós endonukleázzal tovább emésztjük. A dezoxi-ribonukleinsavat fenollal és kloroformmal extraháljuk, majd etanollal kicsapjuk, és a két restrikciós fragmenst 1,2% agarózt tartalmazó gélről izoláljuk, trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav puffért (pH=8,3) használva.
A 0,6 kb nagyságú fragmenst izoláljuk a gélről. A dezoxi-ribonukleinsavat elektroeluáljuk, és DE52 ioncserélő kromatográfiával tovább tisztítjuk, végül etanollal kicsapjuk. A 0,6 kb nagyságú BamHI-Hgal dezoxi-ribonukleinsav fragmenst vízben szuszpendálva 40 pg/ml töménységű oldatot állítunk elő.
c) A pJDB207 élesztő vektor fragmens (6. ábra) izolálása pg pJDB207R/PHO5-TPA(12-2) plazmid dezoxiribonukleinsavat (lásd a 143 081 lajstromszámú európai szabadalmi leírást) emésztünk BamHI restrikciós endonukleázzal. Az emésztés teljessé válása után fe22
HU 209 146 Β nollal és kloroformmal extraháljuk a dezoxi-ribonukleinsavat, és etanollal kicsapjuk. A terméket 0,1 mg/ml koncentrációban 50 mmólos trisz-hidro-klorid, pH=8,0, oldatban szuszpendáljuk, és 7 egység borjú alkalikus foszfatázzal emésztjük 1 órán át, 37 ’C hőmérsékleten. A foszfatázt 1,5 órán át 65 ’C hőmérsékleten inaktiváljuk, és a dezoxi-ribonukleinsavat DE52 ioncserés kromatográfiával tisztítjuk (lásd a 15. példát), majd etanollal kicsapjuk. A 6,8 kb nagyságú BamHI fragmenst 1,2% agarózt tartalmazó gélen triszborát-etilén-diamin-tetraecetsav pufferral (pH=8,3) különítjük el. A dezoxi-ribonukleinsavat elektroeluáljuk, és DE52 ioncserélő kromatografáló oszlopon tisztítjuk, majd etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 0,4 mg/ml (0,1 pmól/μΐ) koncentrációjú oldatot készítve, vízben oldjuk.
d) A PHO5 promoter fragmens és a deszulfato-hirudin struktúrgén ligálása a pJDB207 élesztő vektor fragmenshez (lásd a 6. ábrát)
A dezoxi-ribonukleinsav fragmenseken izolált pJDB207 élesztő vektort, a PHO5 szignál szekvenciát is tartalmazó PHO5 promoter fragmenst, és a deszulfato-hirudin struktúrgént [lásd a 16. példa a)-c) pontját] expressziós plazmid kialakítására ligáljuk.
A p31/PHO5-TPA18 0,6 kb nagyságú BamHIHgal fragmensének 0,3 pmólnyi mennyiségét és a pML310L 0,2 kb nagyságú Hgal-BamHI fragmensének 0,3 pmólnyi mennyiségét ligáljuk 0,1 pmól, 6,8 kb nagyságú, a pJDB207R/PHO5-TPA (12-2) 6,8 kb nagyságú BamHI fragmenséhez 10 μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben:
mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz.
A reakciót 15 ’C hőmérsékleten végezzük 20 órán át.
μΐ ligációs elegyet adunk 100 μΐ transzformáció szempontjából kompetens, Hanahan (lásd előbb) módszere szerint előállított E. coli HB101 sejthez. A transzformációs módszert szintén ebből az irodalomból vesszük. A sejteket 50 μg/ml ampicillint tartalmazó LB agarlemezekre szélesztjük.
LB táptalajban, amely 100 μg/ml ampicillint tartalmaz, felnövesztünk 24 ampR telepet. A tenyészetekből izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavat analizáljuk, és megállapítjuk az inszert nagyságát és orientációját úgy, hogy PstI restrikciós endonukleázzal hasítunk. Az inszertumot megfelelő orientációban tartalmazó egyetlen telepet pJDB207/PHO5-HIR jellel jelöljük.
17. példa
A Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzs transzformálása
Hinnen és munkatársai (lásd előbb) transzformációs módszerét használva a pJDB207/PHO5-HIR plazmidot bejuttatjuk az S. cerevisiae GRF18 törzsbe (a, his3—11, his3—15, leu2-3-, leu2-112, canR). 5 μg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk 100 μΐ szferoplaszt szuszpenzációhoz, és az elegyet polietilén-glikollal kezeljük. A szferoplasztokat 10 ml regenerációs agarral keverjük, és leucint nem tartalmazó élesztő minimál táptalajt tartalmazó petri-csészére szélesztjük.
Egyetlen transzformált élesztő telepet kiemelünk, és leucint nem tartalmazó élesztő minimál táptalajon felnövesztünk. A telepet az alábbi jellel jelöljük: Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HIR.
18. példa
A S. cerevisiae GRF18lpJDB207lPHO5-HIR tenyésztése
A S. cerevisiae GRF18/pJDB207/PHO5-HIR sejteket 20 ml élesztő minimál táptalajon tenyésztjük (Difco Yeast Nitrogén base, aminosavak nélkül), a táptalajhoz 2% glükózt és 20 mg/1 L-hisztidint adunk. A tenyésztést 30 ’C hőmérsékleten végezzük, 3xl07 sejt/ml sejtsűrűségig. 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal mossuk a sejteket, és ezután 50 ml alacsony foszfátion-tartalmú minimál táptalajt oltunk. Az alacsony foszfátion-tartalmú minimál táptalajt úgy állítjuk elő, hogy az megfeleljen a Difco Yeast Nitrogén base táptalajnak (aminosavak nélkül), de tartalmaz 0,03 g/1 kálium-dihidrogénfoszfátot, 1 g/1 kálium-kloridot és 10 g/1 L-aszparagint, az ammónium-szulfát, 2% glükóz és 1 g/1 L-hisztidin helyett. A sejteket 4xl06 sejt/ml sejtsűrűségig oltjuk, majd 42 órán át 30 ’C hőmérsékleten tenyésztjük olyan rázóasztalon, amely percenként 200-at fordul.
19. példa
A deszulfato-hirudin vegyületek izolálása a S. cerevisiae GRF18lpJDB207/PHO5-HIR tenyészetből
a) A deszulfato-hirudin vegyületek izolálása a táptalajból '
A) A hirudin-származékok koncentrációjának növelése
RP-C18 oszlopon
A fermentáció 18., 26. és 42. órájában 10-10 ml mintát veszünk a táptalajból, és a minták protein-tartalmát kisózással és Bond Elüt C-18 oszlopon (1 ml, Analytichem International) koncentráljuk. A mintákat az oszlopra juttatva, és a folyadékot csökkentett nyomású térben eltávolítva, az alábbi eleggyel mossuk a gyantát:
1,5 ml víz és acetonitril 9:1 arányú elegye, amely 0,1% trifluor-ecetsavat tartalmaz. A hirudin-származékokat az oszlopról víz, acetonitril és 0,1% trifluor-ecetsav 6:4 arányú elegyével eluáljuk. 2 ml eluátumot Speed Vác koncentrálóban (Savant) töményítünk 400 μΐ térfogatig. A hirudin-származékokat HPCL analízissel azonosítjuk úgy, hogy autentikus deszulfato-hirudinokkal hasonlítjuk össze. Mérjük továbbá a trombin gátlást. A mintákban 0,2-2 μg/ml hirudinszármazék mutatható ki.
B) Ioncserélő kromatográfia DEAE-cellulóz oszlopon órás fermentléből 1 1 tenyészetet különítünk el és centrifugálunk. A felülúszót DE53 cellulózzal (Whatman) töltött anioncserélő oszlopra öntjük, pH=7,5, az oszlop térfogata 2,5x15,5 cm, 76 ml. Eluálásra az alábbi összetételű pufferokat használjuk: A: 20 mM ammónium-acetát, 100 mM nátrium-klorid,
HU 209 146 Β pH = 7,5; Β: 20 mM ammónium-acetát, 4 M nátriumklorid, pH =5,0. Az átfolyási sebesség 66 ml/óra. Az oszlopot 228 ml A-pufferral mossuk, majd lineáris sógradienssel eluálunk, amely 228-228 ml A- és B-pufferből áll. 22 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk. A hirudin-származékok a 71-74 frakciókkal (88 ml) eluálódnak, jelenlétüket trombin-gátló méréssel mutatjuk ki. Az aktív frakciókat egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten dializáljuk, 20 mmólos ammónium-acetát-oldattal szemben. Ezután alikvotot fagyasztva szárítunk (kétszer). A fagyasztva szárított termékek a reverz fázisú HPLC mérések szerint deszulfato-hirudin-származékokat tartalmaznak.
C) Gélszürés Sephadex G-50 gyantán, és tisztítás
HPLC oszlopon
A trombin-gátló tesztben aktív fő frakciót (80 ml eluátum) egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten dializáljuk, 20 mM ammónium-acetát-oldattal (pH = 7,5) szemben, majd 35 °C hőmérsékleten rotavaporban töményítünk, 5 ml végtérfogatig.
A kapott, átlátszó, vizes oldatot Sephadex G-50 oszlopra (Pharmacia) öntjük, az oszlop térfogata 160 ml, az oszlop 2,5x64 cm méretű (Biorad). A gyantát 5%-os ecetsav-oldattal egyensúlyozzuk ki. A fő aktivitás-csúcsot az 50 ml-es eluátumban találjuk, ez az 5-7. frakció, az átfolyási sebesség pedig 50 ml/óra, egy frakció 25 percenként gyűlik össze. Ezt rotavaporban töményítjük, és ezután reverz fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiával tisztítjuk. Egyetlen frakcióból 500 μΐ-t 1:10 arányban töményítünk, a töményítést „Speed vac” koncentrátorban (Savant) végezzük, és a deszulfato-hirudin-származékok jelenlétére reverz fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiával végzünk analízist. Az oldatok deszulfato-hirudin-származékokat tartalmaznak. A 6. frakció (18 ml) tartalmazza a szekunder vegyületek legkisebb mennyiségét, ezt szemipreparatív reverz fázisú folyadék-kromatográfiával tovább tisztítjuk.
A kísérleti körülmények a következők:
Vydac 218 TP 510 RP-HPLC nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlop, 10x250 mm méretű; hat frakció alikvot részeit gyűjtjük (200 μΐ-re töményítve,
1:10 arányban); AUFS: 0,5, 220 nm-en; átfolyási sebesség: 2 ml/perc. Eluálóelégy a következő: A: 0,1% trifluor-ecetsav, B: acetonitril és víz 8:2 arányú elegye + 0,07% trifluor-ecetsav, 1 percig 16% B-, majd 40 percig 64% B-oldatot engedünk át. A kapott frakciókat 1:1 arányban vízzel hígítjuk, és fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított termék tiszta deszulfato-hirudin-származékokat tartalmaz.
b) A deszulfato-hirudin-származékok izolálása az S. cerevisiae GRF18lpJDB207IPHO5-HIR sejtextraktumából
A sejteket ismert módon tárjuk fel (lásd a 100561 számú európai szabadalmi leírást). A felülúszót 2% ecetsavval kezeljük, majd percenként 12000-et forduló rotorban 10 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. Ammóniaoldattal 7,5-re állítjuk be az oldat pH-ját, és az enyhén opaleszkáló, 50 ml térfogatú oldatot a továbbiakban a 19. példa a) pontjában megadottak szerint kezeljük.
A deszulfato hirudint az előbbiek szerint azonosítjuk, pl. trombin-inhibiciós teszttel és reverz fázisú HPLC módszerrel.
20. példa
AzS. cerevisiae GRF18/pJDB207lPHO5-HIRfermentlevében levő termék-keverék analízise
a) A 19. példa b) pontja szerint előállított felülúszó 2 ml térfogatú alikvotját „Speed vac” koncentrátorban szárítjuk nagymértékben csökkentett nyomású térben. A mintákat egyenként 100 μΐ vízben oldjuk, és nagynyomású folyadék-kromatográfiával analízist végzünk (kísérleti körülmények: 1: lásd később). Mérjük az egyes frakciók trombin-inhibícióját. A 16,5 perc és a 17,7 perc retenciós idejű frakciók trombin-gátlást váltanak ki. A két frakció aránya (expressziós hozam) közel 4:1. Az aminosav-összetétel szerint ezek a frakciók deszulfato-hirudinokat tartalmaznak.
b) A trombin-inhibiciós tesztben aktív frakciókat [lásd: 19. példa a) pontját] különböző körülmények között nagynyomású folyadék-kromatográfiával analizáljuk.
Az 1. kísérleti körülmények: Nucleosil (MN) C18, 5 μηι RP-HPLC oszlop, 4,6x120 mm méretű: 50 μΐ hirudin-származék/szeparáció; 214 nm-en: 6; átfolyási sebesség: 1,2 ml/perc; A-eluens: 0,1% trifluor-ecetsav, B-eluens: acetonitril és víz 8:2 arányú elegye, amely 0,08% trifluor-ecetsavat tartalmaz; 2 percig 16% B-t, majd 50 percig 64% B-t tartalmazó gradienst alakítunk ki. Ellennyomás 66 bar.
A 2. kísérleti körülmények: mint előbb, azzal a különbséggel, hogy a gradiens kialakítására 2 percig 20% B-, majd 40 percig 80% B-oldatot tartalmazó gradienst alakítunk ki.
perces időközönként veszünk frakciókat (összesen 45-öt), amelyeket trombin-inhibícióra tesztelünk. A 17-19. frakciók aktívak. A 17-18. frakciókban levő aktív hirudin-vegyületek aminosav-összetételét, N-terminális aminosavát és az N-terminális szekvenciáját meghatározzuk. Az egyik frakciót (17. frakció) összehasonlítjuk autentikus deszulfato-hirudinnal, amit úgy kapunk, hogy a piócából nyert természetes hirudint aril-szulfatázzal reagáltatunk. Az eredményeket az alábbi I. táblázatban adjuk meg:
I. táblázat
Frakció Retenciós idő (perc) 1. körülmények Retenciós idő (perc) 2. körülmények Trombin-gátlás (%)
17. 16,5 13,7 96
18. 17,7 14,7 86
19. 18,7 - 78
autentikus deszulfato-hirudin 16,5 13,6 86
HU 209 146 Β
A 17. és 18. frakciókban lévő termék aránya ismét 4:1.
c) A 19. példa a) pontja szerint előállított felülúszó 200 ml térfogatú alikvot mintáit HPLC analízissel vizsgáljuk (a nagynyomású kromatográfiás vizsgálat körülményeire vonatkozóan a továbbiakban: lásd: 3. kísérleti körülmények). A mintákat ezután FPLC oszlopon különítjük el (lásd: 4. kísérleti körülmények). Az egyes frakciók trombin-gátló hatását vizsgáljuk. A 8,0 perccel jellemezhető frakciók (első csúcs), a 11,1 perces (második csúcs) és a 12,1 perces frakciók (harmadik csúcs) erős trombin-gátló hatással rendelkeznek. Az expressziós hozam erre a három vegyületre számítva sorrendben: 1:4:1. A nagynyomású folyadék-kromatográfiás analízis szerint a második és harmadik csúcsban levő vegyületek azonosak a 20. példa b) pontjában megadott hirudin-származékokkal (17. és 18. frakció). Az eredményeket a II. táblázatban foglaljuk össze.
II. táblázat
Frakció Retenciós idő (perc) 1. körülmények Retenciós idő (perc) 2. körülmények Retenciós idő (perc) 3. körülmények [c] NaCl 4. körülmények
1. csúcs 14,0 11,6 8,0 365 mmól
2. csúcs (17.) 16,5 13,7 11,1 340 mmól
3. csúcs (18.) 17,7 14,7 12,1 360 mmól
A 3. számú kísérleti körülmények: Vydac 218 TPB5 RP-HPLC oszlop, mérete: 4,0x120 mm, egy futásban 15 pg hirudint választunk el, att.: 7, 214 nm-en, átfolyási sebesség: 1,2 ml/perc; az A-eluens a következő: 0,1% trifluor-ecetsav. A B-eluens a következő összetételű: acetonitril, amely 0,08% trifluor-ecetsavat tartalmaz. Két percig 16% B-eluenst adagolunk, majd a B-komponens koncentrációját a 20. percig 40%-ra növeljük; ellennyomás: 80 bar.
A 4. számú kísérleti körülmények: Pharmacia Mono Q FPLC anioncserélő oszlop, mérete: 5,0x50 mm, futásonként 15 pg hirudint választunk el, AUFS 0,01 280 nm-en; az átfolyási sebesség: 1,0 ml/perc. A gradiens eluáló pufferek összetétele a következő: A: 20 mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5; B: A-puffer és 1 M nátrium-klorid, pH=7,5; 9 percig 15% B-puffert tartalmazó elegyet használunk, majd a 21. percig a B-puffer arányát 70%-ig növeljük.
“S
21. példa
AzS. cerevisiae GRF18lpJDB207IPHO5-HlR törzs fermentlevéből származó deszulfato-hirudinszármazékok jellemzése
A nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálatok szerint a táptalajból izolált hirudin-származékokat tartalmazó 17. (1. csúcs) és 18. (2. csúcs) frakciókban (lásd 20. példa, I. és II. táblázat) azonosak a sejtextraktumokból (intracelluláris hirudin-származékok) izolált, megfelelő vegyületekkel. Ezek a vegyületek és a 3.
csúccsal lejövő származékok (lásd II. táblázat) az alábbi jellemzőkkel rendelkeznek:
a) Az aminosav-összetétel meghatározása
2,5 pg tiszta hirudint hidrolizálunk 24 órán át 6 normál hidro-kloriddal 110 °C hőmérsékleten, majd Chang és munkatársai szerint [DABS-C1 módszer; Methods in Enzymology, 91,41 (1983)] analizáljuk. A hidrolizátum az alábbi összetételű:
1. csúcs (lásd II. táblázat)
Amino- sav Hidrolizátum Amino- sav Hidrolizátum
Asp 9,2 (9) Ile 2,1 (2)
Thr 4,1 (4) Leu 3,3 (3)
Ser 4,0 (4) Tyr 1,9 (2)
Glu 12,4 (12) Phe 1,2 (1)
Pro 3,1 (3) His 1,0 (1)
Gly 9,0 (9) Lys 3,1 (3)
Val 3,4 (4) Met 0 (0)
Cisztin 2,5 (3) teljes (63)
3. csúcs (18. frakció, I. és II. táblázat):
Amino- sav Hidrolizátum Amino- sav Hidrolizátum
Asp 10,0 (9) Ile 1,9 (2)
Thr 3,9 (4) Leu 3,3 (4)
Ser 4,1 (4) Tyr 1,8 (2)
Glu 12,5 (12) Phe 1,1 (1)
Pro 3,1 (3) His 1,0 (1)
Gly 8,7 (9) Lys 2,8 (3)
Val 3,1 (4) Met 0 (0)
Cisztin 2,4 (3) teljes (64)
2. csúcs (17. jrakció, I. és II. táblázat):
Amino- sav Hidrolizátum Amino- sav Hidrolizátum
Asp 9,9 (9) Ile 2,1 (2)
Thr 4,0 (4) Leu 4,4 (4)
Ser 3,9 (4) Tyr 1,2 (2)
Glu 12,8 (13) Phe 1,2 (1)
Pro 3,1 (3) His 1,2 (1)
: Gly 9,1 (9) Lys 2,9 (3)
Val 3,7 (4) Met 0 (0)
Cisztin 2,8 (3) teljes (65)
HU 209 146 Β
b) Parciális szekvencia-analízis nális fenil-tio-hidantoin (PTH)-aminosavakat RP18 pg (2,5 nmól) tiszta hirudint az ismert szekven- HPLC analízissel határozzuk meg.
cia-analízissel analizálunk Edman szerint, az N-termi- Az analízis eredményeit az alábbiakban közöljük:
2. csúcs (17. frakció, I. és II. táblázat):
Ciklus 15 10
Aminosav Val Val Tyr Thr Asp n.d. Thr Glu Ser Gly
Ciklus 11 15
Aminosav Gin Asn Leu n.d. Leu n.d. Glu Gly Ser
Ciklus 20 25
Aminosav Asn Val n.d. Gly n.d. Gly Asn Lys n.d.
Ciklus 29 35
Aminosav Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn
Ciklus 38 40 45
Aminosav n.d. n.d. Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys
Ciklus 48 50
Aminosav Pro n.d. Ser (n.d. = nincs meghatározva)
1. csúcs (II. táblázat):
A szekvencia az 1. ciklustól a 29. ciklusig azonos a fentivel.
3. csúcs (18. frakció, I. és II. táblázat):
A szekvencia az 1-től a 27. ciklusig azonos.
A-bioszintetikus hirudin-származékok N-terminális szekvenciái azonosak az autentikus hirudin szekvenciájával.
C) C-terminális szekvencia analízise
A hirudin-vegyületeket karboxi-peptidáz Y enzimmel emésztjük, és a felszabaduló aminosavakat aminosav-analizátorral határozzuk meg [Chang, Knedel és Braun, Biochem. J., 199,547].
Az eredményeket az alábbiakban adjuk meg:
1. csúcs (II. táblázat):
A C-terminális aminosavak: -Glu-Tyr.
2. csúcs (17. frakció, I. és II. táblázat):
A C-terminális aminosavak: -Glu-Tyr-Leu-Gln.
3. csúcs (18; frakció, I. és II. táblázat):
A C-terminális aminosavak: -Glu-Tyr-Leu.
d) Molekulatömegek
SDS-karbamid (nátrium-dodecil-szulfát-karbamid) gélen [SUDS gél; Kyte és munkatársai, Anal. Biochem., 133, 515 (1983)] analizáljuk a deszulfato-hirudin-vegyületeket. A Coomassie-kékkel vlaó festés előtt 12%-os trifluor-ecetsavval fixálunk. A gélen 6000-7000 daltonnak megfelelő molekulatömege, egyetlen csík látható.
e) Molekulatömeg-meghatározás pozitív iontömeg spektrometriával
i.d.
A deszulfato-hirudin-vegyületeket FAB-MS tömegspektrometriával vizsgáljuk. A használt eszköz: ZABHF tömegspektrométer (VG-Analytical Ltd., Manchester; mátrix: tio-glicerin; xenon bombázás; ionenergia:
10 KeV; külső kalibráció: Cs26J25 [molekulatömeg: 6887,9) és Cs28J27 (7147,76)].
Az eredményeket az alábbiakban adjuk meg:
1. csúcs (II. táblázat):
Tapasztalati képlet: C276H421N77O1Q7S6
Molekulatömeg (számított): 6722,23 Molekulatömeg (mért): 6719,3
2. csúcs (17. frakció, I. és II. táblázat):
Tapasztalati képlet: C287H440N80O110S6
Molekulatömeg (számított): 6963,518 Molekulatömeg (mért): 6963,44
A molekulatömegeket két különböző mérés átlagaként adjuk meg.
3. csúcs (18. frakció, I. és IÍ. táblázat):
Tapasztalati képlet: C282h432n78°108s6
Molekulatömeg (számított): 6835,39 Molekulatömeg (mért): 6832,9
A fentiekben megadott adatok szerint az 1. csúcsban lejövő frakció deszulfato-hirudint (1-63), a 2. csúccsal lejövő frakció az autentikus deszulfato-hirudint (1-65) és a 3. csúccsal lejövő vegyület pedig az új deszulfato-hirudin (1-64).
f) Humán trombin-hirudin dlsszociációs konstans
A humán trombin-deszulfato-hirudin komplexek
KD dlsszociációs konstansait Stone és Hofsteenge módszere szerint határozzuk meg [Biochemistry, 25, 4622-4628. (1986)], majd az eredményeket az alábbi táblázatban adjuk meg. A táblázat tartalmazza az
HU 209 146 Β
ATU/mg-ban kifejezett specifikus aktivitásokat is a három előállított deszulfato-hirudin-féleségre vonatkozóan.
Kd(M) Specifikus aktivitás (ATU/mg)
élesztő deszulfato-hirudin (1-65) 2,9xl0-13 11000
élesztő deszulfato-hirudin (1-64) 3,9xl013 9600
élesztő deszulfato-hirudin (1-63) 3,0xl0-12 8900
g) A transzformált élesztőből nyert további deszulfatohirudin-származékok
A 19. példában megadott módon fermentált és tisztított deszulfato-hirudin-vegyületek keverékét tovább tisztítjuk, és részletesen jellemezzük.
A Vydac 218 TP 510 RP-HPLC segítségével szemipreparatíve elkülönített, és a fentiekben megadott [lásd 21. példa e) pontját] deszulfato-hirudin-vegyületeken kívül további deszulfato-hirudin-szerű vegyületeket kapunk, amelyek az oszlopról 8,1 perces retenciós idővel jönnek le.
Ezt az anyagot FAB-MS tömegspektrometriával jellemezzük, megadjuk aminosav-analízisének eredményeit, parciálisán szekvenáljuk, és vizsgáljuk C-terminális végüket.
A tömegspektrográfiás mérések szerint az anyag két, sorrendben 6429,5 és 6556,8 molekulatömegű vegyületből áll. Az aminosav-összetételt az alábbiakban adjuk meg:
Amíno- sav Hidrolizátum Amino- sav Hidrolizátum
Asn 8,9 (9) Ile 2,1 (2)
Thr 3,7 (4) Leu 3,6 (3)
Ser 4,1 ,(4) . TVr 0,9 (1)
Gin 10,7 (11) Phe 1,1 (1)
Pro 3,2 (3) His 1,2 (1)
Gly 9,7 (9) Lys 3,2 (3)
Val 3,3 (4) Met 0 (0)
Cisztin 3,3 (3) teljes (61)
Az N-terminális vég részleges szekvencia-analízise: Ciklus 12 3 Aminosav ValValTyr
A C-terminális analízis [lásd: 21. példa c) pontját]:
60 61 62
C-terminális aminosav -Ile-Pro-Glu-(.Qlu).
Az adatok szerint a keverékben az alábbi két deszulfato-hirudin származék van jelen: 1-61 és 1-62.
22. példa
A deszulfato-hirudin gént szignál-szekvencia nélkül (lásd 7. ábra) hordozó élesztő deszulfato-hirudin expressziója
a) A pJDB207 plazmid vektor fragmens izolálása pg pJDB207/IF(a-3) (lásd a 100561 sorszámú európai szabadalmi bejelentést) BamHI restrikciós endonukleázzal teljesen emésztjük. A kapott 6,85 és 1,15 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket etanollal kicsapjuk, és 400 pl 50 mM trisz-hidro-klorid-oldatban (pH=8,0) oldjuk. 4,5 egység borjú bél foszfatázt (Boehringer) adagolunk az oldathoz. Egy órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd a foszfatáz inaktiválására 1,5 órán át 65 °C hőmérsékleten tartjuk. Az oldat nátrium-klorid-koncentrációját 150 mM-ra állítjuk be, majd 100 pl térfogatú DE52 (Whatman) anioncserélő oszlopra töltjük, amelyet előzőleg az alábbi összetételű oldattal egyensúlyoztunk ki:
mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5,
150 mM nátrium-klorid, mM etilén-diamin-tetraecetsav.
Az oszlopot hasonló pufferral mossuk, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 400 pl alábbi eleggyel eluáljuk:
1,5 M nátrium-klorid, és
100 mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5, valamint 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
A terméket etanollal kicsapjuk. A 6,8 kb nagyságú BamHI nagy fragmenst a kis fragmenstől 1,2% agarózt tartalmazó gélen pH=8,3 trisz-borát-etilén-diamintetraecetsav pufferral választjuk el.
b) Az 534 bázispárból álló PHO5 promoter fragmens izolálása pg p31/R plazmidot (100561 lajstromszámú európai szabadalmi bejelentés) EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal kezelünk. A kapott három dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 1,2% agarózt tartalmazó gélen
8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav puffer jelenlétében különítjük el. Izoláljuk az 534 bázispárból álló BamHI-EcoRI fragmenst. Ez tartalmazza a transzkripciós startjelekkel együtt a PHO5 promotert.
c) A deszulfato-hirudin kódoló szekvenciáját tartalmazó 206 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav fragmens izolálása pg pML310 plazmidot [lásd a 13. példa c) pontját] teljesen emésztünk BamHI és EcoRI restrikciós endonukleázokkal. A két keletkezett dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 1,2% agarózt tartalmazó, trisz-borátetilén-diamin-tetraecetsav puffért tartalmazó gélen különítjük el (pH= 8,3). Izoláljuk a 206 bázispárból álló EcoRI-BamHI fragmenst.
d) A dezoxi-ribonukleinsav fragmensek ligálása
A fentiekben a)-c) pontokban megadott három dezoxi-ribonukleinsav fragmenst elektro-elúcióval izoláljuk az ágaróz géldarabokból, DE52 (Whatman) anioncserélő ' gyantán tisztítjuk, etanollal kicsapjuk és vízben oldjuk.
pl alábbi összetételű elegyben ligáljuk a 0,1 pmólnyi (0,45 pg) mennyiségű, 6,85 kb nagyságú BamHI vektor fragmenst, a 0,3 pmólnyi (0,1 pg) 534 bázispárból álló BamHI-EcoRI PHO5 promoter fragmenst és a 0,25 pmólnyi (34 ng) mennyiségű, 206 bázispárból álló pML310 plazmidból származó EcoRI-BamHI fragmenst:
' 60 mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
600 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs).
HU 209 146 Β
A reakciót 15 μΐ reakcióelegyben végezzük 15 °C hőmérsékleten, 16 órán át.
100 μg/ml ampicillinnel kiegészített LB táptalajban külön-külön tenyésztünk 24 transzformált ampR telepet. Holmes és munkatársai szerint (lásd előbb) plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izoláljuk, és HindlIIEcoRI kettős emésztéssel analizáljuk a termékeket. 600 bázispárból álló, nagyméretű EcoRI-HindlII fragmens megjelenése jelzi, hogy a klón tartalmazza a vektoron a transzkripciós stop jelekhez viszonyítva megfelelő orientációban a PHO5 promoter-hirudin dezoxi-ribonukleinsav fragmenst. Ahogy az várható, a kiónok 50%-a megfelelő orientációban tartalmazza az inszertet. Az egyik ilyen kiónt pJDB207R/PHO5-HIR jellel jelöljük.
e) A Saccharomyces cerevisiae GRF18 transzformálása
A S. cerevisiae GRF18 törzset (a, his3—11, his315, leu2-3, leu2-112, canR) a pJDB207R/PHO5-HIR plazmiddal transzformáljuk Hinnen és munkatársai (lásd előbb) szerint eljárva. A transzformált élesztősejtek szelektálását leucint nem tartalmazó minimál táptalajon végezzük. Egy transzformált élesztőtelepet izolálunk, és Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-HIR jellel jelöljük.
f) Az S. cerevisiae GRF18/pJDB207R/PHO5-HIR tenyésztése
A fenti sejteket 20 ml élesztő minimál táptalajban (Difco Yeast Nitrogén base, aminosav-hiányban) tenyésztünk 2% glükóz és 20 mg/1 L-hisztidin adagolása után. A tenyésztést 30 ’C hőmérsékleten végezzük, 3xl07 sejt/ml sejtsűrűségig. 0,9%-os nátrium-kloridoldattal mossuk a sejteket, majd 50 ml, alacsony foszfátion-tartalmú minimál táptalajt oltunk. Az alacsony foszfátion-tartalmú minimál táptalajt a Difco Yeast Nitrogén base táptalajnak (aminosavak nélkül) megfelelően állítjuk össze, de literenként 0,03 g káliumdihidrogén-foszfátot, 1 g kálium-kloridot és 10 g Laszparagint adagolunk az ammónium-szulfát, a 2% glükóz és az 1 g L-hisztidin helyett. A tenyészeteket 4xl06 sejt/ml sejtkoncentrációig inokuláljuk, majd 30 ’C hőmérsékleten folytatjuk a tenyésztést 42 órán át olyan rázóasztalon, amely percenként 200-at fordul.
g) Az S. cerevisiae GRF18lpJDB207RIPHO5-HIR fermentlevéből izolált termék-keverék analízise
A 22. példa f) pontjában foglaltak szerint előállított sejteket ismert módon feltárjuk (például a 100561 sorszámú európai szabadalmi bejelentés szerint). A felülúszót 1,5%-os ecetsavval kezeljük, és centrifugáljuk; majd 2 ml átlátszó oldatot vízmentesítünk „Speed Vác” koncentrátorban, nagymértékben csökkentett nyomású térben. A mintákat egyenként 100 μΐ vízben oldjuk, és nagynyomású folyadék-kromatográffal analizáljuk (lásd a 20. példát). Az egyes frakciók trombin-gátló hatását mérjük. A 16,5 perc retenciós idővel lejövő frakciók trombin-inhibíciós aktivitással rendelkeznek. Az aminosav analízis adatai szerint ez a frakció deszulfato-hirudint tartalmaz. A nagynyomású folyadék-kromatográfia analízis-adatai szerint ennek mennyisége 10 μg/l fermentlé. A táptalajban hirudin-aktivitás nem mérhető.
A deszulfato-hirudin gént szignál-szekvencia nélkül, vagy a teljes szignál-szekvencia nélkül hordozó élesztőtörzsek intracelluláris és extracelluláris hirudin aktivitását a III. táblázatban foglaljuk össze. A hirudinaktivitást trombin-inhibíciós méréssel határoztuk meg.
III. táblázat
S. cerevisiae GRF18/plazmid PHO5 szignál szekven- cia Hirudin tenyészlé Aktivitás sejtext- raktum (pg/ml) Teljes
PJDB207/PHO5- H1R + 6xl03 lxlO3 7x103
pJDB207R/PHO5- HIR - nem kimutatható 10 10
23. példa
A PHO5 promoter deléciók előállítása .
a) Bal31 emésztés
A PHO5 promoter forrásaként a 8. ábrán bemutatott, a PHO5-ből származó BamHI-Sall fragmenseket tartalmazó M13mp9/PHO5 Bam-Sal rekombináns fágot használjuk.
μg fág dezoxi-ribonukleinsavat (RF: replikatív forma) Sáli restrikciós endonukleázzal emésztünk, amikor 9 kb nagyságú lineáris dezoxi-ribonukleinsavat kapunk. Fenol és kloroform elegyével extraháljuk az elegyet, majd etanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat. 10 mM trisz-oldatban (pH = 8,0) szuszpendáljuk a dezoxi-ribonukleinsavat, 0,5 mg/ml koncentrációban.
μg Sáli enzimmel hasított dezoxi-ribonukleinsavat 2 egység Bal31 exonukleázzal emésztünk, 100 μΐ alábbi összetételű elegyben:
mM trisz; pH = 8,0,
199 mM nátrium-klorid, mM magnézium-klorid, mM kalcium-klorid, és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
2-2 μg dezoxi-ribonukleinsav alikvotot veszünk ki az elegyből, az inkubáció L, 2., 3., 4., 5. és 6. percében. Az inkubációt 30 ’C hőmérsékleten végezzük. A kivett mintákat azonnal összekeverjük 50 μΐ fenollal és 60 μΐ TME-oldattal. Fenollal és kloroformmal extraháljuk az oldatokat, etanollal kicsapjuk, majd a kivált dezoxi-ribonukleinsavat 100 μg/ml koncentrációban 8,0 pH-jú, 10 mM trisz-oldatban szuszpendáljuk. A Bal31 enzimmel végzett exonukleolitikus hasítás mértékének megállapítására 0,5-0,5 μg dezoxi-ribonukleinsavat mindegyik mintából BamHI endonukleázzal >. emésztünk, és a fragmenseket trisz-borát-pufferral (pH=8,3) készült, 1,5% agarózt tartalmazó gélen analizáljuk. A puffer összetétele a következő:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 8,3, mM bórsav, és
2,5 mM etilén-diamin-tetraecetsav.
perces Bal31 emésztés alatt átlagosan 100 bázispár hasad le a fragmens mindegyik végéről.
b) Az EcoRI linkerek kapcsolása a Bal31 kezelt dezoxiribonukleinsavhoz
HU 209 146 Β
A26o egységben számítva 2 egység EcoRI linkért (5’-GGAATTCC-3’, BRL) szuszpendálunk 250 μΐ 10 mmól triszt (pH = 8) és 1 mmól etilén-diamintetraecetsavat tartalmazó elegyben. 2 pg EcoRI linkért kinázzal kezelünk 75 μΐ alábbi összetételű elegyben:
mM trisz, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, μΜ adenozin-trifoszfát, és egység T4 polinukleotid kináz (Boehringer).
órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd szobahőmérsékletre hagyjuk hűlni, és ezután -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
A kezelt, kétszálú EcoRI linkereket tompa végeiknél ligáljuk a Bal31 enzimmel kezelt dezoxi-ribonukleinsav fragmensekkel. 0,5 pg Bal31 enzimmel kezelt dezoxi-ribonukleinsavat [lásd 23. példa a) pontja] szobahőmérsékleten 16 órán át inkubálunk 50-szeres mennyiségű kinázzal kezelt EcoRI linkerrel, 20 μΐ alábbi összetételű elegyben:
mM trisz, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
600 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs).
A T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt 10 percig 65 °C hőmérsékleten inkubálva inaktiváljuk, a fölös mennyiségű EcoRI linkereket pedig 50 egység EcoRI (Boehringer) restrikciós endonukleázzal hasítjuk, 50 μΐ térfogatú reakcióelegyben.
A dezoxi-ribonukleinsavat fenollal és kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és 10 mM triszt és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsavat tartalmazó elegyben oldjuk. Ezután 5 egység BamHI restrikciós endonukleázzal (Biolabs) hasítjuk a dezoxi-ribonukleinsavat, és az elegyet 1,5% alacsony olvadáspontú agaróz gélen (Sigma) trisz-borát-pufferban különítjük el (lásd előbb). A csíkokat etídium-bromiddal festjük, és hosszú hullámhosszú (366 nm) ultraibolya fényben detektáljuk. A100-600 bázispárnak megfelelő diffúz csíkot kivágjuk a gélből, és az alábbiak szerint extraháljuk a dezoxi-ribonukleinsavat:
az agardarabot 65 °C hőmérsékleten folyékony halmazállapotúvá olvasztjuk, az oldat nátrium-klorid koncentrációját 500 mmól-ra állítjuk be, és 20 percen át 65 °C-on inkubálunk. 1 térfogat fenolos oldatot adunk az elegyhez, amelynek koncentrációja:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM etilén-diamin-tetraecetsav,'és
500 mM nátrium-klorid.
A vizes fázist kétszer fenollal, és egyszer kloroformmal újra extraháljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat
2,5 térfogat hideg, vízmentes etanollal kicsapjuk, és centrifugálással összegyűjtjük. A kivált dezoxi-ribonukleinsavat hideg, 80%-os etanollal mossuk, majd ezután csökkentett nyomású térben szárítjuk. Á terméket 10 μΐ TE elegyben szuszpendáljuk.
c) Ligálás az M13mp9-be
Az M13mp9 replikatív alakjának 3 pg-ját 15 egység EcoRI (Biolabs) és 15 egység BamHI (Boehringer) restrikciós endonukleázzal emésztjük 50 pl térfogatú reakcióelegyben. Fenolos extrakciót és etanolos kicsapást követően a dezoxi-ribonukleinsavat 50 pl TE-pufferben szuszpendáljuk. 5 pl hasított vektor dezoxi-ribonukleinsavat (körülbelül 200 ng) tartalmazó oldatot 10 pl fenti mintákkal keverünk [A különböző Bal31 emésztésből kapott 23. példa b) pontjában megadottak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav fragmensek]. A fragmenseket 20 pl alábbi összetételű elegyben ligáljuk:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
200 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz.
A ligálást 15 órán át végezzük. Az E. coli JM101 törzs kompetens sejtjeinek transzdukcióját az alábbi irodalom szerint végezzük: M13 cloning and sequencing system, kiadva a New England Biolabs. által. A fehér színű tarfoltok helyéről fágokat izolálunk és növesztünk fel, majd EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel hasítva analizáljuk a beépült dezoxi-ribonukleinsav fragmenst.
d) A Bal31 deléció végpontjainak meghatározása Sanger-szekvenálással (deléciók a Sáli helytől)
A szekvenálást a didezoxi dezoxi-ribonukleinsav szekvenáló rendszerrel végezzük [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74,5463 (1977)]. A módszert a fentiekben megadott módszereket ismertető kiadványban is megtaláljuk. A deléció végpontjait az alábbiakban adjuk meg:
Klón A PHO5 szekvencia utolsó nukleotidjának pozíciója (8. ábra)
A -502
B -471
C -422
D -400
E -392
F -369
G -350
H -328
I -300
K -283
L -255
M -226
N -211
O -187
P -111
Q - 88
R - 57
S - 33
HU 209 146 Β
e) A Bal31 deléció végpontjainak meghatározása Sanger szekvenálással (deléciók a BamHl helytől)
Az a)-c) pontokban megadottak szerint Bal31 deléciókat váltunk ki, azzal a különbséggel, hogy az M13mp9 PHO5 Bam-Sal fragmenst BamHl endonukleázzal hasítjuk. A Bal31 enzimmel emésztett molekulát EcoRI és Sáli enzimekkel vágjuk, és a kapott fragmenseket EcoRI és Sáli enzimekkel emésztett M13mp9 dezoxi-ribonukleinsavba klónozzuk. A deléciós pontokat az alábbiakban adjuk meg:
Klón A PHO5 szekvencia (lásd 8. ábra) utolsó nukleotidjának pozíciója
A’ - 24
B’ - 35
C’ - 41
D’ - 48
E’ - 74
F’ - 89
G’ - 93
H’ - 97
I’ -124
K’ -162
L’ -174
M’ -262
N’ -277
O’ -306
P’ -332
Q’ -346
R’ -361
S’ -382
T’ -393
f) A PHO5 promoter belső delécióinak előállítása
A d) pont szerint végzett Bal31 deléció úgynevezett „bal kar” PHO5 promoter fragmenst eredményez, amely EcoRI hellyel végződik; az e) pontban megadott Bal31 deléció úgynevezett „jobb kar” PHO5 promoter fragmens deléciót eredményez, amely EcoRI hellyel végződik. A bal kar és a jobb kar különböző pozícióban való kombinálásakor belső deléciók jönnek létre, amelyek a kiesett dezoxi-ribonukleinsav helyén EcoRI linker szegmenst tartalmaznak. Egyes belső deléciókat hozunk létre úgy, hogy a bal kart és a jobb kart hasítjuk az M13mp9 származékokban. A hasítást, a bal karon EcoRI és BamHl, a jobb karon pedig EcoRI és Sáli restrikciós endonukleázokkal végezzük. A megfelelő fragmenseket lágy agaróz gél-elektroforézissel izoláljuk, ahogy azt a b) pontban megadtuk.
Ekvimoláris mennyiségű bal kart, jobb kart és 200 ng, BamHl és Sáli enzimekkel emésztett Ml3mp9 vektor dezoxi-ribonukleinsav fragmenst ligálunk a c) pontban megadottak szerint eljárva. E. coli JM101 sejtekbe transzdukáljuk a terméket, és fehérszínű tarfoltokat keresünk. Replikatív alakokat hozunk létre, amelyeket ezután BamHl, Sáli és EcoRI restrikciós enzimekkel analizálunk. A következő karokat kombináljuk specifikus belső deléciók létrehozása érdekében (a nukleotidok számozására vonatkozóan lásd a 8. ábrát):
Bal kar Jobb kar Deléció -tói - -ig Kiesett nukleo- tidok száma
A T’ Δ 7 -501-394-ig ;08
B T’ Δ 8 -470-394-ig 77
C T’ Δ 9 -421-394-ig 28
D S’ Δ10 -399-383-ig 17
E R’ Δ11 -391-362-ig 30
F Q’ Δ12 -368-347-ig 22
G P’ Δ13 -349-333-ig 17
H O’ Δ14 -327-307-ig 21
I N’ Δ15 -299-278-ig 22
K M’ Δ16 -282-263-ig 20
L L’ Δ17 -254—175-ig 80
M L’ Δ18 -225-175-ig 51
N L’ Δ19 -210-175-ig 36
O L’ Δ20 -186-175-ig 12
O K’ Δ21 -186-163-ig 24
0 Γ Δ22 -186-125-ig 62
0 H’ Δ23 -186- 98-ig 89
P H’ Δ24 -110- 98-ig 13
P G’ Δ25 -110- 94-ig 17
P F’ Δ26 -110- 90-ig 21
Q E’ Δ27 - 87- 75-ig 13
R D’ Δ28 - 56- 49-ig 8
R C’ Δ29 - 56- 42-ig 15
R B’ Δ30 - 56- 36-ig 21
S A’ Δ31 - 32- 25-ig 8
g) A PHO5 promoter belső delécióinak in vivő analízise
A 23. példa f) pontjában leírt különböző deléciós származékokat klónozzuk a pJDB207/PHO5 plazmádba [Haguenauer-Tsapis és Hinnen, Molecular and Cellular Biology, 4, 2668-2675 (1984)]. A vad típusú PHO5 BamHI-Sall fragmenset helyettesítjük a deléciót tartalmazóval. Az S. cerevisiae AH216 törzset, transzformáljuk (143081 számú európai szabadalmi leírás), és meghatározzuk a tenyészetek savas foszfatáz-aktivitását Toh-e és munkatársai szerint [J, Bacteriol., /73,727 (1973)]. A All és Δ12 deléciók tízszeresére csökkentik a PHO5 aktivitását, és egy 5’-irányú régiót definiálnak (5’-aktivációs hely, UAS), amely eszenciális a PHO5 expressziójához. Hasonló negatív hatást figyeltünk meg a Δ17 delécióval (ötszörös redukció), és a TATA-box Δ23 és Δ26 deléciójaikor (körülbelül harmincszoros a redukció). Az összes többi
HU 209 146 Β deléciókor körülbelül a vad típusnak megfelelő értéket kaptuk. Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a PHO5 expresszálódásához három szükséges információ helyezkedik el, áz alábbi pozíciókban:
1. A-349 és -383 között (UAS1)
2. A -225 és -263 pozíció között (UAS2), végül
3. a -87 és -125 pozíciók között (TATA-box).
Az UAS2 vagy UAS1 és UAS2 PHO5 szakaszon elhelyezkedő régiókat tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket előállíthatjuk a rekombináns M13mp9/PHO5 Bam-Sal (lásd előbb) fágból úgy, 5 hogy megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasítunk. A 268 bázispárból álló BamHI-CalI fragmensen jelen levő UAS1 az alábbi nukleotid szekvenciájú:
GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTT
ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAG
GTAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGT
TTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAA
TTGAATAGGCAATCTCTAAATGAAT, ugyanakkor az UAS2-t tartalmazó, 100 bázispárból álló Clal-BstEII fragmensen az alábbi szekvenciát találjuk:
CGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAGACTAAATTT
ATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATC
AAATTG, a 368 bázispárból álló BamHI-BstEII fragmensen az alábbi szekvenciájú UAS1 és UAS2 helyezkedik el:
GATCCGAAAGTTGTATTCAACAAGAATGCGCAAATATGTCAACGTATTTGGAAGTCATCTT
ATGTGCGCTGCTTTAATGTTTTCTCATGTAAGCGGACGTCGTCTATAAACTTCAAACGAAGG
TAAAAGGTTCATAGCGCTTTTTCTTTGTCTGCACAAAGAAATATATATTAAATTAGCACGT
TTTCGCATAGAACGCAACTGCACAATGCCAAAAAAAGTAAAAGTGATTAAAAGAGTTAATT
GAATAGGCAATCTCTAAATGAATCGATACAACCTTGGCACTCACACGTGGGACTAGCACAG
ACTAAATTTATGATTCTGGTCCCTGTTTTCGAAGAGATCGCACATGCCAAATTATCAAATTG.
24. példa
A deszulfato-hirudin gén kifejeződése a fuzionált
PHO5-GAPDH hibrid promoter szabályozása alatt
A 23. példában olyan régiókat hoztunk létre a -365 [UAS1(PHO5)] és egy másik régiót a -180 pozíció körül [UAS2(PHO5)j, amely a PHO5 génen belül UAS szerepet játszhat, reguláié funkciókkal. Az UAS1 (PHO5) egy 268 bázispárból álló BamHI-CalI fragmensen belül helyezkedik el, míg az UAS1 (PHO5) és az UAS2 (PHO5) egy 368 bázispárból álló, BamHIBstEII fragmensen belül van. Ezt a két fragmenst kapcsoltuk két különböző GAPDH 3’-irányú promoter elemekkel, amelyek tartalmazzák a TATA-boxot, és a GAPDH transzkripciós iniciációs helyeit, a) Élesztő génbank előállítása
Saccharomyces cerevisiae S288C törzsből 30 pg nagy molekulatömegű teljes élesztő dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk [Olsen és munkatársai, J. Mól. Bioi., 132, 387 (1979)], és 30 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, 2 egység EcoRI metilázzal (New England Biolabs) 250 pl EcoRI metilező pufferban, az eladó javaslatai szerint. A dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, 500 pl alábbi összetételű elegyben szuszpendáljuk:
mM trisz-hidro-klorid, pH=8,5, mM magnézium-klorid (EcoRI* puffer) [Meyer, FEBS Lett., 90, 341 (1979)], majd
EcoRI restrikciós endonukleázzal (Boehringer) addig emésztjük, míg a dezoxi-ribonukleinsav fragmensek maximális mérete 30-50 kb (a lambda-dezoxi-ribonukleinsav Xhol emésztésekor 33 kb és 17 kb nagyságú markereket kapunk). Az EcoRI* enzimmel emésztett élesztő dezoxi-ribonukleinsavat szacharóz gradiensen nagyság-frakcionáljuk (5-20%-os szacharóz-oldat, 10 mM trisz-hidro-klorid, pH=7,5, és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav elegyében). A centrifugálást 6 órán át végezzük, percenként 38 000-et forduló rotorban (SW rotor). 0,4 ml térfogatú, összesen 30 frakciót gyűjtünk a gradiens tetejéről. A 16. frakció tartalmazza a 30-40 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket. A 3 pg tömegű dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk, és 16 órán át 15 ’C hőmérsékleten ligáljuk,' 15 pl reakcióelegyben, 1 pg pYcl kozmid vektorral [Hohn és munkatársai, Genetic Engineering, 2. kötet, 169. oldal, New York (1980)], amit előzőleg EcoRI restrikciós enzimmel linearizáltunk. A ligálást 300 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal (New England Biolabs.) végezzük, a reakcióelegy az eladó által javasolt összetételű. A dezoxi-ribonukleinsavat in vitro lambda bakteriofágba pakoljuk [Hohn, Methods in Enzymology, 68. kötet, 299. oldal, New York (1979)], és a bepakolódott fágokkal E. coli HB101 törzset (rk, mk, leu®, pro0, recA) transzdukálunk. Hatékony transzdukciókor pg-nyi mennyiségű pYcl vektorra számítva 5000 ampicillin-rezisztens telepet kapunk. 3000 ampicillinre rezisztens telepet replikázunk, és mikrotiter lapon levő vályúban egyenként felnövesztünk LB táptalajban. Ennek összetétele a következő:
HU 209 146 Β
Bacto-Tryptone (Difco) 10 g,
Bacto-Yeast Extráét (Difco) 5 g, nátrium-klorid 10 g, desztillált víz 11.
A táptalajba ml-enként 100 pg ampicillint mérünk.
b) Az élesztő GAPDH génjének, izolálása
A fentiek szerint előállított génbankot egy szintetikus oligonukleotiddal vizsgáljuk. A szintetikus oligonukleotidot Itakura és munkatársai [J. Am. Chem. Soc., 97,7327 (1975) és de Rooij és munkatársai, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 98, 537 (1979)] szerint állítjuk elő. Szerkezete a következő: 5’-GCTCCATCTTCCACCGCCCC-3’.
pg oligonukleotidot kinázzal kezelünk 10 pl gamma“32P-adenozin-trifoszfáttal (3000 Ci/mmól, 10 pCi/pl, Amersham), a reakciót T4 polinukleotid kinázzal (Boehringer) végezzük, Maniatis és munkatársai szerint, 50 pl térfogatú reakcióelegyben [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Láb., 125. oldal (1982)].
A telephibridizációt a fenti szerző azonos műve szerint (312. oldal) végezzük. A pozitív kiónokat autoradiográfiával határozzuk meg, Kodak X-5 filmet használva. A plazmid dezoxi-ribonukleinsav izolálást követően egy olyan kiónt találunk, amely 2100 bázispárból álló HindlII ffagmensen tartalmazza a GAPDH kódoló szekvenciát [Holland és munkatársai, J. Bioi. Chem., 254, 9839 (1979)]. A klónozott dezoxi-ribonukleinsav mibenlétének végső bizonyítékát a dezoxi-ribonukleinsav szekvenálásából kapjuk, miközben a fenti oligonukleotidot használjuk a Hong által leírt didezoxi-szekvenáló módszerrel [BioscienceReports, 1,243 (1981)], amit kétszálú dezoxi-ribonukleinsavakra ad meg. A klónozott GAPDH génnek (lásd 9. ábra) azonos a szekvenciája a Holland és munkatársai által publikált pgap49l szekvenciájával [J. Bioi. Chem., 255,2596 (1980)].
c) A GAPDH 3’-irányú promoter elemeinek (lásd 10. ábra) előállítása
A -27 —675 pozícióig terjedő, az ATG-től számított GAPDH gént tartalmazó, 649 bázispárból álló Taql fragmenst (lásd 9. ábra) izoláljuk a fenti hibrid plazmidból Taql restrikciós endonukleázzal (New England Biolabs.), 1,2% agarózt tartalmazó lágy gélen elkülönítjük a dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket, és forró fenollal (lásd 23. példa) extraháljuk a dezoxi-ribonukleinsavat. A Taql fragmens klónozását a pBR322 plazmid Clal helyére a következőképpen végezünk:
pg pBR322 dezoxi-ribonukleinsavat 3 egység Clal (New England Biolabs.) endonukleázzal hasítunk, az eladó utasításai szerint, 300 ng fenolos extrakcióval tisztított és hasított vektort ligálunk 300 ng inszerthez (a 649 bázispárból álló Taq fragmens), 200 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt használva, összesen 20 pl térfogatú reakcióelegyben [lásd a 23. példa b) pontját]. Az E. coli HB101 transzformálását elvégezve, ampicillinre rezisztens sejtekből plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, és Taql, Dral restrikciós endonukleázokkal analizáljuk. A Taql fragmens orientációját Dral restrikciós endonukleázzal állapítjuk meg, továbbá azzal, hogy lokalizáljuk a plazmidon levő BamHI helyet. Azt a plazmidot szelektáljuk, amely a Taql helyet a -675 pozícióban tartalmazza, közel a pBR322 plazmid HindlII helyéhez. Ezt a plazmidot pBR322/GAPDH jellel jelöljük, és BamHI (New England Biolabs.) endonukleázzal emésztjük, ezután Bal31 emésztést végzünk a 23. példában megadottak szerint, azzal a különbséggel, hogy BglII linkereket adagolunk a reakcióelegyhez (5’-CAGATCTG3’, New England Biolabs.), és az emésztett plazmidot 5 pg/ml dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó, 20 pl össztérfogatú reakcióelegyben közvetlenül körré zárjuk. A Bal31 enzimmel rövidített Taql fragmenst restrikciós enzimekkel analizáljuk (BglII és HindlII). Két olyan kiónt választunk ki, amely a GAPDH promoter és az ATG kodontól számítva 200 bázispár és 265 bázispár nagyságú fragmenssel hosszabb. Mindkét fragmens tartalmazza a -140 bázispár pozícióban a TATA-boxot. Ezek a kiónok még tartalmazzák a pBR322 replikációs origóját, sorrendben pGAPDH-E és pGAPDH-F jellel jelöljük őket.
d) A 3’-irányú GAPDH promoter elemek kombinálása a PHO5 UASI (PHO5) fragmensével, és a deszulfato-hirudin proteint meghatározó régiójával
I. A GAPDH elem
A GAPDH promoter elem meghosszabbítására a Taql -27 pozíciójától közvetlenül a GAPDH gén ATG helyéig két szintetikus komplementer oligonukleotidot állítunk elő:
5’-CGAATAAACACACATAAATAAAG-3’ ’ -TTATTTGTGTGTATTTATTTCTTA A-5 ’.
Ezek az oligonukleotidok létrehozzák a GAPDH promoter szekvenciát a -26-tól a -5 pozícióig úgy, hogy egy terminális EcoRI helyet generálnak. A 24. példa c) pontja szerint előállított két Bal31 izolátum (pGAPDH-E és -F) két-két pg-ját 6 egység Taql endonukleázzal emésztjük 50 pl reakcióelegyben, és a kapott keveréket fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, és 10 pl vízben szuszpendáljuk. A szintetikus oligonukleotidokat kapcsoljuk úgy, hogy 2 pl mennyiségű, egyszálú oligonukleotidot tartalmazó oldatot 100 pl alábbi összetételű elegyben keverünk:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, és mM nátrium-klorid.
Az elegyet 3 percen át 90 ’C hőmérsékleten inkubáljuk, majd lassan szobahőmérsékletre hűtjük (3 óra alatt). A Taql enzimmel emésztett plazmidok 1-1 pg-ját 20szoros moláris fölöslegben lévő, kapcsolt oligonukleotiddal keverjük, 20 pl térfogatú reakcióelegyben, és 18 órán át 800 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázzal ligá. lünk. Az egész elegyet 3 egység BglII endonukleázzal (New England Biolabs.) emésztjük, és a kapott dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket l,5%xagarózt tartalmazó, lágy gélen elkülönítjük. A körülbelül 200, illetve 265 bázispárból álló BglII-EcoRI fragmenseket kivágjuk a gélből, extraháljuk, és etanollal kicsapjuk.
A pGAPDH-E plazmidot BglII és EcoRI endonukleázokkal emésztjük, és a nagy, 3,5 kb nagyságú fragmenst izoláljuk. Ezt a fragmenst vektorként használjuk a 265 és 200 bázispár nagyságú BglII-EcoRI fragmensek klónozására, a klónozást ligálással végezzük. Transzformációt követően plazmidot izolálunk, a fentiek szerint eljárva. A kapott plazmidokat pGAPDH-EL
HU 209 146 Β és pGAPDH-FL jellel jelöljük. A pGAPDH-EL és pGAPDH-FL plazmidokba klónozott BglII-EcoRI fragmensek nukleotid szekvenciáját a 11. ábrán adjuk meg. A fragmensek pontos nagysága sorrendben: 266 bázispár és 201 bázispár.
II. Az UASI (PHO5) reguláló elemek pg p31/Y plazmidot (lásd a 100 561 sorszámú európai szabadalmi bejelentést) 6 egység Clal (New England Biolabs.) restrikciós endonukleázzal emésztünk. A 3’ túlnyúló végeket az E. coli dezoxi-ribonukleinsav I polimerázzal (Klenow-fragmens) feltöltjük (Bethesda Research Laboratories) Maniatis (lásd előbb) szerint eljárva. Ezután a 23. példában megadottak szerint BglII linkereket (5’-CAGATCTG-3’) adagolunk. Sáli és BglII (New England Biolabs.) endonukleázokkal emésztjük a dezoxi-ribonukleinsavat, és 1% agarózt tartalmazó, lágy gélen elektroforézist végzünk. Az 548 bázispárból álló fragmenst kivágjuk a gélből, fenollal tisztítjuk, és a fentiek szerint eljárva, etanollal kicsapjuk.
III. A deszulfato-hirudint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav
Előállítjuk a pJDB207/PHO5(Eco)-HIR (lásd a 12. ábrát) plazmidot. Az UAS(PHO5)-GAPDH hibrid promoter elemek előnyös kapcsolására a PHO5 szignál szekvenciát is hordozó és deszulfato-hirudint kódoló régióhoz (mint például a pJDB207/PHO5-HIR plazmid) a hírvivő ribonukleinsav starthelyei és a kódoló régió ATG kodonja között az 5’-nem-transzlatált régióba egy EcoRI restrikciós helyet építünk be.
pg pJDB207/PHO5-HIR plazmid [lásd a 16. példa
d) pontját] dezoxi-ribonukleinsavat Dral (Boehringer) restrikciós endonukleázzal emésztünk. A kapott négy fragmenst 0,8% agarózt tartalmazó gélen különítjük el,
8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav pufferban. A gélről elkülönítjük a 4,2 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav fragmenst, elektroeluáljuk, és etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsavat 0,6 mg/ml koncentrációban, vízben szuszpendáljuk.
Előállítunk két szintetikus oligonukleotidot. Ezek a következők:
5’-AATTCGATTACCAATGITT - 3’ ’- GCTAATGGTTACAAA - 5’.
Sorrendben 2,3 pg és 2,9 pg oligo-nukleotidot kinázzal kezelünk 20 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:
mM trisz, pH=7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
0,5 mM adenozin-trifoszfát, és egység T4 polinukleotid kináz (Boehringer).
percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a két elegyet egyesítjük, és 10 percen át 75 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután szobahőmérsékletűre hagyjuk hűlni. A kapcsolt oligo-nukleotid linkereket -20 °C hőmérsékleten tároljuk.
6,5 pg (2,3 pmól) 4,2 kb nagyságú Dral-gyel előállított dezoxi-ribonukleinsav fragmenst inkubálunk 16 órán át, 15 °C hőmérsékleten, 70-szeres feleslegben lévő kinázzal kezelt és összekapcsolt oligo-nukleotid linker jelenlétében, 50 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:
mM trisz, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
3,5 mM adenozin-trifoszfát, és
800 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs.)
A T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz inaktiválására 10 percen át 85 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a fölös mennyiségben levő linkerek eltávolítására 10 mmól etilén-diamin-tetraecetsav és 300 mmól nátrium-acetát, pH = 6,0, jelenlétében 0,54 térfogat izopropanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat.
A dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI és HindlII restrikciós endonukleázokkal emésztjük. A kapott fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el,
8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav puffért használva. A gélről elektroelúcióval elkülönítjük a 643 bázispárból álló fragmenst, és etanollal kicsapjuk. 0,1 pmól/pl koncentrációban szuszpendáljuk a dezoxiribonukleinsavat. Az EcoRI-HindlII fragmens tartalmazza a PHO5 szignál szekvenciát, a deszulfato-hirudint kódoló szekvenciát, és a PHO5 transzkripciós terminátort.
A p31/R plazmidból (100561 sorszámú európai szabadalmi bejelentés) izoláljuk az 534 bázispárttól álló HPO5 promoter fragmenst, 10 pg p31/R dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI és BamHI restrikciós endonukleázokkal emésztünk. A kapott három fragmenst 0,6% alacsony olvadáspontú agaróz gélen 8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav pufferban elkülönítjük. Izoláljuk az 534 bázispárból álló BamHI-EcoRI fragmenst, amely tartalmazza a hírvivő ribonukleinsav starthelyeket hordozó PHO5 promotert.
A vektor fragmenst izoláljuk a pJDB207/PHO5-HIR plazmidból [lásd a 16. példa d) pontját]. 6 pg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat BamHI és HindlII endonukleázzal emésztünk. A 6,5 kb nagyságú nagy BamHI-HindlII fragmenst elkülönítjük a kis fragmenstől, 0,6% alacsony olvadáspontú agaróz gélen, 8,3 pH-jú trisz-borát-etiléndiamin-tetraecetsavas puffért használva.
A megfelelő ragadós végekkel rendelkező, fentiekben leírt három dezoxi-ribonukleinsav fragmenst a következő reakcióban ligáljuk:
pl reakcióelegyben ligáljuk a következő fragmenseket: 0,2 pmól (70 ng) 534 bázispárból álló BamHI-EcoRI PHO5 promoter fragmens, 0,2 pmól (85 ng) 643 bázispárból álló EcoRI-HindlII fragmens (ez tartalmazza a hirudint kódoló szekvenciát), és 0,1 pmól (0,4 pg) 6,5 kb nagyságú BamHI-HindlII vektor fragmens. A reakcióelegy összetétele a következő:
mM trisz, pH=7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz.
A reakciót 15 °C-on végezzük, 6 órán át. A ligációs elegy 1 pl-ét 100 pl kalciumionokkal kezelt, transzformációra alkalmas E. coli HB101 sejtszuszpenzióhoz adjuk.
HU 209 146 Β
100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban 12 transzformált, ampicillinre rezisztens telepet növesztünk fel külön-külön. A tenyészetekből plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izoláljuk, Holmes és munkatársai szerint [Anal. Biochem., 114, 193 (1981)], majd EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel emésztve analizáljuk a terméket. A várt restrikciós fragmenseket adó egy kiónt izoláljuk, és pJDB207/PHO5(Eco)-HIR jellel jelöljük,
IV. Az UASI(PHO5)-GAPDH hibrid promoterek ligálása a deszulfato-hirudin proteint meghatározó régióhoz pg pJDB207/PHO5(Eco)-HIR plazmid [lásd a
24. példa d) pontjának III. részét] dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI és Hindlll endonukleázzal emésztünk. A dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el, 8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav puffért használva. A 643 bázispárból álló fragmenst izoláljuk a gélről, elektroeluáljuk és etanollal kicsapjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 0,1 pmól/pl koncentrációban vízben szuszpendáljuk.
Hindlll és Sáli restrikciós endonukleázokkal teljesen emésztünk 6 pg pJDB207/PHO5-HIR plazmid dezoxiribonukleinsavat. A 6,3 kb nagyságú nagy fragmenst (vektor rész) lágy agaróz gélen elektroforézist végezve izoláljuk, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A vektor dezoxi-ribonukleinsav fragmenst ezután 0,05 pmól/pl koncentrációban, vízben szuszpendáljuk.
pg pGAPDH-EL plazmid [lásd a 24. példa d) pontjának I. részét] dezoxi-ribonukleinsavat Bgllí és EcorI endonukleázokkal emésztünk. A 266 bázispárból álló BglII-EcoRI fragmenst 1,2% agarózt tartalmazó gélen 8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav puffért használva elkülönítjük. Ezután elektroeluáljuk a gélről, majd etanollal kicsapjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 0,3 pmól/pl koncentrációban, vízben szuszpendáljuk.
pl térfogatú reakcióelegyben ligáljuk az alábbi fragmenseket: 0,3 pmól 548 bázispárból álló, az UAS1 (PHO5) szekvenciát tartalmazó Sall-BglI fragmens [lásd a 24. példa d) pontjának II. részét], a pGAPDH-EL 266 bázispárból álló BglII-EcoRI ffagmense, a pJDB207/PHO5(Eco)-HIR plazmid 643 bázispárból álló EcoRI-HindlII fragmensének 0,3 pmólnyi mennyisége, végül 0,12 pmólnyi, 6,3 kb nagyságú Sáli—Hindlll vektor fragmens. A ligálást 20 pl alábbi összetételű reakcióelegyben végezzük, 6 órán át, 15 °C hőmérsékleten:
mM trisz, pH=7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs.)
A ligációs elegyből 1 pl és 3 pl térfogatú alikvot mintákat veszünk, és 100 pl E. coli HB101 sejtekhez adjuk, amelyeket előzőleg kalciumionokkal kezeltünk. Az ampicillinre rezisztens telepekből plazmidot izolálunk, ezeket Sáli, Bgllí, EcoRI és Hindlll enzimekkel analizáljuk, a fentiek szerint eljárva [lásd a 24. példa d) pontjának III. részét]. Egy pozitív kiónt szelektálunk, ezt pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) jellel jelöljük.
A fentieket megismételjük pGAPDH-FL-ből származó, 201 bázispárból álló BglII-EcoRI fragmenssel. Egy szelektált plazmidot pJDB207/PAPFLHIR(UAS1) jellel jelölünk.
V. Az UAS1(PHO5)-UAS2(PHO5)-GAPDH hibrid promoterek ligálása a deszulfato-hirudint leíró régióhoz (lásd a 13. ábrát) pg pJDB207/PAPEL-HIR(UASl) és pJDB207/
PAPFL-HIR(UASl) plazmid dezoxi-ribonukleinsavat emésztünk Bgllí enzimmel. Fenollal extrahálunk, majd etanollal kicsapjuk a terméket, a 3’-rövidített végeket E. coli dezoxi-ribonukleinsav polimerázzal (Klenow-fragmens; Bethesda Research Laboratories) feltöltjük, a feltöltést Maniatis és munkatársai szerint végezzük (lásd előbb). Az enzimet 10 percen át 70 °C hőmérsékleten inkubálva inaktiváljuk. Ezután Sáli endonukleázzal tovább emésztjük a dezoxi-ribonukleinsavat, és a nagy,
7,2 kb nagyságú fragmenseket lágy agaróz gélen elektroforézissel izoláljuk, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Mindegyik fragmenst vízben szuszpendáljuk úgy, hogy 0,05 pmól/pl koncentrációjú oldatot kapjunk. A fragmensek tartalmazzák a hirudint kódoló szakaszt, a vektor szekvenciák nagy részét és a pGAPDH-FL vagy a pGAPDH-EL plazmidokból izolált mindkét különböző GAPDH promoter elemeket hordozó szakaszt.
A p31/Y plazmidot (100561 lajstromszámú európai szabadalmi leírás) BstEII endonukleázzal emésztjük, E. coli dezoxi-ribonukleinsav polimerázzal (Klenowfragmens) inkubáljuk a fentiek szerint eljárva, és ezután Sáli endonukleázzal hasítjuk. A 649 bázispárból álló fragmenst lágy agaróz gélen különítjük el, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk.
Az UAS1-UAS2(PHO5) promoter elemet tartalmazó, 649 bázispárból álló p31/Y fragmens 0,3 pmólnyi mennyiségét ligáljuk, mindkét 7,2 kb nagyságú fragmenshez (0,15 pmól), majd a ligálás után E. coli HB101 sejtekbe transzformáljuk, az előzőek szerint eljárva. Az ampicillinre rezisztens telepekből plazmidokat izolálunk, és restrikciós analízissel vizsgáljuk. Különálló kiónokat szelektálunk, a bennük levő plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az alábbi jelekkel jelöljük:
pJDB207/PAPEL-HIR(UAS 1 + UAS2) és pJDB207/PAPFL-HIR(UASl + UAS2).
25. példa
A GAPDH promoter elemek fúziója a deszulfato-hirudint kódoló szekvenciához A különböző hosszúságú két GAPDH promoter elemet [lásd a 24. példa d) pontjának I. részét) ligáljuk a PHO5 szignál szekvenciát is hordozó deszulfato-hirudin proteint kódoló régióhoz.
A két, 266, illetve 201 bázispárból álló elem tartalmazza a TATA-boxot, a hírvivő ribonukleinsav starthelyeket, és egy adeninben és timinden gazdag 5’-nem transzlatált régiót. Mindkét elem nukleotid szekvenciáját a 10. ábrán mutatjuk be.
Az elemek 3’-végei a GAPDH gén ATG kodonjától -5’ távolságra vannak, majd egy EcoRI restrikciós en34
HU 209 146 Β zim által felismerhető hely következik [lásd a beépített oligo-nukleotid linkért, 24. példa d) pontjának I. részét], tartalmazza továbbá az 5’-végeket a -198 és -263 pozícióban, az ATG helytől számítva egy BglII linker szakasszal együtt.
A BglII-EcoRI promoter fragmenseket egy olyan EcoRI-HindlII fragmenshez ligáljuk, amelyek hordozzák a PHO5 szignál szekvenciát és a deszulfato-hirudint leíró kodonokat, továbbá egy HindlII-BamHI vektor fragmenst.
pg pJDB207/PHO5-HIR plazmid dezoxi-ribonukleinsavat teljesen emésztünk Hindlll és BamHI restrikciós endonukleázokkal. A nagy, 6,5 kb nagyságú fragmenst (vektor rész) 0,8% agarózt tartalmazó gélen elkülönítjük 8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamintetraecetsav puffért használva. A fragmenst elektroeluáljuk a gélről, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A vektor dezoxi-ribonukleinsav fragmenst ezután vízben szuszpendáljuk úgy, hogy 0,05 pmól/pl koncentrációjú oldatot kapjunk.
A pGAPDH-EL plazmid 266 bázispárból álló BglII-EcoRI fragmensének 0,3 pmólnyi mennyiségét [lásd a 24. d) IV. példát], a pJDB207/PHO5(Eco)-HIR plazmid 643 bázispárból álló EcoRI-HindlII fragmensének 0,3 pmólnyi mennyiségét [24. d) III. példa], és 0,1 pmól 6,5 kb nagyságú HindlII-BamHI vektor fragmenst ligálunk 10 pl alábbi összetételű reakcióelegyben, 6 órán át, 15 °C hőmérsékleten:
mM trisz, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz. (Biolabs.) pl elegyet adunk 100 pl kalciumionokkal kezelt E. coli HB101 sejtszuszpenzióhoz. Az ampicillinre rezisztens telepekből plazmidot izolálunk, és a 24. példa d) III. pontjában megadottak szerint EcoRI restrikciós enzimmel analizáljuk. Egy pozitív kiónt szelektálunk. Akiónban levő plazmid dezoxi-ribonukleinsavat pJDB207/GAPEL-HIR jellel jelöljük.
Egy analóg plazmidot állítunk elő úgy, hogy a pGAPDH-FL plazmidból izolált 201 bázispárból álló BglII-EcoRI fragmenst használjuk. A szelektált kiónban levő plazmid dezoxi-ribonukleinsavat pJDB207/GAPFL-HIR jellel jelöljük.
26. példa
A szekretált deszulfato-hirudint kódoló szekvenciát tandem inszertumként hordozó expressziós plazmid előállítása (lásd a 14. ábrát)
Az alábbiak szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav egy dezoxi-ribonukleinsav fragmenst kétszerezve, fejtől-farokig elrendezésben tartalmaz. A kétszeresen jelen levő fragmens tartalmazza a GAPDH promotert, vagy egy PHO5-GAPDH hibrid promotert (lásd a 24., illetve a 25. példában megadottakat), tartalmazza a POH5 szignál szekvenciát, a deszulfato-hirudin kódoló szekvenciáját, és a PHO5 transzkripciós terminátort.
pg pJDB207/GAPEL-HIR plazmidot Hindin restrikciós endonukleázzal kezelünk. A 3’ rövidebb végeket E. coli dezoxi-ribonukleinsav I polimerázzal (Klenow-fragmens; Bethesda Research Laboratory) feltöltjük Maniatis (lásd előbb) szerint eljárva. 50 pl reakcióelegyben 1,85 pg 5’-GGTCGACC-3’ Sáli linkért (Biolabs.) kezelünk kinázzal:
mM trisz, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
0,5 mM adenozin-trifoszfát, és egység T4 polinukleotid kináz (Boehringer).
A reakciót 37 °C hőmérsékleten végezzük 45 percen át, majd 10 percen át 75 °C-on tartjuk a reakcióelegyet, amiután szobahőmérsékletre hagyjuk hűlni. 7 pg (1,5 pmól) Hindlll helyeit tompa végként tartalmazó linearizált pJDB207/GAPEL-HIR plazmidot (lásd fentebb) 16 órán át 15 °C hőmérsékleten inkubálunk, 80-szoros fölöslegben lévő, kinázzal kezelt és összekapcsolt Sál linkerrel, 30 pl térfogatú, alábbi összetételű reakcióelegyben:
mM trisz, pH=7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
3,5 mM adenozin-trifoszfát, és
800 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz (Biolabs.).
A T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz inaktiválására 10 percen át 75 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd a fölös mennyiségű linkerek eltávolítására a dezoxi-ribonukleinsavat 10 mmól etilén-diamin-tetraecetsav, 30 mmól nátrium-acetát (pH = 6,0) és 0,54 térfogat izopropanol jelenlétében kicsapjuk. A kicsapott dezoxi-ribonukleinsavat Sáli enzimmel hasítjuk. A kapott fragmenseket 1% agarózt tartalmazó gélen különítjük el, 8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav puffért használva. A gélről elektroelúcióval izoláljuk az 1,1 kb nagyságú Sáli fragmenst, fenollal extraháljuk, végül etanollal kicsapjuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 0,1 pmól/pl koncentrációban oldjuk.
pg pJDB207/GAPEL-HIR plazmidot Sáli enzimmel teljesen emésztünk. Fenolos extrakció és etanolos kicsapás után a dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl 8,0 pHjú, 50 mM trisz-oldatban szuszpendáljuk. Az oldathoz
4,6 egység borjú bél alkalikus foszfatázt (Boehringer) adunk. 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk, majd a foszfatázt 15 percen át 68 °C hőmérsékleten tartva, 100 mM nátrium-klorid, 5 mM etilén-diamintetraecetsav és 0,5 tömeg% nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében inaktiváljuk. A dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot 100 pl DE 52 (Whatman) anioncserélő oszlopra öntjük, amit előzőleg 10 mmól trisz, pH=7,5, 150 mM nátrium-klorid és 1 mM etilén-diamintetraecetsav eleggyel egyensúlyozzuk ki. Az oszlopot a fenti pufferral mossuk, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 400 pl alábbi összetételű eleggyel eluáljuk:
1,5 M nátrium-klorid,
10,0 mM trisz, pH = 7,5,
1,0 mM etilén-diamin-tetraecetsav. ’
A terméket etanollal kicsapjuk. A linearizált plaz35
HU 209 146 Β midot a nem hasított dezoxi-ribonukleinsavtól 0,6% agarózt tartalmazó gélen különítjük el, trisz-acetát puffért használva. A lineáris 7,3 kb nagyságú dezoxi-ribonukleinsav fragmenst elkülönítjük a gélről, elektroeluáljuk, fenollal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, majd 0,1 pmól/pl koncentrációban oldjuk.
μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben 0,2 pmól 1,1 kb nagyságú Sáli fragmenst és 0,1 pmól linearizált vektort ligálunk:
mM trisz, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
200 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz.
A reakciót 16 órán át végezzük 15 °C hőmérsékleten. 1 μΐ ligációs elegyet adunk 100 μΐ kalciumionokkal kezelt, transzformációra alkalmas E. coli HB101 sejtszuszpenzióhoz.
transzformált, ampicillinre rezisztens telepet külön-külön felnövesztünk LB táptalajban, ami 100 pg/ml ampicillint tartalmaz. A plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Holmes és munkatársai szerint [Anal. Biochem., 114, 193 (1981)] izoláljuk, és EcoRI restrikciós endonukleázzal analizáljuk. A várt restrikciós fragmenseket adó egy kiónt izoláljuk, és pJDB207/[GAPEL-HIR]D jellel jelöljük.
A pJDB207/GAPFL-HIR és a pJDB207/PAPFL/HIR (UAS1 + UAS2) plazmidokkal a fentiekkel azonos kísérletet végezzük el. A kapott, egy kiválasztott klónból izolált dezoxi-ribonukleinsavat pJDB207/[GAPFL-HIR]D, illetve a pJDB207/[PAPFL-HIR(UASl + UAS2)]D jellel jelöljük.
27. példa
A deszulfato-hirudin kódoló szekvenciáját négy inszertben tartalmazó expressziós plazmid előállítása Az élesztő expressziós vektorba tandem elrendezésben (fejtől-farokig elhelyezkedő) négy olyan dezoxi-ribonukleinsav fragmenst építünk be, amely az alábbi szekvenciákat tartalmazza: GAPDH-promoter, PHO5 szignál szekvencia, a deszulfato-hirudin kódoló szekvenciája, és a PHO5 transzkripciós terminátor.
Sáli restrikciós endonukleázzal kezelünk 10 pg pJDB207/[GAPFL-HIR]D plazmid (lásd a 26. példát) dezoxi-ribonukleinsavat. A kapott lineáris fragmens ragadós végeit E. coli dezoxi-ribonukleinsav polimeráz I-gyel (Klenow-fragmens, BRL) feltöltjük, Maniatis és munkatársai szerint (lásd előbb) eljárva.
0,94 pg Hindin linkért (5’-CAAGCTTG-3’, Biolabs.) kinázzal kezelünk, önmagában kapcsolunk, és ligáljuk a Sáli helyeket tartalmazó, és azokat tompa végekké alakított linearizált JDB207/[GAPFL-HIR]D plazmiddal. A linker ligálását és az izopropanollal való kicsapást a 26. példában megadottak szerint végezzük. A dezoxi-ribonukleinsavat ezután HindlII restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a kapott 2,2 kb nagyságú fragmenst elektroelúcióval izoláljuk, fenollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A dezoxi-ribonukleinsavat oldjuk úgy, hogy 0,1 pmól/pl koncentrációjú oldatot kapjunk.
HindlII restrikciós endonukleázzal teljesen emésztünk 5 pg pJDB207/[GAPFL-HIR]D plazmidot. A dezoxi-ribonukleinsavat ezután borjú bél alkalikus foszfatázzal (Boehringer) defoszforilezzük, majd DE52 ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk, és 0,6% agarózt tartalmazó gélről elektroelúcióval izoláljuk, ahogy azt a 26. példában megadtuk.
0,2 pmól 2,2 kb nagyságú HindlII fragmenst és 0,1 pmól linearizált vektor dezoxi-ribonukleinsavat ligálunk (lásd előbb). 1 pl alikvot mintát adunk 100 pl kalciumionokkal kezelt, transzformálásra kompetens E. coli HB101 sejtszuszpenzióhoz.
transzformált, ampicillinre rezisztens telepet LB-táptalajban egyenként felnövesztünk, a táptalajhoz oltás előtt 100 pg/ml ampcillint adunk. Plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, és Sáli, Xbal; Aval, Xbal kettős endonukleázos kezeléssel és BamHI emésztéssel analizáljuk. Az 1,1 kb nagyságú BamHI kapcsolt fragmens jelenléte azt jelzi, hogy az inszert fej-farok elrendeződésben van jelen a már a plazmádban lévő két másolathoz képest. Az egyik ilyen orientációjú inszert elrendeződéssel bíró plazmidot pJDB207/[GAPFL-HIR]T jellel jelöljük.
28. példa
A PHO5 promoter, az invertáz szignál szekvenciát és a deszulfato-hirudint meghatározó régiót hordozó élesztő expressziós vektor előállítása
A) Az invertáz szignál szekvencia oligo-dezoxl-ribonukleotidok szintézise
Dezoxi-ribonukleinsav szintetizátorral (380B Applied Biosystems modell) négy oligo-dezoxi-ribonukleotidot (1-1,1-2,1-3,1-4) szintetizálunk. A védőcsoportok eltávolítása után a szintetikus fragmenseket 12%-os, 8 mól karbamidot tartalmazó poliakril-amid gélen tisztítjuk. Sőmentes, tiszta oligo-dezoxi-ribonukleotidokat kapunk, Sep. Pák rendszert (Waters Associates) használva. Ezek a fragmensek egy duplexet alkotnak, amelyek a gyakori élesztő kodonokkal egy invertáz szignál szekvenciát hoznak létre. Nukleotid szekvenciájuk a következő:
HindlII
EcoRI MetLeuLeuGlnAlaPheLeuPheLeuLeu 1-1 5’AATTCATGCTTTTGCAAGCTTTCCTTTTCCTTTT 3’
1-2 3 ’GTACGAAAACGTTCGA AAGGAAAAGGAAAACCGAC 5 ’
AlaGlyPheAlaAlaLysIleSerAla
1-3 5’GGCTGGTTTTGCAGCCAAAATATCTGCATCTTAGCGTC 3’ i-4 3 ’caaaacgtcggttttatagacgtagaatcqcagagct 5 ’
Hgal_
Xhol
HU 209 146 Β
B) Az invertáz szignál szekvencia szubklónozása
a) A vektor előállítása egység EcoRI restrikciós endonukleázzal (Boehringer) emésztünk 1,5 pg p31H/SS-TPAÁ2 plazmidot (143 081 számú európai szabadalmi leírás) 50 pl alábbi összetételű reakcióelegyben:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM nátrium-klorid, mM merkapto-etanol.
Az emésztést 1 órán át végezzük 37 ’C hőmérsékleten. Az elegyhez 1 pl 2,5 mólos nátrium-klorid-oldatot adunk, majd 10 egység Xhol restrikciós endonukleázt (Boehringer), majd 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten inkubálunk. 0,8% agarózt tartalmazó gélen izoláljuk a
4,2 kb nagyságú vektort. A géldarabokat Micro Colloidor csőbe (Sartorius GmbH) tesszük, 200 pl TE elegygyel fedjük, majd elektroeluáljuk (50 percen át 90 mA erősségű árammal elektroforézist végzünk. Összegyűjtjük a TE-oldatot, majd 2,5 térfogat vízmentes etanollal kicsapjuk, miután 0,1 térfogat lOxTNE elegyet adtunk hozzá. 80%-os hideg etanollal mossuk a dezoxi-ribonukleinsav csapadékot, majd csökkentett nyomású térben szárítjuk. Ezután 6 pl TE elegyben szuszpendáljuk a terméket, amikor mikroliterenként 40 pmól dezoxi-ribonukleinsavat tartalmazó oldatot kapunk.
b) Az l-l, 1-2,1-3,1-4 oligo-dezoxi-ribonukleotidok kapcsolása, kinázzal való kezelése és ligálása a vektorral pl 0,5 M trisz-hidro-klorid, 8,0 pH-jú oldatban pM dezoxi-ribonukleotidot oldunk (mind a négy ribonukleotidból 10-10 pmólt). Az oldatot 5 percen át 95 °C-os vízfürdőben inkubáljuk. Ezután 5 óra alatt 30 PC hőmérsékletre hűtjük a vízfürdőt. Az összekapcsolódó termékeket tartalmazó elegyhez 2-2 pl 0,1 M magnézium-klorid, 0,1 M nátrium-klorid, 30 mM ditio-treitol, 4 mM adenozin-trifoszfát összetételű oldatot és 8 egység (1 pl) polinukleotid kinázt (Boehringer) adunk. A kinázos reakciót 1 órán át 37 ’C hőmérsékleten végezzük. Az összekapcsolt, kinázzal kezelt oligodezoxi-ribonukleotidokat és 60 pmól EcoRI-XhoI végekkel bíró vektor 1,5 pl térfogatú oldatban levő fragmensét 400 egység (1 pl) T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz enzimmel (Biolabs.) ligáljuk 14 ’C hőmérsékleten, 17 órán át. A reakció leállítására 10 percen át 65 ’C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet. 10 pl ligációs eleggyel E. coli HB101, kalciumionokkal kezelt sejteket transzformálunk [Dagert és Ehrlich, Gene, 56, 2328 (1979)]. 20 ampicillinre rezisztens telepet választunk ki. A sejtekből gyors izolálási módszerrel dezoxiribonuklein-savat izolálunk [Holmes és Quigley, Anal. Biochem., 114, 193-197 (1981)]. A dezoxi-ribonukleinsavat EcoRI és Xhol endonukleázokkal emésztjük, az EcoRI végen radioaktívan jelezzük, és 6% poliakrilamidot tartalmazó, 8 mólos karbamiddal készült gélen analizáljuk, dezoxi-ribonukleinsav markerként HaelII enzimmel hasított, radioaktívan jelzett pBR322 dezoxiribonukleinsavat használva. Mind a 20 kiónból izolált dezoxi-ribonukleinsav pontos futási távolságát meghatározzuk. Egy kiónt 100 pg/ml ampicillint tartalmazó, 100 ml térfogatú LB táptalajban felnövesztünk. A tenyészetből plazmid dezoxi-ribonukleinsavat izolálunk, amit p31RIT-12 jellel jelölünk.
C) A GAPFL promoter elem kapcsolása az invertáz szignál szekvenciához
Sáli és EcoRI restrikciós endonukleázokkal teljesen emésztjük az 5 pg tömegű p31R!T-12 plazmid dezoxiribonukleinsavat. A nagy, 3,3 kb nagyságú Sall-EcoRI fragmenst 0,6% agaróz gélen izoláljuk, trisz-acetátpuffert (pH=8,2) használva. Elektroeluáljuk a dezoxiribonukleinsavakat a gélről, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Sáli és EcoRI enzimekkel emésztünk 10 pg pJDB207/GAPFL-HIR plazmidot (lásd a 25. példát). A 477 bázispárttól álló Sall-EcoRI fragmenst 0,8% agaróz gélen izoláljuk, 8,3 pH-jú trisz-borát-etilén-diamin-tetraecetsav puffért használva. Elektroeluáljuk a dezoxi-ribonukleinsavat, fenollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk. Mindkét izolált dezoxi-ribonukleinsav fragmenst ligáljuk. A ligációs elegy egy alikvot mintájával E. coli HB101 kompetens sejteket transzformálunk. Az ampicillin-rezisztens telepeket felnövesztjük, és az izolált plazmid dezoxi-ribonukleinsavat HindlII—Sáli kettős emésztéssel analizáljuk. A megfelelő inszertet tartalmazó plazmidot p31/GAPFL-IT jellel jelöljük.
D) A pJDB207IGAPFL-l-HlR plazmid (lásd a 15. ábrát) előállítása
PstI és Sáli restrikciós endonukleázokkal teljesen emésztünk 25 pg p31/GAPFL-IT plazmid dezoxi-ribonukleinsavat. 10% agarózt tartalmazó preparatív gélen izoláljuk a 676 bázispárból álló fragmenst, a gélt triszborát-etilén-diamin-tetraecetsav pufferral készítjük el (pH = 8,3). A dezoxi-ribonukleinsavat elektroeluáljuk, DE52 ioncserélő kromatográfiával tisztítjuk, etanollal kicsapjuk, és Hgal emésztéskor ajánlott pufferban szuszpendáljuk úgy, hogy 0,1 pg/pl töménységű oldatot kapjunk. A Sall-PstI dezoxi-ribonukleinsav fragmenst 0,5 egység/pg dezoxi-ribonukleinsav koncentrációjú Ngal restrikciós endonukleázzal részlegesen emésztjük. Az emésztést 60 percen át végezzük 37 ’C hőmérsékleten. A reakciót etilén-diamin-tetraecetsav adagolásával állítjuk le, az EDTA végkoncentrációja 10 mmól. 1% agarózt tartalmazó preparatív gélen izoláljuk az 534 bázispárból álló Sáli— HGAI fragmenst. Elektroeluáljuk a dezoxi-ribonukleinsavat a gélről, DE52 gyantán kromatografálva tisztítjuk, etanollal kicsapjuk, és vízzel 0,1 pmól/pl koncentrációjú oldatot készítünk.
Ball és HindlII restrikciós endonukleázokkal 10 pg pJDB270/PHO5-HIR plazmid (lásd a 16. példát) dezoxi-ribonukleinsavat emésztünk. A kapott 587 bázispárból álló Ball-HindlII fragmenst 1% agarózt tartalmazó gélen izoláljuk. Elektroeluáljuk a dezoxi-ribonukleinsavat, etanollal kicsapjuk, és HinfI endonukleázzal tovább hasítjuk.
Az alábbi oligo-dezoxi-nukleotidok 1,3 pg-nyi (160 pmól) mennyiségét kinázzal kezeljük, majd öszszekapcsoljuk a 24. d) III. példában megadottak szerint eljárva:
HU 209 146 Β ’ -CTGC AGTTGTTTAC ACCG ACTGC ACCG-3 ’ ’-CAACAAATGTGGCTGACGTGGCTTA-5 ’.
0,6 Rg (1,6 pmól) HinfI enzimmel hasított BallHindlII fragmenst (lásd előbb) és 160 pmól kinázzal kezelt és összekapcsolt linkért ligálunk 16 órán át 15 °C hőmérsékleten, 83 μΐ alábbi összetételű elegyben:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol,
3,5 mM adenozin-trifoszfát, és
400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz.
percen át 85 °C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a fölös mennyiségű linker molekulák eltávolítására izopropanollal kicsapjuk a dezoxi-ribonukleinsavat [lásd a 24. d) III. példát]. 1% agarózt tartalmazó preparatív gélen izoláljuk az 584 bázispárból álló Hgal-HindlII fragmenst. Az elektroeluált, tisztított és etanollal kicsapott dezoxi-ribonukleinsavat vízben szuszpendálva 0,1 pmól/μΐ töménységű oldatot állítunk elő.
Rg pJDB207/PHO5-HIR plazmid dezoxi-ribonukleinsavat HindlII és Sáli restrikciós endonukleázokkal kezelünk, de izoláljuk a 6,2 kb nagyságú, nagy fragmenst.
μΐ alábbi összetételű reakcióelegyben 5 órán át 15 °C hőmérsékleten ligáljuk az alábbi fragmenseket:
534 bázispárból álló Sall-Hgal fragmens (0,2 pmól),
584 bázispárból álló Hgal-HindlII fragmens (0,2 pmól), és
6,2 kb nagyságú Sal-HindlII vektor fragmens (0,1 pmól).
A reakcióelegy összetétele a következő:
mM trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, mM magnézium-klorid, mM ditio-treitol, mM adenozin-trifoszfát, és
400 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz.
A ligálás befejezése után 1 μΐ alikvot mintával E. coli HB101 kompetens sejteket transzformálunk.
ampicillinre rezisztens, transzformált telepet egyenként felnövesztünk 100 Rg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban, izoláljuk a plazmid dezoxi-ribonukleinsavat, és HindlII és Sáli restrikciós endonukleázokkal kezeljük. A megfelelő restrikciós képet adó telepet izoláljuk, és pJDB207/GAPFL-I-HIR jellel jelöljük. Az invertáz szignál szekvencia azonosítását és a hirudint meghatározó szekvenciával való pontos kapcsolódást nukleotid szekvenálással bizonyítjuk.
29. példa
a) A Saccharomyces cerevisiae GRF 18 transzformálása
A Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzset (a, his3—11, his3—15, leu2-3, leu2-112, canR) a következő plazmidokkal transzformáljuk:
pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1), pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1), pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1 + UAS2), pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1 + UAS2), pJDB207/GAPEL-HIR, pJDB207/GAPFL-HIR, pJDB207/[GAPEL-HIR]D, pJDB207/[GAPFL-HIR]D, pJDB207/[PAPFL-HIR (UAS1 + UAS2)]D, pJDB207/[GAPFL-HIR]T, pJDB207/GAFPL-I-HIR.
A transzformációt Hinnen és munkatársai szerint végezzük [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75, 1929 (1978)]. A transzformált élesztő sejteket olyan élesztő minimál táptalajon szelektáljuk, amely leucint nem tartalmaz. A transzformáit élesztő telepek közül egyetegyet kiválasztunk, és az alábbi névvel jelöljük:
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPEL-HIR (UAS1 + UAS2), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1 + UAS2), Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPEL-HIR,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPEL-HIR]D,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/PJDB207/[GAPFL-HIR]D,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/[PAPFL-HIR (UAS1 + UAS2)]D, Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/[GAPFL-HIR]T,
Saccharomyces cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-I-HIR.
HU 209 146 Β
b) A transzformánsok fermentálása
A Saccharomyces cerevisiae GRF18 transzformáns sejtek mindegyikét 10 ml élesztő minimál táptalajban (Difco Yeast Nitrogén Base, aminosavak nélkül, 2% glükózzal és 20 mg/1 L-hisztidinnel kiegészítve). A fermentálást 50 ml térfogatú Erlenmeyer-lombikokban végezzük, lombikonként 10 ml táptalajt mérünk be, és 30 °C hőmérsékleten 24 órán át addig inkubáljuk a tenyészeteket, míg 3xl07 sejt/ml sejtsűrűséget érünk el. Azok a transzformánsok, amelyek a PHO5GAPDH hibrid promoterrel együtt tartalmazzák a plazmidot, derepressziót igényelnek a deszulfato-hirudin expressziójához. A sejteket 0,9%-os nátrium-klorid-oldattal mossuk, és 50 ml alacsony foszfátion-tartalmú minimál táptalajt oltunk velük, a táptalajt a Difco Yeast Nitrogén Base nevű, aminosavakat nem tartalmazó készítménnyel állítjuk elő. A táptalajt 0,03 g/1 káliumdihidrogén-foszfát, 10 g/1 L-aszparagin-oldattal egészítjük ki, a táptalajban lévő ammónium-szulfát, 2% glükóz és 1 g/1 L-hisztidin helyett. Az oltást úgy végezzük, hogy a tenyészet ml-enként 4xl06 sejtet tartalmazzon, majd inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten, 24 órán át olyan rázóasztalon, amely percenként 200-at fordul. A tenyészet sejttartalma ekkor lxlO8 sejt/ml.
A GAPDH promotert hordozó plazmidokat tartalmazó élesztő transzformánsok konstitutíven fejezik ki a deszulfato-hirudint. A sejteket az alábbi összetételű komplex táptalajban növesztjük:
pepton 5 g/1
élesztőkivonat 10 g/1
glükóz 20 g/1
szacharóz 40 g/1
ammónium-szulfát 3 g/1
kálium-dihidrogén-foszfát 2 g/1
magnézium-szulfát 0,5 g/1
nátrium-klorid 0,1 g/1
kalcium-klorid 0,1 g/1
biotin 10pg/l.
Ha a tenyésztést 30 °C hőmérsékleten végezzük olyan rázóasztalon, amely percenként 200-at fordul, úgy 48 órás tenyésztést követően lxlO9 sejt/ml sejtsűrűségű tenyészetet kapunk.
Az egyes kiemelt transzformáns élesztő törzsek tenyésztésekor kapott deszulfato-hirudin-mennyiségeket (trombin-gátlás alapján határoztuk meg) az alábbi táblázatban adjuk meg.
Saccharomyces cerevisiae GRF18/ Kiválasztott hirudin (mg/1) A sejtek összegyűjtésének ideje
pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1) 7 ' 24
pJDB207/PAPFL-HIR (UAS1 + UAS2) 8 24
pJDB207/GAFPL-HIR 41 48
pJDB207/GAPEL-HIR 35 48
pJDB207/[GAPFL-HIR]D 39 48
pJDB207/[GAPEL-HIR]D 31 48
Ezenkívül meghatároztuk, hogy az élesztő transzformánsok által termelt deszulfato-hirudin-származékok legalább 90%-a a táptalajba szekretálódik. Annak érdekében, hogy meghatározzuk a deszulfato-hirudin megoszlását a tenyészlé és a sejten belüli tér között, 3 1-es MBR fermentorban (MBR Bioreactor AG, Wetzikon, Svájc) fermentációt végzünk, és a fermentáció különböző időpontjaiban mintát veszünk. Az S. cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR törzzsel 3 1, az előzőekben megadott összetételű komplex táptalajt oltunk, és 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészetet, percenként 500-at forduló keverő működtetése közben. A tenyészeten óránként 200 1 levegőt buborékoltatunk át. így 5xl09 sejt/ml sejtsűrűséget érünk el. A 18., 24. és 42. órában mintát veszünk, és trombingátlás méréssel, valamint nagynyomású folyadék-kromatográfiás analízissel meghatározzuk a táptalajban és a sejten belül (a 22. példa szerint tárjuk fel a sejteket) levő deszulfato-hirudint. Az alábbi táblázatban adjuk meg az eredményeket.
Idő (óra) Deszulfato- hirudin (mg/1) trombin- gátlás HPLC
fermentlé 18 60 78
sejten belüli 18 7 <1
fermentlé 24 70 70
sejten belüli 24 9 <1
fermentlé 42 110 105
sejten belüli 42 9 <1
30. példa
A transzformánsok tenyésztése 3001 térfogatú fermentorban
a) Az inokulálás
S. cerevisiae GRF18/pJDB207/GAPFL-HIR sejteket tartalmazó, mélyhűtött ampullából egy sorozat ferdeagart oltunk. Egy vagy több ferdeagar-tenyészetet inkubálunk 3-5 napon át, 28-30 °C hőmérsékleten. Egy agar ferde sejtjeivel oltunk sterilen 100 ml inokulum táptalajt, amelyet 500 ml térfogatú Erlenmeyerlombikokban sterileztünk. A tenyészeteket 50 mm átmérőjű kör mentén percenként 250-et forduló rázóasztalon tenyésztjük, 28 °C hőmérsékleten. 48 óra múlva 2% inokulummal (első inokulum) oltunk 2 1 térfogatú Erlenmeyer-lombikokban sterilezett 600 ml térfogatú inokulum táptalajt. Ezeket a tenyészeteket (második inokulum) 48 órán át 28 °C hőmérsékleten inkubáljuk, percenként 120-at forduló (50 mm-es kör mentén) rázóasztalon. Az egyik tenyészettel (2%) 501 térfogatú saválló fermentorban sterilezett 30 1 térfogatú inokulum táptalajt oltunk (üzemi inokulum). Az inokulálás fermentációs paraméterei a következők: a keverő fordulatszáma 600 percenként (hatlapátos turbina típusú keverő, 115 mm átmérőjű); túlnyomás 0,3 bar; levegőztetés: 1 1 levegő/1 táptalaj/perc; a tenyésztést 28 °C hőmérsékleten végezzük, 48 órán át.
HU 209 146 Β
Az agar táptalaj és az inokulum táptalaj összetétele azonos; a különbség közöttük annyi, hogy az inokulum táptalajban nincs agar. Az összes inokulálást azonos összetételű táptalajban végezzük, amelynek összetétele a következő;
élesztő nitrogén bázis (Difco) 8,4 g/1
L-hisztidin 1,0 g/1
L-aszparaginxH2O 11,6 g/1 glükóz (külön sterilezett) 2,0 g/1.
Az agaros táptalaj összetétel az inokulum táptalaj összetételével azonos, de 1-enként 20 g agart adagolunk.
b) Aföfermentációs körülmények (3001 térfogat)
Az üzemi inokulum 5%-ával sterilen oltunk 600 1 térfogatú fermentorban sterilezett, 300 1 térfogatú termelő táptalajt. A 300 1 térfogatú termelő fermentor fermentációs paraméterei a következők: keverés: 450 fordulat/perc (egy hatlapátos keverő, átmérője: 230 mm); négy torló; túlnyomás: 0,3 bar; a táptalajon a 0-9. óra között 0,25 1 levegőt vezetünk át, per liter per perc; a 9. óra után az átbuborékoltatott levegő mennyisége 1 1/1 táptalaj/perc; a fermentációt 28 °C hőmérsékleten végezzük, 24-48 órán át. OD600: 1520.
Hozam: 15-25 mg/1 (az eredményeket nagynyomású folyadék-kromatográfiával és trombin-gátlás teszttel kaptuk).
A termelő táptalaj összetétele a következő:
pepton 5 g/1
élesztőkivonat 10 g/1
szacharóz 40 g/1
ammónium-szulfát 6 g/1
magnézium-szulfátx7 H2O 1 g/i
nátrium-klorid 0,1 g/1
kálium-dihidrogén-foszfát 2 g/1
kalcium-kloridx2 H2O 0,013 g/1.
A táptalaj pH-ja sterilezés előtt: 6,0. Habzásgátló-
ként UCON LB 625 habzásgátlót adagolunk.
31. példa
A deszulfato-hirudin izolálása a 300 l térfogatú fermentléből
A 30. példában megadottak szerint előállított, 3,3 pH-jú fermentlevet 17 °C hőmérsékletre hűtjük. A sejteket Westfalia SA-14 extraktorral (400-600 1/óra) elkülönítjük. A maradékot kiöntjük. Az enyhén zavaros felülúszót Skan-szűrősorozaton engedjük át (először 5 μπι, másodszor 1 μπι, végül harmadszor 0,22 μηι pórusnagyságú szűrőket használunk). A szűrlet pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk be, majd DEAE anioncserélő oszlopra öntjük. Az oszlopot 20 mM, 4,5 pH-jú nátrium-acetát-oldattal mossuk, és 20 mM, 3,1 pH-jú nátrium-acetáttal eluáljuk. Az így kapott 15 1 oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk be, majd 1,8 1-re töményítjük desztíllációval. 1 1 mintát Sephadex G-25 kromatografáló oszlopra öntünk (ágytérfogat: 8,0 1; az oszlopot vízzel egyensúlyozzuk ki). A deszulfato-hirudint tartalmazó frakciókat nagynyomású kromatográfiával analizáljuk. A 2,5 1 térfogatú, deszulfato-hirudint tartalmazó frakciót rotavaporban töményítjük, a desztillálást csökkentett nyomású térben végezzük. A desztillációs maradékként kapott 200 ml térfogatú oldatot fagyasztva szárítjuk.
g tömegű nyersterméket 50 ml vízben oldunk, az oldat pH-ját nátrium-hidroxiddal 7,5-re állítjuk be, és Q Sepharose gyors átfolyású oszlopra töltjük (ágytérfogat: 200 ml). Az oszlopot 100 mM, 3,9 pH-jú ammónium-formiát-oldattal mossuk, 25 ml térfogatú frakciókat gyűjtünk, a frakciók deszulfato-hirudin koncentrációját nagynyomású folyadék-kromatográfiával határozzuk meg. Az 1-65. frakciók deszulfato-hirudint tartalmaznak, ezeket összegyűjtjük (125 ml), és csökkentett nyomású térben rotavaporban töményítjük 10 ml végtérfogatra. A tömény oldatot Sephadex G-25 oszlopra öntjük (Amicon, vízzel kiegyensúlyozva) sómentesítés céljából. A kapott 25 ml térfogatú tiszta oldatot fagyasztva szárítjuk. A kapott szilárd halmazállapotú termék tiszta deszulfato-hirudin.
32. példa
A pJDB207IPHO5-EGLplazmid előállítása
Eglin C-t, egy 70 aminosavból álló, piócából származó polipeptidet meghatározó nukleotid szekvenciát szintetizálunk in vitro. A szekvenciát szubklónozzuk, és E. coli sejtben kifejezzük, ahogy azt a 146785 számú európai szabadalmi leírásban megadják. A 15. és 16. példában megadottak szerint eljárva elérjük, hogy az eglint meghatározó szekvencia leolvasási fázisban pontosan kapcsolódik a PHO5 szignál pepiidet leíró szekvenciához. Az inszertumot megfelelő orientációban tartalmazó kiónt hordozó vektort pJDB207/PHO5-EGL jellel jelöljük. Saccharomyces cerevisiae GRF18 törzset transzformálunk, az előzőek szerint eljárva. Transzformánsokat szelektálunk, és a 29. példában megadottak szerint tenyésztünk. A tenyészetben eglin C nem mutatható ki.

Claims (12)

1. Eljárás a táptalajba kiválasztódó deszulfato-hirudin előállítására élesztő-gazdasejtből, azzal jellemezve, hogy előállítunk egy, egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav inszertumot tartalmazó hibridvektort - ahol az inszertum áll egy élesztő expressziós szabályozó-szekvenciából, továbbá egy első dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát és egy második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát hordozó ribonukleinsav szegmensből, ahol az első szekvencia egy élesztő PHO5 vagy invertáz szignálpeptidet kódol és 5’-irányban, továbbá leolvasási fázisban helyezkedik el a második, egy érett deszulfatohirudint kódoló szekvenciával és a szegmens az expressziós szabályozó-szekvencia transzkripciós kontrollja alatt áll, és egy élesztő transzkripciós terminációs jeleket hordozó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciábólés az így kapott hibrid vektorral transzformált élesztő40
HU 209 146 Β gazdasejt megfelelő táptalajon való tenyésztése után a deszulfato-hirudint a táptalajból kinyerjük. (Elsőbbsége: 1985. 12. 12.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan hibridvektort állítunk elő, ahol expressziós szabályozó-szekvenciaként olyan hibridpromotert használunk, amely egy élesztőgén 5’-irányban elhelyezkedő aktivációs szekvenciájából és 3’-irányú promoter-elemekből áll és a promoter-elemek egy másik élesztőgénből származó funkcionális TATA-boxot tartalmaznak. (Elsőbbsége: 1985.12.12.)
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav inszertumot tartalmazó hibridvektort állítunk elő, ahol az inszertum egy PHO5 promoterből, egy első és második dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát hordozó ribonukleinsav szegmenséből, ahol az első PHO5 szignálszekvencia 5’-irányban és leolvasási fázisban helyezkedik el az egy érett deszulfato-hirudint kódoló második szekvenciával és a szegmens a PHO5 promoter transzkripciós szabályozás alatt áll, továbbá az inszertum PHO5 gén 3’-túlnyúló szekvenciájából áll, és az így kapott hibridvektorral transzformált élesztő-gazdasejtet tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1985.12.12.)
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav inszertumot tartalmazó hibridvektort állítunk elő, ahol az inszertum egy GAPDH promoterből, az érett deszulfato-hirudint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciával leolvasási fázisban levő, és attól 5’-irányban elhelyezkedő PHO5 szignál szekvenciát hordozó dezoxi-ribonukleinsav szegmensből, ahol a dezoxi-ribonukleinsav szegmens a GAPDH promoter transzkripciós szabályozása alatt áll, továbbá az inszertum PHO5 gén 3’-irányú túlnyúló szekvenciájából áll és az így kapott hibridvektorral transzformált élesztő gazdasejtet tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1985. 12. 12.)
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav inszertumot tartalmazó hibridvektort állítunk elő, ahol az inszertum egy, az élesztő PHO5 génjéből 5’-irányban elhelyezkedő aktivációs helyét (helyeit) tartalmazó hibrid promoterből és a GAPDH gén TATA-boxát is tartalmazó, 3’-irányban elhelyezkedő promoter elemet hordozó hibrid promoterből, továbbá az érett deszulfato-hirudint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciával leolvasási fázisban levő, és attól 5’-irányban elhelyezkedő PHO5 szignál szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav szegmensből, ahol a dezoxi-ribonukleinsav szegmens a hibrid promoter transzkripciós szabályozása alatt áll, továbbá az inszertum PHO5 gén 3’ túlnyúló szekvenciájából áll és az így kapott hibridvektorral transzformált élesztő gazdasejtet tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1985. 12. 12.)
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több dezoxi-ribonukleinsav inszertumot tartalmazó hibridvektort állítunk elő, ahol az inszertum egy PHO5 promoterből, az érett deszulfatohirudint meghatározó dezoxi-ribonukleinsav szekvenciával leolvasási fázisban levő, és attól 5’-irányban elhelyezkedő invertáz szignál szekvenciát hordozó dezoxi-ribonukleinsav szegmensből, ahol a dezoxi-ribonukleinsav szegmens a PHO5 promoter transzkripciós szabályozása alatt áll, továbbá az inszertum PHO5 gén 3’-túlnyúló szekvenciájából áll és az így kapott hibridvektorral transzformált élesztő gazdasejtet tenyésztjük. (Elsőbbsége: 1985. 12.12.)
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás az alábbi aminosav sorrendű dezJLeu^.GliüJ-deszulfato-hirudin HV1 variáns élesztő-gazdasejtből a táptalajba való kiválasztására.
Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly
Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben megadott struktúrájú deszulfato-hirudint kódoló hibridvektorral transzformált gazdasejt megfelelő táptalajon való tenyésztése után az adott deszulfato-hirudint a táptalajból kinyerjük. (Elsőbbsége: 1986.05. 29.)
Asn Leu Cys
Asn Lys Cys
Val Thr Gly
Gly Asp Phe
8. Az 1. igénypont szerinti eljárás az alábbi amino45 sav sorrendű dez-(Gln65)-deszulfato-hirudin HV1 variáns élesztő gazdasejtből a táptalajba való kiválasztására:
Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben megadott struktúrájú deszulfato-hirudint kódoló hibridvektorral transzformált gazdasejt megfelelő táptalajon való tenyésztése után az adott deszulfato-hirudint a táptalajból kinyerjük. (Elsőbbsége: 1986.05. 29.)
9. Az 1. igénypont szerinti eljárás az alábbi aminosav sorrendű deszulfato-hirudin HV1 variáns élesztő gazdasejtből a táptalajba való kiválasztására:
HU 209 146 Β
Val Val Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben megadott struktúrájú deszulfato-hirudint kódoló hibridvektorral transzformált gazdasejt megfelelő táptalajon való tenyésztés után az adott deszulfato-hirudint a táptalajból kinyerjük. (Elsőbbsége: 1986.05. 29.)
10. Az 1. igénypont szerinti eljárás az alábbi aminosav sorrendű deszulfato-hirudin HV2 variáns élesztő gazdasejtből a táptalajba való kiválasztására:
Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys
Ile Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin Cys Val Thr Gly
Glu Gly Thr Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe
Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gin, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben megadott struktúrájú deszulfato-hirudint kódoló hibridvektorral transzformált gazdasejt megfelelő táptalajon való tenyésztése után az adott deszulfato-hirudint a táptalajból kinyerjük. (Elsőbbsége: 1986. 05. 29.)
11. Az 1. igénypont szerinti eljárás az alábbi ami20 nosav sorrendű deszulfato-hirudin PA variáns élesztő gazdasejtből a táptalajba való kiválasztására:
Ile Thr TyrThr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys
Leu Cys GluGly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys
Ile LeuGlySer Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Val Thr Gly
Glu Gly ThrPro Lys Pro Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe
Glu Pro Ile Pro Glu Asp Alá Tyr Asp Glu, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben megadott struktúrájú deszulfato-hirudint kódoló hibridvektorral transzformált gazdasejt megfelelő táptalajon való tenyésztése után az adott deszulfato-hirudint a táptalajból'kinyérjük. (Elsőbbsége: 1986. 05. 29.)
12. A 7. igénypont szerinti eljárás az alábbi aminosav sorrendű dez-(Val)2-deszulfato-hirudin élesztőgazdasejtből a táptalajba való kiválasztására:
Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu Cys
Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu
Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Val Thr Gly Glu Gly
Thr Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu
Ile Pro Glu Glu Tyr, azzal jellemezve, hogy a tárgyi körben megadott struk- 13. A 8. igénypont szerinti eljárás az alábbi aminotúrájú deszulfato-hirudint kódoló hibridvektorral sav sorrendű dez-(Gln65)-deszulfato-hirudin élesztőtranszformált gazdasejt megfelelő táptalajon való te- 45 gazdasejtből a táptalajba való kiválasztására: nyésztése után az adott deszulfato-hirudint a táptalajból kinyerjük. (Elsőbbsége: 1986.05.29.)
HU865177A 1985-12-12 1986-12-11 Method for producing desulphato-hydrudine HU209146B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB858530631A GB8530631D0 (en) 1985-12-12 1985-12-12 Thrombin inhibitors
GB868613088A GB8613088D0 (en) 1985-12-12 1986-05-29 Thrombin inhibitors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT42523A HUT42523A (en) 1987-07-28
HU209146B true HU209146B (en) 1994-03-28

Family

ID=26290108

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU865177A HU209146B (en) 1985-12-12 1986-12-11 Method for producing desulphato-hydrudine

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0225633B1 (hu)
JP (2) JPH0650990B2 (hu)
AT (1) ATE79403T1 (hu)
AU (1) AU615413B2 (hu)
CA (1) CA1341496C (hu)
DE (1) DE3686399T2 (hu)
DK (1) DK175492B1 (hu)
ES (1) ES2051688T3 (hu)
FI (1) FI94773C (hu)
GR (1) GR3006248T3 (hu)
HU (1) HU209146B (hu)
IE (1) IE57859B1 (hu)
IL (1) IL80932A (hu)
MY (1) MY101203A (hu)
NO (1) NO178035C (hu)
PH (1) PH31277A (hu)
PT (1) PT83898B (hu)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3583361D1 (de) * 1984-06-14 1991-08-08 Ucp Gen Pharma Ag Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren.
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation
GB8620926D0 (en) * 1986-08-29 1986-10-08 Delta Biotechnology Ltd Yeast promoter
CA1341032C (en) * 1987-01-23 2000-06-20 John L. Krstenansky Anticoagulant peptides
US5789540A (en) * 1987-01-23 1998-08-04 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US6005071A (en) * 1987-01-23 1999-12-21 Merrell Pharmaceuticals Inc. Anticoagulant peptides
US5256559A (en) * 1988-03-04 1993-10-26 Biogen, Inc. Methods and compositions for inhibiting platelet aggregation
GB8809860D0 (en) * 1988-04-26 1988-06-02 Ciba Geigy Ag Process for production of polypeptides
GB8907110D0 (en) * 1988-05-04 1989-05-10 Ciba Geigy Ag Improvements in the production of polypeptides
US5268296A (en) * 1988-06-11 1993-12-07 Ciba-Geigy Corporation DNA vector and recombinant host cell for production of hirullin P6 and P18
US5167960A (en) * 1988-08-03 1992-12-01 New England Deaconess Hospital Corporation Hirudin-coated biocompatible substance
US5112615A (en) * 1988-08-03 1992-05-12 New England Deaconess Hospital Corporation Soluble hirudin conjugates
GB8826428D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Biopharm Ltd Antithrombin
FR2646437B1 (fr) * 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
US5179196A (en) * 1989-05-04 1993-01-12 Sri International Purification of proteins employing ctap-iii fusions
DE4009268A1 (de) * 1990-03-22 1991-09-26 Consortium Elektrochem Ind Sekretion von hirudinderivaten
US6514730B1 (en) 1991-03-21 2003-02-04 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Secretion of hirudin derivatives
PT592358E (pt) * 1992-09-04 2001-03-30 Ucp Gen Pharma Ag Processo para a producao de inibidores de proteases
AU707657B2 (en) 1995-02-09 1999-07-15 Behringwerke Aktiengesellschaft Process for the production of proteins
US7795205B2 (en) 2004-04-12 2010-09-14 Canyon Pharmaceuticals, Inc. Methods for effecting regression of tumor mass and size in a metastasized pancreatic tumor
JP7284955B2 (ja) * 2020-07-20 2023-06-01 フォーデイズ株式会社 神経幹細胞の増殖促進剤及びそれを用いた神経幹細胞の増殖促進方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1984004330A1 (en) * 1983-04-22 1984-11-08 Amgen Secretion of exogenous polypeptides from yeast
EP0656418B1 (en) * 1983-10-03 2002-12-04 Chiron Corporation Superoxide dismutase and expression in microorganisms
EP0143081B1 (en) * 1983-11-21 1989-08-23 Ciba-Geigy Ag Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast
DE3342139A1 (de) * 1983-11-22 1985-05-30 Ciba-Geigy Ag, Basel Desulfatohirudine, verfahren zu ihrer herstellung und pharmazeutische mittel
DE3586333T2 (de) * 1984-03-27 1992-12-10 Transgene Sa Expressionsvektoren fuer hirudin, transformierte zellen und verfahren zur herstellung von hirudin.
DE3583361D1 (de) * 1984-06-14 1991-08-08 Ucp Gen Pharma Ag Verfahren zur herstellung von thrombin-inhibitoren.
FR2568891B1 (fr) * 1984-08-09 1988-05-27 Transgene Sa Procede de preparation d'une souche, notamment de levure, transformee par un vecteur d'expression, qui peut etre cultivee sur un milieu complet sans pression de selection et souche ainsi obtenue
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
FR2593518B1 (fr) * 1985-05-02 1989-09-08 Transgene Sa Vecteurs d'expression et de secretion de l'hirudine par les levures transformees
GB8521496D0 (en) * 1985-08-29 1985-10-02 Ciba Geigy Ag Repressible yeast promoters
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation

Also Published As

Publication number Publication date
PH31277A (en) 1998-07-06
PT83898B (pt) 1989-06-30
FI94773C (fi) 1995-10-25
DK595286D0 (da) 1986-12-11
IL80932A0 (en) 1987-03-31
DK175492B1 (da) 2004-11-08
HUT42523A (en) 1987-07-28
EP0225633A2 (en) 1987-06-16
FI865003A0 (fi) 1986-12-08
JPS62208296A (ja) 1987-09-12
IL80932A (en) 1998-02-22
IE863244L (en) 1987-06-12
NO865007D0 (no) 1986-12-11
JPH0787791B2 (ja) 1995-09-27
NO178035B (no) 1995-10-02
FI94773B (fi) 1995-07-14
DE3686399T2 (de) 1993-01-14
JPH0650990B2 (ja) 1994-07-06
JPH06197766A (ja) 1994-07-19
NO178035C (no) 1996-01-10
DK595286A (da) 1987-06-13
ATE79403T1 (de) 1992-08-15
DE3686399D1 (de) 1992-09-17
ES2051688T3 (es) 1994-07-01
GR3006248T3 (hu) 1993-06-21
MY101203A (en) 1991-08-17
NO865007L (no) 1987-06-15
CA1341496C (en) 2006-02-14
IE57859B1 (en) 1993-04-21
AU615413B2 (en) 1991-10-03
EP0225633A3 (en) 1988-11-30
PT83898A (en) 1987-01-01
AU6650486A (en) 1987-06-18
EP0225633B1 (en) 1992-08-12
FI865003A (fi) 1987-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU209146B (en) Method for producing desulphato-hydrudine
FI90787C (fi) Menetelmä desulfatohirudiinin valmistamiseksi
US5102789A (en) Production of epideramal growth factor in pichia pastoris yeast cells
AU600667B2 (en) Vectors for the expression and secretion of hirudin by transformed yeasts
EP0285448B1 (en) Leukaemia inhibitory factor
FI80720B (fi) Saccharmyces cerevisiae-hybridvektorer och deras anvaendning foer framstaellning av plypeptider.
JP2733602B2 (ja) ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母
US5516656A (en) Production of a new hirudin analog and anticoagulant pharmaceutical composition containing the same
Omura et al. The histidine residue of codon 715 is essential for function of elongation factor 2
US20020142414A1 (en) Process for the preparation of protease inhibitors
US6410272B1 (en) Production of thrombin inhibitors
JPH0649719B2 (ja) ヒルディン誘導体
US6342373B1 (en) Process for preparing recombinant eglin, protease inhibitor
AU623881B2 (en) Modified proteins
HU214698B (hu) Eljárás rekombináns deszulfátó-hirudin HV-1 peptidek előállítására
US5420113A (en) [Leu13]motilin, DNAs coding for same and methods for producing same
CA2139612A1 (en) Novel inhibitor
KR940011534B1 (ko) 억제성 효모 프로모터의 제조방법
JPH0746995A (ja) プラスミド及び組替え体 デスルファトヒルヂン ｈｖ−１ ペプチドの製法

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: UCP GEN-PHARMA AG,CH

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: NOVARTIS AG (NOVARTIS SA, NOVARTIS INC.), CH

Owner name: UCP GEN-PHARMA AG., CH

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: UCP GEN-PHARMA AG, CH

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: UCP GEN-PHARMA AG, CH