DD253642A5 - Verfahren zur Synthese der rekombinanten DNA eines Einzelpolypeptidkettenproteaseinhibitors - Google Patents

Abstract

Eine synthetische DNA-Sequenz und dessen genetische Aequivalente werden beschrieben, wobei die Sequenzen in der Lage sind, wenn sie in rekombinanten DNA-Verfahren verwendet werden, die Herstellung eines Serinproteaseinhibitorproteins zu veranlassen. Die rekombinanten DNA-Methoden fuer die Herstellung des Proteaseinhibitorproteins sind ebenso offenbart. Diese Methoden beinhalten entweder die synthetische DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung oder natuerliche Sequenzen, die aus einer menschlichen cDNA oder Genom-Bibliothek isoliert wurden.

Description

Verfahren zur Synthese der rekombinanten DNA eines Einzelpo l'y pe pt idket te np ro tease inhibitors

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese der rekombinanten DNA eines Einzelpolypeptidkettenproteaseinhibitors»

Insbesondere betrifft die Erfindung rekombinierte Verfahren für die Herstellung von Serinproteaseinhibitoren und für diesen Zweck zu verwendende DNA-Sequenzen_β

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Endogene, proteolytische Enzyme dienen dazu, eindringende Organismen., Antigen-Antikörper-Komplexe und bestimmte Gewebeproteine, die für den Organismus nicht mehr nötig oder nützlich sind, abzubauen,, In einem normal funktionierenden Organismus werden proteolytische Enzyme in beschränkter Menge hergestellt und werden zum Teil, durch die Synthese von Protease-Inhibitoren regulierte

Eine große Anzahl der natürlich vorkommenden Protease-Inhibitoren dient dazu, die endogenen Proteasen durch Limitierung deren örtlicher und zeitlicher Reaktionen zu kontrollieren* Weiterhin können die Protease-Inhibitoren Proteasen inhibieren, die durch infektiöse oder parasitäre Substanzen in den Körper gelängt sind* Gewebe, die in besonderem Maße proteolytischen Angriffen und Infektionen aus-

-2.9.86- 371283

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- la -

gesetzt sind, beispielsweise die Gewebe des Atemtrakts sind reich an Proteaseinhibitoren, \

Proteaseinhibitoren machen ungefähr IO % der menschlichen Plasmäproteine aus. Aus dieser Quelle wurden mindestens acht Inhibitoren isoliert und in uer Literatur charakterisiert. Zu diesen Inhibitoren gehören pi_-Macroglobulin ( o< 2^M) ' pt ₁~^p'"otease-Inhibitor (cC.PI), ö^.-Antichymotrypsin ( oC .Achy)> ß.-Anticollagenase (ß.AC) und Inter-eC-Trypsin-Inhibitor (IeCI).

Eine Störung des Protease/Protease-Inhibitor-Gleichgewichts kann zu einer durch die Protease hervorgerufenen

Π.86- 371283

, &. *S ^ W Aj, g

!

Zerstörung des Gewebes führen, die sich in einem Emphysem, Arthritis, Glomerulonephr i'tis , Periodontitis , Muskeldystrophie, Tumorausbreitung und verschiedenen anderen pathologischen Zuständen ausdrückt. In bestimmten Situationen, beispielsweise schweren pathologischen Prozessen, wie Sepsis oder akuter Leukämie, steigt die Menge der vorhandenen freien proteolytischen Enzyme als Folge der Enzymausschüttung aus den sekretorischen Zellen an. Zusätzlich, oder in anderen Situationen in gesonderter Form, kann eine verminderte regulierende Inhibitorkapazität des Organismus auch eine Änderung in dem Protease/Protease-Inhibitor-Gleichgewicht verursachen. Ein Beispiel für eine derartige verminderte regulierende Inhibitorkapazität ist der Mangel an oC -Protease-Inhibitor, der in hohem Maße mit der Entwicklung eines Lungenemphysems korreliert ist.

In Organismen, in denen derartig anormale Bedingungen herrschen, können ernsthafte Zerstörungen des Organismus auftreten, wenn nicht Maßnahmen ergriffen werden, um die proteolytischen Enzyme zu kontrollieren. Man hat daher nach Protease-Inhibitoren gesucht, die für die Anwendung an Organismen geeignet sind, um proteolytische Enzyme zu kontrollieren.

Ein Beispiel einer Serinprotease, die aus pharmakologischer Sicht von besonderem Interesse ist, ist die Leukozytenelastase. Wenn Leukozytenelastase im extrazellulären Raum freigegeben wird, zerstört sie Bindegewebe und andere wertvolle Proteine. Für einen normal funktionierenden Organismus ist es nötig, daß eine bestimmte Menge an Bindegewebe und anderen Proteinen abgebaut wird. Die Anwesenheit einer übermäßigen Menge an Leukozytenelastastase wurde jedoch mit verschiedenen pathologischen Zuständen, beispielsweise dem Emphysem

und rheumatischer Arthritis in Verbindung gebracht. Um diesen Wirkungen der Leukozytenelastase zu begegnen, wenn diese in Mengen vorhanden ist, die das normale Maß übersteigen , wurde nach einem Protease-Inhibitor gesucht, der gegen Leukozytenelastase wirksam ist.Ein derartiger Protease-Inhibitor ist insbesondere nützlich, wenn er durch die Methoden der rekombinanten DNA herstellbar ist und so in gereinigter Form und ausreichender Menge für die pharmazeutische Anwendung hergestellt werden kann.

Kürzlich wurden mindestens zwei Leukozytenelastase-Inhibitoren in der Literatur identifiziert. Das eine Protein, das bei Schiessler et al., "Acid-Stable Inhi-

IQ bitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions: Biochemistry and Possible Biological Function," in Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes, Havemann.et al. (eds),Urban and Schwarzenberg, Inc. (1978) beschrieben wurde, wurde aus menschlichem Samenplasma und Sputum isoliert 'und in der Weise charakterisiert, daß es eine Größe von ungefähr 11 Kda und ein Tyrosin als N-terminale Aminosäure aufweist. Soweit im Hinblick auf dieses Protein aus der Literatur zu entnehmen ist, wurde bisher nur eine teilweise Aminosäuresequenz-A.nalyse. durchgeführt, doch sogar diese Teilsequenz läßt erkennen, daß dieses Protein sich wesentlich von dem Protein der vorliegenden Erfindung unterscheidet. Die Berichte über die Sequenz dieses Pro-, teins, in Verbindung mit den Aminosäuresequenz-Daten

QQ für Proteine der vorliegenden Erfindung weisen für die Erfinder der vorliegenden Erfindung 'darauf hin, daß das Produkt, das durch Schiessler et al. sequenziert wurde, ein Abbauprodukt eines Proteins sein kann, das keine Einzel-Polypeptidkette war.

.. C -IO 0 Γ _ ~! ,",Q 7 -i

Ein zweites Protein, das in einem Fall aus menschlichem Plasma isoliert wurde, wurde oC -, -Protease-Inhibitor genannt. Die Arbeit an diesem Protein ist in einer Übersicht zusammengefaßt bei Travis and Salvesen, Annual Review of Biochemistry 52: 655-709 (1983). Die Berichte bezüglich der Aminosäuresequenz dieses Proteins deuten darauf hin, daß es sich ebenfalls wesentlich vom Protein der vorliegenden Erfindung unterscheidet.

Aufgrund der wesentlichen -Strukturunterschiede zwischen den Einze-1-Polypeptid-Ketten-Proteinen der vorliegenden Erfindung und jeglichen Einzel-Polypeptid-Ketten-Serinproteaseinhibitoren des Standes der Technik sind die Einzel-Polypepdid-Ketten-Serinproteaseinhibitoren des Standes der Technik nicht' als"im wesentlichen homolog" zu den Proteinen der vorliegenden Erfindung anzusehen.

Eine weitere Protease von besonderem Interesse aus pharmakologischer Sicht ist Trypsin. Es ist bekannt, daß Trypsin den Abbau von Gewebe bestimmter weicher Organe, beispielsweise des Pankreasgewebes während einer Vielzahl von akuten Zuständen, beispielsweise Pankreatitis, initiiert. Es sind verschiedene Vorstöße in die Richtung der Behandlung dieser Zustände durch die Verwendung von Proteinen unternommen worden, von denen man hoffte,-sie würden die Aktion von Trypsin inhibieren, jedoch ohne nennenswerten Erfolg. Beispiele für solche Vorstöße sind Vers'uche, exogene Rindertrypsininhibitoren bei der Behandlung menschlicher Pankreatits zu verwenden. Während diese Techniken in Europa versucht wurden, wurden sie durch die U.S. Food and Drug Administration nicht als wirksam anerkannt. Es besteht daher ein Bedarf an einem Proteaseinhibitor, der sich als wirksam erweist bei der Neutralisierung eines Trypsinüberschusses in einer Vielzahl akuter und chronischer Zustände.

&12.85

5-

Ebenso wie im Fall des oben diskutierten Leukozytenelastase-Inhibitors ist auch ein Trypsin-Inhib.itor insbesondere dann nützlich,wenn er durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt und isoliert werden kann und zwar in gereinigter Form und in ausreichenden Mengen, um pharmazeutisch verwendbar zu sein.

Eine andere Protease, die in großen Mengen in Leukozyten vorhanden ist, ist Cathe-psin G. Cathepsin G ist dafür bekannt, daß es in vitro eine Vielzahl wertvoller Proteine abbaut, einschließlich derer des Komplementwegs. Eine weitere Protease, die eine Rolle bei der Pankreatitis spielen kann, ist die Pankreaselastase. Inhibitoren für diese Proteasen sind somit auch von potentiellern pharmazeutischem Wert.

Die Leukozytenelastase, das Trypsin, das Cathepsin G und die Pankreaselastase sind Beispiele einer Klasse von Proteasen, die als Serinproteasen bekannt sind, die Elemente gemeinsamer Strukturen und Mechanismen aufweisen. IhVe Aktivität gegen verschiedene Substrate und ihre Empfindlichkeit für verschiedene Inhibitoren hält man für das Ergebnis von Änderungen lediglich einiger weniger Aminosäure'reste. In Analogie dazu, ist es möglieh, sich eine Klasse von Serinproteaseinhibitoren vorzustellen, die ebenfalls gemeinsame Strukturelemente und Mechanismen aufweisen, bei denen Änderungen bezüglich nur verhältnismäßig weniger Aminosäuren ebenfalls in der Inhibierung verschiedener Proteasen resultieren können, wobei mindestens ein Mitglied dieser Klasse jede Serinprotease der vorhergenannten Klasse inhibieren wird. Die Klasse der Serinproteaseinhibitoren wäre dann von substantiellem Wert.

5.12.8

5 -

Überraschenderweise haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine DNA-Sequenz gefunden, die in der Lage ist, die Synthese derartiger Serinproteaseinhibitoren zu dirigieren, wobei dieser Inhibitor biologisch äquivalent ist zu einem Inhibitor, der aus dem Ohrspeicheldrüsensekret isoliert wurde. Der Protease-Inhibitor der vorliegenden Erfindung, der durch rekombinante DNA-Methoden, wie in dieser Anmeldung beschrieben, hergestellt wurde, hat vermutlich mindestens zwei aktive Stellen. Eine dieser aktiven Stellen übt Leukozytenelastase inhibierende Wirkungen aus und die zweite aktive Stelle zeigt inhibitorische Aktivität gegen Trypsin.

Man vermutet, daß der rekombinante Inhibitor,' der durch die vorliegende Erfindung hergestellt wird, in bemerkenswerter Weise resistent ist gegen das Denaturieren durch Hitze und Säure und resistent ist gegen proteolytischen Abbau durch eine Vielzahl proteolytischer Enzyme. Die Verwendung des Ausdrucks "rekombinanter Inhibitor" in der vorliegenden Anmeldung bezieht sich auf einen Protease-Inhibitor, der durch rekombinante DNA-Methoden und' Techniken hergestellt wurde. Die aktive Form des rekombinanten Inhibitors der vorliegenden Erfindung ist weiterhin thermodynamisch stabil unter Bedingungen, die normalerweise im Säugetierkörper exträzellulär vorkommen. Denaturierte Formen des rekombinanten Protease-Inhibitors haben auch die Fähigkeit, Disulfidbindungen zu bilden und die nichtkovalenten Interaktionen auszuüben, die nötig sind, um eine aktive tertiäre Struktur in Abwesenheit eines biochemischen Stimulans anzunehmen.

Die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, die im folgenden genauer beschrieben werden, sind /ähig, die Synthese eines Proteins zu dirigieren, die in großem

S. 12.8 5 - 3 C 3 7 -i 7

Maße von anderen publizierten Leukozytenelastase-Inhibitor-Sequenzen differiert. Das Identifizieren der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung hat daher die Erfindung der rekombinanten DNA-Methoden des Herstellern des neuen rekombinanten Protease-Inhibitors möglich gemacht, wie er in dieser Anmeldung offenbart ist.

Derartige rekombinante Verfahren werden es erlauben, die Inhibitoren in Mengen und Reinheiten herzustellen, die ausreichend sind, um ökonomisch pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verfügung zu stellen, die Serinproteaseinhibitoraktivität haben. Desweiteren hat die Identifizierung der DNA-Sequenz die Erfindung von rekombinanten DNA-Methoden möglich gemacht, um Analoge des oben beschriebenen Serinproteaseinhibitors herzustellen ..

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante DNA-Methoden zur Herstellung von Pratease-Inhibitoren allgemein und auf die Herstellung von rekombinanten Inhibitoren, die gegen menschliche polymorphonukleare Granulozytenprotease (PMN) im besonderen gerichtet sind. Ganz besonders bezieht sich die vorliegende Erfindung auf rekombinante DNA-Methoden zum .Herstellen von Inhibitoren für menschliche Serinproteasen, einschließlich der Leukozytenelastase und dem Trypsin.

Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf rekombinante DNA-Methoden zum Herstellen von Analogen der genannten Serinproteaseinhibitoren. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf synthetische und natürliche DNA-Sequenzen, die.in rekombinanten DNA-Methoden verwendet werden können, wie es im folgenden beschrieben wird .

~ in η r -i .·--. O *7 ,^:

Ziel der Erfindung

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens für eine rekombinante DNA-Synthese eines Serinproteaseinhibitors, wobei der Inhibitor eine Einzelpolypeptidkette ist, die Serinproteaseinhibitorenaktivität ausübt. Diese Inhibitoren besitzen eine Aktivität,'die biologisch äquivalent ist zu der Aktivität, die durch native Leukozytenelastase- oder Trypsin-Inhibitoren ausgeübt wird, die aus menschlichen Ohrspeicheldrüsensekreten isoliert wurden ο

Um alternative rekombinante DNA-Synthesen dieser Serinproteaseinhibitoren zu erleichtern, ist es ein weiteres Ziel der Erfindung, synthetische DNA-Sequenzen zur Verfugung zu stellen, die in der Lage sind, die Herstellung dieser rekombinanten Proteaseinhibitoren zu dirigieren; ebenso sollen äquivalente natürliche DNA-Sequenzen zur Verfugung gestellt werden. Derartige natürliche DNA-Sequenzen können von einer cDNA isoliert werden oder aus einer Genombibliothek, aus der das Gen, das fähig ist, die Synthese desProtease-Inhibitors zu dirigieren, identifiziert und isoliert werden kann _β

Weiterhin ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, rekombinante DNA-Methoden für die Herstellung von Analogen der Protease-Inhibitoren zur Verfugung zu stellen, wie sie oben diskutiert wurden sowie korrespondierende analoge DNA-Sequenzen, die in derartigen Verfahren zu verwenden sind_o

Zusätzliche Ziele und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung dargelegt und können zu einem anderen Teil- aus der Beschreibung in naheliegender Weise

entnommen vv erden oder sind bei der Durchführung der Erfindung erlernbar« Die Ziele und Vorteile können realisiert ,und erreicht.werden mit Hilfe der Angaben und Kombinationen, wie sie im besonderen in den anhängenden Patentansprüchen herausgestellt sind» - ,

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, in Übereinstimmung mit den Absichten der vorliegenden Erfindung eine DNA-Sequenz aufzufinden, die in der Lage ist, durch rekombinante DNA-Methoden die Herstellung eines Protease-Inhibitors zu dirigieren/der, in seiner aktiven Form, ein Einzelpeptidkettenprotein ist, das eine Serinproteaseinhibitoraktivität ausübt. ,

Erfindungsgemäß wird ein rekombinanter Protease-Inhibitor zur Verfügung gestellt, der in bemerkenswerter Weise gegen die Denaturierung durch Hitze und Säure resiatent ist. Der erfindungsgemäße Protease-Inhibitor behält seine biologische Aktivität sogar, nachdem er vielen proteolytischen Enzymen ausgesetzt wurde, beispielsweise dem Chymotrypsin, der Maussubmaxillar-Protease und Clostripain.

Der codierende Strang einer DNA-Sequenz, von der gefunden wurde-, daß sie die Herstellung dieser rekombinanten Serinproteaseinhibitoren dirigiert, ist der folgende:

5' AGCGG TAAAA GCTTC AAAGC TGGCG TATGC CCGCC

GAAAA AATCC GCGCA GTGTC TGCGG TACAA AAAAC

CGGAA TGCCA GTCCG ACTGG CAGTG CCCGG GTAAA

AAACG TTGTT GCCCG GACAC CTGCG GCATC AAATG

- 9a -

CCTGG ATCCG GTTGA TACCC CGAAC CCGAC TCGTC

GAAAA CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GCCAG

TGTCT GATGC TGAAC CCGCC GAACT TCTGC GAAAT

GGACG ,GCCAG' TGTAA ACGAG ATCTG AAATG CTGTA

TGGGT ATGTG CGGCA AATCT TGTGT TTCCC CGGTA

AAAGC ATAA " .

Die Nukleotide, die durch die obigen Abkürzungen repräsentiert sind, werden in der Spezialbeschreibung definiert.

: ' -10-

Der codierende Strang für eine zweite, bevorzugte DNA-Sequenz, von der gefunden wurde, daß sie die Herstellung dieser rekombinanten Serinproteaseninhibitoren dirigiert, insbesondere die eines sekretorischen Leukozytenproteaseinhibitors (SLPI) der vorliegenden Erfindung, ist der folgende:

5'TCTGG	TAAAA	GCTTC	AAAGC	TGGCG	TATGC	CCGCC
GAAAA	AATCC	GCGCA	GTGTC	TGCGG	TACAA	AAAAC
CGGAA	TGCCA	GTCCS	ACTGG	CAGTG	CCCGG	GTAAA
AAACG	TTGTT	GCCCG	GACAC	CTGCG	GCATC	AAATG
CCTGG	ATCCG	GTTGA	TACCC	CGAAC	CCGAC	TCGTC
GAAAA	CCGGG	TAAAT	GCCCG	GTAAC	CTATG	GCCAG
TGTCT	GATGC	TGAAC	CCGCC	GAACT	TCTGC	GAAAT
GGACG	GCCAG	TGTAA	ACGAG	ATCTG	AAATG	CTGTA
TGGGT.	ATGTG	CGGCA	AATCT	TGTGT	TTCCC	CGGTA
AAAGC	ATAA

•Um. die Ziele der vorliegenden Erfindung zu erreichen und in Übereinstimmung mit den Zwecken der vorliegenden Erfindung, wird eine rekombinaftte DNA-Methode offenbart, die in der mikrobiellen Herstellung der vorliegenden Serinproteaseinhibitoren resultiert unter Verwendung entweder der natürlichen oder synthetischen DNA-Sequenzen, wie sie oben dargestellt wurden. Das rekombinante DNA-Verfahren enthält:

(a) Die Herstellung einer DNA-Sequenz, die in der Lage ist, einen Wirtsmikroorganismus so zu dirigieren, daß er ein Protein herstellt, das Serinproteaseinhibitoraktivität aufweist, vorzugsweise Leukozytenelastaseinhibitorenaktivität;

-in η r

-πι (b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der geeignet ist, um in einen Wirtsmikroorganismus transferiert zu werden und sich in diesem zu replizieren, wobei der genannte Vektor Operonelemente für die. DNA-Sequenz enthält;

(c) das Transferieren des Vektors, der die DNA-Sequenz und die Operonelemente enthält in einen Wirtsmikroorganismus, der in der Lage ist, Protease inhibie-]_0 rendes Protein zu exprimieren;

ι (d) das Kultivieren des Mikroorganismus unter Bedingun-

! i gen, die für die Vermehrung des Vektors und die

! ι

Expression des Inhibitors günstig sind; ^;

j (e) das Ernten des Inhibitors;

; (f) das· Zurverfügungsstellen von Umständen, die es dem Inhibitor erlauben, eine aktive Tertiärstruktur an-

, 20 zunehmen, wobei er Serinproteaseinhibitoraktivität besitzt.

Um das Identifizieren und Isolieren von natürlichen DNA-Sequenzen für die Anwendung in der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, haben die Erfinder eine cDNA-Bibliothek aus menschlichem Ohrspeicheldrüsengewebe entwickelt. Diese Bibliothek enthält die genetische Information,¹ die fähig ist, eine Zelle zu veranlassen, die Serinproteaseinhibitoren der vorliegenden Erfi-ndung zu synthetisieren. Andere

OQ natürliche DNA-Sequenzen, die in der im folgenden beschriebenen rekombinanten DNA-Methode verwendet werden können , können von einer menschlichen Genombibliothek isoliert werden.

oc Die synthetischen DNA-Sequenzen, die in den Verfahreri der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, können dur.ch

-hi?Rl· 30371 7

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Polynukleotidsynthese und Sequenzierungstechniken, wie sie im Stand der Technik allgemein bekannt sind, hergestellt werden. Die natürlichen DNA-Sequenzen, die im oben beschriebenen Verfahren anwendbar sind, können mittels einer Methode identifiziert und isoliert werden, die enthält:

(a) die Herstellung einer menschlichen cDNA-Bibliothek aus Zellen, vorzugsweise Ohrspeicheldrüsenzellen, die in der Lage sind, einen Serinproteaseinhibitor herzustellen;

(b) Testen der menschlichen DNA-Bibliothek mit mindestens einer Testsubstanz, die fähig ist, an das Proteaseinhibitoren oder dessen Proteinprodukt zu binden;

(c) Identifizieren von mindestens einem Klon, der das Gen enthält, das für den Inhibitor codiert, durch ' die Fähigkeit des Klons, zumindest an eine Testsubstanz, für das Gen oder dessen Proteinprodukt zu binden;

(d) das Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert, aus dem identifizierten Klon bzw. gegebenenfalls den Klonen; und

(e) Verbinden des Gens oder geeigneter Fragmente des Gens mit Operonelementen, die nötig sind, um die Gene in einem Wirtsmikroorganismus zu erhalten und exprimieren.

Die natürlichen DNA-Sequenzen, die in dem oben beschriebenen Verfahren anwendbar sind , können weiterhin mittels eines Verfahrens identifiziert und isoliert werden, das enthält:

-6.12.85

5·

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(a) Die Herstellung einer menschlichen Genom-DNA-Bibliothek, die vorzugsweise in einem recArecBC E. coli-Wirt vermehrt wurde ;

(b) Testen der menschlichen Genom-DNA-Bibliothek mit

mindestens einer . Testsubstenz , die in der Lage ist,

j an ein Serinproteininhibitorgen oder dessen Protein-

j produkt zu binden;

(c); Identifizieren von mindestens einem Klon,der das

' Gen enthält, das für den Inhibitor codiert durch ! die Fähigkeit des Klons, an mindestens eine Test-

; ' substanz für das Gen oder dessen Proteinprodukt zu ; binden;

(d) 'Isolieren des Gens, das für den Inhibitor c-odiert aus dem identifizierten Klon oder gegebenenfalls den Klonen; und

. (e) Verbinden des Gens oder geeigneter Fragmente des Gens mit Operonelementen, die nötig sind, um das Gen in einem Wirtsmikroorganismus zu erhalten-und zu exprimieren.

Um die genannten Ziele zu erreichen und in Übereinstimmung mit den Absichten der vorliegenden Erfindung, können pharmazeutisch verwendbare Analoge des Serinproteaseinhibitors mittels der oben beschriebenen rekombinanten DNA-Methode hergestellt werden, indem die synthetische DNA-Sequenz oder das natürliche DNA-Segment mittels rekombinanter DNA-Techniken geändert wird, so daß ein Gen geschaffen wird, das in der Lage ist, die Expression des gewünschten Analogen zu induzieren, wenn es in einem ge-, eigneten Vektor kloniert wird und mit diesem Vektor in einen geeigneten Wirtsorganismus transferiert wird.

ι / U

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Um die Ziele der vorliegenden Erfindung zu erreichen und in Übereinstimmung mit den Absichten der vorliegenden Erfindung, werden weiterhin pharmazeutische Zusammensetzungen offenbart, die, als aktive Substanz, einen rekombinanten Protease-Inhibitor oder dessen biologisch aktive Analoge enthalten, die mittels der oben beschriebenen rekombinanten DNA-Methoden hergestellt wurden.

Die Zeichnungen der vorliegenden Beschreibung stellen verschiedene Plasmide dar, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden und dienen zusammen mit der Beschreibung dazu, im die Grundlagen der Erfindung zu erklären. In den Zeichnungen ist dargestellt als:

Fig.' 1 die Karte des Plasmids pSGE6, Fig. 2 die Karte des Plasmids pSGE8, Fig. 3 die Karte des Plasmids pGS285, Fig. 4 die Karte des Plasmids pGS485.

Im folgenden wird die Erfindung nun in ihren Einzelheiten anhand, von bevorzugten Ausführungsbeispielen näher erläutert,- wodurch die Erfindung, zusammen mit den darauffolgenden Beispielen, in ihren Prinzipien erklärt wird .

Wie bereits oben erwähnt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Proteaseinhibitoren, die in gereinigter Form isoliert wurden. Vorzugsweise sind die Serinproteaseinhibitoren der vorliegenden Erfindung Einzelpolypeptidkettenproteine, die im wesentlichen homolog und, besonders bevorzugt, biologisch äquivalent zu nativen Serinproteaseinhibitoren sind, die aus menschlichen Ohrspreicheldrüsensekreten isoliert wurden. Unter dem Begriff "biologisch äquivalent", wie er in der Beschrei-

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bung und in den Ansprüchen verwendet wird,- versteht man, daß die Zusammensetzungen in der Lage sind, Gewebezerstörungen desselben Typs zu verhindern, die durch Protease verursacht werden, jedoch nicht notwendigerweise in dem selben Ausmaß, wie der native Pro.tease-Inhibitor. Unter den Begriff "im wesentlichen homolog", wie er in der'Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet wird, ! ist ein Grad an Homologie zum nativen Ohrspeicheldrüseninhibitor zu verstehen, der über das hinausgeht, was für : 10 die bereits früher beschriebenen Einzelpolypeptidketten- ^; Serinproteaseinhibitorproteine dargestellt wurde. Vorzugsweise geht der Grad an Homologie über 40 % hinaus, besonders bevorzugt jedoch über 50 %, mit einer ins- . besondere bevorzugten Gruppe von Proteinen, deren Grad an Homologie mit dem nativen Ohrspeicheldrüseninhibitor über 60 % hinausgeht. Die prozentuale Homologie, wie sie oben beschrieben wurde, wird als der prozentuale Anteil der Verbindungen berechnet, der in der kleineren der beiden Sequenzen gefunden wird, der auch in der größeren der beiden Se.quenzen gefunden werden kann, wobei die genannte Verbindung als 'Sequenz von vier an^ einandergrenzenden Aminosäuren zu verstehen ist.

Bevorzugte Protease-Inhibitoren, wie sie durch die vorliegende •25 rekombinante Methode hergestellt werden, sind in der US-Patentanmeldung 678, 823 von Robert C. Thompson et al. beschrieben. Die Patentanmeldung hat den Titel "Serinproteaseinhibitoren und Verfahren zum Isolieren derselben"; die Anmeldung wurde am 6.12.1984 eingereicht. Die genannten Inhibitoren werden weiterhin beschrieben in der US-Patentanmeldung Nr. ,'von Robert C. Thompson et. al. , mit dem Titel "Serinproteaseinhibitoren und Verfahren zum Isolieren derselben", die gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung eingereicht wurde. Diese Protease-Inhibitoren sind bemerkenswert

-6.i5.85- 3C37-i7

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resistant gegen das Denaturieren durch Hitze und Säuren und ebenfalls resistent gegen den Verlust.von Aktivität, wenn sie vielen proteolytischen Enzymen ausgesetzt werden, einschließlich dem Chymotrypsin, der Maus-Submaxillar-Protease und Clostripain. Diese Inhibitoren haben .auch die Fähigkeit, die nötigen Disulfidbindungen zu bilden und die geeigneten nichtkovalenten Interaktionen auszuüben, so daß eine aktive Tertiärstruktur angenommen wird, die den Inhibitor in die Lage versetzt, die Serinproteaseinhibitoraktivität auszuüben , und zwar in Abwesenheit eines biochemischen Stimulans, oder, falls die Disulfidbindungen gelöst sind und die nichtkovalenten Interaktionen unterbrochen sind, die genannten Bindungen und Interaktionen wieder zurückzubilden , um die aktive Tertiärstruktur in Abwesenheit eines biochemischen Stimulans wieder zu rekonstituieren.

Ein bevorzugter Serinproteaseinhibitor, der die genannte Charakteristika aufweist, wurde sequenziert. Dabei wurde die folgende Sequenz bestimmt:

Ser-Gly-Lys-Ser'-Phe-Lys-Ala-Gly-Val-Cys-Pro-

Pro-Lys-Lys-Ser-AIa-Gln-Cys-Leu-Arg-Tyr-Lys-'

Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro-Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-Gly-Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-

Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-30

Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Leu-Met-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn-Phe-Cys-Glu-Met-Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg- Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Met-Gly-Met-Cys-Gly-Lys-

oc S'er-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-Ala.

12.85- 3ü37-i7

Die !oben genannten Abkürzungen entsprechen den folgenden ^:Aminosäureresten in dem Polypepdid:

Aminosäure . Abkürzung

Alanin AIa

Valin VaI

Leucin Leu

Isoleucin He

Prolin Pro

Phenylalanin Phe

Tryptophan Trp

Methionin Met

Glycin GIy

Serin Ser

Threonin Thr

Cystein Cys

Tyrosin Tyr

Asparagin Asn

Glutamin GIn

Asparaginsäure . Asp

Glutaminsäure GIu

Lysin Lys

Arginin Arg

Histidin His

Es wurde gefunden, daß diese Protease-Inhibitoren, die durch rekombinante DNA-Methoden, wie sie in der vorliegenden Anmeldung offenbart werden, hergestellt wurden, mehr als eine distinkte Domäne haben. Unter "einer

distinkten Domäne" ist zu verstehen, daß das Protein multiple aktive Stellen aufweist, die funktionell gegen verschiedene Enzyme sind. Die Anwesenheit und Lokalisierung dieser funktioneilen Stellen wurden durch die Entdeckung einer wesentlichen Homologie zwischen mindestens zwei Bereichen des Protease-Inhibitors festgestellt. Man vermutet, daß die Anwesenheit der distink

-5.12.35- 3037-i

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ten Domänen den vorliegenden Protease-Inhibitoren die Fähigkeit verleiht, eine große Zahl verschiedener Serinproteasen zu inhibieren, einschließlich sowohl der Leukozytenelastase als auch dem Trypsin.

Es wurde weiterhin beobachtet, daß,infolge der Vielzahl der distinkten Domänen dieser Protease-Inhibitoren, diese Protease-Inhibitoren als Gerüste dienen können, um verschiedene andere aktive Stellen herzustellen, um Protease-

}q Inhibitoren zu schaffen, die zusätzliche Fähigkeiten haben. Die bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung schließt die Herstellung eines Protease-Inhibitors ein, der Leukozytenelastase, Cathepsin G, Pankreaselastase und Trypsin inhibiert. Diese Enzyme sind alle

je Mitglieder einer Klasse von Proteasen, die als Serinproteasen bekannt sind, denen gemeinsame Mechanismen und viele Struktureigenschaften gemeinsam sind . Man vermutet, daß, durch Manipulation von nur wenig Aminosäureseitenketten an den Protease-Inhibitoren, die durch die

2Q vorliegende Erfindung hergestellt wurden, eine Vielzahl von Inhibitoren geschaffen werden können, von denen jeder fähig ist,'mindestens ein Mitglied der gesamten Klasse der Serinproteasen zu inhibieren. Desweiteren wird von den genannten Seitenkettenmodifikationen erwartet, daß man eine Vielzahl von Inhibitoren erhält, die verbesserte inhibitorische Fähigkeiten haben, im Hinblick auf bestimmte Mitglieder der Klasse der oben beschriebenen Serinproteasen.

QQ Diejenigen Aminosäureseitenkettenänderungen, die benötigt werden, um die beschriebenen Zwecke zu erreichen, werden durch bestimmte Elemente struktureller Ähnlichkeiten zwischen dem bevorzugten Inhibitor, wie er durch die vorliegende Erfindung hergestellt wird, und anderen Seringa proteaseinhibitoren nahegelegt, für die der wichtige Teil

des Inhibitors durch Röntgenkristallografie aufgeklärt wurde. Diese Elemente struktureller Ähnlichkeiten schließen die Aminosäuren 17 bis 29 und die Aminosäuren 70 bis 83 des bevorzugten Serinproteaseinhibitors ein, der, wie

5- oben beschrieben, durch die vorliegende Erfindung hergestellt wird. Die Änderungen, von denen erwartet wird, -daß sie die Aktivität des Inhibitors, gerichtet gegen Trypsin-ähnliche Serinproteasen, sowohl im Hinblick auf Quantität als auch Qualität.verbessern, schließen eine l'ß-· Änderung von einer oder mehreren der Aminosäure 20 von Arg in Lys, der Aminosäuren 72 oder 74 von Leu in Iys oder Arg, und der Aminosäure 73 von Met in Lys oder Arg ein.

Die Änderungen, von denen vermutet wird, daß sie die 1'5 Aktivität des Inhibitors gegen Chymotrypsin-ähnliche Serinproteasen,. sowohl im Hinblick auf Quantität als auch Qualität verbessern, einschließlich des Cathepsin G, schließen eine Änderung von einer oder mehreren der Aminosäure 20 von Arg in Phe, TyrcderTrp, der Aminosäuren72 oder 74 von Leu in Phe, Tyr oder Trp und der Aminosäure 73 von Met in Phe, Tyr oder Trp ein.

Die Änderungen, von denen vermutet wird, daß sie die Aktivität des Inhibitors gegenüber Pankreaselastaseähnlichen Serinproteasen sowohl im Hinblick auf Quantität als auch auf Qualität verbessern, schließen Änderungen in einer oder mehreren der Aminosäure 20 von Arg in AIa, Aminosäuren 72 oder 74 von Leu in AIa, und Aminosäure 73 von Met in AIa ein.

Bei der Durchführung der Erfindung muß daran gedacht werden, daß die Änderung der Aminosäuresequenzen mit dem. Ziel,neue proteaseinhibierende Fähigkeiten zu erhalten, bei den vorliegenden Proteinen die Aktivität des Inhibitors gegen Leukozytenelastase oder Trypsin zerstört wird. Derartige Wirkungen können durch Routine-

- 6.12.0 5

-20-

versuche im Rahmen der Lehre der vorliegenden'Erfindung •herausgefunden werden.

Es muß weiterhin damit gerechnet werden, daß die Substitution bestimmter Aminosäuren oder bestimmter Aminosäure-Sequenzen, wie sie oben geschildert wurde, die Fähigkeit des vorliegenden Protease-Inhibitors, Leukozytenelastase oder Trypsin zu inhibieren, verstärkt werden können, wobei einige Aktivität der unverstärkten Domänen geopfert wird. Tatsächlich kann die Aktivität irgendeiner Domäne in dem Inhibitorprotein durch geeignete Aminosäuresubstitutionen vollständig eliminiert werden, wodurch Inhibitorproteine geschaffen werden, die für eine oder mehrere Untergruppen der Enzyme.gegen die das Protein normalerweise aktiv ist, spezifisch sind. Beispielsweisedeaktiviert eine Substitution von GIy durch Arg in Position 20 die Trypsin-inhibierende Domäne, wohingegen die Substitution von GIy durch Met in Position 73 oder durch Leu in den Positionen 72 oder 74 die Leukozytenelastase-inhibierende Domäne deaktiviert. Die Domänen können weiterhin in verschiedene Proteine aufgeteilt werden, wobei jedes der Proteine die gewünschte inhibitorische Funktion behält. Die Patentansprüche der vorliegenden Anmeldung beschreiben noch;weitere Verfahren zum Herstellen solcher Inhibitoren auf die beschriebene Weise.

Die Erfinder der vorliegenden Patentanmeldung haben eine synthetische DNA-Sequenz gefunden, die in der Lage ist, die intrazelluläre Produktion der oben diskutierten Protease-Inhibitoren zu dirigieren..Diese Sequenz hat die folgende Struktur:

Hindlll

5'AGC GGT AAA AGC TTC AAA GCT GGC GTA TGC CCG CCG

AIuI

FnuDII Rsal Hpall AAA AAA TCC GCG CAG TGT CTG CGG TAC AAA AAA CCG

Hhal

-R19R5- 3ü37-i

. -21-

XmalGAA TGC CAG TCC GAC TGG CAG TGC CCG GGT AAA AAA

Hpall

: Neil

Neil

CGT TGT TGC CCG GAC ACC TGC GGC ATC AAA TGC CTG

Hpall . Fnu4HI BstNI

BamHI

GAT CCG GTT GAT ACC CCG AAC CCG ACT CGT CGA AAA

Hpall Tagl

Neil Hpall Ball

CCG GGT AAA TGC CCG GTA ACC TAT GGC CAG TGT CTG Hpall Neil HaeIII '

ATG CTG AAC CCG CCG AAC TTC TGC GAA ATG GAC GGC

HaatII

BqIII

CAG TGT AAA CGA GAT CTG AAA TGC TGT ATG GGT ATG

MbOl

Fnu4HI Neil

TGC GGC AAA TCT TGT GTT TCC CCG GTA AAA GCA TAA 3'

Hpall

wobei die folgenden Nukleotide durch die unten beschriebenen Abkürzungen repräsentiert sind.

Nukleotide Abkürzung

= —

Desoxyadenylsaure A

Desoxyguanylsäure G

Desoxycytidylsäure C

Thymidylsäure ' T

Die Erfinder haben desweiteren eine zweite, bevorzugte

synthetische DNA-Sequenz gefunden, die in der Lage ist, die extrazelluläre Herstellung der oben diskutierten Protease-Inhibitoren zu dirigieren, insbesondere den sekretorischen Leukozytenproteaseinhibitor, der oben bereits erwähnt wurde. Diese Sequenz hat die folgende Struktur:

12.G5- ouo

-22-

HindHI

5'TCT GGT AAA AGC TTC AAA GCT GGC GTA TGC CCG CCG

AIuI

FnuDII

Rsal

HpaII

AAA AAA TCC GCG CAG TGT CTG CGG TAC AAA AAA CCG

Hhal

Xmal

GAA TGC CAG TCC GAC TGG CAG TGC CCG__GGT AAA AAA

HpaIINeil

HpaII

CGT TGT TGC CCG GAC ACC TGC GGC ATC AAA TGC CTG Neil Fnu4HI ' BstNI

BamHI

SAT CCG GTT GAT ACC CCG AAC CCG ACT CGT CGA AAA Hpall Taql

HpaII HpaII ' Ball

CCG GGT ' AAA* TGC CCG GTA ACC TAT GGC CAG TGT CTG Neil Neil HaeIII

j ATG CTG AAC CCG CCG AAC TTC TGC GAA ATG GAC GGC

^; BollI .

CAG TdT AAA CGA GAT CTG AAA TGC TGT ATG GGT ATG

MbOl

HaeIII

Fnu4HI TGC GGC

Neil

AAA TCT TGT GTT TCC CCG GTA AAA GCA TAA 3'

HpaII

Im Hinblick auf die vielfältigen Strukturen von Domänen der vorliegenden Protease-Inhibitoren, wurden Veränderungen in der synthetischen DNA-Sequenz vorgenommen, die zum Ergebnis hatten, daß eine DNA-Sequenz entstand, die in der Lage ist, die Herstellung von Serinproteaseinhibitoranalogen zu dirigieren, wie es oben bereits diskutiert wurde. Bevorzugte Analoge der Serinproteaseinhibitoren-, wie sie durch rekombinante DNA-Techniken gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert wurden, haben die folgende Aminosäuresequenz:

-23--

R]_--GIy-Ly S-Se r-Phe-Lys-AIa-G Ly-VaI-Cys-P ro- Pro-Lys-Ly s-Se r-AIa-G In-Cy s-Leu-R2-Ty r-Ly s-

Lys-Pro-Glu-Cys-Gln-Ser-Asp-Trp-Gln-Cys-Pro- Gly-Lys-Lys-Arg-Cys-Cys-Pro-Asp-Thr-Cys-GIy-

Ile-Lys-Cys-Leu-Asp-Pro-Val-Asp-Thr-Pro-Asn-Pro-Thr-Arg-Arg-Lys-Pro-Gly-Lys-Cys-Pro-Val-

Thr-Tyr-Gly-Gln-Cys-Rg-R3- Fb-Asn-Pro-Pro-XO

Asn-Phe-Cys-Glu-R^Asp-Gly-Gln-Cys-Lys-Arg-

Asp-Leu-Lys-Cys-Cys-Rs-Gly-Rg-Cys-Gly-Lys-Ser-Cys-Val-Ser-Pro-Val-Lys-R7,

wobei R.. und R₇ gleich oder verschieden sind und ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Aminosäureresten_ oder Abkömmlingen dieser ; und

Rp, R-., R₁,, R₁-, Rg, Rg, Rq gleich oder verschieden sind und ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Methionin, Valin, Alanin, 'Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Lysin, Glycin und Arginin.

Es sollte festgehalten werden, daß die DNA-Sequenz, wi§ sie oben dargestellt ist, eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist. Aufgrund der Tatsache, daß der genetische Code degeneriert ist, folgt, daß zahlreiche Änderungen der Nukleotide durchgeführt werden können, wobei

jedoch die DNA-Sequenz immer in der Lage bleibt, die Herstellung der vorliegenden Protease-Inhibitoren oder deren Analogen zu dirigieren. Es liegt daher im Rahmen der vorliegenden Erfindung, DNA-Sequenzen herzustellen, die zu der oben aufgezeigten Sequenz funktionell äquivalent sind oder funktionell äquivalent sind zu Sequenzen, die die

ϊοογ. -; Λ 3 7-i

-24-

1 Herstellung von Analogen des Protease-Inhibitors dirigieren, der in Übereinstimmung mit der oben aufgezeigten Aminosäuresequenz hergestellt wurde. Als ein Beispiel von Codonsubstitutionen, die durch die Tatsache, daß der ge-5 netische Code degeneriert ist, durchgeführt werden können, sind in dem folgenden Diagramm DNA-Sequenzen gezeigt, die im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, liegen sollen und für die Herstellung der bevorzugten, oben gezeigten Aminosäuresequenz geeignet sind. Dem Beispiel für die iQ Bestimmung äquivalenter DNA-Sequenzen für die Herstellung

dieses Proteins folgend, wird der Fachmann in der Lage ; sein, äquivalente DNA-Sequenzen für die Herstellung von j Analogen der bevorzugten Aminosäuresequenz ebenfalls zu bestimmen.

^:ίο

Ser GIy Lys Ser Phe Lys Ala GIy VaI Cys Pro Pro Lys Lys Ser AIa 5'TCN GGK AAP TCN TTQ AAP GCN GGN GTN TGQ CCN CCN AAP AAP TCN GCN AGQ ' AGQ AGQ

^: 20 30

GIn Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro GIu Cys GIn Ser Asp Trp GIn Cys

CAP TGQ CTN CGN TAQ AAP AAP CCN GAP TGQ CAP TCN GAQ TGG CAP TGQ TTP AGP AGQ

40 .

Pro GIy Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys GIy He Lys Cys Leu CCN GGN AAP AAP CGN TGQ TGQ CCN GAQ ACN TGQ. GGN ATQ AAP TGQ CTN

AGP ATA TTP

50 60

Asp Pro VaI Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro GIy Lys Cys

GAQ CCN GTN GAQ ACN CCN AAQ CCN ACN CGN CGN AAP CCN GGN AAP. TGQ

AGP AGP

70 80

Pro VaI Thr Tyr GIy GIn Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys CCN GTN ACN TAQ GGN CAP TGQ CTN ATG CTN AAQ CCN CCN AAQ TTQ TGQ

TTP TTP

90

GIu Met Asp GIy Gin Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met GIy Met GAP ATG GAQ GGN CAP TGQ AAP CGN GAQ CTN AAP TGQ TGQ ATG GGN ATG

AGP TTP

100

Cys GIy Lys Ser Cys VaI "Ser Pro VaI Lys Ala TGQ GGN AAP TCN TGQ GTN TCN CCN GTN AAP GCN 3' AGQ AGQ

~: ΓΟ Ί -:

-25-

In der gezeigten Sequenz repräsentieren die verwendeten Abkürzungen die unten gezeigten Nukleotide.

Nukleotide Abkürzung

A,G,C,T N

A₁G P

C,T Q

Bei der Auswahl der Codons für die Verwendung in den

synthetischen DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung, einschließlich derer, wie sie oben gezeigt werden, werden vorzugsweise Codons verwendet, die für Aminosäuren codieren, die im Zusammenhang stehen mit in hohem Maße exprj.-mierten Proteinen. Beispiele dieser bevorzugten Codons sind zum'Teil bei Grantham, R. et al , "Codon Catalog Usage Is a Genome Strategy Modulates For Gene Expressivity" in Nucleic Acids Research _9 : r43 (1981) beschrieben. Die bevorzugte DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung wurde durch Auswahl der Escherichia coli-Sequenz

für jede der degenerierten Sequenzen gewählt.

Es ist weiterhin erwünscht, Codons auszuwählen, die die Änderung der synthetischen DNA-Sequenz für die Herstellung weiterer synthetischer DNA-Sequenzen,die in der Lage sind, die Herstellung von Analogen der vorliegenden Protease-Inhibitoren zu dirigieren, erleichtern. Besonders bevorzugt werden Nukleotidsequenzen ausgewählt, die, falls möglich, Restriktionsendonukleaseerkennungsstellen an den Positionen oder zumindest in der Nähe dieser Po-

sitionen der synthetischen DNA-Sequenz bilden, an der es erwünscht sein kann, zusätzliche Codons einzubauen, oder ein Codon auszutauschen, so daß Analoge geschaffen werden können. In der bevorzugten Ausführungsform der DNA-Sequenz.der vorliegenden Erfindung sind die ° Restriktionserkennungsstellen unter der oben ge-

-26- j zeigten Nukleotidsequenz erwähnt.

Verfahren zum Herstellen der synthetischen DNA-Sequenzen, wie sie hier beschrieben werden, liegen grundsätzlich innerc halb des Bereichs von Routineaufgaben, die von einem Fachmann durchgeführt werden können, angeleitet durch die vorliegende Beschreibung. Ein Beispiel eines geeigneten Verfahrens-, das verwendet werden kann, um die synthetischen DNA-Sequenzen, wie sie hier offenbart werden, zu erhalten, ,Q ist beispielsweise bei Matteacci, M.D. und Caruthers, M.H., J.Am.Chem.Soc. 103: 3185 (1981) und Beaucage, S.L. und Caruther|s, M.H., Tetrahedron Lett. 22: 1859 (1981) aufgezeigt, wobei beide Referenzen hiermit in die Offenbarung miteinbezogen werden.

.

In einer alternierenden Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde aus einer menschlichen Genombibliothek eine DNA-Sequenz isoliert, die für einen bevorzugten sekretorischen Leukozytenproteaseinhibitor (SLPI) der vorliegenden „,«-Erfindung codiert. Diese Sequenz, codierend vom 4.Codon an und die Introns einschließend, ist, so weit den Erfindern zur Zeit bekannt, die folgende:

ScoRl . 20 .40 .60

gaattctggtggggccacacccactggtgaaagaataaatagtgaggtttggattggcc

80 . 100 . 120

ATCAGAGTCACTCCTGCCTTCACCATGAAGTCCAGCGGCCTCTTCCCCTTCCTGGTGCTG

140 . 160 . 180

CTTGCCCTGGAACTCTGGCACTTGGGCTTGGAAGGCTCTGAAATGTAAGTTGGAGTCACT 3Q _

Pstl . 220 . 240

CTGTCTAATCTGGGCTGCAGGGTCAGAGGTGGGGTCTCCTTGTGGTGTGGGTGTGTCCCC

260 .280 . 300

5 TTCTGTAGGCTCTGATCCCTCAGCTTAGTTTCGGGAGACCTCCCTGAGGGTGGAATACAT

i" or.

-27-

Sad 320 . 340 . 360

GTCTGGCTGAGCTCCAAGGTTTGTGTGACAGTTTGAGCTTCTGGAAATGCTTCCTCTATG

380 . 400 . 420

CAGCCATGCTGTCAGCCCAGGTCCCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCA

440 . 460 . 480 TACTCCGCCTTCTTCTTCACCTTGCTGCGACTCTCAAATCATTAGTTTCTGACTCfGCTT

500 . 520 . 540 CCGTTGTGTCTTTGCTTCTGCTATTTTGTCTCTGTGCTTCTCGCTTGGGATTTAGCTCTC

- 1 .

560 . 580 . 600

AACTTCTCTCACACTGGTTCTATTTATCTTTGTTTACCTCTCTCCATCTCCATCACTCCC

620 , 640 . 660

AGCCTTCCTCTCTGCCTTTGTGTAGCCTTGTTTTGCTCTTGGGTGGAGGTCTTGACTAGA

680 . 700 . 720

AGCCTGCTGCCCTTTTCTTGGGTGTGAAACGTCCCCTGTCCATTTGTCTAATTTAATCAA

740 . 760 . 780 GCCCATCAATACACCTGGAGATCAGGCAGGCATGACCTTTGGGCTTTGTGGACAGCTACT

800 . 820 . 840 GAGGTAAGGGTCTCTCCCCCTCAAAAGTGGTGCTTTGTTCAGGAGGCATGATGGGTCCTC

. 860 . 880 . 900 AGTACCCAGCCTCCTCCTACCTCTTGACTTTCTCTTCAAAAGCCTTCAAAGCTGGAGTCT

._ ENDEDES INTRONS · F KA G V

920 . 940 . 960

gtcctcctaagaaatctgcccagtgccttagatacaagaaacctgagtgccagagtgact cppkksaqclrykkpecqsd

980 . 1000 . BamHl GGCAGTGTCCAGGGAAGAAGAGATGTTGTCCTGACACTTGTGGCATCAAATGCCTGGATC wqcpgkkrccpdtcgikcld

, ' . 1040 . 1060 . 1080 CTGTTGACACCCCAAACCCAAGTAAGCAGGTCGGGGAACTGGGTAGAGAGATAGCCTGGG PVDTPNP -START INTRON

-28-

1100 . 1120 Stul . 1140 GACACAGCATTAGAGGGACGGAACTGGGTGATGGGTCCTGCCAGGCCTCCTTGTCAATGC

ι . 1160 . ΡνυΙΙ . 1200

CGTAGTGAGTCACAGTGCCCTAAGAGAAGTAGCCAGCTGGTGAAGCAGCGGGCATTTAGA

1220 . 1240 . 1260 TAGCCAGGTAGTTGGAAGCCTCCCACCTAGTCAGCACTGGGCGGCTGGCACCTGCATAAT

1280 . 1300 . 1320 GGGGGGCCTGAAGTTCTAGGAGAGCCAGGTGCTATGTTTGGGGGCCGCCTTAGGGAGAAG

1340 . 1360 . 1380 GTGGTGGTGATAGAGGTGGGGAGGGGATGATCCCCCCTGCTGAAGCTGGACGAGGGGCTC

· 1400 . 1420 Stul . 1440 ACTCTAAAAAGTGGGGATGGGAGGGGTTGTATAAAGTACAAGGCCTCTGACCGGTAGCCT

" H]_{NDE DES}

1.460 . 1480 ' . 1500

CACTCTCACCCAACCCAGCAAGGAGGAAGCCTGGGAAGTGCCCAGTGACTTATGGCCAAT RRKPGKCPVTYGQ

. 1520 · . 1540 . 1560 GTTTGATGCTTAACCCCCCCAATTTCTGTGAGATGGATGGCCAGTGCAAGCGTGACTTGA CLMLNPPNFCEMDGQCKRDL

1580 . 1600 . 1620

AGTGTTGCATGGGCATGTGTGGGAAATCCTGCGTTTCCCCTGTGAAAGGTAAGCAGGGGA KCCMGMCGKSCVS PVK --START INTRON 25

. Sad 1640 . 1660 . 1680 CGAGGGCACACTGAGCTCCCTCAGCCCTCTCAGCCTCAACCCTCTGGAGGCCCAGGCATA

1700 . 1720 . 1740 TGGGCAGGGGGACTCCTGAACCCTACTCCAAGCACAGCCTCTGTCTGACTCCCTTGTCCT

1760 . 1780 . 1800 TCAAGAGAACTGTTCTCCAGGTCTCAGGGCCAGGATTTCCATAGGAGTCGCCTGTGGCTT

1820 . 1840 . 1860 TGATTCTATTCTAGTGTCTCTGGGTGGGGGTCCTGGGCAAGTGTCTTTCTGAGTCTAGTT

6.12.85

LC/ I /

-29-

1880 . 1900 . 1920 TCTTTATCGGTAAAATGTACATAATGAGATGAAAGTGCTCTGCAAAGACCTATGTGCACT

. 1940 . 1960 . 1980 AAGAATTATTATTCAGGTGTTTCCATCATGTTTTCTGAGGTGAAATCACAAAGGATCAGT

2000 . 2020 . 2040 GGAGTTTGAGGATTATCTAGTTCAATGCTTTGAGTTTAGAGTTTTACGTGAAAATGAGAC

. 2060 . 2080 . 2100 TTGTCTCCTGACACTAAGTCTCTCTCAACTATAGCGCTATCTTGCTATTTTCTCTATCTC

2120 . 2140 · . 2160 AGAAGGATCCTTGGGCAGGAGGAAGGATGTGGATATATGATTTGGCTGGTTTCTATGCTG

„ . 2180 . 2200 ' . 2220 AAGCTCTGATCTGATTTTCTCTCACAGCTTGATTCCTGCCATATCGGAGGAGGCTCTGGA - VERMUTETES STOP

ENDE DES INTRONS

2240 . 2260 GCCTGCTCTGTGTGGTCCAGGTCCTTTCCACCCTdAGCTTGGCTCCACCACTGGT

In dieser Sequenz sind die verwendeten Abkürzungen für die Aminosäurereste die Einbuchstaben-Abkürzungen, die üblicher „p. weise verwendet werden und beispielsweise in Biochemistry by A.L.Lehninger, 2nd ed., Worth Publishers, Inc., New York, New York (1976), S.72 beschrieben sind.

Unter.Verwendung dieser Sequenz und der Aminosäuresequenz _ daten, die hierin enthalten sind, kann eine synthetische DNA-Sequenz hergestellt werden, die, wenn sie an die obige gerjiomische Sequenz angefügt wird, zu einem Gen führt, das für den vollständigen Protease-Inhibitor codiert. Alternativ dazu können unter Verwendung der oben gezeigten

DNA-Sequenz Sonden konstruiert werden, mit Hilfe derer do

ein DNA-Segment aus einer menschlichen Genombibliot.hek gefunden werden kann, das Codons für die ersten drei Aminosäuren aufweist.

-5.12.85- 303/-17

- 30 -

Des weiteren können derartige Sonden dazu verwendet werden, eine menschliche Genomsequenz zu identifizieren, die eine geeignete Leadersequenz enthält» Es wird erwartet, daß diese Leadersequenz oder jede andere geeignete Leadersequenz, in Verbindung mit dieser genomischen DNA-Sequenz in einem Säugetierexpressionssystem verwendet werden kann.

In einer weiteren, alternierenden Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde aus einer Ohrspeicheldrüsenbibliothek ein cDNA-Klon isoliert, der für eine DNA-Sequenz codi'ert, die in der Lage ist, die intrazelluläre Herstellung eines bevorzugten sekretorischen Leukozytenproteaseinhibitors der vorliegenden Erfindung zu dirigieren. Dieser Klon wurde am 03.12.1985 bei der Hinterlegungsstelle American Type Culture Collection, Rockville, Maryland unter der Hinterlegungsnummer 40 207 hinterlegt, mit der Bezeichnung "Lambda CSLPI-I".

Ein rekombinantes DNA-Verfahren für die Herstellung eines Protease-Inhibitors, der aus einer Einzelpolypeptidkette be-¹ steht, mit mindestens einer aktiven Stelle, die Serinproteaseinhibitoraktivität aufweist, wird hier beschrieben. In. einer Ausführungsform der Erfindung reagiert die aktive Stelle in biologisch äquivalenter Weise zu dem nativen Leukozytenelastaseinhibitor, der aus menschlichen Ohrspeicheldrüsensekreten isoliert wurde» Eine natürliche oder synthetische DNA-Sequenz kann verwendet werden, um die Herstellung des Protease-Inhibitors zu dirigieren» Dieses Verfahren enthält:

(a) die Herstellung einer DNA-Sequenz, die in der Lage ist, einen Wirtsmikroorganismus zu veranlassen, ein Protein herzustellen, das Serinproteaseinhibitoraktivität aufweist ;

- 30a -

(b) das Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in der Lage ist, in einen Wirtsmikroorganismüs trans- -feriert zu werden und sich in diesem zu replizieren.

]_ wobei dieser Vektor Operonelemente für die DNA-Sequenz enthält;

(c) das Transferieren des Vektors, der die synthetische

DNA- Sequenz und die Operonelemente enthält, in einen Wirtsorganismus, der in der Lage ist, den Protease-Inhibitor zu exprimieren;

(d) die Kultivierung des Mikroorganismus unter Bedingun-,Q. gen, die für die Vermehrung des Vektors und die Expression des Inhibitors geeignet sind;

(e) das Ernten des Inhibitors; und

(f) das Zurverfügungstellen von Umständen, die es dem Inhibitor erlauben, eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wobei diese Serinproteaseinhibitoraktivität besitzt.

_on Synthetische DNA-Sequenzen, von denen erwartet wird, daß sie in diesem Verfahren verwendet werden können, wurden oben im einzelnen diskutiert. Es wird weiterhin, als eine alternative Ausführungsform,erwartet, daß natürliche DNA-Sequenzen ebenfalls in diesem Verfahren verwendet werden

_o_ können. Diese Sequenzen schließen cDNA oder genomische DNA-Segmente ein. In einer bevorzugten Version dieser Ausführungsform, wird erwartet,, daß die natürliche DNA-Sequenz durch ein Verfahren erhalten werden kann, das enthält:

(a) Herstellung einer menschlichen cDNA-Bibliothek aus Zellen, vorzugsweise Ohrspeicheldrüsenzellen, die in der Lage sind, einen Serinproteaseinhibitor zu produzieren;

-32-

(b) Testen der menschlichen DNA-Bibliothek mit mindestens einer Sonde, die in der Lage ist, an das Protea seinhibitorgen oder dessen Proteinprodukt zu binden;

(c) Identifizieren von mindestens einem Klon, der das Gen enthält, das für den Inhibitor codiert,durch die Fähigkeit des Klons, an mindestens eine Sonde für das Gen oder dessen Proteinprodukt zu binden;

jQ (d) Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert aus dem ausgewählten Klon oder gegebenenfalls den Klonen ;

(e) Verbinden des Gens oder geeigneter Fragmente des Gens . c . mit Operonelementen, die nötig sind, um das Gen in dem Wirtsmikroorganismus zu erhalten und zu exprimieren.

Die natürlichen DNA-Sequenzen, dre in dem oben beschriebenen Verfahren nützlich sind, können auch durch ein Verfahren identifiziert und isoliert werden, das enthält:

(a) Herstellen einer menschlichen Genom-DNA-Bibliothek, vorzugsweise vermehrt in einem recArecBC E.coli-Wirt;

j (b) Testen der menschlichen Genom-DNA-Bibliothek mit min-. jdestens einer Sonde, die in der Lage ist, an ein Serin-ί 'iproteininhibitorgen oder dessen Proteinprodukt zu bin-

;den ;

! 30 ^:

(c) .Identifizieren von mindestens einem Klon, der das Gen enthält, das für den Inhibitor codiert,durch die Fähigkeit des Klons, an mindestens eine Sonde für das Gen oder dessen Proteinprodukt zu binden;

(d) Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert aus dem identifizierten Klon oder gegebenenfalls den Klonen; und

Ce) Verbinden des Gens oder geeigneter Fragmente des Gens an Operonelemente, die nötig sind ,uiu das Gen in einem Wirtsmikroorganismus zu erhalten und zu expri rnieren.

Beim Isolieren einer natürlichen DNA-Sequenz, die für die IQ Verwendung in dem oben beschriebenen Verfahren geeignet ist, ist es bevorzugt, die beiden Restriktionserkennungsstellen zu identifizieren, die innerhalb und am nächsten zu den Endbereichen des geeigneten Gens oder Teilen des Gens lokalisiert sind. Das DNA-Segment, das das geeignete ,κ Gen enthält, wird sodann aus dem Rest des Genommaterials entfernt, wobei geeignete Restriktionsendonukleasen verwendet werden. Nach dem Herausschneiden werden die 3'-und 5'-Enden der DNA-Sequenz wieder hergestellt, um geeignete . DNA-Sequenzen zur Verfügung zu stellen, die in der Lage 2Q sind, für die N- und C-Termini des Serinproteaseinhibitorproteins zu codieren und in der Lage sind, die DNA-Sequenz an dessen Operonelemente anzufügen.

Die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung vor-2(-gesehenen Vektoren schließen jegliche Vektoren ein, in die eine oben diskutierte DNA-Sequenz eingefügt werden kann, zusammen mit jeglichen bevorzugten oder benötigten Operonelementen, und die sodann in einen Wirtsorganismus transferiert werden können und sich in einem derartigen Mikro-OQ Organismus replizieren. Bevorzugte Vektoren sind solche, dessen Restriktionserkennungsstellen gut bekannt sind und die Operonelemente enthalten, die bevorzugt oder benötigt werden für die Transkription der DNA-Sequenz.

_o_ Die "Operonelemente", wie sie hier geschildert werden, ob

schließen mindestens einen Promoter ein, mindestens einen Operator, mindestens eine Leadersequenz, mindestens eine

^j.n ρ π.. ~: { .¹^, 7 -

-34-

j_ Shine-Dalgarno-Sequenz, mindestens ein Terrninatorcodon und jegliche weiteren DNA-Sequenzen, die nötig oder bevorzugt sind für eine geeignete Transkription und die anschließende Translation der Vektor-DNA. Insbesondere § ist zu erwarten, daß ein derartiger Vektor mindestens einen Origin der Replikation enthält, der durch den.·- Wirtsorganismus erkannt wird, zusammen mit mindestens einem selektierbaren Marker und mindestens einer Promotersequenz, die fähig ist, die Transkription der syntheti-

^Q sehen DNA-Sequenz zu initiieren. Es ist weiterhin günstig, wenn der Vektor, in einer weiteren Ausführungsform, bestimmte DNA-Sequenzen enthält, die fähig sind, als Regulatoren zu handeln, sowie weitere DNA-Sequenzen, die in der Lage sind, für ein Regulatorprotein zu codieren.

, ρ- Diese Regulatoren dienen in einer weiteren Ausführungsform dazu, die Expression der synthetischen DNA-Sequenz in Anwesenheit bestimmter Umweltbedingungen zu verhindern, und, in der Anwesenheit anderer Umweltbedingungen, die Transkription und anschließende Expression des Proteins,· für das die synthetische DNA-Sequenz codiert, zu erlauben. Es ist insbesondere bevorzugt, daß regulatorisehe Segmente in den Vektor eingebaut werden, so daß die Expression der synthetischen DNA nicht in Abwesenheit beispielsweise von Isopropylthio-ß-d-Galactosid erfolgt.

_or- In dieser Situation kann der transformierte Mikroorganismus, der die synthetische DNA enthält, bis zu einer gewünschten Dichte wachsen, ehe die Expression des Protease-Inhibitors initiiert wird. In dieser Ausführungsform wird die gewünschte Expression des Protease-Inhibitors durch

Zugabe einer Substanz zu der mikrobiellen Umgebung induoU

ziert, die in der Lage ist, die Expression der DNA-Sequenz zu veranlassen, wenn die gewünschte Dichte erreicht ist.

Es wird weiterhin in bevorzugter Weise angestrebt, daß eine geeignete sekretorische Leadersequenz anwesend ist, 35

entweder in dem Vektor oder an dem 5'-Ende der syntheti-

_ i: ^j.o ο ζ'- "V 3 7 'i

V. 3

-35-

sehen DNA-Sequenz. Die Leadersequenz ist in einer Position; die es ihr erlaubt, unmittelbar angrenzend an den Initialteil der Nukleo'tidsequenz zu liegen, die geeignet ist, die Expression des Protease-Inhibitors zu veranlassen, ohne irgendwelche dazwischenliegenden Translations-Terminations-Signale. Die Anwesenheit ist_% aus einem oder mehreren der folgenden Gründe erwünscht: 1) Die Anwesenheit der.Leadersequenz kann die Herstellung eines Ausgangsprodukts für den reifen rekombinanten Protease-Inhibitor durch den Wirt erleichtern; 2) die Anwesenheit der Leadersequenz kann die Reinigung des rekombinanten Protease-Inhibitors erleichtern, durch das Ausschleusen des Protease-Inhibitors aus dem Zellzytoplasma; 3) die Anwesenheit der Leadersequenz kann die Fähigkeit des rekombinanten Protease-Inhibitors bewirken, sich in die aktive Struktur zu falten,' ebenfalls durch den Vorgang des Ausschleusens des Protease-Inhibitors aus dem Zellzytoplasma.

Im besonderen kann die Leadersequenz dafür verantwortlich sein, daß das Ausgangstranslationsprodukt durch eine Leader-Peptidase geschnitten wird, so daß die Leadersequenz entfernt wird und ein Polypeptid hinterläßt, das die bevorzugte Aminosäuresequenz aufweist, die die Fähigkeit der Serinproteaseinhibitoraktivität hat. In einigen Arten von Wirtsmikroorganismen erlaubt die Anwesenheit einer geeigneten Leadersequenz den Transport des vollständigen Proteins in den periplasmatischen Raum, wie es beispielsweise für E. coli. der Fall ist. Im Falle bestimmter Hefen und bestimmter Stämme der Gattungen Bacilli und Pseudomonas erlaubt eine geeignete Leadersequenz den Transport des Proteins durch die Zellmembran in das extrazelluläre Medium. In dieser Situation kann das Protein aus extrazellulärem Protein gereinigt werden.

Sodann kann, im Falle einiger der Protease-Inhibitoren, die nach der vorliegenden Erfindung hergestellt werden,

-36- '

die Anwesenheit der Leadersequenz nötig sein , um fertiggestelltes Protein in eine Umgebung zu bringen, in der es sich falten kann, um seine aktive Struktur anzunehmen, wobei diese Struktur die geeignete Elastaseinhibitoraktivität besitzt.

Weitere Operonelemente schließen Ribosomen-Bindestellen · und andere DNA-Sequenzen ein, die nötig sind für die mikrobielle Expression fremder Proteine, die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Elemente beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung könnte die Sequenz GAGGCGCAAAAA(ATG) als Ribosomen-Bindestelle verwendet werden. Die Operonelemente, wie sie hier diskutiert werden, können durch einen Fachmann mit dem Wissen aus dem Stand der Technik und der hier enthaltenen Lehre routinemäßig selektiert werden. Allgemeine Beispiele für diese Operonelemente werden bei B. Lewin, Genes, Wiley & Sons, New York (1983), beschrieben, wobei diese Literaturstelle hiermit ausdrückliche in die Offenbarung eingeschlossen wird. Die Vektoren, wie sie hier verwendet werden können, können.zum Teil aus Bereichen der Plasmide pBR322 und/oder pIQ konstruiert werden.

• In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden ' 25 Erfindung wird eine zusätzliche DNA-Sequenz unmittelbar folgend auf die synthetische DNA-Sequenz, die für den Protease-Inhibitor codiert, angefügt. Die zusätzliche DNA-Sequenz dient als Translationskuppler, d.h. daß diese DNA-Sequenz für eine RNA codiert, die dazu dient, Ribosomen unmittelbar benachbart an die Ribosomen-Bindestelle der Protease-Inhibitor-RNA anzubringen, mit der sie benachbart ist. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Translationskuppler unter Verwendung der DNA-Sequenz

TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCGGAGTGTAAGAAATg

-37-

hergeleitet werden sowie über Methoden, wie sie dem Fachmann derzeit bekannt sind, hergestellt werden. Ein zweiter, bevorzugter Translationskuppler hat die DNA-Sequenz

TAACGAGGCGCAAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATG. 5

Nach der Synthese und Isolierung aller nötigen und gewünschten Bestandteile des .diskutierten Vektors kann der Vektor durch Verfahrensschritte zusammengefügt werden, wie sie allgemein dem Fachmann bekannt sind. Das Zusammenfügen dieser Vektoren liegt innerhalb des Aufgabenbereichs eines Fachmannes und kann daher unter zumutbarem Aufwand wieder •hergestellt werden. Beispielsweise wurden ähnliche DNA Sequenzen in geeignete Klonierungsvektoren eingefügt, wie es bei Schoner et al., Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 8j_ : 54O3-5W (1984) beschrieben wird, wobei diese Referenz wiederum ausdrücklich in die vorliegende Offenbarung miteinbezogen wird.

Bei der Herstellung des klonierenden Vektors der vorliegenden Erfindung sollte weiterhin erwähnt werden, daß multiple Kopien der synthetischen DNA-Sequenz und dessen anhängenden Operonelementen in jeden Vektor eingefügt werden können. Bei einer derartigen Ausführungsform produziert der Wirtsorganismus größere Mengen des gewünschten Protease-Inhibitors pro Vektor. Dies Zahl der vielfachen Kopien der DNA-Sequenz, die' in den Vektor inseriert werden kann, wird lediglich durch die Fähigkeit des resultierenden Vektors begrenzt, in einen geeigneten Wirtsorganismus transferiert zu werden und in diesen zu replizieren und transkribiert zu werden, wobei diese Fähigkeit im Zusammenhang mit der Größe des Vektors steht.

Es ist weiterhin bevorzugt, daß der Vektor einen selek-.35 tierbaren Marker enthält, beispielsweise einen Arznei-

" ~ O "7 -\

-38-

mittelresistenzmarker oder anderen Marker , der die Expression einer selektierbaren Eigenschaft durch den ^ Wirtsmikroorganismus bewirkt. In einer besonders bevorzugten Ausführpngsform der vorliegenden Erfindung enthält der klonierende Vektor das Gen für Tetracy.clinresistenz .

Eine derartige Arzneimittelresistenz oder' anderer¹ selektierbarer Marker wird teilweise verwendet, um die Selektion der Transformanten zu erleichtern. Weiterhin kann. ' ₁₀ jedoch die Anwesenheit eines selektierbaren Markers auf dem'klonierenden Vektor dazu verwendet werden, um konta- : minierende Mikroorganismen von der Vermehrung im KuI- . turmedium abzuhalten. In dieser Ausführungsform, würde j eine derartige reine Kultur der transformierten Wirts-

,ρ- Organismen durch Kultivieren der Mikroorganismen .erhalten!.w.erden'Unter Bedingungen, die den eingefügten Phänotyp für das überleben benötigen.

Ein auf diese Weise erhaltener Vektor wird sodann in einen 2Q geeigneten Wirtsmikroorganismus transferiert. Man vermutet, daß jeder Mikroorganismus, der die Fähigkeit hat, exogene DNA aufzunehmen und diese Gene sowie die dazugehörigen Operonelemente zu exprimieren, verwendet werden kann. Vorzugsweise wird ein Wirtsmikroorganismus verwende det, der fakultativ anaerob oder aerob ist. Besondere Wirtsorganismen, die bevorzugt für die Anwendung in den vorliegenden Verfahren zu verwenden sind, schließen Hefen und Bakterien ein. Bevorzugte Hefen können solche der Gattung Saccharomyces sein, insbesondere Saccharomyces cerevisiae. Besondere Bakterien können die der Gattungen

Bacillus, Escherichia und Pseudomonas sein, insbesondere Bacillus subtilis und Escherichia coli.

Nach der Auswahl des Wirtsorganismus wird der Vektor in den Wirtsorganismus transferiert unter Verwendung von

O -7 .·

-39-

^ Verfahren, die dem Fachmann allgemein bekannt sind. Beispiele derartiger Verfahren sind beschrieben in Advanced Bacterial Genetics von R.W.Davis et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, (1980), wobei diese Literaturstelle wiederum ausdrücklich in die Offenbarung der vorliegenden Erfindung miteinbezogen wird. Es ist in einem weiteren Ausführungsbeispiel bevorzugt, daß die Transformation bei niedrigen Temperaturen durchgeführt wird, wie auch die Regulierung durch Temperatur

j_0 als Mittel der Regulierung der Genexpression über die Verwendung der Operonelemente, wie oben beschrieben, angestrebt wird. In einem weiteren Ausführungsbeispiel, falls osmolare Regulatoren in den Vektor inseriert wurden, kann die Regulierung über Salzkonzentrationen wäh-

Tg rend der Transformation erfolgen, um die erwünschte Kontrolle über die synthetischen Gene sicherzustellen.

Falls es beabsichtigt ist, die rekombinanten Serinproteaseinhibitoren letztlich in Hefe zu exprimieren, ist es

2Q . dennoch bevorzugt, daß der klonierende Vektor zuerst in Escherichia coli transferiert wird, wo man den Vektor sich replizieren läßt. Der Vektor wird sodann aus Escherichia coli nach der Vervielfachung gewonnen und gereinigt und sodann in Hefe transferiert, wo letzlich

2g die Expression des Serinproteaseinhibitors erfolgt.

Die Wirtsmikroorganismen werden unter Bedingungen kultiviert, die geeignet sind für die Expression des Serinproteaseinhibitors. Diese Bedingungen sind allgemein

^_ spezifisch für den Wirtsorganismus und können von einem Fachmann leicht bestimmt werden, wenn er den Stand der Technik bezüglich der Wachstumsbedingungen für derartige Organismen berücksichtigt, beispielsweise Bergey's Manual of Determinative Bacertiology, 8th Ed., Williams & Wilkins

„p. Company, Baltimore, Maryland, das hiermit in die Offenbarung miteinbezogen wird.

-HO-

Alle Bedingungen, die für die Regulierung der Expression der DNA-Sequenz nötig sind, in Abhängigkeit von den Operonelementen, die entweder in den Vektor eingefügt wurden oder bereits vorhanden waren, sind bei der Transformierung und während der Kulturstufen wirksam. In einer Ausführungsform werden die Zellen bis zu einer ι hohen Dichte in Anwesenheit geeigneter regulativer Bedingungen wachsen gelassen,die die Expression der. DNA-Sequenz inhibieren. Nach Erreichen der optimalen Zeil-, ι !

dichte werden die Umweltbedingungen so weit geändert, daßj eine Expression der synthetischen DNA-Sequenz erfolgt. Es ist somit beabsichtigt, daß die Herstellung des! Protease-Inhibitors in einer Zeitspanne anschließend an das Wachstum der Wirtszellen bis in die Nähe jg optimaler Dichte erfolgt und daß der erhaltene Protease-Inhibitor einige Zeit nach dem Zeitpunkt geerntet wird, zu dem die regulatorischen Bedingungen induziert wurden, die für dessen Expression nötig sind.

«ο In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der rekomblnante Protease-Inhibitor anschließend an das Ernten und vor dem Annehmen seiner aktiven Struktur gereinigt. Diese Ausführungsform ist insoweit bevorzugt, als die Erfinder glauben, .daß die Ausbeute einer großen Menge des gefalteten Proteins erleichtert wird, wenn das Protein vorher gereinigt wird. Es ist jedoch auch ein Verfahren möglich, bei dem der Protease-Inhibitor vor dem Reinigen zur Faltung gebracht wird, um die aktive Struktur anzunehmen.

OQ In einer zusätzlichen, bevorzugten alternierenden Ausführungsform kann der Protease-Inhibitor in seinem gefalteten, aktiven Zustand vorliegen, ehe er aus dem Kulturmedium gewonnen wird.

op- Unter bestimmten Umständen nimmt der 'Protease-Inhibitor seine richtige, aktive Struktur nach der Expression in

3 υ 3 / Ί /

- 41 -

dem Wirtsorgänismus und dem Transport des Proteins durch die Zellwand oder Membran in den periplasmatischen Raum an» Dies wird im allgemeinen dann^intreten, wenn DNA, die für eine geeignete Leadersequenz codiert, mit" DNA verbunden wird, die für. das rekombinante Protein codiert. Falls der Protease-Inhibitor seine richtige, aktive Struktur nicht annimmt, müssen zuerst jegliche Disulfidbindungen, die gebildet wurden und/oder jegliche nichtkövalenten Interaktionen, die aufgetreten sind, durch denaturierende und reduzierende Mittel zerstört werden, beispielsweise durch Guanidiniumchlorid und ß-Mercaptoethanol, ehe es dem Protease-Inhibitor möglich ist, seine aktive Struktur nachfolgend an Verdünnung und Oxydation dieser Mittel unter kontrollierten Bedingungen anzunehmen.

Es wird davon ausgegangen, daß die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung bezüglich eines bestimmten Problems oder Umstandes im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmannes liegen, ^!' " , ·

Ausführunqsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Insbesondere werden Beispiele der Produkte der vorliegenden Erfindung und repräsentative Verfahren für deren Isolierung und Herstellung im einzelnen dargelegt»

Beispiel 1 . .

Auf der Basis der Aminosäuresequenz, wie sie oben beschrie-

. 25 3*42

- 41a -

ben wurde-» wird die folgende DNA-Sequenz vorgeschlagen, wobei die Verwendung der Codorts für hochexpressive Gene von Escherichia cpli und die Zurverfügungsteiluhg von geeigneten Restriktionsendonuklease-Schneidestelien vorgeschlagen wird: _v

Hindlll 5'AGC GGT AAA AGC TTC AAA GCT GGC GTA TGC CCG CCG

AIuI

FnuDlI

Rsal

HpaII

AAA AAA TCC GCG CAG TGT CTG CGG TAC AAA AAA CCG

Hhai

Xmal

QAA TGC CAG TCC GAC TGG CAG TGC CCG GGT AAA AAA

HpaIINeil

Heil

CGT TGT TGC CCG GAC ACC TGC GGC ATC AAA TGC CTG

HpaII Fnu4HI BstNI

BaroHI

GAT CCG GTT GAT ACC CCG AAC CCG ACT CGT CGA AAA HpaII _v Tagl

Neil HpaII Ball

CCG GGT AAA TGC CCG GTA ACC TAT GGC CAG TGT CTG HpaII Neil HaeIII

ATG CTG AAC CCG CCG AAC TTC TGC GAA ATG GAC GGC

HaeIII

BqIII

CAG TGT AAA CGA GAT CTG AAA TGC TGT ATG GGT ATG

MbOl

Neil

TGC GGC AAA TCT TGT GTT TCC CCG GTA AAA GCA TAA 3*

HpaII

Um die Expression des Proteins in einer Form zu regulieren, die für den Export in das Periplasma von E.coli geeignet ist, werden die folgenden regulatorischen Elemen'te vorgeschlagen:

30 ein tac-Promoter ,,für die Initiation der Transkription auf einem hohen Level; ein lac-Operator für die Regulierung der Transkription; einen lac-Repressor (lac 1^), der an einer anderen Stelle auf dem Plasmid codiert; eine OmpA-Shine-Dalgarno-Sequenz, um die Translation auf einem hohen Level

35 zu initiieren; einen OmpA-Leader, um den Export des Produkts in das Periplasma zu erleichtern; ein AIa einer Ala-Ser-Ver-

-6.12.85

π.

3C37i

' 1 bindung zwischen der Proteinsequenz, die durch diese Ope-, rato.relemente codiert wird und derjenigen,, die durch die j Strukturgene, wie sie oben beschrieben wurden, codiert wird, 'um ein gezieltes Schneiden des Ausgangsproduktes zu ermöglichen, so daß ein reifer Leukozytenelastaseinhi-

bitor 'erhalten werden kann. Alle diese Eigenschaften sind ! in der' folgenden DNA-Sequenz enthalten:

CTGCA GCTGT TGACA ATTAA TCATC GGCTC GTCTC GTATA ATGTG ATAAC GAGGC GCAAA AAATG AAAAA GACAG CTATC GCGAT CGCAG TGGCA ¹CTGGC TGGTT TCGCT ACCGT AGCGC AGGCC.

Um die Expression des Proteins in einer Weise zu regulieren, daß das Pro'tein im E . c öl i- Zy to plasma verbleibt, wer-, den die folgenden Operonelemente vorgeschlagen: der tac-Promoter, der lac-Operator und der lac-Repressor (lac I^) ; eine mit den Shine-Dalgarno-Sequenzen übereinstimmende Sequenz; und um eine Translation auf hohem Level zu initiieren, ein Fragment eines OmpA-Leader-Peptids, das als Translationskuppler verwendet" werden kann.Die Translationskupplungssequenz enthält die DNA, die für die Translationsinitiationsregion des OmpA-Gens codiert, die ersten Aminosäuren des OmpA-Leader-Peptids, die mit der Shine-Dalgarno-Sequenz übereinstimmenden Sequenzen, wie sie oben beschrieben wurden und einen Translationsterminator. Die Translationskupplungssequenz muß zwischen den Promoter und die Translationsinitiationsstelle des Serinproteaseinhibitorgens inseriert werden, wobei sie die letztere Sequenz überlappt. Alle diese Eigenschaften sind in der folgenden DNA-Sequenz enthalten:

CTGCA GCTGT TGACA ATTAA TCATC GGCTC GTCTC GTATA ATGTG ATAAC GAGGC GCAAA AAATG AAAAA GACAG CTATC GCGAT CGGAG TGTAA GAAAT G.

-619RR- 3-u3 7 "i /

-44-A. Konstruktion eines Genfragments

Um die obengenannten Sequenzen zu konstruieren, wurden die folgenden Desoxyribonukleotide synthetisiert, wobei ein ABI DNA-Synthesegerät (Foster City California) verwendet wurde. Die Produkte werden durch Polyacrylamidg'elelektrophorese, wie in der Gebrauchsanweisung für das ABI-Gerät beschrieben, gereinigt. Die Produkte sind am 5'-Ende phosphoryliert, wobei T4-Polynukleotidkinase und ATP unter Standardbedingungen verwendet wird.

Die folgende Gruppe von Oligonukleotidsequenzen wird verwendet, um ein Fragment Aa zu konstruieren.

Oligonukleotid Aa1: GCTGT TGACA ATTAA TCAT. Oligonukleotid Aa2: CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG

GATAA CAATT T.

Oligonukleotid Aa3: CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA.

Oligonukleotid Aa4: ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG.

Oligonukleotid Aa5: CAGTG GCACT GGCTG GTTTC GCTAC CGTAG CGCAG GCCAG CGGTA AA.

Oligonukleotid Aa6: GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC-TGCA.

Oligonukleotid Aa7: TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C.

Oligonukleotid Aa8: CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA.

Oligonukleotid Aa9: GCCAC TGCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG.

Oligonukleotid Aa1Ö: AGCTT TTACC GCTGG CCTGC GCTAC GGTAG CGAAA CCAGC CAGT.

Die folgenden Oligonukleotidsequenzen werden miteinander

verbunden, um Fragment Ab zu bilden.

Oligonukleotid Ab'1 : GCTGT TGACA ATTAA TCAT. Oligonukleotid Ab2: CGGCT CGTAT AATGT GTGGA ATTGT GAGCG GATÄA CAATT T

Oligonukleotid Ab3: CACAC ATAAC GAGGC GCAAA AA.

I -45-

1 Oligonukleotid AbM: ATGAA AAAGA CAGCT ATCGC GATCG.

Oligjonukleotid Ab5 : GAGTG TAAGA AATGA GCGGT AAA.

Olig'onukleotid AB6 : GAGCC GATGA TTAAT TGTCA ACAGC TGCA.

Oligonukleotid Ab7: TCCGC TCACA ATTCC ACACA TTATA C.

⁵ Oligonukleotid Ab8: CCTCG TTATG TGTGA AATTG TTA.

Oligonukleotid Ab9: AGCTT TTACC. GCTCA TTTCT TACAC

TCCGA TCGCG ATAGC TGTCT TTTTC ATTTT TTGCG.

Im folgenden werden die Oligonukleotidsequenzen darge-10 stellt, die verbunden werden, um das Fragment B herzustellen.

Oligonukleotid BI AAATC CGCG

Oligonukleotid B2 Oligonukleotid B3 TGTTG C.

Oligonukleotid B4 Oligonukleotid B5 GGCAA CAACG TTTTT Oligonukleotid B6 GTACC G.

Oligonukleotid B7 TACGC CAGCT TTGA.

AGCTT CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA

CAGTG- TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG

TCCGA CTGGC AGTGC CCGGG TAAAA AACGT

CCGGA CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG.

GATCC AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG TACCC GGGCA

CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT

CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA

Im folgenden sind die Oligunukleotidsequenzen dargestellt, die verwendet werden,, um das Fragment C zu bilden.

Oligonukleotid C1 Oligonukleotid C2 Oligonukleotid C3 Oligonukleotid C4 Oligonukleotid C5 Oligonukleotid C6 AAGTT.

GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG.

ACTCG TCGAA AA.

CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC.

CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC.

TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GAT.

CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG

-6.12.95

r,.

3 υ 3 7 ) /

-46- .

Oligonukleotid C7: CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA.

Oligonukleotid C8: TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT.

Oligonukleotid C9: CGGGG TATCA ACCG.

Die folgende Gruppe von Oligonukleotidsequenzenwird zusammengefügt, um das Fragment D zu bilden.

Oligonukleotid D1: GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC.

Oligonukleotid D2: AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G.

Oligonukleotid D3: TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA-GATTT GCCGC A.

Oligonukleotid DlJ: CATAC CCATA CAGCA TTTCA.

,c Die folgenden Gruppen von Oligonukleotiden werden unter Standardbedingungen gemischt und abgekühlt und sowohl miteinander verbunden, als auch mit den klonierenden und sequenzierenden Vektoren M13 mpi8 und 19, die mit geeigneten Restriktionsendonukleasen geschnitten wurden,

„η verbunden , unter Verwendung von T4' DNA-Ligase bei Standardbedingungen. Die Produkte werden verwendet, um E.coli JM105 zu' transformieren und Klone, die die interessierende DNA enthalten , werden von weißen Plaques von IPTG-Xgal-Platten ausgewählt und sodann durch Hybridi-

₂g sierung mit P-markierten Oligonukleotiden, ausgewählt · aus der Gruppe, die im Abkühlungsschritt verwendet wurde,I weitergescreened. Die inserierte Struktur wurde durch Didieoxysequenzierung der klonierten DNA bestätigt, wobei ein Universalprimer verwendet wird.

'

Die_; Gruppe Aa enthält Oligonukleotide Aal - AaIO, die

mit M13 mpi8 und 19, die mit Pstl und Hindlll geschnitten wurden, ligiert werden. Die Gruppe Ab enthält die Oligonukleotide Ab1 Ab9, die mit M13 mp1.8 und 19 verbunden werden, die mit _ Pstl und Hindlll geschnitten wurden. Die Gruppe B, die

- ö. "ϊ2. ö 5 -

-117-

die Oligonukleotide BI bis.B7 enthält, wird mit M13 mpi8 und 19 verbunden, die mit, HindIII und BamHI geschnitten wurden. Die Gruppe C, die die Oligonukleotide Cl bis C9 enthält, wird mit ΜΊ3 mpi8 und 19 verbunden, die mit BamHI und Xbal geschnitten wurden. Die Gruppe D, die die Oligonukleotide D1 bis D4 enthält, wird mit Ml 3 mpi8 und '-19 verbunden, die mit BamHI und Sail geschnitten wurden.

Die replikative Form der M13 DNA wird aus dem Klon, der die gewünschte DNA-Insertion enthält, durch Standardmethoden gewonnen. Die zur Gruppe Aa "korrespondierende, inserierte DNA wird aus der M13 DNA durch Schneiden der DNA mit geeigneten Restriktionsendonukleasen herausgeholt und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Die Struktur dieser DNA-Insertion ist die folgende:

aattcgagctcggtacccggggatcctctagagtcgacctgcagctg gctcgagccatgggcccctaggagatctcagctggacgtcgac

ttgacaattaatcatcggctcgtataatgtgtggaattgtgagcg aactgttaattagtagccgagcatattacacaccttaacactcgc

gataacaatttcacacataacgagg€gcaaaaa ctattgttaaagtgtgtattgctccgcgttttt

atgaaaaagacagctatcgcgatcgcagtggcactggct tactttttctgtcgatagcgctagcgtcaccgtgaccga

ggtttcgctaccgtagcgcaggccagc ccaaagcgatggcatcgcgtccggtcg

GGTAAA CCATTTTCGA

Die inserierte DNA, die zur Gruppe Ab korrespondiert, wird durch Schneiden der DNA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und HindIII ' exzisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende:

-48-

AATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTA GCTCGAGCCATGGGCCCCTAGGAGAT

GAGTCGACCTGCAGCTGTTGACAATTAATC CTCAGCTGGACGTCGACAACTGTTAATTAG 5

ATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAG TAGCCGAGCATATTACACACCTTAACACTC

CGGATAACAATTTCACACATAACGAGGCGC GCCTATTGTTAAAGTGTGTATTGCTCCGCG

_n AAAAAATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCGG

^iU TTTTTTACTTTTTCTGTCGATAGCGCTAGCC

AGTGTAAGAAATGAGCGGTAAA TCACATTCTTTACTCGCCATTTTCGA

Die inserierte DNA, die zur Gruppe D korrespondiert , wird durch Schneiden der DNA mit den Restriktionsendonukleasen Hindlll und BamHI exzisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende:

AGCTTCAAAGCTGGCGTATGCCCGCCG

AGTTTCGACCGCATACGGGCGGC

AAAAAATCCGCGCAGTGTCTGCGGTACAAATTTTTTAGGCGCGTCACAGACGCCA7GTTT

: AAACCGGAATGCCAGTCCGACTGC-CAGTGC ' TTTGGCCTTACGGTCAGGCTGACCGTCACG

CCGGGTAAAAAACGTTGTTGCCCGGACACC GGCCCATTTTTTGCAACAACGGGCCTGTGG

TGCGGCATCAAATGCCTG ACGCCGTAGTTTACGGACCTAG

Die inserierte DNA, die zur Gruppe C korrespondiert, wird durch Schneiden der DNA mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und BgIII exzisiert und durch Polyacrylamidgelelek-

trophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende: 35

-6.i2.85-. GC-37-iT

-49-

GATCCGGTTGATACCCCGAACCCGACT GCCAACTATGGGGCTTGGGCTGA

CGTCGAAAACCGGGTAAATGCCCGGTA GCAGCTTTTGGCCCATTTACGGGCCAT

ACCTATGGCCAGTGTCTGATGCTGAACCCG TGGATACCGGTCACAGACTACGACTTGGGC

CCGAACTTCTGCGAAATGGACGGCCAGTGT GGCTTGAAGACGCTTTACCTGCCGGTCACA

AAACGA

TTTGCTCTAG

Die inserierte DNA, die zur Gruppe D korrespondiert, wird durch Schneiden der DNA mit den Restriktionsendonukleasen SauIIIA und Sa_ll exzisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende:

GATCTGAAATGCTGTATGGGTATG ACTTTACGACATACCCATAC

TGCGGCAAATCTTGTGTTTCCCCG ACGCCGTTTAGAACACAAAGGGGC

GTAAAAGCATAAG CATTTTCGTATTCAGCT

B. Herstellung der Gene

Für die Konstruktion des Gens, werden,die Insertionen aus der Gruppe Aa, B, C und D kombiniert und mit M13 mpi8 und 19, die mit EcoRI und Sail unter Verwendung von T-4 DNA-Ligase unter Standardbedingungen geschnitten wurden, ligiert. Die Klone, die das Gen enthalten, werden durch ihre Farbe auf Xgal-Platten selektiert und durch Hybridisierung mit - P Oligonukleotiden hybridisiert. Die Struktur der selektierten Klone wird durch Dideoxysequenzierung der inserierten Region der DNA unter Verwendung des Universalprimers bestätigt .

6.12.85- 3-C37-1

q-7..;

-50-

Bei der Konstruktion für die zytoplasmatische Expression werden, die Insertionen der Gruppen Ab, B, C und D kombiniert und mit Ml3 mpi8 und 19, die mit EcoRI und Sail unter Verwendung von T4 DNA-Ligase geschnitten wurdenunter Standardbedingungen ligiert. Die Klone, die die Gene enthalten, werden durch ihre Farbe auf Xgal-Platten selektiert und durch Hybridisierung mit ^ P-markierten Insertionen weiter gescreened.Die Strukturen der selektierten Klone werden durch Dideoxysequenzierung der inserierten Regionen der DNA unter Verwendung eines Universalprimers bestätigt.

BEISPIEL 2

Auf der Basis der oben beschriebenen Aminosäuresequenz wird die folgende DNA-Sequenz vorgeschlagen, wobei Codons von hochgradig exprimierten Genen von Esrcherichia coli verwendet werden sowie Codons für geeignete Restriktionsendonukleaseschneidestellen:

i Hindlll

5' TCT GGT AAA AGC TTC AAA GCT GGC GTA TGC CCG CCG

AIuI

FnuDII y Rsal Hpall AAA AAA TCC GCG CAG TGT CTG CGG TAC AAA AAA CCG

Hhal

Xmal GAA TGC CAG TCC GAC TGG CAG TGC CCG GGT AAA AAA

Hpall

Neil Hpall

CGT TGT TGC CCG GAC ACC TGC GGC ATC AAA TGC CTG Neil Fnu4HI BstNI

BamHI

CCG GTT GAT ACC CCG AAC CCG ACT CGT CGA AAA Hpall . Taql

-6.12.85- 3-U-3/-I

-51-

HpaII HpaII Ball

CCG GGT AAA TGC CCG GTA ACC TAT GGC CAG TGT CTG •Neil Neil HaeIII

ATG CTG AAC CCG CCG AAC TTC TGC GAA ATG GAC GGC

HaeIII

BqIII

CAG TGT AAA CGA GAT CTG AAA TGC TGT ATG GGT ATG

MbOl

Fnu4HI Neil

TGC GGC AAA TCT TGT GTT TCC CCG GTA AAA GCA TAA 3'

Hpall

Um die Expression des Proteins in einer Form zu regulieren, die geeignet ist für das Ausschleusen in den periplasmatisehen Raum von E.coli, werden die folgenden regulatorischen Elemente vorgeschlagen: tac-Promoter auf Plasmid pKK223-3 für die Initiierung der Transkription auf einem hohen Level; ein lac-Operator auf Pl-asmid pKK223-3 für die Regulierung der Transkription; ein lac-Repressor (Iac I^q)der auf dem Chromosom des E.coli-StammesJ M107 codiert ist;

eine OrapA-Shine-Dalgarno-Sequenz, um die Translation auf • einem hohen Level zu initiieren; ein OmpA-Leader, um das Ausschleusen des Produkts in den periplasmatischen Raum zu erleichtern; ein AIa einer Ala-Ser-Verbindung zwischen der Proteinsequenz, die durch diese Operatorelemente codiert wird und derjenigen, die durch die Strukturgene, wie sie oben beschrieben wurden, codiert werden, um ein gezieltes Schneiden des Ausgangsprodukts zu ermöglichen, um den reifen Leukozytenelastaseinhibitor®zu erhalten.

Die OmpA-Elemente werden in die folgende DNA-Sequenz eingebaut: . ' '

CGfiTA TCTCG^r-TGGA- GATAT TCAT GACGT ATTTT GGATG ATAAC GAGOC GCAAA" AAATtJ" AAAAA GACAG CTATC GCGAT CGCAG TGGCA CTC-GC TGGTT TCGCT ACCGT AGCGC AGGCC.

!2.85· 3C37'i7

-52-

Um die Expression des Proteins in einer Form zu regulieren, daß das Protein im E.coli-Zytoplasma verbleibt, werden die folgenden Operonelemente vorgeschlagen: Der tac-Promoter auf dem Plasmid pKK223-3; der lac-Operator auf dem Plasmid pKK223-3 und der lac-Repressor (Iac I^q) auf dem Chromosom des E.coli-Stammes JM1O7; eine mit der Shine-Dalgarno-Sequenz übereinstimmende Sequenz; und. um einen hohen Grad an Translation zu initiieren, ein. Fragment des OmpA-Leader-Peptids, das als.Translationskuppler verwendet wird. Die Translations-Kupplungssequenz enthält die DNA, die für die Translations-Initiationsregion des OmpA-Gens codiert, die ersten acht Aminosäuren jdes OmpA-Leader-peptids, eine mit der Shine-Dalgarno-Sequ'enz übereinstimmende Sequenz, wie sie oben beschrieben 'wurde und einen Translationsterminator. Die Translätiorfskupplungssequenz muß zwischen dem lac-Operator und ;der Translationsinitiationsstelle des Protease-Inhibitorgens inseriert werden, wobei sie die letztere Sequenz überlappt. Die Eigenschaften des Translationskupplers sind in der folgenden DNA-Sequenz enthalten:

GAATT CGATA TCTCG TTGGA GATAT TTCAT GACGT ATTTT GGATG ATAAC GAGGC GCAAA AAATG AAAAA GACAG CTATC GCGAT CAAGG AGAAA TAAAT G.

-

C. Herstellung eines Genfragments

Um die oben genannten Sequenzen herzustellen, werden die

folgenden Desoxyribonukleotide synthetisiert, wobei ein on

^Q ABI DNA-Synthesegerät (Foster City, California) verwendet wird.. Die Produkte werden durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt, wie es in der Betriebsanleitung für das ABI-Gerät beschrieben ist. Sie sind am 5'-Ende phosphoryliert, wobei T4-Polynukleotidkinase und ATP standardmäßig verwendet werden.

_ ~. - Γ-s —; ' —*

-53-

Die folgende Gruppe von Oligonukleotidsequenzen wird verwendet, um das Fragment Aa herzustellen.

Oligonukleotid Aa. 1 : AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA Oligonukleotid Aa2:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG.

Oligonukleotid Aa3:

GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC. Oligonukleotid Aa4:

GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG.

Oligonukleotid Aa5:

GATCCGATCGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTAAA.

Oligonukleotid Aa6: AGCTTTTACCAGAGGCCTGCGCTACGGTAGCGAAACCAGCCAGTGCCACTGCGATCG.

Die folgenden Oligonukleotidsequenzen werden zusammengefügt, um das Fragment Ab zu bilden.

Oligonukleotid Ab1:

AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAA.

Oligonukleotid Ab2:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATCG.

Oligonukleotid Ab3: GATCCGATCGCGATAGCTGTCTTTTTCATTTTTTGC.

Oligonukleotid Ab4:

GCCTCGTTATCATCCAAAATACGTCATGAATATCTCCAACGAGATATCG.

Oligonukleotid Ab5: ' -

CAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA. Oligonukleotid Ab6:

AGCTTTTACCGCTCATTTATTTCTCCTTGAT.

' -R1¹?ft^ri- 3C37

. -54-

Im folgenden sind die Oligonukleotidsequenzen zusammengestellt ,um das Fragment B zu bilden.

Oligonukleotid B1:

AGCTT'CAAAG CTGGC GTATG CCCGC CGAAA AAATC CGCG. Oligonukleotid B2:

CAGTG. TCTGC GGTAC AAAAA ACCGG AATGC CAG. Oligopukleotid B3:

tccgaj ctggc agtgc ccggg taaaa aacgt tgttg c.

Oligonukleotid B4:

CCGGA; CACCT GCGGC ATCAA ATGCC TG.

Oligonukleotid B5:

GATCC^; AGGCA TTTGA TGCCG CAGGT GTCCG GGCAA CAACG TTTTT TACCC GGGCA

Oligonukleotid B6:

CTGCC AGTCG GACTG GCATT CCGGT TTTTT GTACC G.

Oligonukleotid B7:

CAGAC ACTGC GCGGA TTTTT TCGGC GGGCA TACGC CAGCT TTGA.

Im folgenden werden die Oligonukleotidsequenzen verwendet, um das Fragment C herzustellen.

Oligonukleotid C1:

GATCC GGTTG ATACC CCGAA CCCG..· Oligonukleotid C2:

ACTCG TCGAA AA.' Oligonukleotid C3:

CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GC. , Oligonukleotid C4: CAGTG TCTGA TGCTG AACCC GCCGA AC.

Oligonukleotid C5:

TTCTG CGAAA TGGAC GGCCA GTGTA AACGA GATJ Oligonukleotid C6:

• CTAGA TCTCG TTTAC ACTGG CCGTC CATTT CGCAG AAGTT. 35

• -55-

Oligonukleotid C7:

CGGCG GGTTC AGCAT CAGAC ACTGG CCATA GGTTA CCGGG CA.

Oligonukleotid C8:

. TTTAC CCGGT TTTCG ACGAG TCGGG TT. Oligonukleotid C9:

CGGGG TATCA ACCG.

Die folgende Gruppe von Oligonukleotidsequenzen wird

zusammengefügt, um das Fragment D zu bilden. 10

Oligonukleotid D1:

GATCT GAAAT GCTGT ATGGG TATGT GCGGC.

Oligonukleotid D2:

AAATC TTGTG TTTCC CCGGT AAAAG CATAA G. Oligonukleotid D3:

TCGAC TTATG CTTTT ACCGG GGAAA CACAA GATTT GCCGC A.

Oligonukleotid D4:

CATAC CCATA CAGCA TTTCA.

Die folgenden Gruppen von Oligonukleotiden werden unter Standardbedingungen gemischt und abgekühlt und sowohl miteinander als auch an die klonierenden und sequenzierenden Vektoren M13 mpi8 und 19, die mit geeigneten Restriktionsendonukleasen geschnitten wurden, unter Ver-Wendung von T4-DNA-Ligase, ebenfalls unter Standardbedingungen_jligiert. Die Produkte werden verwendet,·um E.coli JM105 zu transformieren und die Klone, die die interessierende DNA enthalten, werden durch Hybridisie-

3 2

rung mit -" P markierten Oligonukleotiden, ausgewählt aus der Gruppe, die im Abkühlungsschritt verwendet wurde, -,selektiert. Die inserierte Struktur wird durch Dideoxysequenzierung der klonierten DNA unter Verwendung eines Universalprimers bestätigt.

Die Qligonukleotide Aa1 - Aa4 werden mit M13mpi8 und M13mp19, geschnitten mit EcoRI und BamHI,ligiert. Die

P ',Π Q Γ, . ^ ι :?, 7 "I /

-56-

replikative Form von Ml 3 DNA, die die gewünschte inserierte DNA enthält,'wird mittels Standardmethoden gewonn-en. Die inserierte DNA wird aus der M13 DNA durch Schlneiden der MI3 DNA mit den Restriktionsendonukleasen Eco!rI und Pvu1 exzisiert und. durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Die Struktur dieser DNA ist die folgende:

aattcgatatctcgttggagatattcatgacgtattttggatgataacgaggcgcaaaaaatga gctatagagcaacctctataagtactgcataaaacctactattgctccgcgttttttact

aaaagacagctatcgcgat ttttctgtcgatagcgc

^e Die Oligonukleotide Aa5 und Aa6 werden mit M13mpi8 und M13mp19, die mit BamHI und Hindlll geschnitten wurden, ligiert. Die replikative Form der M13 DNA, die die gewünschte inserierte DNA enthält, wird durch Standardmethoden gewonnen. Die inserierte DNA wird aus

2Q der M13 DNA durch Schneiden der DNA mit dem Restriktionsendonukleasen Pvu1 und Hindlll exzisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die, folgende :

CGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTCTGGTAAA 5 TAGCGTCACCGTGACCGACCAAAGCGATGGCATCGCGTCCGGAGACCATTTTCGA

Dieses Pvu1-Hindlll-Fragmeht wird mit dem EcoRI-Pvu1-Fragment, das aus den Oligonukleotiden Aa1 - Aa4 herge-

„Q stellt wurde.kombiniert und mit M13mpi8 und M13mp19, die mit EcoRI und Hindlll geschnitten wurden, ligiert.· Die replikative Form der M13 DNA, die die gewünschte, inserierte DNA enthält, wird durch Standardmethoden gewonnen. Die inserierte DNA, bei der es sich um das DNA-

_Q[- Fragment Aa handelt, wird aus der MI3 DNA durch Schneiden

-57-

der M13 DNA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Hindlll exzisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende:

AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGT ATTTTGGATGAT AACGAGGCGCAAAAAATGA gctatagagcaacctctataagtactgcataaaacctactattgctccgcgttttttact

aaaagacagctatcgcgatcgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcctctggta ttttctgtcgat agcgct agcgtcaccgtgaccgaccaaagcgatggcatcgcgtccggagaccat

TTTCGA

Die Oligonukleotide Ab1 - AbM werden mit M13mpi8 und M13mp19, die mit EcoRI und BamHI geschnitten wurden, ligiert. Die replikative Form derMi3 DNA, die die gewünschte, inserierte DNA aufweist, wird mit Standardmethoden gewonnen. Die inserierte DNA wird aus der MI3 DNA durch Schneiden der DNA mit den Restriktions-2Q endonukleasen EcoRI und Pvu1 exzisiert und durch PoIyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende:

AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGCGTTTTTTACT

AAAAGACAGCTATCGCGAT TTTTCTGTCGATAGCGC

Dieses EcoRI-Pvu1-Fragment wird mit den Oligonukleo- -Q tiden Ab5 und Ab6 vereint und mit M13mpi8 und M13mp19, geschnitten mit EcoRI und Hindlll ,ligiert. Die replikative Form der M13 DNA, die die gewünschte, inserierte: DNA enthält, wird durch Standardmethoden gewonnen. Dip inserierte DNA, bei der es sich um das Fragment

_oe Ab handelt, wird aus der M13 DNA durch Schneiden der du

DNA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Hindlll exzisiert und mittels Polyacrylamidgelelektrophorese

ι -58-

gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende:

AATTCGATATCTCGTTGGAGATATTCATGACGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAAATGA GCTATAGAGCAACCTCTATAAGTACTGCATAAAACCTACTATTGCTCCGCGTTTTTTACT

^! AAAAGACAGCTATCGCGATCAAGGAGAAATAAATGAGCGGTAAA j TTTTCTGTCGATAGCGCTAGTTCCTCTTTATTTACTCGCCATTTTCGA

Die Gruppe B, die die Oligonukleotide B1 bis-B7 enthält, wird mit M13mp18 und 19, geschnitten mit Hindlll und BamHi; -^q ligiert. Die inserierte DNA, die zur Gruppe B korrespondiert,, wird durch Schneiden der DNA mit,den Restriktionsendonukleasen Hindlll und BamHI exzisiert und durch PoIyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist

die folgende: AGCTTCAAAGCTGGCGTATGCCCGCCGAAAAAATCCGCGCAGTGTCTGCGGTACAAA

AGTTTCGACCGCAT ACGGGCGGCTTTTTT AGGCGCGTCACAGACGCCATGTl 1

aaaccggaatgccagtccgactggcagtgcccgggtaaaaaacgttgttgcccggacacc tttggccttacggtcaggctgaccgtcacgggcccattttttgcaacaacgggcctgtgg

tgcggcatcaaatgcctg

ACGCCGTAGTTTACGGACCTAG

Die Gruppe C, die die Oligonukleotide C1 bis C9 enthält, wird mit MI 3mp18 und 19,' die mit BamHI und Xbal geschnitten wurden, ligiert. Die inserierte DNA, die zur Gruppe C korrespondiert, wird durch Schneiden der DNA mit den Restriktionsendonukleasen BamHI und BgIII exzisiert und wird durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende:

gatccggttgataccccgaacccgactcgtcgaaaaccgggtaaatgcccggta gccaactatggggcttgggctgagcagcttttggcccatttacgggccat

acctatggccagtgtctgatgctgaacccgccgaacttctgcgaaatggacggccagtgt tggataccggtcacagactacgacttgggcggcttgaagacgctttacctgccggtcaca

AAACGA

TTTGCTCTAG

Die Gruppe D, die die Oligonukleotide D1 bis D4 enthält, wird mit M13mpi8 und 19, die mit BamHI und Sail g.eschnit-

-59- _:

ten wurden, ligiert. Die inserierte DNA, die zur Gruppe D korrespondiert, wird durch Schneiden der DNA mit den Restriktionsendonukleasen SauIIIA und Sail exzisiert und durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Ihre Struktur ist die folgende:

gatctgaaatgctgtatgggtatgtgcggcaaatcttgtgtttccccg actttacgacatacccatacacgccgtttagaacacaaaggggc

gtaaaagcataag cattttcgtattcagct

n D. Herstellung des Gens

Bei der Herstellung eines Gens, das ausgeschleust werden soll, werden die Insertionen aus den Gruppen Aa, B, C und D vereint und mit M13mpi8 und 19, die mit EcoRI und Sail geschnitten wurden, unter Verwendung der T¹J DNA-Ligase unter S,tandardbedingungen ligiert. Beim Herstellen eines Gens für die zytoplasmatische Expression, werden die Insertionen aus den Gruppen Ab, B, C und D vereint und mit M13nipi8 und 19, die mit EcoRI und Sail geschnitten wurden., unter Verwendung von T4 DNA-Ligase unter Standardbedingungen ligiert. Die Klone, die die Gene enthalten, werden aufgrund ihrer Farbe auf Xgal-Platten selektiert und weiterhin durch

2p Hybridisierung mit ^J P markierten Oligonukleotiden gescreened.Die Struktur für die selektierten Klone wird durch Dideoxysequenzierung der inserierten Region der DNA unter Verwendung des Universalprimers bestätigt.

! BEISPIEL 3

·

Herstellung des Expressionsvektors.

Die Insertionen für die Herstellung von Genprodukten, die sowohl für das Ausschleusen als auch für die zytoplasmatische Expression geeignet sein sollen, werden auf Expressionsplasmide transferiert, wie es im folgenden beschrieben wird. Die replikative Form der M13 DNA, die die ge-

ein⁵;- · 3C-37i /

: -6o-

wünschte, inserierte DNA enthält, wird mittels Standardmethoden, wie oben beschrieben, -gewonnen. Eine geeignete DNA-Insertion wird aus der MI3 DNA durch Schneiden der DNA mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Pstl exzisiert und mittels Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt. Sie wird sodann mit pKK223-3,. das mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und Pstl geschnitten wurde, ligiert und das so entstandene Plasmid wird in E. coli JM107 kloniert. Auf diese Weise wird das Plasmid pSGEö, wie es in den Beispielen 4 und 5 erwähnt ist, hergestellt, das für das System des Ausschleusens geeignet ist und für die Anwendung in Beispiel 7, bei der es sich 'um die zytoplasmatische Expression handelt, wird das Plasm.id pSGE8 hergestellt. Der . E .coli-Stamm, . der für das Ausschleusen, aufgezeigt in den Beispielen 4 und,5, geeignet ist, ist der Stamm SGE10 und der Stamm, der für die zytoplasmatische Expression, wie sie in Beispiel '6 beschrieben ist, geeignet ist, ist der.Stamm SGE30.

A. Organisation des Plasmids pSGE6

Das Plasraid pSGE6 wurde hergestellt, indem die DNA zwischen die EcoRI-und Pstl-Erkennungsstellen von pKK223-3 zusammen mit einem EcoRI/Pstl-Fragment, das die DNA enthält, die für ompA SLPI codiert, eingebautwird. Die DNA-Sequenz von ompA-SLPI ist die folgende:

10 20 30 40 50 60 GAATTCGATA TCTCGTTGGA GATATTCATG ACGTATTTTG GATGATAACG AGGCGCAAAA CTTAAGCTAT AGAGCAACCT CTATAAGTAC TGCATAAAAC CTACTATTGC TCCGCGTTTT

70 80 90 100 110 120 AATGAAAAAG ACAGCTATCG CGATCGCAGT GGCACTGGCT GGTTTCGCTA CCGTAGCGCA TTACTTTTTC TGTCGATAGC GCTAGCGTCA CCGTGACCBA CCAAAGCGAT GGCATCGCGT

130 140 150 160 170 180 GGCCTCTGGT AAAAGCTTCA AAGCTGGCGT ATGCCCGCCG AAAAAATCCG CGCAGTGTCT CCGGAGACCA TTTTCGAAGT TTCGACCGCA TACGGGCGGC TTTTTTAGGC GCGTCACAGA

_C i») fts- .^ 03 / "i

-61-

190 200 210 220 230 240 GCGGTACAAA AAACCGGAAT GCCAGTCCGA CTGGCAGTGC CCGGGTAAAA AACGTTGTTG CGCCATGTTT TTTGGCCTTA CGGTCAGGCT GACCGTCACG GGCCCATTTT TTGCAACAAC

250 260 270 280 290 300 CCCGGACACC TGCGGCATCA AATGCCTGGA TCCGGTTGAT ACCCCGAACC CGACTCGTCG GGGCCTGTGG ACGCCGTAGT TTACGGACCT AGGCCAACTA TGGGGCTTGG GCTGAGCAGC

310 320 330 340 350 360 AAAACCGGGT AAATGCCCGG TAACCTATGG CCAGTGTCTG ATGCTGAACC CGCCGAACTT TTTTGGCCCA TTTACGGGCC ATTGGATACC GGTCACAGAC TACGACTTGG GCGGCTTGAA

370 380 390 400 410 ' 420 CTGCGAAATG GACGGCCAGT GTAAACGAGA TCTGAAATGC TGTATGGGTA TGTGCGGCAA GACGCTTTAC CTGCCGGTCA CATTTGCTCT AGACTTTACG ACATACCCAT ACACGCCGTT

430 440 450 460 ATCTTGTGTT TCCCCGGTAA AAGCATAAGT CGACCTGCAG TAGAACACAA AGGGGCCATT TTCGTATTCA GCTGGACGTC

Die Sequenz, die im folgenden als "OrapA-SLPI" bezeichnet

wird, ist die DNA aus der Endkonstruktion Μ13πφΐ8, die für das Ausschleusen, wie es oben diskutiert wurde, geeignet ist. Das Plasmid pSGE6 ist in Fig. 1 dargestellt.

In Fig.1 ist das erste Codon für OrapAss-SLPI an der Po-

sition 62 bis 64 der DNA-Sequenz, die "OmpA-SLPI" genannt wird. Das erste Codon für das reife SLPI befindet sichjan Position 125-127. Ptac enthält DNA für den tac-Promote.r , lac-Operator und die Betagalactosidase-Shine /

Dalgarno-Sequenz. Die Abkürzungen R1, Pst und Barn sind

Erkerinungsregionen für die Restriktionsenzyme EcoRI, Pstl und'BamHI. Tet^r ist ein Teil des Gens aus pBR322, das für Tetracyclinresistenz codiert, amp ist das Gen für Ampicillinresistenz, rrnB enthält die DNA aus dem

rrnB-Operon aus der Position 6416 bis zur Position 6840.

Die Pfeile zeigen die Richtung der Transkription an.

B. Organisation des pCJ-OmpA-SLPI

Das Plasmid pCJ-OmpA-SLPI ist das gleiche wie das Plasmid pSGE6 mit der Ausnahme, daß es das vollständige Tetracyclin-

-62-

resistenzgen und den Promoter anstelle des teilweisen Gens enthält. Dieses Plasmid weist Tetracyclinresistenz auf, wenn es in E.coli transferiert wird und wurde in ähnlicher Weise hergestellt wie das Plasmid pSGE6 , mit

der Ausnahme, daß das EcοRI /Psti-Fragment, das die DNA enthält, das für OmpA-SLPI codiert, in den Vektor pCJI anstelle des Vektors pKK223-3 kloniert wurde. Der Vektor pCJI wurde folgendermaßen hergestellt: Das Plasmid pKK223-3 wurde vollständig mit Sphl und teilweise mit BamHI verdaut. Ein 4 , 4Kbp-Fragment wurde über ein Gel gereinigt und mit dem folgenden synthetischen Adapter vereint:

GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC

sowie mit einem 539 bp-Fragment einer DNA aus einem CIaI, 'Sphl-Fragment des tet^r-Gens von pBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01).

C. Struktur des Plasmids pSGE8 20

Das Plasmid pSGE8 ist zu pSGE6 isogen, mit der Ausnahme, daß die DNA zwischen den EcoRI und Pstl-Erkennungsstellen eine Sequenz enthält, die OmpA-tc-met-SLPI genannt wird, die aus der Endkonstruktion M13mpi8, die geeignet ist, für die zytoplasmatische Expression, wie es oben diskutiert wurde, abgeleitet wurde. Diese Sequenz veranlaßt die Synthese von Methionyl-SLPI im Zytoplasma von E .coli. Ein Teildiagramm des Plasmids pSGE8 ist in Fig.2 dargestellt. In der Sequenz, die "OmpA-tc-met-SLPI" genannt ' wird, liegt das Initiationscodon für OmpA an der Position 62-64, das Terminationscodon liegt an der Position 95-97 und das Initiationscodon für Methionyl-SLPI liegt bei 98-100. Die DNA-Sequenz des OmpA-tc-met-SLPI ist die folgende:

-63-ι

10 20 , 30 40 " 50 60

GAATTCGATA TCTCGTTGGA GATATTCATG ACGTATTTTG GATGATAACG AGGCGCAAAA

CTTAAGCTAT AGAGCAACCT CTATAAGTAC TGCATAAAAC CTACTATTGC TCCGCGTTTT

70 ΘΟ 90 100 110 120

AATGAAAAAG ACAGCTATCG CGATCAAGGA GAAATAAATG AGCGGTAAAA GCTTCAAAGC

TTACTTTTTC TGTCGATAGg GCTAGTTCCT CTTTATTTAC TCGCCATTTT CGAAGTTTCG

130 140 150 160 . 170 180.

TGGCGTATGC CCGCCGAAAA AATCCGCGCA GTGTCTGCGG TACAAAAAAC CGGAATGCCA ACCGCATACG GGCGGCTTTT TTAGGCGCGT CACAGACGCC ATGTTTTTTG GCCTTACGGT

190 200 210 ' 220 230 240

GTCCGACTGG CAGTGCCCGG GTAAAAAACG TTGTTGCCCG GACACCTGCG GCATCAAATG

CAGGCTGACC GTCACGGGCC CATTTTTTGC AACAACGGGC CTGTGGACGC CGTAGTTTAC

250 . 260 270 280 ' 290 300 CCTGGATCCG GTTGATACCC CGAACCCGAC TCGTCGAAAA CCGGGTAAAT GCCCGGTAAC GGACCTAGGC CAACTATGGG GCTTGGGCTG AGCAGCTTTT GGCCCATTTA CGGGCCATTG

310 320 330 340 350 360

CTATGGCCAG TGTCTGATGC TGAACCCGCC GAACTTCTGC GAAATGGACG GCCAGTGTAA

GATACCGGTC ACAGACTACG ACTTGGGCGG CTTGAAGACG CTTTACCTGC CGGTCACATT

370 380 390 400 410 420

ACGAGATCTG AAATGCTGTA TGGGTATGTG CGGCAAATCT TGTGTTTCCC CGGTAAAAGC

ί tgctctagXc tttacgacat acccatacac gccgtttaga acacaaaggg gccattttcg

: 430 ATAAGTCGAC CTGCAG TATTCAGCT¹G GACGTC

²⁵ D. Organisation des pCJ-met-SLPI

Das Plasmid pCJ-met-SLPI ist das gleiche wie pSGE8, mit der Ausnahme, daß es anstatt des teilweisen Tetracyclinreistenzgens das vollständige Gen enthält. Das Plasmid CJ-met-SLPI wurde in analoger Weise hergestellt, wie das Plasmid pSGE8 mit der Ausnahme, daß das EcoRI/Pstl-Fragment, das die DNA enthält, das für OmpA-tc-met-SLPI codiert, in den Vektor pCJ1 anstelle des Vektors pKK22'3-3 cloniert wurde ..

•-8.Ί2.85- 3037 i 7

E. Herstellung eines Hefe-Expressionsplasmids

Das Plasmid pUC8 wurde mit; Hindlll verdaut und an einen HindlCC/Smal-Adapter ,(erhältlich bei Amersharn, Cat. Nr.DA 1006) ligiert. Das Einfügen dieses Adapters bei einer HindIII-Erkennungssteile stellt die HindHI-Erkennungsstelle nicht wieder her. Die DNA wird sodann mit Srnal verdaut und in einer verdünnten Lösung ligiert und nachfolgend in E.coli JM83 transformiert. Das rich-

^q tige Plasmid, d.h. ein Plasmid, dem in dem Polylinker die Restriktions'erkennungsstellen von der Hindlll-Erkennungsstelle bis zur Smal-Erkennungsstelle fehlt, wurde durch Verdauung der Plasmid-DNA, die aus Transformanten isoliert wurde, mit EcoRI, Smal oder Hindlll identifiziert. Eine Transformante, die ein Plasmid enthält, dem die Hindlll-Erkennungsstelle fehlt, das jedoch die EcoRI-Erkennungsstelle und Smal-Erkennungssteile aufweist, wurde auf diese Weise identifiziert. Dieses Plasmid ist das Plasmid pGSi85.

Ein EcoRI-Fragment, das das Hefegen MFcCi enthält, wurde durch Gelelektrophorese aus dem Plasmid pCY17 gereinigt, wie es bei J. Kurjan & I. Herskowitz in Cell' 30 .: 933 (1982) beschrieben wurde, wobei auch die-

_oc ses Literaturzitat hiermit ausdrücklich in die Offenbarung miteinbezogen wird,und mit einem EcoRI geschnittenen pGSl85 ligiert. Die Ligierungsmischung wurde verwendet, um E.coli HB101 zu transformieren, wobei auf Ampizillinresistenz selektiert wurde. Die Plasmid-DNA wurde aus

_qn den Transformanten isoliert und die Anwesenheit der korrekten Insertion durch Verdauung der DNA mit EcoRI bestätigt. Dieses Plasmid pGS285 ist in Fig.3 dargestellt

Das Plasmid pGS285- wurde vollständig mit Hindlll verdaut _,_ und unter Verdünnungsbedingungen religiert, um drei der vier inneren Hindlll-Erkennungsstellen. des MFoU-Gens, wie es bei Kurjan & Herskowitz,a a.0.,angegeben wird,zu

-65- ι beseitigen. Ein ko'rrektes Plasmid wurde selektiert, wie

es oben beschrieben wurde. Dieses Plasmid hat die Be-. zeichnung pGS385.

Der M13 AaBCD-Klon, wie er im Beispiel 2 beschrieben wurde, der die Nukleotidsequenzen trägt, die für die Aminosäuren vier bis 107 des synthetischen Gens SLPI codieren, wurde mit Hindlll verdaut. Diese DNA wurde mit 'dem nachfolgend dargestellten Oligonukleotidadapter ligiert:

5' GCT GAA GCT TCA GGT AAG

CGA CTT CGA AGT CCA TTC TCGA.

! . Dieser Adapter wurde durch Zusammenfügen zweier Oligonu-, c kleotide gebildet, wie sie im folgenden dargestellt sind:

5' GCT GAA GCT TCA GGT AAG und 5' AGC TCT TAC CTG AAG CTT CAGC

Das'Verschmelzen wurde durchgeführt, indem die Mischung auf 70⁰C für 2' gehalten wurde, gefolgt durch langsames Abkühlen über Nacht.

Nach dem Ligieren des Adapters mit M13 AaBCD, das mit Hindlll geschnitten wurde, wird die Ligierungsmischung mit Hindlll und Sail verdaut, um ein Fragment zu ergeben, das durch Agarosegelelektrophorese und Elektroelution gereinigt wurde. Dieses Fragment wurde noch einmal mit Hindlll verdaut und dann mit pGS385 DNA ligiert, die mit Hindlll und Sail geschnitten wurde. Sodann wurde E .coli HB101 mit der Ligationsmischung transformiert und Transformanten, die gegen Ampicillin resistent sind, wurden selektiert. Transformanten, die Plasmide mit der korrekt inserierten DNA enthalten, würden durch Preparaton der Plasmid-DNA und deren Verdauung mit Hindlll und Sail identifiziert. Ein Plasmid, das auf diese Weise hergestellt und isoliert wurde, wurde pGS485 genannt

3l 37i 7

-66-

und ist in Fig.4. dargestellt. Dieses Plasmid enthält das MFiX-1-Gen, das in Lesephase mit dem synthetischen SLPI-Gen an der Hindlll-Erkennungsstelle der ersten Spacer-Region des MF<?C1-Gens fusioniert. Von einem auf diese Weise konstruierten Plasmid konnte gezeigt werden, daß es , wenn es in Hefe ein-geführt wird, die Synthese, das Processing und die Sekretion des heterologen Proteins veranlaßt, wie es bei A.J.Brake et al. in PNAS (USA) 81: 4642, gezeigt wurde. Diese Literaturstelle wird hiermit, in die Offenbarung raiteinbezogen. Die Fusion des MFoC-]_Gens und des SLPI ist auf einem EcoRI-Fragment in PGS485 enthalten. Dieses EcoR1-Fragment wurde in den Vektor YIp5 kloniert, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist. .

BEISPIEL 4

Die Expression und Reinigung des sekretorischen Leuko-

zytenproteaseinhibitors (SLPI) unter Verwendung des Plasmids pSGE6.

E.coli-Zellen, die das Plasmid pSGE6 (SGE10 Zellen) enthalten, .werden 6 Stunden in 10 -Liter M9-Medi:<m mit 2 % Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 20g/l Glucose, 200 mg/1 Vitamin B und 100 mg/1 Ampicillin gezüchtet.IPTG wird bis zu 0,2mM der Kultur zugegeben, die sodann weitere 6 Stunden gezüchtet wird. 10 Liter E.coli SGE10-Zellen, bei 8 Gramm pro Liter, werden bei 18.000 χ g pelletiert und in 50 niM Tris.HCl (pH 7,5), ¹JmM EDTA-Puffer (im folgenden T5OE*I ) resuspendiert und pelletiert. Das Pellet wird in 2,5 Litern Τ5ΟΕ4 resuspendiert und in 150 ml-Einheiten geßoren. Acht dieser Einheiten (äquivalent zu 36 Gramm Zellen) werden gepoolt und lysiert durchweinen Einzeldurchgang durch eine.französische Presse (french press)

3C37-i

-67-

bei 12.000 psi und 4°C'. Das Lysat wird 1,5 Stunden bei 20.000 χ g zentrifugiert. Ei'n Sechstel des Pellets, das die unlöslichen Zellbestandteile enthält (äquivalent zu 6 Gramm der Zellen), wird zweimal mit 125ml Τ5ΟΕ4 gewaschen und das verbleibende Material wird über Nacht gefroren.

Das /gefrorene Pellet wird extrahiert mit 25ml eines 10OmM Tris.HCl (pH 8,0), HmM EDTA (im folgenden T100E4), enthaltend 2OmM DTT (erhältlich bei Sigma, Cat. No. D-0632), 4mM!PMSF (erhältlich durch Sigma, Cat .No . P-7626 ) und 8M Harnstoff (ultrarein, erhältlich bei BRL, Cat. No.5505UA), und'zwar eine Stunde lang bei 37⁰C und sodann bei

10.000 x, g zehn Minuten lang zentrifugiert. Der resultierende Überstand wird mit 10ml gepacktem Sephadex SP-C25 (erhältlich von Pharmacia) gemischt, wobei das Sephadex SP-C25 vorher mit dem Extraktionspuffer TIOOE¹I, enthaltend 2OmM DTT und 8M Harnstoff equilibriert wurde und dann auf einem Roller 10 Minuten bei 37⁰C gemischt, damit das SLPI an dem SP-Sephadex absorbieren kann.

Das Harz mit dem absorbierten SLPI wird mittels zehnminütigem Zentrifugieren bei 3-000 χ g pelletiert und der Überstand dekantiert. Das verbleibende Harz wird zweimal mit 25ml T100E4, enthaltend 2OmM DTT und 8M „c Harnstoff gewaschen, gefolgt- von zweimaligem Waschen mit 25ml T100E4, enthaltend 2OmM DTT. Das Harz wird sodann einmal mit einer Mischung aus 0,6ml 5 M NaCl und 25 ml T100E4, enthaltend 20 mM DTT und 0,3 M NaCl extrahiert. Dieser Extrakt enthält etwa 0,15mg/ml Protein und mehr _n als 0,04mg/ml SLPI: Das durch dieses Verfahren erhaltene SLPI läßt sich auf eine Reinheit von mehr als 70% durch Hochdruckflüssigchromatographie bestimmen.

r\ ι η r\ Γ

•\ ο '7 J₁ ~~

-68-' ' BEISPIEL 5

Unter Anwendung des Verfahrens nach Beispiel 4, wird ein gefrorenes Pellet mit T1OOE4 extrahiert, das 1% Triton x-100 (erhältlich bei Sigma, Cat.No.t-6878), anstelle des ersten T100E4/DTT/PMSF/Harnstoff-Waschens enthält. Das so erhaltene SLPI war in geringem Umfang reiner als das, das gemäß der Arbeitsweise des Beispiels 4 gewonnen wurde und wies eine höhere Aktivität bei dem FaI-tungs-Assay auf, wie es nachfolgend im Beispiel 6 beschrieben wird.

BEISPIEL'6

Faltung des gereinigten SLPI.

Etwa 40yg eines teilgereinigten SLPI gemäß Beispiel 4 oder 5, wurde 8M in Harnstoff gemacht oder 5M in Guanidinhydrochlorid (erhältlich bei Pierce Chemical Co., # 24110), und 4mM in DTT und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Oxidiertes Glutathion (erhältlich bei Sigma, Cat.No. G-4626), wurde bis zu 1 3,5mM zugegeben und die Mischung sodann wiederum eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde 10-fach mit einer Lösung von 5OmM Tris in NaOH, pH10,7 "verdünnt und weitere vier Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Sodann wurde die Mischung 5-fach mit 5OmM Tris, pH8,0 und 0,15M NaCl verdünnt und auf eine 1 χ 2 cm Säule Sephadex SP-C25, präequilibriert mit 5OmM Tris, ρΗδ,Ο und 0,25MNaCl , aufgegeben. Das Harz wurde mit 5OmM Tris, pH' 8,0, enthaltend O,25M NaCl gewaschen und sodann mit 5OmM Tris, pH8,0, enthaltend 0,5M NaCl nochmal gewaschen. Die mit der 0,5M Salzwaschung eluierte Fraktion war vollaktiv und repräsentiert etwa 30% des SLPI, das auf die Säule aufgegeben wurde.

-69- · BEISPIEL 7

Reinigung des SLPI aus löslichen und unlöslichen Fraktionen des SGE30 Zell-Lysats

1

Die Expression des Plasmids pSGE8 in E.ooli SGE3O 'Zellen stellt SLPI sowohl in löslichen als auch unlöslichen Fraktionen des Zell-Lysats her. Ein Prozent des totalen Zellproteins enthält eine Verteilung des SLPI zu etwa 80% als lösliche und etwa 20% als unlösliche Fraktionen.

A. Reinigung des SLPI aus der unlöslichen Fraktion.

Die E.coli SGE30-Zellen,enthaltend pSGE8,werden in einem LB-Medium, das 50pg/ml Ampicillin enthält, in einer Schüttelflasche gezüchtet bis zu einer 0D600 von 0,7 und sodann'durch die Zugabe von IPTG bis 0,2mM induziert. Nach drei Stunden werden die Zellen pelletiert und in dem Zweifachen ihres Gewichts von 5OmM Tris HCl (pH 7,5) und 4mM EDTA (im folgenden T50E4) suspendiert. Die Zellen

werden bei 4⁰C durch Ultraschall zerstört und der Extrakt 20 Minuten lang bei 4⁰C bei 12.000 χ g zentrifugiert.

Das Pellet wird im dreifachen Volumen von T5OE4 gewaschen und bei Zimmertemperatur in einer Lösung', die entweder. 1OM Harnstoff oder 6M Guanidinhydrochlorid enthält, sowie 5mM reduziertes DTT, gelöst. Nach einer Stunde Inkubation bei Zimmertemperatur wird oxidiertes Gluthadion in einer Konzentration von 17,5mM zugegeben und die Mischung für eine weitere Stunde inkubiert. Die

Mischung wird sodann im 10-fachen Volumen von 5OmM Tris HCl, pH 10,7 gelöst. Die gelöste Mischung läßt man 4 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und führt darauffolgend eine -Einstellung des pH-Wertes auf 8 durch die Zugabe von 5 N HCl durch. Diese Mischung wird zentrifugiert, um

das präzipitierte Protein zu entfernen.

-70-

Der auf diese Weise hergestellte überstand enthält SLPI, das sekretorische Leukozytenproteaseinhibitoraktivität aufweist. Dieses Protein wurde durch Chromatografie auf Sephadex SP-C25-Säulen, wie oben beschrieben, gereinigt.

B. Reinigung des SLPI aus der löslichen Fraktion.

E.coli SGE30-Zellen, die das Plasmid pSGE8 enthalten, werden in Schüttelflaschen zu einer 0D600 von 0,7 gezüchtet und durch die Zugabe von IPTG bis zu 0,2mM .induziert. Bei einer 0D600 von 1,1 werden die Zellen bei 25.000 χ g 15 Minuten lang pelletiert. Das Pellet wird in T5OE4 resuspendiert und durch zwei Passagen l§ durch eine französische Presse (french press) bei 20.000 psi und 4⁰C lysiert. Das Lysat wird bei 25.000 χ g 15 Minuten lang zentrifugiert,.

Der Überstand wurde 25mM in DTT gemacht. Diese Mischung on wird bei O⁰C eine Stunde lang inkubiert und es wird

ausreichend HCl zugegeben, so daß eine Endkonzentration von 5% erreicht wird. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei O⁰C wird die Mischung bei 2500Ox g 15 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand für die weitere Behand-2g lung entfernt. Der pH des Überstands wird auf 8,0 mit

1OM NaOH eingestellt und durch SDS-PAGE, reverse Phasenhplc-Chromatografie und ELISA analysiert, wodurch mindestens 0,7 Ug SLPI pro 130 ug totalem Protein nachweisbar ist. Das auf diese Weise erhaltene SLPI wird weiter „Q auf einer Sephadex SP-C25 Chromatografiesäule gereinigt. Es wird zu dem aktiven SLPI gemäß Beispiel 6 gefaltet.

^ 7-i 7

; -71-

. ' BEISPIEL 8

Das Ec oRI-Fragment, das das fusionier te SLPI-MFä-1 -Gen

j (siehe Beispiel 3E) enthält, wird an die EcoRI-Erken-

'

nungsstclle der. Hcfevcktors YTp5, wie es bei D.ßototoin und R.W.Davis in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold S"pring Harbor Laboratory, Seiten 607-636 (1982), beschrieben wurde, (dieses Zitat wird ausdrücklich in die Offenbarung miteinbezogen) ligiert, um YIpSLPI-I herzustellen und. wurde in das URA3-Gen von S. cerevisiae BS21¹I (MAT«c, Ura3-52, pep¹!, prbl) integriert, und zwar durch auf bestimmte Stellen gerichtete Rekombination, wie es bei T. Orr-Weaver et al . in Methods in Enzymology 101:228 (1983), (auch dieses Zitat wird in die Offenbarung miteinbezogen),beschrieben wurde.Dieser Stamm, 'S.cerevisiae SGY-1 _t sekretiert ein vollaktives SLPI in den Kulturüberstand.

Ein zweiter Stamm, SGY-3 produziert und sekretiert ebenfalls aktives SLPI. Dieser Stamm trägt die MFOU::

. SLPI-Fusion auf dem replikativen Hefeplasmid pGS585-Dieses Plasmid wurde aus pJDB2O7 hergestellt, wie es

bei J.R.Broach in Methods in Enzymology 101:307 (1983) (ebenfalls in die Offenbarung miteinbezogen) beschrieben wurde, und zwar durch die Zugabe des Hefegens URA3, das· aus dem Plasmid YEp24 isoliert wurde, wie es bei D. Botstein und R.W. Davis in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, S.607-636, beschrieben wurde (auch dieses Literatur-

zitat ist in die Offenbarung miteinzubeziehen), worauf es in die Hindlll-Stelle von pJDB207 geklont wird, um pGS585 herzustellen. Das MFoC1::SLPI-Fusionsgen, das auf einem EcoRI-Fragment enthalten ist, wird in die

Sall-Erkennungsstelle des Plasmids pGS585 unter Verwendung 35

Γ -in ο Γ .

-72-

eines EcoRI-XhoJ-Adapters, (erhältlich bei Araersham, Cat.No. DA1007) geklont, um YEpSLPI-I herzustellen. Dieses Plasmid wird in S.cerevisiae DBY746 (ΜΑΤΛ,, Ura3-52, leu2-3, his 3-1, trp 1-289) durch Transformation eingeführt, wie es bei Ito et al in J. Bacteriology ,153: 163 (1983) beschrieben ist. (Die Literaturstelle ist in die Offenbarung miteinbezogen) .

Die Stämme Saccharomyces cerevisiae SGY-T und SGY-3 läßt man bei 30⁰C bis zur stationären Phase in SD-Medium, dem Uracil fehlt, wachsen, in Übereinstimmung mit dem Verfahren von F.Sherman et al., beschrieben in Methods" in Yeast Genetics, S.62, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York (1,981 ), (einbezogen in die vorliegende Offenbarung); Die Zellen werden aus dem Kulturmedium durch Zentrifugieren entfernt und der Kulturüberstand wird auf SLPI-Aktiviät durch Messen von 1) der Proteaseinhibitoraktivität und 2) der Menge des Materials, das spezifisch mit Anti-SLPI-Antikörpern bindet, mittels eines ELISA.

Reinigungsverfahren können in analoger Weise entwickelt werden, wie es oben bereits beschrieben wurde.

Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß Modifikationen und Variationen des Verfahrens und des Produkts der , vorliegenden Erfindung möglich sind. Die vorliegende j Erfindung deckt diese Modifikationen und Variationen j der Erfindung_f soweit sie im Schutzumfang der Patentansprüche der vorliegenden Erfindung und deren Äquivalentep liegen , ab .

Claims (15)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zum Herstellen der DNA eines Einzelpolypeptidkettenproteaseinhibitors, der mindestens eine aktive Stelle aufweist, die Sermproteaseinhibitoraktivität hat, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

   a) Herstellen einer DNA-Sequenz, die in der Lage ist, einen Wirtsmikroorganismus so zu dirigieren, daß er ein Protein herstellt, das Serinproteaseinhibitoraktivität hat, wobei der genannte Inhibitor wesentliche Homologien zu dem nativen Serinproteaseinhibitor aufweist, der aus Ohrspeicheldrüsensekreten isoliert wird;

   b) Klonieren der DNA-Sequenz in einen Vektor, der geeignet ist,

   in einen Wirtsmikroorganismus transferiert zu werden und sich in diesem zu replizieren, wobei ein derartiger Vektor Operonelemente für die DNA-Sequenz enthält;

   c) Transferieren des Vektors, der die DNA-Sequenz und die Operonelemente enthält in einem Wirtsmikroorganismus, der in der Lage ist, Protease inhibierendes Protein zu exprimieren;

   d) Kultivieren des Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, die für die Vermehrung des Vektors und die Expression des Inhibitors geeignet sind;

   e) Ernten des Inhibitors und

   f) Zurverfügungstellen von Umständen, die es dem Inhibitor erlauben, eine aktive Tertiärstruktur anzunehmen, wobei diese Serinprotease inhibitoraktivität besitzt.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die im Verfahrensschritt a) zur Verfügung gestellte DNA-Sequenz eine synthetische Sequenz ist..
3. 3. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte synthetische DNA-Sequenz geeignet ist, die mikrobielle Synthese eines Einzelpolypeptidkettenserinproteaseinhibitors zu dirigieren, der mindestens eine aktive Stelle hat, die Serinproteaseinhibitoraktivität aufweist, wobei das genannte Protein wesentliche Homologien zu dem nativen Serinproteaseinhibitor aufweist, der aus Ohrspeicheldrüsensekreten isoliert wurde.
4. 4. Verfahren nach Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte synthetische DNA-Sequenz ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus -

   1) 5' AGCGG TAAAA GCTTC AAAGC TGGCG TATGC CCGCC GAAAA AATCC GCGCA GTGTC TGCGG TACAA AAAAC CGGAA TGCCA GTCCG ACTGG CAGTG CCCGG GTAAA AAACG TTGTT GCCCG GACAC CTGCG GCATC AAATG CCTGG ATCCG GTTGA TACCC CGAAC CCGAC TCGTC GAAAA CCGGG TAAAT GCCCG GTAAC CTATG GCCAG TGTCT GATGC TGAAC CCGCC GAACT TCTGC GAAAT GGACG GCCAG TGTAA ACGAG ATCTG AAATG CTGTA TGGGT ATGTG CGGCA AATCT TGTGT TTCCC CGGTA AAAGC ATAA 3'

   oder 2) genetisch äquivalenten Sequenzen, die für die Herstellung desselben Proteins codieren.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die im Verfahrensschritt a) zur Verfügung gestellte DNA-Sequenz eine natürliche DNA-Sequenz ist.
6. 6. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte natürliche DNA-Sequenz durch ein Verfahren erhältlich ist, das die folgenden Verfahrensschritte enthält:

   a) Herstellen einer menschlichen cDNA- Bibliothek aus Zellen, die in der Lage sind, einen Serinproteaseinhibitor zu produzieren;

   b) Testen der menschlichen DNA-Bibliothek mit mindestens einer als Sonde geeigneten Substanz, die fähig ist, an das Proteaseinhibitorgen

   oder dessen Proteinprodukt zu binden;

   c) Identifizieren von mindestens einem Klon, der das Gen enthält, das für den Inhibitor codiert, durch die Fähigkeit des Klons, zumindest an eine Sonde für das Gen oder desen Proteinprodukt zu binden;

   d) Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert aus dem identifizierten Klon oder den identifizierten Klonen; und

   e) Verbinden des Gens oder geeigneter Fragmente des Gens mit Operonelementen, die nötig sind, um die Gene in einem Wirtsmikroorganismus zu erhalten und zu exprimieren.
7. 7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei den Zellen um menschliche Ohrspeicheldrüsenzellen handelt.
8. 8. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte natürliche DNA-Sequenz erhältlich ist durch ein Verfahren, das die folgenden Schritte enthält:

   a) Herstellen einer menschlichen Genom-DNA-Bibliothek;

   b) Testen der menschlichen Genom-DNA-Bibliothek mit mindestens einer als Sonde geeigneten Substanz, die fähig ist, an ein Serinproteaseinhibitorgen oder dessen Proteinprodukt zu binden;

   c) Identifizieren von mindestens einem Klon, der das Gen enthält, das für den Inhibitor codiert durch die Fähigkeit des Klons, an mindestens eine Sonde für das Gen oder dessen Proteinprodukt zu binden;

   d) Isolieren des Gens, das für den Inhibitor codiert aus dem identifizierten Klon oder den identifizierten Klonen; und

   e) Verbinden des Gens oder geeigneter Fragmente des Gens mit Operonelementen, die nötig sind, um das Gen in einem Wirtsmikroorganismus zu erhalten und zu exprimieren.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das genannte Verfahren weiterhin die Reinigung des Inhibitors aufweist.
10. 10. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte Reinigung durchgeführt wird, ehe dem Inhibitor erlaubt wird, eine aktive Form anzunehmen.
11. 11. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Reinigung durchgeführt wird, nachdem man dem Inhibitor erlaubt hat, eine aktive Form anzunehmen.
12. 12. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der genannte Vektor aus Teilen von Vektoren konstruiert wird, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus pBR322 und pIQ.
13. 13. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der genannte Wirtsmikroorganismus ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus den Mikroorganismen der Gattungen Escherichia, Bacillus und Saccharomyces.
14. 14. Verfahren nach Punkt 13, gekennzeichnet dadurch, daß der genannte Wirtsmikroorganismus Escherichia coli ist.
15. 19. Verfahren nach Punkt 13, gekennzeichnet dadurch, daß der genannte Wirtsmikroorganismus Saccharomyces cerevisiae ist.

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