JPH0819395A - 抗菌性ポリペプチドをコードするｄｎａ断片及び抗菌性ポリペプチドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ロイヤルゼリーに含有されている抗菌性ポリ
ペプチドをコードするする新規な塩基配列を有する組換
えプラスミドでエシェリキア属に属する微生物を形質転
換し、この形質転換株を培養し、培地または菌体から抗
菌性ポリペプチドを採取する。 【効果】 ロイヤルゼリーに含有されている抗菌性ポリ
ペプチドを産生するエシェリキア属に属する微生物を作
出することができ、抗菌活性を有するポリペプチドを大
量、かつ安価に製造し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗菌性ポリペプチドを
コードするＤＮＡ断片及びこれを用いた抗菌性ポリペプ
チドの製造法に関し、詳しくは、ロイヤルゼリーに含有
されている抗菌性ポリペプチドをコードする新規なＤＮ
Ａ断片、このＤＮＡ断片を有する組換えプラスミドによ
り形質転換されたエシェリキア(Escherichia) 属に属す
る微生物及び該微生物を用いた前記抗菌性ポリペプチド
の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らが発見したロイヤルゼリー中
に含まれる分子量約５５００ダルトンの抗菌性ポリペプ
チド（特開平２−２６８１９８号公報）は、５１個のア
ミノ酸残基からなり３か所のジスルフィド結合を有し、
グラム陽性菌、特に乳酸菌、ビフィズス菌、ブドウ球菌
等に対して強い増殖阻害作用を示す。ロイヤルゼリーは
蜜蜂の咽頭腺から分泌される黄色を帯びた乳白色のゲル
状の物質であり、ロイヤルゼリーを摂取した幼虫のみが
女王蜂として生殖に関与するため、その効果に滋養強壮
作用を期待して食品等に利用されている。ロイヤルゼリ
ーから抽出される天然の抗菌性ポリペプチドは、安全性
が高く、食品の防腐剤としてはもとより、医薬品の抗菌
剤としての利用が大いに期待されている物質である。

【０００３】しかしながら、従来報告されている上記抗
菌性ポリペプチド（以下、単に「抗菌性ポリペプチド」
と記す）の製造方法は、微量にしか存在せず、かつ高価
なロイヤルゼリーから抽出する［ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological C
hemistry) ，第２６５巻，第１１３３３〜１１３３７ペ
ージ，１９９０年］というものであり、抗菌性ポリペプ
チドを、大量に、しかも安価に供給できるものではなか
った。したがって、この方法によっては、抗菌性ポリペ
プチドを食品、医薬品等へ応用することは実用上不可能
であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記従来技
術に鑑みてなされたものであり、抗菌性ポリペプチドを
大量、かつ安価に供給するために、抗菌性ポリペプチド
をコードする新規なＤＮＡ断片を提供すること、抗菌性
ポリペプチドを産生するエシェリキア属に属する微生物
を提供すること、及び抗菌性ポリペプチドの工業的規模
の製造方法を提供することを課題としている。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決するために鋭意研究を行った結果、抗菌性ポリペ
プチドを産生し得るエシェリキア属に属する微生物を遺
伝子工学的な手法により創出し、抗菌性ポリペプチドを
大量、かつ安価に生産する方法を見い出し、本発明を完
成した。

【０００６】前記課題を解決する本願の第１の発明は、
配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列を有する抗
菌性ポリペプチドをコードする新規なＤＮＡ断片であ
り、そのヌクレオチド配列が、配列表の配列番号２に記
載の配列を有することを望ましい態様としている。

【０００７】前記課題を解決する本願の第２の発明は、
前記ＤＮＡ断片を有する組換えプラスミドにより形質転
換されたエシェリキア属に属する微生物であり、組換え
プラスミドが、ｐＥＫＯ３１、ｐＥＫＯ３２又はｐＥＫ
Ｏ３４であること及びエシェリキア属に属する微生物
が、ＭＯ９４０１、ＭＯ９４０２、ＭＯ９４０３又はＭ
Ｏ９４０４であることを望ましい態様としている。

【０００８】前記課題を解決する本願の第３の発明は、
前記ＤＮＡ断片を有する組換えプラスミドにより形質転
換されたエシェリキア属に属する微生物を好適な培地で
培養し、この培地又は微生物菌体から抗菌性ポリペプチ
ドを採取することを特徴とする抗菌性ポリペプチドの製
造法であり、組換えプラスミドが、ｐＥＫＯ３１、ｐＥ
ＫＯ３２又はｐＥＫＯ３４であること、及びエシェリキ
ア属に属する微生物が、ＭＯ９４０１、ＭＯ９４０２、
ＭＯ９４０３又はＭＯ９４０４であることを望ましい態
様としている。

【０００９】尚、本明細書において、抗菌性ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片、この５’末端に開始コドン
及び両端に制限酵素認識配列が連結されたもの、さらに
はこの上流に配置されたプロモーターを含めて、単に
「抗菌性ポリペプチド遺伝子」ということがある。

【００１０】次に本発明について詳述する。

【００１１】＜１＞本発明のＤＮＡ断片及び微生物 エシェリキア属に属する微生物に抗菌性ポリペプチド産
生能を付与するために、本発明においては、抗菌性ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ断片を化学合成し、これを
エシェリキア属に属する微生物に導入した。

【００１２】公知である抗菌性ポリペプチドのアミノ酸
配列（配列表配列番号１）から推定される抗菌性ポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列は、理論的には１
０²⁴通り存在する。本発明者らは、次の点を考慮して、
抗菌性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にお
けるコドン使用等を検討し、抗菌性ポリペプチド遺伝子
を化学的に合成した。

【００１３】１）抗菌性ポリペプチド遺伝子をエシェリ
キア属に属する微生物に導入した際に、 効率の良い
発現を計るため、大腸菌のｔＲＮＡ存在量の高いコドン
（最適コ ドン）を選択したこと。 ２）転写の終結を確実にするため終止コドンを２個とし
たこと。 ３）抗菌性ポリペプチド遺伝子の転写が起こる際に、転
写阻害を惹起する可能性のあるステム−ループ構造を転
写産物が形成しない配列としたこと。 ４）エシェリキア属に属する微生物の翻訳開始コドンで
あるメチオニンのコドン（ＡＴＧ）を抗菌性ポリペプチ
ド遺伝子の先頭に付加したこと ５）抗菌性ポリペプチド遺伝子とペクターとの組換えプ
ラスミドを作製する際の、 ロイヤリシン遺伝子のベ
クターへの挿入部位として、５’側にＥｃｏＲＩ（ＧＡ
ＡＴＴＣ）及びＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）、３’側にＢ
ａｍＨＩ（Ｇ ＧＡＴＣＣ）認識配列を付加したこ
と。

【００１４】上記１）〜５）を考慮し、配列番号１に示
すアミノ酸配列に基づいて、ＤＮＡ合成機（アプライド
バイオシステムズ社製。３９４）を用いて一本鎖ＤＮＡ
を合成する。そのヌクレオチド配列は、配列表の配列番
号２に示すとおりである。次に、常法、例えば，アニー
リング及びライゲーション［モレキュラー・クローニン
グ(Molecular Cloning) 、第３巻、第２版、コールド・
スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press) 、１９８９年］により
２本鎖ＤＮＡを調製する。尚、配列番号２に示したヌク
レオチド配列は、１例を示したものであり、上記思想を
利用し、これと異なるヌクレオチド配列を有する抗菌性
ポリペプチド遺伝子を取得することは当業者にとって容
易である。そのような抗菌性ポリペプチド遺伝子も、ま
た本発明のＤＮＡ配列に含まれる。また、抗菌性ポリペ
プチド遺伝子の両端に付加した制限酵素認識配列は、本
発明に必須なものではない。

【００１５】本発明のエシェリキア属に属する微生物
は、上記の抗菌性ポリペプチド遺伝子が細胞内に導入さ
れて形質転換されることにより得られる。エシェリキア
属に属する微生物としては、大腸菌（エシェリキア・コ
リ (Escherichia coli)）等が挙げられる。抗菌性ポリ
ペプチド遺伝子のエシェリキア属に属する微生物細胞内
への導入は、その細胞内で抗菌性ポリペプチド遺伝子が
安定、かつ発現可能な形で導入される限り、方法は問わ
ない。例えば、抗菌性ポリペプチド遺伝子を有する組換
えプラスミドにより形質転換する方法、相同組換えによ
って、又はファージベクターもしくはトランスポゾン等
を用いて抗菌性ポリペプチド遺伝子を染色体ＤＮＡに組
み込む方法等が挙げられる。

【００１６】組換えプラスミドにより形質転換する場合
には、次の特徴を有するプラスミドが好ましい。

【００１７】ａ）エシェリキア属に属する微生物で機能
できるプロモーター、リボソーム結合部位を含む配列、 ｂ）エシェリキア属に属する微生物細胞内で自律複製す
るための複製オリジン、 ｃ）選択マーカー遺伝子、 ｄ）前記プロモーター、リボソーム結合部位を含む配列
に機能的に連結された配列番号１に記載したアミノ酸配
列の抗菌性ポリペプチドをコードするＤＮＡ。

【００１８】上記ａ）、ｂ）及びｃ）を有するプラスミ
ドとしては、市販されている公知のプラスミド［例え
ば、市販の大腸菌発現ベクターｐＫＫ２２３−３（ファ
ルマシア社製）、ｐＥＴ３ｄ（ノバゲン社製）等を例示
することができる］等を利用することもでき、また、こ
れらから常法、例えば、制限酵素の切断及びライゲース
による連結［モレキュラー・クローニング(Molecular C
loning) 、第３巻、第２版、コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor La
boratory Press) 、１９８９年 参照］により誘導され
た各種プラスミドを利用することもできる。抗菌性ポリ
ペプチドをコードする構造遺伝子ｄ）としては、配列表
の配列番号１に記載されたアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡであれば、あらゆる組合せの塩基配列のＤＮＡを利
用することができるが、特に配列表の配列番号２に示し
た塩基配列が、上記１）〜５）を考慮している点で望ま
しい。

【００１９】本発明による抗菌性ポリペプチドは、常
法、例えば、制限酵素の切断及びライゲースによる連結
［モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning) 、
第３巻、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory P
ress) 、１９８９年］により、少なくとも前記ａ）、
ｂ）、ｃ）及びｄ）を含み、これらが機能的に連結され
てなる組換えプラスミドを構築し、この組換えプラスミ
ドを用いて、通常、公知、かつ容易に入手し得るエシェ
リキア属に属する微生物［例えば、市販の大腸菌ＪＭ１
０９株（宝酒造社製）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノ
バゲン社製）等を例示することができる］を宿主とし、
この宿主を形質転換することにより形質転換体を得、プ
ラスミド上の抗菌性ポリペプチド遺伝子を発現させるこ
とにより製造される。

【００２０】その一例を示せば次のとおりである。本発
明の抗菌性ポリペプチド発現ベクターの一例であるｐＥ
ＫＯ３２は、図１に示すとおりである。図１においてＰ
Ｔ７、antibacterial peptide、５Ｓ、ｒｒｎＢ、Ａｍ
ｐ及びＯｒｉは、それぞれＴ７ファージプロモーター、
抗菌性ポリペプチド合成遺伝子、５ＳリボソームＲＮＡ
遺伝子の断片、５ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の転写終了
シグナル、アンピシリン耐性遺伝子及び複製起点を示
す。

【００２１】抗菌性ポリペプチド発現ベクターは、例え
ば図２の系統図に示すようにして調製することができ
る。即ち、該発現ベクターｐＥＫＯ３２は、ｐＥＫＯ３
０由来の抗菌性ポリペプチドをコードする合成ＤＮＡ、
ｐＥＴ３ｄ（ノバゲン社製）から由来するＴ７ファージ
プロモーター、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社製）
から由来する転写終了シグナル、ｐＧＥＭＥＸ−２（プ
ロメガ社製）から由来するアンピシリン耐性遺伝子及び
複製起点を常法、例えば、制限酵素の切断及びライゲー
スによる連結［モレキュラー・クローニング(Molecular
Cloning) 、第３巻、第２版、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor
Laboratory Press)、１９８９年］を行い、図１の制限
地図で示される機能的な構造となるように連結して組込
み、約２．７ｋｂｐのプラスミドとして調製することが
できる。

【００２２】この発現ベクターを用いて、Ｔ７ポリメラ
ーゼを保持する宿主、例えば、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ
３）株［ノバゲン社製］を、ハナハン(Hanahan) の形質
転換法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジ
ー(Journal of Molecular Biology)、第１６６巻、第５
５７〜５８０ページ、１９８３年］等によって形質転換
することにより、抗菌性ポリペプチドを発現する大腸菌
を作出することができる。

【００２３】尚、配列表の配列番号２に示したヌクレオ
チド配列及び本明細書の記載をもとに、抗菌性ポリペプ
チド遺伝子を合成し、抗菌性ポリペプチド発現型プラス
ミドを構築し、抗菌性ポリペプチドを発現する微生物を
作出することは、いわゆる当業者にとって容易である。

【００２４】＜２＞本発明の抗菌性ポリペプチドの製造
法。 前記のようにして得られた本発明のエシェリキア属に属
する微生物を好適な培地で培養し、この培地又は微生物
菌体から抗菌性ポリペプチドを採取する。抗菌性ポリペ
プチドを直接発現させた場合は、抗菌性ポリペプチドは
顆粒体として菌体内に蓄積されるので、エシェリキア属
に属する微生物の菌体から抗菌性ポリペプチドを採取す
る。また、抗菌性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
の５’末端に分泌シグナルを連結し、これを用いて抗菌
性ポリペプチドを分泌発現させた場合は、培地から抗菌
性ポリペプチドを採取する。

【００２５】該微生物の培養は、大腸菌を培養する通常
の培地を使用することができるが、組換えプラスミドが
保持するマーカー遺伝子に対応した薬剤を含むことが好
ましい。後記実施例で得られた抗菌性ポリペプチド産生
微生物ＭＯ９４０１、ＭＯ９４０２及びＭＯ９４０３の
培養においては、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
有する２×ＹＴ培地［１. ６％（重量。以下濃度につい
て、特に断りのない限り同じ）バクトトリプトン、１.
０％酵母エキス及び０. ５％食塩からなる。モレキュラ
ー・クローニング(Molecular Cloning) 、第３巻、第２
版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス(Cold Spring Harbor LaboratoryPress) 、１９
８９年］が特に好ましい。

【００２６】前培養した菌体懸濁液を、培地に添加して
培養し、対数増殖後期に１ｍＭの濃度でイソプロピルチ
オ−β−Ｄ−ガラクトシドを培養液に添加し、更に約５
時間培養し、抗菌性ポリペプチドを産生させる。次いで
培養液から遠心分離等により菌体を回収し、洗浄し、菌
体を破砕し、遠心分離等により顆粒体を回収する。

【００２７】回収した顆粒体に、尿素及びエチレンジア
ミン四酢酸を添加して攪拌し、顆粒体を可溶化し、遠心
分離して上清を得る。得られた上清を２段階の透析法に
より尿素を除去することによって抗菌性ポリペプチドを
リフォールディングさせ、遠心分離して不溶物を除去し
た後、上清を逆相高速液体クロマトグラフィーで精製す
ることにより、ほぼ純粋な抗菌活性のある抗菌性ポリペ
プチドを得ることができる。

【００２８】＜３＞試験例 次に試験例を示して本発明を詳述する。 （試験例１）この試験は、合成ＤＮＡのヌクレオチド配
列を確認するために行った。

【００２９】実施例２と同一の方法により得た抗菌性ポ
リペプチド遺伝子を挿入したｐＥＫＯ３０のヌクレオチ
ド配列を、ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシス
テムズ社製。３７３Ａ）及びダイ・プライマー・シーケ
ンシング・キット(Dye Primer Sequencing Kit) （アプ
ライドバイオシステムズ社製）を用いて決定した結果、
配列表の配列番号２に示したＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴ
Ｃ）部位からＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）部位までのヌ
クオレチド配列と一致していた。

【００３０】（試験例２）この試験は、本発明の方法に
より製造された抗菌性ポリペプチドのアミノ酸配列を確
認するために行った。

【００３１】後記実施例５と同一の方法により得た抗菌
性ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列を、ペプチドシー
ケンサー（アプライドバイオシステムズ社製。４７３
Ａ）を用い、エドマン分解後に得られるＰＴＨ（フェニ
ールチオヒダントイン）アミノ酸を分析することによっ
て決定した。

【００３２】その結果、配列表の配列番号３に示すよう
に、大部分がＮ末端（１残基目）にメチオニン残基が付
加されていたが、それ以降の９残基までは公知の抗菌性
ポリペプチドのアミノ酸配列と一致していた。尚、実施
例６、７及び９に示した方法により製造した抗菌性ポリ
ペプチドについても同様に試験を行ったが、ほぼ同様の
結果が得られた。

【００３３】（試験例３）この試験は、本発明の方法に
より得られた抗菌性ポリペプチドの抗菌活性を調べるた
めに行った。

【００３４】１％ラクトースを含むＧＡＭ培地（日水製
薬社製）に、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifido
bacterium longum) ＡＴＣＣ１５７０７及び表１に示す
濃度の抗菌性ポリペプチド（実施例５と同一の方法によ
り得た）を添加し、３７℃で１８時間培養した。培養液
の６６０ｎｍでの吸光度（OD₆₆₀）の測定から次の計算
式で増殖率を算出し、抗菌活性を試験した。

【００３５】増殖率（％）＝（サンプルのOD₆₆₀／コン
トロールのOD₆₆₀）×１００ この試験結果を、天然の抗菌性ポリペプチド（特開平２
−２６８１９８号公報の実施例１と同一の方法により得
た）と比較して表１に示した。

【００３６】

【表１】

【００３７】表１から明らかなように、本発明の方法に
より製造された抗菌性ポリペプチド（組換え型）は、天
然型に比して同一濃度において増殖率が高く、すなわち
抗菌活性が低いことが認められた。しかしながら、本発
明の抗菌性ポリペプチドの製造法によれば、大量生産が
可能であり、かつ安価であることから、十分に産業的利
用価値があることが判明した。尚、実施例６、７及び９
に示した方法により製造した抗菌性ポリペプチドについ
ても同様に試験を行ったが、ほぼ同様の結果が得られ
た。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を示して本発明を更に具体的に
説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるもので
はない。

【００３９】

【実施例１】抗菌性ポリペプチド遺伝子及びそれを有す
るプラスミドの構築 抗菌性ポリペプチド遺伝子の作製 抗菌性ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側
に、開始コドン（ＡＴＧ）、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＧＡ
ＡＴＴＣ）及び制限酵素ＮｃｏＩ（ＣＣＡＴＧＧ）認識
配列を、更に３’側に終止コドン（ＴＧＡ及びＴＡＧ）
及び制限酵素ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＣＣ）認識配列を付
加し、配列表の配列番号２に示したヌクレオチド配列を
有するＤＮＡを、次のようにして合成した。

【００４０】６種のオリゴヌクレオチド（Ｎ１〜Ｎ６：
配列をそれぞれ順に配列表の配列番号４〜９に示す）を
ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社製。３９
４）を用いて合成した。次に、これら６種のオリゴヌク
レオチドを脱保護し、１０％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により各オリゴヌクレオチドを精製した。そのう
ち４種のオリゴヌクレオチド（Ｎ２、Ｎ３、Ｎ５及びＮ
６）をリン酸化し、６種のオリゴヌクレオチドを混合
し、常法によりアニーリング及びライゲーション［モレ
キュラー・クローニング(Molecular Cloning) 、第３
巻、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラ
トリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s) 、１９８９年］を行い、配列番号２に示した塩基配
列の２本鎖ＤＮＡ、即ち、抗菌性ポリペプチド遺伝子を
調製した。二本鎖抗菌性ポリペプチド遺伝子における上
記６種のオリゴヌクレオチドの位置を図４に示す。

【００４１】抗菌性ポリペプチド遺伝子を有するプラ
スミドｐＥＫＯ３０の構築 合成したＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ
（いずれも東洋紡（株）製）で切断し、ｐＨＳＧ３９９
（宝酒造（株）製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ
Ｉで切断した断片に連結し、得られたプラスミドをｐＥ
ＫＯ３０と命名した。

【００４２】

【実施例２】 抗菌性ポリペプチド発現プラスミドｐＥ
ＫＯ３１及びこれを保持した抗菌性ポリペプチド発現大
腸菌の作出 実施例１で得られた抗菌性ポリペプチド遺伝子を有する
プラスミドｐＥＫＯ３０を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍ
ＨＩ（いずれも東洋紡社製）で切断し、抗菌性ポリペプ
チド遺伝子を含む断片を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨ
Ｉで切断したｐＥＴ３ｄ（ノバゲン社製）に連結し、得
られたプラスミドをｐＥＫＯ３１と命名した。ｐＥＴ３
ｄは、ＮｃｏＩ部位の上流にＴ７プロモーターを有して
おり、挿入された抗菌性ポリペプチドはＴ７プロモータ
ーの制御下で発現することができる。

【００４３】得られた抗菌性ポリペプチド発現ベクター
ｐＥＫＯ３１を用いてハナハン(Hanahan) の形質転換法
［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Jou
rnalof Molecular Biology)、第１６６巻、第５５７〜
５８０ページ、１９８３年］により大腸菌ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）株（ノバゲン社製）を形質転換し、抗菌性ポリペ
プチド発現大腸菌（ＭＯ９４０１）を作出した。

【００４４】大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、ｌａｃＵ
Ｖ５プロモーターの下流に連結したＴ７ファージのＲＮ
Ａポリメラーゼ遺伝子がλファージＤＮＡ上にクローニ
ングされて得られたＤＥ３が、大腸菌宿主であるＢＬ２
１株に溶源化した株である。したがって、ＭＯ９４０１
では、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドの添加
によりｌａｃＵＶ５プロモーターによる転写が誘導され
てＴ７ファージのＲＮＡポリメラーゼが生成し、さらに
Ｔ７プロモーターによる転写が起こる。宿主大腸菌には
Ｔ７プロモーターは存在しないので、結果として抗菌性
ポリペプチドのみが効率よく発現する。上記機構による
イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシドによるＴ７プ
ロモーターの誘導は、後述のＭＯ９４０２、ＭＯ９４０
３、ＭＯ９４０４においても同様である。

【００４５】

【実施例３】 抗菌性ポリペプチド発現プラスミドｐＥ
ＫＯ３２及びこれを保持した抗菌性ポリペプチド発現大
腸菌の作出（Ｉ） 図１に、抗菌性ポリペプチド発現ベクターの一例を示
す。ｐＥＫＯ３１をＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで、ｐＫ
Ｋ２２３−３（ファルマシア社製）をＢａｍＨＩ及びＳ
ｃａＩで、ｐＧＥＭＥＸ−２（プロメガ社製）をＢｇｌ
ＩＩ及びＳｃａＩでそれぞれ切断し、得られたそれぞれ
の断片を連結し、図１に示したｐＥＫＯ３２を得た。
尚、ｐＫＫ２２３−３のＢａｍＨＩ−ＳｃａＩ断片には
５Ｓリポゾーム遺伝子の断片及び転写終了シグナルが含
まれており、抗菌性ポリペプチド遺伝子の転写を効率よ
く終了させることができる。

【００４６】得られた抗菌性ポリペプチド発現ベクター
ｐＥＫＯ３２を用いて、ハナハン(Hanahan) の形質転換
法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J
ournal of Molecular Biology)、第１６６巻、第５５７
〜５８０ページ、１９８３年］により大腸菌ＢＬ２１
（ＤＥ３）株（ノバゲン社製）を形質転換し、抗菌性ポ
リペプチド発現大腸菌（ＭＯ９４０２）を作出した。

【００４７】

【実施例４】 ｐＥＫＯ３２を保持した抗菌性ポリペプ
チド発現大腸菌の作出（II） 大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバゲン社製）を大腸菌
ＪＭ１０９（ＤＥ３）株（プロメガ社製）に代えたこと
を除き、と同一の方法により抗菌性ポリペプチド発現
大腸菌（ＭＯ９４０３）を作出した。

【００４８】

【実施例５】 抗菌性ポリペプチドの製造 抗菌性ポリペプチド発現大腸菌の培養 実施例２と同一の方法により作出した抗菌性ポリペプチ
ド発現大腸菌（ＭＯ９４０１）を、２００μｇ／ｍｌの
割合でアンピシリンを含む前記２×ＹＴ培地（１. ６％
バクトトリプトン、１. ０％酵母エキス及び０. ５％塩
化ナトリウムを含む）で前培養し、この前培養液を同一
組成の培地２Ｌに１％（容量）の割合で添加し、３Ｌの
培養槽で通気しながら培養し、対数増殖後期（OD₆₆₀＝
０. ６〜０. ８）に達した段階で、１ｍＭの濃度でイソ
プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（宝酒造（株）
製）を添加し、更に５時間培養した。

【００４９】顆粒体の調製 で得られた培養液を遠心分離して菌体を回収し、この
菌体を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８. ０）に懸
濁し、菌体破砕装置ミニラボ（レイニー社製）を用いて
細胞を破砕し、再度遠心分離し、顆粒体を含む沈澱を回
収し、前記と同一の緩衝液に顆粒体を懸濁した。

【００５０】顆粒体の可溶化 で得られた顆粒体に、尿素、ＥＤＴＡ（エチレンジア
ミン四酢酸）を各々８Ｍ及び１０ｍＭの最終濃度で加
え、更に脱イオン水を加え、最終液量を２０ｍｌに調整
し、室温で２時間撹拌して顆粒体を還元し、可溶化し、
顆粒体溶液を超遠心（１００，０００×ｇで３０分間）
して上清を得た。

【００５１】抗菌性ポリペプチドのリフォールディン
グ で得られた上清を、４Ｍ尿素、１ｍＭ ＥＤＴＡを含
む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）で一夜透析し
た。次いで１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．０）で透
析し、さらに１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で透
析することによって、変性した抗菌性ポリペプチドのリ
フォールディングを行い、透析液を超遠心し（１００，
０００×ｇで３０分間）、不溶物を除去した。

【００５２】逆相ＨＰＬＣによる抗菌性ポリペプチド
の精製 で得られた上清に含まれる抗菌性ポリペプチドを、Ｃ
ｏｓｍｏｓｉｌカラム５Ｃ４−３００（サイズ１０×２
５０ｍｍ；ナカライテスク社製）を使用して、逆相高速
液体クロマトグラフィーにより精製した。溶出溶媒は、
溶媒Ａ：０. １％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：０. １％ＴＦＡ／９
０％（容量）アセトニトリルを使用し、溶媒Ａ及び溶媒
Ｂの混合液によるアセトニトリルの濃度勾配により溶出
を行った。流速は、１ｍｌ／分、抗菌性ポリペプチド検
出は２８０ｎｍの吸収（Ａ280）を測定することにより
行った。アセトニトリルの濃度勾配は、０分；０％溶媒
Ｂ、１０分；３３％溶媒Ｂ、２０分；３３％溶媒Ｂ、４
０分；３６％溶媒Ｂとなるように、溶媒Ａ及び溶媒Ｂの
混合割合を変化させた。

【００５３】この結果は、図３に示すとおりである。図
３において横軸は保持時間、左縦軸及び右縦軸は、それ
ぞれ２８０ｎｍにおける吸光度及びアセトニトリルの濃
度を示し、破線はアセトニトリルの濃度の変化を示す。
溶出画分の抗菌活性を前記試験例３の方法によって測定
した結果、溶出時間２９〜３２分（２９〜３２ｍｌ）の
画分が、抗菌性ポリペプチドを含むことがわかったの
で、この画分を採取し、凍結乾燥し、抗菌性ポリペプチ
ドを約２０ｍｇ得た。

【００５４】

【実施例６】実施例３で作出した抗菌性ポリペプチド発
現大腸菌（ＭＯ９４０２）を用いたことを除き、実施例
５と同一の方法により、約６０ｍｇの抗菌性ポリペプチ
ドを得た。

【００５５】

【実施例７】実施例４で作出した抗菌性ポリペプチド発
現大腸菌（ＭＯ９４０３）を用いたことを除き、実施例
５と同一の方法により、約３０ｍｇの抗菌性ポリペプチ
ドを得た。

【００５６】

【実施例８】 抗菌性ポリペプチド分泌発現プラスミド
及びこれを保持した大腸菌の作出 実施例１と同一の方法により得たｐＥＫＯ３０を、制限
酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ（いずれも東洋紡社製）で
切断し、得られた断片を制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨ
Ｉ（共に東洋紡社製）で切断した分泌発現ベクターｐＥ
Ｔ２５ｂ（＋）（ノバゲン社製）に連結し、得られたプ
ラスミドをｐＥＫＯ３４と命名した。ｐＥＴ２５ｂ
（＋）は、ＮｃｏＩ部位の上流にＴ７プロモーター及び
Erwinia carotovora由来のPectate lyaseの分泌シグナ
ルをコードする配列を有しており、ＮｃｏＩ部位に挿入
されたＤＮＡ断片がコードするポリペプチドを菌体外に
分泌させることができる。

【００５７】得られた抗菌性ポリペプチド分泌発現ベク
ターｐＥＫＯ３４をハナハン(Hanahan) の形質転換法
［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Jou
rnal of Molecular Biology)、第１６６巻、第５５７〜
５８０ページ、１９８３年］により大腸菌ＢＬ２１（Ｄ
Ｅ３）株（ノバゲン社製）に形質転換し、抗菌性ポリペ
プチド発現大腸菌（ＭＯ９４０４）を作出した。

【００５８】

【実施例９】 抗菌性ポリペプチドの分泌生産 実施例８と同一の方法により作出した抗菌性ポリペプチ
ド発現大腸菌（ＭＯ９４０４）を、２００μｇ／ｍｌの
割合でアンピシリンを含む前記２×ＹＴ培地（１. ６％
バクトトリプトン、１. ０％酵母エキス及び０. ５％塩
化ナトリウムを含む）で前培養し、菌体懸濁液を同一組
成の培地５ｍｌに１％（容量）添加し、１８×１８０ｍ
ｍ試験管で振とう培養し、対数増殖後期（OD₆₆₀＝０．
６〜０．８）に達した段階で、１ｍＭの濃度でイソプロ
ピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（宝酒造社製）を添加
し、更に５時間培養した。培養液を遠心して細胞上清を
得た。得られた上清を、抗菌性ポリペプチドのポリクロ
ーナル抗体を用いて、ドットブロット法［アナリティカ
ル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry) 、
第１１９巻、第１４２〜１４７ページ、１９８２年］に
より抗菌性ポリペプチドの生産を確認した。

【００５９】

【発明の効果】以上詳述したように本発明は、抗菌性ポ
リペプチドをコードする新規な塩基配列、該塩基配列を
有する組換えプラスミドにより形質転換したエシェリキ
ア属に属する微生物、及び該微生物を好適な培地で培養
し、この培地又は微生物菌体から抗菌性ポリペプチドを
採取することを特徴とする抗菌性ポリペプチドの製造法
に係るものであり、本発明によって奏せられる効果は、
次のとおりである。 １）抗菌性ポリペプチドを効率的に発現しうるＤＮＡ断
片が得られる。 ２）抗菌性ポリペプチドを産生するエシェリキア属に属
する微生物が得られる。 ３）抗菌活性を有する抗菌性ポリペプチドを大量、かつ
安価に製造し得る。

【００６０】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Val Thr Cys Asp Leu Leu Ser Phe Lys Gly Gln Val Asn Asp Ser Ala 1 5 10 15 Cys Ala Ala Asn Cys Leu Ser Leu Gly Lys Ala Gly Gly His Cys Glu 20 25 30 Lys Gly Val Cys Ile Cys Arg Lys Thr Ser Phe Lys Asp Leu Trp Asp 35 40 45 Lys Tyr Phe 50

【００６１】配列番号：２ 配列の長さ：１７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１０．．１７１ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 CGGAATTCC ATG GTT ACT TGC GAT CTG CTG TCT TTC AAA GGC CAG GTA AAC 51 Met Val Thr Cys Asp Leu Leu Ser Phe Lys Gly Gln Val Asn 1 5 10 GAC TCC GCT TGC GCT GCA AAC TGC CTG TCT CTG GGT AAA GCT GGT GGT 99 Asp Ser Ala Cys Ala Ala Asn Cys Leu Ser Leu Gly Lys Ala Gly Gly 15 20 25 30 CAC TGC GAA AAA GGC GTA TGC ATC TGC CGC AAA ACT TCC TTC AAA GAC 147 His Cys Glu Lys Gly Val Cys Ile Cys Arg Lys Thr Ser Phe Lys Asp 35 40 45 CTG TGG GAC AAA TAC TTC TGATAGGGAT CCCG 179 Leu Trp Asp Lys Tyr Phe 50

【００６２】配列番号：３ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【００６３】配列番号：４ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGGAATTCCA TGGTTACTTG CGATCTGCTG TCTTTCAAA 39

【００６４】配列番号：５ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGCCAGGTAA ACGACTCCGC TTGCGCTGCA AACTGCCTGT CTCTGGGTAA AGCTGGTGGT 60 CACTGCGAAA 70

【００６５】配列番号：６ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAGGCGTATG CATCTGCCGC AAAACTTCCT TCAAAGACCT GTGGGACAAA TACTTCTGAT 60 AGGGATCCCG 70

【００６６】配列番号：７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ

【００６７】配列番号：８ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAGGAAGTTT TGCGGCAGAT GCATACGCCT TTTTCGCAGT GACCACCAGC TTTACCCAGA 60 GACAGGCAGT 70

【００６８】配列番号：９ 配列の長さ：７０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTGCAGCGCA AGCGGAGTCG TTTACCTGGC CTTTGAAAGA CAGCAGATCG CAAGTAACCA 60 TGGAATTCCG 70

【００６９】

【図面の簡単な説明】

【図１】 抗菌性ポリペプチド発現ベクターの一例であ
るｐＥＫＯ３２の概略図である。

【図２】 プラスミドｐＥＫＯ３０、ｐＥＫＯ３１、ｐ
ＥＫＯ３２及びｐＥＫＯ３４の構築過程を示す系統図で
ある。

【図３】 抗菌性ポリペプチドの逆相高速液体クロマト
グラフィーによる溶出曲線である。

【図４】 抗菌性ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片
の合成過程を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 田仲 昭子 神奈川県座間市東原５丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 関 玲子 神奈川県座間市東原５丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内 (72)発明者 高津 善太 神奈川県座間市東原５丁目１番83号 森永 乳業株式会社生物科学研究所内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１に記載したアミノ酸
   配列を有する抗菌性ポリペプチドをコードするＤＮＡ断
   片。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号２に記載のヌクレオチ
   ド配列を有する請求項１に記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】 配列表の配列番号１に記載したアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ断片または配列番号２に記載の
   ヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片が細胞内に導入さ
   れて形質転換されたエシェリキア属に属する微生物。
4. 【請求項４】 前記ＤＮＡ断片が、これを有する組換え
   プラスミドにより細胞内に導入された請求項３に記載の
   エシェリキア属に属する微生物。
5. 【請求項５】 前記組換えプラスミドが、ｐＥＫＯ３
   １、ｐＥＫＯ３２又はｐＥＫＯ３４である請求項４に記
   載の微生物。
6. 【請求項６】 エシェリキア属に属する微生物が、ＭＯ
   ９４０１、ＭＯ９４０２、ＭＯ９４０３又はＭＯ９４０
   ４である請求項５に記載の微生物。
7. 【請求項７】 配列表の配列番号１に記載したアミノ酸
   配列をコードするＤＮＡ断片または配列番号２に記載の
   ヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片が細胞内に導入さ
   れて形質転換されたエシェリキア属に属する微生物を好
   適な培地で培養し、この培地又は微生物菌体から抗菌性
   ポリペプチドを採取することを特徴とする抗菌性ポリペ
   プチドの製造法。
8. 【請求項８】 前記ＤＮＡ断片が、これを有する組換え
   プラスミドにより細胞内に導入されたことを特徴とする
   請求項７に記載の抗菌性ポリペプチドの製造法。
9. 【請求項９】 前記組換えプラスミドが、ｐＥＫＯ３
   １、ｐＥＫＯ３２又はｐＥＫＯ３４である請求項８に記
   載の抗菌性ポリペプチドの製造法。
10. 【請求項１０】 エシェリキア属に属する微生物が、Ｍ
    Ｏ９４０１、ＭＯ９４０２、ＭＯ９４０３又はＭＯ９４
    ０４である請求項９に記載の抗菌性ポリペプチドの製造
    法。