DE3177288T2

DE3177288T2 - Reife menschliche leukozyten-interferone, verfahren zu ihrer bacteriellen herstellung, zwischenprodukte hierfuer und zusammensetzungen diese enthaltend.

Info

Publication number: DE3177288T2
Application number: DE8686105365T
Authority: DE
Inventors: David Van Norman Goeddel; Sidney Pestka
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Genentech Inc
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Genentech Inc
Priority date: 1980-07-01
Filing date: 1981-06-30
Publication date: 1992-12-10
Anticipated expiration: 2001-07-01
Also published as: NL8103151A; PH18036A; IE49255B1; HK49285A; DD210305A5; AT380272B; NO159392B; EP0211148A1; FR2486098A1; DE3177288T3; GEP19960519B; DE3176448D1; KE3534A; NO812247L; FI82712C; BR8104189A; GR75714B; DD210304A5; AU7246281A; DD202307A5

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNA- Technologie, d.h. Verfahren, die bei der rekombinanten DNA-Technologie verwendet werden und Produkte, die mit diesen Verfahren erhalten werden.
Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung reife menschliche, bakteriell hergestellte Leukozyteninterferone, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus 165-166 Aminosäuren bestehen und Cys-Asp-Leu oder Cys-Asn-Leu an den Stellen 1,2 und 3 enthalten und derartige reife Leukozyteninterferone mit einem zusätzlichen Methioninrest am Aminoende, diese enthaltende pharmazeutische Präparate und ein Verfahren zu deren Herstellung, das darin besteht, dass man eine Kultur eines Bakteriums, das mit einem zur Expression solcher Polypeptide befähigten, replikablen Expressionsvehikel transformiert ist, aufwachsen und besagte Polypeptide exprimieren lässt. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Expressionsvehikel, die in diesem Verfahren verwendet werden und die neuen Bakterien, die diese Expressionsvehikel enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung. Schliesslich betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die Sequenzen enthalten, die die Aminosäuresequenz eines reifen menschlichen Leukozyteninterferons kodieren.

Hintergrund der Erfindung

Human-Leukozyten-Interferon (LeIF) wurde zuerst von Isaacs and Lindenmann (Proc. R. Soc. B 147, 258-267 [1957]; U.S.P. 3.699.222) entdeckt und in Form der rohen Präzipitate hergestellt. Die seit dieser Zeit andauernden Anstrengungen, das Material zu reinigen und zu charakterisieren, haben zur Herstellung relativ homogener Leukozyteninterferone aus normalen Leukozyten oder aus Leukozyten von leukämischen Spendern geführt (Deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2.947.134). Diese Interferone gehören zu einer Familie von Proteinen, die die bekannte Eigenschaft besitzen, ihren Zielzellen einen Virus-resistenten Zustand zu verleihen. Darüberhinaus kann Interferon die Zell-Proliferation hemmen und die Immunantwort modulieren. Diese Eigenschaften haben dazu geführt, dass Leukozyteninterferon klinisch als therapeutisches Mittel zur Behandlung viraler Infektionen und Krankheiten eingesetzt wurde.
In der Vergangenheit wurden Leukozyteninterferone im wesentlichen bis zur Homogenität gereinigt (Rubinstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 640-644 [1979]; Zoon et al., ibid. 76, 5601-5605 [1979]) und die berichteten Molekulargewichte liegen im Bereich von etwa 17,500 bis etwa 21,000. Die spezifische Aktivität dieser Präparate ist bemerkenswert hoch mit 2 x 10&sup8; bis 1 x 10&sup9; Einheiten pro mg Protein, aber die aus den Zellkulturen erhaltenen Ausbeuten sind bisher entmutigend niedrig. Trotzdem gelang durch verfeinerte Proteinsequenzierungsmethoden die Bestimmung von Aminosäurepartialsequenzen (Zoon et al., Science 207, 527 [1980]; Levy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 5102-5104 [1980]). Die Frage der Glykosylierung der verschiedenen Leukozyteninterferone ist bis jetzt noch nicht völlig abgeklärt, aber es ist jetzt klar, dass Unterschiede in den beobachteten Molekulargewichten nicht allein durch Unterschiede in der Glykosylierung zwischen Familienmitgliedern hervorgerufen werden. Statt dessen unterscheiden sich die Leukozyteninterferone deutlich voneinander durch unterschiedliche Aminosäurezusammensetzung und -sequenz und die Aminosäurehomologie ist in manchen Fällen niedriger als 80%.
Während das aus Spender-Leukozyten isolierte homogene Leukozyteninterferon ausreichte zur partiellen Charakterisierung und zu limitierten klinischen Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für breite klinische Prüfungen und die anschliessende prophylaktische und/oder therapeutische Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Human-Leukozyteninterferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit < 1%) und die langen Zeiten, die nötig sind, um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten, noch dazu bei unrealistischem Preisniveau, haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in grösserem Massstab geführt.
Durch rekombinante DNS-Technologie ist es jedoch inzwischen gelungen, eine grosse Anzahl wertvoller Polypeptide kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren inzwischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, dass sie die Herstellung von Polypeptiden wie Somatostatin, den A und B Ketten des Human-Insulins und Human-Wachstumshormon gestatten (Itakura et al., Science 198, 1056- 1063 [1977]; Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979] ). Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin und Thymosin alpha 1, und verschiedene Autoren haben berichtet, dass es ihnen gelungen ist, Human-Leukozyteninterferon kodierende DNA und entsprechende Proteine mit Leukozyten- Interferonaktivität zu erhalten (Nagata et al., Nature 284, 316-320 [1980]; Mantei et al., Gene 10, 1-10 [1980]; Taniguchi et al., Nature 285, 547-549 [1980]).
Das Zugpferd der rekombinanten DNA-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppelsträngiger DNA, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasmid-DNA enthaltene Information umfasst diejenige zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d.h. ein "Replicon") und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Charakteristiken wie, im Fall von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibiotika, die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das interessierende Plasmid enthalten, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, dass sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktionsendonuklease (auch Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endonuklease eine andere Stelle der Plasmid- DNA erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können danach in das Plasmid durch Verknüpfen der Enden an den Spaltstellen oder anschliessend an die Spaltstellen rekonstruierte Enden eingefügt werden. Die DNA-Rekombination wird ausserhalb der Zelle durchgeführt aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch einen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt und grosse Mengen an heterologe Gene enthaltenden, rekombinierten Plasmiden können durch Kultivierung der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise bezüglich derjenigen Teile des Plasmids eingefügt, die für die Transkription und Translation der kodierten DNA-Nachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene Expressionsvehikel zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden, das durch das heterologe Gen kodiert wird. Dieser Prozess wird als Expression bezeichnet.
Die Expression wird ausgelöst in der Promotor-Region, die durch RNA- Polymerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z.B. beim Tryptophan- oder "trp"-Promotor, der in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promotor-Regionen von "Operator"-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Operator. Operatoren sind DNA-Sequenzen, die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren. Die Polymerase wandert an der DNA entlang und überschreibt die Information, die die kodierenden Stränge enthalten, vom 5'- zum 3'-Ende in Boten-RNA, die dann wiederum in ein Polypeptid mit der durch die DNA kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jede Aminosäure wird durch ein Nukleotid-Triplett oder "Codon" innerhalb des sogenannten "Strukturgens" kodiert, d.h. jener Teil, der die Aminosäuresequenz des Expressionsprodukts kodiert. Nach der Bindung an den Promotor transkribiert die RNA-Polymerase zunächst Nukleotide, die eine Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewöhnlich ATG, das in der mRNA zu AUG wird) und schliesslich die Nukleotid Codons im Strukturgen selbst. Am Ende des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weitere mRNA-Sequenzen bilden kann, die aber wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden. Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRNA an, in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstellen kodieren, richtig liegen in Bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Codons mit dem Startsignal in Phase sind. Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lyse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise.
Der vorliegenden Erfindung lag der Gedanke zugrunde, dass die Anwendung der rekombinanten DNA-Technologie (d.h. die Einfügung von Interferongenen in bakterielle Expressionsvehikel und deren Expression unter der Kontrolle bakterieller genregulatorischer Elemente) der wirkungsvollste Weg zur Gewinnung grosser Mengen von reifem Leukozyteninterferon wäre, welches trotz der Tatsache, dass es nicht glykosyliert ist wie das natürliche, zur klinischen Behandlung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden könnte.
Ein erstes Leukozyteninterferon-Gen wurde erfindungsgemäss durch die folgenden Massnahmen erhalten:
(1) Aminosäurepartialsequenzen von homogenem Human-Leukozyteninterferon wurden verwendet, um synthetische DNA-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle möglichen Nukleotidkombinationen repräsentierten, durch die die Aminosäurepartialsequenzen kodiert werden können.
(2) Es wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DNA (cDNA) aus induzierter mRNA enthielten. Andere induzierte und radioaktiv markierte mRNA wurde mit Plasmid-cDNA aus dieser Bank hybridisiert. Hybridisierende mRNA wurde eluiert und auf Translation in Interferon im Oozyten-Test getestet. Plasmid-DNA aus Kolonien, die in diesem Test Interferonaktivität besassen, wurden weiterhin auf Hybridisierung mit Sonden die nach (1) erhalten wurden, getestet.
(3) Parallel zu dem Vorgehen unter (2) wurde mittels induzierter mRNA erhaltene cDNA in Plasmiden dazu verwendet, eine unabhängige Bank transformierter Kolonien zu bilden. Die gemäss (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter für die Synthese radiomarkierter einzelsträngiger cDNA verwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden. Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induzierter mRNA als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte cDNA zu bilden. Auf diese Weise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDNA hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kodierenden Gens. Jedes gemäss (1) oder (2) erhaltene, möglicherweise eine Teilsequenz kodierende Genfragment kann als Sonde für ein vollständiges Gen verwendet werden.
(4) Das so erhaltene vollständige Gen wurde massgeschneidert unter Verwendung synthetischer DNA, um jegliche Leader-Sequenz, die die bakterielle Expression des reifen Polypeptids verhindern könnte, auszuschliessen und um es in einem Expressionsvehikel in die richtige Position bringen zu können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle eines bakteriellen Promotors. Das exprimierte Interferon wurde soweit gereinigt, dass es charakterisiert und seine Aktivität bestimmt werden konnte.
(5) Das auf diese Weise erhaltene Interferon-Genfragment konnte seinerseits als Sonde für die Isolierung (mittels Hybridisierung) von weiteren Genen für andere, teilweise homologe Leukozyteninterferone verwendet werden.
Durch die Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DNA-Technologie wurde die bakterielle Herstellung der Familie homologer Leukozyteninterferone (in nicht-glykosylierter Form) als reife Polypeptide, d.h. im wesentlichen frei von entsprechenden Präsequenzen oder Teilen davon, erreicht. Diese Interferone können direkt exprimiert, isoliert und soweit gereinigt werden, dass sie für die Verwendung zur Behandlung viraler und bösartiger Krankheiten von Tieren und Menschen geeignet sind.
Einzelne Glieder der Interferon-Familie, soweit sie exprimiert wurden, waren in in vitro-Tests wirksam und, in einem ersten derartigen Versuch, ebenfalls in einem in vivio-Test, wobei es sich bei letzterem um die Prüfung des ersten bakteriell hergestellten reifen Leukozyteninterferons handelte.
Der Ausdruck "reifes Leukozyteninterferon", der im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, definiert ein bakteriell hergestelltes Leukozyteninterferonmolekül, das keine Glykosylgruppen trägt und unmittelbar von einem Translations-Startsignal (ATG) direkt vor dem ersten Aminosäurecodon des natürlichen Produktes exprimiert wird. Das "reife" Polypeptid kann daher als erste Aminosäure seiner Sequenz Methionin (für das ATG codiert) enthalten, ohne dass damit sein Charakter wesentlich geändert würde. Andererseits kann der bakterielle Wirt das Translationsprodukt prozessieren und das anfängliche Methionin abspalten. "Expression" von reifem Leukozyteninterferon bedeutet bakterielle Herstellung eines Interferonmoleküls, das weder Glykosylgruppen noch eine Präsequenz enthält, die bei der mRNA Translation eines menschlichen Leukozyteninterferon Genoms unmittelbar zugegen ist.
Einzelne reife Leukozyteninterferone wurden auf Grund der DNA- Sequenzen der entsprechenden Gene (Figuren 3 und 8) und der davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen (Figuren 4 und 9) definiert. Für alle diese einzelnen Leukozyteninterferone der Familie der Leukozyteninterferone existieren natürliche, von Individuum zu Individuum unterschiedliche allelische Varianten. Diese Varianten können gekennzeichnet sein durch (einen) Aminosäure Unterschied(e) in der Gesamtsequenz oder durch Deletionen, Substitutionen, Insertionen, Inversionen oder Additionen einzelner oder mehrerer Aminosäuren in der Sequenz. Derartige allelische Variationen der erfindungsgemässen Leukozyteninterferone A bis J sind von den jeweiligen Formeln (LeIF A bis LeIF J) mitumfasst und ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Menschliches Leukozyteninterferon A (LeIF A), entsprechende DNA, Vektoren, rekombinante Mikroorganismen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung und seine Verwendung in pharmazeutischen Präparaten sind in der Europäischen Patentanmeldung No. 81105067.3 beansprucht. Der Zweck des Verweises auf LeIF A in dieser Beschreibung dient zum besseren Verständnis der Erfindung.

Beschreibung der Figuren

Figur 1 beschreibt zwei Aminosäuresequenzen, die allen Interferonspezies, die aus menschlichen Leukozyten isoliert und bis zur Homogenität gereinigt wurden, gemeinsam sind und mit T-1 und T-13 bezeichnet sind. Es sind alle möglichen mRNA-Sequenzen, die diese Peptide kodieren, dargestellt, ebenso wie die entsprechenden cDNA-Sequenzen. Die Buchstaben A, T, G, C und U bezeichnen die Nukleotide mit den Basen Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin und Uracil. Der Buchstabe N bedeutet A, G, C oder U. Die Polynukleotide sind vom 5'-Ende (links) zum 3'-Ende (rechts) angegeben und wo sie doppelsträngig dargestellt sind, ist die untere DNA (nicht-kodierender Strang) von 3' - in 5'-Richtung wiedergegeben.
Figur 2 stellt ein Autoradiogramm dar, das die Hybridisierung von möglichen LeIF-Plasmiden mit ³²P-markierten synthetischen Deoxyoligonukleotiden zeigt.
Figur 3 gibt die Nukleotidsequenzen (kodierende Stränge) von acht isolierten Genfragmenten (bezeichnet A-H) wieder, die für die Expression von Leukozyteninterferonen verwendet werden können. Der ATG Translations-Startcodon und die Stoptripletts für jedes LeIF sind unterstrichen. Auf die Stoptripletts folgen unübersetzte Sequenzen. Dem vollständigen Gen für LeIF A fehlt ein Codon der bei den anderen LeIFs vorhanden ist, wie in der dritten A Linie von Figur 3 gezeigt. Vor der Leader-Sequenz liegen 5' unübersetzte Sequenzen. Dem isolierten Fragment E fehlt die volle Leader-Präsequenz, aber es enthält das vollständige Gen für ein etwaiges reifes LeIF E. Dem isolierten Fragment G hingegen fehlt ein Teil der kodierenden Sequenz.
Figur 4 gibt einen Vergleich von 8 aus den Nukleotidsequenzen abgeleiteten LeIF Proteinsequenzen. Die für die Bezeichnung der einzelnen Aminosäuren verwendeten grossen Buchstaben sind die von der IUPAC- IUB Kommission für biochemische Nomenklatur empfohlenen. Es bedeuten: A, Alanin; C, Cystein; D, Asparaginsäure; E, Glutaminsäure; F, Phenylalanin; G, Glycin; H, Histidin; I, Isoleucin; K, Lysin; L, Leucin; M, Methionin; N, Asparagin; P, Prolin; Q, Glutamin; R, Arginin; S, Serin; T, Threonin; V, Valin; W, Tryptophan; und Y, Tyrosin. Die Zahlen geben die Position der Aminosäuren an (S bezieht sich auf das Signal-Peptid). Der Bindestrich in der 165 Aminosäuren umfassenden Sequenz von LeIF A in Position 44 wurde eingeführt, um die Sequenz des LeIF A in Uebereinstimmung mit den 166 Aminosäuren der anderen Leukozyteninterferone zu bringen. Für die Festlegung der Sequenz des LeIF E wurde das extra Nukleotid (Position 187 in Figur 3) nicht berücksichtigt. Die Sterne stellen in-Phase-befindliche Stopcodons dar. Aminosäuren, die allen LeIFs (mit Ausnahme des Pseudogens LeIF E) gemeinsam sind, sind ebenfalls dargestellt. Die unterstrichenen Reste sind Aminosäuren, die auch im Human-Fibroblasten-Interferon vorkommen.
Figur 5 gibt die Restriktionsendnuklease-Karten der klonierten cDNAs der 8 verschiedenen LeIF Typen wieder (A bis H). Die hybriden Plasmide wurden nach der dC:dG-Tailing-Methode (Goeddel, D.V. et al., Nature 287, 411-416 [1980]) hergestellt. Deshalb können die cDNA-Einsätze mit PstI herausgeschnitten werden. Die Linien an den Enden jedes cDNA-Einsatzes stellen die flankierenden homopolymeren dC:dG-Schwänze dar. Die Lage der PvuII-, EcoRI- und BglII-Restriktionsstellen sind angegeben. Schattierte Regionen in der Figur stellen kodierende Sequenzen für reife LeIFs dar; die schräg-gestrichelten Regionen bezeichnen kodierende Sequenzen für Signalpeptide, während die weissen Regionen 3' und 5 nichtkodierende Sequenzen darstellen.
In Figur 6 wird schematisch die Konstruktion eines Gens, das die direkte bakterielle Synthese von reifem LeIF A kodiert, dargestellt. Es werden die Restriktionsstellen ("PstI" usw.) und Reste gezeigt. Die Abkürzung "b.p." bedeutet "Basenpaare".
Figur 7 (nicht massstabsgerecht) stellt schematisch die Restriktions- Karte von 2 Genfragmenten dar, die zur Expression von reifem LeIF B verwendet wurden. Die bezeichneten Kodonsequenzen sind die Enden der kodierenden Stränge, die durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym Sau3a in den beiden dargestellten Fällen entstehen.
Die Figuren 8 und 9 geben die DNA- und Aminosäuresequenzen von 5 LeIF Proteinen, einschliesslich der Typen I und J wieder (siehe Figur 4 betreffend die entsprechenden Abkürzungen im Einbuchstaben-Code). In Figur 9 bedeutet der Stern einen Stopcodon in der entsprechenden DNA- Sequenz und der Bindestrich eine Deletion oder eine Lücke in der Sequenz.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFUEHRUNGSFORMEN

A. Die verwendeten Mikroorganismen

Die beiden folgenden Mikroorganismen wurden verwendet: E. coli x 1776, wie beschrieben in U.S.P. 4.190.495, und E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi&supmin;, hsr&supmin;, hsm ), wie in der britischen Patentanmeldung Nr. 2055382 A beschrieben. Beide Organismen wurden bei der American Type Culture Collection deponiert unter den ATCC Nrn. 31537 und 31446. Die gesamte rekombinante DNA Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National Institute of Health durchgeführt.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung unter Hinweis auf E. coli beschrieben. Ausser dem obengenannten E. coli Stamm x 1776 und dem obengenannten E. coli Stamm 294 können aber auch andere Stämme, beispielsweise E. coli B oder weitere Bakterienstämme, verwendet werden, von denen die meisten an einem Depositorium, wie der American Type Culture Collection, hinterlegt worden sind und allgemein zugänglich sind. Vergleiche auch Deutsche Offenlegungsschrift 2644432. Weitere Mikroorganismen sind z.B. Bacilli, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem Salmonella typhimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die unter Verwendung von replikablen Plasmiden heterologe Gene zur Expression bringen können.

B. Quelle und Reinigung von LeIF mRNA

LeIF mRNA kann von Human-Leukozyten normalerweise von Patienten mit chronischer myeloischer Leukämie, die zur Produktion von Interferon mit Sendai-Virus oder Geflügelpest (Newcastle disease) Virus, wie beispielsweise in der deutschen Offenlegungsschrift Nr. 2947134 beschrieben, angeregt wurden, erhalten werden. Eine besonders bevorzugte und für die vorliegende Arbeit verwendete Quelle ist eine Zell-Linie, die KG-1 bezeichnet ist und sich von einem Patienten mit akuter myeloischer Leukämie ableitet. Die Zell-Linie, beschrieben von Koeffler, H.P. und Golde, D.W., Science 200, 1153 (1978), wächst schnell in einem Medium enthaltend RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 mit 10% FCS (fötales Kälberserum), hitzeinaktiviert, 25 mM HEPES-Puffer (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethan-sulfonsäure) und 50 ug/ml Gentamycin und wird zweimal die Woche subkultiviert im Verhältnis 1:3. Die Zellen können in dem vorstehend beschriebenen Medium nach Zusatz von 10% Dimethylsulfoxid eingefroren werden. Die KG-1 Linie ist bei der American Type Culture Collection deponiert worden (ATCC Nr. CRL 8031).
Die KG-1-Zellen wurden nach der von Rubinstein et al. in (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 640-644 [1979]) beschriebenen Weise mit Sendai-Virus oder Newcastle disease Virus zur Produktion von Leukozyteninterferon- mRNA angeregt. Die Zellen wurden 5 Stunden nach der Induktion geerntet und die mRNA wurde nach der Guanidinthiocyanat-Guanidinhydrochlorid- Methode (Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294-5299 [1979]) hergestellt. RNA aus nicht-induzierten Zellen wurde in der gleichen Weise isoliert. Oligodeoxythymidin (dT)-Cellulose-Chromatographie und Saccharose-Gradient- Ultrazentrifugation wurden benutzt, um die 12S Fraktion von Poly (A)- mRNA, wie von Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 [1976]) und Okuyuma et al. (Arch. Biochem. Biophys. 188, 98-104 [1989]) beschrieben, zu erhalten. Diese mRNA hatte einen Interferontiter von 8000-10,000 Einheiten pro Mikrogramm im Xenopus laevis Oozytentest (Cavalieri et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 3287-3291 [1977]).

C. Herstellung von Koloniebänken, die LeIF-cDNA- Sequenzen enthalten

5 ug mRNA wurden zur Herstellung doppelsträngiger cDNA nach Standardmethoden (Wickens et al., J. Biol. Chem. 253, 2483-2495 [1978] und Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]) verwendet. Die cDNA wurde der Grösse nach fraktioniert durch Elektrophorese auf einem 6% Polyacrylamidgel und 230 ng des Materials mit 500-1500 Basenpaaren wurden durch Elektroelution isoliert. 100 ng dieser cDNA wurden mit Deoxycytidin (dC)-Resten nach der von Chang et al. (Nature 275, 617-624 [1978]) beschriebenen Methode verlängert, verbunden mit 470 ng des Plasmids pBR322, welches mit Deoxyguanosin (dG)-Resten an der PstI- Spaltstelle (Bolivar et al., Gene 2, 95-113 [1977]) verlängert worden war und zur Transformation von E. coli x 1776 verwendet. Es wurden etwa 130 Tetracyclin-resistente, Ampicillin-empfindliche Transformanten pro ng cDNA erhalten.
In einem zweiten ähnlichen Experiment wurden etwa 1000 Tetracyclinresistente, Ampicillin-empfindliche E. coli K-12 Stamm 294-Transformanten pro ng cDNA erhalten. In diesem Falle lag die Grösse des fraktionierten cDNA-Materials zwischen 600 und 1300 Basenpaaren. Es wurde durch Elektroelution für die Verlängerung mit Deoxycytidin (dC) gewonnen.

D. Herstellung synthetischer Oligonucleotide und deren Verwendung

Die Kenntnis der Aminosäuresequenzen verschiedener tryptischer Fragmente von humanen Leukozyteninterferonen erlaubte die Synthese von Deoxyoligonukleotiden, die bestimmten Regionen der LeIF mRNA komplementär waren. Die beiden tryptischen Peptide T1 und T13 wurden ausgewählt, weil ihre Aminosäuresequenzen die Synthese von nur 12, bzw. 4 Undecameren erforderte, um alle möglichen Nukleotidsequenzen zu erfassen (Figur 1). 4 Sätze von Deoxynukleotidsonden wurden für jede Sequenz synthetisiert, die entweder 3 (T-1A, B, C, D) oder ein (T-13A, B, C, D) Oligonukleotid enthielten. Die bezeichneten komplementären Deoxyoligonukleotide aus jeweils 11 Basen wurden chemisch synthetisiert nach der Phosphortriestermethode (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 5765-5769 [1978]). In der T-13 Serie wurden 4 individuelle Sonden hergestellt. Die zwölf T-1 Sonden wurden in vier Pools zu 3 Sonden, wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt.
Die vier individuellen Sonden der T-13 Serie und die zwölf T-1 Sonden, hergestellt in je vier Gruppen zu 3 Sonden, wurden verwendet, um die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNA zum Gebrauch als Hybridisierungssonden zu starten. Die Matrizen-mRNA war entweder 12S RNA von mit Sendai-Virus induzierten KG-1 Zellen (8000 Einheiten IF- Aktivität per ug) oder gesamte Poly (A)-mRNA aus nicht induzierten Leukozyten (< 10 Einheiten pro ug). ³²P-markierte cDNA wurde aus diesen Startern hergestellt unter Verwendung bekannter Reaktionsbedingungen (Noyes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 1770-1774 [1979]). Die 60 ul- Reaktionen wurden durchgeführt in 20mM Tris-HCl (pH 8,3) 20mM KCl, 8mM MgCl&sub2; und 30mM β-Mercaptoethanol, jeweils mit 1 ug jedes Starters (d.h. 12 ug insgesamt für die T-1 Serie , 4 ug insgesamt für die T-13 Serie), 2 ug "induzierter" 12S mRNA (oder 10 ug nicht-induzierter Poly (A)-mRNA), 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 uCi (α³²p) dCTP (Amersham, 2-3000 Ci/mmole) und 60 Einheiten Reverser Transkriptase (Bethesda Research Laboratories). Das Produkt wurde von nicht-markiertem Material durch Gelfiltrationen an einer 10 ml-Sephadex G-50 Säule getrennt, 30 Minuten bei 70ºC mit 0,3N NaOH, zur Zerstörung der RNA, behandelt und mit HCl neutralisiert. Die Hybridisierungen wurden wie von Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 [1979] beschrieben, durchgeführt.

E. Identifizierung der Klone pL1-pL30

Die Methode von Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979), zur schnellen Isolierung von Plasmiden wurde verwendet, um 1 ug Plasmid-DNA aus jeder der 500 individuellen E. coli K-12 Stamm 294- Transformanten (vergleiche C) zu gewinnen. Jede DNA Probe wurde denaturiert und auf Nitrocellulosefilter in dreifacher Ausführung, nach der Methode von Kafatos et al. (siehe oben), aufgebracht.
Die drei Sätze der Nitrocellulosefilter, die 500 Plasmidproben enthielten, wurden hybridisiert mit
a) induzierter cDNA, gestartet mit einem T-1 Startersatz,
b) T-13 gestarteter induzierter cDNA und
c) nicht induzierter cDNA, hergestellt unter Verwendung beider Startersätze. Klone wurden als positiv angesehen, wenn sie stärker hybridisierten mit einer oder beiden der induzierten cDNA-Sonden als mit der gesamten nicht-induzierten Sonde. 30 positive Klone (pL1- pL30) wurden aus den 500 zur weiteren Analyse ausgesucht.

F. Identifikation der Klone pL31-pL39, Isolierung eines Plasmids (Nr. 104), das ein LeIF-Genfragment enthielt

Transformanten von E. coli x 1776 wurden nach der Koloniehybridisierungsmethode von Grunstein und Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961-3965 [1975]) getestet, unter Verwendung von ³²P- markierter induzierter mRNA als Sonde (Lillenhaug et al., Biochemistry 15, 1858-1865 [1976]). Nichtmarkierte mRNA von nicht-induzierten Zellen wurde mit der Sonde in einem Verhältnis von 200:1 gemischt, um zu konkurrieren mit in dem ³²P-markierten Präparat vorhandener nicht-induzierter mRNA. Die Hybridisierung markierter mRNA sollte vorwiegend bei Kolonien erfolgen, die induzierte Sequenzen enthalten. Drei Klassen von Transformanten wurden erhalten:
(1) 2-3% der Kolonien hybridisierten sehr stark mit ³²P-mRNA,
(2) 10% hybridisierten signifikant schwächer als die erste Klasse und
(3) der Rest lieferte kein erkennbares Hybridisierungssignal.
Die positiven Kolonien (Klassen (1) und (2) ) wurden auf die Anwesenheit Interferon-spezifischer Sequenzen mittels eines Assays geprüft, der auf der spezifischen Hybridisierung von Interferon-mRNA an Plasmid-DNA beruht. Zunächst wurden 60 der stark positiven Kolonien (Klasse (1)) individuell in 100 ml M9-Medium, das ergänzt war mit Tetracyclin (20 ug/ml), Diaminopimelinsäure (100 ug/ml), Thymidin (20 ug/ml) und d-Biotin (1 ug/ml), gezüchtet. Das M9-Medium enthält pro Liter: Na&sub2; HPO&sub4; (6g), KH&sub2;PO&sub4; (3 g), NaCl (0,5 g) und NH&sub4;Cl (1 g). Nach Autoklavieren wurde 1 ml steriles 1M MgSO&sub4; und 10 ml steriles 0,01 M CaCl&sub2; zugesetzt. Jeweils 10 der 60 Kulturen wurden zusammengefasst und die Plasmid-DNA wurde, wie von Clewell et al., Biochemistry 9, 4428-440 [1970], beschrieben, isoliert. 10 ug jedes Plasmid DNA-Pools wurden mit HindIII gespalten, denaturiert und kovalent an DBM-Papier (Diazobenzyloxymethylpapier) gebunden. 1 ug gereinigte mRNA aus induzierten Zellen wurde an jedes Filter hybridisiert. Nicht-hybridisierte mRNA wurde durch Waschen entfernt. Die spezifisch hybridisierte mRNA wurde eluiert und in Xenopus laevis Oozyten translatiert. In diesem Assay waren alle sechs Pools negativ. Aus 59 schwach positiven Kolonien (Klasse (2)) wurden fünf Pools zu je 10 Kolonien und 1 Pool zu 9 Kolonien gebildet und Plasmide der Pools wurden hergestellt und nach der oben beschriebenen Methode geprüft. Unter den sechs getesteten Pools hybridisierte einer (K10) mit Interferon mRNA jedesmal signifikant über dem Hintergrund, wenn er getestet wurde. Um den spezifischen Interferon- cDNA-Klon zu identifizieren, wurde aus jeder der im Pool K10 zusammengefassten neun Kolonien Plasmid-DNA hergestellt und individuell geprüft. Zwei der neun Plasmide (Nr. 101 und 104) banden Interferon-mRNA 5 stärker als die anderen. Aus dem Plasmid Nr. 104 wurde ein besonderes Bgl II-Restriktionsfragment, das 260 Basenpaare enthielt, isoliert, ³²P-markiert nach der von Taylor et al., Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 (1976), beschriebenen Methode und als Sonde verwendet, um 400 E. coli 294-Transformanten nach einem in situ-Kolonie- Screeningverfahren (Grunstein und Hogness, Proc. Natl. Sci. U.S.A. 72, 3961-3965 [1975]) zu testen. Neun Kolonien (pL31-pL39) wurden identifiziert, die in verschieden starkem Masse mit dieser Sonde hybridisierten.
Zusätzlich wurde das markierte 260-Basenpaar-Fragment verwendet, um 4000 E. coli 294-Transformanten in derselben Weise zu testen. 50 Kolonien konnten identifiziert werden, die in unterschiedlichem Masse mit dieser Sonde hybridisierten. Eine enthielt das LeIF G-Fragment, eine enthielt das LeIF H-Fragment und eine enthielt ein Fragment, das als LeIF H1 bezeichnet wurde, offensichtlich ein Allel von LeIF H. Die hybriden Plasmide, die erhalten wurden, wurden "pLeIF H", usw., bezeichnet.

G. Isolierung und Sequenzierung eines ersten vollständigen LeIF Gens

Plasmid DNA wurde aus allen 39 potentiellen LeIF-cDNA-Klonen hergestellt und nochmals mit der gleichen 260 Basenpaare-enthaltenden DNA-Sonde getestet, unter Verwendung des Hybridisierungsprozederes von Kafatos et al. (siehe oben). Drei Plasmide (pL4, pL31, pL34) gaben sehr starke Hybridisierungssignale, vier (pL13, pL30, pL32, pL36) hybridisierten mittelmässig, während drei (pL6, pL8, pL14) nur schwach mit der Sonde hybridisierten.
Die 39 potentiellen LeIF cDNA Rekombinant-Plasmide wurden ebenfalls unter Verwendung der ³²P-markierten synthetischen Undecameren (individuelle T-1 Starterpools oder individuelle T-13 Starter) als Hybridisierungssonden getestet. Die Hybridisierungsbedingungen wurden so ausgewählt, dass eine perfekte Basen-Paarung notwendig war, um feststellbare Hybridisierungssignale zu erhalten (Wallace et al., Nucleic Acids Res. 6, 3543-3557 [1979]). Folglich wurde Plasmid-DNA aus den 39 Klonen nach einer Standardmethode (Clewell et al., siehe oben) hergestellt und mittels Biorad Agarose A-50 Säulenchromatographie gereinigt. Proben (3 ug) jedes Präparats wurden durch Behandlung mit EcoRI linearisiert, mit Alkali denaturiert und auf 2 getrennte Nitrocellulosefilter getüpfelt und zwar 1,5 ug/Fleck (Kafatos et al., siehe oben). Die individuellen synthetischen Deoxyoligonukleotid-Starter und Starterpools wurden mit (γ³² P) ATP folgendermassen phosphoryliert: 50 pmol Oligonukleotid und 100 pMol (γ³² P) ATP (New England Nuclear, 2500 Ci/mMol) wurden mit 30 ul 50 mMol Tris-HCl, 10 mMol MgCl&sub2; und 15 mMol β-Mercaptoethanol versetzt. Es wurden 2 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase zugesetzt und nach 30 Minuten bei 37ºC wurden die ³²P-markierten Starter durch Chromatographie an 10 ml Sephadex G-50-Säulen gereinigt. Die Hybridisierungen wurden unter Verwendung von 10&sup6; cpm Starter T-13C oder 3 x 10&sup6; cpm Starterpool T-1C durchgeführt und zwar bei 15ºC während 14 Stunden in 6 x SSC [1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,2], 10 x Denhardt's Lösung [0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Polyvinylpyrolidon, 0,2% Ficoll], wie von Wallace et al. (siehe oben) beschrieben. Die Filter wurden während 5 Minuten (3 mal) bei 0ºC in 6 x SSC gewaschen, getrocknet und Röntgenfilm ausgesetzt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 für ³² P-Starterpool T-13C und Starter T-1C dargestellt.
Die Plasmid-DNA aus Klon 104 lieferte bemerkenswerte Hybridisation mit Starterpool T-1C und Starter T-13C, während Hybridisation mit den anderen Undecameren nicht festgestellt werden konnte. Wie in Figur 2 dargestellt, hybridisierten verschiedene der 39 potentiellen LeIF-Plasmide (pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) mit diesen beiden Sonden. Die Restriktionsanalyse zeigte jedoch, dass nur eines der Plasmide, pL31, auch ein 260 Basenpaare-enthaltendes BglII-Fragment enthielt. PstI-Behandlung von pL31 zeigte, dass die Grösse des cDNA-Abschnittes etwa 1000 Basenpaare war.
Der gesamte PstI Abschnitt von pL31 wurde sowohl nach der chemischen Methode von Maxam-Gilbert (Methods Enzymol. 65, 499-560 [1980]) wie nach der Dideoxy-Kettenbruchmethode (Smith, Methods Enzymol. 65, 560-580 [1980]) sequenziert, nachdem die Sau3a-Fragmente in einen M13-Vektor unterkloniert worden waren. Die DNA-Sequenz ist in Figur 3 ("A") gezeigt. Der passende Translations-Leseraster konnte auf Grund der zur Verfügung stehenden Proteinsequenz-Information, dem bekannten Bereich der LeIF Molekulargewichte und dem relativen Vorkommen von Stop-Tripletts in den drei möglichen Leserastern vorhergesagt werden und dies wiederum erlaubte die Vorhersage der gesamten LeIF Aminosäuresequenz, einschliesslich des Prä- oder Signalpeptids. Der erste ATG Translations-Startcodon befindet sich 60 Nukleotide vom 5'-Ende der Sequenz entfernt und wird nach 188 Codons von einem TGA Stoptriplett gefolgt. Es gibt 342 nicht übersetzte Nukleotide am 3'-Ende, die schliesslich von einer Poly (A)-Sequenz gefolgt werden. Das mutmassliche Signalpeptid (wahrscheinlich beteiligt an der Sekretion von reifem LeIF aus Leukozyten) ist 23 Aminosäuren lang. Das aus 165 Aminosäuren bestehende reife LeIF hat ein berechnetes Molekulargewicht von 19,390. Wir haben das von pL31 kodierte LeIF "LeIF A" genannt. Von den Sequenzdaten ("A") in Figur 4 kann entnommen werden, dass die tryptischen Peptide T-1 und T-13 von LeIF B Aminosäuren 145-149 und 57-61 des LeIF A entsprechen. Die tatsächlichen DNA-Sequenzen, die in diesen beiden Regionen gefunden wurden, werden durch den Starterpool T1-C und den Starter T13-C (siehe Figur 8) dargestellt.

H. Direkte Expression von reifem Leukozyteninterferon A (LeIF A)

1. Allgemeines

Die Methode, nach der das reife LeIF A direkt exprimiert wurde, ist eine Variante der früher bereits für das menschliche Wachstumshormon angewandten (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]), insofern es eine Kombination von synthetischer (N-terminal) und komplementärer DNA darstellte.
Wie in Figur 6 gezeigt, befindet sich zwischen den Codons 1 und 3 von LeIF A eine Sau3a-Restriktionsendonuklease-Stelle. Es wurden 2 synthetische Deoxyolinukleotide geschaffen, die einen ATG-Translations- Startcodon enthalten, den Codon für die Aminosäure 1 (Cystein) wiederherstellen und ein EcoRI kohäsives Ende schaffen. Diese Oligomeren wurden an ein Sau3a-AvaII Fragment von pL31, das aus 34 Basenpaaren bestand, gehängt. Das entstandene 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde an 2 zusätzliche DNA-Fragmente gehängt, so dass ein künstlichnatürliches Hybridgen aus 865 Basenpaaren entstand, das LeIF A kodierte und welches durch EcoRI- und PstI-Restriktionsstellen begrenzt ist. Dieses Gen wurde zwischen die EcoRI- und PstI-Restriktionsstellen des Plasmids pBR322 eingefügt und lieferte das Plasmid pLeIF A1.

2. Konstruktion des Tryptophan-Kontrollelements (enthaltend den E. coli trp Promotor. Operator und die trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle ohne die ATG-Sequenz für den Translationsbeginn)

Das Plasmid pGMI trägt das E. coli-Tryptophan-Operon mit der Deletion ΔLE1413 (Miozzari et al., J. Bacteriology 133, 1457-1466 [1978]) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des trp- Leaders und etwa dem letzten Drittel des trp E-Polypeptids (im folgenden LE' genannt), sowie dem vollständigen trp D-Polypeptid, und zwar unter der Kontrolle des trp-Promotor-Operator-Systems. Das Plasmid, 20 ug, wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII an 5 Stellen gespalten. Die Genfragmente wurden dann mit EcoRI-Verbindungssequenzen (bestehend aus einer selbstkomplementären Polynukleotidsequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, um eine EcoRI-Spaltstelle für das spätere Klonieren in ein Plasmid mit einer solchen EcoRI-Spaltstelle zu schaffen. Die 20 ug der aus pGMl erhaltenen DNA-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T&sub4; DNA-Ligase in Gegenwart von 200 pMol des 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonukleotids pCATGAATTCATG in 20 ul T&sub4; DNS-Ligase-Puffer (20 mMol Tris, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgCl&sub2;, 5 mMol Dithiothreit) bei 4ºC über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70ºC erwärmt. Die Verbindungssequenzen wurden mit EcoRI gespalten und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5% Polyacrylamidgelektrophorese (hiernach PAGE) aufgetrennt und die drei grössten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV- Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Jedes Gelfragment wurde mit 300 Mikroliter 0,1 x TBE in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 x TBE-Puffer der Elektrophorese bei 100 Volt ausgesetzt (TBE-Puffer enthält: 10,8 g Tris- Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na&sub2;EDTA in 1 Liter H&sub2;O). Die wässrige Lösung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2M an Natriumchlorid gemacht. Die DNA wurde nach Ethanolfällung in wässriger Lösung erhalten. Das den trp-Promotor-Operator enthaltende Gen mit EcoRI kohäsiven Enden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht, dass man Fragmente in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promotor-Operators Tetracyclin-resistent werden.
Das Plasmid pBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Acids Res. 6, 3267-3287 [1979]) exprimiert Ampicillinresistenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promotor existiert, exprimiert diese Resistenz nicht. Das Plasmid ist daher Tetracyclin- empfindlich. Durch Einfügung eines Promotor-Operator-Systems an der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden.
pBRHl wurde mit EcoRI behandelt und das Enzym durch Phenolextraktion und Chloroformextraktion entfernt. Das nach Ethanolpräzipitation in Wasser erhaltene DNA-Molekül wurde in getrennten Reaktionsgemischen kombinert mit jedem der drei DNA- Fragmente, die oben erhalten wurden und mit T&sub4; DNA-Ligase, wie bereits beschrieben, verbunden. Die DNA des Reaktionsgemischs wurde zur Transformation kompetenter E. coli K-12 Stamm 294-Organismen nach Standardmethoden (Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71, 3455- 3459 [1974]) verwendet und die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani) - Platten gebracht, die 20 ug/ml Ampicillin und 5 ug/ml Tetracyclin enthielten. Es wurden verschiedene Tetracyclin-resistente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNA isoliert und das Vorhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktionsenzymanalysen bestätigt. Das entstandene Plasmid wurde pBRHtrp genannt.
Ein EcoRI und BamHI Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis B- Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoRI und BamHI Spaltstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979]), wodurch das Plasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit XbaI gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und der Ethanolpräzipitation unterworfen. Es wurde dann mit 1 ul E. coli DNA-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheim), in 30 ul Polymerase-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7.4, 7 mM MgCl&sub2;, 1 mM β-Mercaptoethanol), enthaltend 0,1 mM dTTP und 0,1 mM dCTP, während 30 Minuten bei 0ºC und 2 Stunden bei 37ºC behandelt. Durch diese Behandlung werden 2 der 4 zum überstehenden 5' Ende der XbaI Spaltstelle komplementären Nukleotide aufgefüllt:
Zwei Nukleotide, dC und dT, wurden eingebaut, wodurch ein Ende mit 2 5' überstehenden Nukleotiden erhalten wurde. Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten. Das grosse Plasmidfragment wurde vom kleinen EcoRI-XbaI-Fragment abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNA-Fragment von pHS32 (0,2 ug) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den oben beschriebenen an das EcoRI-TaqI-Fragment des Tryptophanoperons (etwa 0,01 ug) aus pBRHtrp gebunden.
Beim Verknüpfen des Fragments von pHS32 mit dem EcoRI-Taq I Fragment, wie vorstehend beschrieben, wird das überstehende Taq I Ende mit dem restlichen noch überstehenden XbaI Ende verknüpft, obwohl dieses keine vollständige Basenpaarung nach Watson-Crick ergibt:
Ein Teil dieses Ligations-Reaktionsgemisches wurde in E. coli 294- Zellen transformiert, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, ausplattiert. Es wurden 24 Kolonien ausgewählt, in 3 ml LB (Luria-Bertani) Medium aufgezogen und das Plasmid isoliert. Es wurde festgestellt, dass sechs davon die XbaI-Spaltstellen in E. coli durch katalysierte DNA-Ausbesserung und Replikation regeneriert hatten:
Diese Plasmide konnten auch mit ExoRI und HpaI gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente. Ein Plasmid, pTrpl4 bezeichnet, wurde für die Expression heterologer Peptide, wie im folgenden beschrieben, verwendet.
Das Plasmid pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544, [1979]) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon, bestehend aus 23 Aminosäurecodons, die aus synthetischen DNA Fragmenten hergestellt wurden und 163 Aminosäurecodons, die von cDNA über reverse Transkription von menschlicher Wachstumshormon mRNA erhalten wurden. Dieses Gen, obgleich es die Codons der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormons nicht enthält, besitzt ein ATG- Translations-Startcodon. Das Gen wurde aus 10 ug pHGH 107 isoliert nach Behandlung mit EcoRI und E.coli DNA Polymerase I Klenow-Fragment, sowie dTTP und dATP, wie oben beschrieben. Nach Phenol- und Chloroformextraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.
Das das HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNA-Fragment enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetracyclinresistenz-verleihenden Strukturgens, aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promotor-Operator-System, so dass, wenn es anschliessend in ein Expressionsplasmid kloniert wird, diejenigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die wiedergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren, hat das Fragment ein stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein Expressionsplasmid eingefügt wird.
Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltenden Fragments, das oben hergestellt wurde, vorbereitet. pTrpl4 wurde mit XbaI behandelt und die entstehenden kohäsiven Enden wurden nach dem Klenow-Polymerase I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und dCTP aufgefüllt. Nach Phenol- und Chloroform- Extraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNA mit BamHI behandelt und das entstandene grosse Plasmidfragment wurde durch PAGE und Elektroelution eluiert. Das von pTrp14 abstammende Fragment besass ein stumpfes und ein kohäsives Ende und erlaubte die Rekombination in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde.
Das das HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpl4 ΔXba- BamHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbunden unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen, die vorstehend beschrieben sind. Durch die Verbindung der aufgefüllten XbaI- und EcoRI-Enden wurden die XbaI- und EcoRI-Restriktionsstellen wiederhergestellt: XbaI aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-GEN-Anfang
Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promotor, der stromaufwärts vom HGH-Gen (Lac-Promotor) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGH 207, die Expression des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promotor-Operators. Das erhaltene Gemisch wurde daher in E. coli 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5 ug/ml Tetracyclin enthielten, selektioniert.
Das Plasmid pHGH 207 wurde mit EcoRI behandelt und ein 300 Basenpaare-enthaltendes Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution erhalten, das den trp-Promotor, Operator und die trp-Leader- Ribosomenbindungsstelle enthielt, dem aber eine ATG-Sequenz für den Start der Translation fehlte. Dieses DNA Fragment wurde in die EcoRI- Spaltstelle von pLeIF A kloniert. Expressionsplasmide, die das vorstehend modifizierte trp-Regulon (E. coli-Operon, dem die Attenuator-Sequenz fehlt, so dass die Expression erhöht ist) können bis zu vorgegebenen Konzentrationen herangezüchtet werden in einem Medium, das genügend Tryptophan enthält, um das Promotor-Operatorsystem zu unterdrücken. Wird dann das Tryptophan entzogen und das System deblockiert, so wird das gewünschte Produkt exprimiert.
Insbesondere, und wie in Figur 6 dargestellt, wurden 250 ug des Plasmids pL31 mit PstI verdaut und das 1000 Basenpaare-enthaltende Teilstück durch Gelektrophorese auf einem 6% Polyacrylamidgel isoliert. Es wurden etwa 40 ug des Teilstücks aus dem Gel durch Elektroelution erhalten und in 3 gleiche Teile für die weitere Behandlung aufgeteilt: a) Eine 16 ug-Probe des Fragments wurde mit 40 Einheiten von BglII während 45 Minuten bei 37ºC teilweise gespalten und das Reaktionsgemisch wurde auf einem 6% Polyacrylamidgel gereinigt. Etwa 2 ug des gewünschten 670 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden erhalten. b) Eine andere Probe (8 ug) des 1000 Basenpaare-enthaltenden PstI- Bruchstücks wurde mit AvaII und BglII behandelt. l ug des gezeigten 150 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden nach Gelelektrophorese erhalten. c) 16 ug des 1000 Basenpaare-enthaltenden Fragments wurden mit Sau3a und AvaII behandelt. Nach Elektrophorese auf 10% Polyacrylamidgel wurden etwa 0,25 ug (10 pMol) des 34 Basenpaare-enthaltenden Fragments erhalten. Die zwei angegebenen Deoxyolinukleotide, 5'-dAATTCATGTGT (Fragment 1) und 5'-dGATCACACATG (Fragment 2) wurden nach der Phosphotriestermethode synthetisiert. Das Fragment 2 wurde folgendermassen phosphoryliert: 200 ul (etwa 40 pM) von (γ³²P) ATP (Amersham, 5000 Ci/mM) wurden getrocknet und in 30 ul 60 mM Tris-HCl (pH 8), 10mM MgCl&sub2;, 15 mM β-Mercaptoethanol, 100 pM des DNA-Fragments und 2 Einheiten T4 Polynukleotid-Kinase resuspendiert. Nach 15 Minuten bei 37ºC wurde l ul 10mM ATP hinzugefügt und die Reaktion weitere 15 Minuten laufengelassen. Das Gemisch wurde dann während 15 Minuten auf 70ºC erwärmt, mit 100 pM des 5'-OH-Fragments 1 und 10 pM des 34 Basenpaare- enthaltenden Sau3a-AvaII-Fragments versetzt. Die Verbindung wurde bei 4ºC während 5 Stunden in 50 ul 20mM Tris-HCl (pH 7,5), 10mM Mg Cl&sub2;, 10mM Dithiothreit, 0,5mM ATP und 10 Einheiten T4 DNA-Ligase hergestellt. Das Gemisch wurde der Elektrophorese auf einem 6% Polyacrylamidgel unterworfen und das 45 Basenpaare-enthaltende Produkt wurde durch Elektroelution erhalten. Etwa 30 ng (1 pM) des 45 Basenpaare- enthaltenden Produkts wurden mit 0,5 ug (5pM) des 150 Basenpaare- enthaltenden AvaII - BglII-Fragments und 1 ug (2 pM) des 670 Basenpaare- enthaltenden BglII - PstI-Fragments vereint. Die Bindung wurde bei 20ºC während 16 Stunden unter Verwendung von 20 Einheiten T4 DNA-Ligase hergestellt. Die Ligase wurde dann durch Erhitzen auf 65ºC während 10 Minuten inaktiviert. Das Gemisch wurde mit EcoRI und PstI behandelt zwecks Spaltung von Polymeren des Gens. Das Gemisch wurde dann auf PAGE (6%) gereinigt. Es wurden etwa 20 ng (0,04 pM) des 865 Basenpaare- enthaltenden Produkts isoliert. Eine Hälfte davon (10 ng) wurde zwischen die EcoRI- und PstI-Spaltstellen von pBR322 (0,3 ug) eingefügt. Die Transformation von E. coli 294 lieferte 70 Tetracyclin-resistente, Ampicillin- empfindliche Transformanten. Die aus 18 dieser Transformanten isolierte Plasmid-DNA wurde mit EcoRI und PstI behandelt. 16 der 18 Plasmide besassen ein EcoRI - PstI-Fragment, das 865 Basenpaare lang war. 1ug eines dieser Plasmide, pLeIF Al, wurde mit EcoRI behandelt und an das 300 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment (0,1 ug), das den E. coli trp- Promotor und die trp-Leader-Ribosomenbindungsstelle enthielt, erhalten wie vorstehend beschrieben, gebunden. Die den trp-Promotor enthaltenden Transformanten wurden unter Verwendung einer ³²P-trp-Sonde nach der Grunstein-Hogness Kolonie-Screening-Methode identifiziert. Eine asymmetrisch sitzende Xbal-Spaltstelle in dem trp-Fragment erlaubte die Bestimmung von Rekombinanten, in denen der trp-Promotor in der Richtung des LeIF A-Gens orientiert war.

I. In vitro und in vivo Aktivität von LeIF A

Extrakte für den IF-Assay wurden folgendermassen hergestellt: 1 ml- Kulturen wurden in L-Brühe, enthaltend 5 ug/ml Tetracyclin, bis zu einem A&sub5;&sub5;&sub0;-Wert von etwa 1,0 aufgezogen, dann mit 25 ml M9-Medium, enthaltend 5 ug/ml Tetracyclin, verdünnt. Wenn der A&sub5;&sub5;&sub0;-Wert 1,0 erreicht hatte, wurden jeweils 10 ml-Proben zentrifugiert und die Zellkuchen in 1 ml 15%iger Saccharose, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 50 mM EDTA suspendiert. 1 mg Lysozym wurde zugesetzt und nach 5-minütiger Aufbewahrung bei 0º C wurden die Zellen durch Ultrabeschallung zerstört. Es wurde 10 Minuten zentrifugiert (15,000 U/Min) und die Interferon- Aktivität im Ueberstand wurde bestimmt durch Vergleich mit LeIF- Standard nach dem CPE-Hemmtest. Zur Bestimmung der Anzahl von IF- Molekülen pro Zelle wurde eine spezifische LeIF-Aktivität von 4 x 10&sup8; Einheiten pro mg verwendet.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, liefert Klon pLeIF A trp 25, in dem der trp- Promotor in der richtigen Richtung orientiert ist, hohe Aktivitäten (bis zu 2,5 x 10&sup8; Einheiten pro Liter). Wie in Tabelle 2 gezeigt, verhält sich das von E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF A trp 25 hergestellte Interferon wie authentisches Human-LeIF; es ist bei pH 2 stabil und wird durch Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Antikörper neutralisiert. Das Interferon hat ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20,000.
Der Nachweis von in vivo-Aktivität von Interferon macht die Gegenwart von Makrophagen und natürlichen Killerzellen (NK) notwendig, und es scheint, dass diese Zellen stimuliert werden. Es war daher möglich, dass das von E. coli 294/pLeIF A 25 produzierte Interferon, das im Zellkultur-Assay antivirale Aktivität zeigte, an infizierten Tieren inaktiv ist. Ferner ist es durchaus möglich, dass sich die antivirale in vivo-Aktivität des bakteriell hergestellten, nicht-glykosylierten LeIF A von der des glykosylierten Interferons, das aus menschlichen "buffy coat" Leukozyten gewonnen wird, unterscheidet. Es wurden daher die biologischen Aktivitäten von bakteriell hergestelltem LeIF A (2% rein) und von aus Leukozyten isoliertem "buffy coat" LeIF (8% rein) miteinander verglichen und zwar an Hand der lethalen Enzephalomyocarditis (EMC) bei Totenkopfäffchen (Tabelle 3). Tabelle 1: Interferon-Aktivität in Extrakten von E. coli E. coli K-12 Stamm 294 transformiert mit Zelldichte (Zellen/ml) IF-Aktivität E/ml Kultur LeIF-Moleküle pro Zelle Tabelle 2: Vergleich der Aktivitäten von Extrakten aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit Standard-LeIF *) Interferon-Aktivität (E/ml) 294/pLeIF A trp 25-Extrakt LeIF-Standard unbehandelt Kaninchen-anti-Human-Leukozyten-Antikörper
*) Der 250,000 E/ml enthaltende Extrakt von E. coli 294/pLeIF A trp 25, der in Tabelle 1 beschrieben wird, wurde auf das 500-fache verdünnt mit Minimalmedium, so dass er eine spezifische Aktivität von 500 E/ml aufwies. Ein vorher gegen NIH-Leukozyteninterferon-Standard titrierter Leukozyteninterferon-Standard (Wadley Institute) wurde ebenfalls auf eine Endkonzentration von 500 E/ml verdünnt. Aliquote Teile (jeweils 1 ml) wurden mit 1 N HCl auf pH 2 gebracht, 52 Stunden bei 4ºC inkubiert, durch Zusatz von NaOH neutralisiert und die IF-Aktivität nach dem Standard- CPE-Hemmtest bestimmt. Aliquote Teile (25 ul) der 500 E/ml-Proben (unbehandelt) wurden mit 25 ul Kaninchen-anti-Human-Leukozyteninterferon während 60 Minuten bei 37ºC inkubiert, zentrifugiert mit 12,000 xg während 5 Minuten und der Ueberstand getestet. Tabelle 3: Antiviraler Effekt verschiedener LeIF-Präparate gegen EMC Virus-Infektionen bei Totenkopfäffchen Serum PFU/ml Behandlung Ueberlebende Kontrolle (Bakterienproteine) Bakterielles LeIF A LeIF-Standard
Alle Affen waren männlichen Geschlechts (mittleres Gewicht 713 g) und besassen keine EMC Virus-Antikörper vor der Infektion. Die Affen wurden intramuskulär mit 100 x LD&sub5;&sub0; EMC-Virus (bestimmt an Mäusen) infiziert. Die Kontrolltiere starben 134, 158 und 164 Stunden nach der Infektion. Die Interferon-Behandlung mit 10&sup6; Einheiten erfolgte intravenös und zwar -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 und 240 Stunden nach der Infektion. Bei dem bakteriellen Leukozyteninterferon handelte es sich um eine Säulenchromatographie-Fraktion eines Lysats aus E. coli 294/pLeIF A 25 mit einer spezifischen Aktivität von 7,4 x 10&sup6; E/mg Protein. Die bei den Kontrollen verwendeten Bakterien-Proteine waren der Säulenfraktion des Lysats von E. coli 294/pBR322 bei doppelter Gesamtproteinkonzentration äquivalent. Bei dem Leukozyteninterferon-Standard handelte es sich um durch Sendai-Virus induziertes Interferon aus normalen menschlichen Zellen, das chromatographisch auf eine spezifische Aktivität von 32 x 10&sup6; E/mg Protein gereinigt war.
Die Kontrolltiere verloren das Gleichgewicht, zeigten progressive Lethargie, schlaffe Lähmung der hinteren Gliedmassen und wässerige Augen, beginnend etwa 8 Stunden vor dem Tod. Die mit Interferon behandelten Affen zeigten keine dieser Abnormalitäten; sie blieben während der gesamten Zeit aktiv und entwickelten keine Virämie. Der eine Affe der Kontrollgruppe, der innerhalb von 4 Tagen keine Virämie entwickelte, starb zuletzt (164 Stunden nach der Infektion), aber zeigte nach dem Tode hohe Virus-Titer im Herzen und Gehirn. Die Interferon-behandelten Affen entwickelten keine Antikörper gegen EMC-Viren, was 14 und 21 Tage nach der Infektion festgestellt wurde. Die Ergebnisse zeigen somit, dass der antivirale Effekt der LeIF-Präparate an den infizierten Tieren lediglich der Wirkung des Interferons zugeschrieben werden kann, da die kontaminierenden Proteine des bakteriellen und des aus Leukozyten gewonnenen Interferons völlig unterschiedlich sind. Ausserdem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass für eine in vivo antivirale Aktivität von LeIF A eine Glykosylierung nicht notwendig ist.

J. Isolierung von cDNA für weitere reife Leukozyteninterferone

DNA aus dem Plasmid, das cDNA für das vollständige LeIF A enthält, wurde mit PstI herausgeschnitten, elektrophoretisch isoliert und mit ³²P markiert. Die erhaltene radioaktiv markierte DNA wurde als Sonde für das Screening von zusätzlichen E. coli 294-Transformanten verwendet, die in der gleichen Weise, wie in Teil C beschrieben, nach der in-situ-Kolonie-Testmethode von Grunstein und Hogness (siehe oben) erhalten wurden. Die mit der Sonde hybridisierenden Kolonien wurden isoliert. Plasmid -DNA aus diesen Kolonien sowie aus den zehn hybridisierenden Kolonien, die in Teil G oben erwähnt wurden, wurden durch Behandlung mit PstI herausgeschnitten und nach drei verschiedenen Methoden charakterisiert. Zunächst wurden diese PstI-Fragmente durch die Abbauprodukte, die durch Behandlung mit den Restriktions-Endonukleasen BglII, PvuII und EcoRI entstanden, charakerisiert. Diese Analyse erlaubte die Klassifizierung von mindestens acht unterschiedlichen Typen (LeIF A, LeIF B, LeIF C, LeIF D, LeIF E, LeIF F, LeIF G und LeIF H), dargestellt in Figur 5, die einen Ueberblick über die Lage der verschiedenen Restriktionsstellen relativ zu der bis jetzt bekannten Präsequenz und der kodierenden Sequenz von LeIF A gibt. Ein Typ von diesen, LeIF D, ist anscheinend identisch mit dem von Nagata et al., Nature 284, 316-320 (1980), beschriebenen LeIF.
Zweitens wurden verschiedene DNAs mit dem von Cleveland et al. (Cell 20, 95-105 [1980]) beschriebenen Hybridisations-Selektions-Test untersucht auf ihre Fähigkeit, LeIF-mRNA selektiv von Poly-A enthaltender RNA aus KG-1 Zellen zu entfernen. In diesem Test waren LeIF A, B, C, und F positiv. Drittens wurden letztere PstI-Fragmente in Plasmide eingefügt, E. coli 294 wurde mit diesen Plasmiden transformiert und die Fragmente wurden exprimiert. Die exprimierten Produkte, von denen man annahm, dass sie Präinterferone wären, waren im CPE-Assay auf Interferon-Aktivität alle positiv, wobei das LeIF F-Fragment nur geringfügige Aktivität aufwies. Im übrigen wurden alle LeIF-Typen sequenziert.

K. Direkte Expression eines zweiten reifen Leukozyteninterferons (LeIF B)

Die Sequenz des isolierten DNA-Fragments, welches das Gen für reifes LeIF B enthält, zeigt, dass die ersten vierzehn Nukleotide für LeIF A und B identisch sind. Folglich wurde ein Fragment aus pLeIF A25, das den trp- Promotor-Operator, die Ribosomenbindungsstelle und den Beginn des LeIF A (=B)-Gens enthielt, isoliert und mit dem Rest der B-Sequenz in einem Expressions-Plasmid kombiniert. Die Restriktionskarten für die Pst- Fragmente von pL4 (ein Plasmid, enthaltend das an Pst endende LeIF B- Gen aus Figur 5) und pLeIF A 25 sind in den Figuren 7a und 7b dargestellt.
Um das etwa 950 Basenpaare lange Sau3a-PstI-Fragment aus der Sequenz, die in Figur 7a dargestellt ist, zu erhalten, waren mehrere Schritte notwendig wegen des Vorkommens weiterer, in diesem Bereich liegender Sau3a-Restriktionsstellen, nämlich:
1. Die folgenden Fragmente wurden isoliert:
a) 110 b.p aus Sau3a-EcoRI;
b) 132 b.p. aus EcoRI-Xba;
c) 700 b.p. aus Xba-Pst.
2. Die Fragmente (1a) und (1b) wurden miteinander verbunden und mit Xba und BglII behandelt, um Selbstpolymerisation über die Sau3a- und Xba- Enden zu verhindern (die entsprechende Sau3a-Spaltstelle lag innerhalb einer Bg1II-Spaltstelle; BglII-Schnitte hinterlassen ein Sau3a kohäsives Ende). Es wurde ein 242 b.p. enthaltendes Fragment isoliert.
3. Das Produkt von (2) wurde mit (1c) verbunden und mit PstI und BglII behandelt, wieder um Selbstpolymerisation zu verhindern. Ein etwa 950 b.p. enthaltendes Fragment, Sau3a-PstI von Figur 7a wurde isoliert. Dieses Fragment enthielt denjenigen Teil des LeIF B-Gens, der keine Entsprechung beim LeIF A hatte.
4. Ein etwa 300 b.p. enthaltendes Fragment (HindIII-Sau3a), das den trp-Promotor-Operator, die Ribosomenbindungsstelle, das ATG-Startsignal und den Cystein-Codon von LeIF A enthielt, wurde aus pLeIF A25 isoliert.
5. Ein etwa 3600 b.p. enthaltendes Fragment (PstI-HindIII) wurde aus pBR322 isoliert. Es enthielt das Replikon, und kodiert Tetracyclin-Resistenz, aber nicht Ampicillin-Resistenz.
6. Die Fragmente, die gemäss 3, 4 und 5 erhalten wurden, wurden miteinander verbunden und mit dem resultierenden Plasmid wurde E. coli K-12 Stamm 294 transformiert.
Die Transformanten wurden einem Minitest unterzogen (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 [1979]) und Plasmidproben wurden mit EcoRI behandelt. Der Abbau lieferte folgende drei Fragmente: 1) Ein EcoRI- EcoRI trp Promotor-Fragment; 2) das innere EcoRI-EcoRI-Fragment von pL4 und 3) das Fragment vom Translations-Startsignal bis zur EcoRI- Spaltstelle von pL4.
Im CPE-Assay zeigen Bakterienextrakte aus Klonen, die in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden, Aktivitäten von 10 x 10&sup6; Einheiten Interferon pro Liter bei A&sub5;&sub5;&sub0; = 1. Ein repräsentativer Klon, der in dieser Weise hergestellt wurde, ist E. coli 294/pLeIF B trp 7.

L. Direkte Expression weiterer reifer Leukozyteninterferone (LeIF C, D, F, H, I und J)

Weitere Genfragmente in voller Länge von anderen LeIF-Typen können geschneidert und in Vektoren eingebaut werden zwecks Expression in Analogie zu der für das LeIF A beschriebenen Weise. Durch vollständige Sequenzierung in konventioneller Weise kann festgestellt werden, ob eine Restriktionsstelle genügend nahe an dem ersten Aminosäurecodon des reifen Interferons liegt, so dass die im Teil H beschriebene Methode für die Expression von reifem LeIF A verwendet werden kann, d.h. die Eliminierung der Präsequenz durch einen Restriktionsschnitt und Ersatz der aminoendständig zusammen mit der Präsequenz verlorenen Aminosäurecodons durch Anhängen eines synthetischen DNA-Fragments. Sollte dies nicht der Fall sein, so kann die folgende Methode angewandt werden. Hierbei wird das die Präsequenz kodierende Fragment präzis an der Stelle abgetrennt, an der der Codon für die erste Aminosäure des reifen Polypeptids beginnt, und zwar dadurch, dass
1. in der Umgebung dieses Punktes die doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA übergeführt wird;
2. die im Schritt (a) gebildete einzelsträngige Region mit einer komplementären Starter-Sequenz einer einzelsträngigen DNA hybridisiert wird, deren 5'-Ende gegenüber dem Nukleotid liegt, das an die beabsichtigte Spaltstelle grenzt;
3. derjenige Teil des in 3'-Richtung des Starters liegenden zweiten Stranges, der in Schritt 1 eliminert wurde, durch Umsetzung mit DNA- Polymerase in Gegenwart von Adenin-, Thymin-, Guanin- und Cytosinhaltigen Deoxynukleotidtriphosphaten wiederhergestellt wird und
4. die verbleibende einzelsträngige DNA-Sequenz, die über die beabsichtigte Spaltstelle hinausreicht, abgebaut wird.
Eine kurze synthetische DNA-Sequenz, die am 3'-Ende des kodierenden Stranges mit dem Translations-Startsignal ATG endet, kann dann verbunden werden, z.B. über stumpfe Enden, mit dem zurechtgeschnittenen Gen für die reifen Interferone und die Gene können in ein Plasmid eingefügt und unter die Kontrolle eines Promotors und seiner zugehörigen Ribosomenbindungsstelle gebracht werden.
In ähnlicher Weise, wie es in Abschnitt K oben beschrieben ist, wurden Genfragmente, die für LeIF C und LeIF D kodieren, aufgebaut, zwecks direkter Expression in Bakterien. Bei der Strategie, die zur Expression dieser weiteren Leukozyteninterferone führte, wurde in jedem Falle auf das etwa 300 Basenpaare-enthaltende Fragment (HindIII-Sau3a), das den trp- Promotor-Operator, die Ribosomenbindungsstelle, das ATG Startsignal und den Cystein-Codon von LeIF A aus pLeIF A25 enthielt, zurückgegriffen. Dieses Fragment wurde kombiniert mit den Fragmenten anderer Interferone, die die entsprechenden Aminosäursequenzen, die auf den allen gemeinsamen Cysteinrest folgen, kodieren. Jedes erhaltene Plasmid wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 verwendet. Die Ligierungen für die einzelnen Gene waren wie folgt:

LeIF C

Isolierung der folgenden Fragmente aus pLeIF C:
(a) ein 35 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau3a - Sau96;
(b) ein mehr als 900 Basenpaare-enthaltendes Fragment Sau96 - PstI;
(c) Isolierung eines etwa 300 Basenpaare-enthaltenden Fragments Hind III - Sau3a) aus pLeIF A-25, wie in Teil K (4) oben, beschrieben;
(d) Isolierung des etwa 3600 Basenpaare-enthaltenden Fragments aus Abschnitt K (5) oben.

Konstruktion:

(1) Verbindung von (a) mit (c). Spaltung mit BglII, HindIII und Isolierung des etwa 335 Basenpaare-enthaltenden Produktes.
(2) Dreifach-Verbindung von (1), (b) und (d) und Transformation von E. coli mit dem resultierenden Plasmid.
Ein repräsentativer Klon der auf diese Weise erhalten wurde, ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF C trp 35.

LeIF D

Aus pLeIF D wurden isoliert:
a) 35 Basenpaare von Sau3a-AvaII;
b) 150 Basenpaare von AvaII-BglII und
c) etwa 700 Basenpaare von BglII-PstI.
Aus pLeIF A25 wurden isoliert:
d) 300 Basenpaare von HindIII-Sau3a:
Aus pBR322 wurden isoliert:
e) etwa 3600 Basenpaare von HindIII-PstI.

Konstruktion

(1) Verbindung von (a) mit (b), Spaltung mit BglII und Reinigung eines 185 Basenpaare-enthaltenden Produkts (1).
(2) Verbindung von (1) mit (d), Spaltung mit HindIII und BglII und Reinigung des etwa 500 Basenpaare enthaltenden Produkts (2).
(3) Verbindung der Fragmente (2), (c) und (e) miteinander und Transformation von E. coli mit dem erhaltenen Plasmid.
Ein in dieser Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF D trp 11.

LeIF F

Bei der Konstruktion eines vollständigen LeIF F Gens und der direkten Expression des entsprechenden Interferons kann man sich die Homologie der Aminosäuren 1-13 zwischen LeIF B und LeIF zunutze machen. Ein den trp Promotor enthaltendes Fragment (a) mit geeignet konstruierten Enden wird aus pHGH207 erhalten, das oben beschrieben ist, über die Behandlung mit PstI und XbaI und anschliessende Isolierung eines ca. 1050 Basenpaare-enthaltenden Fragments. Ein zweites Fragment (b) steht in dem grösseren der beiden durch Behandlung des Plasmids pHKY 10 mit PstI und BglII entstandenen Fragmente zur Verfügung. Das Fragment (a) enthält etwa das halbe die Ampicillinresistenz kodierende Gen; Fragment (b) enthält den Rest dieses Gens und das vollständige Gen für die Tetracyclinresistenz bis auf den zugehörigen Promotor. Die Fragmente (a) und (b) werden mittels T4 Ligase kombiniert und das erhaltene Produkt wird mit XbaI und BglII behandelt, um Dimerisierungen auszuschliessen. So entsteht das Fragment (c), welches den trp Promotor-Operator, sowie die Gene für die Tetracyclin- und Ampicillinresistenz enthält.
Ein Fragment (d) mit etwa 580 Basenpaaren wird durch Behandlung von pLeIF F mit AvaII und BglII erhalten. Dieses Fragment enthält die Codons für die Aminosäuren 14-166 von LeIF F.
Ein Fragment (e) (49 Basenpaare) wird durch Behandlung von pLeIF B mit XbaI und AvaII erhalten. Dieses Fragment kodiert die Aminosäuren 1- 13 von LeIF F.
Die Fragmente (c), (d) und (e) werden in Gegenwart von T4 Ligase miteinander verbunden. Die kohäsiven Enden der entsprechenden Fragmente sind so beschaffen, dass das entstehende Plasmid in der richtigen Weise gebildet wird, wobei das Gen für Tetracyclinresistenz unter die Kontrolle des trp Promotor-Operators gebracht wird, zusammen mit dem Gen für reifes LeIF F, so dass die damit transformierten Bakterien auf Grund ihrer Tetracyclin-Resistenz selektioniert werden können. Ein auf diese Weise erhaltener repräsentativer Klon ist E. coli K-12 Stamm 294/pLeIF F trp 1.

LeIF H

Das für die Expression von reifem LeIF H geeignete Gen kann folgendermassen hergestellt werden:
1. Plasmid pLeIF H wird der Behandlung mit HaeII und RsaI unterworfen und ein 816 Basenpaare-enthaltendes Fragment wird isoliert, welches den Bereich von der Aminosäure 10 des Signalpeptids bis zur 3' nicht-kodierenden Region kodiert.
2. Das Fragment wird denaturiert und der Reparatursynthese mit dem Klenow-Fragment der DNA Polymerase I (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 65, 168 [1970]) unterworfen, bei der der synthetische Deoxyribooligonucleotid-Starter 5'-dATG TGT AAT CTG TCT verwendet wird.
3. Das erhaltene Produkt wird mit Sau3a gespalten und ein 452 Basenpaare-enthaltendes Fragment, das die Aminosäuren 1-150 kodiert, wird isoliert.
4. Die Behandlung von pLeIF H mit Sau3a und PstI und die Isolierung eines 500 Basenpaare-enthaltenden Fragments führt zu einem Gen, das die Aminosäuren 150 bis zum Ende der Sequenz kodiert.
5. Die in (3) und (4) isolierten Fragmente werden verbunden zu dem folgenden Fragment
das die 166 Aminosäuren des LeIF H kodiert.
6. pLeIF A trp 25 wird zunächst mit XbaI, dann mit DNA Polymerase I und schliesslich mit PstI behandelt. Das resultierende grosse Fragment kann isoliert und mit dem Produkt aus (5) verbunden werden zu einem Plasmid, mit dem E. coli K-12 Stamm 294 oder ein anderes Bakterium transformiert werden kann, das dann in der Lage ist, reifes LeIF H zu exprimieren.

LeIF I

Die von Lawn et al., Cell 15, 1157 (1978), konstruierte Genbibliothek des menschlichen Genoms im Phagen λ Charon 4A wurde nach Leukozyteninterferon-Genen untersucht, wobei die von Lawn et al. (siehe oben) und Maniatis et al., Cell 15, 687 (1978), angegebenen Verfahren verwendet wurden. Eine von der cDNA des LeIF A-Klons abgeleitete radioaktive LeIF- Sonde wurde verwendet, um etwa 500,000 Plaques zu testen. Sechs genomische LeIF-Klone wurden bei diesem Screening erhalten. Nach nochmaligem Screening und Plaque-Reinigung wurde einer dieser Klone, λHLeIF2, für die weitere Analyse ausgewählt.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Methode können andere Sonden verwendet werden, um weitere pLeIF-Klone aus dem menschlichen Genom zu isolieren. Diese wiederum können verwendet werden, um weitere Leukozyteninterferon-Proteine gemäss der vorliegenden Erfindung herzustellen.
1. Das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment des Klons λ HLeIF2 wurde an der EcoRI-Spaltstelle in pBR325 kloniert. Das resultierende Plasmid LeIF I wurde mit EcoRI gespalten und das 2000 Basenpaare-enthaltende Fragment isoliert. Das Deoxyoligonukleotid dAATTCTGCAG (ein EcoRI - PstI-Konverter) wurde an das 2000 Basenpaare-enthaltende EcoRI-Fragment gebunden und das resultierende Fragment mit PstI gespalten, so dass man ein 2000 Basenpaare- enthaltendes Fragment mit PstI-Enden erhielt. Dieses wurde mit Sau96 gespalten und ein Fragment aus 1100 Basenpaaren wurde isoliert, welches ein PstI- und ein Sau96-Ende besass.
2. Das Plasmid pLeIF C trp 35 wurde mit PstI und XbaI behandelt. Das grosse Fragment wurde isoliert.
3. Das kleine XbaI - PstI-Fragment aus pLeIF C trp 35 wurde mit XbaI und Sau96 behandelt. Ein 40 Basenpaare-enthaltendes XbI-Sau96-Fragment wurde isoliert.
4. Die unter (1), (2) und (3) isolierten Fragmente wurden verbunden zu dem Plasmid pLeIF I trp 1.

LeIF J

1. Das Plasmid pLeIF J enthält ein aus 3800 Basen bestehendes HindIII-Fragment menschlicher genomischer DNA, welches die LeIF J Gensequenz umfasst. Ein 760 Basenpaare-enthaltendes DdeI - RsaI- Fragment wurde aus diesem Plasmid isoliert.
2. Das Plasmid pLeIF B trp 7 wurde mit HindIII und DdeI gespalten und ein 340 Basenpaare-enthaltendes HindIII-DdeI-Fragment isoliert.
3. Das Plasmid pBR322 wurde mit PstI gespalten, die Enden wurden abgespalten durch Inkubation mit DNA-Polymerase I (Klenow Fragment) und schliesslich wurde mit HindIII behandelt. Das grosse (etwa 3600 Basenpaare-enthaltende) Fragment wurde isoliert.
4. Die Fragmente aus (1), (2) und (3) wurden miteinander verbunden zu dem Plasmid pLeIF J trp 1.

M. Reinigung

Der Leukozyteninterferon-Gehalt von Bakterienextrakten kann durch die folgenden Massnahmen in der angegebenen Reihenfolge erhöht werden:
1. Polyethyleniminfällung, bei der der grösste Teil der cellulären Proteine, einschliesslich des Interferons, im Ueberstand verbleibt.
2. Amoniumsulfatfraktionierung, wobei das Interferon bei einer Sättigung von 55% mit Ammoniumsulfat aus der Lösung ausfällt.
3. Suspendierung des Ammoniumsulfatkuchens in 0,06 M Kaliumphosphat, 10 mM Tris-HCl (pH 7,2) und Dialyse gegen 25 mM Tris- HCl (pH 7,9) (die Interferonaktivität bleibt in der Lösung).
4. Chromatographie des Ueberstandes, auf ein pH von 8,5 eingestellt, an einer DEAE-Cellulose-Säule (Elution mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,2 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 8,5).
5. Adsorption an Cibachrom Blau-Agarose bzw. Hydroxylapatit und Elution mit 1,5 M KCl bzw. 0,2 M Phosphatlösung (fakultativ).
6. Fraktionierung an einer Sephadex G-75 Säule.
7. Kationenaustauschchromatographie an CM-Cellulose in 25 mM Ammoniumacetat bei pH 5,0 mit einem Ammoniumacetatgradienten (bis zu 0,2 M Ammoniumacetat).
Nach dem vorstehend angegebenen Verfahren erhält man ein Material von einer Reinheit mit > 95%.
Das Material kann auch gereinigt werden durch Grössenausschluss- Chromatographie, HPLC an umgekehrten Phasen (RP-8) oder Affinitätschromatographie an immobilisierten Antiinterferon-Antikörpern.
Alternativ kann das nach Absatz 4 oben erhaltene Material auf eine Säule monoklonaler Antikörper gebracht werden, die, wie von Milstein in Scientific American 243, 66 (1980) beschrieben, hergestellt wird und mit 0,2 M Essigsäure, 0,1% Triton und 0,15 M NaCl eluiert wird.
In einem anderen, bevorzugten Verfahren kann das mittels vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltene Interferon folgendermassen gereinigt werden:
1. Gefrorenes Zellmaterial, enthaltend das exprimierte Leukozyteninterferon, wird mechanisch zerkleinert. Die teilweise aufgetauten Zellen werden in dem vierfachen Volumen des Puffers A, enthaltend 0,1 M Tris (pH 7, 5-8, 0), 10% (w/v) Saccharose, 0,2 M NaCl, 5mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 10-100 mM MgCl&sub2;, suspendiert. Die Suspension wird bei 4ºC gehalten. Die Suspension wird zuerst bei einem Druck von etwa 6000 psi und dann nochmals bei einem Druck von weniger als 1000 psi durch einen Homogenisator gegeben. Die Suspension aus dem Homogenisator aus beiden Passagen wird in einem Eisbad gekühlt.
2. Dem Homogenisat wird langsam Polyethylenimin bis zu einer Konzentration von etwa 0,35% zugesetzt. Das Gemisch wird stehengelassen und die Feststoffe werden durch Zentrifugieren und Filtration getrennt. Bei diesem Schritt wird die Temperatur kontrolliert oder dieser Schritt wird genügend schnell durchgeführt, so dass der Ueberstand (das Filtrat) unter 10º C gehalten wird. Der Ueberstand (das Filtrat) wird durch Ultrafiltration auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens konzentriert. Die Lösung wird notfalls noch einmal durch eine mikroporöse Membran filtriert, um Teilchen und Unklarheiten im Rückstand zu entfernen.
3. Die klare Lösung wird direkt auf eine Säule monoklonaler Antikörper bei einer Durchflussrate von 5-8 cm/Stunde (z.B. 25-40 ml pro Stunde auf einer Säule mit einem Säulendurchmesser von 2,6 cm) gegeben. Nach der Beladung wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 - 8,5, 0,5 M NaCl und 0,2% eines Detergenz, wie Triton X-100 enthält, gewaschen. Anschliessend wird mit dem etwa zehnfachen Säulenvolumen einer Lösung, die 0,15 M NaCl und 0,1% eines Detergenzes, wie Triton X-100, oder ein Aequivalent davon enthält, gespült. Die Säule wird dann mit 0,2 M Essigsäure, enthaltend ein Detergenz, wie Triton X-100 (0,1%), eluiert. Der proteinhaltige Peak der Antikörpersäule (bestimmt durch UV-Absorption und andere geeignete Testverfahren) wird zusammengefasst und mit 1 N NaOH oder 1,0 M Tris- Base auf einen pH von etwa 4,5 gebracht.
4. Der gesammelte Protein-Peak wird dann auf einen Kationenaustauscher, beispielsweise Whatmann CM52-Cellulose oder ein Aequivalent davon, die vorher mit einem geeigneten Puffer, beispielsweise Ammoniumacetat pH 4,5 (50 mM), äquilibriert wurden, gebracht. Es wird dann mit dem Puffer so lange gewaschen, bis die UV-Absorption im Eluat konstant ist. Die Säule wird dann mit 25 mM Ammoniumacetat / 0,12 M Natriumchlorid oder einer Kombination, die das Wiederauffinden des Interferons optimiert und einen lyophilisierten Kuchen mit zufriedenstellender Erscheinung und zufriedenstellenden Lösungseigenschaften gewährleistet, eluiert.
Die in der bevorzugten Ausführungsform verwendeten monoklonalen Antikörper können nach dem von Staehelin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1848-52 (1981) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Die Reinigung und Bindung der monoklonalen Antikörper an Affigel-10 wird im folgenden beschrieben.

Gewinnung und Reinigung monoklonaler Antikörper aus Aszites- Flüssigkeit

Fünf weibliche Balb/c Mäuse wurden jeweils mit 5-10 x 10&sup6; Hybriddomzellen aus der Mitte der logarithmischen Wachstumsphase inokuliert. Weitere Mäuse (10 oder mehr) wurden jeweils mit 5 x 10&sup6; lebensfähigen Zellen, die aus der von inokulierten Mäusen hergestellten Flüssigkeit gewonnen wurden, intraperitoneal inokuliert. Die Aszites-Flüssigkeit jeder Maus wurde wiederholt gesammelt (2-4 mal). Bis zu drei Uebertragungen und Sammlungen können von einer Mäusegruppe zur nächsten Gruppe durchgeführt werden. Die Aszites-Flüssigkeit der Mäuse von jeder Uebertragung wurde gesammelt.
Die Flüssigkeit wurde zunächst 15 Minuten bei niedriger Umdrehungszahl (500-1000 x g) zentrifugiert um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen und dann 90 Minuten mit 18'000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Ueberstand wurde gefroren und bei -20ºC aufbewahrt. Nach dem Auftauen wurde weiteres festes Material durch 90 minütiges Zentrifugieren mit 35'000 Umdrehungen pro Minute entfernt. Die von jedem Transfer erhaltenen einzelnen Batches wurden auf spezifische Antikörperaktivität nach einem Festphasenantikörperbindungstest (Staehelin et al., siehe oben) getestet und, wenn als zufriedenstellend befunden, zusammengefasst.
Die Proteinkonzentrationen der Lösungen wurden annäherungsweise bestimmt, wobei man davon ausging, dass 1 mg Protein eine Absorption von 1,2 bei 280 nm in einer 1 cm-Küvette lieferte. Aszites-Flüssigkeiten mit einem hohen Antikörpergehalt enthalten 30-35 mg Protein/ml. Dies entspricht etwa 4-7 mg spezifischem Antikörper/ml. Die Flüssigkeit wurde verdünnt mit PBS (0,01 M Natriumphosphat, pH 7,3, 0,15 M NaCl) auf eine Proteinkonzentration von 10-12 mg/ml.
Zu je 100 ml der verdünnten Lösungen wurden bei 0ºC unter starkem Rühren langsam 90 ml von bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung gegeben. Die Suspension wurde während 40-60 Minuten in Eis aufbewahrt, dann während 15 Minuten bei 4º C mit 10,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert. Der Ueberstand wurde dekantiert. Der Proteinkuchen wurde in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9) / 0,04 M NaCl (Puffer I) gelöst und die Proteinlösung während 16-18 Stunden bei Raumtemperatur gegen 100 Volumina des Puffers I dialysiert, während dessen wenigstens ein Pufferwechsel stattfand. Die dialysierte Lösung wurde 10 Minuten mit 15,000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, um nicht-gelöstes Material zu entfernen. Etwa 30-35% des ursprünglichen Gesamtproteingehalts der Aszites-Flüssigkeit wurde mittels Messung der Absorption bei 280 nm wiedergefunden.
Diese Lösung, enthaltend 30-40 mg Protein/ml, wurde dann auf eine DEAE-Cellulosesäule, die mit Puffer I äquilibriert war, gegeben, wobei für jeweils 1 g Protein mindestens ein Säulenvolumen von 100 ml verwendet wurde. Der Antikörper wurde von der Säule mit einem linearen NaCl- Gradienten von 0,04 M - 0,5 M in 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9) eluiert. Die Fraktionen mit einem NaCl-Gehalt von 0,06 - 0,1 M wurden zusammengefasst, mittels Fällung mit einem gleichen Volumen bei Zimmertemperatur gesättigter Ammoniumsulfatlösung konzentriert und zentrifugiert. Die Proteinkuchen wurden in 0,2 M NaHCO&sub3; (pH etwa 8,0) / 0,3 M NaCl (Puffer II) gelöst und bei Raumtemperatur gegen diesen dreimal gewechselten Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde 15 Minuten lang mit 20,000 x g zentrifugiert, um nicht-gelöstes Material zu entfernen. Der Proteingehalt wurde auf 20-25 mg/ml mit Puffer II eingestellt.

Herstellung von Immunadsorbentien

Affigel-10 (BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornien) wurde auf einem gesinterten Glasfilter dreimal mit eiskaltem Isopropanol und dreimal mit eiskaltem destilliertem Wasser gewaschen. Das Gel (ungefähr 50% in kaltem Wasser) wurde in Plastikröhrchen übergeführt und durch kurzes Zentrifugieren sedimentiert. Der Ueberstand wurde verdunstet. Das gepackte Gel wurde mit einem gleichen Volumen gereinigter Antikörperlösung gemischt und während 5 Stunden bei 4º C Ende-über- Ende rotieren gelassen. Nach der Reaktion wurde das Gel zentrifugiert und zweimal mit Puffer III (0,1 M NaHCO&sub3;/0,15 M NaCl) gewaschen, um nichtgebundene Antikörper zu entfernen. Die Proteinbestimmung der vereinten Waschfraktionen zeigte, dass mehr als 90% des Antikörpers an das Gel gebunden worden war.
Um noch freie, reaktive Bindungsstellen abzusättigen wurde das Gel mit einem gleichen Volumen 0,1 M Ethanolamin HCl (pH 8) gemischt und während 60 Minuten bei Raumtemperatur Ende-über-Ende rotieren gelassen. Schliesslich wurde das Gel mit PBS gewaschen und bei 4ºC in PBS in Gegenwart von 0,02% (w/v) Natriumazid aufbewahrt.

N. Parenterale Applikation

LeIF kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine Antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an solche, die immunsuppresive Zustände aufweisen. Die Dosierung kann sich an die des zur Zeit in klinischer Prüfung befindlichen, von Menschen abstammenden Materials anlehnen und kann z.B. etwa (1-10) x 10&sup6; Einheiten pro Tag, im Fall von Material mit einer Reinheit, die grosser ist als 1%, bis zu etwa 5 x 10&sup7; Einheiten pro Tag, betragen.
Ein für die parenterale Applikation geeignetes, im wesentlichen homogenes bakterielles LeIF kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man 3 mg bakteriell hergestelltes LeIF mit einer spezifischen Aktivität von etwa 2 x 10&sup8; Einheiten pro mg in 25 ml 5 N humanem Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 x 10&sup6; Einheiten reines Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20ºC) aufbewahrt.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können nach allgemein bekannten Methoden formuliert werden, um pharmazeutisch nützliche Präparate herzustellen, wobei das Polypeptid mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial gemischt wird. Geeignete Träger und ihre Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences von E.W. Martin beschrieben, welches hiermit durch Referenz eingeschlossen wird. Solche Präparate werden eine wirksame Menge des erfindungsgemässen Interferon Proteins zusammen mit einer geeigneten Menge an Träger enthalten, um pharmazeutisch verträgliche Präparate zur wirksamen Verabreichung an einen Wirt herzustellen. Eine bevorzugte Applikation ist die parenterale Applikation.

Claims

1. Ein reifes menschliches, bakteriell hergestelltes Leukozyteninterferon, dadurch gekennzeichnet, dass es aus 165-166 Aminosäuren besteht und Cys- Asp-Leu oder Cys-Asn-Leu an den Stellen 1, 2 und 3 enthält und derartiges reifes Leukozyteninterferon mit einem zusätzlichen Methioninrest am Aminoende.

2. Ein Interferon gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es aus 165 Aminosäuren mit Cys-Asp-Leu an den Stellen 1, 2 und 3 und Asp an der Stelle 114 oder aus 166 Aminosäuren mit Cys-Asp-Leu oder Cys-Asn-Leu an den Stellen 1, 2 und 3 und Glu oder Val an der Stelle 114 besteht.

3. Ein Interferon gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es aus 166 Aminosäuren mit Met an Stelle 1, Cys-Asp-Leu an den Stellen 2, 3 und 4 und Asp an der Stelle 115 oder aus 167 Aminosäuren mit Met an Stelle 1, Cys-Asp-Leu oder Cys-Asn-Leu an den Stellen 2, 3 und 4 und Glu oder Val an der Stelle 115 besteht.

4. Ein Interferon gemäss einem der Ansprüche 1 - 3, das die Aminopartialsequenz Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser enthält.

5. Ein Interferon gemäss einem der Ansprüche 1 - 4, dessen Sequenz die in Figur 4 in der Sequenz "All" angegebenen Aminosäuren von den Stellen 1-166 einschliesst.

6. Reifes menschliches Leukozyteninterferon B (LeIF B), gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz

7. Reifes menschliches Leukozyteninterferon C (LeIF C), gekennzeichnet durch die Amionsäuresequenz

8. Reifes menschliches Leukozyteninterferon D (LeIF D), gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz

9. Reifes menschliches Leukozyteninterferon F (LeIF F), gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz

10. Reifes menschliches Leukozyteninterferon H (LeIF H), gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz

11. Reifes menschliches Leukozyteninterferon I (LeIF I), gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz

12. Reifes menschliches Leukozyteninterferon J (LeIF J), gekennzeichnet durch die Aminosäuresequenz

13. Ein menschliches Leukozyteninterferon gekennzeichnet durch eine Aminosäuresequenz gemäss einem der Ansprüche 6 - 12 mit einem zusätzlichen Methioninrest am Aminoende.

14. Ein bakteriell hergestelltes menschliches Leukozyteninterferon gemäss einem der Ansprüche 1 - 13.

15. Ein durch E. coli hergestelltes menschliches Leukozyteninterferon gemäss einem der Ansprüche 1 - 13.

16. Eine DNA-Sequenz, die für ein menschliches Leukozyteninterferon gemäss einem der Ansprüche 1 - 13 kodiert.

17. Eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der Sequenzen B, C, D, F und H der Figur 3.

18. Eine DNA-Sequenz aus der Gruppe der Sequenzen C, H, I und J der Figur 8.

19. Eine DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 16 - 18, die operabel verbunden ist mit einer DNA-Sequenz, die die Expression eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1 - 13 in einem Bakterium bewirken kann.

20. Eine DNA-Sequenz gemäss einem der Ansprüche 16 - 18, die operabel verbunden ist mit einer DNA-Sequenz, die die Expression eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1 - 13 in E. coli bewirken kann.

21. Ein replikables Expressionsvehikel, das in einem transformierten Bakterium ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1 - 13 zur Expression bringen kann.

22. Ein replikables Expressionsvehikel, das in einem transformierten E.coli Stamm ein Polypeptid gemäss einem der Ansprüche 1 - 13 zur Expression bringen kann.

23. Ein replikables Expressionsvehikel gemäss einem der Ansprüche 21 oder 22, das ein Plasmid ist.

24. Plasmid pLeIF B trp 7, enthaltend den E. coli trp Promotor und, unter der Kontrolle des besagten Promotors, die Nukleotidsequenz, welche für LeIF B kodiert.

25. Plasmid pLeIF F trp 1, enthaltend den E. coli trp Promotor und, unter der Kontrolle des besagten Promotors, die Nukleotidsequenz, welche für LeIF F kodiert.

26. Plasmid pLeIF C trp 35, enthaltend den E. coli trp Promotor und, unter der Kontrolle des besagten Promotors, die Nukleotidsequenz, welche für LeIF C kodiert.

27. Plasmid pLeIF D trp 11, enthaltend den E. coli trp Promotor und, unter der Kontrolle des besagten Promotors, die Nukleotidsequenz, welche für LeIF D kodiert.

28. Plasmid pLeIF H, enthaltend den E. coli trp Promotor und, unter der Kontrolle des besagten Promotors, die Nukleotidsequenz, welche für LeIF H kodiert.

29. Plasmid pLeIF I trp 1, enthaltend den E. coli trp Promotor und, unter der Kontrolle des besagten Promotors, die Nukleotidsequenz, welche für LeIF I kodiert.

30. Plasmid pLeIF J trp 1, enthaltend den E. coli trp Promotor und, unter der Kontrolle des besagten Promotors, die Nukleotidsequenz, welche für LeIF J kodiert.

31. Ein Bakterium, das mit einem Vehikel gemäss einem der Ansprüche 21 - 30 transformiert ist.

32. Ein E. coli Stamm, der mit einem Expressionsvehikel gemäss einem der Ansprüche 21 - 30 transformiert ist.

33. E. coli K-12 Stamm 294, transformiert mit einem Expressionsvehikel gemäss einem der Ansprüche 21 - 30.

34. Eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines reifen menschlichen Leukozyteninterferons gemäss einem der Ansprüche 1 - 13 und ein für pharmazeutische Verabreichung geeignetes Trägermaterial.

35. Eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 34 für parenterale Verabreichung.

36. Die Verwendung von Verbindungen gemäss einem der Ansprüche 1 - 13 zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen.

37. Die Verwendung von DNA-Sequenzen gemäss einem der Ansprüche 16-20 zur mikrobiellen Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 - 13.

38. Die Verwendung eines Expressionsvehikels gemäss einem der Ansprüche 21 - 30 zur bakteriellen Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 - 13.

39. Die Verwendung eines Bakteriums gemäss einem der Ansprüche 31 - 33 zur Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 - 13.

40. Die Verbindungen gemäss den Ansprüchen 1 - 13 zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren und viralen Infektionen und bei der Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die für derartige Behandlungen geeignet sind.

41. Die DNA-Sequenzen gemäss den Ansprüchen 16-20 zur Verwendung bei der mikrobiellen Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 - 13.

42. Ein Expressionsvehikel gemäss einem der Ansprüche 21 - 30 zur Verwendung bei der bakteriellen Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 - 13.

43. Ein Bakterium gemäss einem der Ansprüche 31 - 33 zur Verwendung bei der Herstellung einer Verbindung gemäss einem der Ansprüche 1 - 13.

44. Ein Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Leukozyteninterferons gemäss einem der Ansprüche 1 - 13, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Kultur eines Bakteriums, das mit einem zur Expression eines solchen Polypeptids befähigten replikablen Expressionsvehikel transformiert ist, aufwachsen und besagtes Polypeptid exprimieren lässt und besagtes Polypeptid gewinnt.

45. Ein Verfahren zur Herstellung von Bakterien, die zur Expression eines menschlichen Leukozyteninterferons gemäss einem der Ansprüche 1 - 13 fähig sind, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Bakterium mit einem die Expression besagten Polypeptids bewirkenden, replikablen Expressionsvehikel transformiert und die transformierten Bakterien kultiviert.

46. Ein Verfahren zur Herstellung eines replikablen, in einem transformierten Bakterium die Expression eines menschlichen Leukozyteninterferons gemäss einem der Ansprüche 1 -13 bewirkenden Expressionsvehikels, dadurch gekennzeichnet, dass man eine besagtes Polypeptid kodierende erste DNA-Sequenz konstruiert und besagte erste DNA-Sequenz operabel mit einer zweiten, die bakterielle Expression besagten Polypeptids bewirkenden DNA-Sequenz verbindet.