PL148261B1 - Method of obtaining microorganisms capable to produce mature interferon of human leucocytes - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania drobnoustrojów zdolnych do wytwarza¬ nia dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich, zawierajecego 165-166 aminokwasów lub w przypadku gdy metionina jest przyleczona do N-konca pierwszego aminokwasu tego interferonu, 166 - 167 aminokwasów oraz czesciowa sekwencje aminokwasowa Cys-Ala-Trp- Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser, jak wskazano na fig. 4 lub fig. 9 w pozycji od 139 do 151.Interferon leukocytów ludzkich /LelF/ zostal po raz pierwszy odkryty i otrzymany w postaci surowych osadów przez Isaacs#a i Lindenmanna /Proc. R.Soc, B 147, 258 - 267 /1957/. Od tego czasu podjeto wysilki majace na celu oczyszczenie i scharakteryzowanie tego materialu, co doprowadzilo do otrzymania wzglednie Jednorodnych interferonów leukocytów ludzkich pochodzacych od zdrowych lub chorych na bialaczke dawców leukocytów /opia patentowy RFN nr DOS 2 947 134/. Interferony te tworza rodzine bialek znanych z tego, ze posiadaja, zdolnosc nadawania komórkom docelowym stanu opornosci na wirusy.Oprócz tego, interferon moze hamowac namnazanie sie komórek i wplywac na odpowiedz immunologiczne. Wlasciwosci te sklaniaje do klinicznego uzywania interferonu leukocytów jako srodka leczniczego do leczenia zakazen wirusowych i chorób nowotworowych.Interferony leukocytów oczyszczone do istotnej jednorodnosci /Rubinstein i inni.Proc. Natl. Acad. Sci.t USA, 76, 640 - 644 /1979/j Zoon i inni, lbod., 76, 5601 - 5603 /1979/, a ich ciezar czasteczkowy zawiera sie w granicach od okolo 17 500 do okolo 21 000. Aktywnosc wlasciwa tych preparatów Jest nadzwyczaj wysoka i wynosi 2 x 10 do 1 x 10 jednostek/mg bialka, ale ich wydajnosc z hodowli komórkowych jest zniechecajaco niska. Tym nie nniej, postepy w metodach ustalania sekwencji bialek pozwolily na usta¬ lenie czesciowej sekwencji aminokwasów /Zoon i wsp., Science, 207, 527 /1980/| Levy i wsp.# Proc* Natl. Acad. Sci., USA, 77, 5102 - 5104 /1980/. Wyjasnienie sprawy glikozy- lacji róznych interferonów leukocytów nie jest dotychczas calkowite, ale obecnie wiado¬ mo, ze róznice w glikozylacji wsród bialek tej rodziny nie wynikaja tylko ze spektrum zaobserwowanych ciezarów czesteczkowych. Natomiast interferony leukocytów róznie sie2 148 261 znacznie w skladzie amlnokwasowym 1 sekwencji, • homologia aminokwasów jest w niektórych przypadkach mniejsza niz 80%* Chociaz Izolowanie z leukocytów dawców zapewnilo dostateczna Ilosc materialu do c esciowej charakteryzacji i ograniczonych badan klinicznych hemogennego Interferonu leukocytów. Jest to zupelnie niewystarczajece zródlo interferonu w ilosciach niezbednych do badan klinicznych na wielka, skale, a nastepnie szerokiego stosowania zapo¬ biegawczego i/lub leczniczego* I rzeczywiscie, badacze kliniczni stosujecy obecnie w bada¬ niach aktywnosci przeciwnowotworowej i przeciwwirueowej Interferony otrzymane z ludzkich leukocytów byli ograniczeni do surowych /<1% czystosci/ preparatów tego materialu, a dlugi czas wytwarzania odpowiednich ilosci, nawet przy nierealistycznym poziomie cen, krytycznie opóznial badania na duze skale* Wraz z opracowaniem technologii rekombinantowego ONA, stalo sie Jednak mozliwe kontrolowane wytwarzanie wielu róznorodnych uzytecznych polipeptydów, przy uzyciu drobno¬ ustrojów* Obecnie dostepne se bakterie modyfikowane przy uzyciu tej technologii umozliwiaje- ce wytwarzanie produktów polipeptydowych, takich Jak somatostatyna,lancuch A i B Insuliny ludzkiej i ludzki hormon wzrostu /Itakura 1 inni. Science, 198. 1056 - 1063 /1977/, Goedel 1 .inni. Nature 281, 544 - 548 /1979/* Ostatnio uzyto technik rekombinantowego ONA w przypadku tworzenia przez bakterie prolnsuliny i tymozyny *& 1, a szereg autorów donioslo o otrzymaniu ONA kodujecego interferon leukocytów ludzkich 1 uzyskaniu bialek o aktywnosci interferonu leukocytów /Nagata i inni. Nature, 284, 316 - 320 /1980/, Mantei i inni, Gene, 10, 1-10 /1980/, Taniguchl 1 inni. Natura, 285, 547 - 549 /1980/* Jednak wszystkie te wymienione publikacje lecznie opisuje klonowanie plazmidu zawierajecego wstawke genetyczne, kodujece wytwarzanie Jedynie prekursorów interferonu leuko¬ cytów* W publikacji Nagata i wsp* opisano wyodrebnianie plazmidu E.coli, zawierajecego gen Interferonu leukocytów* Wskazano w niej, ze komórki E.coli transformowane tym plazmidem wytwarzaje w wyniku ekspresji pollpeptyd o aktywnosci biologicznej interferonu* Przyznano Jednak, ze powstajecy w wyniku ekspresji pollpeptyd moze nie byc dojrzalym interferonem leuko¬ cytów ludzkich, to Jest, ze pollpeptyd powstajecy w wyniku ekspresji moze zawierac presek- wencje nie wystepujece w postaci dojrzalego interferonu.W publikacji tej, na przelomie stron 319 i 320 stwierdzono: "Mozliwe Jest takze, ze E*coli IF sklada sie z sekwencji Le-IF poprzedzonej sekwencje sygnalowe, gdyz analiza sekwen¬ cji nukleotydowej klonowanego IF cONA ujawnila obszar kodujecy 22 aminokwasy, wystepujecy za pierwszym AUG 1 poprzedzajecy obszar kodujecy dojrzaly IF /M.Schwarzstein, N*Mantei i M*S*, wyniki niepublikowane1** Wspomniana publikacja Mantei i wsp* opisuje sekwencjonowanie nukleotydu genu leuko¬ cytu klonowanego przez Nagata i wsp* i potwierdza, ze obszar kodujecy genu rzeczywiscie za¬ wiera sekwencje, kodujece bialko sygnalowe* W podsumowaniu w publikacji tej stwierdzono: "Wstawka z 910 par zasad zawiera sekwencje kodujece z 567 /lub 543/ par zasad, okreslajece domniemany pollpeptyd preinterferonu skladajecy sie z bialka sygnalowego z 23 /lub mniej, mozliwe 15/ aminokwasów, po którym nastepuje polipeptyd interferonu zawierajecy 166 aminokwa¬ sów*.Y/e wspomnianej publikacji Taninguchi i wsp* porównano sekwencje z. DNA wytworzonego przez Taninguchi i wsp* /Gema 10 /1980/, str* 11-15/, kodujece interferon fibroblastów i otrzymane przez Mantei i wsp.f kodujece interferon leukocytów. Tak wiec wszystkie wymienione publikacje ujawniaje wytwarzanie drobnoustrojów zdolnych do wytwarzania prekursorów interfero¬ nu leukocytów. W przeciwienstwie do tych ujawnien, sposób wedlug wynalazku dotyczy wytwarza¬ nia drobnoustrojów zdolnych do wytwarzania interferonów leukocytów ludzkich o pelnej dlugosci, którym nie towarzyszy zadna ludzka presekwencja lub jej czesc, to jest dojrzalej postaci leukocytów ludzkich.Obecnie stwierdzono, ze zastosowanie technologii rekombinantowego DNA /to jest insercja genów interferonu do drobnoustrojowych nosników ekspresji i ich ekspresja pod kontro¬ le drobnoustrojowych elementów regulatorowych genów do wytwarzania drobnoustrojów zdolnych do wytwarzania dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich mogloby byc najskuteczniejsze droge zapewnienia duzych ilosci dojrzalego interferonu leukocytów, który pomimo braku w tak tworzo¬ nym naterlale gllkozylacjl charakterystycznej dla materialu poohodzecego od czlowieka, móglby148 261 3 byc zastosowany klinicznie do leczenia szeregu chorób wirusowych i nowotworowych• Sposób wytwarzania drobnoustrojów zdolnych do wytwarzania dojrzalego interfero¬ nu leukocytów ludzkich, zawierajecego 165-166 aminokwasów lub, w przypadku gdy metionina jest przyleczona do N-konca pierwszego aminokwasu tego interferonu, 166-167 aminokwasów oraz czesciowe sekwencje aminokwasowe Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser, jak wskazano na fig .4 lub fig.9 w pozycji od 139 do 151, polegajacy na transformowaniu szczepu E.coli nosnikiem ekspresji i hodowli transformowanego szczepu, wedlug wynalazku charakteryzuje sie tym, ze konstruuje sie wektor E.coli zawierajecy promotor trp. E.coli, operator i liderowe miejsce przyleczanla rybosomów trp, izoluje sie gen kodujecy interferon leukocytów ludzkich ze zbioru kolonii bakteryjnych zawierajecych DNA komplementarny z indukowanym mRNA leukocytów ludzkich lub z indukowanym mRNA linii komórkowej bedz ludzki genomowy DNA, wycina sie przez ciecie restrykcyjne gen kodujecy Interferon leukocytów ludz¬ kich i dokonuje sie insercji tak wycietego genu z wyeliminowane jakekolwiek sekwencje lide¬ rowe mogece zapobiegac drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich za promotorem trp. E.coli, operatorem i liderowyra miejscem przyleczanla rybosomów trp, otrzymanym nosnikiem ekspresji E.coli, zdolnym do ekspresji w E.coli wspomnianego dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich transformuje sie w znany sposób szczap E.coli i prowadzi sie hodowle transformowanego organizmu.Otrzymywanie z leukocytów genu stosowanego w sposobie wedlug wynalazku obejmuje nastepujece etapy: 1/ Do skonstruowania próbek syntetycznego DNA, których kodony,w agregacie,repre¬ zentuje wszystkie mozliwe kombinacje nukleotydów zdolne do kodowania czesciowych sekwencji aminokwasów, stosuje sie czesciowe sekwencje aminokwasów interferonu leukocytów ludzkich, oczyszczone do stopnia jednorodnosci. 2/ Przygotowuje sie zbiór kolonii bakteryjnych zawierajecych DNA komplementarny /cDNA/ do indukowanego informacyjnego DNA. Inny indukowany mRNA, znaczony promieniotwórczo, hybrydyzuje sie z plazmidowym cDNA tego zbioru. Zhybrydyzowany mRNA eluuje sie i bada pod wzgledem translacji do interferonu w oocytach. Plazmidowy DNA z kolonii, wykazujecy w ten sposób indukcje aktywnosci interferonu, bada sie dalej przez hybrydyzacje z próbkami przy¬ gotowywanymi jak opisano wyzej w etapie 1/. 3/ Równolegle z przystepieniem do czynnosci w etapie 2/ otrzymany w plazmidach cDNA indukowany mRNA stosuje sie do tworzenia niezaleznego zbioru transformowanych kolonii.Próbki otrzymano w etapie 1/ stosuje sie do prymowania syntezy znaczonego promieniotwórczo jednoniciowego cDNA przeznaczonego do zastosowania w charakterze próbek do hybrydyzacji.Syntetyczne próbki zhybrydyzowane z indukowanym mRNA jako matryce wydluza sie za pomoce odwrotnej transkrypcji, tworzec indukowany, znaczony promieniotwórczo cDNA. Klony zbioru kolonii, które hybrydyzowaly z otrzymanym w ten sposób znaczonym promieniotwórczo cDNA, bada sie dalej w celu potwierdzenia obecnosci genu kodujecego interferon, o pelnej dlugosci.Kazdego z fragmentów genu otrzymanych w etapie 1/ lub 2/ o domniemanej czesciowej dlugosci mozna uzyc Jako próbki dla genu o pelnej dlugosci. 4/ Gen o pelnej dlugosci, otrzymany jak opisano wyzej, poddaje sie obróbce z uzyciem syntetycznego DNA aby wyeliminowac jakekolwiek sekwencje liderowe, która moglaby zapobiegac ekspresji drobnoustrojowej dojrzalego polipeptydu i aby umozliwic prawidlowe umiejscowienie w nosniku ekspresji drobnoustrojowego promotora w stosunku do sygnalów startu i miejsca przyleczenia rybosomów. Powstaly w wyniku ekspresji interferon oczyszcza sie do punktu pozwalajecego na potwierdzenie jego charakteru i oznaczenie aktywnosci. 5/ Fragment genu interferonu, przygotowany w powyzszy sposób,stosuje sie jako próbke do hybrydyzacji dla innych, czesciowo homologicznych rodzajów interferonu leukocytów.Czynnikiem glównie wykorzystywanym w technologii rekominantowego DNA jest plaz¬ mid, niechromosomalna petla dwuniciowego DNA znajdowana w bakteriach i innych drobnoustro¬ jach, czesto w wielu kopiach na komórke, w sklad informacji kodowanej przez plazmidowy DNA wchodzi informacja wymagana do replikacji plazmidu w komórkach potomnych /to jest "repli- kon"/ i zwykle jedna lub wiecej selekcyjnych cech charakterystycznych, takich jak w przypad-4 148 261 ku bakterii, opornosc na antybiotyki, co pozwala na rozpoznanie klonów komórek gospodarza zawierajecych plazmid,o którym mowa i na uprzywilejowany wzrost w wybiorczych podlozach.Uzytecznosc plazmidów polega na tym, ze moge byc one specyficznie rozszczepione przez take lub inne endonukleaze restrykcyjne, czyli "enzym restrykcyjny", z których kazdy rozpoznaje odmienne miejsce w plazmidowym DNA. Nastepnie mozna wprowadzic do plazmidu heterologiczne geny lub fragmenty bakteriologicznych genów przez leczenie konców w miejscu rozszczepienia, lub zrekonstruowanych konców przylegajecych do miejsca rozszczepienia. Rekombinacja DNA przeprowadzana jest po2a komórke, ale wynikajecy z niej "rekombinantowy" plazmid mozna wpro¬ wadzic do komórki sposobem znanym jako transformacja* Przez wzrost transformantu otrzymuje sie duze ilosc rekombinantowego plazmidu zawierajecego gen* Ponadto, jesli gen jest wprowa¬ dzony do plazmidu prawidlowo w odniesieniu do czesci decydujecych o transkrypcji i transla¬ cji kodowanej przez DNA informacji, mozna uzyc otrzymanego nosnika ekspresji do faktycznego tworzenia sekwencji polipeptydowej, które wprowadzony gen koduje, to jest procesu zwanego ekspresje* Ekspresja jest inicjowana w regionie znanym jako promotor, który jest rozpozna¬ wany przez przyleczenie polimerazy DNA, W niektórych przypadkach, jak w przypadku promotora stanowiacego tryptofan lub "trp", korzystnego w praktycznym zastosowaniu wynalazku, na regio¬ ny promotora zachodze regiony "operatora", tworzec kombinowany promotor-operator* Operatora¬ mi se sekwencjo DNA rozpoznawane przez tak zwane bialka represorowe, które sluze do regula¬ cji czestotliwosci inicjacji transkrypcji na poszczególnym promotorze* Polimeraza posuwa sie wzdluz DNA, dokonujec transkrypcji infornacjl zawartej w niciach kodujecych, od Ich konca 5#- do konca 3#-, do informacyjnego DNA, który z kolei ulega translacji do polipepty- du o sekwencji aminokwasów, które koduje ONA* Kazdy aminokwas jest kodowany przez tryplet nukleotydowy czyli "kodon", który noze celowo byloby nazywac "genem strukturalnym", to Jest w czesci kodujecej sekwencje aminokwasów produktu ekspresji* Po przyleczeniu do promotora, polimeraza DNA najpierw dokonuje transkrypcji nukleotydów kodujecych miejsca przylaczania rybosomu, a nastepnie sygnalu inicjacji transla¬ cji, czyli sygnalu "start" /zwykle ATG, który w powstajecym informacyjnym RNA staje sie AUG/, a pózniej kodonów nukleotydowych w samym genie strukturalnym. Tak zwane kodony stop ulegaje transkrypcji na koncu strukturalnego genu, po czym polimeraza moze tworzyc dodatkowe sekwen¬ cje mRNA, która z powodu obecnosci sygnalu etop nie ulegnie translacji na rybosomach. Rybo¬ somy lecze sie z miejscem przyleczenie, które zapewnie informacyjny RNA, w bakteriach tworzony zwykle jako mRNA, przez co dochodzi do tworzenia kodowanego polipeptydu, zaczynajec od sygnalu startu translacji, a konczec na uprzednio wspomnianym sygnale stop* Pozedany produkt tworzy sie jesli sekwencje kodujece miejsca przyleczenie rybosomów se umiejscowione prawi¬ dlowo w odniesieniu do kodonu inicjacji AUG i jesli wszystkie pozostale kodony nastepuje po kodonie inicjacji w fazie* Powstaly produkt mozna otrzymywac przez lize komórek gospodarza 1 odzyskiwanie produktu przez odpowiednie oczyszczenie od innych bialek bakteryjnych, W zastosowaniu metod technologii rekombinantowego DNA, jak to podano wyzej, osie- ga sie wytwarzanie przez drobnoustroje z wysoke wydajnoscie 1 czystoscie, rodziny homolo¬ gicznych Interferonów leukocytów /nie gllkozylowanych/ jako dojrzalych polipeptydów, którym zasadniczo nie towarzysze odpowiednie presekwencje lub jakiekolwiek ich czesci. Te interfe¬ rony moge ulegac bezposredniej ekspresji, odzyskaniu i oczyszczaniu do poziomu przystosowu- jecego je do uzycia w leczeniu chorób wirusowych i nowotworowych ludzi i zwierzat. Udowodniono, ze bialka z tej rodziny ulegajece w ten sposób ekspresji se skuteczne w badaniach in vitro i po raz pierwszy dla tego rodzaju bialek równiez in vivo, przy czym te ostatnie badania obejmuje pierwszy dojrzaly interferon leukocytów wytwarzany przez drobnoustroje* Termin "dojrzaly interferon leukocytów" w kontekscie niniejszego opisu definiuje czesteczke interferonu wytworzone przez drobnoustroje /np* bakterie/* pozbawione grup gliko- zylowych* Dojrzaly interferon leukocytów wedlug wynalazku ulega ekspresji bezposrednio od translacyjnego sygnalu startu /ATK/ dokladnie przed pierwszym kodonem aminokwasu naturalnego produktu* "Dojrzaly" polipeptyd moze wiec zawierac jako pierwszy aminokwas w sekwencji metionine /które koduje ATG/, bez zasadniczej zmiany charakteru polipeptydu* Z drugiej stro¬ ny, drobnoustrój - gospodarza moze przeksztalcac produkt translacji z usunieciem poczet- kowej metloniny* Dojrzaly interferon leukocytów moze ulegac ekspresji lecznie z przyleczo- nym bialkiem, innym niz zwykly lider, przy czym koniugat moze byc specyficznie rozszcze¬ pialny w srodowisku wewnetrz-lub zewnetrz-komórkowym /patrz brytyjski opis patentowy nr 2007676 A/.148 261 5 Wreszcie, dojrzaly Interferon moze byc tworzony w poleczeniu z drobnoustrojo¬ wym peptydem "sygnalowym", który transportuje konlugat do sciany komórkowej, gdzie peptyd sygnalowy ulega odszczepieniu, a dojrzaly polipeptyd wydzieleniu. "Ekspresja" dojrzalego interferonu leukocytów oznacza wytworzenie przez bakterie lub inne drobnoustroje czestecz- ki interferonu nie zawierajecej grup glikozylowych lub presekwencjif co bezposrednio towa¬ rzyszy translacji mRNA genomu interferonu leukocytów* Poszczególne leukocytowe bialka interferonowe se zdefiniowane przez okreslony DNA genu /figury 3 i 8/ i dedukcyjne sekwencje aminokwasów /figury 4 i S/. Nalezy rozumiec, ze w odniesieniu do tych poszczególnych interferonów, wlasciwie wszystkie z rodziny leukocy- towych bialek interferonowych, które mozna wytwarzac przy zastosowaniu drobnoustrojów wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, istnieje naturalne wariacje zalezne od alleli, poja- wiajece sie od osobnika do osobnika* Wariacje te,mozna wykazac przez róznice /róznice/ w calkowitej sekwencji lub przez delecje, podstawienia, insercje, inwersje lub dodanie amino¬ kwasu /aminokwasów/ we wspomnianej sekwencji* Dla kazdego z leukocytowych bialek interfero- nowych otrzymanych przy zastosowaniu drobnoustrojów wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku, oznaczonych od LelF A do LelF D wspomniane wariacje zalezne od alleli objete se zakresem oznaczenia lub definiujecego je terminu i w ten sposób dotycze zakresu niniejszego wynalazku* Wynalazek jest blizej wyjasniony na rysunku, na którym fig.l przedstawia dwie sekwencje aminokwasów wspólne wszystkim rodzajom interferonu wyizolowanym z leukocytów ludz¬ kich i oczyszczonym do stopnia jednorodnosci, oznaczone T-l i T-13* Wszystkie potencjalne sekwencje mRNA kodujece te peptydy ukazano tak, jak i odpowiednie sekwencje DNA* Litery A, T, G, C i U oznaczaje odpowiednio nukleotydy zawierajece jako zasade adenine, tymine, guanine, cytozyne i uracyl* Litera N oznacza którykolwiek z nukleotydów A, G* C i U* Polinu- kleotydy se przedstawione jako odczytywane w kierunku od 5*/z lewej/ do 3*/z prawej/, a gdy przedstawiony jest dwuniciowy /"d*s*V DNA, w kierunku odwrotnym dla nizszej lub nie koduje- cej nici; fig* 2 przedstawia autoradiogram wykazujecy hybrydyzacje potencjalnego plazmidu LelF z syntetycznym dezoksyoligonukleotydem znaczonym 32Pj fig*3 przedstawia sekwencje nukleotydów /nic kodujeca/ osmiu fragmentów genowych izolowanych jako kandydujece do uzycia w ekspresji interferonów leukocytów, odpowiednio oznaczonych od "A" do "H"; inicjacyjny kodon translacji ATG i tryplet dla kazdego zakonczenia LelF jest podkreslony, po kodonach stop czyli trypletach zakonczenia nastepuje regiony 3#nie ulegajece translacji* Przedstawiono równiez gen LelF A o pelnej dlugosci, któremu brak jest jednego kodonu znajdowanego w innych przedstawionych genach, jak wskazano w trzeciej linii A na fig* 3* Nie ulegajece translacji regiony 5* poprzedzaje sekwencje liderowe* Po wyizolowaniu, we fragmencie E brak pelnej presekwencji lidera, ale zawiera on nie naruszony gen domniemanego dojrzalego LelF E* We fragmencie G po wyizolowaniu brak pelnej sekwencji kodujecej* Figura 4 przedstawia porównanie sekwencji osmiu bialek LelF przewidzianych na podstawie sekwencji nukleotydów. Uzyto jednoliterowych skrótów zalecanych przez IUPAC - IUB Commision on Biochemical Nomenclature: A - alanina, C - cysteina, D - kwas asparaginowy.E - kwas glutaminowy, F - fenyloalanina, G - glicyna, H - histydyna, I - izoleucyna, K - lizyna, L - leucyna, M - metionina, N - asparagina, P - prolina, Q - glutamina, R - arginina, S - seryne, T - treonina, V - walina, W - tryptofan i Y - tyrozyna* Numery odnosze sie do pozycji aminokwasów /S odnosi sie do peptydu sygnalowego/* Kreske w 165 aminokwasie sekwen¬ cji LelF A w pozycji 44 wprowadzono w celu ustawienia sekwencji LelF A w jednym szeregu z 166 - aminokwasowymi sekwencjami pozostalych LelF* Sekwencje LelF ustalono przy zingnorowa- niu nadprogramowego nukleotydu /pozycja 187 na fig*3/ w regionie kodujecym. Gwiazdka wskazu¬ je kodony zakonczenia w fazie* Przedstawiono równiez aminokwasy wspólne wszystkim LelF /z wyleczenlem pseudogenu LelF E/* Podkreslone reszty se resztami aminokwasów obecnymi rów¬ niez w interferonie fibroblastów ludzkich* Figura 5 przedstawia mapy restrykcyjne sklonowanych ONA osmiu typów LelF /A do H/* Hybrydowe plazmidy konstruowano metode leczenia konców dC : dG ^~D*V* Goeddel i inni.Nature, 287, 411 - 416 /198Q7» Tak wiec. Inserty cDNA mozna wyciec za pomoce Pstl* Linie na kazdym z konców insertów cDNA reprezentuje boczne homopolimeryczne zakonczenia dC : dG* Wskazano pozycje miejsc restrykcyjnych PvuII, EcoRI i Bglll* Obszary zacieniowane na rysun¬ ku przedstawiaje sekwencje kodujece dojrzalych LelF* Obszary zakreskowane skosnie przedsta-6 148 261 wiaje sekwencje kodujece peptydy sygnalowe, a obszary otwarte ukazuje nie kodujece sekwen¬ cje 3#i 5#.Figura 6 przedstawia schematycznie konstrukcje genu kodujecego bezposrednie synteze przez drobnoustroje dojrzalego LelF A* Wskazano miejsca restrykcyjne i reszty /•Pst I" itp/* Termin ¦b*p." oznacza "pary zasad".Figura 7 /nie w skali/ schematycznie przedstawia nape restrykcyjne dwóch frag¬ mentów genów zastosowanych do wywolywania ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów LelF B.Wskazane sekwencje kodonów przedstawiaja zakonczenia nici kodujecej bedece rezultatem tra¬ wienia enzymem restrykcyjnym Sau3a w dwóch pokazanych przypadkach* • Figury 8 i 9 przedstawiaje sekwencje DNA i aminokwasów S bialek LelF wytwarza¬ nych sposobem wedlug wynalazku wlecznie z typami I i 3 /co do odpowiadajecych Jednolitero¬ wych skrótów, patrz fig*4/* Na fig.9 gwiazdka wskazuje kodon zakonczenia w odpowiadajecej mu sekwencji DNA, a lecznik delecje lub przerwe w sekwencji* Zastosowany drobnoustrój,korzystnie stosuje sie dwa drobnoustroje E.coli x 1776, jak opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 190 495 oraz E*coli K-12 szczep 294 /end A,thi", har", hsm^/, jak opisano w brytyjskim opisie patentowym nr 2 055 382 A* Kazdy z nich jest zdeponowany w American Type Culture Collection /numery rejestracyjne ATCC, odpowiednio, 31 537 i 31 446/* Cale prace zwiezane z rekombinantowym DNA prowadzi sie zgodnie ze stosowanymi wskazówkami National Institutes of Health* Wynalazek, w najkorzystniejszej postaci, opisano w odniesieniu do E.coli, w tym nie tylko szczepów E* coli x 1776 i E*coli K-12 6zczep 294, zdefiniowanych wyzej, ale i innych znanych szczepów E.coli, takich jak E. coli B lub innych szczepów drobnoustrojów, z których wiele jest zdeponowanych i dostepnych w znanych instytucjach deponujacych drobnoustroje, ta¬ kich jak American Type Culture Collection* Patrz równiez opublikowany opis zgloszenia paten¬ towego RFN nr DOS 2 644 432.Wynalazek jest blizej zilustrowany nastepujacymi przykladami* Przyklad I* Wytwarzanie szczepu E.coli zdolnego do wytwarzania dojrza- leon LelF A.A. zródlo i oczyszczanie mRNA LelF mRNA LelF mozna otrzymac z leukocytów ludzkich pochodzecych zwykle od pacjentów z przewlekle bialaczke szpikowe, indukowanych w celu wytworzenia interferonu wirusem Sendai lub choroby Newcastle, jak opisano np* w opublikowanym opisie zgloszenia patentowego RFN nr DOS 2947134. Szczególnie korzystnym zródlem, którego uzywa sie w sposobie wedlug wynalazku, jest linia komórkowa oznaczona Kg-1, otrzymana od pacjenta z ostre bialaczke szpikowe. Ta linia komórkowa, opisana przez H.P. Koefflara i D.M. Golde#a, Science, 200, 1153 /1978/, rosnie latwo w hodowli w podlozu hodowlanym zawierajecym RPMI /Rosewell Park Memorial Insti- tute/ 1640 x 10% FCS /plodowa surowica cieleca/ inaktywowane cieplem, 25 mM buforu HEPES /kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N*-2-etanosulfonowy/ i 50 ^g/ml gentamycyny i jest przeszczepiana z podzialem na 1 - 3 czesci dwa razy na tydzien. Komórki mozna wymrozic z wymienionego poprzednio podloza wzrostowego + 10% dwumetylosulfotlenku. KG-1 zdeponowano w American Type Cukture Collection /nr rejestracyjny ATCC CRL 8031/.Komórki KG-1 indukuje sie w celu wytworzenia mRNA interferonu leukocytów wirusem Sendai lub wirusem choroby Newcastle metode opisane przez Rubinsteina i innych /Proc* Natl* Acad. Sci., USA, 76, 640-646 /1979/* Komórki zbiera sie po uplywie 5 godzin po indukcji i otrzymuje sie RNA metode: tiocyjanian guanidyny - chlorowodorek guanidyny /Chirgwin i wsp*, Biochemistry, 18, 5294 - 5299 /1979/* RNA z komórek nie indukowanych izoluje sie w ten sam sposób* do otrzymania frakcji 125 mRNA poli/A/ uzywa sie chromatografii na oligodezoksyty- midyno /dT/ -.celulozie i ultrawirowania w gradiencie sacharozy, jak opisali Green i inni /Aren. Blochem. Biophys*, 172, 74 - 89 /1979/ i Okuyuma i inni /Aren, Biochem. Biophys*, 188, 98 - 104 /1978/* Taki mRNA wykazuje miano interferonu 8000 - 10000 jednostek/ /jg w ba¬ daniu w oocytach Xenopus laevis /Cavalieri i inni. Proc* Natl* Acad, Sci* USA, 74, 3287 - 3291 /1977/* B. Przygotowanie zbiorów kolonii zawierajecych sekwencje LelF cDNA.Do otrzymania dwunicowego cDNA zwyklymi metodami /Wickens i inni, O.Biol* Chem., 253, 2483 - 2495 /1978/ i Goeddel i inni. Nature, 281, 544 - 548 /1979/ stosuje sie 5 yug mRNA.148 261 7 cDNA frakcjonuje sie pod wzgledem wielkosci za pomoce elektroforezy w 6% zelu poliakrylo- amidowym i za pomoce elektroelucji odzyskuje sie 230/jg materialu w zakresie 500 - 1500 b.p.Do konców tego cDNA,w 100 ^g próbce, wprowadza sie reszty dezoksycytydyny /dC/, Jak opisali Chang i inni, Nature, 275, 617 - 624 /1978/, leczy sie z 470 ng plazmidu pBR322, do konców którego wprowadzono reszty dezoksyguenozyny /dG/ w miejscu Pstl /Bolivar i inni, Gene, 2, 95 - 113 /1977/ i uzywa do transformowania E.coli x 1776. Otrzymuje sie okolo 130 transfor¬ mantów opornych na tetracykllne, wrazliwych na ampicyline, na ng cDNA.W drugim podobnym eksperymencie otrzymuje sie okolo 1000 transformantów E.coli K-12 szczep 294 opornych na tetracykline, wrazliwych na ampicyline, na ng cDNA. W tym przypad¬ ku po frakcjonowaniu pod wzgledem wielkosci odzyskuje sie za pomoce elektroelucji cDNA w zakresie 600 - 1300 b.p. w celu wprowadzenia reszt dC* C* Otrzymywanie i stosowanie syntetycznych dezoksynukleotydów* Znajomosc sekwencji aminokwasów kilku fragmentów trypsynowych Interferonu leuko¬ cytów ludzkich pozwala wyznaczyc syntetyczne dezoksynukleotydy komplementarne do róznych regionów mRNA LelF* Wybrano dwa peptydy trypsynowe Tl i T13, poniewaz ich sekwencja aminokwa¬ sów wymaga syntezy tylko, odpowiednio 12 1 4 undekamerów, odpowiadajecych wszystkim mozliwym sekwencjom kodujacym /fig.l/. Syntetyzuje sie 4 zestawy próbek dezoksynukleotydów, dla kazdej z sekwencji zawierajecych albo trzy /T1A, B, C, D/, albo Jeden /T-13 A, B, C, 0/ oligodezoksy- nukleotyd* Wskazane komplementarne dezoksynukleotydy o dlugosci 11 zasad syntetyzuje sie chemicznie metode fosfotriestrowa /Crea i inni, Proc* Natl* Acad* Sci* USA, 75, 5765 - 5769 /1978/.Otrzymuje sie cztery indywidualne próbki w serii T-13, a dwanascie próbek T-l w czterech pulach po trzy próbki, jak przedstawiono na fig.l* Przygotowuje sie cztery indywidualne próbki serii T-13 i dwanascie T-l w czte¬ rech pulach po trzy primery w kazdej 1 uzywa sie do prymowania syntezy znaczonego promienio¬ twórczo jednoniciowego cDNA, uzywanego jako próbki do hybrydyzacji. Matryce mRNA jest albo 12S RNA z komórek kG-1 Indukowanych wirusem Sendai /8000 jednostek aktywnosci IF//ug/t albo calkowity mRNA poli/A/ z nie indukowanych leukocytów /^10 jednostek/ y«jgA Z primerów tych, stosujec znane warunki reakcji /Noyes i inni. Proc* Natl. Acad* Sci* USA* 76, 1770 - 1774 /1979/9, otrzymuje sie cDNA znakowany 32P. Reakcje prowadzi sie w objetosci 60 /jl, w 20 mM Tris-HCl /pH 8f3/, 20 mli HCl, 8 mM MgCl2, 30 mM fi -merkaptoetanolu* W mieszaninach reakcyjnych znajduje sie 1/ug kazdego z primerów /xo jest 12/jg w calosci dla serii T-l, 4/jg w calosci dla serii T-13/, 2 jug "indukowanej" frakcji 12S mRNA /lub 10/jg nie indukowanego mRNA poli/A/ 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 ug Ci/«£ 32P/, dCTP /Amersham, 2-3000 Ci/milimol/ i 60 jednostek odwrotnej transkryptazy /Betheada Research Laboratories/* Produkt oddziela sie od materialu nie znaczonego za pomoce seczenia zelowego na 10 ml kolumnie zelu Sephadex G-50, traktuje sie w ciegu 30 minut w temperaturze 70°c, 0,3 N roztworem NaOH w celu rozlozenia RNA i zobojetnie¬ nia HCl* Hybrydyzacje przeprowadza sie jak opisali Kafatos i inni, Nucleic Acids Res*, 7, 1541 - 1552 /1979/.D. Identyfikacja klonów pLI-pL30 Stosuje sie szybke metode izolowania plazmidów opisane przez Blrnboima 1 innych, Nucleic Acids Res*, 7, 1513 - 1523 /1979/, w celu otrzymania 1 /ug plazmidowego ONA z kazdych 500 indywidualnych transformantów E.coli szczep 294 /patrz punkt C/. Kazde próbke DNA denatu¬ ruje sie i nanosi na seczki nitrocelulozowe /po trzy jednakowe/ metode Kafatosa 1 innych /patrz wyzej/* Trzy zestawy seczków nitrocelulozowych, zawierajecych po 500 próbek plazmidu hybrydyzuje sie z: a/ indukowanym cDNA prymowanym zestawem primerów T-l, b/ indukowanym cDNA prymowanym T-13* oraz c/ nie indukowanym cDNA otrzymanym przy uzyciu obydwu serii primerów* Klony se uwazane za pozytywne, jesli hybrydyzuje silniej z jedne lub dwoma próbkami indukowa¬ nego cDNA niz z calkowicie nie indukowane próbke* Z pieciuset klonów wybiera sie trzydziesci "pozytywnych" klonów /pLl - pL30/ do dalszej analizy.E. Identyfikacja klonów pL31 - pL39 Izolowanie plazmidu /nr 104/ zawierajecego fragment genu LelF. Transformanty E.coli x 1776 poddaje sie screeningowi metode hybrydyzacji kolonii /Grustein i Bogness, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961 - 3965 /1975/ stosujec jako próbke indukowany nRNA znaczony 32P /Lillen-haug i inni, Biochemistry, 15, 1858 - 1865 /1976/. Nie znaczony mRNA z nie indukowanych komórek miesza sie z próbke w stosunku 200 : 1 w celu kompetycji z nie indukowanym mRNA, obec- nym w preparacie znaczonym 0<1P# Hybrydyzacja znaczonego mRNA powinna byc uprzywilejowana w8 148 261 odniesieniu do kolonii zawierajecych indukowane sekwencje. Otrzymuje sie trzy klasy transfor¬ mantów: 1/2 - 3% kolonii hybrydyzuje z P-mRNA bardzo silnie, 2/ 10^ hybrydyzuje znacznie slabiej niz klasa 1/ oraz 3/ pozostale kolonie nie daje wykrywalnego sygnalu hybrydyzacji.Pozytywne kolonie /klasa 1 i 2/ bada sie pod wzgledem obecnosci sekwencji specy¬ ficznych dla interferonu w oznaczeniu zaleznym od hybrydyzacji mRNA specyficznego dla interfe¬ ronu z plazmidowym DNA* Najpierw hoduje sie indywidualnie 60 wybitnie pozytywnych kolonii /klasa 1/ w 100 ml podloza M9 uzupelnionego tetracykline /20 /ug/ml/, kwasem dwuaminopimeli- nowym /100 /ug/ml, tymidyne /20 /ug/ml, i d-biotyne /l /jg/ml/. Podloze M9 zawiera na litr: 6 g Na2HP04, 3 g KH2P04» 0,5 g NaCl i 1 g NH4CI. Po wyjalowieniu w autoklawie dodaje sie 1 ml jalowego 1 M MgS04 i 10 ml jalowego 0,01 M CaCl2* Tworzy sie pule z 10 hodowli i izoluje plaz¬ midowy DNA z 6 pul, jak to opisali Clewell i inni, Biochemistry, 9, 4428 - 4440 /1970/* 10 /ug z kazdej puli plazmidowego DNA rozszczepia sie Hindlll, denaturuje i wieze kowalencyjnie z OBM /dwuazobenzyloksymetylo/-bibule* Z kazdym seczkiem hybrydyzuje sie 1 /ug oczyszczonego mRNA z indukowanych komórek* Niezhybrydyzowany mRNA usuwa sie za pomoce przemywania* Specyficznie zhybrydyzowany mRNA eluuje sie i poddaje translacji w oocytach Xenopus laevis* W tym oznaczeniu wszystkie szesc pul okazuje sie negatywnymi* Z 59 slabo pozytywnych kolonii /klasa 2/ przygotowuje sie piec "pul z dziesieciu kolonii kazda 1 jedne pule z dziewieciu kolonii, przeprowadza preparatyke plazmidów i bada jak opisano wyzej* Wsród badanych 6zesciu pul* jedna KIO hybrydyzuje z mRNA interferonu na poziomach znacznie wyzszych od tla przy kazdorazowym badaniu* W celu identyfikacjo cDNA specyficznego dla interferonu przeprowadza sie preparatyke plazmidowego DNA z 9 kolonii puli K-10 i bada indywidualnie* Dwa z dziewieciu plazmidów /nr 101 i nr 104/ przyleczaje mRNA interferonu na poziomie znacznie wyzszym od tla* Z plazmidu nr 104 izoluje sie unikalny fragment restrykcyj¬ ny Bglll zawierajecy 260 b.p*, znakuje sie go 32P metode opisane przez Taylora i innych, Blochem* Biophys* Acta*, 442, 324 - 330 /1976/ i uzywa Jako próbki do niezaleznego screeningu 400 transformantów E.coli 294 metode screeningu kolonii in situ /Grunstein i Hogness* Proc* Natl. Sci* USA, 72, 3961 - 3965 /1975/* Dziewiec kolonii /pL31 - pL39/ zidentyfikowano jako hybrydyzujece w róznym stopniu z te próbke* Poza tym, w ten sam sposób do niezaleznego scree¬ ningu 4000 transformantów E.coli 294 stosuje sie znaczony fragment o 260 b*p* Identyfikuje sie 50 kolonii jako hybrydyzujece w róznym stopniu z te próbke* Oedna z próbek zawiera fragment LelF G, Jedna - LelF H, a inna zawiera fragment oznaczony LelF HI, przypuszczalnie allel LelF H* Otrzymane hybrydowe plazmidy oznaczono "pLelF H", itp* F* Izolacja i oznaczenie sekwencji pierwszego genu LelF o pelnej dlugosci* Ze wszystkich 39 potencjalnych klonów cDNA LelF otrzymuje sie plazmid DNA i po¬ nownie poddaje screeningowi z take sarne próbke DNA o 260 b*p* za pomoce metody hybrydyzacji Kafatosa 1 innych /patrz wyzej/* Trzy plazmidy /pL4, pL31, pL34/ daje bardzo silne sygnaly hybrydyzacji, cztery /pL13, pL30f pL32* pL36/ hybrydyzuje umiarkowanie, a trzy /pL6* pL8, pL14/ slabo hybrydyzuje z próbke* Poddaje sie równiez screeningowi 39 potencjalnych rekombinantowych plazmidów cDNA LelF* stosujec jako próbki bezposrednio do hybrydyzacji syntetyczne undekamery znaczone 2P /indywidualne pule primerów Tl, lub indywidualne primery T13/* Wybiera sie takie warunki hybrydyzacji, ze do wykrycia sygnalów hybrydyzacji wymagane jest dokladne parowanie zasad /Wallace i inni, Nucleic Acids Res*, 6, 3543 - 3557 /1979/. Tak wiec, w standardowy sposób metode klarowanych lizatów /Clewell i inni, patrz wyzej/, otrzymuje sie plazmidowy DNA z 39 klonów i oczyszcza za pomoce chromatografii kolumnowej na kolumnie Biorad Agarose A-50.. Próbki po 3 /tig kazdego preparatu przeprowadza sie w postac linearne za pomoce EcoRI, denaturuje w odczynie zasadowym i nakrapla na 2 oddzielne seczki nitrocelulozowe, po 1,5 /4jg na miejsce /Kafatos i inni, patrz wyzej/. Indywidualne syntetyczne primery dezoksyoli- gonukleotydowe i pule primerów poddaje sie fosforylacji za pomoce )T P/ ATP w nastepujecy sposób: 50 pikomoli oligonukleotydu i 100 pikomoli / f32p/ATP /New England Nuclear, 2500 Ci/ milimol/ leczy sie w 30 /jl 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 15 mM fi-merkaptoetanolu* Dodaje sie 2 jednostki kinazy polinukleotydowej T4 i po 30 minutach inkubacji w temperaturze 37°C oczysz- cza sie polimery znaczone P za pomoce chromatografii na 10 ml kolumnach zelu Sephadex G-50* Hybrydyzacje przeprowadza sie stosujec primer T-130 /106 zliczen/min/ lub pule primerów T-1C / 3 x 10 zliczen/min/* Hybrydyzacje przeprowadza sie w temperaturze 15°C w ciegu 14 godzin w 6 x SSC /l x SSC « 0,15 M NaCl, 0,015 M cytrynian sodowy, pH 7,2/, 10 x w roztworze Denhardta148 261 9 /0,2% bydleca albumina surowicza, 0,2% pilowinylopirolidon, 0,2% Ficoll/, Jak opisali Wallace i inni /patrz wyzej/. Seczki przemywa sie w ciegu 5 minut /3 razy/ w temperaturze 0°C w 6 x SSC, suszy i eksponuje na blonie czulej na promienie X. Wyniki przedstawiono na fig.2 dla puli 32P-primerów T-13C i T-1C.Stwierdzono, ze plazmidowy DNA z klonu 101 wykazuje znaczne hybrydyzacje z pule primerów T-1C i primerem T-13C, ale nie wykazuje wykrywalnej hybrydyzacji z innymi udekame- rami. Jak przedstawiono na fig.2, kilka z potencjalnych plazmidów LelF /pL2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34/ równiez hybrydyzuje z obydwoma próbkami. Tym niemniej analiza restrykcyjna wykazuje, ze tylko jeden z tych plazmidów, pL31, zawiera równiez wewnetrzny fragment Bglll o 260 b.p. Trawienie pL31 za pomoce Pstl wykazuje, ze dlugosc Insertu cDNA wynosi okolo 1000 b.p.Analizuje sie sekwencje calego insertu Pstl z pL31 zarówno chemiczne metode Maxama-Gilberta /Methods Enzymol., 65, 499 - 560'/1960/, jak i metode dwuazoksy zakonczenia lancucha /Smith, Methods Enzymol,, 65, 560 - 560 /1980/ po podklonowaniu fragmentów Sau3a do nosnika M13. Sekwencje ONA przedstawiono na fig.3 /•A"/. Odpowiednie translacyjne faze odczyty- wania mozna przewidziec z posiadanej informacji co do sekwencji aminokwasów w bialku, znanego zakresu ciezarów czesteczkowych LelF i wzglednego wystepowania trypletów stop w trzech mozli¬ wych fazach odczytywania, co z kolei pozwala przewidziec calkowite sekwencje aminokwasów, wlecznie z prepeptydem lub peptydem sygnalowym. Pierwszy kodon inicjacji translacji ATG stwierdzono z pozycji 60 sekwencji nukleotydów od konca 5#, a nastepnie o 188 kodonów dalej wystepuje tryplet zakonczenia TCA, tak wiec istnieje 342 nie ulegajece translacji nukleotydy na koncu 3#, a nastepnie sekwencja poli /A/.Domniemany peptyd sygnalowy /przypuszczalnie zaangazowany w wydzielaniu dojrzale¬ go LelF z leukocytów/ ma dlugosc 23 aminokwasów, 165 aminokwasów skladajecych sie na dojrzaly LelF ma wyliczony ciezar czesteczkowy 19 390. LelF kodowany przez pL31 nazwano LelF A.Peptydy trypsynowe Tl i T13 LelF B odpowiadaje aminokwasom 145 - 149 i 57 - 61 w odniesieniu do LelF A, jak to jest widoczne z danych dotyczecych sekwencji /"A"/ na fig.4. Faktycznymi kodujecymi sekwencjami DNA znajdowanymi w tych dwóch regionach se sekwencje reprezentowane przez pule primerów Tl-C i primer T13-C /patrz fig.8/.G. Wytwarzanie E.coli 294/pLeIF A trp 25 1* Uwagi ogólne. Metoda ekspresji LelF bezposrednio jako dojrzalego interferonu jest wariantem metody wczesniej uzywanej dla ludzkiego hormonu wzrostu /Goeddel i inni.Nature, 281, 544 - 548 /1979/, w tym zakresie w jakim wlecza kombinacje syntetycznego /N-kon- cowego/ i komplementarnych DNA.Oak wskazano na figurze 6, miejsce endonukleazy restrykcyjnej Seu3a jest dogod¬ nie ulokowane miedzy kodonami 113 LelF A. Zaplanowane se dwa syntetyczne dezoksynukleotydy, które wleczaje kodon inicjacji translacji ATG, przywracaje kodon pierwszego aminokwasu /cysteina/ i tworze lepkie konce EcoRI. Oligomery te leczy sie z fragmentem Sau3a - AvaII pL31 o 34 b.p. Powstaly produkt o 45 b.p. leczy sie z dwoma dodatkowymi fragmentami DNA w celu konstrukcji hybrydowego genu syntetyczno - naturalnego kodujecego LelF oraz zakonczone¬ go miejscami restrykcyjnymi EcoRI i Pstl. Gen ten wlecza sie do pBR322 miedzy miejsca EcoRI i Pstl otrzymujec plazmid pLelF Al. 2. Konstrukcja tryptofanowego elementu kontrolnego /zawierajecego promotor trp E.coli, operator i liderowe miejsce przyleczenia rybosomów trp, ale bez sekwencji inicjacji translacji /ATG7 • Plazmid pGMI zawiera tryptofanowy operon E.coli z delecje A LE1413 /~Mlozzari i inni, J.Bacteriology, 133, 1457 - 1466 /1%73/J * dlatego doprowadza do ekspresji poleczone¬ go bialka zawierajecego 6 pierwszych aminokwasów lidera trp i w przyblizeniu 3 ostatnie aminokwasy polipeptydu E trp /w dalszej czesci opisu lecznie nazywanego LE#/» j&fc równiez polipeptyd D trp w calosci, wszystko pod kontrole ukladu promotor - operator. Plazmid w ilos¬ ci 20/ug trawi sie enzymem restrykcyjnym PvuII, który rozszczepia plazmid w 5 miejscach.Fragmenty genu leczy sie nastepnie z lecznlkami EcoRI /skladajecymi sie z 6eaokomplementar- nego oligonukleotydu o sekwencji pCATGAATTCATG/ zapewnlajec miejsce rozszczepienia EcoRI do pózniejszego klonowania do plazmidu zawierajecego miejsce EcoRI.Fragmenty DNA w ilosci 20 /jg otrzymane z pGMI traktuje sie w ciegu nocy w tempe- rat. 4°C 10 jednostkami ligazy DNA T4 w obecnosci 200 pikomoll 5#- fosforylowanego syntetycz¬ nego oligonukleotydu pCATGAATTCATG w 20 /ii buforu dla ligazy DNA T4 /20 aM Tris, pH 7,6,10 148 261 0.5 mM ATP, 10 mM MgCl2# 5 mM dwutiotreitol/* Nastepnie roztwór ogrzewa sie w ciegu 10 minut w temperaturze 70°c w celu zatrzymania laczenia. Laczniki rozszczepia sie przez trawienie EcoRI, rozdziela sie za pomoce elektroforezy w 5% zelu poliakryloamidowym /w dalszej czesci opisu okreslonym Jako PAGE/ i izoluje sie w zelu trzy najwieksze fragmenty przez, po pierwsze, barwienie bromkiem etidium, zlokalizowanie fragmentów w swietle ultrafioletowym i wyciecie z zelu interesujacych czesci* Kazdy fragment umieszcza sie w woreczku dializujacym wraz z 300 u litrami 0,1 x T6E i poddaje w ciegu 1 godziny elektroforezie w 0,1 x buforze TBE przy róznicy potencjalów 100 V /bufor TBE zawiera 10,8 g Iris w postaci zasady 5,5 g kwasu borowego, 0,09 g Na2EDTA w 1 litrze wody/* Zbiera sie wodny roztwór z woreczka dializacyjnego, ekstrahuje fenolem, ekstrahuje chloroformem, doprowadza do stezenia 0,2 M chlorkiem sodowym i odzyskuje DNA w wo¬ dzie po straceniu etanolem* Gen zawierajecy promotor - operator trp z lepkimi koncami EcoRI identyfikuje sie metode opisana dalej, wymagajece insercji fragmentów do plazmidu wrazliwego na tetracykline, który po wleczeniu promotora - operatora staje sie oporny na tetracykline* Plazmid pBRHI /Rodriguez i inni, Nucleic Acids Res, 6, 3267 - 3287 /19797 wykazuje ekspresje opornosci na ampicyline i zawiera gen opornosci na tetracykline, ale nie majec przyleczonego promotora, nie wykazuje ekspresji tej opornosci* Plazmid jest skutkiem tego wrazliwy na tetracykline* Przez wprowadzeniu ukladu promotor - operator do wiejsca EcoRI, plazmid mozna uczynic opornym na tetracykline* Plazmid pBRHI trawi sie EcoRI i usuwa enzym za pomoce ekstrakcji fenolem, a nastep¬ nie chloroformem i odzyskuje w wodzie po streceniu etanolem* Powstajece czesteczki DNA miesza sie w oddzielnych mieszaninach reakcyjnych z kazdym z trzech fragmentów DNA otrzymanych jak opisano wyzej i leczy sie za pomoce ligazy DNA T4, jak opisano wyzej* DNA obecny w mieszaninie reakcyjnej stosuje sie do transformowania zwyklymi metodami kompetentnej E.coli K-12 szczep 294 /"Hershfield i inni. Proc. Natl. Acad* Sci. USA, 71, 3455 - 3459 /197AJ i wysiewa bakterie na plytki LB /Luria-Bertani/ zawierajece ampicyline w stezeniu 20/jg/ml i tetracykline w stezeniu 5 yug/ml. Selekcjonuje sie kilka kolonii, izoluje plazmidowy DNA i potwierdza obecnosc zedanego fragmentu za pomoce analizy enzymami restrykcyjnymi* Powstaly plazmid nazwano pBRHtrp* Produkt trawienia EcoRI i BamHI genomu wirusa hepatitis B otrzymuje sie zwyklymi sposobami i klonuje do miejsc EcoRI i BamHI plazmidu pGHG £~Goeddel i inni. Nature, 281, 544 /197§7 w celu utworzenia plazmidu*pHS32. Plazmid pHS32 rozszczepia sie Xbal, ekstrahuje fenolem, nastepnie chloroformem i wytreca etanolem* Nastepnie otrzymany material traktuje ar ciegu 30 minut w temperaturze 0 C 1 /jl polimerazy DNA I E*coli /fragment Klenowa/ produkcji Boehringer - Mannheim, w 30 ul buforu polimerazy /50 mM fosforan potasowy, pH 7,4, 7 mM MgCl2» 1 «M /-merkaptoetanol/ zawierajecego 0,1 nM dTTP i 0,1 mM dCTP, a nastepnie w ciegu 2 godzin w temperaturze 37°C* Traktowanie to powoduje, ze 2 z 4 nukleotydów staje sie komplementarne do wystajecego konca miejsca rozszczepienia Xbal do uzupelnienia w: 5* CTAGA 5* CTAGA 3# T 3* TCT Dwa nukleotydy, dC i dT zostaje wleczone dajec zakonczenie o dwóch wystajecych nukleotydach 5** Te linearne pozostalosc plazmidu pHS32 /po ekstrakcji fenolem, chloroformem oraz odzyskaniu w wodzie po streceniu etanolem/ rozszczepia sie EcoRI* Duzy fragment plazmidu oddziela sie od mniejszego fragmentu EcoRI - Xbal za pomoce PAGE i izoluje po elektroelucji* Ten fragment DNA otrzymany z pHS32 /0,2/jg/ leczy sie w warunkach podobnych do wyzej opisanych z fragmentem EcoRI - Taql operonu tryptofanowego / r** 0,01 yug/, otrzymanym z pBRHtrp* W procesie leczenla fragmentu otrzymanego z pHS32 z fragmentem EcoRI - Taql, jak opisano wyzej, leczy sie wystajecy koniec Taql z pozostalym wystajecym koncem Xbel, nawet jesli nie se one calkowicie sparowane w sposób zgodny z zasade Watsone i Cricka: T CTAGA -TCTAGA * - AGC TCT -AGCTCT Czesc tej mieszaniny reakcyjnej, w której odbywalo sie leczenie, transformuje sie do komórek E.coli 294, poddaje sie obróbce cieplnej i wysiewa na plytki LB zawierajece ampicy-148 261 11 line. Wybiera sie 24 kolonie, prowadzi ich hodowle w 3 ml podloza LB /Lauria - Bertanl/ i izoluje sie plazmid* Stwierdzono, ze szesc sposród tych plazmidów na miejsce Xbal zregenero¬ wane przez reperacje DNA katalizowane przez E.coli 1 replikacje: ZCTAGA TCTAGA - —__ AGCTCT AGATCT Stwierdzono równiez* ze plazmidy te rozszczepiane ee zarówno przez EcoRI, Jak i Hpal. dajec oczekiwane fragmenty restrykcyjne. Plazmidu oznaczonego Jako pTrpl4, uzywa sie do ekspresji heterologicznych polipeptydów. Jak opisano dalej* Plazmid pHGH 107 /"Goeddel i inni, Nature, 281, 544 /197?7 zawiera gen ludzkiego hormonu wzrostu skledajecy sie z 23 kodonów aminokwasów otrzymanych z fragmentów syntetyczne¬ go ONA i 163 kodonów aminokwasów otrzymanych z komplementarnego DNA otrzymanego za pomoce od¬ wrotnej transkrypcji mRNA ludzkiego hormonu wzrostu. Gen ten. w którym brak kodonów "pre" sekwencji ludzkiego hormonu wzrostu, zawiera kodon inicjacji translacji ATG. Gen izoluje sie .z 10 ug pHGH 107 przez dzialania EcoRI, a nastepnie polimerazy DNA. I E.coli /fragment Klono¬ wa/ i dTTp oraz dATP, Jak opisano wyzej* Po ekstrakcji fenolem 1 chloroformem oraz wytreceniu etanolem, plazmid traktuje sie BamHI» Fragment zawierajecy gen ludzkiego hormonu wzrostu /HGH/ izoluje sie za pomoce PAGE, a nastepnie elektroelucji. Otrzymany fragment ONA zawiera równiez pierwsze 350 nukleoty- dów genu strukturalnego opornosci na tetracykline, ale brak w nim ukladu promotor - operator tak, ze gdy zostanie klonowany dla plazmidu wykazujacego ekspresje, mozna zlokalizowac plazmi¬ dy zawierajece insert przez przywrócenie opornosci na tetracykline. Poniewaz EcoRI - koniec fragmentu uzupelniono metode z uzyciem polimerazy I /fragment Klenowa/, fragment ten zawiera Jaden wolny koniec i Jeden koniec lepki, co zapewnia prawidlowe orientacje po pózniejszym wleczeniu do plazmidu wykazujacego ekspresje.Wytwarza sie nastepnie plazmid ekspresji pTrpl4 w celu przyjecia fragmentu zawiera¬ jecego gen HGH, otrzymanego jak opisano wyzej. Tak wiec trawi sie pTrpl4 Xbel i powstale lepkie konce uzupelnia metode z uzyciem polimerazy I /fragment Klenowa/ i dATP, dTTP, dGTP, dCTP.Po ekstrakcji fenolem i chloroformem oraz wytreceniu etanolem, powstaly ONA traktuje sie BamHI otrzymany duzy fragment plazmidu izoluje sie za pomoce PAGE, a nastepnie elektroelucji» Fragment otrzymany z pTrpl4 zawiera jeden wolny koniec 1 jeden koniec lepki, co pozwala na rekombinacje w prawidlowej orientacji z fragmentem zawierajecym gen HGH, opisanym poprzednio.Fragment genu HGH i fragment & Xbe-BamHI pTrpl4 miesza sie i leczy w warunkach podobnych do opisanych wyzej• Uzupelnione konce Xbal i EcoRI leczy sie metode leczenia wolnych konców w celu od¬ tworzenia miejsca zarówno Xbal jak i EcoRI: Uzupelniony Xbal Uzupelniony EcoRI Inicjacja genu HGH TCTAG AATTCTATG TCTAGAATTCTATG ? AGATC TTAAGATAC AGATCTTAAGATAC Xbal EcoRI Konstrukcja te przywraca równiez ekspresje genu opornosci na tetracykline. Ponie¬ waz plazmid pHGH 107 wykazuje ekspresje opornosci na tetrecykline od promatora w góre /promo¬ tor lac/, konstrukcja ta, oznaczona pHGH 207, pozwala na ekspresje genu opornosci na tetra¬ cykline pod kontrole ukladu promotor - operator tryptofanowy. Tak wiec mieszanine reakcyjne, z której odbywalo sie laczenie, transformuje sie E.coli 294 i dokonuje selekcji kolonii na plytkach LB zawierajecych tetracykline w stezeniu 5/jg/ml.Plazmid pHGH 207 trawi sie EcoRI i za pomoce PAGE, a nastepnie elektroelucji od¬ zyskuje sie fragment o 300 b.p. zawierajecy promotor trp, operator i liderowe miejsce przyla¬ czenia rybosomów trp, ale bez sekwencji inicjacji translacji ATG. Ten fragment DNA klonuje sie do miejsca EcoRI pLelF A. Plazmidy wykazujace ekspresje, zawierajece zmodyfikowany jak wyzej, regulon trp /operon trp E.coli, z którego usunieto sekwencje oslabiajaca w celu mozli¬ wego do kontrolowania podwyzszenia poziomu ekspresji/ mozna hodowac do ustalonego poziomu w12 148 261 podlozach odzywczych zawierajecych tryptofan w ilosciach niezbednych do represji ukladu promotor - operator, a nastepnie pozbawionych tryptofanu w celu depresji ukladu i mozliwos¬ ci ekspresji zadanego produktu.Bardziej szczególowo i w odniesieniu do fig.6, 250 /jg plazmidu pL31 trawi sie Pstl i insert o 1000 b.p. izoluje sie za pomoce elektroforezy w 6% zelu poliakryloamidowym.Dokonuje sie elektroelucji z zelu okolo 40 ug insertu i dzieli go na 3 próbki do dalszego t rawienia: a/ trawi sie czesciowo 16 /ug próbke tego fragmentu 40 jednostkami Bgllll w ciegu 45 minut w temperaturze 37°C i oczyszcza mieszanine reakcyjne w 6% zelu poliakryloamidowym* Odzyskuje sie okolo 2 /ug zadanego fragmentu o 670 b*p* b/ 8 /jg insertu Pstl o 1000 b*p», jako inne próbke, poddaje sie dzialaniu AvaII i Bglll. Za pomoce elektroforezy w zelu odzyskuje sie 1 yug wskazanego fragmentu o 150 b.p. c/ 16 AJg fragmentu o 1000 b.p. traktuje sie Sau3a i AvaII. Po elektroforezie w 10% zelu poliakryloamidowym odzyskuje sie okolo 0,25 yug /10 pikomoli/ fragmentu o 34 b.p. Dwa wskazane oligodezoksynukleotydy, 5#-dAATTCATGTGT /fragment 1/ i 5#-dGATCACAGATG /fragment 2/ syntetyzuje sie metode fosfotroestrowe* Fragment 2 fosforyluje sie w nastepujecy sposób: "200 A*l /r^/40 pikomoli/ }f 32P/ ATP/Amersham, 5000 Ci/milimol/ przeprowadza sie w proszek i zawiesza w 30 1 60 mh Tri6-HCl /pH 8,0/, 10 mM MgCl2# 15 mM p-merkaproetanolu zawierajecym 100 pikomoli fragmentu DNA i 2 jednostki kinazy polinukleotydowej T4. Po 15 minutach inoku- lacji w temperaturze 37°C dodaje sie 1/jl 10 mM ATP i prowadzi reakcje w ciagu dalszych 15 mi¬ nut* Nastepnie mieszanine reakcyjne ogrzewa sie w ciegu 15 minut w temperaturze 70°C, miesza z 100 pikomolami fragmentu 1 5*-OH i 10 pikomolami fragmentu Sau3a - AvaII o 34 b.p. Leczenie przeprowadza sie w ciagu 5 godzin w temperaturze 4°C w 50 /ul 20 mM Tris-HCl /pH 7,5/, 10 mM MgCl2, 10 mM dwutiotreitolu, 0,5 mM ATP w obecnosci 10 jednostek ligazy DNA T4.Mieszanine poddaje sie elektroforezie w 6% zelu poliakryloamidowym i odzyskuje produkt o 45 b.p. za pomoce elektroelucji. Okolo 30 /ug /l pikomol/ produktu o 45 b.p* miesza sie z 0,5 ug /5 pikomoli/ fragmentu AveII - Bglll o 150 b.p* i 1/ug /2 pikomole/ fragmentu Bglll - Pstll o 670 b.p. Leczenie przeprowadza sie w temperaturze 20°c w ciegu 16 godzin z uzyciem 20 jednostek ligazy DWA T4. Ligaze inaktywuje sie przez ogrzewanie do temperatury 65 C w ciegu 10 minut* Nastepnie w celu wyeliminowania polimerów genu mieszanine trawi sie EcoRI i Pstl* Mieszanine oczyszcza sie z zastosowaniem 6% PAGE* Izoluje sie 20/ug /0,04 pikomola/ produktu o 865 b.p. Polowe tej ilosci /10/jg/ wlacza sie do pBR322 /0,3 /jg/ miedzy miejsca EcoRI a Pstl* Transformacja E.coli 294 daje 70 transfornantów opornych na tetracykline, wrazli¬ wych na ampicyline* Plazmidowy DNA izolowany z 18 tych transformantów trawi sie EcoRI i Pstl* Sposród tych 18 plazmidów 16 mialo fragment EcoRI - Pstl o dlugosci 865 b.p. Jeden /jg jednego z tych plazmidów pLelF Al trawi sie EcoRI i leczy z 0,1 /ug fragmentu EcoRI o 300 b.p. zawiera¬ jecego promotor trp i liderowe miejsca przylaczenia rybosomów trp, otrzymanego jak opisano 32 wyzej* Transfornanty zawierajece promotor trp identyfikuje sie z uzyciem próbki -P-trp w poleczeniu z metode screeningu kolonii Grunstelna-Hognesea* Asymetrycznie umieszczone we frag¬ mencie trp miejsce Xbal pozwala na okreslenie rekorobinantów, w których promotor trp zoriento¬ wany byl w kierunku genu LelF A* 3* Aktywnosc LelF A in vitro i in vivo* Ekstrakty przygotowuje sie do badania IF w nastepujecy sposób* Prowadzi sie 1 ml hodowle w podlozu L zawierajecym tetracykline w stezeniu /jg/ml do wartosci A550 okolo 1,0 i rozciencza do objetosci 25 ml podlozem M9 zawierajecym tetracykline w stezeniu 5/jg/ml* Gdy wartosc A550 osiagnie 1,0 zbiera sie przez odwirowanie 10 ml próbki i osad komórek zawiesza w 1 ml 15% sacharozy, 50 mM Tris-HCl /pH 8,0/, 50 mM EDTA* Dodaje sie 1 mg lizozymu i po 5 mi- o nutach inkubacji w temperaturze 0 C komórki rozbija sie przez nadzwiekowienie* Próbki .odwiro¬ wuje sie w ciegu 10 minut /l5000 obrotów/minute/ i okresla aktywnosc LelF w supernantantach w porównaniu ze standardowymi LelF na podstawie zahamowania efektu cytopatycznego /CPE/* W celu okreslenia ilosci czasteczek IF na komórke uzywa sie LelF o aktywnosci wlasciwej 4 x 10 jednostek/mg* Jak przedstawiono w tablicy 1, klony pLelF A trp 25, do których promotor trp zostal wleczony w zadanej orientacji, wykazuje wysoki poziom aktywnosci /tak wysoki, jak 2,5 x 108 jednostek/litr/* 3ak przedstawiono w tablicy 2;IF wytworzony przez E.coli K-12 szczep 294/146 261 13 pLelF A trp 25 zachowuje sie podobnie do oryginalnego ludzkiego LelF* Oeat on stabilny w pH 2 i ulega neutralizacji przez królicze przeciwciala przeciw ludzkim leukocytom* Interfe¬ ron wykazuje ciezar czesteczkowy okolo 20000* Skuteczne dzialanie interferonu in vivo wymaga obecnosci makrofagów i natural¬ nych komórek zabijajacych /MK/* Mechanizm dzialania in vivo obejmuje stymulacje tych komórek* Tak wiec pozostaje mozliwe, ze interferon tworzony przez E.coli 294/pLeIF A 25, wykazujacy aktywnosc w badaniu w hodowlach komórkowych, nie wykazywalby aktywnosci w orga¬ nizmie zakazonych zwierzat* Ponadto przeciwwirusowa aktywnosc LelF A wytworzonego przez bakterie, nie glikozylowanego, moze róznic sie od aktywnosci LelF otrzymanego z ludzkich leukocytów "buffy coat"* Tak wiec, porównuje sie aktywnosc biologiczna wytworzonego przez bakterie LelF A /2% czystosci/ z aktywnoscie LelF "buffy coat" /8% czystosci/ w smiertelnym zakazeniu wirusem zapalenia mózgu i miesnia sercowego u malp seimiri /tablica 3/* Tablical Aktywnosc interferonu w ekstraktach E.coli i E.coli K-12 | Gestosc ' Aktywnosc IF i Ilosc czasteczek szczep 294 trans- , komórek ¦ jednostki /ml , LelF na komórke formowany przez /komórki/ml i hodowli pLelF A trp 25 J 3.5 x 108 i 36,000 ' 9,000 pLelF A trp 25 ¦ 1,8 x 109 , 250,000 ¦ 12,000 Tablica 2 Porównanie aktywnosci ekstraktów E.coli 294/pLeIF A ze standardem LelF*' §Aktywnosc interferonu /jednostki/ml/ 1 nie poddany ' pH 2 ' królicze przeciwciala 1 obróbce ' ' przeciw leukocytom i L L lydzkim m ekstrakt 294/pLeIF A trp 25 standard LelF i i i i 500 500 i i 500 500 l i i i < < 10 10 W powyzszej tablicy 2 uzyto nastepujacych oznaczen: x/ Ekstrakt E*coli 294/pLeIF A trp 25 o aktywnosci 250000 jednostek/ml opisany w tablicy 1 rozciencza sie 500 x minimalnym podlozem podstawowym, co daje aktyw¬ nosc wlasciwa 500 jednostek/ml* Standard interferonu leukocytów /Wadley Institute/, uprzednio wymiareczkowany wobec standardu interferonu leukocytów NIH, równiez rozciencza sie do koncowego stezenia 500 jednostek/ml* Próbki o objetosci 1 ml doprowadza sie do pH 2 za pomoca 1 N HCl, inkubuje w temperaturze 4°C w ciagu 52 godzin i zobojetnia przez dodanie NaOH, po czym okresla aktywnosc interferonu w zwyklym badaniu zahamowania CPE. Próbki o objetosci 25 /Ol o aktywnosci 500 jednostek/ml /nie poddane obróbce/ inkubuje sie z 25/ul roztworu króliczych o przeciwcial leukocytom ludzkim w temperaturze 37 C w ciagu 60 minut, wiruje przy 12000 x g przez 5 minut i bada supernatant*14 148 261 Tablica i Czynnik , dzialajacy Kontrola 1 /bialka , bakteryjne/ 1 Bakteryjny , LelF A Standard i LelF i i i i i i i i i i i i i i i • i i Dzialanie przeciw Ilosc zwierzet przezywa- Jecycn 0/3 3/3 3/3 przeciwwirusowe róznych preparatów LelF zakazeniu wirusem Surowicze dzien 2 10 "\ 0 3 oJ 0 0 0 0 0 0 EMC u malp saimiri czynniki tworzece lysinki 1 dzien 3 \ 3xl04 ~) ' ° 1 i 0 J ^io4 i 0 1 0 i 0 i 0 1 0 i 0 , jednostki 1 dzien 4 105 * 1 1,200 i 0 < i 0 1 o i 0 i 0 1 o i 0 na ml i : f3,4xl04 i ) ; Wszystkie malpy se samcami /sredni ciezar 713 g/ i nie wykazuje przed zakazeniem przeciwcial przeciw wirusowi EMC* Malpy zakaza sie domiesniowo 100 x LD5q wirusa EMC /oznaczo¬ nymi na myszach/* Malpy kontrolne padly po 134, 156 i 164 godzinach od zakazenia* Leczenia interferonem /106 jednostek/ dokonuje sie przez dozylne podawanie w godzinach: -4t +2, 23, 29, 48, 72, 166 i 240 w stosunku do czasu zakazenia* Bakteryjny interferon leukocytów jest frakcje otrzymane przy prowadzeniu chromatografii kolumnowej lizatu E*coli 294/pLeIF A 25 o aktywnosci wlasciwej 7,4 x 10° jednostek/mg bialka* Kontrolne bialka bakteryjne se równowazne frakcje otrzymane przy prowadzeniu chromatografii kolumnowej lizatu E.coli 294/pBR322 przy dwukrotnym zageszczeniu bialka calkowitego* Standardem interferonu leukocytów jest interferon indukowany wirusem Sendai, z normalnych komórek ludzkich "buffy coat", oczyszczony chromatograficznie do aktywnosci wlasciwej 32 x 106 Jednostek/ag bialka* Malpy kontrolne wykazywaly postepujecy letarg* utrate równowagi, porazenie wiot¬ kie tylnych konczyn i zaburzania w równowadze plynów zwiezane z oczami, zaczynajece sie osiem godzin przed smiercie* Malpy leczone interferonem nie wykazywaly zadnego z tych nienormalnych objawów, pozostawaly aktywne przez caly czas 1 nie wykazywaly wiremii* Jedyna malpa w grupie kontrolnej* u której nie powstala w ciegu 4 dni wiremia, padla ostatnia /164 godziny po zaka¬ zeniu/* Wykazywala ona jednak wysokie miana wirusa w sercu i mózgu post aortem* U malp leczo¬ nych interferonem nie powstawaly przeciwciala przeciw wirusowi EMC, jak to oznaczono 14 1 21 dnia po zakazeniu. Wyniki te wykazuja, ze przeciwwirusowe dzialanie preparatów LelF u zakazonych zwierzet moze byc przypisane jedynie interferonowi, poniewaz bialka zanieczyszczajace se cal¬ kowicie rózne w preparatach bakteryjnych i "buffy coat"* Wyniki te wskazuje poza tym, ze glikozylacja nie Jest wymagana jesli chodzi o aktywnosc przeciwwirusowe LelF A in vivo* Przyk lad II* Wytwarzanie szczepów E.coli zdolnych do wytwarzania doj¬ rzalych LelF B - H.Z plazmidu zawierajecego calkowicie scharakteryzowany cONA LelF A wycina sie DNA za pomoce Pstl, izoluje elektroforetycznie i znakuje 32P* Otrzymanego znaczonego promienio¬ twórczo DNA uzywa sie jako próbki do screeningu dodatkowych transformantów E.coli 294, otrzy¬ manych w ten sam sposób jak opisano w czesci B przykladu I, metode screeningu kolonii in situ 6run6telna i Hogaessa /patrz wyzej/* Izoluje sie kolonie hybrydyzujece z próbke w róznych148 261 15 ilosciach. Izoluje sie plazmidowy DNA z tych kolonii oraz dziesieciu hybrydyzujecych kolo¬ nii okreslonych w czesci G, jak wyzej, przez przeciecie Pstl i charakteryzuje trzema róznymi metodami* Po pierwsze, fragmenty Pstl charakteryzuje sie przez sposób, w jaki trawione sa one przez endonukleazy restrykcyjne, z uzyciem enzymów Bgl II, Pvu II i EcoRI. Analiza ta pozwala na klasyfikacje co najmniej osmiu róznych typów /LelF A, LelF B, LelF C, LelF D, LelF E, LelF F, LelF G i LelF H/ przedstawionych na fig.5, gdzie rózne naciecia restrykcyjne przedstawione se /w przyblizeniu/ wzgledem dodatkowej znanej presekwencji i sekwencji koduje- cej LelF A* Uwaza sie, ze jeden z nich, LelF D jest identyczny z tym,o którym doniesli Negata i inni, Nature, 284, 316 - 320 /1980/.Po drugie, rózne DNA bada sie metode selekcji hybrydyzacyjnej, opisane przez Clevelanda i innych. Celi, 20, 95 - 105 /l980/, pod wzgledem zdolnosci do wybiórczego usuwa¬ nia mRNA LelF z RNA komórek KG-1 zawierajecego poli A. LelF A, B, C i F okazaly sie w tej próbie pozytywne.Po trzecie, dalsze fragmenty Pstl wprowadza sie do plazmidu wykazujecego ekspresje, transformuje tym plazmidem E.coli 294 i doprowadza do ekspresji fragmentów. Produkty ekspre¬ sji, co do których uwaza sie, ze zawieraje pre-interferony, byly wszystkie pozytywne w badaniu aktywnosci CPE interferonu, aczkolwiek w przypadku fragmentu LelF aktywnosc byla bliska grani¬ cy. Oprócz powyzszych badan wszystkie trzy LelF poddano badaniu sekwencji* A. Wytwarzanie E.coli 294 /pLelF B trp 7.Sekwencja izolowanego fragmentu zawierajecego gen dojrzalego LelF B wskazuje na pierwsze 14 nukleotydów identycznych w typie A i B. Zgodnie z tym izoluje sie fragment genu pLelF A25 zawierajecy uklad promotor-operetor trp, miejsce przylaczenia rybosomów i startu genu LelF A /»B/ i miesza z pozostaloscia, czesci sekwencji B w plazmidzie wykazujecym ekspre¬ sje. Odpowiednie mapy restrykcyjne fragmentu Pst pL4 /plazmid zawierajecy gen LelF B zakon¬ czony Pst, pokazany na fig.5/ i pLelF A25 przedstawiono na rysunku, odpowiednio na fig.7a i 7b.Dla otrzymania fragmentu Sau3a - Pstl o okolo 950 b.p. z sekwencji przedstawionej na fig.7a, niezbednych jest kilka stadiów, a to z powodu obecnosci jednego lub kilku wytre- conych miejsc restrykcyjnych Sau3af a mianowicie: 1. Izoluje sie nastepujace fragmenty: a/ Sau3a-EcoRI o 110 b.p., b/ EcoRI-Xba o 132 b.p. oraz c/ Xba-Pst o 700 b.p, 2. Fragmenty /la/ i /Ib/ leczy sie i nacina za pomoce Xba i Bglll w celu zapobie¬ zenia samopolimeryzecji koncami Sau3a i Xba /zwiazane z omawiane sprawe miejsce Sau3a znajdu¬ je sie w miejscu Bglll, a Bglll nacina z pozostawieniem lepkiego konca Sau3a/. Izoluje sie fragment o 242 b.p. 3. Produkty otrzymane w stadiach /2/ i /lc/ leczy sie i nacina Pst i Bglll, takze w celu zapobiezenia samopolimeryzacji. Izoluje sie odpowiedni fragment Sau3a - Pst I o 950 b.p. /fig.7a/« Fragment ten zawiera czesc genu LelF B, która nie jest wspólna z LelF A. 4. Z pLelF A25 izoluje sie fragment Hindlll - Sau3a o okolo 300 b.p. zawierajecy uklad promotor-operator trp, miejsce przyleczenia rybosomów, sygnal startu ATG i kodon cysteiny LelF A. 5. z pBR322 izoluje sie fragment Pstl - Hindlll o okolo 3600 b.p. Zawiera on repli- kon i koduje opornosc na tetracykline, ale nie na ampicyline. 6. Fragmenty otrzymane w stadiach /3/, /4/ i /5/ leczy sie razem i powstalym plaz¬ midem transformuje komórki E.coli K-12 szczep 294.Transformanty poddaje sie miniscreeningowi / Birnboim i inni, Nucleic Acid Res., 7, 1513 - 1523 /1979/ i próbki plazmidu trawi EcoRI. Produkt trawienia dostarcza 3 fragmenty o nastepujecej charakterystyce: 1/ fragment EcoRI - EcoRI promotora trp, 2/ wewnetrzny fragment EcoRI - EcoRI pL 4, oraz 3/ fragment bialkowy sygnalu poczetku translacji - EcoRI pL 4.Ekstrakty bakteryjne klonów otrzymanych w powyzszy sposób wykazuje zwykle w próbie CPE okolo 10 x 106 jednostek aktywnosci interferonu na litr A550 « i. Oednym z reprezenta¬ tywnych klonów otrzymanych w ten sposób jest E.coli 294/pLeIF B trp 7.16 148 261 B* Wytwarzanie szczepów E.coli zdolnych do wytwarzania dojrzalych interferonów leukocytów /LelF C,D,FfH/* Dodatkowe fragmenty genów /o pelnej dlugosci/ innych typów LelF mozna poddawac obróbce 1 wprowadzac do nosników ekspresji tak, jak w przypadku LelF A. Badanie calkowitej sekwencji zwyklymi srodkami ujawni, czy miejsce restrykcyjne lezy dostatecznie blisko kodonu pierwszego aminokwasu dojrzalego interferonu typu pozwalajacego na dogodne podjecie dzialan zastosowanych w czesci G przykladu I, jak wyzej* w celu ekspresji dojrzalego LelF A, to Jest eliminacji presekwencji przez naciecie enzymem restrykcyjnym i przywrócenie kodonów N-koncowych aminokwasów utraconych przy eliminacji presekwencji przez wleczenie fragmentów syntetycznego DNA, Jesli nie spelni to zadania, mozna zastosowac nastepujacy sposób* Mówiec zwiezle, fragment zawierajecy presekwencje odszczepia sie dokladnie przed punktem, w którym zaczyna sie kodon pierwszego aminokwasu dojrzalego polipeptydu, przez: 1/ konwersje dwuniciowego DNA do jednoniciowego w regionie otaczajecym ten punkt* 2/ hybrydyzacje jednoniciowego regionu utworzonego w stadium /a/ z komplementarnym primerem dlugosci jednoniciowego DNA* przy czym koniec 5# prinara jest polozony przeciwnie do nukleotydu przylegajacego do zedanego miejsca rozszczepienia* 3/ przywrócenie czesci drugiej nici wyeliminowanej w stadium /!/, umiejsco¬ wionej w kierunku 3#od primera, za pomoce reakcji z udzialem polime razy DNA w obecnosci tri- fosforanów nukleotydów* zawierajecych adenine, tymine* guanine i cytozyne oraz 4/ trawienie pozostalego jednoniciowego DNA wystajacego poza zedany punkt rozszczepienia* Krótkie fragmenty syntetycznego DNA konczace nic kodujece w stronie konca 3*, z sygnalem poczetku translacji ATG. mozna przyleczyc, np* przez leczenie wolnych konców, do powstajecego w wyniku obróbki genu dojrzalego interferonu okreslonego typu i gen wleczyc do plazmidu wykazujecego ekspresje pod kontrole promotora i poleczonego z nim miejsca przylecze- nia rybosomów* W sposób podobny do zastosowanego w czesci A wyzej, uksztaltowuje sie odpowiednio fragmenty genów LelF C i LelF D do bezposredniej ekspresji bakteryjnej* W strategie ekspresji tych dodatkowych interferonów leukocytów wchodzi w kazdym przypadku przywrócenie fragmentu HindIII-Sau3a o okolo 300 b*p*f zawierajecego uklad promotor-operator trp, miejsce przylacze¬ nia rybosomów* sygnal startu ATG i kodon cysteiny LelF A z pLelF A25* Dolecza sie do niego fragmenty genów z genów dodatkowych interferonów, kodujece odpowiednie sekwencje aminokwasów poza poczetkowe cysteine wspólne dla wszystkich* Kazdego otrzymanego plazmidu uzywa sie do transformowania E*coli K-12 szczep 294.W celu utworzenia odpowiednich genów stosuje sie nastepujece poleczenia: C* Wytwarzanie E*coli 294/pLeIF C trp 35 Izoluje sie z pLelF C nastepujece fragmenty: a/ Sau3a - Sau96 o 35 b*p*, b/ Sau96 - Pstl o 900 b*p*. c/ z pLelF A25 izoluje sie odpowiedni fragment HindIII-Sau3a o okolo 300 b*p* sposo¬ bem opisanym wyzej w czesci K/4/, d/ izoluje sie fragment jak opisano wyzej w czesci K/5/ o okolo 3600 b*p* Konstruowanie: 1/ leczy sie a/ i c/, rozszczepia Bglll, Hindlll i izoluje produkt o okolo 335 b*p.# 2/ leczy 6ie trzy fragmenty: 1/ ? b/ ? d/ i otrzymanego plazmidu uzywa sie do transformowania E*coli* Reprezentatywnym klonem otrzymanym w powyzszy sposób jest E*coli K-12 szczep 294/ pLelF C trp. 35* D. Wytwarzanie E*coli 294/pLeIF D trp 11 Z pLelF D izoluje sie nastepujece fragmenty: a/ Sau3a - AvaII o 35 b*p*t b/ AvaIII - Bglll o 150 b*p*, c/ Bglll - Pstl o okolo 700 b.p., z pLelF A25 izoluje sie nastepujecy fragment: d/ Hindlll - Sau3a o 300 b*p* Z pBR322 izoluje sie nastepujecy fragment: e/ Hindlll - Pstl o okolo 3600 b*p.148 261 17 Konstruowanie; 1/ leczy sie 1/ i b/, nacina Bglll i oczyszcza produkt 1/ o 185 b.p., 2/ leczy 1/ i d/, nacina Hindlll, Bglll i oczyszcza produkt /2/ o okolo 500 b.p., 3/ leczy sie 2/ + c/ ? e/ i uzywa otrzymanego plazmidu do transformowania E.coli.Reprezentatywnym klonem otrzymanym w powyzszy sposób jest E.coli K-12 szczep 294/ pLelF O trp 11.E. Wytwarzanie E.coli 294/pLeiIF trp 1 Fragment zawierajecy LelF F mozna przygotowac do bezposredniej ekspresji przez powtórzenie, dogodne z powodu calkowitej homologii, aminokwaów 1-13 LelF B i LelF C.Fragment a/ zawierajecy promotor trp z odpowiednio uksztaltowanymi koncami otrzymu¬ je sie z opisanego wyzej pHGH207, przez trawienie Pstl i Xbal, a nastepnie izolowanie fragmen¬ tu o okolo 1050 b.p. Drugi fragment b/ otrzymuje sie z wiekszego z fragmentów powstajecych w wyniku trawienia plazmidu pHKY 10 przez Pstl i Bglll.Fragment a/ zawiera okolo polowy genu kodujecego opornosc na ampicyline, a frag¬ ment b/ zawiera pozostale czesc tego genu i calkowity gen opornosci na tetracykline pozostawio¬ ny dla przyleglego promotora.Fragmenty a/ i b/ leczy sie za pomoce ligazy T4 i produkt traktuje Xbal i Bglll w celu wykluczenia dimeryzacji, tworzec fragment c/ zawierajecy uklad promotor - operator trp i geny opornosci na tetracykline i ampicyline.Fragment d/ o okolo 580 b.p. otrzymuje sie z pLelF przez trawienie AvaII i Bglll.Zawiera on kodony aminokwasów 14 - 166 LelF F.Fragment e/ o okolo 49 b.p. otrzymuje sie z pLelF B przez trawienie Xbal i AvaII.Fragment e/ koduje aminokwasy 1-13 LelF F.Trzy fragmenty c/, d/ i e/leczy sie razem w obecnosci ligazy T 4. Lepkie konce od¬ powiednich fragmentów se tego rodzaju, ze zlozony z nich plazmid przybiera postac koliste prawidlowo z umiejscowieniem genu opornosci na tetracykline pod kontrole ukladu promotor - ope¬ rator trp razem z genem dojrzalego LelF F tak, ze bakterie transformowane zedanym plazmidem mozna wyselekcjonowac na plytkach zawierajecych tetracykline. Reprezentatywnym klonem otrzy¬ manym w powyzszy sposób jest E.coli K-12 szczep 294/pLeIF F trp 1.F. Wytwarzanie E.coli 294/pLeIF H Calkowity gen LelF M mozna uksztaltowac w celu ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów w nastepujecy sposób: 1/ Plazmid pLelF H poddaje sie trawieniu Haell i Rsal z izolowaniem fragmentu o 816 b.p. rozciegajecego sie od aminokwasu 10 sygnalowego peptydu do nie kodujecego regionu 3#. 2/ Fragment denaturuje sie i poddaje syntezie reperacyjnej z uzyciem polinerazy DNA I /fragment Klenova/ /Klenow i inni, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 65 - 168 /1970/ stosujec synte¬ tyczny dezoksynukleotydowy 5#- sATG TGT AAT CTG TCT. 3/ Powstaly produkt rozszczepia sie Sau3a i izoluje fragment o 452 b.p. reprezentu- jecy aminokwasy 1 - 150. 4/ Przez trawienie pLelF G za pomoce Sau3a i Pstl i izolowanie powstajacego fragmen¬ tu o 500 b.p. uzyskuje sie gen kodujecy aminokwasy od 150-go do konca kodujecej sekwencji. 5/ Fragmenty izolowane w stadium 3/ i 4/ leczy sie z utworzeniem fragmentu: 1 166 met cys asp stop ATG TGT ... —/ .... GAT TGA Pstl Sau3a kodujecego 166 aminokwasów LelF H. 6/ pLelF A trp 25 trawi sie Xbal, leczy wolne konce za pomoce polimerazy ONA 1 trawi produkt P6tl. Powstajecy duzy fragment mozna wyizolowac i poleczyc z produktem otrzymanym w stadium /5/ z utworzeniem plazmidu wykazujecego ekspresje, zdolnego po transformacji E.coli K-12 szczep 294 lub innej bakterii - gospodarza, do ekspresji dojrzalego LelF H.Przyklad III. Wytwarzanie szczepów E.coli zdolnych do wytwarzania LelF 113 A. Wytwarzanie E.coli 294/pLeIF I Faze A Charon 4A zbioru rekombinantów ludzkiego genomu skonstruowanego przez Lawna i innych. Celi, 15, 1157 /1978/, poddaje sie screeningowi pod wzgledem genów interferonu leuko¬ cytów metode opisane przez Lawna i innych /jak wyzej/ i Maniatisa i innych. Celi, 15, 687 /1978/.18 148 261 Próbke promieniotwórcze LelF pochodzece z cDNA klonu LelF A stosuje sie do scree- nlngu okolo 500 000 lysinek* Za pomoce tego screeningu otrzymano 6 klonów z genomem LelF.Po powtórnym screeningu i oczyszczeniu materialu z lysinek. Jeden z tych klonów, \ HLeIF2# wybrano do dalszych badan* Stosujac metody opisane wyzej do korzystnego izolowania dodatkowych klonów LelF z genomu ludzkiego mozna uzyc innych próbek • Moge byc one z kolei stosowane do wytwarzania Innych bialek lnterferonowych leukocytów* 1* Dokonuje sie podklonowania fragmentu EcoRI o 2 000 b.p. klonu A HLelF2 do miejs¬ ca EcoRI w pBR325* Powstajecy plazmid LelF rozszczepia sie i izoluje fragment o 2 000 b*p* Oezoksyoligonukleotyd dAATTCTGCAG /konwertor EcoRI - Pstl/ leczy sie z fragmentem EcoRI o 2 000 b*p. zawierajecego konce Pstl* Rozszczepia sie go Sau96 i izoluje fragment, który ma jeden koniec Pstl a jeden Sau 96, o 1 100 b.p* 2* Plazmid pLelF C trp 35 trawi sie Pstl 1 Xbal* Izoluje sie duzy fragment* 3* Maly fragment Xbal - Pstl z pLelF C trp 35 trawi sie Xbal 1 Sau96* Izoluje sie fragment Xbal - Sau96 o 40 b*p* 4* Fragmenty izolowane w stadiach /l/, /2/ i /3/ leczy sie z utworzeniem wykazuje- cego ekspresje plazmidu pLelF I trp.l* B* Wytwarzanie E.coli 294/pLeIF O 1. Plazmid pLelF 3 zawiera fragment Hindlll DNA genomu ludzkiego o 3,8 kilozesad, w którego sklad wchodzi sekwencja genu LelF 3* Z plazmidu tego izoluje sie fragment Ddel - Real o 760 b*p* 2* Plazmid pLelF B trp 7 rozszczepia sie Hindlll i Ddel i izoluje sie fragment Hindlll - Ddel o 340 b.p* 3* Plazmid rozszczepia sie Pstl, konce przeksztalca sie w wolne za pomoce polime- razy DHAI /fragment Klanowa/, a nastepnie trawi Hindlll* Izoluje sie duzy fragment o okolo 3600 b*p* 4* Fragmenty izolowane w stadiach /l/, /2/ i /3/ leczy sie z utworzeniem wykazuje- cego ekspresje plazmidu pLelF 3 trp 1* Zastrzezenia patentowe 1* Sposób wytwarzania drobnoustrojów zdolnych do wytwarzania dojrzalego interfe¬ ronu leukocytów ludzkich, zawierajecego 165 - 166 aminokwasów lub w przypadku gdy metionina Jest przyleczona do N-konca pierwszego aminokwasu tego interferonu, 166-167 aminokwasów oraz czesciowe sekwencje eminokwasowe Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser,jak wskazano na fig*4 lub fig*9 w pozycji od 139 do 151, polegajecy na transformowaniu szczepu E*coli nosnikiem ekspresji i hodowli transformowanego szczepu, znamienny tym, ze konstruuje sie wektor E*coli zawierajecy promotor trp E.coli, operator i liderowe miejsce przylaczania rybosomów trp, izoluje sie gen kodujecy interferon leukocytów ludzkich ze zbioru kolonii bakteryjnych zawierajecych DNA komplementarny z indukowanym mRNA leukocytów ludzkich lub z Indukowanym mRNA linii komórkowej bedz ludzki genomowy DNA, wycina sie przez ciecie restrykcyjne gen kodujecy interferon leukocytów ludzkich i dokonuje sie insercji tak wyciete¬ go genu z wyeliminowane jakekolwiek sekwencje liderowe mogece zapobiegac drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich za promotorem trp E.coli, operatorem i liderowym miejscem przyleczenia rybosomów trp, otrzymanym nosnikiem ekspresji E.coli, zdolnym do ekspresji w E.coli wspomnianego dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich transformuje sie w znany sposób szczep E.coli i prowadzi sie hodowle transformowanego organizmu. 2* Sposów wedlug zastrz.l, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu A leukocytów ludzkich /LelF A/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4. 3* Sposób wedlug zastrz.l, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu B leukocytów ludzkich /LeiF B/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4.148 261 19 4. Sposób wedlug zastrz. lf znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu C leukocytów ludzkich /LelF C/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig .4. 5. Sposób wedlug zastrz.l, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu O leukocytów ludzkich /LelF B/» o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4. 6. Sposób wedlug zastrzel, znamienny t y n, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu F leukocytów ludzkich /LelF F/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4. 7* Sposób wedlug zastrz.lf znamienny t y m, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu H leukocytów ludzkich /LelF H/t o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4. 8. Sposób wedlug zastrz.1, znamienny tym, ze jako wyciety gen sto¬ suje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu 1 leuko¬ cytów ludzkich /LelF I/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig* 9. 9. Sposób wedlug zastrz.1, znamienny tyn, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu J leukocytów ludzkich /LelF 3/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.9. 10* Sposób wedlug zastrz.1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, ze jako drobnoustrój E.coli stosuje sie E.coli K-12 szczep 294*Peptyd trypsynowy (T-1) Peptyd trypsynowy(T-13) Bialko Ala - Glu - Ile - Met - Arg —His~Glu-Met -Ile - Gin AA A CA AA mRNA 5' GCN GA AUC AUG GN 5' CA GA AUG AUC CA G U C U G U G A Komplemen- 3' CTT TAG TAC GC(T-1A) 3' GTA CTT TAC TA (T-13A) tarne primery T DNA C (T-1B) -»G (T-13B) —T-(T-1C) C -(T-13C) C T-(T-1D) —G C (T-13D) Fig! to148 261 Próbka 52P-T-1C 1 |345678 9 10 H 12 13 14 15 16 17^019AO 21 2225 24 25 • • • \ 26 27282930313255 543536 373839 ^ Próbka 32P-T-13C 12 5 4 5 6? R 91011 12 1514-15 16 17 1019 2fi£l 22 9Z 24 • *v«* «.• m a ? 25 26 27 28 29 30T1 32 55 34 35 36 37 38 39 ** Fig.2-60 •40 •20 ?l 20 aO LelF LelF LelF LelF LelF LelF LelF LelF H LelF A LelF B LelF LelF LelF LelF LelF LelF H LelF A LelF B LelF LelF LelF LelF LelF LelF H tgagcctaaaccttaggctcacccatttcaaccagtctagcagcatctgcaacatctacaatcgccttgacctttgctttactggtgcccctcctgctgc tactagctcagcagcatccgcaacatctacaatggccttgactttttatttaatggtggccctagtggtcc caaggttatccatctcaagtagcctagcaatatttgcaacatcccaatggccctgtccttttctttacttatgcccgtgctggtgc caaggttcagagtcacccatctcagcaagcccagaagtatctgcaaratctacgatggcctcgccctttgctttagtgatggtcctcgtcctgc acatcccaatggccctgtccttttctttactcatggccgtgctggtgc ccaaggttcagtgttacccctcatcaaccagcccagcagcatcttcgggattcccaatg(x:attgccctttgctttaatgatggccctggtggtgc 60 80 100 1-20 140 • I t • I t I I I • tcagctgcaagtcaagctgctctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacagatgaggaaaat tcagctacaagtcattcagctctctgggctgtgatctgcctcagactcacagcctgggtaacaggagggccttgatactcctggcacaaatgcgaagaat tcagctacaaatccatctgttctctgggctgtgatctgcctcagacccacagcctcggtaataggagggccttcatactcctgggacaaatgggaagaat tcagctgcaagtcaagctgctctctgggctgtgatctccctgagacccacagcctggataacaggaggaccttgatgctcctggcacaaatgagcagaat ctgcctctgggctgtgatctgcctcaggcccacagcgtgggtaacaggagggccttcatactcctgacacaaatgacgagaat tcagctacaaatccatctgttctctgggctgtgatctgcctcagacccacagcctgggtaataggagggccttgatactcctggcacaaatgggaagaat tcagctgcaagtcaagctgctctctgggctgtaatctgtctcaaacccacagcctgaataacaggaggactttgatgctcatggcacaaatgagcagaat 160 180 20(< 220 240 I I » I I f I • I I CTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTT GGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCT CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGAATTCCCCCAGGAGGAGTTTGATGATAAACAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGATTTCCGAATCCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT CTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTCCT CTCTCCTTTTTCTTACCTGAAGGACAGACATGACTTTGATTTTCCATCATCAGGTGTTTCATGGCAACCACTTCCAGAAGGTTCAAGCTATCTTCCTTTT CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTCCCCCAAGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCACAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT CATGACTTTGGATTTCCT CACGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGAATTTCCCCAGGAGGAATTTGATGGCAACCAGTTCCACAAAGCTCAAGCCATCTCTGTCCT 260 280 300 320 340 LeIF A CCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTAC LeIF B CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTTGGATGAGACGCTTCTAGATGAATTCTACATCCAACTTGAC LelF C CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTAC LelF D CCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTCArCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTAC LelF E CCATGAGATGATGCAGCAGACCTTCAACCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGATACTTGCGATGAGACCCTTTTAGACAAAfCCTACACTGAAGTTTAC LelF F CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTAAC LelF G CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGATGAGACACTTCTAGACAAATTCTACACTGAACTTTAC LelF H CCATGAGArGATGCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGAACTCArCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGAAAAATTCTACATTGAACTTTTC Fig. 3148 261 o t-b* OOOOOOOO <<<<<<<< HHHHHHHH < < << o ' < < %i$ o ooo <<<<<<<< .oooooooo HHHHHHHH OOOOOOOO OOOOOOOO oooooo OOOOOOOO OOOHOHOO O HOOOOOOO cm- H^HHHHHH OOOOOOHO OOOOOOOO H H H H p l- (_ h OOOOOOOO <<<<<<<< oooooooo oooooooo «oooooooo OOHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOOO pHHHOHHH <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH O OOOOOOOO O- OOOOOOHO ^ OOOOOOOO oooooooo ht*+* b^b^b^b^b^ OOOOOOOO O O O < O O O O <<<<<<<< oooooooo <<<<<<<< -OH<0<<<< < oooooooo b* b* 1-t" t-h1 b* h« oooooooo oooo oooooooo ooo OOHOHHHH O HHH 00- OOOOOOOO O 0<000000 o<<<<<<< oooo oooooooo <<<<<<<< OOOOHOOO h* < t* i- b+ *- i- b« -OHOOOOOO HOHHHHHH OHOOOO<0' HOHHf-OHH OHOOOOOO b^Ub^^b^Hb^b- O O < O O O O O OHOOOOOO OOOOOOOO o <<<<<<<< *- <<<<<<<< c*» OOOOOOOO oooooooo OOOHO<00 oooooooo <<<<<<<< oooooooo <<<<<<<< •<<<<<<<< OJO O O O O O O b^b^b^b^h*b^b^h* oo o o o oo< oo <<<<<<<< oooooooo oooooooo <<<<<<<< oooooooo p o CM- o o- o 00- o <<<< < o < O H O O O < O O <<<<< <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH 0 HHHHHHhl- Hb^b^b-b-b-^^b^ oooooooo ' f_ H H H H H H . o o o o o o o HHHHHHHH HHOOHHHH HOOOOOOO OOOOOOOO H HH HHHH H <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< oooooooo HHHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH <<<<<<<< <<<<<<<< <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< oooooooo b^b^b^b^b-b^b^b^ oooooooo oooooooo oooooooo <<<<<<<< oooooooo oooooooo oooooooo OOOOOH<0 oooooooo OOOOHOOO oooooooo b*b*b HHH HH HHH oooooooo OHOOOOOO OOOOOOOO oooooooo <<<<<<<< OOOOHOOO <<<<<<<< HHHHHHHH < < < <0 < < < <<<<<<<< <<<<<<<< oooooooo < <<<<<<<< oooooooo <<<<<<<< oooo <<<<<< < < < < < < < < o o < o o oo o HHHHHHHH oooooooo HHHHHHHH <<<<<<<< HHHHHHHH 0 HHHHHHHH OOOOOOOO HHHHHHOH OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH <<<<<<<< <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< <<<<<<<< <<<&<<<< OOOOOOOO OOOOHOHO HHHHHHHH O ^ - O CM- o o- o co- o H 0< H HO OH < OH < O O H H O O < OOHO<00 0 Uk-b^b^<(JCU OOOOOHHH H H H H H O O H OHHH HOO <<< O HOHH <<< HOOO< b* b< t- b* U b* hb-h HOOOHHOO 0< <0 O O < < OOOOH<00 <<<< O H O O O < O O HOHHHOHH O H O O < O H O OOHOOHHH <<<< OOHOH < O O O O H O < O O H 0< H O O O H < O O < "t < < H O < < HHHH< O < < < O H O < 0< b'hhb-<<^b* HOOOOHOO <<< OOOOH<00 H < H H H O h H HHHHHHHH <<<< oooho^coo HHHH H O O O < O O O H H O H < H H H HHHHOOHH <<<< 000<0<00 HHHOHOHH <<<< <<<<<<<< < O O O < O < O O OOOOOOOO H OH H H OH H <<<< O O O O O < O O <<<<<0 <<<<<<<< ooooo H HHHHHHHH OOOOOHOO OOOOOHOO HHHHHOHH OOOOOOOO <0 <<<<<<<< <0 obbkbbbkj hIhIhIhIhIhIhIhI <<<<<<<< oooooooo oooooooo <<<<<<<< <<<<<<<< HHOOOOOO OOOOOOOO <<<<<<<< o <<<<<<<< E P {-, h h i-, H h . <<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< <<<<<<<< <<<<<<<< o< <<< <<<<<<<< oooooooo OOOOOHOO OOOOOHOO < ad o q w u, o ac J ^?JJJ fcuj «r oo o o tij U4 o ac «) « v a< u i « ii JJJ J ^UJJ V V V l' i ti V 41148 261 o O CM- © O- o 00- o *¦ HO OHHHOO<0 < OH<<< O O OH O OO O OHOH<0<< <00 «:o< H<0 H O O H O O O < OHHHOOHO HHOH<<00 OOH OH OOH H <0 UU< HHHHHHHO H<<<<<0< < O H U O O H H H <0^b-\r{r'H 0 HOO<00<0 HOOHO < OH < 0<0<0<<0 00 h^b^ <00 << HO HO < HOOHOOOH OHH<00 0H< O H O H H H O O PL PL PL

Claims (10)

1.Zastrzezenia patentowe 1. * Sposób wytwarzania drobnoustrojów zdolnych do wytwarzania dojrzalego interfe¬ ronu leukocytów ludzkich, zawierajecego 165 - 166 aminokwasów lub w przypadku gdy metionina Jest przyleczona do N-konca pierwszego aminokwasu tego interferonu, 166-167 aminokwasów oraz czesciowe sekwencje eminokwasowe Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser,jak wskazano na fig*4 lub fig*9 w pozycji od 139 do 151, polegajecy na transformowaniu szczepu E*coli nosnikiem ekspresji i hodowli transformowanego szczepu, znamienny tym, ze konstruuje sie wektor E*coli zawierajecy promotor trp E.coli, operator i liderowe miejsce przylaczania rybosomów trp, izoluje sie gen kodujecy interferon leukocytów ludzkich ze zbioru kolonii bakteryjnych zawierajecych DNA komplementarny z indukowanym mRNA leukocytów ludzkich lub z Indukowanym mRNA linii komórkowej bedz ludzki genomowy DNA, wycina sie przez ciecie restrykcyjne gen kodujecy interferon leukocytów ludzkich i dokonuje sie insercji tak wyciete¬ go genu z wyeliminowane jakekolwiek sekwencje liderowe mogece zapobiegac drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich za promotorem trp E.coli, operatorem i liderowym miejscem przyleczenia rybosomów trp, otrzymanym nosnikiem ekspresji E.coli, zdolnym do ekspresji w E.coli wspomnianego dojrzalego interferonu leukocytów ludzkich transformuje sie w znany sposób szczep E.coli i prowadzi sie hodowle transformowanego organizmu.

2. * Sposów wedlug zastrz.l, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu A leukocytów ludzkich /LelF A/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4.

3. * Sposób wedlug zastrz.l, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu B leukocytów ludzkich /LeiF B/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.

4.148 261 194. Sposób wedlug zastrz. lf znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu C leukocytów ludzkich /LelF C/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig .

5. Sposób wedlug zastrz.l, znamienny tym, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu O leukocytów ludzkich /LelF B/» o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4.

6. Sposób wedlug zastrzel, znamienny t y n, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu F leukocytów ludzkich /LelF F/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4.

7. * Sposób wedlug zastrz.lf znamienny t y m, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu H leukocytów ludzkich /LelF H/t o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.4.

8. Sposób wedlug zastrz.1, znamienny tym, ze jako wyciety gen sto¬ suje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu 1 leuko¬ cytów ludzkich /LelF I/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig* 9.

9. Sposób wedlug zastrz.1, znamienny tyn, ze jako wyciety gen stosuje sie gen zdolny do powodowania drobnoustrojowej ekspresji dojrzalego interferonu J leukocytów ludzkich /LelF 3/, o sekwencji aminokwasów w pozycji od 1 do 166 przedstawionej na fig.

10. * Sposób wedlug zastrz.1, albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, znamienny tym, ze jako drobnoustrój E.coli stosuje sie E.coli K-12 szczep 294*Peptyd trypsynowy (T-1) Peptyd trypsynowy(T-13) Bialko Ala - Glu - Ile - Met - Arg —His~Glu-Met -Ile - Gin AA A CA AA mRNA 5' GCN GA AUC AUG GN 5' CA GA AUG AUC CA G U C U G U G A Komplemen- 3' CTT TAG TAC GC(T-1A) 3' GTA CTT TAC TA (T-13A) tarne primery T DNA C (T-1B) -»G (T-13B) —T-(T-1C) C -(T-13C) C T-(T-1D) —G C (T-13D) Fig! to148 261 Próbka 52P-T-1C 1 |345678 9 10 H 12 13 14 15 16 17^019AO 21 2225 24 25 • • • \ 26 27282930313255 543536 373839 ^ Próbka 32P-T-13C 12 5 4 5 6? R 91011 12 1514-15 16 17 1019 2fi£l 22 9Z 24 • *v«* «.• m a ? 25 26 27 28 29 30T1 32 55 34 35 36 37 38 39 ** Fig.2-60 •40 •20 ?l 20 aO LelF LelF LelF LelF LelF LelF LelF LelF H LelF A LelF B LelF LelF LelF LelF LelF LelF H LelF A LelF B LelF LelF LelF LelF LelF LelF H tgagcctaaaccttaggctcacccatttcaaccagtctagcagcatctgcaacatctacaatcgccttgacctttgctttactggtgcccctcctgctgc tactagctcagcagcatccgcaacatctacaatggccttgactttttatttaatggtggccctagtggtcc caaggttatccatctcaagtagcctagcaatatttgcaacatcccaatggccctgtccttttctttacttatgcccgtgctggtgc caaggttcagagtcacccatctcagcaagcccagaagtatctgcaaratctacgatggcctcgccctttgctttagtgatggtcctcgtcctgc acatcccaatggccctgtccttttctttactcatggccgtgctggtgc ccaaggttcagtgttacccctcatcaaccagcccagcagcatcttcgggattcccaatg(x:attgccctttgctttaatgatggccctggtggtgc 60 80 100 1-20 140 • I t • I t I I I • tcagctgcaagtcaagctgctctgtgggctgtgatctgcctcaaacccacagcctgggtagcaggaggaccttgatgctcctggcacagatgaggaaaat tcagctacaagtcattcagctctctgggctgtgatctgcctcagactcacagcctgggtaacaggagggccttgatactcctggcacaaatgcgaagaat tcagctacaaatccatctgttctctgggctgtgatctgcctcagacccacagcctcggtaataggagggccttcatactcctgggacaaatgggaagaat tcagctgcaagtcaagctgctctctgggctgtgatctccctgagacccacagcctggataacaggaggaccttgatgctcctggcacaaatgagcagaat ctgcctctgggctgtgatctgcctcaggcccacagcgtgggtaacaggagggccttcatactcctgacacaaatgacgagaat tcagctacaaatccatctgttctctgggctgtgatctgcctcagacccacagcctgggtaataggagggccttgatactcctggcacaaatgggaagaat tcagctgcaagtcaagctgctctctgggctgtaatctgtctcaaacccacagcctgaataacaggaggactttgatgctcatggcacaaatgagcagaat 160 180 20(< 220 240 I I » I I f I • I I CTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTT GGCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCT CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGAATTCCCCCAGGAGGAGTTTGATGATAAACAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGATTTCCGAATCCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT CTCTCCTTCCTCCTGTCTGATGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCCAGCCATCTCTGTCCT CTCTCCTTTTTCTTACCTGAAGGACAGACATGACTTTGATTTTCCATCATCAGGTGTTTCATGGCAACCACTTCCAGAAGGTTCAAGCTATCTTCCTTTT CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTCCCCCAAGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCACAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT CATGACTTTGGATTTCCT CACGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCT CTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACATGACTTTGAATTTCCCCAGGAGGAATTTGATGGCAACCAGTTCCACAAAGCTCAAGCCATCTCTGTCCT 260 280 300 320 340 LeIF A CCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCTACACTGAACTCTAC LeIF B CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTTGGATGAGACGCTTCTAGATGAATTCTACATCCAACTTGAC LelF C CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAGAGGACTCATCTGCTGCTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTAC LelF D CCATGAGCTGATCCAGCAGATCTTCAACCTCTTTACCACAAAAGATTCArCTGCTGCTTGGGATGAGGACCTCCTAGACAAATTCTGCACCGAACTCTAC LelF E CCATGAGATGATGCAGCAGACCTTCAACCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGATACTTGCGATGAGACCCTTTTAGACAAAfCCTACACTGAAGTTTAC LelF F CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGAACAGAGCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTAAC LelF G CCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTACTTGGGATGAGACACTTCTAGACAAATTCTACACTGAACTTTAC LelF H CCATGAGArGATGCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGAACTCArCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGAAAAATTCTACATTGAACTTTTC Fig. 3148 261 o t-b* OOOOOOOO <<<<<<<< HHHHHHHH < < << o ' < < %i$ o ooo <<<<<<<< .oooooooo HHHHHHHH OOOOOOOO OOOOOOOO oooooo OOOOOOOO OOOHOHOO O HOOOOOOO cm- H^HHHHHH OOOOOOHO OOOOOOOO H H H H p l- (_ h OOOOOOOO <<<<<<<< oooooooo oooooooo «oooooooo OOHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOOO pHHHOHHH <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH O OOOOOOOO O- OOOOOOHO ^ OOOOOOOO oooooooo ht*+* b^b^b^b^b^ OOOOOOOO O O O < O O O O <<<<<<<< oooooooo <<<<<<<< -OH<0<<<< < oooooooo b* b* 1-t" t-h1 b* h« oooooooo oooo oooooooo ooo OOHOHHHH O HHH 00- OOOOOOOO O 0<000000 o<<<<<<< oooo oooooooo <<<<<<<< OOOOHOOO h* < t* i- b+ *- i- b« -OHOOOOOO HOHHHHHH OHOOOO<0' HOHHf-OHH OHOOOOOO b^Ub^^b^Hb^b- O O < O O O O O OHOOOOOO OOOOOOOO o <<<<<<<< *- <<<<<<<< c*» OOOOOOOO oooooooo OOOHO<00 oooooooo <<<<<<<< oooooooo <<<<<<<< •<<<<<<<< OJO O O O O O O b^b^b^b^h*b^b^h* oo o o o oo< oo <<<<<<<< oooooooo oooooooo <<<<<<<< oooooooo p o CM- o o- o 00- o <<<< < o < O H O O O < O O <<<<< <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH 0 HHHHHHhl- Hb^b^b-b-b-^^b^ oooooooo ' f_ H H H H H H . o o o o o o o HHHHHHHH HHOOHHHH HOOOOOOO OOOOOOOO H HH HHHH H <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< oooooooo HHHHHHHH <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH <<<<<<<< <<<<<<<< <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< oooooooo b^b^b^b^b-b^b^b^ oooooooo oooooooo oooooooo <<<<<<<< oooooooo oooooooo oooooooo OOOOOH<0 oooooooo OOOOHOOO oooooooo b*b*b HHH HH HHH oooooooo OHOOOOOO OOOOOOOO oooooooo <<<<<<<< OOOOHOOO <<<<<<<< HHHHHHHH < < < <0 < < < <<<<<<<< <<<<<<<< oooooooo < <<<<<<<< oooooooo <<<<<<<< oooo <<<<<< < < < < < < < < o o < o o oo o HHHHHHHH oooooooo HHHHHHHH <<<<<<<< HHHHHHHH 0 HHHHHHHH OOOOOOOO HHHHHHOH OOOOOOOO <<<<<<<< OOOOOOOO HHHHHHHH <<<<<<<< <<<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< <<<<<<<< <<<&<<<< OOOOOOOO OOOOHOHO HHHHHHHH O ^ - O CM- o o- o co- o H 0< H HO OH < OH < O O H H O O < OOHO<00 0 Uk-b^b^<(JCU OOOOOHHH H H H H H O O H OHHH HOO <<< O HOHH <<< HOOO< b* b< t- b* U b* hb-h HOOOHHOO 0< <0 O O < < OOOOH<00 <<<< O H O O O < O O HOHHHOHH O H O O < O H O OOHOOHHH <<<< OOHOH < O O O O H O < O O H 0< H O O O H < O O < "t < < H O < < HHHH< O < < < O H O < 0< b'hhb-<<^b* HOOOOHOO <<< OOOOH<00 H < H H H O h H HHHHHHHH <<<< oooho^coo HHHH H O O O < O O O H H O H < H H H HHHHOOHH <<<< 000<0<00 HHHOHOHH <<<< <<<<<<<< < O O O < O < O O OOOOOOOO H OH H H OH H <<<< O O O O O < O O <<<<<0 <<<<<<<< ooooo H HHHHHHHH OOOOOHOO OOOOOHOO HHHHHOHH OOOOOOOO <0 <<<<<<<< <0 obbkbbbkj hIhIhIhIhIhIhIhI <<<<<<<< oooooooo oooooooo <<<<<<<< <<<<<<<< HHOOOOOO OOOOOOOO <<<<<<<< o <<<<<<<< E P {-, h h i-, H h . <<<<<<< OOOOOOOO <<<<<<<< <<<<<<<< <<<<<<<< o< <<< <<<<<<<< oooooooo OOOOOHOO OOOOOHOO < ad o q w u, o ac J ^?JJJ fcuj «r oo o o tij U4 o ac «) « v a< u i « ii JJJ J ^UJJ V V V l' i ti V 41148 261 o O CM- © O- o 00- o *¦ HO OHHHOO<0 < OH<<< O O OH O OO O OHOH<0<< <00 «:o< H<0 H O O H O O O < OHHHOOHO HHOH<<00 OOH OH OOH H <0 UU< HHHHHHHO H<<<<<0< < O H U O O H H H <0^b-\r{r'H 0 HOO<00<0 HOOHO < OH < 0<0<0<<0 00 h^b^ <00 << HO HO < HOOHOOOH OHH<00 0H< O H O H H H O O PL PL PL