CS273152B2 - Method of mature human leucocytic interferon production - Google Patents

Description

Vynález ae týká způsobu výroby zralého lidského leukoeytárního interferonu s částečnou aminokyselinovou sekvencí Cys-Als-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Mat-Arg-Ser se 165 až 166 aminokyselinami a s aminokyselinou Asp, Glu nebo Val v poloze 114 nebo, jestliže je na N-konec první aminokyseliny shora uvedené interferonu připojen msthionin, se 166 až 167 aminokyselinami a s aminokyselinou Asp, Glu nebo Val v poloze 115.

Podstata způsobu výroby podle vynálezu spočívá v tom, že se nechá růst kmen B. coli transformovaný expresním vektorem vybraným ze skupiny sestávající z plasmidů pleli A trp 25, pleli¹ B trp 7, pleli¹ trp 1, pleli¹ C trp 35, plel? D trp 11, plel? H, pleli I trp 1 a pleli¹ J trp 1 v kompletní živné půdě, s výhodou 1 bujónu, obsahující tetraoyklin do hodnoty absorbance při 550 nm 1,0, kultura se zředí do živné půdy na bázi hydrogenfosforečnanu obsahující tetraoyklin, kultura se nechá růst do hodnoty absorbance při nm 1,0, interferon se isoluje způsoby jako srážení, chromatografie podle velikosti (SEOsize exolusion chromatography), vysokotlaká kapalinová ohromatigrafie na obrácených fázích nebo afinitivní chromatografie na imobilizovaných anti-interferonových protilátkách.

Způsoby výroby meziproduktů použitých v předloženém vynálezu, tj. buněk E.coli schopných produkovat zralé lelí a expresních vektorů schopných exprese zralých Lelí, jsou předměty patentů č. P 273 181 a P 273 182.

lidský leukocytární interferon (Lelí) byl poprvé objeven a připraven ve formě velmi surových sraženin Isaacsem a lindenmannem (viz časopis Proč. R. Soc. B 147» 258-267 (1957) a USA patent 3 699 222). 0& té doby pokračuje snaha o vyčištění a charakterizaci tohoto materiálu, a toto úsilí vedlo k přípravě relativně homogenních leukocytárních interferonů získaných z normálních nebo leukemickýoh donorských leukocytů (viz NSR patentový zveřejňovací spis Číslo 2 947 134). Tyto interferony tvoří skupinu bílkovin, o kterých je známo, že mají schopnost udělovat svým cílovým buňkám resistenci vůči virům. Interferon může dále působit inhibičně na proliferaoi buněk a modulovat imunitní odpověď. Tyto vlastnosti interferonů inspirovaly jejich klinické použití jako terapeutických prostředků pro léčení virových infekcí a maligních onemocnění.

leukocytární interferony byly vyčištěny až v podstatě do homogenního 3tavu (viz Rubinstein a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76. 640-644 (1979); Zoon a spolupracovníci, tamtéž, 76, 5601-5605 (1979), a jejich uváděné molekulární hmotnosti ae pohybují v rozmezí od asi 17500 do asi 21000. Specifická aktivita těchto preparátů je pozoruhodně vysoká, 2x10 až 1x10^J jednotek na mg bílkoviny, ale výtěžky metod používajících buněčných kultur jsou odrazujícím způsobem nízké. Přesto pokroky v pracovních technikách pro stanovování bílkovinových sekvencí dovolily určení částečných sledů aminokyselin v těchto interferonech (viz Zoon a spolupracovníci, Science 207, 527 (1980); levý a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 5102-5104 (1980)). Objasnění glykosylace různých leukocytárních interferonů není ještě v současné době úplné, ale již nyní je zřejmé, že rozdíly v glykosylaci mezi jednotlivými členy skupiny nevysvětlují samy o sobě spektrum pozorovaných molekulových hmotností, leukocytární interferony se mimo to zjevně liší ve složení a pořadí aminokyselin, a shodnost aminokyselin jest v některých případech nižší než 80 %.

Zatím co isolace interferonů z donorských leukocytů zajistila materiál postačující k částečné charakterisaci a k omezeným klinickým studiím s homogenním leukocytárním interferonem, je tento zdroj zcela nedostatečným pro získávání interferonu v množstvích potřebných pro jeho klinické zkoušení v širokém rozsahu a pro jeho rozsáhlé použití k profylaktickým a/nebo terapeutickým účelům. Současné klinické výzkumy používající interferony získané z lidských leukocytů k testování jejich antineoplastického a antivirového účinku se vskutku principiálně omezily jen na surové preparáty (o čistotě menší než 1 %) a dlouhé doby potřebné pro výrobu dostatečných množství spolu s nereálnou výškou cen kriticky zdržely výzkum na široké frontě.

CS 273 152 B2

Nástup technologie rekombinace DNA umožnil kontrolovanou mikrobiální produkci enormní řady užitečných polypeptidú. V současné době jsou již k dispozici bakterie modifikované touto technologií umožňující výrobu takových polypeptidických produktů jako jsou somatostatin, A a B řetězce lidského insulinu a lidský růstový hormon (viz Itakura se spolupracovníky, Science 193, 1056-1063 (1977; Goeddel se spolupracovníky, Nátuře 281, 544-548 (1979))· Nověji bylo technologií rekombinace DNA použito k bakteriální produkci proinsulinu a thymosinu alfa 1, a řada autorů referuje, že nalezli DNA kódování pro lidský leukocytární interferon a že vzniklé bílkoviny měly účinnost leukocytárního interferonu (Nagata a spolupracovníci, Nátuře 284, 316-320 (1980; Mantei a spolupracovníci, Gene 10, 1-10 (1980); Taniguchi a spolupracovníci, Nátuře 285, 547-549 (1980)).

Výkonným útvarem při technologii rekombinace DNA je plasmid, chromosomů prostá smyčka dvouvláknové DNA nalezená v bakteriích a v jiných mikrobech, často v mnohonásobných kopiích v jedné bakteriální buňce. V informaci zakódované v plasmidické DNA jest včleněna informace potřebná k reprodukci plasmidu do dceřiných buněk (tzv. replikon) a obvykle jedna nebo více selekčních charakteristik, jako je v případě bakterií rezistence vůči antibiotikům, která dovoluje, že klony hostitelské buňky obsahující plasmid, který je předmětem našeho zájmu mohou být rozpoznány, vyhrány a přednostně pěstovány v selektivním růstovém prostředí. Užitečnost bakteriálních plasmidů spočívá ve skutečnosti, že je lze specificky štěpit jednou nebo druhou restrikční endonukleásou neboli restrikčním enzymem, přičemž každá z těchto endonukleáz rozpoznává na plasmidické DNA odlišné místo štěpení. Po rozštěpení lze do plasmidu vpravit cizorodé (heterologní) ge:. ny nebo fragmenty genů bucL přímým připojením v místě rozštěpení nebo připojením na rekonstruovaných koncích sousedících s místem rozštěpení. Rekombinace DNA se provádí vně buněk, ale vzniklý rekombinovaný plasmid lze zavést do bakteriálních buněk postupem známým jako transformace a kultivací získaného transformantu lze připravit velká množ' štvi rekomhinovaného plasmidu obsahujícího heterologní gen. Kromě toho, podle toho kam se gen vhodně zavede vzhledem k částem plasmidu, které řídí transkripci (přepis) a translaci (překlad) zakódovaných DNA informací, lze získaný exprese schopný nosič použít k aktuální produkci polypeptidické sekvence, pro kterou je vestavěný gen kokován; tento postup se v popisu vynálezu označuje jako exprese.

Exprese je iniciována v oblasti známé jako promotor, která je rozpoznávána a na kterou se připojuje RNA-polymeráza. V některých případech, jako v případu tryptofanového (trp) promotoru, kterého se s výhodou používá při praktickém provádění způsobu podle tohoto vynálezu, jsou oblasti promotoru překryty oblastmi operátoru a vytváří se kombinovaný promotor-operátor. Operátory jsou sekvence DNA, které jsou rozpoznávány tak zvanými represorovými bílkovinami, které slouží k regulování frekvence iniciace transkripce u specifického promotoru. Polymeraza se pohybuje podél řetězce DNA, transkribuje informace obsažené v kódovacím vláknu DNA z jeho 5' konce na 3* konec informační kyseliny ribonukleové (m-RNA) a tyto informace se ihned překládají do polypeptidické sekvence, která má takové pořadí aminokyselin, pro které je příslušná DNA kódována. Každá aminokyselina je zakódovaná jediným tripletem nukleotidů, neboli kodonem, pro který je v popisu vynálezu používán termín strukturální gen a který označuje tu část DNA, ve které je zakódována aminokyselinová sekvence exprimovaného peptidického produktu. Poté, co se RNA polymeraza navážena promotor, transkihuje nejprve nukleotidy kódováním ribosomového vazebného místa, pak dojde k iniciaci translace neboli k signálu start (obyčejně kodonem ATG, který se ve vzniklé m-RNA stane AUG) a poté k translaci nukleotidických kodonů uvnitř samotného strukturálního genu. Na konci strukturálního genu se transkribují tak zvané stop-kodony a polymeraza může poté vytvářet další sekvenci m-RNA, která vzhledem k přítomnosti stop-signálu zůstává nepřeložena ribosomy. Ribosomy se naváží na.vazebné místo připravené na m-RNA, v bakteriích obvykle poté, co se m-RNA vytvoří, a samy produkují zakódované polypeptidy, počínaje start signálem

X

CS 273 152 B2

3t translace a konče shora zmíněným stop signálem. Žádaný produkt se tvoří jen tehdy, když jsou sekvence kódující vazebné místo ribosomů umístěny správně vzhledem k AUG iniciačnímu kodonu a když všechny zbývající kodony následují za iniciačním, kodonem ve správné fázi. Vzniklý produkt lze získat lysou hostitelské buňky a jeho oddělením od ostatních bakteriálních bílkovin vhodnou čisticí metodou.

Autoři vynálezu si uvědomili, že aplikace technologie rekombinace DNA (to je vložení interferonových genu do mikrobiálních exprimačníoh nosičů, a jejich exprese pod kontrolou regulačních prvků mikrobiálního genu) by byla nejefektivnější cestou k zajištění velkých množství leukocytárního interferonu, kterého by se přes to, že by nebyl glykosylován, jak je tomu v případě produktu z lidských leukocytů, dalo klinicky používat při léčení širokého okruhu virových a neoplastiokých onemocnění.

Podle vynálezu se první leukocytární gen dá připravit následujícím sledem operací:^-

1) Za použití parciálních aminokyselinových sekvencí lidského leukocytárního interferonu vyčištěných do homogenního stavu se zkonstruují soubory zkušebních vzorků synthetických DNA, jejichž kodony v celku představují všechny možné nukleotidické kombinace schopné zakódovat zmíněné parciální aminokyselinové sekvence.

2) Připraví se banky bakteriálních kolonií obsahující komplementární DNA (cDNA) z indukované mRNA. Jiné indukované mRNA, radioaktivně značené, se hybridizují do plasmidické cDNA z této banky. Hybridizující mRNA se eluuje a testuje se její schopnost translace na interferon pomocí oocytárního testu. Plasmidické DNA z kolonií, u kterých bylo zjištěno, že při tomto způsobu indikují interferonovou aktivitu, se dále testují na jejich schopnost hybridizace do zkušebních vzorků připravených způsobem popsaným výše ad 1).

3) Souběžně s postupem popsaným výše v části 2) se cDNA odvozená z indukované mRNA v plasmidech použije k vytvoření nezávislé banky transformovaných kolonií. Zkušebních vzorků z části 1) se použije k započetí synthesy radioaktivně značených jednovláknových cDNA, kterých se použije jako hybridačních zkušebních vzorků. Synthetické zkušební vzorky se hybridisují s indukovanou mRNA jakožto šablonou a prodlouží se reversní transkripcí za vzniku indukované, radioaktivně značené cDNA. Klony z banky kolonií, které se hybridisují do radioaktivně značené oDNA získané shora uvedeným postupem, se dále zkouší, aby se potvrdila přítomnost celé délky interferonového kódujícího genu. Jako zkušebních vzorků pro interferonový gen o plné délce lze jako takového použít kteréhokoliv domnělého genového fragmentu s částečnou délkou řetězce, získaného ve shora uvedených oddílech 1) a 2).

4) Interferonový gen o plné délce, získaný shora uvedeným postupem, se za použití synthetické DNA uzpůsobí tak, aby se odstranila jakákoliv vedoucí sekvence, která by mohla zabránit mikrobiální expresi zralého polypeptidů á aby se mu zajistilo vhodné umístění v nosiči schopném exprese vzhledem k iniciačním signálům pro start a k ribosomovému vazebnému místu mikrobiálního promotoru. Expresí získaný interferon se vyčistí do stupně dovolujícího potvrzení jeho charakteru a stanovení jeho aktivity.

5) Interferonový genový fragment připravený shora popsaným způsobem se použije jako takový ke zkoušení, cestou hybridisaoe, pro přípravu, jiných částečně homologiokých leukooytárních druhů interferonu.

Shora popsanou aplikací metod technologie rekombinace DNA bylo dosaženo mikrobiální produkce, a to ve vysokých výtěžcích a vysoké čistotě, skupiny homologických leukocytárních interferonů (neglykolysovaných) ve formě zralých polypeptidů, nedoprovázených v podstatě odpovídající presekvenoí nebo jakoukoliv její částí. Tyto interferony se dají přímo exprimovat, isolovat a čistit do stupně čistoty vhodného pro jejich použití při léčení virových a maligních onemocnění u živočichů a u lidí. Mikrobiální

CS 273 152 B2 expresí zatím získané produkty této skupiny prokázaly účinnost při testování in vitro, a v prvních zkouškách toho druhu rovněž při testování in vivo, přičemž posléze uvedené testování zahrnovalo i první zralý leukooytární interferon vyprodukovaný mikrobiálním Způsobem.

Výraz zralý leukooytární interferon používaný v popisu tohoto vynálezu značí mikrobiálně (na příklad bakteriálně) vyprodukovanou interferonovou molekulu, prostou glykosylových skupin. Zralý leukooytární interferon jest při způsobu podle vynálezu bezprostředně exprimován počínaje iniciačním signálem pro translaci (ATG) ještě před prvním aminokyselinovým kodonom přirozeného produktu. Zralý polypeptid tak může obsahovat jako první aminokyselinu ve své sekvenci methionin (pro který kóduje ATG) bez podatatné změny svého charakteru. Na druhé straně může mikrobiální hostitel zpracovat produkt translace tak, že je vynechán počáteční methionin. Zralý leukooytární interferon může být exprimován společně s konjugovanou bílkovinou jiné povahy nez je běžná vedoucí bílkovina, přičemž zmíněný konjugát se dá specificky rozštěpit v intra- nebo extracelulárním prostředí (viz britský patent číslo 2 007 676 A). Posléze může být zralý interferon produkován v konjugaci s mikrobiálním signálním peptidem, který transportuje konjugát do buněčné stěny, kde se signální peptid odštěpí a vyloučí se zralý polypeptid. Pojem exprese zralého leukocytárního interferonu značí bakteriální nebo jinou mikrobiální produkci interferonové molekuly neobsahující glykosylové skupiny ani aminokyselinové presekvenoe, které se bezprostředně zúčastňují mRNA translace lidského leukocytárního interferonového genomu.

Specifické leukooytární interferonové bílkoviny uváděné v tomto vynálezu jsou definovány pomocí stanoveného DNA genu (viz obrázky číslo 3 a 8) a podle dedukované aminokyselinové sekvence (viz obrázky 4 a 9). Rozumí se, že u těchto specifických interferonů, i když je lze vskutku všechny zahrnout do skupiny leukooytárníoh interferonových bílkovin, existují přirozené alelioké variace, které se vyskytují od případu k pří pádu. Tyto variace lze demonstrovat rozdílem (nebo rozdíly) v celkové aminokyselinové sekvenci, nebo vynecháním, substitucí, vložením, inversí nebo přidáním aminokyseliny (nebo aminokyselin) ve zmíněné sekvenci. U každé leukooytární interferonové bílkoviny uvedené v tomto vynálezu, označených symboly LelF A až LelP J, jsou zmíněné alelioké variace zahrnuty do rozsahu uvedených označení nebo termínů definujících tyto inter- , ferony.

Výhodný způsob podle vynálezu jest blíže objasněn v následujícím podrobném popisu a na přiložených obrázcích 1 až 9.

Na obrázku 1 jsou znázorněny dvě aminokyselinové sekvence, které jsou společné všem druhům interferonů isolovaným z lidských leukocytů a vyčištěných do homogenního stavu, označených T-1 až T-13. Všechny možné mRNA sekvence kódují tyto peptidy jsou znázorněny jako odpovídající DNA sekvence. Písmena A, T, G, C a U označují nukleotidy obsahující base adenin, thymin, guanin, cytosin a uraoil. Písmeno N označuje kterýkoliv z uvedených nukletidů A, G, C a U. Polynukleotidy jsou zobrazeny tak, aby se četly ze směru 5' (z leva) do 3’ (do prava), a tam, kde je znázorněna dvouvláknová (d.v.)

DNA, se naopak pročítá od spodu nebo od nekódujícího vlákna.

Na obrázku 2 je uveden autoradiogram znázorňující hybridisaci potenciálních LelP plasraidů se synthetickými deoxyoligonukleotidy značenými ^²P.

Na obrázku 3 jsou znázorněny nukleotidické sekvence (kódující vlákna) osmi genoných fragmentů, které byly isolovány jako možní kandidáti pro použití k expresi leukocytárních interferonů, a které jsou označeny písmeny A až H. Iniciační ATG kodony translace a terminační triplety každého LelP jsou podtrženy. Stop kodony neboli terminační triplety jsou následovány nepřekládanými oblastmi v poloze 3*. Včleněný gen o plné délce pro LelP A má vynechaný jeden kodon, který byl nalezen u ostatních, nekresle5

CS 273 152 B2 ných genů, jak je znázorněno ve třetí A lince obrázku 3. V poloze 5' nepřekládané oblasti předcházejí vedoucím sekvencím. Ve fragmentu E schází po isolaci celá presekvence vedoucí bílkoviny, ale je zahrnut celý gen pro předpokládaný zralý LelE E.

Ve fragmentu 5 schází po isolaci celá kódující sekvence.

Na obrázku 4- jest znázorněno srovnání osmi lei? bílkovinových sekvencí určených nukleotidickými sekvencemi. Pro aminokyseliny jsou používány jednopísměnkové zkrytky, doporučené IUPAC-IUB komisí pro biochemickou nomenklaturu: A = alanin; C = cystein;

D = kyselina asparagová; E = kyselina glutamová; P = fenylalanin; G = glycin;

H = histidin; I = isoleucin; K = lysin; B = leucin; M = methionin; N = asparagin;

P = prolin; Q ~ glutamin; R = arginin; S = serin; T = threonin; V = valin; W - tryptofan; a Y » tyrosin. Čísla označují umístění aminokyselin (S se vztahuje na signální peptid). Pomlčka na místě 44 u sekvence 165 aminokyselin interferonu LeH? A jest zavedena pro vyrovnání zmíněné BelP A sekvence se sekvencí 166 aminokyselin jiných LelF. Sekvence Bělí¹ E byla stanovena za zanedbání extranukleotidu (poloha 187 na obrázku 3) v jeho kódující oblasti. Hvězdičky označují terminační kodony, které jsou ve fázi. Aminokyseliny společné všem LelP (s výjimkou pseudogenu BelP E) jsou rovněž zřejmé. Podtržené zbytky jsou aminokyseliny, které jsou rovněž přítomné v lidském fibroblastovém interferonu.

Na obrázku 5 jsou zobrazeny mapy restrikčních endonukleáz osmi typů. (A až H) oDNA klonovaných interferony BelP. Hybridisované plasmidy byly zkonstruovány za použití metody dC : dG koncových zbytků (Goeddel D.V. a spolupracovníci, Nátuře 287, 411-416 (1980)). Při této metodě se vyříznou vložky cDNA za použití restrikční endonukleázy Pstl. čáry na konci každé oDNA vložky představují přilehlé homopolymerické dC : dG koncové zbytky. Na obrázku je rovněž označeno umístění PvuII, EooRI a BglII štěpných míst. Stínované oblasti obrázku značí kódující sekvence zralých BelP; šrafované oblasti označují sekvence kódující signální peptid; volné oblasti znázorňují 3' a 5' nekddujíoí sekvence.

Na obrázku 6 je schematicky zobrazena konstrukce genu kódujícího přímou mikrobiální synthesu zralého BelP A. Jsou vyznačena místa štěpení a vzniklé zbytky (Pst I, atd.). Zkratka b.p. označuje pár basí.

Na obrázku 7 je schematicky znázorněna restrikční mapa dvou genových fragmentů používaných k expresi zralého leukooytárního interferonu Bell·¹ B. Vyznačené kodonové sekvence jsou kódující koncová vlákna získaná digescí restrikčním enzymem Sau3 a v uvedených dvou případech.

Na obrázcích 8 a 9 jsou uvedeny DNA a aminokyselinové sekvence (pokud se týká příslušných jednopísměnkových zkratek aminokyselin viz shora uvedený popis k obrázku 4) pěti BelP bílkovin, včetně typu I a J. Hvězdička na obrázku 9 označuje terminační kodon příslušné DNA sekvence a rozdělovači čárka značí deleci nebo mezeru v sekvenci.

A. Použité mikroorganismy způsob podle vynálezu zahrnuje používání dvou mikroorganismů: bakterie E. coli x x 1776, jak je popsáno v HSA patentu č. 4 190 495 a bakterie E. coli K-12 kmen 294 (zakončení A, thi”, hsr“, hsm£), jak je popsáno v britském patentu č. 2 055 382 A. Každý z těchto mikroorganismů je uložen v Americké sbírce typových kultur (ATCC) pod označením ATCC č. 31537 a 31446. Všechny práce s rekombinovanými DNA byly prováděny v souhlase se závaznými směrnicemi Národního zdravotnického úřadu (NIH) v USA.

Způsob podle vynálezu ve svém nejvýhodnějším provedení jest popsán za použití mikroorganismů E. ooli, včetně nejen kmenů E. coli x 1776 a E. coli K-12 kmene 294, uvedených výše, ale i jiných známých kmenů E. ooli, jako E. coli B, nebo jiných

CS 273 152 B2 mikrobiálních kmenů, z nichž četné jsou uloženy a dostupné ve známých sbírkových ústavech, jako v Americké sbírce typových kultur·, viz též NSR patentový zveřejňovaoí spis 2 644 432. Mezi zmíněnými jinými mikroorganismy jsou zahrnuty na příklad kmeny Bacilli, jako na příklad Bacillus subtilis, a jiné enterobakteriální mikroorganismy, mezi kterými lze uvést na příklad kmeny Salmonella typhimurium a Serrata marcescens, které využívají plasmidů a jsou schopné replikace a exprese heterologníoh genových sekvencí v nich obsažených.

Jako hostitelského organismu pro přípravu interferonovýoh bílkovin expresí genů pro ne kódovaných, za kontroly kvasinkového promotoru, lze rovněž používat s výhodou kvasinek, jako Sacharomyces cerevisiae.

B. Zdroj a čištění leukooytární interferonové mRNA (LelP mRNA)

LelP mRNA lze získávat z lidských leukocytů, obvykle z leukocytů nemocných s chronickou myeloidní leukémií; tyto leuko.oyty lze indukovat k produkci interferonu virem Sendaiské nebo Newcastleskó nemoci, jak je popsáno na příklad v NSR patentovém zveřejňo vacím spisu č. 2 947 134. Zvláště výhodným zdrojem, používaným rovněž v této práci, jest linie buněk označená KG-1, získaná od nemocných s akutní myeloidní leukémií. Tato linie buněk, popsaná H.P. Koefflerem a D.W. Goldem v časopisu Science 200, 1153 (1978), ochotně roste v kultivačním mediu obsahujícím RPMI (Rosewell Park Memoriál Institute) 1640 plus 10 % PCS (fetální telecí sérum) inaktivované zahřátím, 25 mM pufru HEPES (N-2-hydroxyethyl-piperazin-N^,-2-ethansulfonová kyselina) a 50^ug/ml gentamicinu, a subkultivuje se na jedno až tři rozdělení dvakrát za týden. Buňky z předcházejícího kultivačního prostředí se zmrazí s 10 % DMSO (dimethylsulfoxidu). Buňky KG-1 jsou ulože ny v Americké sbírce typových kultur pod označením ATOC číslo ORL 8031.

Buňky KG-1 se indukují k produkci leukooytární interferonové mRNA virem Sendaiské nebo Newcastleské nemoci způsobem popsaným Rubinstein-em a spolupracovníky (viz časopis Proč. Nati. Acad. Soi. USA 76, 640-644 (1979)). Buňky se isolují za 5 hodin po indukci a RNA se preparuje postupem za použití thiokyanátu guanidinu s hydrochloridem guanidinu (viz Chirgwin se spolupracovníky, Biochemistry 18, 5294-5299 (1979)). Stejným způsobem se isoluje RNA z neindukovaných buněk. Za použití chromatogřafie na oligodeoxythymidin (dT) - oelulose a ultracentrifugaoe se sacharosovým gradientem se získá 12S frakce poly(A) mRNA, jak popisují Green a spolupracovníci (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 (1976)) a Okimura a spolupracovníci (Arch. Biochem. Biophys, 188, 98-104 (1978)). Takto získaná mRNA má interferohovou aktivitu 8000 až 10000 jednotek na mikrogram při oooytovém stanovení za užití žáby Xenopus Laevis (viz Cavalieri a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci USA 74, 3287-3291 (1977))·

G. Příprava bank kolonií obsahujících LelP cDNA sekvence

Za použití 5/ug mRNA se standardními postupy připraví dvouvláknová cDNA (viz Wickens a spolupracovníci, J. Biol. Chem. 253, 2483-2495 (1978)) a Goeddel a spolupracovníci, Nátuře 281, 544-548 (1979))· Získaná cDNA se frakcionuje podle velikosti elektroforesou na 6%ním polyakrylamidovém gelu (PAGE), a elektroelucí se isoluje 230 ng materiálu majícího velikost v rozmezí od 500 do 1500 b.p. U části této oDNA (100 ng) se na konce naváží zbytky deoxycytidinu (dG) způsobem popsaným Changem a spolupracovníky v časopis Nátuře 275, 617-624 (1978), produkt se aneluje se 470 ng plasmidů pBR322, ,na jehož Pst I restrikční místo jsou navázány zbytky desoxyguanidinu (dG) (viz Bolivar a spolupracovníci, Gene 2, 95-113 (1977)) a takto modifikovaného plasmidů se použije k transformaci mikroorganismu E. coli x 1776. Získá se asi 130 transformantů rezistentních vůči tetracyklinu a citlivých na ampicllin, na jeden ng cDNA.

V druhém podobném pokusu se získá přibližně 1000 transformantů E, coli K-12 kmene 294, rezistentních vůči tetracyklinu a citlivých na ampicilin, na jeden ng cDNA.

CS 273 152 B2

V tomto případě se frakcionací oDNA podle velikosti molekul a elektroeluoí získá materiál o velikosti v rozmezí od 600 do 1300 b.p., který se použije k navázání koncových. dC,

D. Příprava synthetiokých oligonukleotidů a jejich použití

Znalost aminokyselinových sekvencí různých tryptiokýoh fragmentů lidského leukooytárního interferonu dovoluje navrhnout synthetické desoxyoligonukleotidy komplementární k různým oblastem Lelí¹ mRNA. Byly zvoleny dva tryptické peptidy T 1 a I 13, poněvadž mají aminokyselinovou sekvenci vyžadující synthesu pouze 12, popřípadě 4 undekamerů, aby se vysvětlily všechny možné kódující sekvence (viz obrázek 1). Synthetisují se čtyři soubory zkušebních vzorků deoxyoligonukleotidů pro každou sekvenci, z nichž každý obsahuje buď tři (T-1A, B, C, D) nebo jeden (T-13A, B, C, D) oligonuleotid. Uvedené komplementární deoxyoligonukleotidy o délce 11 basí se synthetisují chemicky za použití fosfortriesterové metody (viz Crea a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75, 5765-5769 (1973))· V T-13 sérii se připraví čtyři jednotlivé vzorky, v sérii T-1 dvanáct vzorků ve čtyřech skupinách po třech vzorcích, jak je uvedeno na obrázku 1.

Čtyři individuální zkušební vzorky v T-13 sérii a dvanáct T-1 zkušebních vzorků připravených ve čtyřech skupinách po třech primérech v každé se použijí k informační synthese radioaktivně značené jednovláknové cDNA za účelem použití k hybridizačním zkouškám. Jako vzorové mRNA se použije bud 12S RNA z KG-1 buněk indukovaných Sendaiským virem (8000 jednotek IP aktivity na jeden yug) nebo celkové póly (A) mRNA z neindukovaných leukocytů (aktivita menší než 10 jednotek na /ug). Z uvedených primérů se připraví cDNA značená ⁵²P za použití známých reakčních podmínek (viz Noyes a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76, 1770-1774 (1979))« Reakce mM Tris-HCl (hydrochlorid tris-hydroxymetylmethanu) o pH 8,3, 20 mM chloridu draselného, 8 mM bezvodého chloridu horečnatého a 30 mM p-merkaptoethanolu. Pro reakce se použije vždy jednoho yUg každého priméru ( tj. celkem 12 /ug pro primery 1-1 série a celkem 4 /Ug pro T-13 série), /ug indukované 12S frakce mRNA (nebo 10 /ug neindukované póly (A) mRNA), 0,5 mM dATP, dCTP, dTTP, 200 /uCi (o£?2 p) d.CTP (dodavatel Amersham, 2000-3000 Ci/mmol) a 60 jednotek reversní transkriptásy (dodavatel Bethesda Research Laboratories). Žádaný produkt se oddělí od neinkorporovaného značkovacího materiálu gelovou filtrací na sloupci 10 ml Sephadexu™ G-50 a produkt se zahřívá 30 minut na 70 °C š 0,3 N roztokem hydroxidu sodného, aby se rozložila RNA, a pak se směs zneutralizuje kyselinou chlorovodíkovou. Hýbridisace se provedou způsobem popsaným Kafato.sem a spolupracovníky v časopisu Nucleic Acids Res. 7, 1541-1552 (1979).

R. Identifikace klonů pL1 až pL30

K přípravě 1 /Ug plasmidické DNA z každého z 500 individuálních transformantů

E, coli K-12, kmene 294 (viz oddíl C) se použije rychlého způsobu isolace plasmidu popsaného Birnboimem a spolupracovníky v časopisu Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979). Každý získaný vzorek DNA se denaturuje a pak aplikuje trojmo na nitrocelulosový filtr podle postupu popsaného Kafatosem a spolupracovníky (viz výše).

Tři shora uvedené soubory nitrocelulosových filtrů obsahující 500 plasmidických vzorků se hýbridisují

a) s indukovanou cDNA obsahující T-1 soubor primerů;

b) s indukovanou cDNA obsahující T-13 priméry;

c) s neindukovanou cDNA připravenou za použití obou souborů primerů.

Klony se považují za positivní, když hýbridisují silněji na jednom nebo obou vzorcích indukované cDNA než na celkovém neindukovaném vzorku. Z výchozích 500 vzorků plasmidů bylo vybráno třicet positivních klonů (pI1 až pL30) k další analyse.

CS 273 152 B2

P. Identifikace klonů pl31 až pl39. Isolaoe plasmidu číslo 104 obsahujícího LelP genový fragment

Transformanty mikroorganismů B. coli x 1776 se podrobí užšímu výběru metodou koloniové hybridisace podle Grunsteina a Hognesse (viz Proo. Nati. Acad. Soi. USA 72, 3961-3965 (1975)) za použití ⁵²P značené indukované mRNA jako zkušebního vzorku (viz lillenhaug a spolupracovníci, Bioohemistry 15, 1853-1865 (1976)). Neznačená mRNA z neindukovaných buněk se smísí se zkušebním vzorkem v poměru 200;1, aby došlo ke kompetici s neindukovanou mRNA přítomnou v preparátu značeném ^J P. Hybridisaoe značené mRNA nastává přednostně s koloniemi obsahujícími indukované sekvence. Získají se tři druhy transformantů;

1) 2 až 3 % kolonií hybridisovanýoh na P-mRNA velmi silně;

2) 10 % kolonií hybridisovanýoh signifikantně méně než ve skupině 1), a

3) zbytek, který nedává detegovatelný hybridisační signál.

Positivní kolonie (skupiny 1 a 2) se testují .na přítomnost sekvencí specifických pro interferon pomocí zkoušky, která spočívá v hybridisaci interferonové mRNA specificky na plasmidickou DNA. Nejprve se 60 silně positivních kolonií (ze skupiny 1) kultivuje individuálně ve 100 ml živného prostředí M9, doplněného tetracyklinem (20 yug/ml), kyselinou diaminopimelovou (100 yug/ml), thymidinem (20 yug/ral) a d-biotinem (1 yug/ml), Živná půda M9 obsahuje v 1 litru hydrogenfosforečnan sodný (6 g), dihydrogenfosforeonan draselný (3 g), chlorid sodný (0,5 g) a chlorid amonný (1 g); po vysterilisování v auto· klávu se přidá 1 ml sterilního 1M roztoku síranu hořečnatého (bezvodého) a 10 ml sterilního 0,01 M roztoku bezvodého chloridu vápenatého. Kultury se spojí po deseti a ze šesti uvedených spojených skupin se isoluje plasmidická DNA způsobem popsaným Clewellem a spolupracovníky v časopisu Bioohemistry 9, 4428-4440 (1970). Deset /ug plasmidická DNA z každé skupiny se rozštěpí enzymem HindlII, směs se denaturuje a kovalentně naváže na DBM-papír (diazobenzyloxymethylovaný filtrační papír). Jeden yug přečištěné mRNA z indukovaných buněk se hybridisuje s rozštěpenou DNA vázanou na DNA vázanou na DBM-papíru. Nezhybridisovaná mRNA se odstraní promytím, specificky hybridisovaná mRNA se eluuje a testuje pomocí oocytů Xenopus laevis. V tomto testu bylo všech šest skupin negativních. Z 59 slabě positivních kolonií (skupina 2) bylo vytvořeno pět skupin po 10 koloniích a jedna skupina z 9 kolonií, a z těchto skupin byly shora uvedeným způsobem připraveny plasmidy, které byly zhodnoceny jak bylo uvedeno výše. Z šesti testovaných skupin hybridisovala jedna (K 10) na interferonovou mRNA a vykazovala v každé době testování hladiny signifikantně vyšší než byly základní hladiny. Za účelem identifikování specifického interferonového cDNA klonu se z 9 kolonií skupiny K 10 připraví plasmidické DNA a testují se individuálně. Dva ze zmíněných plasmidů (Číslo 101 a číslo 104) vázaly interferonovou mRNA signifikantně nad základní hladiny.

Z plasmidu číslo 104 byl isolován unikátní Bgl II restrikční fragment obsahující 260 b.p., označen radioaktivním ⁵²P způsobem popsaným Taylorem a spolupracovníky v časopisu Biochim. Biophys, Acta 442, 324-330 (1976) a použit jako zkušební vzorek k nezávislému výběrovému hodnocení na 400 transformantech E. coli 294 za použití skríningové metody na koloniích in šitu (viz Grunstein a Hogness, Proč. Nati. Sci. USA 72, 3961-3965 (1975)). Bylo identifikováno devět kolonií (pL31 až pL39), které hybridisovaly v tomto testu do rozdílného stupně.

Shora uvedený značený fragment o 260 b.p. byl dále použit v nezávislém skríningu na 4000 transformantech E. coli 294 stejným způsobem. Bylo identifikováno 50 kolonií, které v tomto testu hybridisovaly se zkušebním vzorkem do rozdílných stupňů. Jedna z nich obsahovala LelF G fragment, jedna LelF H fragment a jedna obsahovala fragment označený jako Dell·¹ Hl, zřejmou alelickou variantu interferonu LelF H. Hybridní plasmidy, které byly uvedeným způsobem získány, byly označeny jako plelF H, atd.

CS 273 152 B2

G. Iaolace a stanovení sekvence prvého LelE genu a plné délce řetězce

Ze všech 39 potenciálních LelP cDNA klonu, se připraví plasmidické DMA, které se znovu podrobí dalšímu výběru se stejným zkušebním vzorkem DMA obsahujícím 260 b.p., za použití hybridisačního postupu popsaného Kafatosem a spolupracovníky (viz výše).

Tři plasmidy (pL 4, pD 31, pL 34) dávaly při tomto skríningu velmi silné hybridisační signály, čtyři (pL 13, pL 30, pL 32, pL 36) hybridisovaly mírně a tři (pL 6, pL 8, pL 14) hybridizovaly se zkušebním vzorkem slabě.

Shora uvedených 39 potenciálních LelP oDMA rekombinovaných plasmidů bylo rovněž podrobeno výběrovému testování za použití syntetických undekamerů značených radioaktivním (skupiny individuálních T-1 primerů nebo individuální T-13 priméry) přímo jako hybridisačních zkušebních vzorku. Hybridisační podmínky byly zvoleny tak, aby mohlo dojít k dokonalému párování basí pro detegovatelné hybridisační signály (viz Wallace a spolupracovníci, Mucleic Aoids Res. 6, 3543-3557 (1979)). Tak byly z 39 klonů připraveny standardním lysátovým postupem (viz Clevell a spol., shora uvedená citace) plasmidické DMA, které byly čištěny sloupcovou chromatografií na agarose značky Biorad Agarose A-50. Vzorky (3 yug) každého preparátu byly linearisovány působením restrikčního enzymu Eco Rl, denaturovány alkálií a naneseny na 2 separátní nitrocelulosové filtry v dávce 1,5 /ug na jednu nanášku (dle Kafatose a spolupracovníků, citaci viz výše). Individuální synthetické deoxyoligonukleotidické primery a skupiny spojených primerů byly fosforylovány pomocí (^³²Ρ)-ΑΤΡ následujícím způsobem: 50 pmol oligonukleotidu a 100 pmol značeného (J^^PJ-ATP (dodavatel Mew England Nuclear, aktivita 2500 Ci/mmol bylo vneseno do 30 mikrolitrů pufru složeného z 50 mM Tris-HCl, 10 mM bezvodého chloridu hořečnatého a 15 mM λ-merkaptoethanolu. Ke směsi byly přidány 2 jednotky polynukleo tidické kinasy T 4 a po 30 minutách zahřívání na 37 Odbyly vzniklé ^J P značené primery čištěny chromatografií na sloupcích z 10 ml Sephadexu^ G-50. Poté byly provedeny hybri disace za použití 10^ cpm primeru T-13C nebo 3x10^ cpm spojených primerů T-1C. Hybridisaoe byly prováděny při 15 °C po dobu 14 hodin v prostředí 6 x SSC (1 x SSC = 0,15 M chlorid sodný a 0,015 M citrát sodný, pH 7,2) a 10 x Denhardtova roztoku (0,2% hovězí serumalbumin, 0,2% polyvinylpyrolidon, 0,2% Picoll), způsobem popsaným Wallacem a spolupracovníky (citaci viz výše). Piltry byly promývány po dobu 5 minut (3krát) při 0 °C v 6 x SSC, vysušeny a exponovány na film citlivý na X-paprsky. Výsledky získané s ^²P značenými spojenými primery T-13C a s primerem T-1C jsou uvedeny na obrázku 2.

Bylo nalezeno, že dochází k signifikantní hybridisaci plasmidické DMA z klonu 104 se skupinou spojených primerů T-1C a s primerem T-130, ale nedochází k detegovatelné hybridizaci s jinými undekamery. Jak je znázorněno na obrázku 2, četné z uvedených 39 potenciálních LelE plasmidů (pL 2, 4, 13, 17, 20, 30, 31, 34) rovněž hybridizují s oběma těmito zkušebními vzorky. Avšak restrikční endonukleázovou analysou bylo zjištěno, že pouze jeden z těchto plasmidů, plasmid pL 31, obsahuje rovněž interní BglII fragment o 260 b. p. Digescí pL 31 restrikčním enzymem Pstl bylo zjištěno, že velikost této cDMA vložky je přibližně 1000 b.p.

M posléze uvedené úplné Bati vložky plasmidů pL 31 byla ahalysována nukleotidická sekvence jednak Maxamovou-Gilgertovou chemickou metodou (viz časopis Methods Enzymol. 65, 499-560 (1980)) a jednak postupem stanovujícím zakončení dideoxydového řetězce (viz Smith, Methods Enzymol. 65, 560-580 (1980)) po subklonování Sau 3a fragmentů do M13 vek toru. Sekvence DMA jest znázorněna na obrázku 3 pod označením A. Příslušná translační pročítací konstrukce zmíněné DMA se dá předpovědět z informací, které jsou k disposici o sekvenci aminokyselin interferonové bílkoviny, ze známého rozmezí molekulárních hmotností LelE a z relativního výskytu stop-tripletů ve třech možných pročítacích konstrukcích, a poznaná nukleotidická sekvence dovoluje naopak předpovídat aminokyselinovou sekvenci celého LelE, včetně presekvence neboli signálního peptidu. První ATG iniciační kodon translace byl nalezen ve vzdálenosti 60 nukleotidů od 5' konce sekvence,

CS 273 152 B2 a jest následován o 188 kodonů později TGA terminačním tripletem; pak je 342 nepřekládaných nukleotidů na 3' konci, následovaných póly (A) sekvencí. Domnělý signální peptid (pravděpodobně zahrnutý do sekrece zralého Dell·¹ z leukocytů) má délku 23 aminokyselin. Zralý LelP tvořený 165 aminokyselinami má vypočítanou molekulovou hmotnost 19390. Autoři vynálezu označili Dell¹ zakódovaný do plasmidu pL 31 jako LelP A. Z údajů o sekvenci (viz A na obrázku 4) je zřejmé, že tryptioké peptidy T1 a T13 interferonu LelP B odpovídají aminokyselinám 145-149, popřípadě 57 až 61, interferonu LelP A. Skutečné DNA kódující sekvence nalezené v těchto dvou oblastech odpovídají sekvencím representovaným spojenými primery T 1-C a primerem T 13-C (viz obrázek 8).

H. Přímá exprese zralého leukooytárního interferonu A (LelP A)

I, Obecně

Následující způsob exprese interferonu LelP A přímo ve formě zralého interferonového polypeptidu je variantou postupu použitého dříve pro přípravu lidského růstového hormonu (Goeddel a spolupracovníci, Nátuře 281, 544-548 (1979)) do té míry, že zahrnuje kombinování syntetické (N-terminální) a komplementární DNA.

Jak je znázorněno na obrázku 6, místo štěpení restrikčhí endonukleázou Sau3a jest výhodně umístěno mezi kodony 1 a 3 interferonu LelP A. Byly určeny dva syntetické deoxyoligonukleotidy, které inkorporují ATG iniciační kodon pro translaci, obnovují kodon pro translaci, obnovují kodon pro aminokyselinu 1 (cystein) a vytváří záchytný (lepivý) EcoRI konec. Tyto oligomery byly navázány na fragment o 34 b.p. mezi Sau3a - Avall místy plasmidu pL 31. Získaný produkt o 45 b.p. byl navázán na další DNA fragmenty a tak byl zkonstruován syntheticko-přirozený gen o 865 b.p., který kóduje interferon LelP A a který je navázán EcoRI a Pstl restrikčními místy. Tento gen byl včleněn do plasmidu pBR 322 mezi jeho EcoRI a Pstl restrikč.ní místa za vzniku plasmidu pLelP Al.

2. Zkonstruování tryptofanového kontrolního prvku (obsahujícího E. coli trp promotor a operátor, a trp hlavní ribosomové vazebné místo, ale kterému pohází ATG sekvence pro iniciaci translace)

Plasmid pGMI nese tryptofánový (trp) operon bakterií E. coli, mající deleci &LE1413 (viz Miozzari a spolupracovníci, J. Bacteriology 133, 1457-1466 (1978)) a proto exprimuje fúzovanou bílkovinu obsahující prvních 6 aminokyselin vedoucí trp sekvence a přibližně poslední třetinu trp E polypeptidu (v dalším označovaný jako LE'), a rovněž exprimuje trp D polypeptid jako celek, vše pod kontrolou tryptofánového promotorového-operátorového systému. Plasmid (20 /ug) se digeruje restrikčním enzymem PvuII, který rozštěpí plasmid na pěti místech. Genové fragmenty se pak zkombinují s EcoRI spojovacími články (sestávajícími z vlastního komplementárního oligonukleotidu o sekvenci pGATGAATTCATG), které obsahují Bco Ri restrikční místo potřebné pro pozdější klonování do plasmidu obsahujícího EooRI místo. Na fragmenty DNA (10 /Ug) získané z pGM1 se působí 10 jednotkami DNA ligásy T^ v přítomnosti 200 pmol 5'-£osforylovaného syntetického oligonukleotidu pCATGAATTCATG a v prostředí 20 mikrolitr.ů T^ DNA ligásového pufru (20 mM Tris, pH 7,6, 0,5 mM ATP, 10 mM bezvodého chloridu horečnatého, 5 mM dithiothreitolu) při 4 °C přes noo. Roztok se pak zahřívá 10 minut na 70 °C, aby se spojování zastavilo. Spojovací články ae rozštěpí digescí endonukleázou EcoRI, vzniklé fragmenty, nyní s EcoRI konci, se oddělí za použití PAGE elektroforesy (5%ní gel) a tři největší fragmenty se isolují, po předchozím obarvení ethidiumbromidem a detekci v ultrafialovém světle, vyříznutím příslušné části gelové vrstvy obsahující žádaný fragment. Každý z uvedených gelových fragmentů se umístí spolu s 300 mikrolitry 0,1 x TBE pufru (TBE pufr obsahuje 10,8 g Tris-base, 5,5 ,g kyseliny borité a 0,09 g dvojsodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové (NagEDTA) v 1 litru vody) do dialysačního vaku a podrobí elektroforese při 100 V po dobu jedné hodiny v 0,1 x TBE pufru. Vodný roztok z dialysačního

CS 273 152 B2 vaku ae vyjme, extrahuje fenolem, extrahuje chloroformem, upraví na 0,2 M roztok chloridem sodným a DNA. se získá, po vysrážení ethanolem, ve vodném prostředí. Získaný gen s BcoRI záchytnými konci, obsahující trp proraotor-operátor, se identifikuje dále popsaným způsobem, který spočívá ve vpravení fragmentů do plasmidu citlivého na tetracyklin, který se po zmíněném začlenění fragmentu stane resistentním vůči tetracyklinu.

Plasmid pBRHI (viz Rodriguez a spolupracovníci, Nucleic Acids R_es. 6, 3267-3287 (1979)) exprimuje ampicilinovou . rezistenci a obsahuje gen pro tetracyklinovou rezisten ci, ale poněvadž není spojen s promotorem, posléze uvedenou rezistenci neexprimuje. Plasmid je proto citlivý vůči tetracyklinu. Vpravením promotorového-operátorového systé mu do EcoRI místa štěpení plasmidu se plasmid stane rezistentním vůči tetracyklinu.

Za tím účelem se plasmid pBRHI digeruje restrikční endonukleázou EcoRI, enzym se odstraní fenolovou extrakcí a následující chloroformovou extrakcí a po vysrážení ethanolem se DNA získá ve vodném prostředí. Získaná molekula DNA se pomocí T^ DNA ligásy, v oddělených reakčních směsích, váže shora popsaným způsobem s každým ze tří DNA fragmentů získaných shora uvedeným postupem. Vzniklá DNA, obsažená v reakční směsi, se použije k transformaci příslušných bakterií E. coli K-12, kmene 294, za použití standardních pracovních technik (viz Hershfield a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Sci, USA 71, 3455-3459 (1974)). Bakterie se pak umístí na LB (Luria-Bertani) agarové desky obsahující 20 /Ug/ml ampioilinu a 5/Ug/ml tetracyklinu. Kolonie bakterií rezistentních na tetracyklin se vyberou, isoluje se plasmidická DMA a přítomnost žádaného fragmentu se potvrdí restrikční enzymatickou analysou. Získaný plasmid byl označen jako pBRHtrp.

Digescí virového genomu hepatitidy B enzymy EcRI a BamHI se obvyklým způsobem získá produkt, který se začlení do EcoRI restrikčních míst plasmidu pGH6 (viz Goeddel a spolupracovníci, Nátuře 281, 544 (1979)) za vzniku plasmidu pHS32. Získaný plasmid pHS32 se rozštěpí enzymem Xbal, směs se extrahuje fenolem, pak se extrahuje chloroformem a vysráží ethanolem. Na získaný rozštěpený plasmid se pak působí 1 mikrolitrem E. coli DNA polymerázy I, Klenowovým fragmentem (Boehringer-Mannheim) v prostředí 30 mikrolitrů polymerázového pufru ( tj. 50 mM fosforečnanu draselného, pH 7,4 7 mM bezvodého chloridu hořečnatého a 1 mM β-merkaptoethanolu), obsahujícího 0,1 mM dTTP a 0,1 mM dCTP, po dobu 30 minut při 0 °C a pak 2 hodiny při 37 °C.. Při této reakci se doplní dva ze 4 nukleotidů komplementárních k 5' vyčnívajícímu konci Xbal štěpícího místa:

5'	CTAGA-	—>	5'	CTAGA-
3'	T-		3'	TCT-

Inkorporují se dva nukleotidy, dC a dT, a vznikne koneo se dvěma 5* vyčnívajícími nukleotidy. Tento lineární zbytek plasmidu pHS32 (isolovaný po extrakci fenolem, extrakci chloroformem a vysrážení ethanolem ve vodném prostředí) se rozštěpí restrikčním enzymem EooRI. Velký plasmidický fragment se oddělí od menšího EcoRI - Xbal fragmentu PAGE elektroforésou a isoluje se elektroelucí. Tento DNA-fragment plasmidu pHS32 (0,2/ug) se naváže, za podmínek podobných těm, které byly popsány výše, na EcoRI - Taql fragment tryptofánového operonu (0,01/ug) získaného z pBRHtrp.

Při tomto shora popsaném postupu navazování fragmentu z plasmidu pHS32 na EcoRI - Taql fragment se Taql vyčnívající konec naváže na Xbal zbývající vyčnívající konec, i když jeho base nejsou kompletně spárovány podle Watsonova a Crickova principu:

-T CTAGA- -TCTAGA__ + ^1,1

-AGG TCT- -AGCTCTČást takto získané reakční směsi ligantů sa transformuje do buněk E. coli 294, pak so na buňky působí teplem a přeočkují se na LB agarové desky obsahující ampicilin.

CS 273 152 B2

Selekcí se získá 24 kolonií rezistentních vůči ampicilinu, které se kultivují dále na 2 ml LB půdy (Luria-Bertani) a plasmid se isoluje. Šest z těchto plasmidů má Xbal štěpné místo regenerované pomocí bakteriemi B. ooli katalysováného přepárování a replikace DNA:

-TCTAGA- -TCTAGA->

-AGGTGT- -AGATCT——

Bylo rovněž nalezeno, že se tyto plasmidy štěpí jak restrikčním enzymem EooRI, tak enzymem Hpal, a že poskytují očekávané štěpné fragmenty. Jeden z těchto plasmidů, označený pTrp14, byl použit pro expresi heterologníoh polypeptidů, jak je popsáno dále.

Plasmid pHGH 107 (viz Goeddel a spolupracovníci, Nátuře 281, 544 (1979)) obsahuje gen pro lidský růstový hormon, složený z 23 aminokyselinových kodonů produkovaných ze syntetických DNA fragmentů, a ze 163 aminokyselinových kodonů získaných z komplementární DNA vytvořené cestou reversní transkripce informační RNA pro lidský růstový hormon. Tento gen, i když mu schází kodony pre-sekvence lidského růstového hormonu, obsahuje ATG kodon pro iniciaci translace. Gen se isoluje z 10/ug plasmidů pHGH 107 postupem zahrnujícím nejprve působení rosirikčního enzymu EcoRI a poté připojení dTTP a dATP na získaný fragment působením Klenová fragmentu E, coli DNA polymerazy I, jak bylo popsáno výše. Vzniklý plasmid se isoluje extrakcí fenolem, extrakcí chloroformem a vysráŽením ethanolem, a poté se rozštěpí enzymem BamHI.

Vzniklý fragment obsahující gen pro lidský růstový hormon (HGH) se isoluje PAGE elektroforesou a následující elektroelucí. Výsledný fragment DNA obsahuje rovněž prvních 350 nukleotidů strukturálního genu pro rezistenci vůči tetracyklinu, ale chybí mu tetracyklinový promotorový-operátorový systém, takže, když se v následujícím postupu tento fragment začlení do plasmidů, který je schopný exprese, lze plasmidy obsahující tuto vložku určit podle obnovení tetracyklinové rezistence. Pnotože EooRI zakončení fragmentu je doplněno postupem za použití Klenowovy polymerazy I, má zmíněný fragment jeden tupý a jeden lepivý konec, což mu zajišťuje správnou orientaci, když je později včleněn do plasmidů schopného exprese.

V dalším se připraví exprese schopný plasmid pTrp 14 tak, aby mohl přijmout shora uvedeným způsobem získaný fragment obsahující HGH gen. Plasmid pTrp 14 se za tím účelem digeruje restrikčním enzymem Xbal a vzniklé lepivé konce fragmentu se doplní postupem s Klenowovou polymerázou I za použití trifosfátů dATP, dGTP a dCTP. Po extrakci získané směsi fenolem, extrakoi chloroformem a vysrážení ethanolem se na získanou DNA působí enzymem BamHI a vzniklý velký fragment plasmidů se isoluje PAGE elektroforesou a elektro eluoí. Uvedený fragment odvozený od pTrp 14 má jeden tupý a jeden lepivý konec, které mu zajišťují správnou orientaci při rekombinaci s výše popsaným fragmentem obsahujícím HGH gen.

Fragment obsahující HGH gen a posléze uvedený fragment pTrp14 áXba - BamHI se zkom binují a .navzájem naváží, za podmínek podobných těm, které byly popsány výše. Doplněné Xbal a EooRI konce se naváží spolu s tupými vazebnými konoi za obnovení obou Xbal a EooRI štěpných míst:

doplněný Xbal doplněný EcoRI konec konec

-TCTAG AATTCTATG+

-AGATC TTAAGATACTouto konstrukcí se rovněž obnoví rezistence genu vůči tetracyklinu. Jelikož plasmid pHGH 107 exprimuje tetracyklinovou rezistenci z promotoru ležícího proti proudu iniciace HGH genu

--TCTAGAATTCTATG-AGATCTTAAGATAC Xbal EcoRI

CS 273 152 B2 od. HGH genu (lac promotor), umožňuje tato výsledná konstrukce plasmldu, označeného jako pHGH 207, expresi genu pro tetraoyklinovou rezistenci za kontroly tryptofsnového promotoru-operátoru. Směs produktů ligace se transformuje do bakterií B. coli 294 a po kultivaci na LB agarovýoh deskách s půdou obsahující 5/ug/ml tetraoyklinu se vyberou rezistentní kolonie.

Plasmid pHGH 207 se digeruje restrikčním enzymem EcoRI a PAGE elektroforesou a následující elektroelucí se Isoluje fragment o 300 b.p. obsahující trp promotor, operátor a vazebné místo pro tryptoíánový hlavní ribosom, kterému vsak schází ATG sekvence pro iniciaci translace. Tento DNA fragment se zaklonuje do EcoRI štěpného místa plasraidu plelF A. Exprese schopné plasmidy obsahující shora uvedený modifikovaný trp regulon (trp operon bakterie E. coli, ze kterého je vynechána útlumová sekvence, aby se kontrolovatelně zvýšily hladiny exprese) lze kultivovat do stadia předem stanovených hladin na živné půdě obsahující přídatný tryptofan v množství dostatečném k potlačení promotorového-operátorového systému, pak se tryptofan odstraní, dojde k derepresi systému a nastane exprese žádaného produktu.

Uvedený postup je podrobněji popsán níže a znázorněn na obrázku 6. Plasmid pl 31 (250/Ug) se digeruje restrikčním enzymem Esti a gelovou elektroforesou na 6%ním polyakrylamidovém gelu se isoluje vložený fragment o 1000 b.p. Elektroelucí se z gelu získá asi 40/Ug žádaného vloženého fragmentu, který se za účelem dalšího zpracování enzymatickou digescí rozdělí na 3 alikvotní podíly.

a) Asi IfiyUg vzorek tohoto fragmentu se částečně digeruje 40 jednotkami endonukleázy Bglll po dobu 45 minut při 37 °C a reakční směs ae čistí PAGE elektroforesou na 6%ním gelu; získají se asi 2/Ug žádaného fragmentu o 670 b.p.

b) Druhý vzorek (8 /ug) Pst fragmentu o 1000 b.p. se štěpí endonukleárními Avall a Bglll; gelovou ohromatografií (PAGE) se získá jeden /ug uvedeného fragmentu o 150 b.p.

c) Na 16 /Ug vloženého fragmentu o 1000 b.p. se působí enzymy Sau3a a Avall; po isolaci elektroforesou na 10%ním polyakrylamidovém gelu se získá asi 0,25 /Ug (10 pmol) fragmentu o 34 b.p. Fosfortriesterovou metodou se synthetizují dva dále uvedené deoxyoligonukleotidy, 5'-dAATTCATGTGT (fragment 1) a 5'-dGATCACACATG (fragment 2). Fragment 2 se fosforyluje následujícím způsobem: 200 mikrolitrů (asi 40 pmol)

O O (J*' P)-ATE (dodavatel Amersham, aktivita 5000 Ci mol) se vysuší a znovu nasuspenduje ve 30 mikrolitrech pufru složeného z 60 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM bezvodého chloridu hořečnatého a 15 mM /3-merkaptoethanolu, a obsahujícího 100 pmol zmíněného DNA fragmentu a 2 jednotky T4 polynukleotidkinázy. Směs se zahřívá 15 minut na 37 °C, pak se přidá 1 mikrolitr 10 mM roztoku ATP, reakce se nechá probíhat dalších 15 minut při uvedené teplotě a pak se provede inaktivace zahříváním směsi po dobu 15 minut na 70 °C. K reakční směsi se přidá 100 pmol 5'-OH fragmentu 1 a 10 pmol Sau3a - Avall fragmentu o 34 b.p. a provede se vzájemné navázání fragmentů v 50 mikrolitrech prostředí složeného z 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM bezvodého chloridu hořečnatého, 10 mM 'dithiothreitolu, 0,5 mM.ATP, v přítomnosti 10 jednotek T4 DNA ligázy, při 4 °C po dobu 5 hodin. Směs se rozdělí PAGE elektroforesou na 6%ním gelu a elektroelucí se získá produkt o 45 b.p. Asi 30 ng (1 mol) posléze zmíněného produktu o 45 b.p. se zkombinuje s 0,5 /Ug (5 pmol) Avall - Pstl fragmentu o 6?0 b.p. Vzájemné navázání se provede působením 20 jednotek T4 DNA ligasy při 20 °C po dobu 16 hodin. Ligasa se inaktivuje zahříváním na 65 °C po dobu 10 minut a směs se za účelem odstranění polymerů, genu digeruje enzymy EcoRI a Pstl. Po přečištění směsi elektroforesou na 6% PAGE se získá asi 20 ng (0,04 pmol) produktu o 865 b.p. Polovina (10 ng) tohoto produktu se naváže’ do plasmidu pBR 322 (0,3/ug) mezi jeho EcoRI a Pstl štěpná místa. Po transformaci tohoto plasmidu do bakterií E, coli 294 se získá 70 transformantů rezistentních vůči tetracyklinu a citlivých na ampicilin.

CS 273 152 B2

Plasmidická DNA isolovaná z 18 z těchto transformantú se digeruje enzymy EcoRI a Pstl. Z těchto 18 plasmidů obsahovalo 16 EcoRI - Pstl fragment o délce 865 b.p.

Jeden ^ug jednoho z těchto fragmentů, pLelP Al, se digeruje enzymem EcoRI a naváže na shora popsaným způsobem připravený EooRI fragment o 300 b.ú. (0,1/Ug), obsahující trp promotor a trp vazebné místo hlavního ribosomu E. coli. Transformanty obsahující trp promotor se identifikuji za použiti ^J P-trp zkušebního vzorku ve spojeni se skríningovou metodou pro kolonie bakterií podle Grunsteina-Hognesse. Asymetricky umístěné Xbal štěpné místo v trp fragmentu dovoluje stanovení rekombinantů, ve kterých trp promotor je orientovaný ve směru na LelP A gen.

I. In vitro a in vivo účinnost interferonu LelP A

Pro stanovení interferonové účinnosti se připraví extrakty následujícím způsobem: Kultury o objemu 1 ml se pěstují na živné půdě L obsahující 5/úg/ml tetracyklinu do hodnoty absorbance při 550 .nm (Α^θ) asi 1,0, pak se kultura zředí do 25 ml M9 živné půdy obsahující 5/ug/ml tetracyklinu. Když A^_Q dosáhne 1,0, odeberou se 10 ml vzorky, které se odstředí, a Získané buňky se suspendují v 1 ml roztoku obsahujícím 15 % sacharosy, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) a 50 mM EDTA (kyseliny ethylendiamintetraoctové). K susponsi se přidá jeden mg lysozymu a po 5 minutách stání při 0 °C se buňky rozruší ultrazvukem. Vzorky se centrifugují 10 minut (15000 otáček za minutu) a v supernatantu se stanoví interferonová účinnost srovnáním se standardy interferonu LelP pomocí testu inhibice cytopatioké účinnosti (CPE). Ke stanovení počtu molekul interferonu (IP) na jednu buňku se používá LelP o specifické aktivitě 4x10⁸ jednotek/mg.

Jak je zřejmé z tabulky 1, klon pLelP A trp 25, ve kterém je trp promotor začleněn v žádané orientaci, dává v tomto testu vysoké hladiny aktivity (ve výši 2,5x10⁸ jednotek v litru). Jak vyplývá z tabulky 2, interferon produkovaný bakteriemi E. coli K-12 kmene 294(pLeIP A trp 25 se chová jako autentický lidský interferon LelP; je stálý vůči kyselému prostředí o pH 2 a jeho účinnost je neutralisována králičími protilátkami lidských leukocytárních interferonů. Uvedený interferon má zdánlivou molekulovou hmotnost asi 20000.

Účinnost interferonu in vivo vyžaduje přítomnost makrofágů a přirozených umrtvujících (NK) buněk, přičemž se zdá, že způsob jeho účinnosti in vivo spočívá ve stimulaci těchto buněk. Je proto možné, že interferon produkovaný bakteriemi E. coli 294/pLeIP A 25, i když má antivirovou účinnost v testech na buněčných kulturách, by nemusel být účinný u infikovaných živočichů. Kromě toho, in vivo antivirová účinnost bakteriálně produkovaného, neglykosylovaného interferonu LelP A by mohla být rozdílná od glykosylovaného LelP pocházejícího z lidských leukocytů. Proto biologická účinnost bakteriálně syntetisovaného interferonu LelP A (o čistotě 2 %) byla srovnávána s účinností interferonu z lidských kůží pokrytých leukocytů (LelP, čistota 8 %) u virové infekce letální encefalomyokarditidy (EMC) hranostajů (viz tabulka 3).

Tabulka 1. Interferonová účinnost extraktů z E. coli

E. coli K-12 kmen 294 transformovaný plaamidem	buněčná hustota (počet buněk na ml)	IP účinnost jednotky/ml kultury	počet LelP molekul na buňku
pLelP A trp 25	3,5 x 108	36 000	9 000
pLelP A trp.25	1,8 x 109	250 000	12 000

CS 273 152 B2

Tabulka 2. Srovnání účinností extraktů z bakterií E. coli 294/pLeIP A 25 se standardním interferonem LeIP^x

Extrakt	Interferonová účinnost (jednotky/ml)
bez úpravy	při pH 2	v přítomnosti králičích anti-lidských leukocytárních protilátek
extrakt z E. coli 294/pLeIP A trp 25	500	500	-<10
LelP standard	500	500	-<10

x) Extrakt z bakterií E. ooli 294/pLeIP A trp 25 o interferonové aktivitě 250 000 jednotek na ml, popsaný v tabulce 1, byl zředěn 500krát minimální základní živnou půdou na specifickou aktivitu 500 jednotek/ml.

Standard leukooytárního interferonu (z Wadleyova ústavu), předem otitrovaný vůči

NIH leukocytárnímu interferonovému standardu, byl rovněž zředěn na konečnou konoentraci 500 U/ml. Alikvotní podíly o objemu 1 ml byly upraveny kyselinou chlorovodíkovou n koncentraci 1N na pH 2, vzorky inkúbovány 52 hodin při 4 °C, zneutralisovány přidáním roztoku hydroxidu draselného a stanovena IP aktivita pomocí standardního testu CPE inhibice. Jiné alikvotní podíly o objemu 25 mikrolitrů ze vzorků o koncentraci 500 jednotek/ml (nijak neošetřené) byly inkúbovány s 25 mikrolitry králičí protilátky lidského leukooytárního interferonu při 37 °C po dobu 60 minut, vzorky byly 5 minut centrifugovány při 12000 násobku g a supernatant testován.

Tabulka 3. Antivirová účinnost různých LelP preparátů vůči EMC virové infekci hranostajů

Ošetření interferonem	Přežití	Jednotky tvoření sérových destiček/ml
den 2	den 3	den 4
Kontrola	0/3	10)	3x104\	1θ5) a
(bakteriální		°b	0 V104·	1200 (>3,4x104
bílkoviny)		0'	03	OJ
Bakteriální	3/3	0	0	0
LelP A		0	0	0
		0	0	0
Standardní LelP	3/3	0	0	0
		0	0	0·
		0	0	0

K testování byli použiti 3amci hranostajů o průměrné hmotnosti 713 g, kteří neměli před infikováním protilátky vůči EMC viru. Zvířata byla infikována intramuskulárně dávkou 100 x LD^q EMC viru (zjištěno u myši). V kontrolní skupině uhynuli hranostajové za 134, 158 a 164 hodin po infikování. Ošetření zvířat interferonem v dávce 10^ jednotek bylo prováděno intravenosní cestou v intervalech -4, +2, 23, 29, 48, 72, 168 a 240 hodin, vztaženo na dobu, kdy bylo provedeno infikování. Použitý bakteriální leukocytární interferon byla frakce ze sloupcové chromatografie lysátu bakterií E. ooli 294/pLeIP A 25 o specifické aktivitě 7,4x10^ jednotek/mg bílkoviny. Jako kontrolních bakteriálních bílkovin bylo použito bílkovin z ekvivalentní frakce sloupcové chromatografie lysátu E. coli 294 pBR 322 o dvojnásobné koncentraci celkových bílkovin. Jako standardního leukocytárního interferonu bylo použito interferonu indukovaného Sendaiským virem z normál ní e.h

CS 273 152 B2 g

lidských buněk, přečištěný chromatografioky do speoifioké aktivity 32x10 jednotek na mg bílkoviny.

Hranostajové v kontrolní skupině vykazovali postupující lethargii, ztrátu rovnováhy, ochablost a ochrnutí zadních končetin a zalévání očí začínající asi 8 hodin před smrtí. Interferonem ošetření hranostajové nevykazovali žádnou z těchto abnormalit; zůstávali po celý Čas aktivní a nevyvinula se u nich virémie. Jeden hranostaj z kontrolní skupiny, u kterého se nevyvinula virémie během 4 dnů, uhynul nejpozději z neléčených zvířat (za 164 hodin po infikování), ale vykázal vysoké titry viru v srdci a v mozku post mortem. U hranostajů ošetřených interferonem se nevytvořily protilátky proti EMC viru, jak bylo stanoveno za 14 a za 21 dnů po infikování. Tyto výsledky ukazují, že antivirální účinnost LelP preparátů u infikovaných zvířat lze přisoudit pouze interferonu, poněvadž kontaminující bílkoviny v bakteriálních preparátech a v preparátech z lidských leukocytů jsou zcela rozličné. Tyto výsledky dále naznačují, že glyko3ylace není pro in vivo antivirovou účinnost interferonu LelP A potřebná.

J. Isolaoe dalších cDNA pro ostatní leukocytární interferony

Z plně charakterisovaného plasmidu obsahujícího interferonovou LelP A cDNA se vy32 řízne DNA enzymem Pstl, isoluje pomocí elektroforézy a označí radioaktivním P. Získaná radioaktivně značená DNA se použije jako zkušební vzorek k výběrovému třídění dalších transformantů bakterií E. ooli 294, získaných stejným postupem jak bylo popsáno v části C, pomocí metody skríningu kolonií in šitu podle Grunsteina a Hognesse (viz výše). Isolují se kolonie, které hybridisují v rozličných množstvích se zkušebním vzorkem. Štěpením těchto kolonií a deseti hybridizujíoích kolonií popsaných v části G pomocí enzymu Pstl byla isolována plasmidická DNA, která byla oharakterisována třemi rozdílnými metodami. Zmíněné Pstl fragmenty byly nejprve charakterizovány na základě vzorků získaných digescí restrikčními endonukleásami, enzymy Bgl II, PvuII a EcoRI. Tato analysa umožnila oharakterisovat nejméně osm rozličných typů (LelP A, LelP B,' LelP C, LelP D, LelP E, LelP P, LelP G a LelP H), znázorněných na obrázku 5, na kterém je přibližně uvedeno umístění různých restrikčních míst ve vztahu k současné znalosti o presekvenci a kódující sekvenci LelP A. Jeden z těchto fragmentů, LelP D, je pravděpodobně identický s DNA fragmentem popsaným Nagatou a spolupracovníky v časopisu Nátuře 284, 316-320 (1980).

Za druhé byly některé ze zmíněných DNA testovány pomocí hybridisač.níoh selekčních testů popsaných Clevelandem a spolupracovníky v časopisu Cell 20, 95-105 (1980), na základě schopnosti selektivně odstraňovat LelP mRNA z KG-1 buněčné RNA obsahující poly-A řetězce. V tomto testu byly LelP A,· B, C a P positivní. Za třetí, posledně zmíněné ťst fragmenty byly včleněny do exprese schopného plasmidu, zmíněným plasmidem byly transfor mováný bakterie E. ooli 294 a fragmenty byly exprimovány. Všechny produkty zmíněné exprese, o kterých se předpokládalo, že to jsou pře-interferony, byly positivní v CPE testu na interferonovou aktivitu, ačkoliv v případě LelP P fragmentu byla nalezena jen okrajová účinnost. Kromě shora uvedeného charakterisování byla u všech popsaných LelP typů stanovena sekvence.

K. Přímá exprese druhého zralého leukooytárního interferonu (LelP B)

Bylo zjištěno, že sekvence prvních čtrnácti nukleotidů isolovaného fragmentu obsahujícího gen pro zralý interferon LelP B je stejná u typů A i B. Z plasmidu pLelF A 25 byl proto isolován fragment nesoucí trp promotor-operátor, ribosomové vazebné místo· a iniciační signál pro LelP A (=B) gen, a tento fragment byl zkombinován se zbývající částí B-sekvence za vzniku exprese schopného plasmidu. Mapy vyčnívajících restrikčních míst Pst fragmentu plasmidu pL4 (plasmid obsahující interferonový LelP B gen zakončený

CS 273 152 B2

Pat zbytky, znázorněný na obrázku. 5), a plasmidu pLelP A 25 jsou uvedeny na obrázcích 7a a 7b.

Aby ae ze sekvence znázorněné na obrázku 7a získal Sau3a až Pstl fragment obsahující přibližně 950 b.p., je třeba provést několik operací vzhledem k tomu, že je přítomno jedno nebo více intervenujících Sau3a restrikčních míst, to jest:

1. Po provedeném štěpení se isolují následující fragmenty:

a) fragment od Sau3a štěpícího místa po EcoRI místo obsahující 110 b.p.;

b) fragment od EcoRI místa k Xba místu obsahující 132 b.p.;

c) fragrifent od Xba místa k Pst místu obsahující více než 700 b.p.

2. Fragmenty 1a) a 1b) se vzájemně naváží a koncové skupiny Sau3a a Xba se odříznou působením enzymů Xba a BglII, aby se zabránilo samopolymeraci způsobené těmito terminály (relevantní Sau3a místo je uvnitř BglII místa; enzymem BglII se štěpí, aby ae odříznul 3au3a záchytný konec). Isoluje se fragment obsahující 242 b.p.

3. Produkty získané postupy 2) a 1c) se navzájem naváží a za účelem zabránění samovolné polymerisace se koncové skupiny odříznou působením enzymů Pstl a BglII. Isoluje se frag ment od Sau3a až k Pstl místu obsahující asi 950 b.p., znázorněný na obrázku 7a. Tento fragment obsahuje tu část LelP B genu, která není společná s LelP A.

4. Z plasmidu pLoIP A 25 se isoluje fragment obsahující přibližně 300 b.p. (od IíindlII k Sau3a), obsahující trp promotor-operátor, ribosomové vazebné místo, ATG startovací signál a oysteinový kodon pro LelP A.

5. Z plasmidu pBR 322 se isoluje fragment od Pstl k HindlII obsahující přibližně 3600 b.p.; tento fragment obsahuje replikou a zakódovanou tetraoyklinovou, ale nikoliv ampicilinovou resistenci.

6. Fragmenty získané ve stupních 3, 4a 5 ae navzájem trojitě naváží a získaný plasmid se transformuje do bakterií E, coli K-12 kmene 294.

Provede se minimální vyhledávací třídění transformantů (postupem podle Birboima a spolupracovníků, Nucleic Acids Res. 7, 1513-1523 (1979)) a vzorky plasmidu se digerují endonukleasou EcoRI. Digescí se získají tři fragmenty, které byly identifikovány jako 1) fragment obsahující EcoRI-EooRI trp promotor; 2) vnitřní EcoRI až EcoRI fragI ment plasmidu pL4, a 3) fragment plasmidu pL4 obsahující iniciační signál pro translaci bílkoviny až EcoRI.

Bakteriální extrakty z klonů připravených shora uvedeným způsobem vykázaly v CPE testu typickou hodnotu asi 10x10^ jednotek interferonové aktivity na litr při Α^^θ = 1. Jeden representaoní klon připravený tímto postupem byl označen jako E. coli 294/pLeIP B trp 7.

L. Přímá exprese dalších zralých leukooytárníoh interferonů (LelP C, D, P, Η, I a J)

Stejně jako v případě LelP A lze sestrojit i další genové fragmenty o plné délce, obsahující jiné typy interferonů LelP, a lze je umístit do exprimačních nosičů určených pro jejich expresi. Pomocí úplného stanovení sekvence obvyklými způsoby se zjistí, které restrikění místo leží dostatečně blízko prvého aminokyselinového kodonu zralého interferonového typu, aby umožnilo aplikovat postup popsaný ve shora uvedené části H pro expresi zralého interferonu LelP A, to je eliminaci presekvenoe restrikčním odříznutím a nahrazení kodonů pro N-terminální aminokyseliny ztracených eliminací preselcvenco navázáním synthetického DNA fragmentu. Selže-li tento způsob, lze použít následujícího postupu, který, ve stručnosti, spočívá ve štěpení fragmentu obsahujícího presekvenci přesně před bodem, ve kterém začíná kodon pro první aminokyselinu zralého polypeptidu. Postupuje se- tak, že se

CS 273 152 B2

1. Dvouvláknová DNA převede v oblasti obklopující tento bod na jednovláknovou DNA;

2. Na jednovláknovou oblast vytvořenou podle bodu 1) se hybridizuje komplementární délka priméru jednovláknové DNA, přičemž 5* konec priméru leží na opačné straně nukleotidu sousedícího se zamýšleným štěpícím místem;

3. Ta část druhého vlákna odstraněná ve stupni 1), která leží v 3' směru od primeru, se obnoví reakcí s DNA polymerásou v přítomnosti trifosfátů deoxynukleotidů obsahujících adenin, thymin, guanin a cytosin;

4. Zbývající délka jednovláknové DNA, která vyčnívá nad zamýšlené místo štěpení, ae odstraní digesoí.

Poté lze navázat na 3' koneo kódujícího vlákna jako jeho zakončení krátký řetězec synthetické DNA s iniciačním signálem ATG pro translaci, na příklad tak, že se pomocí lepivých konců naváže na sestrojený gen pro zralý interferon a takto získaný gen se včlení do plasmidu schopného exprese a uvede pod kontrolu promotoru a jeho přidruženého ribosomového vazebného místa.

Podobným způsobem, jaký byl popsán výše v části K, se příslušně pro přímou bakteriální expresi uspořádají genové fragmenty kódující interferony LelP C a LelP D. Strategie exprese pro tyto další leukocytární interferony zahrnuje v každém případě použití fragmentu přibližně o 300 b.p. (HindlII až Sau3a), obsahujícího trp promotor-operator, ribosomové vazebné místo, ATG iniciační signál a cysteinový kodon interferonu LelP A z plasmidu pLelP A 25. S tímto fragmentem se zkombinují genové fragmenty z dalších interferonových genů kódující jejich příslušné aminokyselinové sekvence mimo počátečního cysteinu, který je společný všem. Každý takto vzniklý plasmid se použije k transformaci bakterií E. ooli K-12, kmene 294· K sestrojení příslušných genů se použije následujících ligací.

Interferon LelP C

Z plasmidu pLelP C se isolují následující fragmenty:

a) fragment od Sau3a k Sau 96 o 35 b.p.;

b) fragment od Sau 96 lc Pstl o více než 900 b.p.

Z plasmidu pLelP A 25 se isoluje postupem popsaným výše v Části K 4)

c) fragment HindlII až Sau3a o 300 b.p.;

Z plasmidu pBR 322 se isoluje způsobem popsaným výše v části K 5)

d) fragment Pstl až HindlII o přibližně 3600 b.p.

Sestrojení genu

1) Naváží se fragmenty a) a c), produkt se štěpí enzymy BglII a HindlII a isoluje se fragment asi o 335 b.p.

2) Provede se trojitá ligace fragmentů 1) + b) + d) a resultujícím plasmidem se transformují bakterie B. coli.

Typický klon získaný tímto způsobem byl označen jako E. coli K-12 kmen 294/pLeIP 0 trp 35.

Interferon LelP D

Z plasmidu pLelP D se isolují následující fragmenty:

a) fragment Sau3a až Avall o 35 b.p.;

b) fragment od Avall k BglII o 150 b.p.;

o) fragment od BglII k Pstl o přibližně 700 b.p.

CS 273 152 B2

Z plasmidů. pleli A 25 se isoluje

d) fragment od HindlII až po Sau3a o 300 b.p.

Z plaamidu pBR 322 se isoluje

e) fragment od HindlII k Pstl o přibližně 3600 b.p.

Sestrojení genu

1) Naváží se fragmenty a) + b), produkt se vyřízne enzymem BglII a po přečištění se získá produkt o 185 b.p. (1).

2) Provede se navázání fragmentů 1) + d), vyřízne se enzymy HindlII a BglII a vyčistí se produkt o přibližně 500 b.p. (2).

3) Provede se navázání fragmentů 2) + c) + e) a získaným plasmidem se transformují bakterie E. coli.

Typický klon připravený tímto způsobem byl označen jako E. coli K-12 kmen 294/ /pleli D trp 11.

Interferon lelí I

Iragment obsahující lelí I lze pro přímou expresi sestrojit tak, že se k rekonstrukci s výhodou použije aminokyselinové sekvence 1 až 13 interferonu lelí B, která je úplně shodná s obdobnou sekvencí interferonu lelí I. Z plasmidů pHGH 207, popsaného výše, se postupem za použití restrikČních enzymů Pstl a Xbal digescí a následující isolací připraví fragment asi o 1050 b.p. (a), obsahující trp promotor a mající žádanou konfiguraci na svých koncích. Druhý fragment (b) se isoluje jako větší fragment ze směsi získané digescí plasmidů ρΗΚΪ 10 endonukleásami Pstl a BglII. Iragment a) obsahuje přibližně polovinu genu kódujícího ampicilinovou resistenci; fragment b) obsahuje zbytek tohoto genu a celý gen pro tetracyklinovou rezistenci, kromě připojeného promotoru. Iragmenty a) a b) se naváží pomocí T4 ligasy a produkt se štěpí enzymy Xbal a BglII, aby se odstranily produkty dimerisace. Vznikne fragment c), obsahující trp promotor-operátor a geny pro tetracyklinovou a ampicilinovou rezistenci.

Digescí plasmidů pleli I enzymy Avall a BglII se získá fragment d) mající přibližně 580 b.p. a obsahující kodony pro aminokyseliny 14 až 166 interferonu lelí I.

Digescí plasmidů pleli B enzymy Xbal a Avall se získá fragment e) o 49 b.p., který kóduje aminokyseliny 1 až 13 interferonu lelí I.

Provede ae trojitá ligace fragmentů c), d) a e) v přítomnosti T4 ligasy. Kohesivní konce příslušných fragmentů jsou takové, že se fragmenty správně uzavřou do kruhu za vzniku kompositního plasmidů, který nese gen pro tetracyklinovou rezistenci pod kontrolou trp promotoru-operátoru, spolu s genem pro zralý interferon lelí I. Bakterie transformované tímto plasmidem lze proto vybrat na základě zmíněné rezistence při jejich kultivaci na agarových deskách obsahujících tetraoyklin. Typický klon připravený tímto způsobem byl označen jako E. coli K-12 kmen 294/pleII I trp 1.

Interferon lelí H

Úplný lelí H gen pro expresi zralého leukoeytárního interferonu Bell H lze zkonstruovat následujícím způsobem:

1) Plasmid pleli H 3e podrobí digescí enzymy Haell a Rsal a isoluje se fragment o 816 b.p. rozkládající se od signálu pro peptidiclcou aminokyselinu 10 až do 3* nekódující oblasti.

CS 273 152 B2

2) Fragment se denaturuje a podrobí se reparaČní synthese pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerasy I (viz Klenow a spolupracovníci, Proč. Nati. Acad. Soi. USA 65,

168 (1970)), za použití synthetického deoxyribooligonukleotidu 5”-dATG TGT AAT CTG TCT jako priméru.

3) Vzniklý produkt se štěpí enzymem Sau3a a isoluje se fragment o 452 b.p. representují cí aminokyseliny interferonu 1 až 150.

4) Plasmid pleli¹ H se digeruje enzymy Sau3a a Pstl a isoluje se vzniklý fragment o 500 b.p.j získá se gen kódující aminokyseliny od 150 až do konce kódující sekvence.

5) Fragmenty isolované ve stupních 3) a 4) se navzájem naváží za vzniku fragmentu

166 met oys asp stop

ATG TGT ...--.... GAT TGA - ··· - Pstl

Sau3a zakódovajícího 166 aminokyselin interferonu LelF H.

6) Plasmid pLelF A trp 25 se digeruje restrikěním enzymem Xbal, zakončí záchytnými konci s DNA polymerásou X a produkt se digeruje endonukleásou Pstl. Vzniklý velký fragment se isoluje a provede se ligace s produktem získaným ve stupni 5)· Získá se exprese schopný plasmid, který může po transformaci do E. coli K-12 kmene 294 nebo do jiné hostující bakterie exprimovat zralý interferon LelF H.

Interferon LelF I

Rekombinant lidského genomu fáze Charonu 4A, sestrojený Lawnem a spolupracovníky (viz časopis Cell 15, 1157 (1978)) byl podroben skríningu na leukooytární interferonové geny pomocí postupů popsaných Lawnem a spolupracovníky (viz výše) a Maniatisem a spolupracovníky (viz časopis Cell 15, 687 (1978)). Radioaktivní LelF zkušební vzorek, získaný z cDNA klonu interferonu LelF A byl použit k třídění přibližně 500 000 plaků, z nichž bylo vybráno šest LelF genomových klonů. Po opakovaném třídění a přečištění plaků byl vybrán jeden z uvedených klonů, 7<HleIF 2, pro další analysování.

Za použití shora popsané metody lze s výhodou použít jiných zkušebních vzorků k iso lování dalších leukocytárních interferonových bílkovin podle tohoto vynálezu.

Sestrojení genu pro interferon LelF I:

1) EcoRI fragment klonu JlHLelF 2 o 2000 b.p. se subklonuje do plasmidu pBR 325 v jeho Eoo Rl restrikčním místě. Získaný plasmid obsahující LelF I se štěpí enzymem EooRI a isoluje se fragment o 2000 b.p. Na tento EcoRI fragment o 2000 b.p. se naváže deoxyoligonukleotid dAATTCTGCAG (konvertor EcoRI - Pstl), vzniklý produkt se rozštěpí enzymem Pstl a získá se fragment o 2000 b.p. obsahující Pgtl konce. Tento fragment se rozštěpí enzymem Sau 96 a isoluje se fragment o 1100 b.p., který má jeden Pstl a jeden Sau 96 konec.

2) Plasmid pLelF C trp 35 se digeruje enzymy Pstl a Xbal a isoluje se větší fragment.

3) Malý Xbal - Pstl fragment z plasmidu pLelF C trp 35 so digeruje enzymy Xbal a Sau 96 a isoluje se Xbal - Sau 96 fragment o 40 b.p.

4) Provede se ligace fragmentů isolovaných ve stupních 1), 2) a 3) a tak se vytvoří exprese schopný plasmid pLelF I trp 1.

- 'I

CS 273 152 B2

Interferon LelF J

Postup k sestrojení plasmidů schopného exprese LelF J:

1) Plasmid pLelF <T obsahuj e HindlII fragment o 3,8 kilobasích lidské genomové DNA, který zahrnuje LelF J genovou sekvenci. Z tohoto plasmidů se isoluje Ddel - Rsal fragment o 760 b.p.

2) Plasmid pLelF B trp 7 se rozštěpí enzymy HindlII a Ddel a isoluje se HindlII - Ddel fragment o 340 b.p.

3) Plasmid pBR. 322 se rozštěpí enzymem Pstl, fragmenty se zakončí lepivými konci inkubací s DNA polymerasou I (Klenowův fragment) a provede se digesce enzymem HindlII. Isoluje se velký fragment přibližně o 3600 b.p.

4) Provede se ligace fragmentů, isolovaných ve stupních 1), 2) a 3) a tak se sestrojí exprese schopný plasmid pLelF J trp 1.

M. čištění

Obsah leukocytárního interferonu v bakteriálních extraktech lze zvýšit postupným čištěním:

1. Polyethyleniminovým srážením, při kterém většina buněčných bílkovin, včetně interferonu, zůstává v supernatantu.

2. Amoniumsulfátovou frakcionací, při které interferon vypadává z 55%ního nasyceného roztoku síranu amonného.

3. Suspendováním amoniumsulfátových pelet v pufru složeném z 0,06 M fosforečnanu draselného a 10 mM Tris-HCl, pH 7,2, a dialysou proti 25 mM Tris-HCl, pH 7,9 (interferonová aktivita zůstává v roztoku).

4. Chromatografií shora uvedeným způsobem získaného supernatantu, při pH upraveném na 8,5, na sloupci DEAE celulosy (lineární gradientově eluce s 0 až 0,2 M roztokem chloridu sodného ve 25 mM Tris-Hcl, pH 8,5).

5. Adsorpci na agarose (značky Cibachrome Blue Agarose) nebo na hydroxyapatitu a elucí 1,5 M roztokem chloridu draselného, popřípadě 0,2 M roztokem fosforečnanu.

p

6. Molekulárním tříděním na koloně Sephadexu G-75.

7. Katexovou chromatografií na CM-celulose ve 25 mM roztoku octanu amonného při pH 5,0, eluce amoniumacetátovým gradientem (až na 0,2 M roztok octanu amonného).

Shora uvedenými čisticími postupy se získá materiál o čistotě vyšší než 95 %.

Surový materiál lze rovněž čistit chromatografickým tříděním podle velikosti molekuly, vysokotlakou kapalinovou chromatografií s reversní fází (RP-8) nebo afinitní chromatografií na imobilisováných antiinterferonových protilátkách.

Alternativně lze materiál získaný ve shora uvedeném stupni 4 nanést na sloupec obsahující monoklonální protilátku, připravený způsobem popsaným Milsteinem v časopisu Scientific American 243, 66 (1980), a interferon elnovat směsí 0,2 M kyseliny octové,

0,1 % roztoku Tritonu a 0,15 M roztoku chloridu sodného.

Při alternativním výhodném provedení lze leukooytární interferon vyprodukovaný shora popsaným způsobem čistit pomocí následujících čisticích operací:

1. Zmražené buněčné pelety obsahující exprimovaný leukooytární interferon se rozbijí bud manuálně nebo ve vhodném drticím zařízení. Částečně rozmražené buňky se suspendují ve 4 objemech pufru A, obsahujícího 0,1 M roztok Tris-base upravený na pH 7,5 až 8,0, 10 % (m/V) roztok sacharosy, 0,2 M roztok chloridu sodného, 5 mM roztok EDTA,

0,1 mM roztok PMSF a 10 až 100 mM roztok bezvodého chloridu hořečnatého. Suspenze se

OS 273 152 B2 udržuje na teplotě asu 4 °C.

Suspense ae pak nechá projít homogenisátorem při aai 41,4 MPa pak znovu při tlaku menším než 6,9 MPa. Efluent z homogeniaátoru z obou pasáží se jímá za chlazení ledovou lázní.

2. K homogenátu se pomalu přidává polyethylenimin až do koncentrace asi 0,35 % a směs se ponechá stát asi 30 minut. Pevné podíly se oddělí odstředěním nebo filtraci. Tento stupeň se provádí za stálého kontrolování teploty nebo dostatečně rychle, tak aby teplota supernatantu (nebo filtrátu) byla stále nižší než 10 °C. Supernatant (filtrát) se zkoncentruje ultrafiltrací přibližně na 1/10 původního objemu. Drobné částečky nebo zákal v zadrženém zahuštěném roztoku lze odstranit filtrací přes vhodný filtr, jako na příklad přes mikroporesní membránu.

3. Vyčeřený roztok se nanese přímo na sloupec obsahující monoklonální protilátku, při rychlosti toku 5 až 8 cm/hod. (na příklad 25 až 40 ml/hod. na sloupci o průmětu 2,6 cm). Po nanesení roztoku se sloupec promyje přibližně desetinásobkem objemu sloupce roztoku 25 mM Tris-H01 o pH 7,5 až 8,5, obsahujícího 0,5 M roztok chloridu sodného a roztok povrchově aktivní látky, jako 0,2 % roztok Tritonu X-100 nebo ekvivalentní látky. Po promyti se sloupec vypláchne desetinásobkem objemu sloupce roztoku obsahujícího 0,15 M chlorid sodný a povrchově aktivní činidlo jako Triton X-100 (0,1 % roztok) nebo jeho ekvivalent. Pak se sloupec eluuje 0,2 M roztokem kyseliny octové obsahujícím povrchově aktivní látku jako Triton X-100 (0,1 % roztok) nebo jeho ekvivalent. Bílkovinová frakce ze sloupce a monoklonální protilátkou (stanovená pomocí UV absorbance nebo jinou vhodnou analytickou metodou) se shromáždí a pH se upraví 1N roztokem hydroxidu sodného nebo 1,0 M roztokem Tris-base na hodnotu přibližně 4,5.

4. Spojené interferonové frakce se nanesou na sloupec katexu, jako na sloupec celulosy CM 52 (značky Whatman) nebo její ekvivalent, která byla před tím ekvilibrována vhodným pufrem, jako 50 mM roztokem octanu amonného o pH 4,5. Po nanesení interferonu se sloupec promývá pufrem použitým k ekvilibraoi tak dlouho, až UV absorbance efluentu dosáhne takové hladiny, že se ze sloupce eluuje trochu žádané bílkoviny. Sloupec se pak aluuje roztokem 25 mM octanu sodného obsahujícího 0,12 M chloridu sodného nebo jinou kombinací, která optimalisuje získání interferonu a poskytne po lyofilisaci produkt mající vyhovující vlastnosti jako vzhled a rozpustnost.

Monoklonální protilátky používané při výhodném provádění čištění podle vynálezu popsaném výše lze připravit postupy popsanými Staehelinem a spolupracovníky v časopisu Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78, 1848-1852 (1981). Monoklonální protilátky připravené z ascitické tekutiny se vyčistí a kovalentně naváží na Affigel-10 způsobem popsaným níže.

Každá z pěti myších samic druhu Balb/c se naočkuje 5 až 10x10 hybridomních buněk ze střední růstové fáze kmene. Asi 5x10^ životaschopných buněk získaných z myší produkč ní kapaliny se inokuluje intraperitoneálně další skupině deseti nebo více myší. Od každé myši z posléze uvedené skupiny se opakovaně (2x až 4x) odebírá ascitická kapalina. Mohou být provedeny až tři přenosy buněk a následující odebrání ascitické kapaliny z jedné skupiny myší na druhou. Asoitická kapalina odebraná myším při každém přenosu buněk se shromažďuje.

Z ascitické kapaliny se odstraní buňky a jejich zbytky odstředěním při nízkých otáčkách (500 až 1000násobek g) po dobu 15 minut. Pak se pokračuje v odstřelování při 18 000 otáčkách za minutu po dobu 90 minut. Supernatant se zmrazí a uloží při teplotě -20 °C. Po rozmražení se odstraní další fibrin a jemný vyloučený materiál odstřeďováním při 35 000 otáčkách za minutu po dobu 90 minut. Všechny šarže ascitické kapaliny z každého transferu se testují na specifickou protilátkovou aktivitu stanovením protilátkové vazby v pevné fázi (viz Staehelin a spolupracovníci, citace uvedená

CS 273 152 B2 výše) a vyhovující podíly se spojují.

Koncentrace bílkoviny ve spojených roztocích se stanoví aproximačně na základě toho, že 1 mg bílkoviny vykazuje při 280 nm absorbanei 1,2 v kyvetě o tloušťce 1,0 cm. Ascitické kapaliny s vysokými hladinami protilátky obsahují 30 až 35 mg bílkoviny v jednom ml. Toto množství je ekvivalentní 4 až 7 mg specifické protilátky/ml. Ascitická kapalina o této koncentraci se ředí PBS roztokem (roztok 0,01 M fosforečnanu sodného o pH 7,3 a 0,15 M chloridu sodného) na koncentraci 10 až 12 mg bílkoviny v ml.

Ke každým 100 ml takto zředěného roztoku se při 0 °C, za intensivního míchání, pomalu přidá 90 ml při teplotě místnosti nasyceného roztoku síranu amonného. Suspense se chladí ledem po dobu 40 až 60 minut a pak se odstředuje 15 minut při teplotě 4 °C při 10 000 otáčkách za minutu. Supernatant se oddekantuje a odcentrifugovaná látka se dobře vysuší. Pelety bílkoviny se rozpustí v roztoku obsahujícím 0,02 M Tris-HCl (pH 7,9) a 0,04 M chlorid sodný (pufr I). Roztok bílkoviny se dialysuje 16 až 18 hodin při teplotě místnosti proti 100 objemům zmíněného pufru I s minimálně jednou výměnou pufru. Dialysovaný roztok se za účelem odstranění nerozpustného materiálu odstředuje 10 minut při 15 000 otáčkách za minutu. Podle stanovení absorpce při 280 nm se získá 30 až 35 % původního množství celkové bílkoviny přítomné v ascitické kapalině.

Roztok obsahující 30 až 40 mg bílkoviny na ml se poté nanese na sloupec DEAE-celulosy, ekvilibrované předem pufrem I. Na každý gram nanesené bílkoviny se použije vrstva sloupce o objemu alespoň 100 ml. Protilátka se za sloupce vymývá gradientovou elucí roztokem chloridu sodného obsahujícím 0,02 M Tris-HCl o pH 7,9, s lineárním gradientem od. 0,04 Mdo 0,5 M chloridu sodného. Spojené frakce bílkoviny eluované roztokem o koncentraci mezi 0,06 až 0,1 M chloridu sodného se zkoncentrují tím způsobem, že se bílkovina vysráží stejným objemem roztoku síranu amonného nasyceného při teplotě místnosti a produkt se odcentrifuguje. Získané pelety bílkoviny se rozpustí v roztoku obsahujícím 0,2 M hydrogenuhličitan sodný (pH asi 8,0) a 0,3 M chlorid sodný (pufr II) a roztok se dialysuje při teplotě místnosti proti stejnému pufru, který se třikrát vymění. Dialysovaný roztok se za účelem odstranění malého množství nerozpustného materiálu odstředuje 15 minut při 20 000 násobku g, a koncentrace bílkoviny se upraví pufrem II na hodnotu 20 až 25 mg/ml. Uvedeného roztoku protilátky se použije k přípravě imunoadsorbantu následujícím způsobem.

Affigel-10 (dodavatel BioRad Laboratories, Richmond, Kalifornie) se promyje na sintrovaném skleněném filtru třikrát ledem ochlazeným isopropanolem a pak třikrát ledovou destilovanou vodou. Kaše gelu (asi 50%ní v ledové vodě) se přenese do trubic z plastické hmoty a provede se sedimentace adsorbentu krátkým odstředěním; supernatant se odsaje. Do trubice naplněné gelem se přidá stejný objem (vzhledem ke gelu) přečištěného roztoku protilátky a trubice se nechá za účelem promíchání obsahu otáčet kolem kolmé osy 5 hodin při 4 °C. Po skončení reakce se gel odstředí a promyje dvakrát pufrem III (roztok 0,1 M hydrogenuhličitanu sodného a 0,15 M chloridu sodného), aby se odstranila nezkopulovaná protilátka. Stanovení bílkovin ve spojených promývacích roztocích ukázalo, že více než 90 % protilátky se navázalo na gel.

Aby se zablokovala nezreagovaná místa, smísí se takto upravený gel se stejným objemem 0,1 M roztoku hydrochloridu ethanolaminu (pH 8) a trubice se nechá znovu za účelem promíchání obsahu rotovat 60 minut pří teplotě místnosti. Kaše gelu se promyje až do odstranění reaktantů roztokem PBS a přechovává se v roztoku PBS v přítomnosti 0,02 % (m/K) azidu sodného při teplote 4 °C.

N. Parenterální podávání interferonů

Interferony LelE lze podávat parenterálně osobám potřebujícím antitumorové nebo antivirové léčení a těm, u kterých se projevují imunosupresivní stavy. Dávkování

CS 273 152 B2 a počet dávek jsou paralelní s těmi, které se běžně používají při klinickém zkoušení interferonů získaných z lidských zdrojů, na příklad asi (1 až 10)χ10θ jednotek denně, a v případě materiálů o vyšší čistotě než 1 účelně až do této čistoty, na příklad 5x10? jednotek denně.

Jako jeden příklad_vhodné aplikační formy pro v podstatě homogenní bakteriální interferon LelP lze uvédt přípravu parenterální formy: 3 mg LelP o specifické aktivip tě na příklad 2x10 jednotek/mg se rozpustí ve 25 ml 5N roztoku lidského serumalbuminu, roztok se zfiltruje přes bakteriologický filtr a zfiltrovahý roztok se asepticky rozdělí do 100 kusů injekčních ampulek, které pak obsahují po 6x10^ jednotek čistého interferonu vhodného pro parenterální podávání. Ampulky se před použitím výhodně přechovávají v chladu (při -20 °C).

Sloučeniny podle předloženého vynálezu lze formulovat známými metodami do formy farmaceuticky vhodných přípravků, přičemž účinný polypeptid se používá ve směsi s farmaceuticky přijatelným nosným vehikulem. Vhodná vehikula a jejich formulování jsou popsány na příklad v příručce Remington’s Bharmaceutioal Sciences E.V. Martinem, na kterou zde odkazujeme, farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují účinné množství interferonové bílkoviny spolu s vhodným množstvím vehikula umožňujícího účinné podávání preparátu hostiteli. Jeden z přednostních způsobů podávání je parenterální podávání.

Claims (6)

1. Způsob výroby zralého lidského leukooytárního interferonu s částečnou aminokyselinovou sekvencí Cys-Ala-Trp-Glu-Val-Val-Arg-Ala-Glu-Ile-Met-Arg-Ser se 165 až 166 aminokyselinami a s aminokyselinou Asp, Glu nebo Val v poloze 114 nebo, jestliže je na N-koneo první aminokyseliny shora uvedeného interferonu připojen methionin, se 166 až 167 aminokyselinami a s aminokyselinou Asp, Glu nebo Val v poloze 115, vyznačující se tím, že se nechá růst kmen E. coli transformovaný expresním vektorem vybraným ze skupiny sestávající z plasmidů pLelf' A trp 25, pLelf B trp 7, pLelf P trp 1, pLelf C trp 35, pLelf D trp 11, pLelf H, pLelP I trp 1 a pLelf J trp 1 v kompletní živné půdě, s výhodou L bujónu, obsahující tetracyklin do hodnoty abSorbaňce při 550 nm 1,0, kultura se zředí do živné půdy na bázi hydrogenfosforečnanu obsahující tetracyklin, kultura se nechá růst do hodnoty absorbance při 550 nm 1,0, interferon se isoluje způsoby jako je srážení, chromatografie podle velikosti, vysokotlaká kapalinová chromatografie na obrácených fázích nebo afinitní ohromatografie na imobilizovaných anti-interferonových protilátkách.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se nechá růst kmen E. coli transformovaný expresním vektorem pLelf A trp 25.

3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se nechá růst kmen B. coli transformovaný expresním vektorem vybraným ze skupiny sestávající z plasmidů pLelf B trp 7, pLelf E trp 1, pLelf C trp 35 a pLelP D trp 11.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se nechá růst kmen E. coli transformovaný expresním vektorem pLelf H.

5. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se nechá růst kmen E. coli transformovaný expresním vektorem vybraným ze skupiny sestávající z plasmidů pLelf I trp 1 a pLelf J trp 1.

6. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se k produkci interferonu používá transformovaný kmen 294 E. coli K-12.