DE69925917T2 - PEG-Urikase Konjugate und Verwendung davon - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine chemische Modifikation von Proteinen, mit der Zielsetzung, deren biologische Halbwertszeit zu verlängern und deren Immunogenität zu verringern. Insbesondere bezieht sich die Erfindung dabei auf die Konjugation von Polyethylenglykolen bzw. Polyethylenoxiden zu Uratoxidasen, wodurch die Immunogenität der Uratoxidasen im Wesentlichen ausgeschaltet wird, ohne dabei deren urikolytische Aktivität zu beeinträchtigen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die im Abschnitt zum Hintergrund der Erfindung enthaltenen Aussagen sind nicht als Zugeständnis an früher gewonnene Fachkenntnisse zu begreifen, sondern reflektieren die selbstständigen subjektiven Beiträge der Erfinder zum Erkenntnisstand, wie er zum Zeitpunkt der Erfindung aktuell war, und deren Interpretationen dieses Erkenntnisstandes. Diese Interpretationen können persönliche, und daher noch nicht veröffentlichte Erkenntnisse der Erfinder zum Inhalt haben, die selbst nicht Gegenstand früherer Fachkenntnisse gewesen sind.
  • Uratoxidasen (Urikasen; E.C. 1.7.3.3) sind Enzyme, die die Oxidation von Harnsäure zu einem löslicheren Produkt katalysieren, nämlich Allantoin, ein Purinmetabolit, der leichter ausgeschieden werden kann. Der menschliche Körper produziert keine enzymatisch aktive Urikase, was als Ergebnis mehrerer Mutationen des Gens für Urikase anzusehen ist, die sich im Laufe der Evolution der höheren Primaten vollzogen haben (Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34: 78–84). Infolgedessen können bei Personen, die dafür empfänglich sind, zu hohe Konzentrationen von Harnsäure im Blut (Hyperurikämie) bzw. im Urin (Hyperurikosurie) zu schmerzhafter Arthritis (Gicht), zu entstellenden Harnsäureablagerungen (Gichtknoten) und zu Niereninsuffizienz führen. Derzeit verfügbare Medikamente wie Allopurinol (ein Hemmer der Harnsäuresynthese) rufen bei einigen Betroffenen behandlungslimitierende Nebenwirkungen hervor oder lindern die Leiden nicht in angemessener Weise (Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76: 47–56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4: 177–192). Urikase-Injektionen können eine Hyperurikämie oder Hyperurikosurie zumindest vorübergehend mildern. Da Urikase vom menschlichen Körper jedoch als fremdes Protein angesehen wird, hat selbst eine Erstinjektion mit dem nicht modifizierten Protein, das aus Aspergillus flavus isoliert wurde, bei mehreren Prozent der behandelten Patienten anaphylaktische Reaktionen ausgelöst (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemia 11: 1813–1816); Immunreaktionen beschränken seinen Nutzen auf den Einsatz im Rahmen von Langzeit- oder intermittierenden Behandlungen (Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Méd 10: 711–712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50: 553–554).
  • Die unzureichende Leistung der verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten der Hyperurikämie ist seit Jahrzehnten bekannt (Kissel, P, et al., (1968) Nature 217: 72–74). Desgleichen ist seit vielen Jahren bekannt, dass bestimmte Patientengruppen mit schwerer Gicht von einer sicheren und wirksamen Form der Urikase-Injektionen profitieren können (Davis, FF, et al., (1978) in GB Broun, et al., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169–173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, et al., (1979) Enyme 24: 261–264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26: 49–53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2(8241): 281–283; Abuchowski, A, et al., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219: 352–354; Chen, RH-L, et al., (1981) Biochim Biophys Acta 660: 293–298; Chua, CC, et al., (1988) Ann Int Med 109: 114–117; Greenberg, ML, et al., (1989) Anal Biochem 176: 290–293). Urikasen, die aus tierischen Organen gewonnen werden, sind in Lösungsmitteln, die mit einer sicheren Verabreichung in Form von Injektionen vereinbar sind, beinahe unlöslich (US-Patent Nr. 3.616.231). Einige aus Pflanzen oder Mikroorganismen gewonnene Urikasen sind in medizinisch angemessenen Lösungsmitteln besser löslich. Injektionen mikrobieller Enzyme rufen jedoch rasch Immunreaktionen hervor, die zu lebensbedrohlichen allergischen Reaktionen oder zu einer Inaktivierung und/oder einem beschleunigten Ausscheiden der Urikase aus dem Blutkreislauf führen können (Donadio, et al., (1981); Leaustic, et al., (1983)). Enzyme, die auf abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Urikase beruhen, die von Säugetieren gewonnen wurden, wie Schweine- oder Pavian-Urikase, oder Urikasen, die aus Insekten wie z.B. Drosophila melanogaster oder Drosophila pseudoobscura isoliert wurden (Wallrath, LL, et al., (1990) Mol Cell Biol 10: 5114–5127), haben sich aufgrund ihrer problematischen Immunogenität und mangelnden Löslichkeit bei physiologischen pH-Werten als nicht geeignete Kandidaten für den klinischen Einsatz erwiesen.
  • Um die Halbwertszeit der Proteine zu erhöhen und deren Immunogenität zu verringern, sind kovalente Modifikation von Proteinen mit Polyethylenglykol oder Polyethylenoxid (beide als PEG bezeichnet) eingesetzt worden (US-Patente Nr. 4.179.337, 4.766.106 und 4.847.325; Saifer, MGP, et al., (1994) Adv Exp Med Biol 366: 377–387). Die Kopplung von PEG mit hohem Molekulargewicht zur Herstellung von Konjugaten, die eine längere biologische Halbwertszeit und/oder eine geringere Immunogenität aufweisen, dabei gleichzeitig aber ihre funktionelle Aktivität beibehalten, wurde bereits früher an einem anderen Enzym, der Superoxid-Dismutase, (Somack, R, et al., (1991) Free Rad Res Commun 12–13: 553–562; US-Patente Nr. 5.283.317 und 5.468.478) und an anderen Proteinarten, z.B. Cytokinen, gezeigt (Saifer, MGP, et al., (1997) Polym Preprints 38: 576–577; Sherman, MR, et al., (1997) in JM Harris, et al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 155–169) Washington, DC: American Chemical Society). Auch Urikase-Konjugate mit anderen Polymeren als PEG sind beschrieben worden (US-Patent Nr. 4.460.683).
  • In fast allen Berichten über Versuche, Urikase zu PEGylieren (d.h., um PEG kovalent mit Urikase zu koppeln), wurde PEG primär an die Aminogruppen angehängt, wie an die Aminoreste und die verfügbaren Lysinreste. Bei allen Urikasen, die üblicherweise verwendet wurden, liegt die Gesamtzahl der Lysine in jeder der vier identischen Untereinheiten zwischen 25 (Aspergillus flavus (US-Patent Nr. 5.382.518)) und 29 (Schwein (Wu, X, et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9412–9416)). Manche Lysine stehen in der natürlichen Konfiguration des Enzyms für eine PEGylierung nicht zur Verfügung. Die gebräuchlichste Vorgehensweise, um die Immunogenität der Urikase zu verringern, besteht darin, eine große Anzahl von PEG-Ketten mit niedrigem Molekulargewicht zu koppeln. Dies hat ausnahmslos zu einer starken Herabsetzung der enzymatischen Aktivität der daraus resultierenden Konjugate geführt.
  • Frühere Forscher haben Urikase-Injektionen verwendet, um die Konversion von Harnsäure zu Allantoin in vivo zu katalysieren (siehe Pui, et al., (1997)). In Frankreich und Italien bildet dieser Ansatz die Grundlage für den Einsatz von Urikase, die aus Aspergillus flavus gewonnen wird (Uricozyme®), um Hyperurikämien, die im Zusammenhang mit dem Einsatz von Zytostatika in der Behandlung maligner hämatologischer Erkrankungen stehen, vorzubeugen bzw. diese vorübergehend zu korrigieren oder um bei Gichtpatienten eine hochgradige Hyperurikämie vorübergehend zu lindern (Potaux, L, et al., (1975) Nouv Presse Méd 4: 1109–1112; Legoux, R, et al., (1992) J Biol Chem 267: 8565–8570; US-Patente Nr. 5.382.518 und Nr. 5.541.098). Aufgrund seiner kurzen biologischen Halbwertszeit muss Uricozyme® täglich injiziert werden. Darüber hinaus eignet es sich aufgrund seiner Immunogenität nicht besonders gut für eine Langzeittherapie.
  • Die intravenöse Einzelinjektion eines Präparats mit aus Candida utilis gewonnener Urikase, die mit 5 kDa PEG gekoppelt wurde, senkte das Serum-Urat bei fünf Testpersonen, deren durchschnittliche Serum-Uratkonzentration vor der Injektion bei 6,2 mg/dL lag und somit der Norm entsprach, unter die Nachweisgrenze (Davis, et al., (1981)). Den Testpersonen wurde nach vier Wochen eine weitere Injektion verabreicht, es liegen aber keine Angaben zu deren Reaktion vor. Nach der zweiten (und letzten) Injektion konnten keine Antikörper gegen Urikase nachgewiesen werden, wobei ein relativ unempfindlicher Geldiffusionstest verwendet wurde. In dieser Quelle finden sich keine Angaben zu den Ergebnissen chronischer oder subchronischer Behandlungen von Testpersonen oder Versuchstieren.
  • Ein Präparat mit aus Arthrobacter protoformiae gewonnener Urikase, die mit 5 kDa PEG gekoppelt wurde, wurde verwendet, um bei einem einzelnen Lymphom-Patienten, dessen Serum-Uratkonzentration vor der Injektion bei 15 mg/dL lag, eine Hyperurikämie zu kontrollieren (Chua, et al., (1988)). Wegen des kritischen Zustands des Patienten und der Kürze der Behandlungsdauer (vier Injektionen über einen Zeitraum von 14 Tagen) war es nicht möglich, die langfristige Wirksamkeit oder Sicherheit des Konjugats zu beurteilen.
  • In diesem Antrag wird unter der Bezeichnung „Immunogenität" die Auslösung einer Immunreaktion durch die Injektion eines Präparats mit PEG-modifizierter oder nicht modifizierter Urikase (das Antigen) verstanden, während „Antigenität" sich auf die Reaktion eines Antigens auf bereits vorhandene Antikörper bezieht. Antigenität und Immunogenität werden zusammenfassend als „Immunreaktivität" bezeichnet. In frühren Studien zu PEG-Urikase wurde die Immunreaktivität anhand einer Reihe unterschiedlicher Methoden untersucht, wie: 1) die In-vitro-Reaktion der PEG-Urikase auf bereits ausgebildete Antikörper; 2) Messungen der induzierten Antikörpersynthese; und 3) Raten einer beschleunigten Ausscheidung nach wiederholten Injektionen.
  • Frühere Versuche, die Immunogenität von Urikasen unterschiedlicher Quellen durch Kopplung einer unterschiedlich großen Zahl von PEG-Ketten an eine unterschiedlich große Zahl von Bindungsstellen auszuschalten, waren nur wenig erfolgreich. PEG-Urikasen wurden zuerst von F. F. David und von Y. Inada et al. beschrieben (Davis, et al., (1978); US-Patent Nr. 4.179.337; Nishimura, et al., (1979); japanische Patente Nr. 55-99189 und Nr. 62-55079). Das im '337-Patent beschriebene Konjugat wurde durch Reaktion einer Urikase nicht näher spezifizierten Ursprungs mit eines 2000-fach höheren Molargewichts von PEG von 750 Dalton synthetisiert, was darauf hindeutet, dass sich an jede Urikase-Untereinheit wahrscheinlich eine große Anzahl von Polymermolekülen angelagert hatte. Das '337-Patent beschreibt die Kopplung von PEG bzw. Polypropylenglykol mit einem Molekulargewicht von 500 bis 20.000 Dalton, vorzugsweise ca. 500 bis 5.000 Dalton, zur Herstellung von aktiven, wasserlöslichen, nicht immunogenen Konjugaten verschiedener Polypeptid-Hormone und Enzyme, einschließlich Oxidoreduktasen, von denen die Urikase nur eines von drei Beispielen ist. Darüber hinaus wird im '337-Patent besonders die Kopplung von 10 bis 100 Polymerketten pro Enzymmolekül betont, sowie die Beibehaltung von mindestens 40% der enzymatischen Aktivität. Es wurden keine Testergebnisse zum Ausmaß der PEG-Kopplung an die verfügbaren Aminogruppen der Urikase, zur spezifischen urikolytischen Restaktivität oder zur Immunreaktivität des Konjugats berichtet.
  • In Tabelle 1 sind die Daten aus 13 zitierten Quellen zusammengefasst, die sich auf die Urikase-PEGylierung beziehen. Einige dieser Ergebnisse sind in den 1A–2B graphisch dargestellt. In sieben dieser Veröffentlichungen wird eine signifikante Verringerungen der in vitro gemessenen urikolytischen Aktivität beschrieben, die nach Kopplung einer unterschiedlich großen Zahl von PEG-Ketten an Candida-utilis-Urikase beobachtet wurde. Die Kopplung einer unterschiedlich großen Zahl von 5 kDa PEG-Ketten an Urikase der Schweineleber erzielte ähnliche Ergebnisse, wie dies sowohl in der Veröffentlichung von Chen als auch in einem Symposiumsbericht der gleichen Arbeitsgruppe beschrieben wird (Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1978)).
  • Sieben der in Tabelle 1 zusammengefassten Studien berichten, dass sich die Immunreaktivität der Urikase durch PEGylierung verringerte, und fünf, dass die Immunreaktivität dadurch ganz ausgeschaltet werden konnte. Drei der fünf letzteren Studien bringen die Ausschaltung der Immunreaktivität mit einer deutlichen Verringerungen der urikolytischen Aktivität in Verbindung, und zwar auf bis maximal 15%, 28% oder 45% der ursprünglichen Aktivität (Nishimura, et al., (1979) (15% Aktivität); Chen, et al., (1981) (28% Aktivität); Nishimura, et al., (1981) (45% Aktivität)). Im vierten Bericht wird beschrieben, dass PEG an 61% der verfügbaren Lysinreste koppelte, allerdings finden sich keine Angaben zur spezifischen Restaktivität (Abuchowski, et al., (1981)). Eine Forschungsgruppe, der zwei der oben genannten Forscher angehörten, und die mit den gleichen Methoden arbeitete, beschreibt an anderer Stelle jedoch, dass bei einer Koppelung diesen Ausmaßes die Restaktivität lediglich 23–28% betrug (Chen, et al., (1981)). Aus den Veröffentlichungen von Abuchowski et al. und Chen et al. aus dem Jahre 1981 geht hervor, dass PEG an etwa 60% der verfügbaren Lysinreste koppeln muss, um die Immunogenität der Urikase deutlich zu verringern (Tabelle 1). Die fünfte Veröffentlichung, in der berichtet wird, dass die Immunreaktivität der Urikase ausgeschaltet wurde, macht weder Angaben zum Ausmaß der PEG-Kopplung, noch zur urikolytischen Restaktivität noch zur Art der PEG-Protein-Bindung (Veronese, FM, et al., (1997) in JM Harris, et al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 182–192) Washington, DC: American Chemical Society)).
  • Die Konjugation von PEG zu einer kleineren Fraktion der Lysinreste der Urikase verringerte bei den Versuchstieren zwar die Immunreaktivität, schaltete diese jedoch nicht gänzlich aus (Tsuji, J, et al., (1985) Int J Immunopharmacol 7: 725–730 (28%–45% der gekoppelten Aminogruppen); Yasuda, Y, et al., (1990) Chem Pharm Bull 38: 2053–2056 (38% der gekoppelten Aminogruppen)). Die urikolytische Restaktivität der entsprechenden Anlagerungen bewegte sich zwischen < 33% (Tsuji, et al.) und 60% (Yasuda, et al.) der ursprünglichen Werte. Tsuji, et al. synthetisierten neben 5 kDa PEG auch PEG-Urikase-Konjugate mit 7,5 kDa und 10 kDa PEG. Alle resultierenden Konjugate wiesen zwar eine gewisse Immunogenität und Antigenität auf, zeichneten sich allerdings auch durch eine ausgesprochen reduzierte enzymatische Aktivität aus (Tabelle 1; 1A–1B).
  • Ein PEGyliertes Präparat mit Candida-utilis-Urikase, das fünf Personen jeweils zweimal sicher verabreicht wurde, soll laut Bericht nur 11% seiner ursprünglichen Aktivität beibehalten haben (Davis, et al., (1981)). Mehrere Jahre später wurde PEG-modifizierte Urikase aus Arthrobacter protoformiae viermal einem Patienten mit fortgeschrittenem Lymphom und hochgradiger Hyperurikämie verabreicht (Chua, et al., (1988)). Die Restaktivität der einzelnen Enzympräparate wurde zwar nicht bestimmt, allerdings konnten Chua, et al. anhand eines Enzym-Immunassays (ELISA) zeigen, dass 26 Tage nach der ersten PEG-Urikase-Injektion im Serum des Patienten keine Anti-Urikase-Antikörper nachweisbar waren.
  • Wie in Tabelle 1 zusammenfassend dargestellt, zeigen frühere Studien zu PEGylierter Urikase, dass sich die katalytische Aktivität deutlich verringert, wenn eine ausreichend große Anzahl von PEG-Ketten gekoppelt wird, um die Immunreaktivität wesentlich herabzusetzen. Weiterhin wurden die meisten früheren PEG-Urikase-Präparate synthetisiert, indem PEG mittels Cyanurchlorid aktiviert wurde; dieses Triazinderivat (2,4,6-trichloro-1,3,5-triazin) führt aber nachweislich neue antigene Determinanten in die Kalkulation ein und hat bei Kaninchen die Ausbildung von Antikörpern induziert (Tsuji, et al., (1985)).
  • TABELLE 1:
    Figure 00070001
  • Figure 00080001
  • Figure 00090001
  • Figure 00100001
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  • Figure 00120001
  • Das japanische Patent Nr. 3-148298 von A. Sano et al. beschreibt modifizierte Proteine (einschließlich Urikase), die mit PEG derivatisiert wurden, ein Molekulargewicht von 1–12 kDa aufweisen, eine verringerte Antigenität und eine „bessere und längere" Wirkung zeigen, sowie Methoden zur Herstellung derartig derivatisierter Peptide. Es finden sich jedoch keine Beschreibungen zu Anzahl der Ketten, zu Enzymassays, zu biologischen Tests oder zur Bedeutung von „besser und länger". Die japanischen Patente Nr. 55-99189 und Nr. 62-55079, beide von Y. Inada gehalten, beschreiben Urikase-Konjugate, die mit PEG-Triazin bzw. mit bis-PEG-Triazin (in Tabelle 1 als PEG2 bezeichnet) hergestellt wurden (siehe Nishimura et al., (1979 and 1981)). Beim ersten Konjugattyp betrug das Molekulargewicht des PEG 2 kDa bzw. 5 kDa, beim zweiten Konjugattyp wurde lediglich 5 kDa PEG verwendet. Nishimura et al. (1979) beschreiben, dass 15% der urikolytischen Aktivität nach Modifizierung von 43% der verfügbaren Lysine mit linearem 5 kDa PEG erhalten werden konnte, Nishimura et al. (1981) beschreiben dagegen, dass 31% bzw. 45% der urikolytischen Aktivität nach Modifizierung von 46% bzw. 36% der Lysine mit PEG2 erhalten werden konnte.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Frühere Studien zeigen, dass eine signifikante Verringerung der Immunogenität und/oder Antigenität der Urikase, sofern diese durch eine PEGylierung erreicht wird, ausnahmslos mit einem wesentlichen Verlust der urikolytischen Aktivität einhergeht. Die Sicherheit, Anwenderfreundlichkeit und Rentabilität von Biopharmazeutika insgesamt wird durch eine Verringerung ihrer Potenz und der sich daraus ergebenden Notwendigkeit einer höherer Dosierung beeinträchtigt. Deshalb bedarf es sicherer und wirksamer Alternativen zur Senkung eines erhöhten Harnsäurespiegels in Körperflüssigkeiten wie Blut oder Urin. Die vorliegende Erfindung bietet eine im Wesentlichen nicht immunogene PEG-Urikase, die die gesamte oder beinahe die gesamte urikolytische Aktivität eines nicht modifizierten Enzyms beibehält.
  • Eine Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung besteht aus einem Konjugat der Uratoxidase (Urikase), das mindestens ca. 75% der urikolytischen Aktivität der nicht konjugierten Urikase beibehält und eine wesentlich geringere Immunogenität aufweist. Diese Anwendungsmöglichkeit schließt gereinigte Urikase ein, bei der sich jede Untereinheit kovalent mit durchschnittlich 2 bis 10 PEG-Ketten verbinden kann, die linear oder verzweigt sein können, wobei jedes PEG-Molekül ein Molekulargewicht zwischen ca. 5 kDa und 100 kDa aufweisen kann. Die Urikase dieser potenziellen Anwendungsmöglichkeit der Erfindung kann rekombinant sein. Die rekombinante oder nicht rekombinante Urikase kann von Säugetieren stammen. Bei einer potenziellen Anwendungsmöglichkeit kann die Urikase aus Schweine-, Rinder- oder Schafsleber gewonnen worden sein. Eine andere potenzielle Anwendungsmöglichkeit sieht den Einsatz chimärischer Urikase vor. Die chimärische Urikase kann dabei Anteile der Urikase der Leber des Schweins und/oder des Pavians enthalten. So kann es sich beispielsweise bei der chimärischen Urikase um chimärische Schweine-Pavian-Urikase (PBC-Urikase) handeln, oder aber um Schweine-Urikase, welche die Mutationen R291K und T301S aufweist (PKS-Urikase) (siehe auch Sequenzen in 6 sowie die Ergebnisse der physiologischen und immunologischen Studien in den 7–12). Bei der Urikase kann es sich aber auch um Urikase der Pavianleber handeln, bei der Tyrosin 97 durch Histidin ersetzt wurde, wodurch sich die spezifische Aktivität der Urikase um mindestens ca. 60% steigern lässt. Die Urikase dieser Erfindung kann unabhängig von ihrem Ursprung auch in trunkierter Form vorliegen, wobei die Trunkierung entweder am Aminoende, am Carboxylende oder an beiden Enden vorliegen kann. Ebenso kann es sich aber auch um mikrobielle oder Pilz-Urikase handeln. Bei einer potenziellen Anwendungsmöglichkeit kann die aus Pilzen oder Bakterien gewonnene Urikase entweder in ihrer natürlichen Form vorliegen oder in rekombinanter Form als Urikase aus Aspergillus flavus, Arthrobacter globiförmis bzw. Candida utilis. Daneben kann die Urikase auch von Wirbellosen stammen, wie z.B. Urikase aus Drosophila melanogaster oder Drosophila pseudoobscura in natürlicher oder rekombinanter Form. Bei der Urikase dieser Erfindung kann es sich aber auch um pflanzliche Urikase handeln, z.B. Urikase der Wurzelknolle der Sojabohne(Glycine max) in natürlicher oder rekombinanter Form. Das PEG kann dabei ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen ca. 5 kDa und 100 kDa aufweisen; vorzugsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen ca. 10 kDa und 60 kDa, und noch besser ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen ca. 20 kDa und ca. 40 kDa, z.B. 30 kDa. Die durchschnittliche Anzahl der kovalent gekoppelten PEG-Ketten kann bei 2 bis 10 Ketten pro Urikase-Untereinheit liegen; vorzugsweise sollte die durchschnittliche Anzahl der kovalent gekoppelten Ketten bei 3 bis 8 pro Untereinheit liegen; und noch besser wäre eine durchschnittliche Anzahl der PEG-Ketten von 4 bis 6 pro Untereinheit. Eine potenzielle Anwendungsmöglichkeit sieht tetramere Urikase vor. Die PEG-Ketten können kovalent an Urikase gekoppelt sein, und zwar über Urethan (Carbamat-) Verbindungen, sekundäre Aminenverbindungen, und/oder Amidverbindungen. Handelt es sich bei einer der hier erwähnten Formen der Urikase um Urikase in rekombinanter Form, so kann die rekombinante Form im Wesentlichen die Sequenz der natürlich vorkommenden Form aufweisen.
  • Eine andere Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung besteht in einer pharmazeutischen Zubereitung zur Senkung des Harnsäurespiegels in Körperflüssigkeiten, die ein beliebiges der oben beschriebenen PEG-Urikase-Konjugate sowie eine pharmazeutisch angemessene Trägersubstanz enthält. Die Zubereitung kann dabei mittels Lyophilisation stabilisiert und bei Rekonstitution unmittelbar aufgelöst werden, um Lösungen zu gewinnen, die sich für eine parenterale Verabreichung eignen.
  • Die vorliegende Erfindung sieht ebenfalls die Nutzung von PEG-Urikase zur Senkung des Harnsäurespiegels in den Körperflüssigkeiten sowie im Gewebe eines Säugetiers vor. Die Nutzung schließt die Verabreichung einer zur Senkung des Harnsäurespiegels ausreichend wirksamen Menge PEG-Urikase an ein Säugetier ein. Bei der genannten PEG-Urikase kann es sich um in einer pharmazeutisch angemessenen Trägersubstanz vorliegende, gereinigte Urikase mit zwei oder mehr Untereinheiten handeln, bei der jede Untereinheit kovalent mit durchschnittlich 2 bis 10 PEG-Ketten verbunden ist, die ihrerseits linear oder verzweigt sein können, wobei jedes PEG-Molekül ein Molekulargewicht zwischen ca. 5 kDa und 100 kDa aufweisen kann. Bei dem genannten Säugetier kann es sich um einen Menschen handeln. Der Verabreichung kann dabei z.B. in Form einer Injektion erfolgen, die intravenös, intradermal, subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal verabreicht wird, oder als zerstäubtes Präparat, das inhaliert wird. Die erhöhten Harnsäurespiegel können sich im Blut, im Urin und/oder in anderen Körperflüssigkeiten oder im Gewebe finden und im Zusammenhang mit Gicht, Gichtknoten, Niereninsuffizienz, Organtransplantation oder malignen Erkrankungen stehen.
  • Weitere Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung bestehen in Methoden zur Isolierung einer tetrameren Form der Urikase aus einer Lösung, die mehrere Formen der Urikase enthält, sowie in dem Produkt dieser Methoden. Die Lösung kann dabei anfänglich tetramere Urikase und Urikaseaggregate enthalten. Die Methode kann folgende Schritte umfassen: Applikation der Lösung in mindestens eine Trennsäule bei einem pH-Wert zwischen ca. 9 und 10,5, wie z.B. 10,2; Wiedergewinnung von einzelnen Fraktionen des Eluats mit dem Ziel, diejenigen Fraktionen zu identifizieren, die möglicherweise isolierte tetramere Urikase enthalten, wobei die Fraktionen im Wesentlichen frei von Urikaseaggregaten sind; und Pooling der Fraktionen der isolierten tetrameren Urikase. Die Trennsäule kann dabei auf einem Ionenaustausch, auf einem Größenausschluss der Moleküle oder auf einer beliebigen anderen wirksamen Trenneigenschaft basieren. Die Methode kann auch die Analyse von Fraktionen beinhalten, um das Vorhandensein von tetramerer Urikase und/oder das Fehlen von Urikaseaggregaten nachzuweisen. Eine derartige Analyse kann beispielsweise die Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder andere chromatographische Verfahren, Lichtstreuung, Zentrifugieren und/oder Elektrophorese einschließen. Bei einer potenziellen Anwendungsmöglichkeit kann die gereinigte tetramere Urikase weniger als ca. 10% Urikaseaggregate enthalten.
  • Kurzbeschreibung der Abbildungen
  • 1A zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter Candida-utilis-Urikase als eine Funktion der Anzahl der PEG-Ketten, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 1B zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter Candida-utilis-Urikase als eine Funktion des Gesamtgewichts der PEG-Moleküle, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 2A zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter Schweineleber-Urikase als eine Funktion der Anzahl der PEG-Ketten, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 2B zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter Schweineleber-Urikase als eine Funktion des Gesamtgewichts der PEG-Moleküle, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 3A zeigt die Aktivitätsretention bei chimärischer PEGylierter Schweine-/Pavian-Urikase (PBC-Urikase) als eine Funktion der Anzahl der Ketten, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 3B zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter PBC-Urikase als eine Funktion des Gesamtgewichts der PEG-Moleküle, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 4A zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter Aspergillus-flavus-Urikase als eine Funktion der Anzahl der PEG-Ketten, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 4B zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter Aspergillus-flavus-Urikase als eine Funktion des Gesamtgewichts der PEG-Moleküle, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 5A zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter rekombinanter Urikase der Wurzelknolle der Sojabohne als eine Funktion der Anzahl der PEG-Ketten, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 5B zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter rekombinanter Urikase der Wurzelknolle der Sojabohne als eine Funktion des Gesamtgewichts der PEG-Moleküle, die pro Untereinheit gekoppelt sind.
  • 6 zeigt die abgeleiteten Aminosäuresequenzen der chimärischen Schweine-Pavian-Urikase (PBC-Urikase), der PBC-Urikase, die sowohl am Aminoende als auch am Carboxylende (PBC-NT-CT) trunkiert ist, und der Schweine-Urikase, die die Mutationen R291K und T301S (PKS Urikase) aufweist, verglichen mit der Schweine-Sequenz und der Pavian-Sequenz.
  • 7 zeigt die Aktivität der Urikase im Mausserum jeweils 24 Stunden nach jedes von vier bzw. fünf intraperitonealen Injektionen PEG-modifizierter PBC-Urikase, in Vergleich zum Wert 24 Stunden nach der ersten Injektion.
  • 8 zeigt die inverse Relation zwischen der Aktivität nach Injektion von PEG-modifizierter PBC-Urikase im Serum einer Maus mit Urikasemangel, und die Harnsäure-Konzentrationen im Serum und im Urin.
  • 9 zeigt den verringerten Schweregrad eines Urinkonzentrationsdefekts bei ((uox –/–)-Mäusen mit Urikasemangel, die mit PEG-modifizierter PBC-Urikase behandelt wurden.
  • 10 zeigt den verringerten Schweregrad eines nephrogenen Diabetes insipidus bei ((uox –/–)-Mäusen mit Urikasemangel, die mit PEG-modifizierter PBC-Urikase behandelt wurden.
  • 11 zeigt den verringerten Schweregrad einer harnsäureinduzierten Nephropathie bei ((uox –/–)-Mäusen mit Urikasemangel, die mit PEG-modifizierter PBC-Urikase behandelt wurden, in magnetresonanzmikroskopischer Darstellung.
  • 12 zeigt die beschleunigte Ausscheidung aus dem Blutkreislauf bei BALB/c Mäusen, denen ein PBC-Urikase-Oktamer injiziert wurde, in Vergleich zur Tetramer-Injektion, wenn beide mit 5–6 Ketten 10 kDa PEG pro Untereinheit gekoppelt waren.
  • Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Anwendungsmöglichkeiten
  • Die vorliegende Erfindung besteht in verbesserten Konjugaten wasserlöslicher Polymere, vorzugsweise Polyethylenglykole bzw. Polyethylenoxide, mit Urikasen. Die Erfindung bezieht auch die pharmazeutische Zubereitung der verbesserten Konjugate ein. Diese Konjugate sind im Wesentlichen nicht immunogen und behalten mindestens 75%, vorzugsweise 85%, noch besser aber 95% oder mehr der urikolytischen Aktivität des nicht modifizierten Enzyms bei. Zu den Urikasen, die sich für eine Konjugation zu wasserlöslichen Polymeren eignen, zählen Uratoxidasen in natürlicher Form, die aus Bakterien, Pilzen und dem Gewebe von Pflanzen und Tieren, und zwar sowohl der Wirbeltiere als auch der Wirbellosen, isoliert wurden, wie auch rekombinante Formen der Urikase, einschließlich mutierter, hybrider, und/oder trunkierter enzymatisch aktiver Varianten der Urikase. Zu den wasserlöslichen Polymeren, die sich für die Nutzung der vorliegenden Erfindung eignen, zählen lineare und verzweigte Polyethylenglykole bzw. Polyethylenoxide, die allgemein auch als PEG bezeichnet werden. Beispiele für verzweigte PEG sind Gegenstand des US-Patents Nr. 5.643.575. Ein bevorzugtes Beispiel für lineare PEG ist das MonomethoxyPEG, das die allgemeine Strukturformel CH3O-(CH2CH2O)nH aufweist, wobei n zwischen ca. 100 und ca. 2.300 schwanken kann.
  • Eine bevorzugte Säugetier-Urikase ist die rekombinante chimärische Schweine-Pavian-Urikase, die sich aus Teilen der Sequenzen der Schweineleber-Urikase und der Pavianleber-Urikase zusammensetzt; beide wurden zuerst von Wu et al. (1989) bestimmt. Ein Beispiel für eine derartige chimärische Urikase bilden die ersten 225 Aminosäuren der Schweine-Urikase-Sequenz (SEQ ID NR: 1) und die letzten 79 Aminosäuren der Pavian-Urikase-Sequenz (SEQ ID NR: 2) (Schweine-Pavian-Urikase oder PBC-Urikase, siehe 6). Ein anderes Beispiel für eine derartige chimärische Urikase bilden die Reste 7 bis 225 der Schweine-Sequenz (SEQ ID NR. 1) und die Reste 226 bis 301 der Pavian-Sequenz (SEQ ID NR. 2); diese ist äquivalent mit der PBC-Urikase, die sowohl an den Aminoenden als auch an den Carboxylenden trunkiert ist (PBC-NT-CT, siehe 6). Ein weiteres Beispiel für eine derartige chimärische Urikase bilden die ersten 288 Aminosäuren der Schweine-Sequenz (SEQ ID NR: 1) und die letzten 16 Aminosäuren der Pavian-Sequenz (SEQ ID NR: 2). Weil letztere Sequenz sich nur in zwei Positionen von der Schweine-Sequenz unterscheidet, da sie ein Lysin (K) statt eines Arginins als Rest 291 und ein Serin (S) statt eines Threonins als Rest 301 aufweist, wird diese Mutation auch als Schweine-K-S oder als PKS-Urikase bezeichnet. PKS-, PBC- und PBC-NT-CT-Urikasen haben jeweils einen Lysinrest mehr und bieten daher im Vergleich zur Schweine-Sequenz oder zur Pavian-Sequenz eine potenzielle zusätzliche Bindungsstelle für die PEGylierung.
  • Die cDNA der verschiedenen Säugetier-Urikasen, einschließlich der PBC-Urikase, der PKS-Urikase und der rekombinanten Pavian-Urikase, wurde subkloniert und die optimalen Bedingungen für eine Expression in E. coli unter Anwendung der Standardmethoden bestimmt (siehe Erlich, HA, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. New York: Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Die rekombinanten Urikasen wurden extrahiert, gereinigt, und anhand modifizierter Standardassays auf ihre Stabilität und Aktivität hin untersucht (siehe Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240: 2491–2494; Nishimura, et al., (1979), und Beispiel 1).
  • In einer Anwendungsmöglichkeit der Erfindung kann Urikase über eine biologisch stabile, nicht toxische, kovalente Verbindung zu einer relativ kleinen Anzahl von PEG-Ketten konjugiert werden. Zu derartigen Verbindungen zählen etwa Urethan- (Carbamat-) Verbindungen, sekundäre Aminverbindungen und Amidverbindungen. Eine Reihe aktivierter PEG, die sich für derartige Konjugationen eignen, können im Handel über Shearwater Polymers, Huntsville, AL, USA, bezogen werden.
  • Urethan-Verbindungen mit Urikase lassen sich beispielsweise herstellen, indem Urikase in Gegenwart von Succinimidylcarbonat- (SC-) oder 4-Nitrophenylcarbonat (NPC-) Derivaten der PEG inkubiert wird. SC-PEG lässt sich anhand des Verfahrens synthetisieren, das in US-Patent Nr. 5.612.460 beschrieben wird und an dieser Stelle als Literaturhinweis einbezogen wird. NPC-PEG lässt sich synthetisieren, indem PEG nach den Methoden, wie sie von Veronese, FM, et al., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11: 141–152, und im US-Patent Nr. 5.285.637 beschrieben werden und das an dieser Stelle als Literaturhinweis einbezogen werden, mit 4-Nitrophenylchloroformat reagiert wird. Die im '637-Patent beschrieben Methoden wurden für PEG mit einem höheren Molekulargewicht adaptiert, indem die Konzentration der Reagenzien so angepasst wurde, dass gleiche stöchiometrische Werte erzielt wurden. Eine weitere Methode der NPC-PEG-Synthese ist bei Büttner, W, et al., Patentspezifikation DD 279 486 Al der ehemaligen DDR, beschrieben.
  • Amidverbindungen mit Urikase können durch den Einsatz eines N-Hydroxysuccinimidesters eines Carboxysäurederivats des PEG (Shearwater Polymers) hergestellt werden. Sekundäre Aminverbindungen können mit 2,2,2-trifluorethansulfonyl-PEG (tresyl PEG; Shearwater Polymers) oder durch eine reduktive Alkylierung mit PEG-Aldehyd (Shearwater Polymers) und Natriumcyanoborhydrid hergestellt werden.
  • Bei Konjugaten, die PEG mit einem Molekulargewicht zwischen 5 kDa und 30 kDa enthalten, lag die maximale Zahl der pro Untereinheit gekoppelten PEG-Ketten, wenn mindestens 75% der urikolytischen Aktivität des nicht modifizierten Enzyms erhalten blieb, bei durchschnittlich 2 Ketten bei der Sojabohnen-Urikase und mehr als 10 Ketten bei der PBC-Urikase (siehe Bedingungen der Assays in Beispiel 1 und die Ergebnisse in den 1A–5B). Die letztere PEGylierung erfasst vom Umfang her etwa ein Drittel aller Aminogruppen insgesamt. Bei einer Anwendungsmöglichkeit der Erfindung liegt die durchschnittliche Zahl der pro Urikase-Untereinheit gekoppelten PEG-Ketten zwischen 2 und 10 Ketten. Eine bevorzugte Anwendungsmöglichkeit sieht eine durchschnittliche Zahl der pro Urikase-Untereinheit gekoppelten PEG-Ketten zwischen 3 und 8 Ketten vor. Eine stärker bevorzugte Anwendungsmöglichkeit sieht eine durchschnittliche Zahl der pro Urikase-Untereinheit kovalent gekoppelten PEG-Ketten zwischen 4 und 6 vor. Bei einer weiteren Anwendungsmöglichkeit beträgt das Molekulargewicht der PEG, die für die Kopplungsreaktion verwendet werden, zwischen 5 kDa unds 100 kDa, vorzugsweise zwischen 10 kDa und 60 kDa, besser aber zwischen 20 kDa und 40 kDa, wie z.B. 30 kDa.
  • Es gibt mehrere Faktoren, die die Auswahl des optimalen Molekulargewichts und der optimalen Zahl der PEG-Ketten für die Kopplung einer gegebenen Urikase-Form beeinflussen können. Im Allgemeinen erfordert eine Senkung oder gänzliche Ausschaltung der Immunogenität ohne gleichzeitigen wesentlichen Verlust der urikolytischen Aktivität eine Kopplung von relativ vielen PEG-Ketten mit niedrigem Molekulargewicht oder eine Kopplung von relativ wenigen PEG-Ketten mit höherem Molekulargewicht. So kann eine optimale Wirkung z.B. entweder mit 6 20 kDa PEG-Ketten pro Untereinheit oder mit 4 30 kDa PEG-Ketten erreicht werden. Desgleichen können sich bei den unterschiedlichen Urikase-Formen sowohl die Größe als auch die Anzahl der Ketten als unterschiedlich optimal erweisen (siehe 1A–5B).
  • Nach PEG-Konjugation erwiesen sich alle getesteten Urikasen als löslich und bei physiologischem pH-Wert in Puffersubstanzen stabil, und das ohne Hinzufügung eines Substratanalogons oder Inhibitors wie 8-Azaxanthin, das bei der Pilz-Urikase (Uricozyme®) als Stabilisator verwendet und in Frankreich und Italien über Sanofi Winthrop vertrieben wird. Zwei verschiedene Konjugate der PBC-Urikase, von denen eines ca. 6 10 kDa PEG-Ketten pro Untereinheit enthielt, das andere ca. 2 19 kDa PEG-Ketten pro Untereinheit, behielten nach Inkubation im Mausserum bei 37°C über mehr als einen Monat ein signifikantes Maß ihrer Aktivität bei. Darüber hinaus zeigten mehrere Konjugate dieser Erfindung bei Mäusen natürliche Halbwertszeiten, die zwei Tage überschritten, und damit im zu den Halbwertszeiten von ca. 8 Stunden bzw. 24 Stunden standen, wie sie in früheren Arbeiten für PEG-modifizierte Säugetier- und mikrobielle Urikasen beschrieben wurden (Chen, et al., (1981); Fuertges, F, et al., (1990) J Contr Release 11: 139–148; Fujita, T, et al., (1991) J Pharmacobiodyn 14: 623–629). Eine längere Halbwertszeit injizierbarer Proteinmedikamente macht diese rentabler und kann zu einer besseren Therapietreue seitens der Patienten beitragen. Zudem zeichnet eine längere Halbwertszeit Präparate aus, die vom Körper besser vertragen werden.
  • Wenn PEG-Konjugate von PBC-Urikasen der gereinigten tetrameren Form des Enzyms hergestellt wurden (4 35 kDa Untereinheiten), zeigen diese bei Mäusen eine erheblich reduzierte Immunogenität (7), im Gegensatz zu der moderaten Immunogenität von PEG Konjugaten der größeren Formen des Enzyms (z.B. Oktamere der 35 kDa Untereinheit, siehe 12), und im Gegensatz zu der sehr hohen Immunogenität des nicht modifizierten Enzyms. Bei Mäusen mit Urikasemangel, denen wiederholt Injektionen mit PEG-Urikase der vorliegenden Erfindung verabreicht wurden, konnte deren Hyperurikämie für mehr als zwei Monate beseitigt und die Struktur und Funktion der Nieren vor einer harnsäurebedingten Schädigung geschützt werden (8–11).
  • Injektionen mit vollständig aktiven Konjugaten der PBC-Urikase mit 10 kDa PEG (3A–3B) verringerten die Hyperurikämie bei homozygoten Mäusen mit Urikasemangel deutlich (8). Desgleichen konnte der Harnsäurespiegel im Urin bei allen Mäusen mit Urikasemangel, die mit PEG-modifizierter PBC-Urikase behandelt wurden, deutlich gesenkt werden. Mäuse mit einem Urikasemangel erhielten eine Reihe von Injektionen mit der gleichen PEG-Urikase-Zubereitung, die verwendet wurde, um die in 8 dargestellten Daten zu gewinnen. Diese Behandlung verringerte den Schweregrad eines Urinkonzentrationsdefekts, wie Messungen der Urinosmolalität unter Normalbedingungen sowie 12 Stunden nach Wasserentzug (9), Messungen des Wasserkonsums und Messungen der Urinausscheidung (10) belegten, verglichen mit den entsprechenden Messungen, die bei nicht behandelten, genetisch gleichen Mäusen durchgeführt wurden. Es konnte auch gezeigt werden, dass eine zehnwöchige Behandlung mit einer PEG-Urikase dieser Erfindung, die innerhalb der ersten zehn Lebenstage der Versuchstiere begonnen wurde, bei homozygoten (uox –/–) „Knock-Out"-Mäusen den Schweregrad einer uratinduzierten Schädigung der Nierenarchitektur in der magnetresonanzmikroskopischen Darstellung verringerte(11) (für das mikroskopische Verfahren siehe Hedlund, LW, et al., (1991) Fund Appl Toxicol 16: 787–797; Johnson, GA, et al., (1992) in JC Gore, (Ed.), Reviews of Magnetic Resonance in Medicine, Vol. 4 (pp. 187–219) New York: Pergamon Press).
  • Gereinigte Zubereitungen von natürlich vorkommenden und rekombinanten Urikasen enthalten neben der tetrameren Form des Enzyms (140 kDa) für gewöhnlich eine Mischung aus Enzymaggregaten. Der Prozentsatz jeder Urikase-Zubereitung, die in der tetrameren Form vorliegt, schwankt im Allgemeinen zwischen ca. 20% und 90%. Obwohl es Hinweise dafür gibt, dass nicht PEGylierte Aggregate verschiedener anderer Proteine hoch immunogen sind (siehe z.B. Moore, WV, et al., (1980) J Clin Endocrinol Metab 51: 691–697), sind in früheren Studien zu PEG-Urikasen keine Versuche beschrieben worden, den Aggregatgehalt einzuschränken, was darauf schließen lässt, dass der potenziellen Immunogenität der PEG-modifizierten Aggregate keine Aufmerksamkeit geschenkt wurde. Auf der Grundlage der Beobachtungen, die die Erfinder der vorliegenden Erfindung gemacht haben, erscheint es wahrscheinlich, dass in den Enzympräparaten, die bei früheren Synthetisierungen der PEG-Urikase verwendet wurden, derartige Aggregate vorhanden waren. Deren Anwesenheit kann die Aufgabe, ein nicht immunogenes Konjugat herzustellen, erschwert haben. Es scheint auch, dass die großen Verluste der urikolytischen Aktivität, wie sie in früheren Versuchen der Urikase-PEGylierung beobachtet werden, mit der großen Zahl gekoppelter PEG-Ketten mit niedrigem Molekulargewicht zusammenhängen. Andererseits ermöglichen die hier beschriebenen Methoden der Urikase-Reinigung und -PEGgylierung die kovalente Kopplung von bis zu 10 PEG-Ketten pro Untereinheit, während gleichzeitig mehr als 75% der urikolytisehen Aktivität erhalten bleibt, zumindest bei einigen Urikasen, wie z.B. der chimärischen Schweine-Pavian-Urikase und dem aus A. flavus gewonnenen Enzym (siehe 3A und 4A).
  • In einer anderen bevorzugten Anwendungsmöglichkeit lassen sich praktisch alle Aggregate der tetrameren Form des Enzyms entfernen, und zwar mittels Ionenaustausch- oder Größenausschlusschromatographie bei einem pH-Wert zwischen ca. 9 und 10,5, vorzugsweise 10,2, die vor der PEG-Konjugation der daraus resultierenden, im Wesentlichen tetrameren Urikase-Zubereitung durchgeführt wird. Das Molekulargewicht der Urikase jeder in der präparativen Säule vorhandenen Fraktion kann mit jedem analytischen Verfahren kontrolliert werden, das auf einem Größenausschluss der Moleküle basiert, wie z.B. der HPLC, der konventionellen Größenausschlusschromatographie, der Zentrifugierung, der Lichtstreuung, der kapillaren Elektrophorese oder der Gel-Elektrophorese in einem nicht denaturierenden Puffer. Bei der mittels Größenausschlusschromatographie isolierten tetrameren Urikase dürfen nur diejenigen Fraktionen gepoolt und für die PEG-Konjugation verwendet werden, die die 140 kDa Form des Enzyms enthalten. Bei der mittels Ionenaustauschchromatographie isolierten tetrameren Urikase können die in der Ionenaustauschsäule befindlichen Fraktionen auf ihre Größe hin analysiert werden, um zu bestimmen, welche Fraktionen wesentliche Mengen tetramerer Formen ohne nachweisbare Aggregate enthalten. Mindestens 90% der auf diese Weise gepoolten Urikase können in der tetrameren Form vorliegen; die unerwünschten Aggregate können auf diese Weise 10%, 5%, 2% oder sogar weniger der isolierten Urikase insgesamt ausmachen.
  • Aus den hier vorgelegten Ergebnissen geht hervor, dass einige Formen der PBC-Urikase, die in einer höheren als der tetrameren Form vorliegen, selbst nach extensiver PEGylierung bei Mäusen eine hohe Immunogenität zeigen (12). Darüber hinaus nahm bei Mäusen, denen einmalig urikaseaggregathaltige PEG-Konjugate injiziert wurden, nach den Folgeinjektionen von entweder PEGylierten Tetrameren oder PEGylierten Aggregaten die urikolytische Aktivität im Blutkreislauf rasch ab. Dagegen konnten Konjugate, die aus Urikase zubereitet worden waren, die weniger als 5% Aggregate enthielt, mehrmals wiederholt injiziert werden, ohne dass dabei eine Beschleunigung der Ausscheidungsraten beobachtet wurde (7), und ohne dass in einem empfindlichen Enzym-Immunassay Antikörper nachgewiesen werden konnten. Der Einsatz stark gereinigter tetramerer Urikase ist ein weiteres Merkmal, das die verbesserten Konjugate der vorliegenden Erfindung von den bereits früher beschriebenen PEG-Urikase-Zubereitungen unterscheidet. Dagegen könnte das Vorhandensein eines signifikanten Anteils von Aggregaten in den Urikase-Zubereitungen (z.B. > 10%), die von einigen der früheren Forscher verwendet wurden, diese veranlasst haben, bei dem Versuch, die Immunogenität zu unterdrücken, eine größere Anzahl von PEG-Ketten zu koppeln. Folglich wurde die enzymatische Aktivität der resultierenden Konjugate wesentlich verringert. Andere Anwendungsmöglichkeiten der vorliegenden Erfindung haben ausdrücklich PEGylierte Urikase in nicht tetramerer Form im Blick, wie beispielsweise Urikase-Dimere, sofern die Zubereitungen der derartig konjugierten Urikase mindestens ca. 75% ihrer urikolytischen Aktivität beibehalten und im Wesentlichen nicht immunogen sind.
  • Eine andere Anwendungsmöglichkeit der vorliegenden Erfindung besteht in der Mutation einer Pavianleber-Urikase, die sich gegenüber dem nicht mutierten Enzym durch eine ausgesprochen hohe Potenz auszeichnet. Diese verbesserte Primaten-Urikase wurde mit Hilfe konventioneller rekombinanter DNS-Verfahren hergestellt. Dabei überraschte vor allem, dass die Substitution eines einzigen Aminosäurerestes (Histidin für Tyrosin bei Position 97) zu einer substanziellen Steigerung der spezifischen enzymatischen Aktivität der Pavian-Urikase führte. Bei Expression in E. coli zeigte sich, dass diese Proteinmutation eine mindestens 60% höhere spezifische Aktivität aufwies als das rekombinante Pavian-Enzym, von dem sich die Mutation ursprünglich ableitete.
  • Eine andere Anwendungsmöglichkeit besteht in der Erhöhung der spezifischen Aktivität und/oder einer Verbesserung der Löslichkeit des nicht PEGylierten Enzyms, und zwar durch die Expression einer trunkierten Variante der chimärischen Schweine- oder Schweine-Pavian-Urikase, bei der im exprimierten Protein mindestens die ersten sechs Aminosäuren am Aminoende und/oder mindestens die letzten drei Aminosäuren am Carboxylende entfernt wurden (siehe 6). Rekombinante Urikasen mit trunkiertem Carboxylende können sich aufgrund der Entfernung der peroxisomalen Zielsequenz gegenüber nicht PEGylierten Urikasen durch eine bessere Löslichkeit auszeichnen (siehe Miura, S, et al., (1994) Eur J Biochem 223: 141–146).
  • Die PEG-Urikase-Konjugate der vorliegenden Erfindung dienen der Senkung des Harnsäurespiegels in den Körperflüssigkeiten und im Gewebe von Säugetieren, vorzugsweise denen des Menschen, und können daher zur Behandlung eines erhöhten Harnsäurespiegels im Zusammenhang mit Erkrankungen wie Gicht, Gichtknoten, Niereninsuffizienz, Organtransplantationen und malignen Erkrankungen eingesetzt werden. Die PEG-Urikase-Konjugate können einem Säugetier, das einen zu hohen Harnsäurespiegel aufweist, auf unterschiedlichem Wege injiziert werden, einschließlich auf intravenösem, subkutanem, intradermalem, intramuskulärem oder intraperitonealem Wege. Alternativ dazu können sie zerstäubt und inhaliert werden (siehe Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19: 3–36 und US-Patent Nr. 5.458.135). Die effektive Dosis der PEG-Urikase der vorliegenden Erfindung richtet sich dabei nach der Höhe des Harnsäurespiegels und der Körpergröße des Individuums. Eine Anwendungsmöglichkeit eines Aspekts dieser Erfindung sieht die Verabreichung von PEG-Urikase in einem pharmazeutisch angemessenen Auszugs- oder Verdünnungsmittel in einer Menge von ca. 10 μg bis ca. 1 g vor. Eine bevorzugte Anwendungsmöglichkeit sieht die Verabreichung einer Dosis zwischen 100 μg und 500 mg vor. Optimaler wäre jedoch, wenn die konjugierte Urikase in einer Menge zwischen 1 mg und 100 mg verabreicht würde, wie z.B. 5 mg, 20 mg oder 50 mg. Die Mengen der unter den Anwendungsmöglichkeiten aufgeführten Dosierungen beziehen sich dabei auf die Mengen der im Konjugat enthaltenen Proteine.
  • Pharmazeutische Rezepturen, die PEG-Urikase enthalten, können durch konventionelle Verfahren hergestellt werden, wie z.B. bei Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Easton, PA: Mack Publishing Co, beschrieben. Geeignete Trägersubstanzen für Zubereitungen injizierbarer Lösungen sind z.B. phosphatgepufferte Saline, Laktat-Ringer-Lösung, Wasser, Polyole oder Glycerin. Zu den pharmazeutischen Zubereitungen für parenterale Injektionen gehören pharmazeutisch angemessene sterile wässrige oder nicht wässrige Flüssigkeiten, Dispersionen, Suspensionen, oder Emulsionen, sowie sterile Pulver zur Rekonstitution steriler injizierbarer Lösungen und Dispersionen unmittelbar vor Gebrauch. Diese Rezepturen können zusätzliche Komponenten enthalten, wie z.B. Konservierungsmittel, Solubilisatoren, Stabilisatoren, Detergenzien, Emulgatoren, Puffer, Antioxidanzien oder Verdünnungsmittel.
  • PEG-Urikase kann auch in Form eines Implantats zur kontrollierten Abgabe der Zubereitungen bereitgestellt werden, um erhöhte Harnsäurespiegel in Körperflüssigkeiten dauerhaft zu kontrollieren. So bestehen z.B. Polylaktatsäure, Polyglykolsäure, regeneriertes Collagen, Poly-L-Lysin, Natriumalginat, Gellangummi, Chitosan, Agarosegel, multilamellare Liposomen und viele anderen konventionellen Depotpräparate aus biologisch erodierbaren oder biologisch abbaubaren Materialien, die zusammen mit biologisch aktiven Verbindungen formuliert sein können. Diese Materialien bauen sich nach Implantation oder Injektion allmählich ab und setzen dann im umliegenden Gewebe die Wirkstoffe frei. Ein mögliches Verfahren der Einkapselung von PEG-Urikase besteht in der Methode, die in US-Patent Nr. 5.653.974 beschrieben ist. Die vorliegende Erfindung sieht ausdrücklich den Einsatz von biologisch erodierbaren, biologisch abbaubaren und anderen Depotformulierungen vor. Auch der Einsatz von Infusionspumpen und Matrix-Entrapment-Systemen zur Freisetzung von PEG-Urikase ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. PEG-Urikase kann auch vorteilhaft in Mizellen oder Liposomen eingeschlossen werden. Die Technologie der Liposomen-Einkapselung ist der Fachwelt wohl bekannt (siehe z.B. Lasic, D, et al., (Eds.) (1995) Stealth Liposomes. Boca Raton, FL: CRC Press).
  • Die pharmazeutischen Zubereitungen mit PEG-Urikase dieser Erfindung werden bei Hochrisiko-Patienten mit uratinduzierter Niereninsuffizienz den Bedarf einer Hämodialyse verringern, z.B. bei Empfängern von Spenderorganen (siehe Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron 56: 317–321) und bei einigen Patienten mit malignen Erkrankungen. Bei Patienten, bei denen es zu einer starken Ablagerung von Kristallen der Harnsäure gekommen ist (Gichtknoten), werden diese pharmazeutischen Zubereitungen schneller eine Verbesserung der Lebensqualität bewirken als die derzeit verfügbaren Behandlungsmöglichkeiten.
  • Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die verschiedenen oben aufgeführten Aspekte. In diesen Beispielen werden PEG-Urikasen beschrieben, die hergestellt wurden, indem aktivierte (d.h. elektrophile) PEG-Derivate unterschiedlicher Größe und Zusammensetzung mit natürlich vorkommenden Schweine-, Pilz- oder Bakterien-Urikasen oder mit chimärischen rekombinanten Sojabohnen-, Schweine- oder Schweine-Pavian-Urikasen gekoppelt wurden. Ebenfalls aufgeführt sind die Ergebnisse zu Aktivität, Löslichkeit, Stabilität, Pharmakokinetik, Pharmakodynamik sowie die Ergebnisse immunologischer Untersuchungen. Die Daten der 8–11 belegen, dass die PEG-modifizierte PBC-Urikase dieser Erfindung in der Lage ist, Hyperurikämien und Hyperurikosurien zu korrigieren und im Säugetiermodell, in dem Hyperurikämie und Hyperurikosurie eine schwerwiegende Schädigung der Nieren auslösten, die Struktur und Funktion der Niere zu erhalten (Wu, X, et al., (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 742–746). Diese Beispiele bieten Personen mit durchschnittlichen Fachkenntnissen eine Richtlinie zur Herstellung von im Wesentlichen nicht immunogenen Urikase-Konjugaten, die mindestens ca. 75% der urikolytischen Aktivität des nicht modifizierten Enzyms beibehalten.
  • BEISPIEL 1
  • Reinigung der tetrameren Form der Urikase
  • Die tetramere Form der Urikase (Molekulargewicht ca. 140 kDa) wurde mittels präparativer Größenausschluss- oder Ionenaustauschchromatographie und anschließender analytischer Größenausschlusschromatographie aus einer Schweineleber-Urikase-Lösung gereinigt. Die Schweineleber-Urikase wurde über Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, Katalognr. U2350 oder U3377 bzw. über Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA, bezogen.
  • Die präparative und analytische Größenausschlusschromatographie wurden bei einem pH-Wert von 10–10,5, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 10,2, in einem 0,1 M Natriumkarbonat-Puffer durchgeführt, der 0,1 M NaCl in Superdex-200-Säulen enthielt, die zuvor mit Proteinen bekannten Molekulargewichts kalibriert worden waren. Superdex wurde über Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA, bezogen. Es kann jeder Puffer verwendet werden, bei dem der gewünschte pH-Wert erhalten bleibt und der mit den bei der anschließenden PEG-Kopplung eingesetzten Chemikalien kompatibel ist. Derartige Puffer sind der Fachwelt wohl bekannt. Die Ultraviolett-Absorption des Eluats in der präparativen Säule wurde bei 280 nm überwacht; die urikasehaltigen Anteile des Eluats, die dem Molekulargewicht der gewünschten tetrameren Form entsprachen, jedoch frei von Substanzen mit einem höheren Molekulargewicht waren, wurden für die Synthetisierung von im Wesentlichen nicht immunogener PEG-Urikase gesammelt, wie in Beispiel 2 beschrieben. Alternativ dazu können tetramere Formen der Urikase auch isoliert werden, indem andere Trennmittel, wie z.B. Superose 12 (Amersham Pharmacia) oder jedes beliebige andere Medium, das mit leicht alkalischen Lösungen kompatibel ist und das über ein ausreichend breites Spektrum der Größenfraktionierung verfügt, verwendet werden. Derartige Medien sind leicht verfügbar und in der Fachwelt wohl bekannt.
  • Die Ionenaustauschchromatographie wurde bei einem pH-Wert von 10 bis 10,5, vorzugsweise einem pH-Wert von 10,2 in Mono-Q-Säulen (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) durchgeführt, die zuvor mit einem 0,1 M Natriumkarbonatpuffer kalibriert worden waren. Es kann bei einer ausreichend niedrigen Ionenkonzentration, die die Absorption der Urikase in der Säule gewährleistet, jeder Puffer verwendet werden, der mit den bei der PEG-Kopplung verwendeten Chemikalien kompatibel ist und bei dem der gewünschte pH-Wert erhalten bleibt. Derartige Puffer sind in der Fachwelt wohl bekannt. Die Ultraviolett-Absorption des Eluats wurde während der Elution der Urikase bei 280 nm durch das Ionenaustauscherharz kontrolliert, indem die Ionenkonzentration der verwendeten Pufferlösung erhöht wurde, z.B. um einen linearen Gradienten von 0–0,5 M NaCl im Natriumkarbonatpuffer. Anschließend wurden mittels Größenausschluss-HPLC diejenigen Fraktionen des Eluats bestimmt, die die gewünschte Form der Urikase enthielten und in denen keine Aggregate nachweisbar waren, um diese bei der Synthetisierung von im Wesentlichen nicht immunogener PEG-Urikase zu verwenden. Alternativ dazu kann die tetramere Form der Urikase auch isoliert werden, indem ein anderer Ionenaustauscher, wie z.B. Q-Sepharose (Amersham Pharmacia), oder ein beliebiges anderes Medium, das mit leicht alkalischen Lösungen kompatibel ist, verwendet wird. Derartige Medien sind leicht verfügbar und in der Fachwelt wohl bekannt.
  • Die Urikase-Aktivität wurde anhand einer modifizierten Standardmethode getestet (siehe z.B. Fridovich (1965); Nishimura, et al., (1979)). Dazu wurden täglich frische Harnsäurelösungen in einem 50 mM Natriumborat-Puffer (pH-Wert 9,2) hergestellt, um eine endgültige Konzentrationen der Probe von 6–150 μM zu erreichen. Die Urikase-Zubereitungen wurden in diesem Boratpuffer, der Serumalbumin vom Rind (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Katalognr. A-7030) enthielt, gelöst, so dass die endgültige Albuminkonzentration der Probe 0,1 mg/mL betrug. Nachdem verschiedene Lösungen des Enzyms in einem Mikroplattenleser in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit dem Substrat gemischt wurden, wurde die Rate der Zersetzung der Harnsäure bei 25°C über einen Zeitraum von drei Minuten alle vier Sekunden bei 292 nm beobachtet. Bei Proben, bei denen innerhalb von drei Minuten zwischen 10% und 40% des Substrats verbraucht wurden, wurden mindestens 20 Datenpunkte herangezogen, um die maximale Rate der Verringerung der Absorption pro Minute zu berechnen. Eine internationale Einheit (I.E.) der Urikase-Aktivität wird definiert als die Menge des Enzyms, die ein Mikromol Harnsäure pro Minute verbraucht; die spezifische Aktivität wird in I.E./mg Protein ausgedrückt. Einige der Daten zur relativen Urikase-Aktivität in den 1A bis 5B wurden mittels 100 μM Harnsäure der Probe errechnet. Andere Ergebnisse zur Geschwindigkeit bei 100 μM Harnsäure (V100) wurden mit den Werten der Michaelis-Konstante (KM) und der maximalen Geschwindigkeit (Vmax) für die jeweiligen Enzymzubereitung anhand folgender Formel berechnet: V100 = 100 × Vmax/(KM + 100)wobei KM in Mikromol-Einheiten ausgedrückt wird.
  • BEISPIEL 2
  • PEG-Kopplung an tetramere Schweine-Urikase
  • Einer Lösung tetramerer Urikase in 0,1 M Natriumkarbonat-Puffer (pH-Wert 10,2) wurden 10–200 Mol eines aktivierten Derivats des MonomethoxyPEG, z.B. 4-Nitrophenyl-Karbonat (NPC-PEG), in unterschiedlichen Größen (5 kDa bis 30 kDa) für jedes Mol einer Urikase-Untereinheit (Molekulargewicht 35 kDa) hinzugefügt. Diese und andere ausreichend aktivierte PEG können über Shearwater Polymers bezogen werden. Hinweise zur Kopplung dieser PEG mit Proteinen finden sich im Katalog von Shearwater Polymers, im Internet unter www.swpolymers.com, und bei JM Harns, et al., (Eds.) (1997) Poly(ethylene glvcol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Washington, DC: American Chemical Society. Die Kopplungsreaktion durfte dabei bei 0–8°C ablaufen, bis die PEG-Kopplung sich mit der Zeit nicht mehr signifikant veränderte. Anschließend wurde PEG, das nicht reagiert hatte, mittels Chromatographie und/oder Ultrafiltrierung aus dem Reaktionsprodukt entfernt.
  • Die Anzahl der pro Urikase-Untereinheit gekoppelten PEG-Ketten wurde anhand einer Adaption derjenigen Methoden bestimmt, die bei Kunitani, M, et al., (1991) J Chromatogr 588: 125–137; Saifer, et al., (1997) und Sherman, et al., (1997) beschrieben sind. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Aliquote der PEGylierungsreaktions-Mischungen oder Fraktionen der präparativen Ionenaustausch- oder Größenausschlusssäulen mittels analytischer Größenausschluss-HPLC in einer TSK 5.000 PWXL Säule bei Zimmertemperatur in 10 mM Natriumkarbonatpuffer (pH-Wert 10,2), der 0,1 M NaCl enthielt, charakterisiert wurden. Die HPLC-Säule wurde über TosoHaas, Montgomeryville, PA, USA, bezogen. Proteine und PEG wurden mittels Ultraviolett-Absorption und Detektoren des Lichtbrechungsindex überwacht. Die in dem Konjugat enthaltende Proteinmenge wurde anhand der zum entsprechenden nicht modifizierten Urikase-Standard relativen Ultraviolett-Absorption errechnet. Die PEG-Menge des Konjugats wurde anschließend anhand des Bereichs des Lichtbrechungsindex-Spitzenwerts errechnet, korrigiert um den Beitrag der Proteine zum Lichtbrechungsindex und relativ zum Bereich des Lichtbrechungsindex-Spitzenwertes des entsprechenden PEG Standards.
  • 2A zeigt die Aktivitätsretention durch PEGylierie Schweineleber-Urikase als eine Funktion der Anzahl der pro Urikase-Untereinheit gekoppelten PEG-Ketten. Die Daten der Erfinder der vorliegenden Erfindung (π, ☐) wurden mit denen von Chen et al. (1981) verglichen. Der durch einen großen Kreis markierte Datenpunkt bezieht sich auf ein Konjugat, das von Chen et al. (1981) als nicht immunreaktiv beschrieben worden ist. Wie aus 2A hervorgeht, behielten die Konjugate tetramerer Schweine-Urikase mit bis zu 6 Ketten bzw. 30 kDa pro Untereinheit oder bis zu 7 Ketten bzw. 5 kDa PEG pro Untereinheit mindestens 75% der Aktivität des nicht modifizierten Enzyms bei. Der offensichtliche Anstieg der spezifischen Aktivität, der mit einer Erhöhung der Anzahl der Ketten der 5 kDa PEG oder 30 kDa PEG (bis zu 4 Ketten pro Untereinheit) einher geht, spiegelt möglicherweise die gegenüber den Konjugaten relative Unlöslichkeit oder Instabilität des nicht modifizierten Enzyms wieder. Wie aus 2B hervorgeht, weisen Konjugate der Schweine-Urikase mit durchschnittlich mehr als 3 30 kDa PEG-Ketten pro Untereinheit mehr PEG-Masse auf als die Masse, die nach Chen et al. (1981) erforderlich ist, um eine Immunreaktivität auszuschließen.
  • BEISPIEL 3
  • Eigenschaften von PEG-Konjugaten tetramerer rekombinanter PBC-Urikase
  • Die cDNA chimärischer rekombinanter Schweine-Pavian-Urikase (PBC) wurde im pET3d-Expressionsvektor (Novagen, Madison, WI) subkloniert, die resultierende Plasmidkonstruktion anschließend in einen Escherichia coli-Stamm (BL21(DE3)pLysS (Novagen)) eingebracht und in diesem exprimiert. Bei diesem Vorgehen wurden Methoden eingesetzt, die in der Fachwelt wohl bekannt sind (siehe Erlich (1989); Sambrook, et al., (1989); Ausubel, F, et al., (Eds.), (1997) Short Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons).
  • 6 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz der PBC-Urikase (Aminosäuren 1–225 der SEQ ID NR: 1 und Aminosäuren 226–304 der SEQ ID NR: 2), verglichen mit der Schweine-Sequenz (SEQ ID NR: 1) und der Pavian-Sequenz (SEQ ID NR: 2). Reste der Paviansequenz, die sich von Resten der Schweine-Sequenz unterscheiden, sind gedruckt. Sowohl Schweine-Sequenz als auch Pavian-Sequenz wurden zuerst von Wu et al. (1989) beschrieben und deren Ergebnisse von den Erfindern der vorliegenden Erfindung bestätigt. SEQ ID NR. 1 ist identisch mit Akzessionsnummer p16164 der GenBank, mit Ausnahme des Fehlens des ursprünglichen Methionylrestes der GenBank-Sequenz. SEQ ID NR. 2 ist identisch mit der Akzessionsnummer p25689 der GenBank, mit Ausnahme des Fehlens des ursprünglichen Methionylrestes und der Substitution von Histidin durch Threonin bei Rest 153 in der GenBank-Sequenz (Rest 154 in 6).
  • Die tetramere Form der PBC-Urikase wurde isoliert und, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, mit PEG unterschiedlichen Molekulargewichts gekoppelt. Konjugate, die aus 5 kDa, 10 kDa, 19 kDa oder 30 kDa PEG hergestellt wurden, enthielten bis 10 PEG-Ketten pro Untereinheit. Diejenigen Konjugate, die mit PEG von mindestens 10 kDa hergestellt wurden, behielten mehr als 95% der ursprünglichen spezifischen Aktivität der rekombinanten Urikase bei (3A bis 3B).
  • Die folgenden Eigenschaften eines Konjugats tetramerer PBC-Urikase mit ungefähr 6 10-kDa-PEG-Ketten pro Untereinheit werden in den angegebenen Abbildungen dargestellt: die fehlende Immunogenität (7) und die Wirksamkeit bei Mäusen mit Urikasemangel hinsichtlich 1) der Korrektur der Hyperurikämie und Hyperurikosurie (8); 2) der Verringerung des Schweregrades eines Urinkonzentrationsdefekts (9), und 3) der Verringerung des Schweregrades eines nephrogenen Diabetes insipidus (10). Zusätzlich verringerte diese PEG-Urikase den Schweregrad einer harnsäurebedingten Nierenschädigung, wie magnetischresonanzmikroskopisch dargestellt (11).
  • 7 zeigt die Aktivität der PBC-Urikase im Mausserum jeweils 24 Stunden nach jedes von vier bzw. fünf intraperitonealen PEG-Urikase-Injektionen, verglichen mit dem Wert 24 Stunden nach der Erstinjektion. Die PEG-Konjugate wurden aus drei verschiedenen PBC-Urikase-Zubereitungen hergestellt, wobei zur PEG-Aktivierung zwei unterschiedliche Methoden verwendet wurden. Ein Präparat (•) wurde an (uox –/–) Mäusen mit Urikasemangel getestet, die beiden anderen Präparate (Δ,
    Figure 00300001
    ) wurden bei normalen BALB/c-Mäusen getestet. Das am stärksten immunreaktive Präparat wurde aus gereinigter PBC-Urikase hergestellt, die eine unbekannte Menge Urikaseaggregate enthielt, die an durchschnittlich 7 5 kDa PEG-Ketten pro Untereinheit gekoppelt waren, wobei ein Succinimidylcarbonatderivat des PEG (SC-PEG) verwendet wurde (Zalipsky, US-Patent Nr. 5.612.460, das an dieser Stelle in Form eines Literaturhinweises einbezogen wird). Das mäßig immunreaktive Präparat (
    Figure 00300002
    ) wurde hergestellt, indem eine PBC-Urikase-Zubereitung, die 11% Aggregate enthielt, mit durchschnittlich 2 19 kDa PEG-Ketten pro Untereinheit gekoppelt wurde, wobei ein 4-Nitrophenylcarbonat-Derivat des PEG (NPC-PEG) verwendet wurde (Shennan, et al., (1997)). Das am wenigsten immunreaktive Konjugat (•) wurde hergestellt, indem durchschnittlich 6 10 kDa NPC-PEG-Ketten pro Untereinheit mit einer PBC-Urikase-Zubereitung gekoppelt wurden, die < 5% Urikaseaggregate enthielt.
  • 8 zeigt die inverse Relation zwischen der Harnsäurekonzentration im Serum und im Urin und der Aktivität von PEG-Urikase-Injektionen im Serum einer (uox –/–) Maus mit Urikasemangel. Injektionen zum Zeitpunkt Null und nach 72 Stunden enthielten 0,43 I.E. PBC-Urikase, die zu durchschnittlich 6 10 kDa PEG-Ketten pro Enzymuntereinheit konjugiert war.
  • 9 zeigt, dass eine Behandlung mit PEG-modifizierter PBC-Urikase bei Mäusen mit Urikasemangel den Schweregrad eines Urinkonzentrationsdefekts verringert. Die mittlere und Standardabweichung der Daten zur Urinosmolalität sind für zwei Mäuse angegeben, die jeweils eine Kopie des normalen murinen Urikase-Gens (uox +/–) tragen, sowie für sechs nicht behandelte homozygote (uox –/–) Mäuse mit Urikasemangel und für sechs homozygote Mäuse mit Urikasemangel, denen zwischen dem dritten dem 72. Lebenstag zehnmal entweder 95 oder 190 mI.E. PEG-Urikase injiziert wurden. Mäuse jedes genetischen Hintergrunds haben vor der Gewinnung der Urinproben entweder Wasser ad libitum (schwarze Balken) erhalten, oder ihnen wurde für einen Zeitraum von 12 Stunden Wasser entzogen (schraffierte Balken).
  • 10 zeigt, dass eine Behandlung mit PEG-modifizierter PBC-Urikase bei Mäusen mit Urikasemangel den Schweregrad eines nephrogenen Diabetes insipidus, wie er durch einen abnorm hohen Wasserkonsum und eine abnorm hohe Urinausscheidung charakterisiert ist, verringerte. Die genetischen Hintergründe der Mäuse und das Behandlungsprotokoll waren die gleichen wie in 9. Die mittlere und Standardabweichung des täglichen Wasserkonsums (schwarze Balken) und der Urinausscheidung (schraffierte Balken) sind für drei Gruppen von sechs Mäusen angegeben.
  • 11 zeigt, dass eine Behandlung mit PEG-modifizierter PBC-Urikase bei Mäusen mit Urikasemangel den Schweregrad einer uratinduzierten Nephropathie in der magnetresonanzmikroskopischen Darstellung verringerte. Die genetischen Hintergründe der drei Gruppen von Mäusen und das Behandlungsprotokoll waren die gleichen wie in 9 und 10. Die magnetresonanzmikroskopische Untersuchung wurde vom Center for in vivo Microscopy, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, USA, durchgeführt.
  • Zusätzlich zu den in 8–11 zusammengefassten Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass sich der Harnsäurespiegel im Urin bei allen Mäusen mit Urikasemangel nach einer Behandlung mit PEG-modifizierter PBC-Urikase deutlich verringerte. Schließlich zeigt 12, dass im Gegensatz zur PEG-modifizierten tetrameren Form der PBC-Urikase die oktamere Form (Molekulargewicht = 280 kDa) selbst nach extensiver PEGylierung bei Mäusen eine Immunogenität zeigt. Diese Eigenschaft spiegelt sich in einer beschleunigten Ausscheidung des PEG-modifizierten Oktamers innerhalb von 5 Tagen nach einer intraperitonealen Einzelinjektion wieder. Den selben Mäusen wurde an Tag 8 und Tag 15 erneut die gleiche Dosis der gleichen PEG-Urikase-Zubereitung injiziert. 24 Stunden nach den zweiten und dritten Injektionen war in den Seren der Mäuse, denen ein PEGyliertes Oktamer injiziert worden war, keine urikolytische Aktivität nachweisbar, dagegen aber in den Seren der Mäuse, denen ein PEGyliertes Tetramer injiziert worden war. Diese Ergebnisse, sowie das beschleunigte Ausscheiden des PEGylierten Oktamers, wie es nach der ersten Injektion beobachtet wurde (12), unterstreichen, dass es sinnvoll ist, alle Formen der Urikase, die höher sind als die tetramere Form, vor der PEGylierung des Enzyms zu entfernen.
  • BEISPIEL 4
  • PEG-Konjugation von Candida-utilis-Urikase
  • Candida-utilis-Urikase wurde entweder über Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA; Katalognr. U1878) oder über die Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ, USA; Katalognr. URYW) bezogen. Nach den in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde die tetramere Form isoliert und PEG-Konjugate mit 5 kDa PEG, 10 kDa PEG oder 30 kDa PEG synthetisiert (1A–1B). 1A zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter Candida-utilis-Urikase als eine Funktion der Anzahl der pro Untereinheit gekoppelten PEG-Ketten. Die Daten der Erfinder der vorliegenden Erfindung (π, •, ☐) wurden mit den Daten von Nishimura, et al., (1979); Nishimura, et al., (1981); Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1981); Tsuji, et al., (1985); Yasuda, et al., (1990), und Fujita, et al., (1991), verglichen. Die durch einen großen Kreis markierten Datenpunkte beziehen sich auf Konjugate, die von Nishimura, et al., (1979 oder 1981), als nicht antigen bzw. von Chen, et al., (1981), als nicht immunreaktiv beschrieben worden sind.
  • 1B zeigt die Aktivitätsretention bei PEGylierter Candida-utilis-Urikase als eine Funktion des Gesamtgewichts der pro Untereinheit gekoppelten PEG-Moleküle. Die Daten der Erfinder der vorliegenden Erfindung (π, •, ☐) wurden mit den gleichen Daten verglichen wie in 1A. Die Datenpunkte, die durch einen großen Kreis markiert sind, haben die gleiche Bedeutung wie in 1A.
  • Wie in 1A und 1B gezeigt, behielten Konjugate mit durchschnittlich bis zu 6 5 kDa PEG-Ketten bzw. 30 kDa PEG-Ketten oder 9 10-kDa PEG-Ketten pro Untereinheit mindestens 75% der Aktivität des nicht modifizierten Enzyms bei. Der offensichtliche Anstieg der spezifischen Aktivität, der mit einer größeren Zahl der gekoppelten 30-kDa PEG-Ketten einher geht (bis zu 5 oder 6 Ketten pro Untereinheit), spiegelt möglicherweise die gegenüber den Konjugaten relative Unlöslichkeit oder Instabilität des nicht modifizierten Enzyms wieder.
  • BEISPIEL 5
  • PEG-Konjugation von Aspergillus-flavus-Urikase
  • Aspergillus-flavus-Urikase wurde über Sanofi Winthrop (Gentilly Cédex, Frankreich) bezogen. Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurden Konjugate von PEG unterschiedlicher Molekulargewichte synthetisiert (4A–4B). Konjugate, die durch eine Kopplung von aus A. flavus isoliertem Enzym mit durchschnittlich bis zu 12 5-kDa PEG-Ketten oder bis zu 7 30-kDa PEG-Ketten pro Untereinheit hergestellt wurden, behielten mindestens 75% der ursprünglichen spezifischen Aktivität dieser Pilz-Urikase bei.
  • BEISPIEL 6
  • PEG-Konjugation von Sojabohnen-Urikase
  • Rekombinante Urikase, die aus der Wurzelknolle der Sojabohne (auch als Nodulin 35 bezeichnet) gewonnen wurde, wurde wie bei Kahn und Tipton (Kahn, K, et al., (1997) Biochemistry 36: 4731–4738) beschrieben zubereitet, gereinigt und über Dr. Tipton (University of Missouri, Columbia, MO, USA) bezogen. Nach den in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde die tetramere Form isoliert und Konjugate von PEG mit unterschiedlichem Molekulargewicht zubereitet (5A–5B). In Gegensatz zu Candida-utilis-Urikase (1A), Schweine-Urikase (2A), chimärischer Schweine-Pavian-Urikase (3A) und Aspergillus-flavus-Urikase (4A), tolerierte das Sojabohnen-Enzym lediglich eine Kopplung von ca. 2 5-kDa PEG-Ketten bzw. 30-kDa PEG-Ketten pro Untereinheit, wenn mindestens 75% der ursprünglichen urikolytischen Aktivität beibehalten werden sollte.
  • BEISPIEL 7
  • PEG-Konjugation von Arthrobacter-globiformis-Urikase
  • Arthrobacter-globiformis-Urikase wurde über Sigma-Aldrich (Katalognr. U7128) bezogen (siehe japanisches Patent Nr. 9-154581). Nach den in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde die tetramere Form isoliert und Konjugate mit 5 kDa PEG und 30 kDa PEG zubereitet. Während Konjugate mit durchschnittlich mehr als 3 5-kDa PEG-Ketten pro Untereinheit weniger als 60% der ursprünglichen spezifischen Aktivität beibehielten, behielten Konjugate mit durchschnittlich ca. 2 30-kDa PEG-Ketten pro Untereinheit mindestens 85% der ursprünglichen spezifischen Aktivität.
  • BEISPIEL 8
  • PEG-Konjugation von Schweine-Urikase und PBC-Urikase, die am Aminoende trunkiert sind
  • Rekombinante Schweine-Urikase und PBC-Urikase, bei denen die ersten sechs Aminosäuren am Aminoende entfernt wurden, werden nach den in Beispiel 3 beschriebenen Standardverfahren in E. coli exprimiert und von diesen gereinigt. Nach den in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Verfahren werden PEG-Konjugate der am Aminoende trunkierten Urikasen synthetisiert, um im Wesentlichen nicht immunogene Konjugate herzustellen, die mindestens 75% der ursprünglichen spezifischen Aktivität beibehalten.
  • BEISPIEL 9
  • PEG-Konjugation von Schweine-Urikase und PBC-Urikase, die entweder am Carboxylende oder sowohl am Aminoende als auch am Carboxylende trunkiert sind
  • Rekombinante Schweine-Urikase und PBC-Urikase, bei denen die letzten drei Aminosäuren am Carboxylende entfernt wurden, werden nach den in Beispiel 3 beschriebenen Standardverfahren in E. coli exprimiert und von diesen gereinigt. Diese Entfernung der Aminosäuren am Carboxylende kann die Löslichkeit des nicht modifizierten Enzyms erhöhen, da das peroxisomale Zielsignal entfernt wurde (siehe Miura, et al., (1994)). Nach den in Beispiel 1 und Beispiel 2 beschriebenen Verfahren werden PEG-Konjugate der am Carboxylende trunkierten Urikasen synthetisiert, um im Wesentlichen nicht immunogene Konjugate herzustellen, die mindestens 75% der ursprünglichen spezifischen Aktivität beibehalten. 6 zeigt die Sequenz der rekombinanten PBC-Urikase, die am Aminoende um sechs Reste und am Carboxylende um drei Reste trunkiert wurde (PBC-NT-CT). Diese Urikase wird, wie in den Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben, exprimiert, gereinigt und PEGyliert, um im Wesentlichen nicht immunogene Konjugate herzustellen, die mindestens 75% der ursprünglichen spezifischen Aktivität beibehalten.
  • BEISPIEL 10
  • PEG-Konjugation einer Schweine-Urikase-Mutation, die eine erhöhte Anzahl von PEG-Bindungsstellen aufweist
  • Rekombinante Schweine-Urikasen werden wie in Beispiel 3 beschrieben zubereitet, wobei die potenzielle Anzahl von PEG-Bindungsstellen erhöht wird, indem ein oder mehrere Argininreste durch Lysin ersetzt werden (siehe Hershfield, MS, et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 7185–7189). 6 zeigt beispielhaft die Aminosäuresequenz einer derartigen Mutation (PKS-Urikase), bei der Arginin bei Rest 291 durch Lysin und Threonin bei Rest 301 durch Serin ersetzt wird. Nach den in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Verfahren wird PEG zu dieser Urikase konjugiert, um im Wesentlichen nicht immunogene Konjugate herzustellen, die mindestens 75% der ursprünglichen spezifischen Aktivität der rekombinanten Urikase beibehalten.
  • BEISPIEL 11
  • PEG-Konjugation einer rekombinanten Pavian-Urikase-Mutation
  • Nach einem Standardverfahren der Molekularbiologie wird, wie in Beispiel 3 beschrieben, rekombinante Pavian-Urikase konstruiert, wobei in Position 97 eine Aminosäure substituiert wurde (Histidin durch Tyrosin) (siehe Pavian-Sequenz in 6). Nach den in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Verfahren werden PEG-Konjugate der tetrameren Form der rekombinanten Pavian-Urikase-Mutation synthetisiert, um Konjugate mit einer wesentlich herabgesetzten Immunogenität herzustellen, die mindestens 75% der ursprünglichen spezifischen Aktivität der rekombinanten Urikase beibehalten.
  • BEISPIEL 12
  • Immunogenität der aus Candida utilis, Aspergillus flavus und Arthrobacter globiformis gewonnenen PEG-Konjugate
  • Die Urikase wird jeweils nach den in Beispielen 4, 5 und 7 beschriebenen Verfahren aus Candida utilis, Aspergillus flavus und Arthrobacter globiformis gewonnen. Nach den in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Verfahren werden PEG Konjugate mit 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa oder 30 kDa PEG synthetisiert. Die Immunogenität dieser Konjugate ist wesentlich verringert oder ganz ausgeschaltet.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001

Claims (40)

  1. Urikase-Konjugat, das zumindest ungefähr 75% der urikolytischen Aktivität der unkonjugierten Urikase beibehält und im Wesentlichen nicht immunogen ist, das eine gereinigte Urikase mit Untereinheiten umfasst, wobei jede Untereinheit der Urikase kovalent an durchschnittlich 2 bis 10 PEG-Stränge gebunden ist, wobei jedes PEG-Molekül ein Molekulargewicht zwischen 10 kDa und 100 kDa aufweist.
  2. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Urikase Säugetier-Urikase ist.
  3. Konjugat nach Anspruch 2, wobei die Urikase Schweineleber-, Rinderleber- oder Schafleber-Urikase ist.
  4. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Urikase rekombinant ist.
  5. Konjugat nach Anspruch 4, wobei die Urikase im Wesentlichen die Sequenz von Schweine-, Rinder-, Schaf- oder Pavian-Leberurikase aufweist.
  6. Konjugat nach Anspruch 4, wobei die Urikase chimär ist.
  7. Konjugat nach Anspruch 6, wobei die chimäre Urikase Anteile von Schweineleber- und Pavianleber-Urikase enthält.
  8. Konjugat nach Anspruch 7, wobei die chimäre Urikase PBC-Urikase ist.
  9. Konjugat nach Anspruch 7, wobei die chimäre Urikase PKS-Urikase ist.
  10. Konjugat nach Anspruch 4, wobei die Urikase im Wesentlichen die Sequenz von Pavianleber-Urikase aufweist, bei der Tyrosin 97 durch Histidin ersetzt wurde.
  11. Konjugat nach Anspruch 4, wobei die Urikase einen Amino-Terminus und einen Carboxy-Terminus umfasst, und wobei die Urikase an einem oder beiden Termini trunkiert ist.
  12. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Urikase eine Pilz- oder mikrobieller Urikase ist.
  13. Konjugat nach Anspruch 12, wobei die Pilz- oder mikrobielle Urikase aus Aspergillus flavus, Arthrobacter globiförmis oder Candida utilis isoliert wird oder ein rekombinantes Enzym ist, das im Wesentlichen die Sequenz einer dieser Urikasen aufweist.
  14. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Urikase eine Urikase von Wirbellosen ist.
  15. Konjugat nach Anspruch 14, wobei die Urikase von Wirbellosen aus Drosophila melanogaster oder Drosphila pseudoobscura isoliert ist oder ein rekombinates Enzym ist, das im Wesentlichen die Sequenz einer dieser Urikasen aufweist.
  16. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Urikase eine Pflanzenurikase ist.
  17. Konjugat nach Anspruch 16, wobei die Pflanzenurikase aus Wurzelknoten von Glycine max isoliert oder ein rekombinantes Enzym ist, das im Wesentlichen die Sequenz dieser Urikase aufweist.
  18. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das PEG ein mittleres Molekulargewicht zwischen 10 kDa und 60 kDa aufweist.
  19. Konjugat nach Anspruch 18, wobei das PEG ein mittleres Molekulargewicht zwischen 20 kDa und 40 kDa aufweist.
  20. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die durchschnittliche Anzahl kovalent gebundener PEG-Stränge 3 bis 8 Stränge pro Urikase Untereinheit beträgt.
  21. Konjugat nach Anspruch 20, wobei die durchschnittliche Anzahl kovalent gebundener PEG-Stränge 4 bis 6 Stränge pro Urikase Untereinheit beträgt.
  22. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die Urikase tetramer ist.
  23. Konjugat nach Anspruch 1, wobei die PEG-Stränge kovalent an Urikase über Bindungen gekoppelt sind, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Urethan-Bindungen, sekundären Amin-Bindungen und Amid-Bindungen besteht.
  24. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das PEG linear ist.
  25. Konjugat nach Anspruch 1, wobei das PEG verzweigt ist.
  26. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Senkung der Harnsäurespiegel in einer Körperflüssigkeit oder Gewebe, die das Konjugat nach Anspruch 1 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
  27. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei die Zusammensetzung durch Lyophilisation stabilisiert wird und sich rasch nach Wiederherstellung auflöst, um Lösungen bereit zu stellen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind.
  28. Verwendung einer wirksamen Harnsäure senkenden Menge an PEG-Urikase zur Herstellung eines Medikamentes zur Senkung erhöhter Harnsäurespiegel in einer Körperflüssigkeit oder Gewebe eines Säugetiers, wobei die PEG-Urikase eine gereinigte Urikase umfasst, die zumindest zwei Untereinheiten umfasst, bei der jede Untereinheit kovalent an durchschnittlich zwei bis 10 PEG-Stränge gebunden sind, wobei jedes PEG-Molekül ein Molekulargewicht von zwischen 10 kDa und 100 kDa aufweist.
  29. Verwendung nach Anspruch 28, wobei das Säugetier ein Mensch ist.
  30. Verwendung nach Anspruch 28, wobei die erhöhten Harnsäurespiegel mit einem Zustand assoziiert sind, ausgewählt aus der Gruppe, der aus Gicht, Tophus, Niereninsuffizienz, Organtransplantation und einer malignen Erkrankung besteht.
  31. Verwendung nach Anspruch 28, wobei das PEG linear ist.
  32. Verwendung nach Anspruch 28, wobei das PEG verzweigt ist.
  33. Verfahren zur Herstellung eines Urikase-Konjugats, das die folgenden Schritte umfasst: Aufbringen einer Urikaselösung, die tetramere Urikase und Unkaseaggregate umfasst, auf zumindest eine Trennsäule bei einem pH zwischen ungefähr 9 und 10,5; Gewinnen einer oder mehrerer Fraktionen aus der Säule, die isolierte tetramere Urikase enthält, wobei die ein oder mehreren Fraktionen im Wesentlichen frei von Aggregaten aus tetramerer Urikase sind und; PEGylierung der tetrameren Urikase zur Gewinnung des Konjugats von Anspruch 1.
  34. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Lösung der Urikase auf die Säule bei einem pH von 10,2 aufgebracht wird.
  35. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Auftrennung auf einer Eigenschaft basiert, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Ionenaustausch und Größenausschluss besteht.
  36. Verfahren nach Anspruch 33, das weiterhin den Schritt umfasst, die Fraktionen zu analysieren, um zumindest eine Eigenschaft zu bestimmen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus dem Vorhandensein der tetrameren Urikase und der Abwesenheit von Aggregaten der tetrameren Urikase besteht.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei der Analyseschritt zumindest eine Analyse umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Chromatographie, Zentrifugation, Lichtstreuung und Elektrophorese besteht.
  38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die Chromatographie eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die isolierte tetramere Urikase weniger als ungefähr 10% Urikase-Aggregate enthält.
  40. Isolierte tetramere Urikase, die durch das Verfahren von Anspruch 33 erzeugt wurde.
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