CN105412942B - 聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种治疗由人体内血尿酸升高而引起的各种疾病的聚乙二醇化重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂，其特征在于由以下成分组成：为活性成分的聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶、在冷冻或冻干过程种保持蛋白活性和稳定的的冻干保护剂、填充剂、酸碱调节剂和维持一定pH值条件的缓冲液。其特点是保持聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干后完整的空间构型和生物学活性，不仅有利于药物的保存，而且有利于药物在短时间内重溶并且复性。

Description

聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂

技术领域

本发明涉及新的生物制品冻干制剂、制备方法及在相关治疗领域的应用，具体地说，本发明涉及给予由人体内血尿酸升高而引起的各种疾病的聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂。

背景技术

尿酸是鸟类、爬行类和包括人在内的灵长类动物体内嘌呤代谢的终产物，因为在这些动物体内缺乏以分子氧为受体催化尿酸进一步分解为尿囊素、二氧化碳和双氧水的尿酸氧化酶。尿酸作为人体嘌呤代谢的终产物经肾脏排泄，当尿酸生成超过肾脏代谢时，例如富嘌呤食物摄入过多以及白血病和淋巴瘤及其化疗过程所引起的嘌呤代谢增加或者当肾脏处理病理状态时使正常产生的尿酸排泄受阻，这两种状况都会造成血浆尿酸显著升高，形成高尿酸血症。由于尿素及其盐类在血液中的低溶解度和易沉积性就使得高尿酸血症会引发或加剧很多疾病，例如：持续高尿酸血症时尿酸结晶沉积在外周关节、滑膜引起的急性炎症和疼痛是痛风的主要病因；尿酸不仅可以刺激血管平滑肌细胞增殖，而且还导致内皮细胞功能障碍；血浆高尿酸也是动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素；尿酸沉积在肾脏组织，是引发急性肾衰、肾小管损伤、IgA肾炎的主要原因。

降尿酸的经典方案是用别嘌呤醇等黄嘌呤氧化酶抑制剂类药物降低尿酸生成，或用丙磺舒、苯溴马龙等药物促进尿酸排泄。黄嘌呤的水溶性低于尿酸，其积累有潜在的危险，黄嘌呤氧化酶抑制剂在初始尿酸浓度太高时疗效很差，还能引发超敏综合征，表现为发热、毒性上皮细胞坏死溶解、肝炎和嗜酸细胞增高，死亡率达20％，另外这类药和丙磺舒、苯溴马龙等促尿酸排泄类药都有明显肝肾毒性。因此，经典的降尿酸治疗策略不够安全而且疗效也不够理想。尿囊素的优良水溶性和肾脏对尿囊素的高效排泄能力使尿酸氧化酶成为治疗高尿酸血症及其继发症的理想药物：临床研究表明尿酸氧化酶可快速高效降低血清尿酸，且几乎没有毒副作用；在治疗肿瘤裂解综合征时，尿酸氧化酶比别嘌呤醇更安全有效；用于治疗痛风，能快速分解关节处沉积的尿酸从而消除引发的炎症和皮肤损伤。

尿酸氧化酶是一种新型的降尿酸药物，它以促进尿酸分解为药物特征。其中一种重组黄曲霉尿酸氧化酶(商品名：拉布立酶)被欧美批准用于临床预防治疗肿瘤溶解综合征。但是尿酸氧化酶又是一种外源蛋白，直接或重复使用易引发抗体降低疗效，而且易过敏，需静脉注射，仅适于短期使用以降低尿酸(如使用拉布立酶治疗时间不能超过一个月)。所以对于长期治疗，显然需要长效且无免疫原性的尿酸氧化酶制剂，聚乙二醇化重组尿酸氧化酶能够解决应用天然酶时遇到的这些问题。

本发明申请人制备的聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶是从产朊假丝酵母中提取基因组DNA，通过PCR扩增，设计特定的引物，从产朊假丝酵母基因组中分离尿酸氧化酶基因，并将其插入到大肠杆菌表达质粒中，得到重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶转化子，再将重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶转化子转化入大肠杆菌中，得到可高效表达尿酸氧化酶的大肠杆菌工程菌株。再经过发酵培养，收获表达重组重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶的菌体，在经过菌体裂解、柱层析纯化得到纯化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶(详见发明专利ZL02819387.3)。纯化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶经特定的聚乙二醇修饰，修饰后经超滤或柱层析方法进一步纯化，得到聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶。

众所周知早期的对尿酸氧化酶的聚乙二醇修饰会引起尿酸氧化酶蛋白特异性活性的大大降低，仅能保持修饰前蛋白的30％-50％的活力。本发明选用的PEG连接基团修饰后不影尿酸氧化酶特异性的酶活力。

根据本发明申请人对聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶的研究发现，将其制作成水针注射剂，在存放的过程中连接上的PEG会有少量脱落现象，其稳定性会受到很大影响，因此为延长效期，将其制作成新型的冻干粉针注射剂。

聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶由于本身结构的复杂性，其冷冻干燥的三个阶段(低温效应、冻结效应和脱水效应)都可能导致活性的下降或丧失。聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶在降温与复温的过程中会发生变性。在冻结的过程中，由于产生大量的冰水界面，聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶会吸附在界面上，从而破坏天然的褶皱结构，导致变性。冻结过程中由于溶液pH的变化导致聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶活性的下降，例如使用简单的磷酸盐缓冲液作为冻干缓冲液，在冷冻过程中，NaH₂PO₄的溶解度远远大于Na₂HPO₄，随着Na₂HPO₄的析出，最终导致溶液pH值的巨大改变。在脱水过程中，由于之前聚乙二醇化重组尿酸氧化酶与水溶液充分的水合作用，使其表面吸附了一单层水，即水合层，脱水过程将去除一部分结合水，使得富含结合水的聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶暴露在乏水的环境中，致使将质子转化为带电羧酸基团，破坏其电荷的平衡，电荷密度的降低促进了聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶分子之间的疏水作用，使其发生聚集。并且在完成冷冻干燥后，在储存的过程中，也会发生聚集、脱酰胺、氧化、水解等作用。因此为使聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶在冷冻干燥和储存的过程中，活性的损失达到最小，冷冻干燥工艺的开发和制剂配方的筛选尤为重要。

发明内容

定义：PEG，聚乙二醇；SS，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯；SCM，琥珀酰亚胺基羧甲基酯。

“聚乙二醇”或“PEG”指环氧乙烷缩聚物和水的混合物，可以是直链或带有支链。由通式H(OCH₂ CH₂)_nOH表示，其中n至少为4，“聚乙二醇”或“PEG”与数字后缀结合表示其大约的重均分子量。例如PEG-5K指总重均分子量为5000的聚乙二醇。

通常修饰用的聚乙二醇的两个醇羟基的一端用甲氧基封闭，另一端结合上连接基团。例如一端甲氧基封闭，另一端连接基团为琥珀酰亚胺基琥珀酸酯的聚乙二醇，缩写为mSS-PEG。化学结构式如下：

本发明的目的是提供一种能保持尿酸氧化酶活性并降低其免疫原性的聚乙二醇修饰方法，以及一种储存稳定并能在短时间内重溶并且复性的聚乙二醇化的尿酸氧化酶冻干注射剂及其冷冻干燥工艺。所述冻干注射剂用于治疗由人体内血尿酸升高而引起的各种疾病。

由于产朊假丝酵母尿酸氧化酶的结构与其他蛋白相比非常特殊，其由同源四聚体组成，四聚体间以作用力轻微的氢键和疏水键做为主要结构作用力，因此四聚体在稍剧烈的条件下就解聚成单体，同时尿酸氧化酶必须在完整的四聚体结构下才拥有活性，在单体的条件下活性完全丧失，而在八聚体及多聚体条件下免疫原性会增强，由于尿酸氧化酶蛋白本身稳定性较差，纯化的尿酸氧化酶蛋白非常容易进一步聚合成多聚体，使得尿酸氧化酶蛋白本身的成药性差。而聚乙二醇修饰后的尿酸氧化酶稳定性明显提高，因此对尿酸氧化酶进行聚乙二醇修饰即可保持其酶的活性，还能降低其免疫原性，大大增加了其成药性。聚乙二醇修饰反应的评价指标主要为尿酸氧化酶蛋白的活性的保持及免疫原性的降低。用于修饰反应的聚乙二醇的分子量可选5K-40K，其中最优选为20K。在本发明的一些实施例中检测不同分子量的聚乙二醇修饰后的产物活性及免疫原性。实验数据显示分子量为20K的修饰产物在保持酶活力及降低免疫原性两方面均有明显的优势。

在冻干制剂配方和冻干工艺研究中，保持酶的活性是重要的评价指标，同时关注冻干后样品的外观，水分残留和复溶情况。因此冻干制剂的配方非常复杂，即如下：

(1)0.5～15mg/ml聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶(以下简称聚乙二醇化重组尿酸氧化酶)；

(2)50～200mM注射用缓冲液，pH值范围5.5～8.0；

(3)0.5～3％(体积/体积百分比)填充剂。

本发明所述冻干注射剂为多位点聚乙二醇修饰，修饰后的尿酸氧化酶蛋白粘度明显增加，因此聚乙二醇化重组尿酸氧化酶蛋白在制剂处方中的浓度对冻干后样品的外观，水分残留和复溶后的澄明度均有影响，本发明优选其蛋白含量为3～10mg/ml。

本发明所述聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶中聚乙二醇的连接基团为琥珀酰亚胺基琥珀酸脂和/或琥珀酰亚胺基羧甲基酯。

本发明注射缓冲液优选组氨酸和/或磷酸盐缓冲液，其浓度范围优选为50～150mM，pH值范围优选为6.0～8.0。

因为蛋白质具有两性电解质的性质，既能与酸作用，又能与碱作用。当溶液在某个特定的pH值时，蛋白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，蛋白质不显电性，这时溶液的pH值称为该蛋白的等电点。蛋白质在等电点的环境下最不稳定。然而在极端pH的环境下，高静电荷引起强烈的分子内电推斥力，会导致蛋白质分子的展开。由于在蛋白质溶液的冻结过程中，溶液的浓度逐渐提高。在高浓度时可能会改变溶液的pH值，严重情况下会导致蛋白质变性，从而直接使得蛋白质活性丧失，因此在蛋白质的冻干配方中，缓冲液的选择非常重要。

填充剂主要包括甘露醇和/或山梨醇，其可以防止聚乙二醇化重组尿酸氧化酶随水蒸汽一起升华逸散，同时在慢速冻结时会结晶，从而为聚乙二醇化重组尿酸氧化酶提供支撑结构，并使聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冷冻干燥成型；其浓度范围优选为体积百分比1.0～2.5％。

其中填充剂优选甘露醇，甘露醇在无菌溶液中非常稳定，不易被空气氧化。在聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冷冻干燥过程中，甘露醇作为填充剂，是因为在慢速冻结时会结晶，从而为聚乙二醇化重组尿酸氧化酶提供支撑结构；同时甘露醇也不会与活性组分发生反应。

冻干注射剂含量成分中还可加入冻干保护剂和/或酸碱调节剂，冻干保护剂主要包括蔗糖和/或海藻糖，其在冷冻和干燥的过程中，可以防止聚乙二醇化重组尿酸氧化酶发生变性；其浓度范围优选为0～100mg/ml；

酸碱调节剂主要包括乙二胺四醋酸二钠(EDTA)，其可以在聚乙二醇化重组尿酸氧化酶的冷冻干燥过程和储存过程中，将pH值调整到其活性最稳定的区域；其浓度范围优选为体积百分比0～0.2％；

其中冻干保护剂中的，我们优选低聚糖作为保护剂，尤其是二糖作为保护剂，因为二糖在冻结的过程中起到低温保护剂的功能；并且又能在干燥脱水过程中起到脱水保护剂的作用。二糖分为还原型二糖和非还原型二糖，其中还原型二糖包括乳糖、麦芽糖等，非还原型二糖包括海藻糖和蔗糖等。在冷冻干燥的过程中，无论是还原型二糖和非还原型二糖都具有很好的保护效果，但在冷冻干燥的储存过程中，由于还原型二糖的存在使得冻干品发生Maillard反应(蛋白褐变反应)，最终导致冻干品发生变质。所以我们在冷冻干燥的配方中优选海藻糖和蔗糖作为保护剂。其中海藻糖是一种天然的糖类，由于其为非还原性糖，非常稳定，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣条件下在蛋白表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而保持蛋白活性。

本发明所述冻干注射剂，其给药途径为皮下注射、皮下输液、肌肉注射、静脉注射或静脉输液。

附图说明

图1不同分子量的聚乙二醇化重组尿酸氧化酶SDS-PAGE图。

(其中，1.重组假丝酵母尿酸氧化酶蛋白，2.重组假丝酵母尿酸氧化酶-PEG-5K，3.重组假丝酵母尿酸氧化酶-PEG-5K，4.重组假丝酵母尿酸氧化酶-PEG-20K，5.重组假丝酵母尿酸氧化酶-PEG-30K，6.低分子量Marker，7.高分子量Marker)

图2重组尿酸氧化酶的等电点检测图谱。

图3三种不同聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冻干配方的DSC分析。

图4三种不同聚乙二醇化重组尿酸氧化酶复溶后含量检测(SEC-HPLC法)。

图5三种不同聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冻干配方的外观检测(从左到右分别是配方1、2、11所对应的样品，有些样品有缺口的原因是在冻干的过程中放入了探针)。

图6三种不同聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冻干配方复溶后的外观检测(其中配方1对应的样品复溶后略有浑浊，配方2对应的样品复溶后澄清)。

图7四种新的聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冻干配方复溶后的外观检测。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明做进一步说明，但下述的实例仅是本发明其中的例子，并不代表本发明所限定的权利范围。

实施例1

不同分子量的聚乙二醇修饰产物对酶活力影响

选择聚乙二醇连接基团为琥珀酰亚胺基琥珀酸脂，缩写为mSS-PEG。选择分子量分别为5K，20K，30K的mSS-PEG对纯化的重组尿酸氧化酶蛋白进行修饰，修饰反应的pH控制在7.5-8.0，缓冲体系为100mM磷酸盐缓冲液，重组尿酸氧化酶蛋白与mSS-PEG的反应摩尔比为1：30，室温静置反应120min。反应结束后用截留分子量为30KD的超滤离心管进行超滤离心换液10次，得到纯化的不同分子量的聚乙二醇化重组尿酸氧化酶(图1)。用酶动力法检测修饰前及不同分子量聚乙二醇修饰后产物的酶活力见表1。

表1酶动力法检测尿酸氧化酶活力

结果显示与重组假丝酵母尿酸氧化酶相比，PEG-5K和PEG-30K的修饰产物酶活力均有不同程度的降低，但都在可接受的范围内，而PEG-20K的修饰产物酶活力基本保持不变。

实施例2

不同分子量的聚乙二醇修饰产物免疫原性实验

SPF小鼠70只。随机分3组，每组20只,另外10只采空白血清作为空白对照。采用皮下注射给药方式，3组小鼠分别给予重组假丝酵母尿酸氧化酶、重组假丝酵母尿酸氧化酶-PEG-5K、重组假丝酵母尿酸氧化酶-PEG-20K，给药剂量1.54mg/kg，每周给药2次，连续给药5周。给药前对10只空白小鼠采血作为空白对照；第6周、第8周对每只小鼠采血，用ELISA法检测血清中抗-尿酸氧化酶抗体浓度。每次采血体积不少于250ul。实验结果见表2。

表2 ELIAS法检测血清抗尿酸氧化酶抗体滴度

实验结果显示小鼠聚注射聚乙二醇修饰的重组尿酸氧化酶与未修饰的重组尿酸氧化酶相比血清中抗重组尿酸氧化酶抗体滴度低9-23倍，分子量20K的修饰产物免疫原性要明显低于5K的产物。

实施例3

检测聚乙二醇化重组尿酸氧化酶的等电点，选择制剂配方合适的pH值范围。

毛细管等电聚焦是获得蛋白实际等电点的比较理想的方法，因此使用毛细管等电聚焦的方法检测聚乙二醇化重组尿酸氧化酶的等电点。由于重组尿酸氧化酶经过聚乙二醇化后，聚乙二醇对等电的检测干扰非常严重，因此只能检测重组尿素酶的等电点，检测结果见图2。通过图2的结果分析出重组尿酸氧化酶的等电点在7.3左右，由于重组尿酸氧化酶与聚乙二醇的结合位点主要为赖氨酸，该氨基酸为碱性氨基酸，因此重组尿酸氧化酶与聚乙二醇结合后，等电点向酸性偏移，因此根据聚乙二醇与重组尿酸氧化酶的结合数量，我们预估聚乙二醇化重组尿酸氧化酶的等电点大约为6.5左右。因此根据该结果设计该产品的溶剂pH值，pH值的范围为pH5.5-8.0。

通过设计以下不同pH值的8个配方进行实验，每个配方中加入15mg/ml聚乙二醇化重组尿酸氧化酶，检测冷冻复融后和冷冻干燥复溶后聚乙二醇化重组尿酸氧化酶是否发生聚沉和活性的改变。

配方1：100mM组氨酸缓冲液pH5.5

配方2：100mM组氨酸缓冲液pH6

配方3：100mM组氨酸缓冲液pH6.5

配方4：100mM磷酸盐缓冲液pH6

配方5：100mM磷酸盐缓冲液pH6.5

配方6：100mM磷酸盐缓冲液pH7

配方7：100mM磷酸盐缓冲液pH7.5

配方8：100mM磷酸盐缓冲液pH8

每个配方准备2瓶，每瓶加入1.5ml样品，然后将8个配方的样品直接放入-70℃冰箱中16个小时，每个配方取出1瓶在室温的条件下静置1小时自然融化，用肉眼观察每个配方复溶后样品与没有进行冷冻的样品进行比较，没有发现肉眼可见的变化。对复融后的8个样品和没有冷冻的样品进行活性的检测，活性检测的范围在120～140IU/ml之间，pH5.5的配方活性结果略有升高。通过该实验证明制剂配方在pH5.5～8.0之间，样品经过冷冻复融，不会影响样品质量，因此聚乙二醇化重组尿酸氧化酶制剂的配方的pH值设置在5.5～8.0之间，更优选的pH值范围在6.0-8.0之间。

将冷冻后样品进行冻干，冻干后样品的的水份控制在10％以下，将每瓶样品用1.5ml去离子水进行复溶，用肉眼观察复溶后样品和没有冷冻的样品，观察到冻干复溶后样品都出现轻微的混浊，对复溶后样品和没有冷冻的样品进行活性检测，冻干复溶后样品的活性在40～60IU/ml之间，比没有冷冻的样品都发生了显著性的降低。因此聚乙二醇化重组尿酸氧化酶制剂在冷冻干燥前没有加入冻干保护剂，填充剂或酸碱调节剂的条件下，都会对样品质量产生影响。

实施例4

选择制剂配方合适的缓冲液浓度范围。

通过设计不同缓冲液浓度的11个配方进行实验，每个配方中加入10mg/ml聚乙二醇化重组尿酸氧化酶，检测冷冻复融后聚乙二醇化重组尿酸氧化酶是否发生聚沉和活性的改变。

配方1：25mM组氨酸缓冲液pH5.5

配方2：50mM组氨酸缓冲液pH5.5

配方3：50mM组氨酸缓冲液pH6

配方4：200mM组氨酸缓冲液pH6.5

配方5：250mM组氨酸缓冲液pH6.5

配方6：25mM磷酸盐缓冲液pH6.5

配方7：50mM磷酸盐缓冲液pH6.5

配方8：50mM磷酸盐缓冲液pH7

配方9：200mM磷酸盐缓冲液pH7.5

配方10：250mM磷酸盐缓冲液pH7.5

配方11：250mM磷酸盐缓冲液pH8

每个配方配置1瓶，每瓶加入1.5ml样品，然后将11个配方的样品直接放入-70℃冰箱中16个小时，每个配方取出1瓶在室温的条件下静置1小时自然融化，用肉眼观察每个配方复溶后样品与没有进行冷冻的样品进行比较，发现配方5，10和11发生了肉眼可见的轻微混浊。对复融后的11个样品和没有冷冻的样品进行活性的检测，发现配方1，5，6，10和11在冷冻前后发生显著的活性变化，通过该实验得出，由于聚乙二醇化重组尿酸氧化酶产品本身的特性，过低的缓冲液浓度无法对冷冻样品提供有效的保护，过高的的缓冲液浓度在冷冻的过程中会影响样品的活性，因此聚乙二醇化重组尿酸氧化酶制剂合理的缓冲液浓度范围在50～200mM之间，而不同于其他的蛋白类生物制品，50mM以下的缓冲液浓度即可以符合要求。

对配方2、3、4、7、8、9、11的样品进行冷冻复溶后活性检测，活性检测的范围在110-130IU/ml之间，其中4号配方略有降低，但都在可允许的范围内。因此我们更优选的缓冲液浓度为50～150mM之间。

实施例5

测定不同配方的坍塌温度，从而确定在不同配方下都适用的冻干工艺。

制剂中加入不同浓度的聚乙二醇化重组尿酸氧化酶，缓冲液，冻干保护剂，填充剂和酸碱调节剂会对冻干工艺中参数的设置产生重要的影响，从而影响聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冻干后的产品质量，通过对不同配方的坍塌温度的检测，找到冻干工艺中关键的指标控制参数，将冻干工艺对产品质量的影响控制在最小的情况下，进而合理的评价不同制剂配方对聚乙二醇化重组尿酸氧化酶的适用性。

通过设计不同缓冲液浓度的11个配方进行实验，每个配方中加入10mg/ml聚乙二醇化重组尿酸氧化酶，测定不同配方的坍塌温度。

配方如下：

配方1：200mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)

配方2：200mM磷酸盐缓冲液+3％甘露醇(pH7.0)

配方3：200mM磷酸盐缓冲液+5％山梨醇(pH7.0)

配方4：200mM磷酸盐缓冲液+3％山梨醇+0.2％EDTA(pH7.0)

配方5：200mM磷酸盐缓冲液+10％蔗糖+3％山梨醇+0.2％EDTA(pH7.0)

配方6：200mM磷酸盐缓冲液+10％海藻糖+3％山梨醇+0.2％EDTA(pH7.0)

配方7：200mM组氨酸缓冲液+3％甘露醇(pH7.0)

配方8：200mM组氨酸缓冲液+5％山梨醇(pH7.0)

配方9：200mM组氨酸缓冲液+3％山梨醇+0.2％EDTA(pH7.0)

配方10：200mM磷酸盐缓冲液+10％蔗糖+3％山梨醇+0.2％EDTA(pH7.0)

配方11：200mM磷酸盐缓冲液+10％海藻糖+3％山梨醇+0.2％EDTA(pH7.0)

在测定样品在不同配方中的坍塌温度的时候，我们在配方中尽可能加入高浓度的缓冲液，冻干保护剂，填充剂和酸碱调节剂。这样我们可以评价不同组分的增加会对坍塌问题会有怎么样的影响，在冷冻干燥的工艺建立的过程中，需要评价产品的坍塌温度，在一次干燥的搁板温度必须低于配方的坍塌温度。如果高于坍塌温度，冷冻干燥后的样品将失去松散结构，这样会损失冻干后样品的活性和并延长复性时间。冷冻干燥样品的坍塌温度是通过差示扫描量热仪(DSC)进行热分析，将样品从20℃冷却到-60℃，然后以5℃/min升温到20℃。热分析的结果见图3a～c，配方1的热分析结果显示在-24℃的时候基线向上偏移，这个温度该配方下聚乙二醇化重组尿酸氧化酶的坍塌温度。配方2和7的坍塌温度分别为-21℃和-19℃。其他配方的塌陷温度都有明显的上升，总体上都低于-10℃。基于以上信息，我们可以推断在配方中加入低于以上浓度的缓冲液，冻干保护剂，填充剂或酸碱调节剂，聚乙二醇化重组尿酸氧化酶的坍塌温度都将高于-24℃以上。适合所有配方的冷冻干燥工艺需要将冻干机的搁板的初始温度设置为-30℃，此温度低于所有配方的塌陷温度。

实施例6

根据实施例3的检测结果，设置冷冻干燥工艺。

设计配方，根据实施例3中得到的坍陷温度，对不同配方以预设冷冻干燥工艺进行冷冻干燥，每个配方中加入8mg/ml聚乙二醇化重组尿酸氧化酶，所有配方都使用1ml的装量。

配方1：100mM磷酸盐缓冲液(pH7.5)

配方2：100mM磷酸盐缓冲液+2％甘露醇(pH7.0)

配方3：150mM磷酸盐缓冲液+3％甘露醇(pH8.0)

配方4：200mM磷酸盐缓冲液+5％山梨醇(pH7.0)

配方5：100mM磷酸盐缓冲液+2％甘露醇+0.1％EDTA(pH7.0)

配方6：150mM磷酸盐缓冲液+3％蔗糖+2％山梨醇+0.1％EDTA(pH7.5)

配方7：100mM磷酸盐缓冲液+10％海藻糖+3％山梨醇+0.05％EDTA(pH8.0)

配方8：50mM磷酸盐缓冲液+0.01％海藻糖+2％甘露醇+0.005％EDTA(pH7.0)

配方9：100mM磷酸盐缓冲液+1％海藻糖+2％甘露醇(pH7.5)

配方10：50mM磷酸盐缓冲液+2％海藻糖(pH7.0)

配方11：100mM组氨酸缓冲液+2％甘露醇(pH5.5)

配方12：200mM组氨酸缓冲液+2％山梨醇(pH6.0)

配方13：100mM组氨酸缓冲液+0.5％山梨醇+0.1％EDTA(pH6.5)

配方14：150mM组氨酸缓冲液+0.1％蔗糖+2％甘露醇+0.05％EDTA(pH6.0)

配方15：150mM组氨酸缓冲液+10％蔗糖+2％甘露醇+0.05％EDTA(pH6.0)

配方16：150mM组氨酸缓冲液+10％海藻糖+3％甘露醇+0.05％EDTA(pH6.0)

配方17：200mM组氨酸缓冲液+0.01％海藻糖+0.5％甘露醇+0.005％EDTA(pH6.0)

配方18：50mM组氨酸缓冲液+1％海藻糖+2％甘露醇(pH6.0)

配方19：50mM组氨酸缓冲液+3％海藻糖(pH6.5)。

实施例7：

根据实施例6的配方，设计冻干工艺。

将实施例6中的样品放入冻干机的冷冻托盘后，直接放入-70℃冰箱中16个小时。将冻干机打开，设置冷阱温度为-80℃，当温度探头的温度显示为-70℃时，将样品从-70℃冰箱中取出，放入冻干机中进行冷冻。样品冷冻3小时后，开始升温进行一次干燥，分别设置为-50℃，-30℃和-10℃，然后升温进行二次干燥5℃。冻干过程详见下表。

表3冷冻干燥工艺参数设置

实施例8

实施例6不同配方的聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冷冻干燥后产品质量研究

不同配方的冷冻干燥样品用1ml注射用水进行复溶，复溶后对产品质量进行评价：外观、纯度、酶活性、游离PEG水平。不同配方冷冻干燥后聚乙二醇化重组尿酸氧化酶检测数据见下表。

所有配方复溶后使用SEC-HPLC方法对样品纯度进行检测都合格，没有产生新的杂质(图4)。除配方5以外，其余所有配方的样品冷冻干燥后都为白色海绵状松软固体(图5)，并且水分含量都低于2.5％。配方5样品冻干后固体略微有些收缩，并脱离瓶底，我们认为配方5中的甘露醇浓度有些过高，影响了冻干后样品的外观。配方1，10和19复溶后略有混浊(图6)，同时活性都有较明显的下降，含有甘露醇配方的样品复溶1min内都变成澄明液体(图7)，甘露醇的加入对冻干后样品的复溶的澄清度和酶活性的保持都是有利的。

表4研究结果

与冻干前相比游离PEG都有微小的增加，复溶后酶活性与冻干前一致。

从以上数据看出甘露醇的加入对复溶液的澄清度和酶活性的保持是有利的。

实施例9

四种新配方冻干后产品质量研究

每个配方中选取2瓶用1.7ml注射用水复溶，并评价外观和聚乙二醇尿酸氧化酶的活性、聚乙二醇尿酸氧化酶(SEC-HPLC法)和游离PEG水平。用光密度法(350nm)检测复溶样品的聚体含量。

所有配方冷冻干燥后样品都为白色海绵状松软固体，所有复溶后的样品与对照品相比都略有混浊(例如：未冻干样品)见图7，冻干前样品的光密度(350nm)为0.013，复溶后样品的光密度增加至0.08～0.09。根据美国药典要求，复溶后样品要用光学粒径仪检测样品的粒径分布，参见美国药典的小体积注射药物。

表5研究结果

注：美国药典规定小体积注射剂每剂要求6000颗粒≥10μm和600颗粒≥25μm

聚乙二醇化重组尿酸氧化酶复溶后的质量研究结果如下，复溶后产品为等渗溶液，其渗透压标准为274-334mOsm/kg，除1瓶(配方：聚乙二醇化重组尿酸氧化酶pH8)以外，其余各配方中游离PEG每瓶的含量低于1mg/ml。

表6研究结果

注：每个配方的1号瓶在分析酶活和游离聚乙二醇前都在-70℃条件下保存。

实施例10

不同浓度的聚乙二醇化重组尿酸氧化酶冻干后产品质量研究

采用处方2分别配制含聚乙二醇化重组尿酸氧化酶2mg、5mg、10mg、15mg、20mg、30mg的制剂，采用实施例7的冻干工艺进行冻干，对冻干后的产品进行水份检测及外观评价，分别用1ml注射用水进行复溶，考察其复溶时间及澄明度，实验结果见下表。

表7实验结果

处方中聚乙二醇化重组尿酸氧化酶浓度大于15mg/ml时，冻干后产品的水分及外观均不合格，复溶时间长且澄明度不佳。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂，其特征在于，由下述含量成份组成：

(1)3～10mg/ml聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶，其中聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶中聚乙二醇的连接基团为琥珀酰亚胺基琥珀酸脂和/或琥珀酰亚胺基羧甲基酯，选用的聚乙二醇的分子量为5-40kD；

(2)50～200mM注射用缓冲液，所述注射用缓冲液为组氨酸和/或磷酸盐缓冲液，pH值范围5.5～8.0；

(3)1.0～2.5％填充剂，该百分比为体积/体积百分比，所述填充剂选自甘露醇和/或山梨醇。

2.按照权利要求1所述聚乙二醇化的重组产朊假丝酵母尿酸氧化酶冻干注射剂，其特征在于：注射用缓冲液的pH值范围为pH6.0～8.0。

3.一种权利要求1所述冻干注射剂的应用，其特征在于：用于制备治疗由人体内血尿酸升高而引起的各种疾病的药物。