CN101302501A

CN101302501A - 聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其制备方法和其制剂及应用

Info

Publication number: CN101302501A
Application number: CNA2007100685066A
Authority: CN
Inventors: 刘国安; 杨忠; 刘全海; 吴学军; 刘珉宇; 来庆勤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2007-05-10
Filing date: 2007-05-10
Publication date: 2008-11-12
Anticipated expiration: 2027-05-10
Also published as: CN101302501B

Abstract

本发明涉及聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其制备方法和其制剂及应用，尤其涉及一种具有极低免疫原性和过敏性、能够多次重复用药，具有长效作用的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其制备方法和其制剂及应用。本发明采用对尿酸氧化酶的N末端选择性高的修饰方法，即聚乙二醇活性酯和尿酸氧化酶的N末端通过共价键方式连接，使产物的均一性得到大大提高，容易纯化，纯化产物的活性能够较好地保留，而且能显著性地降低尿酸氧化酶原型蛋白的免疫原性，防止用药过程中发生全身性过敏反应，并且能够多次重复用药，具有治疗与预防痛风、降低血尿酸水平、预防肿瘤溶解综合征和改善肾脏功能等功效。

Description

聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其制备方法和其制剂及应用

技术领域

本发明涉及聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其制备方法和其制剂及应用，尤其涉及一种具有极低免疫原性和过敏性、能够多次重复用药，具有长效作用的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物及其制备方法和其制剂及应用。

背景技术

尿酸氧化酶(尿酸氧化还原酶，EC 1.7.3.3，Urate Oxidase，Uricase)参与生物体嘌呤代谢过程。嘌呤是机体内重要的生物活性分子，嘌呤核苷酸分解产生的产物黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下产生尿酸，尿酸可进一步分解为尿囊素、尿囊酸、CO₂和NH₃。尿酸氧化酶将尿酸氧化为尿囊素。人类和一些灵长类动物体内缺乏有活性的尿酸氧化酶，因此尿酸是人类和这些动物嘌呤代谢的最终产物。尿酸溶解度较低，经尿酸氧化酶的作用后成为溶解度更高的尿囊素，使核酸代谢产物更容易排出体外。

血浆尿酸饱和度：37℃，pH7.4时为380～420μmol/L(6.4～7.1mg/dL)，正常男性成人24小时尿尿酸总量小于600mg。由于尿酸产生增加或排除减少，血尿酸水平会升高。血液中尿酸浓度升高超过正常值时就是高尿酸血症，一般定义为血液中尿酸含量超过420μmol/L(7.0mg/dL)。产生高尿酸血症的原因包括体内嘌呤或尿酸较多，或是由食物摄取到的嘌呤太多，肾脏排泄的尿酸减少等三项。如果血液和尿液中尿酸浓度持续升高出现高尿酸血症，常导致疾病发生。

随着生活水平的不断提高，高尿酸血症和痛风发病率明显增高。流行病学的调查显示，国外至上世纪90年代，英国痛风患者20年间增加了3倍，1990至1999年间美国痛风患者增加80％，加拿大30岁以上男性和50岁以上女性痛风发病率已达2％，80岁以上男性达9％。我国痛风发病率为0.3％，现有400多万痛风患者，每年有200多万急性发作，近100万人痛风致残。积极控制高尿酸血症和痛风危险因素是减少痛风发作的关键，也是降低心血管疾病危险的重要环节之一。

目前痛风治疗主要使用痛风炎症干扰药物和降尿酸化学药，代表性药物有秋水仙碱、非甾体抗炎药、肾上腺皮质激素、尿酸促排药、抑制尿酸生成药。秋水仙碱具有缓解痛风炎症的特异性，通常是小剂量多次口服用药，但该药有严重的胃肠道反应。其它抗炎药也都起到改善症状的作用，但副作用都很大。丙磺舒、苯磺唑酮、痛风利仙是常用的促尿酸排泄药物，别嘌呤醇抑制尿酸的形成，这些药都需要服用较长时间来维持治疗效果，它们的副作用发生率相同，而以别嘌呤醇最严重，常发生别嘌呤过敏综合症达10％，这些患者死亡率达25％。新近开发的新型黄嘌呤氧化酶抑制剂Febuxostat作用强于别嘌呤醇，但需要常年用药，在一项临床试验中，用药4年，有三分之二的患者痛风石消失。

国外已开发了重组尿酸氧化酶产品(Rasburicase)，由法国Sanofi-Synthelabo公司研制成功，欧盟及美国FDA先后于2001年和2002年批准重组尿酸氧化酶上市，在美国商品名是Elitek^TM，在其他国家商品名为Fasturtec^TM。国外上市的重组尿酸氧化酶为冻干粉针剂，有1.5mg/支和7.5mg/支两个规格，用溶媒溶解后浓度1.5mg/ml。国外上市的重组尿酸氧化酶批准的临床适应症为：用于预防和治疗儿童白血病、淋巴癌和恶性实体瘤治疗中可能发生的肿瘤溶解综合征导致的高尿酸血症。该产品主要的副作用是发生免疫反应产生抗体和发生过敏反应，其次是半衰期短。对于痛风患者，无法长期用药。

聚乙二醇(Polyethlene glycol，PEG)是一种无毒、无免疫原性的水溶性高分子物质，可以通过共价键结合方式修饰蛋白质。蛋白质的聚乙二醇化修饰是克服蛋白质免疫原性的一种有效方法，聚乙二醇修饰蛋白质药物不仅可以降低免疫原性和毒性、而且能明显提高蛋白质药物的稳定性，减少蛋白质分子通过肾脏的排泄，延长体内半衰期。PEG修饰后的蛋白质因体内半衰期延长，可减少用药次数，增加治疗的有效性。

聚乙二醇修饰蛋白质技术已广泛应用于生物医药领域，讫今PEG修饰蛋白质和其它化合物至少有四十余种。FDA已批准的PEG化产品有：聚乙二醇化腺苷脱氨酶、聚乙二醇化天冬酰胺酶、聚乙二醇化干扰素、聚乙二醇化粒细胞集落刺激因子等。

专利号为CN1264575C和CN1288243C采用第一代PEG修饰技术修饰尿酸氧化酶。由于第一代PEG是与尿酸氧化酶蛋白质分子中赖氨酸残基中游离的氨基结合，因此所得到的修饰产物均一性差，该专利得到的修饰产物为每个蛋白分子结合多个PEG分子的混合物，难以分离纯化。

发明内容

为了解决上述的PEG修饰尿酸氧化酶修饰产物均一性差、难以分离纯化的技术缺陷，本发明的一个目的是一种修饰产物均一性好，有利于工业化生产、且具有极低的免疫原性和全身过敏反应性，能多次重复使用聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物。

本发明的另外一个目的是提供上述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，该方法适合工业化生产。

本发明的另外一个目的是提供上述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的医药制剂。

本发明还有一个目的是提供上述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物在制药中的用途。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，由聚乙二醇和尿酸氧化酶以共价键连接，其特征在于：所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物由尿酸氧化酶的N末端通过共价键连接聚乙二醇构成。

作为优选，上述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物由一个聚乙二醇分子通过共价键连接一个尿酸氧化酶分子亚基构成。

作为优选，上述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇。作为再优选，所述的单甲氧基聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇醛中的一种或多种。作为最优选，所述的单甲氧基聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇醛。

作为优选，上述的聚乙二醇分子量为5kDa～70kDa。作为再优选，所述的聚乙二醇分子量为5kDa～40kDa。作为最优选，所述的聚乙二醇分子量为20kDa～40kDa。

作为优选，所述的尿酸氧化酶是天然提取的或通过基因工程技术获得的重组尿酸氧化酶。作为再优选，所述的尿酸氧化酶是从黄曲霉、球形节杆菌或假丝酵母中分离得的真菌或微生物尿酸氧化酶或序列来源于微生物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或者，所述的尿酸氧化酶是从哺乳动物肝提取的尿酸氧化酶或序列来源于哺乳动物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或者，所述的尿酸氧化酶是从果蝇等无脊椎动物分离到的尿酸氧化酶或序列来源于无脊椎动物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或者，所述的尿酸氧化酶是从大豆等植物中分离到的尿酸氧化酶或序列来源于植物的重组尿酸氧化酶及其突变体。

为了实现上述的第二个目的本发明采用了以下的技术方案：

上述的各技术方案中所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，包括以下工艺过程：

(1)配制修饰反应缓冲液，离子强度为10～500mmol/L，pH值为4～7；

(2)尿酸氧化酶与活化聚乙二醇在步骤(1)提供的条件反应8～24小时，反应温度4～25℃；

(3)经步骤(2)反应得到的修饰产物经阳离子交换层析，洗脱收集所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶洗脱峰，经浓缩后凝胶过滤进行分离纯化，收集得到所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶。

作为优选，上述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的重量比例为0.5～20。作为再优选，所述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的重量比例为2～10。

作为优选，上述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的缓冲液的pH值为3～8。作为再优选，所述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的缓冲液的pH值为4～7。

作为优选，上述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的温度为4℃～37℃。作为再优选，所述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的温度为4℃～25℃。

作为优选，上述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的时间为4～48小时。作为再优选，所述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的时间为16～24小时。

作为优选，上述的聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应采用NaCNBH₃作为催化剂。

作为优选，上述的阳离子层析凝胶为SP-Sepharose Fast Flow、CM-SepharoseFast Flow、SP-High Performance或Mono-S。

为了实现上述的第三个目的本发明采用了以下的技术方案：

聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物制剂由上述各技术方案中所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物添加药用辅料和稳定剂后制备成无菌注射液或冻干粉针剂。

为了实现上述的第四个目的本发明采用了以下的技术方案：

上述各技术方案中所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物用于制备治疗和预防痛风、降低血尿酸水平、预防肿瘤溶解综合征或改善肾脏功能药物中的应用。

本发明采用对尿酸氧化酶的N末端选择性高的修饰方法，即聚乙二醇活性酯和尿酸氧化酶的N末端通过共价键方式连接，使产物的均一性得到大大提高，容易纯化，纯化产物的活性能够较好地保留。聚乙二醇化尿酸氧化酶具有极低的全身性过敏反应，在临床中能多次重复用药。

附图说明

图1为不同分子量PEG修饰尿酸氧化酶产物的SDS-PAGE电泳分析，其中，1、2、3、4泳道PEG分子量40kDa，5、6、7、8泳道PEG分子量20kDa。

图2为不同温度PEG修饰尿酸氧化酶产物的SDS-PAGE电泳分析结果，其中，泳道A修饰反应温度4℃，泳道B为15℃，泳道C为25℃，泳道D为37℃。

图3为用药后大鼠血尿酸水平变化的曲线图。

图4为抗体对药效影响的柱型图。

具体实施方式

实施例1

聚乙二醇与尿酸氧化酶的修饰反应

本发明中所述的尿酸氧化酶是从采用基因工程技术获得的重组黄曲霉尿酸氧化酶，纯度大于95％，且保持有较高的酶活性。

将尿酸氧化酶(UOX)溶于pH 6.0、100mM的磷酸盐缓冲液中，按UOX∶mPEG活性酯＝1∶5(w/w)的比例加入溶解后，加入NaCNBH₃使其终浓度为10mM，室温反应24小时。

实施例2

聚乙二醇化尿酸氧化酶药物的分离纯化

将聚乙二醇与尿酸氧化酶的修饰反应得到的产物在AKTA-Primer蛋白质层析系统(Amersham Pharmacia公司产品)上进行制备型阳离子交换层析。阳离子层析凝胶为SP-Sepharose Fast Flow，柱床体积50ml。层析柱用20mM PB，pH8.0的缓冲液平衡至少5个柱床体积使流出液pH与缓冲液pH值相同，平衡后将pH调至8.0的修饰产物以较低的流速(10～20ml/min)上样。上样结束后继续用平衡缓冲液平衡至紫外吸收回到基线，再用0～0.5M的NaCl梯度洗脱，当NaCL浓度为0.2～0.3mol/L时出现的蛋白峰主要是一个聚乙二醇分子连接一个UOX分子的聚乙二醇化尿酸氧化酶，收集该洗脱峰，经过超滤(10KD的MILLPORE膜块)浓缩处理后经S-200凝胶过滤柱分离纯化，柱床体积200ml，平衡缓冲液20mM PB，pH8.0，流速5ml/min，上样后洗脱体积为100～150ml的第二个峰为目标蛋白峰，所得到的聚乙二醇化尿酸氧化酶药物，经SDS-PAGE分析纯度大于95％。

实施例3

聚乙二醇与尿酸氧化酶不同比例修饰反应

将尿酸氧化酶溶于pH 6.0、100mM的磷酸盐缓冲液中，按UOX与mPEG活性酯的比例分别为1∶4(w/w)、1∶5、1∶6.5、1∶8的比例加入溶解后，加入NaCNBH3使其终浓度为10mM，室温反应16～24小时，SDS-PAGE分析修饰产物的比例及酶比活性，结果见下表(未修饰的尿酸氧化酶酶比活性为17.6EAU/mg)。

编号	UOX∶mPEG	修饰比例	酶比活性(EAU/mg)
编号	UOX∶mPEG	修饰比例	酶比活性(EAU/mg)	1	1；4	55％	9.7
2	1∶5	61％	10.2	1	1；4	55％	9.7
2	1∶5	61％	10.2	3	1∶6.5	52％	8.8
4	1∶8	48％	12.4	3	1∶6.5	52％	8.8

实施例4

不同分子量聚乙二醇修饰尿酸氧化酶

将尿酸氧化酶溶于pH 6.0、100mM的磷酸盐缓冲液中，分别用分子量为20kDa和40kDa的活化PEG进行修饰，按UOX∶mPEG活性酯＝1∶5(w/w)的比例加入溶解后，加入NaCNBH₃使其终浓度为10mM，室温反应16小时，SDS-PAGE分析修饰反应的产物，结果见图1。

实施例5

不同温度聚乙二醇修饰尿酸氧化酶

将尿酸氧化酶溶于pH 6.0、100mM的磷酸盐缓冲液中，按UOX∶mPEG活性酯＝1∶5(w/w)的比例加入溶解后，加入NaCNBH₃使其终浓度为10mM，分别在4℃、15℃、25℃、37℃反应16小时，SDS-PAGE分析修饰反应的产物，结果见图2。经扫描，不同温度修饰产物的比例分别39.5％、62.3％、64.6％、49.3％。

实施例6

聚乙二醇化尿酸氧化酶药物的体内药效试验

大鼠按体重随机分为4组，每组5只，分别为空白对照组、模型组、尿酸氧化酶组和PEG尿酸氧化酶组。其中模型组和给药组每天一次，连续灌胃给予造模剂(黄嘌呤和乙胺丁醇或腺嘌呤)进行造模。造模后用药，用药剂量为1.25mg/kg，尾静脉注射给药。每天取血测定血尿酸水平，结果见图3。尿酸氧化酶药效维持时间小于24小时，而PEG尿酸氧化酶一次给药后药效作用可维持144小时。

实施例7

聚乙二醇化尿酸氧化酶药物的免疫原性试验

大鼠给予PEG尿酸氧化酶一个月，剂量1.25mg/kg。取血清后经ELISA试验检测到抗体。分别给予模型动物PEG尿酸氧化酶及PEG尿酸氧化酶和抗体，剂量为0.4mg/kg。给药后取血清分析血尿酸水平，结果见图4，PEG尿酸氧化酶给药引起的抗体没有影响其药效的发挥，可使动物血尿酸水平明显降低。

Claims

1.聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，由聚乙二醇和尿酸氧化酶以共价键连接，其特征在于：所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物由尿酸氧化酶的N末端通过共价键连接聚乙二醇构成。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特征在于：所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物由一个聚乙二醇分子通过共价键连接一个尿酸氧化酶分子亚基构成。

3.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特征在于：所述的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇。

4.根据权利要求3所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特征在于：单甲氧基聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酸基碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇醛中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特征在于：单甲氧基聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇醛。

6.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特征在于：所述的聚乙二醇分子量为5kDa～70kDa。

7.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特征在于：所述的尿酸氧化酶是天然提取的或通过基因工程技术获得的重组尿酸氧化酶。

8.根据权利要求7所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物，其特征在于：尿酸氧化酶是从黄曲霉、球形节杆菌或假丝酵母中分离得的真菌或微生物尿酸氧化酶或序列来源于微生物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或者，尿酸氧化酶是从哺乳动物肝提取的尿酸氧化酶或序列来源于哺乳动物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或者，尿酸氧化酶是从果蝇等无脊椎动物分离到的尿酸氧化酶或序列来源于无脊椎动物的重组尿酸氧化酶及其突变体；或者，尿酸氧化酶是从大豆等植物中分离到的尿酸氧化酶或序列来源于植物的重组尿酸氧化酶及其突变体。

9.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，其特征在于包括以下工艺过程：

(3)经步骤(2)反应得到的修饰产物经阳离子离子交换层析，洗脱收集所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶洗脱峰，经浓缩后凝胶过滤进行分离纯化，收集得到所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶。

10.根据权利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，其特征在于：聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的重量比例为0.5～20。

11.根据权利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，其特征在于：聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的缓冲液的pH值为3～8。

12.根据权利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，其特征在于：聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的温度为4℃～37℃。

13.根据权利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，其特征在于：聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应的时间为4～48小时。

14.根据权利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，其特征在于：聚乙二醇与尿酸氧化酶发生共价结合反应采用NaCNBH₃作为催化剂。

15.根据权利要求9所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物的制备方法，其特征在于：阳离子层析凝胶为SP-Sepharose Fast Flow、CM-Sepharose Fast Flow、SP-High Performance或Mono-S。

16.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物制剂，其特征在于：所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物添加药用辅料和稳定剂后制备成无菌注射液或冻干粉针剂。

17.根据权利要求1或2所述的聚乙二醇化尿酸氧化酶化合物用于制备治疗和预防痛风、降低血尿酸水平、预防肿瘤溶解综合征或改善肾脏功能药物中的应用。