CN102229924A - 聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶及其制备方法和用途，涉及聚合物修饰蛋白酶的技术领域，先在沙雷菌蛋白消解酶的溶液中加入缓冲液，调节pH值后加入活化的聚乙二醇衍生物进行反应，再将反应混合液进行色谱分离，得到聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶。本发明基本了保持沙雷菌蛋白消解酶原有的生物活性，增强其生物稳定性，可抵抗胃蛋白酶的水解作用；同时降低了其免疫原性，药物动力学也因此发生较大的变化，提高生物利用度，更好地满足沙雷菌蛋白消解酶在临床应用方面的需求，其应用特别在治疗心脑血管疾病方面。

Description

聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及聚合物修饰蛋白酶的技术领域，具体涉及用聚乙二醇（PEG）修饰沙雷菌蛋白消解酶的结合物及其制备方法和用途。

背景技术

沙雷菌蛋白消解酶（Serratiopeptidase）是一种能够消解动脉血管内壁硬化斑块的生物活性酶。这种酶为蚕蛾羽化出茧时所用，是蚕幼虫肠道中的共生菌粘质沙雷菌产生。历经全球性三十多年的研究和临床应用，沙雷菌蛋白消解酶的生物医学功效已经得到证实，受到国际医学界的青睐，被用于控制和治疗与动脉血管粥样硬化相关的多种慢性疾病。它能够消解和清除人体内无生命活性的蛋白质、血液凝块、组织囊肿和血管内壁的硬化斑，对人体正常功能无副作用。其突出的有效性还包括：A)阻止诱发疼痛胺的产生；B)减轻炎症，加速肌体组织的复原；C)稀释外伤或炎症产生的液体、抗浮肿、调节液体的疏散和水分滞留，恢复运动造成的组织损伤。 

该酶制剂在欧洲一些国家和日本被用于处方药已有20多年。美国、加拿大等国家对这种天然化合物，将其归类为功能性营养素。近几年来，北美的抗衰老医学和自然医学界大力推荐和使用该酶制剂，用于消炎、止痛和动脉硬化等疾病的治疗[Evaluation of Serratia peptidase in acute or chronic inflammation of otorhinolaryngology pathology: A multicenter, double-blind randomized trial versus placebo. J Int Med Res. 1990(18):379-388]。在该酶制剂的临床研究和应用中，著名的德国内科医生Hans A. Nieper (1928--1998)总结了他长期的临床实践，发现沙雷菌蛋白消解酶治疗心脑血管疾病的明确疗效。心脑血管疾病患者，每日3次、每次5毫克/2片沙雷菌蛋白消解酶，连续12-18个月，大多数患者的动脉血管硬化问题均能逆转。他特别指出：颈动脉或颅动脉血管硬化狭窄是产生脑部缺血和脑中风的重要原因。沙雷菌蛋白消解酶对打通颈部和颅内已经部分阻塞的动脉血管、清除硬化斑块，有显着效果。

    现行防治心脑血管疾病的方法往往着重于降血脂和活血化淤，或暂时性地扩张血管。这些方法虽能程度不等地控制疾病的恶化，却无法清除动脉血管粥样硬化斑块，无助于逆转疾病。沙雷菌蛋白消解酶能够消解人体内无生命活性的蛋白质、血液凝块、组织囊肿和血管内壁的硬化斑，且对人体正常功能无副作用。清除动脉血管内壁的硬化斑块，是恢复血管内壁正常功能的前提和防止血栓阻塞血管的必要条件，也是逆转由动脉血管硬化引起的高血压和心脑血管疾病的根本性措施。同时，沙雷菌蛋白消解酶也能够清除血栓形成因子—血液中的蛋白纤维、纤维蛋白原和血小板被异常激活后形成血栓凝块，有助于血液流通和减少血管阻塞的机会。改善血液循环与防止血栓形成，对于降低心、脑血管疾病急性发作的机会至关重要。对于糖尿病患者来说，清除血液循环障碍，更是减少数种并发症的关键。

    但是对于人体而言，沙雷菌蛋白酶属于异源蛋白，所以在使用过程中具有蛋白质药物所共同的特点，如存在免疫原性，半衰期短，稳定性差等。因此有必要采用蛋白质修饰技术以获得低免疫原性的沙雷菌蛋白酶，从而改善该蛋白酶的药物动力学特性；同时提高该蛋白酶对胃酸的耐受性，增加酶稳定性。

目前，研究人员采用了各种药物传递技术来提高蛋白质药物的疗效，包括采用不同的给药途径（如口服，透皮），不同的载体（如微球，脂质体，单克隆抗体），不同高分子材料（如多糖）和不同的药物释控技术。在对蛋白质药物进行化学修饰的研究领域中，应用最多，成功率最高的是聚乙二醇（PEG）修饰技术。在蛋白质药物的PEG修饰中大多数采用对蛋白质分子中的氨基进行修饰，PEG可以共价链接到蛋白质上与活性位点无关的位点上。最常用方法是利用PEG活化后形成的亲电子基团和蛋白质上的氨基进行反应，反应后可以在一个蛋白质分子上共价链接数个PEG长链，聚合物长链的数目取决于蛋白质分子上自由氨基的数目、修饰试剂的化学特性及反应条件（如反应温度、溶液pH等）[Chemistry for peptide and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Reviews. 2002(54):459-476]。通过这样的修饰，PEG的一些特性就传递给了蛋白质，从而改变其在体内的药代动力学和生理学特性，例如，隐蔽了该酶的抗原表位，降低其免疫原性，降低体内清除率，提高该酶的水溶性，增加酶分子的表观分子量，降低肾脏清除速率，延长体循环时间。PEG化还可以通过提高酶稳定性，增加其抵抗酶解的能力[The therapeutic value of poly(ethylene glycol)-modified proteins. Advanced Drug Delivery Reviews. 1991(6):133-151]。PEG是目前被美国FDA批准的极少数能作为注射药用的合成聚合物之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种采用蛋白质修饰技术以获得低免疫原性的聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白酶。

本发明包括沙雷菌蛋白消解酶，在沙雷菌蛋白消解酶上连接至少一条聚乙二醇或其衍生物链，其结构式如下：

                                                  

其中，

为单甲氧基聚乙二醇（简写为mPEG），分子量为2000～100000Da；

x为1～100的整数；

SP是去除x个氨基的沙雷菌蛋白消解酶分子；

当式中i为1时，j为2～5的整数；当式中i为0时，j为0～5的整数。

本发明的优点在于：沙雷菌蛋白消解酶经过聚乙二醇修饰后可以基本保持沙雷菌蛋白消解酶原有的生物活性，增强其生物稳定性，可抵抗胃蛋白酶的水解作用；同时降低了其免疫原性，药物动力学也因此发生较大的变化，主要表现为吸收延缓，延长了沙雷菌蛋白消解酶的作用时间，提高其生物利用度，更好地满足沙雷菌蛋白消解酶在临床应用方面的需求，其应用特别在治疗心脑血管疾病方面。

本发明所述的沙雷菌蛋白消解酶是天然或重组的，优选从工业发酵生产的Serratia E15中提取。

本发明另一目的在于提供上述聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶的方法：

先在沙雷菌蛋白消解酶的溶液中加入缓冲液，调节pH至5.0～9.5，然后加入活化的聚乙二醇衍生物，在4～50℃环境温度下反应5～120min，再将反应混合液进行色谱分离，得到聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶；所述活化的聚乙二醇衍生物和沙雷菌蛋白消解酶的投料摩尔比为0.1～100︰1。

反应方程式如下：

       

         上述中，SP-NH2为沙雷菌蛋白消解酶；mPEG的分子量为2000-100000Da；x为1-100的整数；

当i为1时，j为2-5的整数；i为0时，j为0-5的整数。

所述反应中活化的聚乙二醇衍生物和沙雷菌蛋白消解酶的投料摩尔比为0.1～100︰1。

所述活化的聚乙二醇衍生物可以为单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯或单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯的一种。

本发明的聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶的制备方法简单易行，通过控制pH值、反应温度及投料比可使得对沙雷菌蛋白消解酶的修饰程度和最终的酶活性之间达成平衡。在本发明的优选修饰条件下，沙雷菌蛋白消解酶上的1～50个氨基被同等数目的PEG修饰。

当在沙雷菌蛋白消解酶的溶液中加入缓冲液后调节pH至8.5时，获得的产品修饰率最高。

本发明还采用离子交换层析和凝胶过滤层析方法对反应混合液分离纯化。离子交换层析可以是阳离子交换层析，也可以是阴离子交换层析。凝胶过滤层析中优选Superdex和Superose系列作为层析介质进行分离。由于PEG修饰的沙雷菌蛋白消解酶通常是不均一的，酶分子可以连接数量不等的PEG分子，通过柱层析的方法可以分离纯化出更为均一的部分。

本发明再一目的在于提供聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶的用途，即，用于制备治疗心脑血管疾病药物，特别是用于制备清除动脉血管硬化斑块疾病药物。

所述药物的剂型可以为丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射液或注射用无菌粉针中的任意一种。

制成的药物，给药后，既能够有效消除动脉血管内壁硬化斑块，又能够强效地溶解血栓或血栓形成因子。

具体实施方式

下列实施例中活化的聚乙二醇衍生物采用美国Laysan Bio公司生产的产品(具体产品名称有：单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯)。

mPEG连接基团后面的数字后缀表示它的平均分子量，例如mPEG-SVA-5000是指平均分子量为5000的单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件。通过下面的具体实施例可以进一步了解本发明，但它们不是对本发明的限制。

实施例一：

1、活性聚乙二醇衍生物——单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯5000（mPEG-SVA-5000）对沙雷菌蛋白酶修饰条件的选择

反应pH的选择：各取2mg/ml的沙雷菌蛋白消解酶0.5ml，分别置于8支带塞试管中，分别加入0.2M不同pH值的磷酸盐缓冲液或硼砂-盐酸缓冲液使溶液的pH值为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，每支试管中再分别加入1.7mg的mPEG-SVA-5000，溶解后混匀，并在25℃下反应1h后终止反应。以凝胶渗透色谱法（GPC）测定，确定修饰反应的pH值，结果表明：在这些条件下都得到PEG修饰的沙雷菌蛋白酶，其中pH为8.5时修饰率最高。

mPEG-SVA-5000和沙雷菌蛋白酶的摩尔比的选择：取2mg/ml的沙雷菌蛋白酶溶液2.5ml，加入2.5ml硼砂-盐酸缓冲液溶液并调节pH值为 8.5，各取1ml置于4支带塞试管中，然后分别加入mPEG-SVA-5000固体0.83mg、1.67mg、3.33mg，5.00mg（相当于mPEG-SVA-5000和沙雷菌蛋白酶的摩尔比为0.1～100︰1）溶解后混匀，在25℃下反应1h后终止反应。以凝胶渗透色谱法（GPC）测定，比较修饰率。结果表明：在这些条件下都得到PEG修饰的沙雷菌蛋白酶，当mPEG-SVA-5000和沙雷菌蛋白酶的摩尔比为20︰1时修饰率已经达到最高，进一步增加mPEG-SVA-5000的量对修饰率没有明显提高。

反应时间的选择：取1mg/ml的沙雷菌蛋白酶溶液2ml，加入2ml硼砂-盐酸缓冲液溶液并调节pH值为 8.5，再加入mPEG-SVA-5000固体3.4mg，溶解后混匀，置于带塞的试管中，在25℃下开始反应，分别在反应开始后10、30、60、90、120min抽取0.3ml反应混合液终止反应，并用GPC分别测定修饰率，确定修饰条件。结果表明：在这些条件下都得到PEG修饰的沙雷菌蛋白酶，其中60min后的修饰率没有明显变化。

反应温度的选择：取1mg/ml的沙雷菌蛋白酶溶液2ml，加入2ml硼砂-盐酸缓冲液溶液并调节pH值为 8.5，再加入mPEG-SVA-5000固体3.4mg，溶解后混匀，各取0.5ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4℃、25℃、37℃、45℃水浴中反应1h后终止反应。比较修饰率，确定反应条件。结果表明：在这些条件下都得到PEG修饰的沙雷菌蛋白酶，其中25℃的修饰率最高。

以上反应获得的聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白酶结构式如下：

   

其中，

单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯的分子量为5000；

x为1～100的整数；

SP是去除x个氨基的沙雷菌蛋白消解酶分子；

i为0，j为 5。

、修饰产物的分离纯化

    取2mg/ml的沙雷菌蛋白酶溶液30ml将其pH值调至 8.5，再加入mPEG-SVA-5000固体100mg，溶解后混匀，在25℃下反应1h后，加入甘氨酸终止反应。

取上述反应液进行透析，除去小分子盐分，浓缩，再将浓缩液上CM Sepharose FF层析柱分离，用含0.5 M NaCl的磷酸盐缓冲液（pH 7.0）进行洗脱，检测波长为280nm。收集各洗脱峰。通过此步层析分离可以将已修饰和未修饰的沙雷菌蛋白酶分开，mPEG修饰的产物在未修饰的沙雷菌蛋白酶之前出来。收集mPEG修饰的沙雷菌蛋白酶的峰，浓缩，透析后冷冻干燥，即得到mPEG修饰的沙雷菌蛋白酶。

3、 PEG修饰后沙雷菌蛋白酶体外活性和稳定性

沙雷菌蛋白消解酶活性测定方法参见Serratia protease. Part I. Purification and general properties of the enzyme. Agricultural and Biological Chemistry. 1970(34): 310-318。具体是以酪蛋白为底物来测定沙雷菌蛋白消解酶的活性。沙雷菌蛋白酶在pH 9.0的Tris-HCl缓冲液中催化酪蛋白生成不被三氯醋酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内，酶的水解滤液在波长275nm处光吸收的增值与沙雷菌蛋白酶的活力单位成正比。测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收作对照，根据酶活力单位的定义，确定样品中沙雷菌蛋白酶的活性。酶活力单位的定义：在一定条件下，每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1μmol酪氨酸在275nm 处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。

    热稳定性：取一定量沙雷菌蛋白酶、PEG修饰的沙雷菌蛋白酶分别溶解于0.1M pH7.0磷酸缓冲液中（无任何保护剂），然后分别置于4℃、25℃、37℃条件下，定时取样测定酶活性。结果表明，未修饰沙雷菌蛋白酶在37℃下2-3h内能维持90%的活性，PEG修饰的沙雷菌蛋白酶在4-6h内能维持90%的活性。25℃时未修饰酶在1天内能保持活性不变，PEG修饰酶在2-3内能维持活性不变。未修饰酶在4℃下在6天内可以保持活性不变，而PEG修饰酶在15天以上能够保持活性不变。因此可以初步认定聚乙二醇可以明显改善沙雷菌蛋白酶的热稳定性。

    在37℃下的人血清中的稳定性结果表明：沙雷菌蛋白酶在1-3h内保持稳定，而PEG修饰的沙雷菌蛋白酶在4-6h保持稳定。

酶稳定性：取固定化胰蛋白酶小球分别加入到5ml沙雷菌蛋白酶和PEG修饰的沙雷菌蛋白酶溶液中（pH均为 7.0），37℃下保温，在0-6h内等时间间隔抽取液体样，测定酶活性。结果表明，沙雷菌蛋白酶在20min内活性迅速降低到原来的30%，而PEG修饰的沙雷菌蛋白酶在1h内才降低到原来的50%。因此，聚乙二醇修饰能明显增强沙雷菌蛋白酶抵抗胰蛋白酶水解的能力。

、 PEG修饰的沙雷菌蛋白酶对实验动物免疫原性的研究

    以家兔作为制备抗血清的实验动物，采用福氏佐剂免疫法，分别以沙雷菌蛋白酶和PEG修饰的沙雷菌蛋白酶作为抗原，剂量均为5U/kg/次，每周1次，共5次。

    分别以沙雷菌蛋白酶和PEG修饰的沙雷菌蛋白酶作为抗原，用双向免疫扩散法测定它们各自抗血清的效价，结果表明：沙雷菌蛋白酶组抗血清效价为1：20，而PEG修饰的沙雷菌蛋白酶组抗血清效价测不出。

    分别以沙雷菌蛋白酶和PEG修饰的沙雷菌蛋白酶作为抗原，用沙雷菌蛋白酶组的兔抗血清作为第一抗体，再以辣根过氧化酶（HRP）标记的羊抗兔IgG作为第二抗体，用酶联免疫吸附法（ELISA）测定它们各自的免疫原性，测定结果表明：沙雷菌蛋白酶组为阳性，PEG修饰的沙雷菌蛋白酶组为阴性。

因此，同沙雷菌蛋白酶相比，PEG修饰的沙雷菌蛋白酶的免疫原性显著降低。

、未修饰的沙雷菌蛋白酶与PEG修饰的沙雷菌蛋白酶对于逆转兔腹部动脉血管内壁硬化斑块的作用比较

    对20只试验动物兔予以含有1% 胆固醇的食物喂饲。连续喂饲6个星期后，兔腹部动脉血管内壁硬化斑块形成。20只试验兔分为4组（如下表）。连续6个月给试验兔喂饲未修饰的沙雷菌蛋白酶或PEG修饰的沙雷菌蛋白酶。每个月度量兔腹部动脉血管内壁硬化斑块的厚度。硬化斑块的厚度被逆转的效果大于0.1毫米的，被评价为作用显著。硬化斑块的厚度被逆转的效果小于0.1毫米的，被评价为作用不显著。

沙雷菌蛋白酶对逆转兔腹部动脉血管内壁硬化斑块的作用比较

1个月

2个月

3个月

4个月

5个月

6个月

未修饰的沙雷菌蛋白酶（1）

不显著

不显著

不显著

不显著

显著

显著

PEG修饰的沙雷菌蛋白酶（2）

不显著

不显著

显著

显著

显著

显著

PEG修饰的沙雷菌蛋白酶（3）

显著

显著

显著

显著

显著

显著

双 盲（4）

不显著

不显著

不显著

不显著

不显著

不显著

（1）未修饰的沙雷菌蛋白酶， 每日每公斤体重服用100个 国际单位，

（2）PEG修饰的沙雷菌蛋白酶，每日每公斤体重服用100个 国际单位

（3）PEG修饰的沙雷菌蛋白酶，每日每公斤体重服用200个 国际单位

（4）无沙雷菌蛋白酶和PEG修饰的沙雷菌蛋白酶

上述结果表明：未修饰的沙雷菌蛋白酶在喂饲4个月后表现出清除硬化斑块的效果。PEG修饰的沙雷菌蛋白酶对于清除硬化斑块的效果，远高于未修饰的沙雷菌蛋白酶。其清除硬化斑块的效果，还表现出剂量依赖性。

可见，聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶可用于制备治疗心脑血管疾病，特别是清除动脉血管硬化斑块的药物，药物的剂型可以为通用的丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射液或注射用无菌粉针。

实施例二：

用单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯2000（mPEG-SVA-2000）、单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯10k（mPEG-SVA-10k）或单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯20k（mPEG-SVA-20k）代替实施例1中的mPEG-SVA-5000，得到了与实施例1相似的结果。

实施例三：

以单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯2000（mPEG-SC-2000）、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯5000（mPEG-SC-5000）、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯10k（mPEG-SC-10k）或单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯20k（mPEG-SC-20k）代替实施例1中的mPEG-SVA-5000，同样也得到了与实施例1相似的结果。

实施例四：

以单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯2000（mPEG-SG-2000）、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯5000（mPEG-SG-5000）、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯10k（mPEG-SG-10k）或单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯20k（mPEG-SG-20k）代替实施例1中的mPEG-SVA-5000，同样也得到了与实施例1相似的结果。

实施例五：

单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯2000（mPEG-SPA-2000）、单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯5000（mPEG-SPA-5000）、单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯10k（mPEG-SPA-10k）或单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯20k（mPEG-SPA-20k）代替实施例1中的mPEG-SVA-5000，得到了实施例1相似的结果。

实施例六：

单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯2000（mPEG-SS-2000）、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯5000（mPEG-SS-5000）、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯10k（mPEG-SS-10k）或单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯20k（mPEG-SS-20k）代替实施例1中的mPEG-SVA-5000，得到了实施例1相似的结果。

Claims (10)

1.聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶，其特征在于包括沙雷菌蛋白消解酶，在沙雷菌蛋白消解酶上连接至少一条聚乙二醇或其衍生物链，结构式如下：

                                                     

其中，

的分子量为2000～100000Da；

x为1～100的整数；

SP是去除x个氨基的沙雷菌蛋白消解酶分子；

当式中i为1时，j为2～5的整数；当式中i为0时，j为0～5的整数。

2.根据权利要求1所述聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶，其特征在于所述的沙雷菌蛋白消解酶为天然或人工重组。

3.一种制备权利要求1所述的聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶的方法，其特征在于先在沙雷菌蛋白消解酶的溶液中加入缓冲液，调节pH至5.0～9.5，然后加入活化的聚乙二醇衍生物，在4～50℃环境温度下反应5～120min，然后将反应混合液进行色谱分离，得到聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述活化的聚乙二醇衍生物和沙雷菌蛋白消解酶的投料摩尔比为0.1～100︰1。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于调节pH至8.5后，加入活化的聚乙二醇衍生物。

6.根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，采用离子交换层析和凝胶过滤层析方法对反应混合液分离纯化。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述活化的聚乙二醇衍生物为单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇丁酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇戊酸琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯或单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯。

8.如根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的沙雷菌蛋白消解酶的用途，其特征在于用于制备治疗心脑血管疾病药物。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于用于制备清除动脉血管硬化斑块疾病药物。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在于所述药物的剂型为丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、凝胶剂、注射液或注射用无菌粉针。