CN102458478A - 白蛋白-淀粉样肽缀合物及其用途 - Google Patents

白蛋白-淀粉样肽缀合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102458478A
CN102458478A CN2010800317420A CN201080031742A CN102458478A CN 102458478 A CN102458478 A CN 102458478A CN 2010800317420 A CN2010800317420 A CN 2010800317420A CN 201080031742 A CN201080031742 A CN 201080031742A CN 102458478 A CN102458478 A CN 102458478A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
albumin
conjugate
group
adjuvant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010800317420A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102458478B (zh
Inventor
J·曼努埃尔·萨拉萨·巴里奥
Original Assignee
Araclon Biotech SL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Araclon Biotech SL filed Critical Araclon Biotech SL
Publication of CN102458478A publication Critical patent/CN102458478A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102458478B publication Critical patent/CN102458478B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/385—Haptens or antigens, bound to carriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0007—Nervous system antigens; Prions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了包含白蛋白和源自β淀粉样蛋白肽C端区域的肽的缀合物，以及其在治疗具有淀粉样蛋白沉积特征的疾病尤其是在阿尔茨海默氏病的治疗上的用途。

Description

白蛋白-淀粉样肽缀合物及其用途
技术领域
本发明涉及包含白蛋白-淀粉样肽缀合物的组合物及其用途，更具体地，涉及治疗与淀粉样蛋白沉积相关疾病的用途，如阿尔茨海默病。
技术背景
淀粉样疾病或淀粉样变性包括许多具有各种外在症状的疾病。这些疾病的共同点是存在蛋白质原纤维异常细胞外沉积，蛋白质原纤维也称为“淀粉样原纤维”，“淀粉样蛋白沉积”或“淀粉样蛋白斑”，其直径通常约10-100nm并且局部集中于特定的器官或组织区。这种斑块主要由自然生成的可溶性蛋白或肽组成。这些不溶性的沉积主要是由直径约10-15nm的原纤维横向聚集而成。尽管他们的发生多样化，但是所有的淀粉样蛋白沉积都有着共同的形态学特征，用特定的染料染色(例如硫磺素T、刚果红)，染色后在偏振光下出现特有的红绿双折射。
淀粉样相关疾病的特征在于存在于沉积中的蛋白质类型。例如，神经退行性疾病如羊瘙痒病、牛海绵状脑炎、克雅氏病等等，其特征在于中枢神经系统中的朊蛋白(称为AScr或PrP-27)抗蛋白酶的形成出现和聚集。同样地，另一种神经退行性疾病阿尔茨海默氏病，其特征在于由淀粉样蛋白斑块和神经原原纤维缠结的沉积。在这种情况下，斑块和血管淀粉样蛋白由原纤维状淀粉样β蛋白沉积而成。其他疾病，如成人发病型糖尿病(11型糖尿病)的特征在于淀粉样蛋白在胰腺中的局部积累。
每个淀粉样蛋白都有能力折叠成β-折叠并且形成不溶性原纤维，其在细胞内或细胞外沉积。虽然氨基酸序列不同，但每个淀粉样蛋白具有形成原纤维并与其他元素(如蛋白聚糖、淀粉样蛋白P以及补体成分)结合的相同的属性。此外，每个淀粉样蛋白都有氨基酸序列，其尽管不同，但可催化β-折叠细胞的形成。例如，淀粉样β原纤维与阿尔茨海默氏症患者的神经细胞死亡和小胶质细胞增生相关。在体外测试时，已经证明β淀粉样肽能够引发小胶质细胞(脑巨噬细胞)的激活过程，这可以解释在阿尔茨海默氏症患者的大脑中发现存在小胶质细胞增生和脑部炎症。
在II型糖尿病患者中发现的另一种类型的淀粉样变性中，淀粉源蛋白IAPP已经显示在体外诱导β胰岛细胞毒性。因此，在II型糖尿病患者的胰腺中出现的IAPP原纤维可能导致了β胰岛细胞(朗格汉斯)的缺少和器官功能障碍。
最突出的淀粉样疾病之一是阿尔茨海默氏症，其是一种进行性神经退行性疾病，该疾病影响西方世界人口总数的约0.5％～1％。阿尔茨海默氏症的特征是在大脑中的大量淀粉样蛋白斑沉积。这种沉积被认为是引起疾病的病理，大多数防止阿尔茨海默氏症的方法其目的都是减少，消除或阻止淀粉样蛋白斑块的形成。淀粉样蛋白斑的主要成分是淀粉样β肽(Aβ)，一个40-42个氨基酸的蛋白质，通过淀粉样前体蛋白(APP)剪切产生。
专利申请US20070172496公开了这样的缀合物，其含有Aβ(33-42)肽，由单克隆抗体和白蛋白识别的肽以及所谓的配体呈递的聚合物oLPA，该单克隆抗体和白蛋白用来在ELISA检测中捕获抗原，以便确定样品中抗-Aβ抗体的存在，所述样品来自已经接种了复合物的患者，这种复合物由不同的来自Aβ(1-42)肽的多肽组成。
因此，在本领域中，需要额外的免疫源性组合物来减少淀粉样蛋白沉积的数量，该免疫原性组合物能够诱导有效的和持续的血浆中的淀粉样蛋白的水平下降。
发明简述
第一方面，本发明涉及一种用于药物的包含源自Aβ的C端区域(1-42)的肽和白蛋白的缀合物。
另一方面，本发明涉及一种用于药物的组合物，所述组合物包含包括源自Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白以及佐剂组成的缀合物。
另一方面，本发明涉及包括至少一种源自Aβ(1-42)的C端区域的免疫原性肽和白蛋白的缀合物或涉及一种组合物，其包含至少一种源自Aβ(1-42)C端区域的免疫原性肽、白蛋白的和佐剂，用于治疗或预防与淀粉样蛋白沉积有关的疾病。
附图说明
图1是Aβ肽(底部的箭头)的免疫注射时间表，在线下标示出了免疫接种的次数，采血(顶部的箭头)，以周(w)为单位来标示出了每个样品采集相应的时间点，CFS样品的采集是在第0周和第13周(双箭头)。(A)表和(B)表分别是Aβ(X-42)肽和Aβ(X-40)肽免疫注射时间表。在(A)表里，左图框代表所有的动物都遵循的时间表，右边的图框代表仅影响C组和D组的额外干预措施。
图2(A-C)。血浆抗Aβ抗体滴度的演变。A)血浆样品的抗Aβ抗体滴度，表达为等值的ng/μl的单克隆抗体6E10。B)血浆样品的抗Aβ抗体滴度，通过他们的EC50来表示。D)血浆样品的抗Aβ抗体滴度，通过最大的血浆稀释度的倒数来表示，其中吸光度比空白孔的平均吸光度高出三倍。在横轴上表示不同的时间点(以周为单位)。每条线代表图例中的一只动物。各组动物接受的制剂都是合成肽-蓝载体加水化凝胶HPA(A)合成肽-蓝载体加Abisco-300(B)；合成肽-BSA加水化凝胶HPA(C)和合成肽-BSA加Abisco-300(D)。较短的连续线条对应于的非应答动物(A和B组)，其中在第十三周停止治疗。C组动物由折线和相应的个别符号表示。D组由虚线和相应的个别符号表示。
图3(A-B)。血浆Aβ肽浓度的演变。A)代表在不同时间点的血浆Aβ(1-42)肽浓度的演变。B)代表在不同时间点的血浆Aβ(1-40)肽浓度的演变。横轴Y轴交叉于3.125pg/ml。为了使图示清晰，低于3.125的值已表示为-5pg/ml。在横轴上表示着不同的时间点(以周为单位)。每条线代表图例中的一只动物。4组(A、B、C和D)动物接受不同的疫苗制剂。较短的连续线条对应的非应答动物(组A和B)在第十三周停止处理。C组动物由折线和相应的个别符号表示。D组由虚线和相应的个别符号表示。
图4。各实验组的血浆抗体滴度与免疫前的状态肽浓度的变化比率的演变。横轴代表时间点(以周为单位)。折线代表不同时间点Aβ(1-42)肽血浆浓度与在免疫前的状态下(第0周)的比率的演变。虚线代表不同时间点Aβ(1-40)肽血浆浓度的与在免疫前的状态下(第0周)的比率的演变。连续线表示不同时间点血浆抗Aβ的抗体滴度与在免疫前的状态(第0周)的比率的演变。对于每一个比率来说，纵轴的值代表组中的三只动物的总和。为了使图示清晰，血浆抗Aβ抗体滴度比率的值已经除以了20。
图5。血浆抗Aβ(33-40)抗体滴度的演变。A)血浆样品的抗A β抗体滴定度表达为等值的ng/μl的抗Aβ40(SAR 22)抗体。B)血浆样品的抗Aβ抗体滴度用他们的EC50来表示。在横轴上表示着不同的时间点(以周为单位)。每条线代表图例中的一只动物(A1-A3用黑色表示，B1-B3用白色表示)。两组(组A和B)接受不同的疫苗制剂。
图6是一个图表，示出了与对照组相比，在接种疫苗的两组中，可溶性或不溶性形式的肽浓度。Vacc.1对应于Aβ(X-42)+BSA+Th2-型佐剂，Vacc.2对应于Aβ(X-42)+BSA+混合的Th1/Th2型佐剂。栏(1)对应于Aβ(1-40)可溶性形式；(2)对应于Aβ(1-42)可溶性形式；(3)对应于Aβ(1-40)不溶性形式；(4)对应于Aβ(1-42)不溶性形式。
图7是一个图表，示出了与对照组相比，接种疫苗组的可溶性形式的肽浓度。(A)对应于可溶性Aβ(1-40)肽；(B)对应于可溶性Aβ(1-42)肽。而(1)标示小脑样本；(2)额侧；(3)内鼻和(4)颞脑区。
发明详述
本发明的缀合物在医学中的用途
本发明的作者发现，令人惊讶的是，施用一种包含源自淀粉样β蛋白(1-42)[A(1-42)]C端区域的肽和白蛋白的缀合物，导致存在所述肽的抗体并降低了蛋白Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的血清水平，Aβ(1-40)和Aβ(1-42)是阿尔茨海默氏病的淀粉样蛋白斑的主要成分。这些结果打开了一个新的治疗窗，来治疗、预防和/或缓解与淀粉样蛋白沉积相关的疾病。
因此，一方面，本发明涉及一种用于药物的源自Aβ(1-42)C端区域的免疫原性肽和白蛋白的缀合物。
来自Aβ(1-42)C端区域的免疫原性肽
此处使用的术语“免疫原性肽”指的是一种包括等位基因特异性的基序、表位或其他序列的肽，这样该多肽或片段将结合MHC分子并诱导细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)反应，和/或B细胞反应(例如，抗体的产生)，和/或辅助性T淋巴细胞反应，和/或迟发型超敏反应(DTH)，对抗免疫原性肽源自的抗原，即β淀粉样蛋白肽。在本发明的实施例中示出了确定一个给定的肽是否具有免疫原性的合适的方法。这些方法都是基于在动物体施用所述肽后，所述免疫原性肽能够产生抗淀粉样β蛋白抗体的能力而言的。
此处使用的术语“淀粉样β肽”与Aβ、淀粉样β蛋白、“Aβ”、“βAP”、“Aβ肽”交替使用的，是指一个肽家族，其是在阿尔茨海默氏病(AD)、唐氏综合症、荷兰型(HCHWAD)遗传性淀粉样变性脑出血患者大脑中发现的老年斑和血管淀粉样蛋白沉积(淀粉样血管病)的主要化学成分。不论以何种形式，淀粉样β肽是淀粉样β蛋白前体蛋白(APP)的一个片段，其包括一可变数目的氨基酸，典型地39-43个氨基酸。此处使用的“Aβ(1-42)”指的是一个42个氨基酸的肽，对应于APP的672至713位氨基酸，其由β分泌酶和γ分泌酶连续蛋白水解裂解淀粉样前体蛋白产生。
淀粉样β肽通常表示为″Aβ(x-y)″，其中x代表淀粉样β肽的氨基末端的氨基酸数量而y代表羧基末端的氨基酸数量。例如：Aβ(1-40)是一种淀粉样β肽，其氨基末端从氨基酸1开始，羧基末端终止于氨基酸40，其序列定为：序列号：1。
在本发明中，“源自Aβ(1-42)C端区域的肽”意味着具有2至40个氨基酸残基的多肽，包含部分或全部的Aβ(1-42)的C端区域。该术语还包括与Aβ(1-42)C端区域基本上相似的区域(如结构变异)的肽。
术语“基本上相似”指的是两个肽序列，最优比对时，具有至少50％的序列同源性，优选至少有60％的序列同源性，更优选至少有70％的序列同源性，更优选至少有80％的序列同源性，更优选至少有90％的序列同源性，更优选至少有95％或更多的序列同源性(例如，99％的序列同源性)。优选地，残基的位置，其不同，通过保守的氨基酸替代而不同。保守的氨基酸替代是指具有相似侧链的残基的互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和侧链含硫的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。
不相同的残基位置也可能是由肽类似物组成，包括非天然氨基酸或该氨基酸的衍生物。肽类似物通常与天然发生的肽通常靠保守替代，在一个、两个或几个位置不同。
一些类似物还包括在一个，两个或几个位置的非天然氨基酸或修饰的N端或C端氨基酸。非天然氨基酸的例子包括但不限于：D氨基酸、α，α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羟基脯氨酸、y-羧基谷氨酸盐、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸以及异天冬氨酸。
在本发明的缀合物的特殊的实施例中，源自Aβ(1-42)的C端区域的肽选自Aβ(35-42)(序列号：2)，Aβ(33-42)(序列号：3)y Aβ(33-40)(序列号：4)。
此处使用的“Aβ(35-42)”涉及与Aβ(1-42)最后的8个氨基酸相对应的8个氨基酸。
此处使用的“Aβ(33-42)”涉及与Aβ(1-42)最后的10个氨基酸相对应的10个氨基酸。
此处使用的“Aβ(33-40)”涉及与Aβ(1-42)从33至40的氨基酸相对应的8个氨基酸。
源自Aβ(1-42)C端区域的肽包括肽接头组，可由固相或液相多肽化学标准方法合成。固相技术概要可在Stewart和Young(1963)Solid PhasePeptide Synthesis，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，and Meienhofer(1973)Hormonal Proteins and Peptides，Academic Press(New York)中找到。经典溶液合成可以参考Schroder and Lupke，The Peptides，Vol.1，Academic Press(New York)。
一般来说，这些方法包括给不断增长的肽链连续添加一个或多个氨基酸或适当的保护氨基酸。通常情况下，第一个氨基酸的氨基或是羧基会被适当的保护基所保护。保护氨基酸则无论是连接到一个惰性固体支持或是利用在溶液中按顺序加入下一个氨基酸中，在适合形成酰胺连接的条件下使互补(氨基或羧基)基团得到适当的保护。然后保护基会从这个新添加的氨基酸残基中移除，并添加下一个氨基酸(适当的保护)等。在所需的氨基酸已经以正确的顺序连接后，任何剩余的保护基(任何固体支持)都被按顺序移除或同时给予最终的肽。通过简单的修饰这个一般程序，可以给生长链一次添加一个以上的氨基酸。例如，通过耦合(在非外消旋手性中心的条件下)被保护的三肽与经过适当保护的二肽形成后，脱保护后形成五肽。在优选的实施方案中，半胱氨酸残基被添加到所述免疫原性肽氨基N端，以便促进利用能够与半胱氨酸的巯基反应的双功能试剂使所述肽与载体分子耦合。
白蛋白
如上所述，本发明的一方面涉及一种用于药物的缀合物，其由含有源自Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白组成。
此处使用的“白蛋白”是指血浆中最丰富的蛋白质，根据物种的起源不同，其单体形式，具有大约65至67千道尔顿的分子量。术语“白蛋白”可与“血清白蛋白”交替使用，并不旨在限定与本发明的修饰的肽形成缀合物的白蛋白的来源。因此，此处使用的术语“白蛋白”可以是指从天然来源如血液或浆膜中纯化的白蛋白，也可以是指化学合成或重组产生的白蛋白。在不同的实施方案中，白蛋白变体或天然的白蛋白衍生物能够用于形成本发明的缀合物。在一些实施方案中，白蛋白是哺乳动物白蛋白，或其变体或衍生物。可用的哺乳动物白蛋白的例子包括但不限于人、牛、绵羊、山羊、兔、猫、犬、猪、灵长类动物或是啮齿动物白蛋白。在优选的实施方案中，哺乳动物白蛋白是人白蛋白。
在一个实施方案中，人白蛋白是从血液或浆膜纯化而来的。例如，白蛋白可以从个人或实验动物的血清或血浆样品纯化而来，更多使用的是牛白蛋白，但它也可以从来自其他动物(鸡、猪、兔等)的血清中提取，这种提取可以使用任何标准方法，如通过Cohn方法(Cohn EJ等，J Am ChemSoc 1946；68：459-75)或Kistler和Nitschmann方法(Kistler P和NitschmannHS.，Vox Sang 1962；7：414-24)的冷乙醇分馏或通过层析纯化(Bergloff JH.等In：Curling JM，ed.Separation of Plasma Proteins.Uppsala：Pharmacia，1983；51-8)或冷乙醇分离和层析纯化的组合。白蛋白也可从蛋清(卵清蛋白)中提取。一类不同的白蛋白，贮藏白蛋白，可以从一些植物的种子(如大豆)中提取。
在另一实施方案中，白蛋白是重组白蛋白。在特别的实施方案中，白蛋白是重组人体白蛋白(以下简称“rHA”)。在不同的实施方案中，rHA可以在哺乳动物或非哺乳动物的有机体中产生。在一个实施方案中，rHA在非哺乳动物的有机体中产生。可用于产生rHA的非哺乳动物的生物体的例子包括但不限于，酵母、细菌、植物、真菌和昆虫。在一个实施方案中，rHA产生于整个植物或整个真菌。在另一实施方案中，rHA产生于培养的植物细胞，培养的真菌细胞，或培养的昆虫细胞。在另一实施方案中，rHA产生于非人类的哺乳动物或非人类的哺乳动物细胞。可使用非人类哺乳动物用于生产rHA的例子，包括但不限于下列中的任何一个：牛科、犬科、猪科、啮齿目、兔形目以及灵长目动物(人类除外)。在特别的实施方案中，rHA生产中使用的非人类的哺乳动物选自由牛、狗、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、家兔、黑猩猩和大猩猩组成的组。在另一实施方案中，rHA生产使用的非人类的哺乳动物细胞包括但不限于牛、犬、猪、绵羊、山羊、啮齿动物、兔或者非人类灵长类动物细胞。与人体血液或浆液纯化的白蛋白相比，利用非人类生物产生的rHA在生产过程中没有人源性产品。使用这种控制的生产方法，产品更纯，结构异源性更少。以往的研究表明，可溶性rHA与从血液或浆液纯化而来的人白蛋白之间，其生化特性、放射性标记效率和在体外和体内的生物学行为方面都没有显著的差异。见Dodsworth等，1996，Biotechnol.Appl.Biochem.24：171-176。在特别的实施方案中，白蛋白是商品名RECOMBUMIN(R)(诺维信公司，英国诺丁汉)指定的rHA。RECOMBUMIN(R)是重组人体白蛋白，采用重组酵母技术在体外生产，其中基因修饰的酵母(酿酒酵母)分泌可溶性rHA，而后收获，纯化并配制，作为生物制药辅料或医疗器械的涂层而使用。
可选地，形成了本发明的缀合物的白蛋白、白蛋白的变体或衍生物可以是商业来源的，例如，像RECOMBUMIN(R)(诺维信公司，英国诺丁汉)；PLASBUMIN人体白蛋白(R)(Talecris生物疗法，北卡罗来纳州研究三角园)；ALBAGEN(R)(新世纪制药，汉茨维尔，AL)；人体白蛋白(皮质-生化，圣莱安德罗，加利福尼亚州)，人血清白蛋白，ZLB Behring公司(普鲁士国王，宾夕法尼亚州)，或ALBREC(R)(Mistubishi制药公司，日本)。
在本发明中，“白蛋白”是指任何具有水溶性的蛋白质，其中度溶于浓盐溶液，并经历热凝聚(蛋白质变性)。其具有约65,000的分子量，由不同数量的氨基酸组成，这些氨基酸为609个氨基酸(在大多数物种中，包括人白蛋白)到615个氨基酸(例如鸡白蛋白)。它们都含有35个半胱氨酸残基，其可用于与免疫原性肽通过二硫键形成缀合物。根据本发明，适合用于获得缀合物的白蛋白包括但不限于人白蛋白(序列号：5)或其成熟的部分(序列号：5的25至609位的氨基酸)与牛白蛋白(序列号：6)或其成熟的部分(序列号：6的25至607位的氨基酸)。在本发明中使用的白蛋白还包括白蛋白的结构性变体，其来自保守的氨基酸替代，如在上文解释的从Aβ(1-42)C端区域衍生的肽。
在某些实施方案中，本发明的缀合物包括白蛋白的分子变体，例如在WO 2005/058958中所描述的，将其全部内容并入本文中作为参考。重组人血清白蛋白的变体已经可以从新世纪制药(亚拉巴马州汉茨维尔)买到，其名称为AlbagenTM。根据本发明，用于形成缀合物的白蛋白，可以采用本领域已知的方法或材料获得。例如：白蛋白是可以从商业途径获取到的，例如，诺维信公司(戴维斯，CA；来自酿酒酵母属中的重组人白蛋白)；Cortex-Biochem(加州圣莱昂纳多，Calif：血清白蛋白)，Talecris生物治疗公司(北卡罗莱纳州研究三角园；血清白蛋白)。ZLB Behring公司(普鲁士国王，PA)，或新世纪制药伊勒，阿拉巴马州：来自赤壁酵母属(Pichia pastupsilonris)的重组人白蛋白)。
白蛋白变体包括人类群体中白蛋白多态性的天然变体。通过各种条件下的电泳分析已经确定了人血清白蛋白的超过30个明显不同的遗传变体。参见例如Weitkamp等，Ann.Hum.Genet.，36(4)：381-92(1973)；Weitkamp，Isr.J.Med.ScL，9(9)：1238-48(1973)；Fine等，Biomedicine，25(8)：291-4(1976)；Fine等，Rev.Fr.Transfus.immunohematoL，25(2)：149-63.(1982)；Rochu等，Rev.Fr.Transfus.lmmunohematol.31(5)：725-33(1988)；Arai等，Proc.Natl.Acad.Sd.U.S.A 86(2)：434-8(1989)，它们的全部内容并入本文作为参考。在具体的实施方案中，本发明提供与白蛋白的分子变体形成的缀合物。
在一些实施方案中，本发明的缀合物包括与白蛋白具有实质性同源性的白蛋白衍生物。例如，缀合物可能由与白蛋白的氨基酸序列的同源性至少达到75％、至少为80％、至少有85％、比较典型的至少90％，最典型的至少95％的白蛋白同源物形成。在某些是实施方案中，白蛋白的同源物包括游离的半胱氨酸。
在一些实施方案中，本发明的缀合物包括白蛋白的结构衍生物。白蛋白的结构衍生物可包括具有白蛋白型活性的蛋白质或多肽。例如，白蛋白功能片段。在一些实施方案中，衍生物是白蛋白的抗原决定簇，即，可以通过抗白蛋白抗体识别的多肽的部分。在一些实施方案中，重组白蛋白可以是具有较高的血浆半衰期的任何蛋白质，该蛋白可以通过修饰编码人血清白蛋白的基因而获得。修饰的例子如，但不限于，重组白蛋白可以含有插入或缺失，白蛋白的痕量金属结合区，从而结合痕量金属元素，例如：如美国专利号6,787,636描述的镍和/或铜的减少或清除，其内容整体并入本文作为参考。减少与白蛋白结合的痕量金属，可以有利于减少在用白蛋白组合物处理的受试者的痕量金属过敏反应的可能性。
在某些实施方案中，白蛋白衍生物包括任何通过体外修饰白蛋白获得的具有高血浆半衰期的大分子。在一些实施方案中，白蛋白由脂肪酸修饰。在一些实施方案中，白蛋白由金属离子修饰。在一些实施方案中，白蛋白由对白蛋白具有高亲和力的小分子修饰。在一些实施方案中，白蛋白通过糖类修饰，包括但不限于葡萄糖、乳糖、甘露糖和半乳糖。
白蛋白的结构衍生物可以采用任何本领域技术人员已知的方法生产，包括但不限于，寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描以及聚合酶链式反应(PCR)突变。定点突变(参见Cotter，Biochem J 2371-7(1986)，Zoller and Smith，Methods Enzymol 154329-50(1987))，盒式诱变，限制选择诱变(Wells et alphal，Gene 34 315-323(1985))或其他已知的技术，可以在克隆的白蛋白编码DNA上进行，产生白蛋白变体DNA或序列，其编码白蛋白的结构衍生物(Ausubel et al phal，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York(目前的版本)，Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，3d ed，Cold Spping Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)，其内容整体并入本文作为参考。
在某些实施方案中，白蛋白衍生物包括任何在体外用血浆半衰期高于天然白蛋白修饰的白蛋白大分子。在一些实施方案中，白蛋白被一个或多个脂肪酸修饰。在一些实施方案中，白蛋白被一个或多个金属离子修饰。在一些实施方案中，白蛋白被一个或多个对白蛋白具有高亲和力的小分子修饰。在一些实施方案中，白蛋白被一个或多个糖类修饰，包括但不限于葡萄糖、乳糖、甘露糖、半乳糖。
人血清白蛋白的制备，无论是从血清中获得的或重组产生的，都可以包括非巯基白蛋白(即“封闭”白蛋白)和巯基白蛋白(即“不封闭”白蛋白)的异源混合物。人白蛋白多肽含有35个半胱氨酸残基，其中34个形成17个稳定的二硫键。虽然巯基白蛋白的34位的半胱氨酸残基包括游离的SH基团，在非巯基白蛋白中相同的残基包括与例如半胱氨酸或谷胱甘肽的混合二硫键，或经历了由金属离子或其他佐剂的氧化，从而使巯基反应活性降低或不反应。典型的是，巯基白蛋白富集的实现是使重组白蛋白与任何具有将氧化白蛋白Cys34转化为还原白蛋白Cys34能力的因子，如二硫苏糖醇(DTT)、巯基乙酸(TGA)或β-巯基乙醇(BME)等接触。
在本发明的某些实施方案中，重组白蛋白在缀合物反应前可以去糖基化。人们相信，白蛋白的去糖基化，尤其是酵母产生的重组白蛋白，可以产生形成相关缀合物耐受性和稳定性更优的白蛋白。一般来说，白蛋白的去糖基化可以采用本领域技术人员已知的能够还原非酶催化的糖蛋白的任何技术，在任何条件下进行，如Miksik等人(J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.，1997，699：311-345)所述。可选地，白蛋白可采用酶催化的方法去糖基化。例如，去糖基化可以通过使用糖类内切酶H或不同糖类内切酶的混合物进行。
在另一实施方案中，重组白蛋白可以进一步加工，使缀合物具有更好的特异性，即减少非Cys34缀合物形成的可能性。举例来说，重组白蛋白可以接触化学阻断残基的试剂，在该残基处，已知人血清白蛋白形成共价佐剂。本领域已知的任何能够阻断除了Cys34之外的白蛋白的反应点的试剂都可以使用。在一些是实施方案中，试剂阻断了赖氨酸残基。白蛋白含有可变数目的赖氨酸残基(例如，人白蛋白是60而牛白蛋白是61)，其中25-30个赖氨酸残基位于白蛋白表面，并可形成缀合物。因此，在一些实施方案中，本领域技术人员已知的阻断白蛋白的任何赖氨酸残基的试剂，也具有形成共价佐剂的潜力，如白蛋白的Lys71、Lysl99、Lys351、Lys525、Lys541。
连接区域
源自Aβ(1-42)的C末端区域的肽和白蛋白可直接连接，或可选地，可以通过一个或多个连接基团连接(以下也称为介入分子或间隔部分)。
在本发明特殊的实施方案的缀合物中，如果至少一个免疫原性肽和白蛋白通过连接区域连接，那么所述连接区域包含连接到其上的不超过一个免疫原性肽。
在本发明的另一特殊实施方案的缀合物中，连接区域连接至少一个免疫原性肽和白蛋白，所述连接区域包括半胱氨酸，更优选地该半胱氨酸位于免疫原性肽的N末端。
在某些实施方案中，连接基团是生物相容性的聚合物，例如，肽或含有聚合物的烷基或烷氧基。在具体的实施方案中，连接基团具有一个不稳定化学键的肽，该化学键可通过酶剪切或者在特定的化学条件下(例如，在酸性条件下)剪切。在一个实施方案中，修饰的肽包括一个活性基团通过一个或多个连接基团共价结合到该肽上。在某些实施方案中，连接基团包含一个或多个活性基团，典型地一个连接基团。在某些实施方案中，连接基团有1到100个原子。正如本文所述，连接基团的长度通过连接基团连接的基团之间最短的链的原子数量表示。在某些是实施方案中，连接基团有1到100个原子、1到80个原子、1到60个原子、1到50个原子、1到40个原子、1到30个原子、1到20个原子、10到20个原子或是5到15个原子。凡是出现超过一个连接基团的，该连接基团可以是相同或不同的连接基团。连接基团可以通过本领域技术人员已知的任何方法或技术连接到源自Aβ(1-42)的C端区域的肽。在美国专利号6849714中描述了示范的方法或技术，将其内容整体并入本文作为参考。
连接基团可以包括一个或多个烷基如甲基、乙基、丙基、丁基等基团，烷氧基、烯基、炔基或被烷基取代的氨基、环烷基、多环芳烃基、芳基、聚芳基、取代的芳基、杂环基和取代的杂环基。
在某些实施方案中，连接基团可以选自包括氨基和羧基的连接基团，该连接基团包括但不限于AEA，AEEA和OA。在某些实施方案中，连接基团可以是1到100个原子长度的AEA聚合物。在某些是实施方案中，连接基团可以是1到100个原子长度的AEEA聚合物。在某些实施方案中，连接基团可以是1到100个原子长度的OA聚合物。连接基团的说明性例子包括甘氨酸、赖氨酸、谷氨酸、异亮氨酸或精氨酸残基、AEA、AEEA或OA(例如，OA二聚体(-OA-OA-)或OA三聚体(OA-OA-OA-)的单体、二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体、十二聚体，或其任何组合(例如，任何组合GIyn、LySn、OA、AEA或AEEA，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12)。在一些实施方案中，连接基团有单一的赖氨酸。该单一的赖氨酸可以被修饰，直接或通过一个或多个连接基团连接到活性基团上。例如，K基团可以通过例如侧链的ε氨基连接到活性基团上，或一个或多个额外的连接基团。这种连接基团的例子，包括单一的赖氨酸，例如序列为(单体)aK(单体)b、K(单体)C和(单体)dK、其中a、b、c和d均为大于或等于一的整数，例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多。在一些实施例中，a和b可能是相同的，而在其他的实施例中，a和b是不同的。例如，a可以是3而b可以是4，可以提供具有以下顺序的连接基团，(OA)nK(OA)n，(OA)nK(AEA)n，(G)nK(OA)n，(OA)nK(G)n，其中n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。在活性基团位于两个TMPs之间接头的情况下，两个TMPs之间的总长度一般不会超过100个原子。连接基团的连接不认为是两个TMPS之间的接头的一部分。
连接基团可以包括上述生物相容聚合物的任意组合。例如，多聚甘氨酸接头可与一个或多个具有任意结构的AEA、AEEA或OA单体相结合。在一个实施方案中，多聚甘氨酸接头在多聚甘氨酸接头中第一个或最后一个甘氨酸的残基N或C末端，连接到一个或多个AEA、AEEA或OA的单体。可选地在多聚甘氨酸接头的甘氨酸残基之间插入一个或多个AEA、AEEA或OA单体。在特殊的实施方案中，活性基团(例如：MPA、GMBA、NHS、磺酸基-NHS、MBS或GMBS)，通过一个或多个连接基团来连接肽，其中包括，例如，多聚甘氨酸接头、多聚甘氨酸-赖氨酸的接头、AEEA、AEA或OA，或其任意组合。在某些实施方案中，活性基团通过多个连接基团连接到肽，连接基团通常可独立地选自由包含多聚甘氨酸、多聚赖氨酸、AEA、AEEA和OA组成的组中。在实施方案中，连接基团(例如：单体聚合物单元)的数目可以为1～2、1～3、1～4、1～5、1～6、1～7、1～8、1～9、1～10、1～11、1～12。凡有超过一个连接基团的情况下，连接基团可以是相同或不同的连接基团。例如：多聚甘氨酸、多聚赖氨酸、AEA、AEEA和/或OA的任何顺序的任意组合。在一个实施方案中，活性基团(通常是MPA)通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个多聚甘氨酸、多聚赖氨酸、AEA、AEEA或OA的连接基团依次排列连接到肽。在另一实施方案中，活性基团(通常MPA)通过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个多聚甘氨酸、多聚赖氨酸、AEA、AEEA或OA连接基团以分支的结构排列连接到肽。
在另一实施方案中，连接基团是肽部分，其能够充当源自于Aβ(1-42)C末端区域的肽和白蛋白之间的铰链区，使得它们彼此独立移动，而且保持各自的立体形状。从这个意义上说，根据本发明的优选的非天然中间氨基酸序列将是铰链区，其特征在于具有允许此移动的结构性的延展性，或是非天然的弹性接头。该弹性接头可以是长度不超过20个氨基酸的弹性连接肽。在更优选的实施方案中，连接肽由2个氨基酸或更多选自包括甘氨酸，丝氨酸，丙氨酸和苏氨酸组成的组中的氨基酸。在本发明优选的实施方案中，所述弹性接头是多聚甘氨酸接头，但不限于多聚甘氨酸、多谷氨酸、多聚异亮氨酸、多聚精氨酸或包括两个或两个以上氨基酸的其他合适的连接基团。在一些例子中，氨基酸连接基团可以包括至少二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二个氨基酸残基，例如：甘氨酸或赖氨酸残基。多聚甘氨酸接头可以包含以任意结构插入的一个或多个不同残基(如赖氨酸残基)，例如，在N或C末端附近，或在甘氨酸残基延伸的中间。在其他实施方案中，多聚甘氨酸接头以任意的结构与AEA、AEEA或OA的一个或多个单体相结合，在一个实施方案中，多聚甘氨酸接头，在多聚甘氨酸接头中第一个或最后一个甘氨酸的残基的N或C末端，连接到一个或多个AEA、AEEA或OA的单体。可选地，在多聚甘氨酸接头的甘氨酸残基之间插入一个或多个单体的AEA、AEEA或OA。例如，如果多聚甘氨酸作为接头，多聚甘氨酸可以包括单一的赖氨酸，以提供了一个能够与另一个接头或蛋白质反应的游离的ε氨基。这种包括氨基酸(例如，单一的赖氨酸)的多聚甘氨酸的例子，具有例如(G)aK(G)b、K(G)c、(G)dK的氨基酸序列。其中a、b、c和d每个是大于或等于1的整数，例如：一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二或更多。在一些实施例中，a和b可以是相同的，而在其他的实施例中a和b是不一样的。例如，a可以是3而b可以是4。在一些实施例中，多聚甘氨酸接头内的单赖氨酸可以本身链接到其他基团，例如，一个连接基团、活性基团或活性基团的残基。例如，赖氨酸残基可以与一个或多个额外的接头连接，例如：侧链的ε氨基。
接头/间隔物序列可能的例子包括SGGTSGSTSGTGST(序列号：7)，AGSSTGSSTGPGSTT(序列号：8)或GGSGGAP(序列号：9)和GGGKGGGG(序列号：10)。这些序列被用于结合指定的螺旋到其他蛋白的结构域((Muller，K.M.，Arndt，K.M.and Alber，T.，Meth.Enzymology，2000，328：261-281).。所述接头优选地包括氨基酸序列GGGVEGGG(序列号：11)或由氨基酸序列GGGVEGGG(序列号：11)组成。
连接区域的作用是为源自Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白之间提供间隔。因此，这确保了源自Aβ(1-42)的C端的肽的二级结构不会受到白蛋白存在的影响，反之亦然。间隔物优选地具有肽性质。连接肽优选地包括至少2个氨基酸、至少3个氨基酸、至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸、至少40个氨基酸、至少50个氨基酸、至少60个氨基酸、至少70个氨基酸、至少80个氨基酸、至少90个氨基酸或约100个氨基酸。
此外，接头可以通过共价键结合到源自Aβ(1-42)C端区域的肽和白蛋白的两侧的组合物，优选地间隔物基本上是非免疫原性和/或不包括任何半胱氨酸残基。在类似的方式中，间隔物的三维结构优选地是线性的或实质上线性的。
接头可以包括四连接素的53-56残基，其在四连接素中形成了β折叠，残基57-59在四连接素形成了转角(Nielsen，B.B.等，FEBS Lett.412：388-396，1997)。该片段的序列是GTKVHMK(序列号：12)。此接头的优势是当它在天然四连接素中出现时，适合与三聚域与CRD域结合，因此总的来说，它适合连接三聚域到另一个域。此外，由此产生的结构不会有比没有接头的结构具有更多的免疫原性。
另外，来自人纤连蛋白链3的子序列可被选择作为接头，相对应的是氨基酸1992至2102(SWISSPROT编号，登录号(entry)P02751)。子序列PGTSGQQPSVGQQ(序列号：13)对应的氨基酸数2037至2049优选地采用，其中，对应于氨基酸2038至2042的子序列片段GTSGQ(序列号：14)是更优选的。这种结构的优势在于，它不太容易被蛋白酶剪切，不具有非常高的免疫原性，因为纤维连接蛋白在血浆中高浓度存在。
可选地，合适的肽接头可以以小鼠IgG3上游铰链区的10个氨基酸残基序列为基础。根据本发明，这种肽(PKPSTPPGSS，序列号：15)已被用来产生螺旋(Pack P.和Pluckthun，A.，1992，Biochemistry 31：1579-1584)二聚抗体，且可作为有用的间隔肽。更优选人IgG3上游铰链区的相应的序列。人IgG3序列预计不会在人类中产生免疫原性。在优选的实施方案中，连接肽选自由序列APAETKAEPMT的多肽(序列号：16)和GAP序列的肽组成的组中。
在特别的实施方案中，连接区不包括以下基团：-N(CH2-)2、-NHCH＜或-NHCH(CH2-)2。
在特别的实施方案中，本发明的缀合物不具有以下结构：
Figure BDA0000130806040000191
其中
R代表-N(CH2-)2、-NHCH＜或-NHCH(CH2-)2，
X代表氢或肽基团，而且
LA任选地存在，是一种氨基酸或至少含有2个氨基酸残基的肽，
LB任选地存在，是一种氨基酸或至少含有2个氨基酸残基的肽，
P是肽，选自淀粉样蛋白或与淀粉样蛋白具有实质性相似的蛋白质的全长或片段，
Y是OH或NH2，
以及其药学上可接受的盐。
源自Aβ(1-42)C端区域的肽和白蛋白的缀合物
一旦具有足量的Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白，在适合它们之间形成共价复合物的条件下，通过两个组合物接触可形成本发明的缀合物。
无论是否免疫原性肽和白蛋白直接通过连接基团连接，本发明都设想肽通过其N端(C端呈现)连接，或通过其C末端(N端呈现)连接到白蛋白分子的可能性。在优选的实施方案中，免疫原性肽是C端呈现在白蛋白分子中。此处使用的术语“C端呈现”，是指通过其N端区连接到载体蛋白(白蛋白)，这样C端仍然可被免疫系统识别的肽。
当肽和白蛋白分子通过接头连接时，这通常是通过使用同型双功能试剂来实现的，该双功能试剂能与肽N末端游离的α-氨基及白蛋白分子中的第一位的氨基反应，或是从N端的赖氨酸基团或是游离α-氨基。适合连接免疫原性肽和白蛋白分子伯胺氨基的同型双功能试剂包括但不限于，二醛如戊二醛、乙二醛、丁二醛、乙基丁二醛、2-甲基戊二醛、3-甲基戊二醛、己二醛等。
白蛋白与源自Aβ(1-42)C端区域的肽接触，是在一个包括肽与白蛋白最终的摩尔比约为0.1∶1到约10,000∶1的溶液中进行的。在一些实施方案中，最终的摩尔比为约7500∶1、约5000∶1、约2500∶1、约1000∶1、约750∶1、约500∶1、约250∶1、约100∶1、约75∶1、约50∶1、约25∶1、约10∶1、约7.5∶1、约5∶1、约2.5∶1或约1∶1。在一些实施方案中，最终的摩尔比约在0.1∶1到1∶1之间。在一些实施方案中，最终的摩尔比约为0.1∶1、0.2∶1、0.3∶1、0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1。
通过活性基团耦合缀合物的第一和第二组分，该活性基团耦合于源自Aβ(1-42)C端结构域的肽的任意部位。活性基团根据其能够例如，通过与一个或多个氨基酸残基、羟基或巯基反应，与白蛋白形成稳定的共价键的能力进行选择。优选地，活性基团只与白蛋白的一个氨基、羟基或巯基反应。因此，可以连接到肽或连接基团的任意部位的活性基团，对于本领域技术人员来说，是适合的活性基团。在某些实施方案中，活性基团与肽的骨架或衍生物相连接。在某些实施方案中，活性基团与N末端连接，例如，肽或衍生物的N末端氨基。在某些实施方案中，活性基团与C末端连接，例如，肽或衍生物的C端羧基。在某些实施方案中，活性基团与肽或衍生物的侧链连接，例如，肽或衍生物的羟基，巯基，氨基或羧基侧链。在具体的实施方案中，活性基团与肽或衍生物的赖氨酸侧链ε氨基连接。在具体的实施方案中，活性基团与肽的N端或C端发现的半胱氨酸残基连接。
为了在蛋白质上与功能基团形成共价键，可以使用多种活性羧基基团作为化学活性基团，特别是酯类。羧基通常转化为活性中间体，如N羟基琥珀酰亚胺(NHS)或马来酰亚胺，其易于受到蛋白质上的氨基、巯基和羟基功能团的攻击。在肽上引入NHS和马来酰亚胺活性基团，可以通过使用双功能连接剂进行，这些双功能连接剂如马来酰亚胺-苯甲酰-琥珀酰亚胺(MBS)，γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基-琥珀酰亚胺酯(GMBS)，二硫基双-N-琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSP)，N-琥珀酰亚胺3-(2-二硫吡啶)(SPDP)，琥珀酰亚胺反-4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸(SMCC)，琥珀酰亚胺乙酰硫代乙酸酯(SATA)，二苯甲酮-4-马来酰亚胺。λ′-((2-吡啶基二硫醇)乙基)-4-叠氮水杨酰胺(PEAS；AET)。这种双功能接头将基于保护基团的选择，激活肽上的羧基或氨基。
可选地，除了向肽上添加马来酰亚胺外，还可以通过使用偶联剂进行，如N，N，二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)等，像马来酰亚胺丙酸一样去激活衍生物。[2-[2-[2-马来酰亚胺丙胺(乙氧基)乙氧基]乙酸，并随后与肽上的胺反应。类似试剂像DCC和EDAC，也可以用于添加衍生物像马来酰亚胺烷基胺到肽的羧基上。
伯胺是NHS酯的主要靶标。呈现在蛋白质N末端的可用的ε-氨基与NHS酯反应。然而，蛋白质上的ε-氨基可能不希望或不能与NHS耦合。虽然5个氨基酸在其侧链有氮，但只有赖氨酸的ε-胺显著地与NHS酯反应。当在NHS酯缀合物与伯胺反应，释放N羟基琥珀酰亚胺时，就形成了酰胺键。这些含有琥珀酰亚胺的活性基团以下简称琥珀酰亚胺基。
在特别的实施方案中，白蛋白上的功能团是位于氨基酸残基34(Cys34)上的单独的游离巯基，化学活性基团含马来酰亚胺基(如MPA)。MPA代表马来酰亚胺基丙酸或马来酰亚胺基丙酸盐。这样的含有马来酰亚胺的基团被称为马来酰亚胺基。
在一些实施方案中，本文所述的缀合物的形成过程包括白蛋白共价连接到治疗性多肽上的琥珀酰亚胺或马来酰亚胺基。在一些实施方案中，白蛋白氨基、羟基或巯基共价连接到治疗性多肽上的琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基。在一些实施方案中，白蛋白半胱氨酸残基34巯基共价连接到[2-[2-[2-马来酰亚胺基丙酰胺基(乙氧基)乙氧基]乙酰胺接头上，该接头位于治疗性肽的赖氨酸的ε氨基酸上。
在具体实施方案中，活性基团是在单一限定的氨基酸上，连接到肽的单一的MPA活性基团，任选地通过连接基团，MPA在白蛋白的单一氨基酸上共价连接到白蛋白上，优选半胱氨酸残基34。在优选的实施方案中，白蛋白是重组人白蛋白。
在某些实施方案中，活性基团可以连接到治疗肽的任意残基，该治疗肽适合连接这种活性基团。残基可以是肽的末端或内部残基。在某些实施例中，活性基团可以连接到肽的羧基端或氨基端。在某些实施方案中，可以连接活性基团到肽的羧基端或氨基末端。在有利的实施方案中，活性基团连接到肽的单个部位。这可以通过使用本领域技术人员已知的保护基团来实现。在某些实施方案中，治疗肽的衍生物可以包含整合的用于连接活性基团的残基。对连接有用的残基包括但不限于，半胱氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸残基。残基可以整合到肽的内部或末端，例如，通过游离α-氨基端整合到N-末端氨基酸残基。在某些实施方案中，活性基团连接到内部的赖氨酸残基。在某些实施方案中，活性基团连接到末端的赖氨酸残基。在某些实施方案中，活性基团连接到氨基末端的赖氨酸残基。在某些实施方案中，活性基团连接到羧基末端的赖氨酸残基，例如，治疗性肽的羧基端的赖氨酸残基。
在其他实施方案中，激活的二硫键通过适合形成分子间二硫键方法可以耦合到治疗肽的半胱氨酸或半胱氨酸类似物上，其基于选择性的巯基激活方案。已经描述了，基于选择性激活激活基团上的巯基的方法，并随后在蛋白质或肽之间选择性地与第二个游离的巯基反应，形成不对称的二硫键，以缓解由于对称二硫键的形成产量降低的问题。见D.Lambdandreu等，″分子生物学上的方法″(M.W.Pennington and B.M.Dunn，eds.).Vol.35，p.91.Humana Press.Totowa.N.J.，(1994)。优选地，这样的激活基团是那些基于吡啶-亚氧硫基的激活基团。(M.S.Bernatowicz elid.，Int.J.Pept.ProteinRes.28：107(1986))。优选地采用2，2′-二硫基二吡啶(DTDP)(Carlsson等，Diupsilonchem.J.173：723(1978)；L.H.Kondejewski等，Bioconjugate Chem.5：602(1994)或2.2-二硫基双(5-硝基)(NPYS)(J.Org.Chem.56：6477(1991))或N琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)(SPDP)。此外，5，5′-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(埃尔曼试剂)或6，6′-二硫二烟酸可作为激活基团。
按照这些方法，二硫键激活基团首先与含有半胱氨酸或半胱氨酸类似物的治疗性肽，在有多余的激活基团的条件下反应。这些条件非常有利于形成治疗性化合物，其包含治疗性肽与激活的二硫基团耦合，基本上没有产生二硫键肽二聚体。偶联反应后，产生的肽类化合物被纯化，如通过反相高效液相色谱法。当肽化合物与白蛋白反应，形成治疗性化合物和血清白蛋白之间的缀合物时，与第二个游离巯基的反应发生。
治疗性多肽的半胱氨酸或半胱氨酸类似物，通过亚硫酸盐解反应，转换为具有S磺酸。在这个方案中，治疗性肽或通过合成或通过重组首先合成。然后使用亚硫酸盐解反应，通过肽的半胱氨酸或半胱氨酸类似物的巯基，连接S磺酸到治疗性肽，亚硫酸盐解反应之后，治疗性肽化合物被纯化，如通过梯度柱层析。然后，利用S磺酸化合物在治疗性肽化合物和血液成分(优选血清白蛋白)之间形成缀合物。
用活性基团修饰治疗性肽，以与白蛋白共轭的方式差别很大，取决于包含治疗性肽的各个元件的性质。选择合成方案，以使合成过程简单，提供高产且高纯度的产品。通常情况下，将在肽合成的最后阶段产生化学活性基团，例如，使用羧基，酯化以形成活性酯。生产修饰后的促胰岛素肽的具体方法见美国专利号6,329,336、6,849,714或6,887,849所述。
本发明缀合物的第一和第二组分的缀合可以以不同的方式进行。一种可能是功能团直接与治疗性的活性成分缀合，其缀合位置不会干扰所述组分的活性。如本发明的理解，功能团涉及在分子中的一组特定原子，其负责所述分子的特征性的化学反应。功能团的例子包括但不限于羟基、醛、烷基、烯基、炔基、酰胺基、甲酰胺、伯、仲、叔和丁胺、氨氧基、叠氮基、偶氮基(酰亚胺)、苯基、碳酸酯、酯、醚、乙醛酰、卤代烷基、酰基、亚胺、亚胺、酮、马来酰亚胺、异氰化物、异氰酸酯、羰基、硝酸盐、亚硝酸盐、硝基、亚硝基、过氧化氢、苯、磷、磷酸、膦、吡啶、硫化物、磺酰亚磺酰基、硫酯、巯基和氧化的3，4二羟基苯(DOPA)基团。
另一种可能是通过使用同源或异源双功能团使第一和第二组分缀合。双功能团可以先缀合源自Aβ(1-42)的C端区域的肽，然后缀合白蛋白，或可选地，还可能缀合双功能团和白蛋白，然后，缀合源自Aβ(1-42)的C端区域的肽。这些类型的缀合的说明性的例子包括被称为酮-肟的缀合物(US20050255042中描述)，其中缀合物的第一组分包括氨氧化物基团，其结合到出现在异源双功能团上的酮基，该双功能团然后结合到缀合物的第二组分的氨基上。
在其他的实施方案中，用于缀合本发明的缀合物的第一和第二组分的试剂可以通过光解作用、化学方法、热方法或酶方法来处理。特别有趣的是，使用可在靶向细胞内的酶的作用下水解的试剂，这样治疗性活性化合物只在细胞内释放。可在细胞内加工的类型的连接试剂的例子已经在WO04054622、WO06107617、WO07046893和WO07112193中描述。
在两个组分的二级结构和功能保持不变的情况下，本发明缀合物的组分可以化学修饰。本领域技术人员已熟知化学修饰多肽链的方法，包括基于通过出现在半胱氨酸基团的巯基缀合的方法，基于通过出现在赖氨酸基团(US6809186)上的伯氨基团缀合的方法，基于通过N末端和C末端的基团的缀合的方法。适合修饰多肽以使其耦合到其他化合物的试剂包括：戊二醛(其允许结合化合物到多肽的N末端)，碳二亚胺(其允许结合化合物到多肽的C末端)，琥珀酰亚胺酯(例如MBS，SMCC)其允许激活N末端和半胱氨酸基团，联苯胺(BDB)，其允许激活酪氨酸基团，碘酸，其激活糖化蛋白质的碳水化合物基团。
在特别的实施方案中，源自Aβ(1-42)C末端区域的肽还包括额外的N末端半胱氨酸。
在另一实施方案中，包含血清蛋白修饰的肽通过在体外共价连接修饰的肽到血清蛋白，在体外制备，这样肽的活性基团的残基与血清蛋白形成共价键。在一个实施方案中，血清蛋白是受试者本身。在一个具体的实施方案中，血清蛋白从受试者中分离。在某些实施方案中，从受试者分离出的血清蛋白，在共价连接到修饰的肽之前，从呈现在血液和/或血细胞中的其他蛋白质中纯化。根据该实施方案，产生的缀合物施用到分离血清蛋白的受试者，或施用到自体受试者。在另一实施方案中，血清蛋白是重组的血清蛋白。典型地，血清蛋白是重组白蛋白；最典型的血清蛋白是重组人白蛋白。在优选的实施方案中，本发明的缀合物通过在pH值6.5～7.4的条件下，将包含马来酰亚胺基的修饰肽与含巯基的血清蛋白(通常是白蛋白)接触而形成的，从而典型地形成稳定的硫醚键，其在生理条件下不能裂解。在某些优选的实施方案中，血清蛋白是重组人白蛋白或重组牛白蛋白。
在一个实施方案中，修饰的肽是在其C端酰胺化的。在另一实施方案中，修饰的肽不在其C末端酰胺化。本发明的修饰的肽，缀合物或化合物，也可以包括这样的酰氨化肽。在一个实施方案，修饰的肽是在其N末端酰化。在另一实施方案中，修饰的肽不是在其N末端酰化。本发明的修饰的肽、缀合物、化合物，也可以包括这样的酰化肽。
通过肽的N末端的半胱氨酸残基偶合免疫原性肽到白蛋白，允许偶合到单一白蛋白分子，在白蛋白分子中发现了如半胱氨酸残基一样多的肽分子。例如，牛血清白蛋白(BSA)包含35个半胱氨酸，可被偶合多达35个半胱氨酸修饰肽的N端，以获得至少含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个肽分子的缀合物
可选地，通过使用能够与伯氨基反应的同源功能试剂进行免疫原性肽与白蛋白的偶合，该缀合物可包含像在白蛋白中发现的赖氨酸残基一样多的肽分子。例如，牛血清白蛋白(BSA)包含58个赖氨酸残基，可以被多达58个的免疫原性肽偶合，以获得至少含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57或58个肽分子的缀合物。
本发明的组合物在药物中的用途
本发明的缀合物能够诱导受试者的免疫应答，使得Aβ(1-42)的特异性抗体的数量增加，并能够降低在血清中淀粉样蛋白的负载。然而，如本领域技术人员已知，可以使用佐剂增加免疫应答，以增加缀合物的抗原性。因此，另一方面，本发明提供了一种包含本发明缀合物和佐剂的组合物在药物中的应用。
此处使用的术语“佐剂”，是指免疫调节物质，其能够与本发明的缀合物组合，以增强、改善或以其他方式调节受试者的免疫应答，且对受试者无有害影响。
佐剂通过几种机制来发挥它们的免疫调节特性，如淋巴细胞募集和细胞因子诱导。细胞因子佐剂包括但不限于，粒细胞-巨噬细胞菌落-刺激因子、白细胞介素-12、GM-CSF、合成胞壁酰二肽类似物或单磷酰脂质A。佐剂的进一步例子选自由弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、QS21、氢氧化铅胶体、MF59、磷酸钙、静脉脂肪乳剂、皂荚苷、角鲨烯、L121、乳剂单磷酰脂质A(MPL)、聚山梨酸酯80、霍乱毒素(CT)、LTK和LTK63。最好的佐剂是这样的，其已被批准用于人类，如氢氧化铅胶体，磷酸钙和MF59。
在更具体的实施方案中，佐剂是刺激Th2型免疫应答的类型，例如：氢氧化铅胶体和CT。通过诱导Th2型应答，产生抗炎细胞因子，优选如IL-4、IL-10和TGF-β以及产生IgG1和IgG2b抗体类。优选的用于诱导主要的Th2型反应的佐剂包括，例如：磷酸多聚体(Guy等1998，Vaccine16：850-856)和明矾(如氢氧化铝，磷酸铝)。
本发明可以使用任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂，其是普遍使用的佐剂。称为“氢氧化铝”的佐剂典型的是铝氢氧盐，其通常是至少部分结晶的。称为“磷酸铝”的佐剂典型的是羟基磷酸铝盐，往往还含有少量的硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。他们可以通过沉淀获得，沉淀时的反应条件和浓度影响盐中磷酸对羟基的取代程度。
纤维状形态(例如，在透射电子显微镜里所看到的)是氢氧化铝佐剂的典型形态。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH值时，佐剂本身有正的表面电荷。已经有在pH 7.4每毫克Al3+能吸附1.8～2.6mg的蛋白的氢氧化铝佐剂的报告。
磷酸铝佐剂一般PO4/Al摩尔比为0.3～1.2，优选0.8～1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝一般是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是无定形铝羟基磷酸盐，其PO4/Al摩尔比为0.84～0.92，包括在0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是颗粒状的(如：在透射电子显微镜所看到的片形)。在任意抗原吸附后，颗粒直径范围通常在0.5～20μm之间(例如约5～10μm)。已有在pH 7.4每毫克Al3+吸附0.7～1.5mg蛋白质磷酸铝佐剂的报道。
磷酸铝的零电荷点(PZC)与羟基磷酸盐的取代程度呈负相关，这种取代的程度根据沉淀制备盐的反应条件和试剂浓度而不同。PZC也可以通过改变溶液中游离的磷酸根离子的浓度而改变(更多磷酸盐＝更多的酸性PZC)或通过加入缓冲液，如组氨酸缓冲液(使PZC碱性更强)。根据本发明使用的磷酸铝盐，PZC通常在4.0和7.0之间，更优选在5.0和6.5之间，例如约5.7。用于制备本发明的组合物的铝盐悬浮液可能包含缓冲液(例如：磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)，但这并非总是必须的。优选地悬浮液是无菌且无热原的。悬浮液可能包括游离的磷酸盐离子水溶液，例如，其浓度为1.0～20mM，优选地5～15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可能包含氯化钠。
本发明可以使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝可能比氢氧化铝多，例如：其重量比至少为2∶1，例如＞5∶1、＞6∶1、＞7∶1、＞8∶1、＞9∶1等等。
施用于病人的组合物中Al4+的浓度优选少于10mg/ml，例如：＜5mg/ml、＜4mg/ml、＜3mg/ml、＜2mg/ml、＜1mg/ml等等。
另一方面，佐剂是刺激Th1型免疫应答的一种类型。这里使用的术语1型佐剂或Th1佐剂旨在限定能够刺激Th1型(1型)应答(或用相对薄弱的TH2(2型)应答，对1型应答极化或倾斜)的佐剂。Th1型免疫应答(特征是产生γ干扰素(IFN-γ)，且与对病毒和细胞内细菌的保护性免疫相关)是所需用的，因此，在另一特别的实施方案中，佐剂是刺激Th1型免疫应答的类型。用于诱导主要Th1型应答的优选的佐剂选自由弗氏完全佐剂、单磷酰脂质A、3-脱-O-乙酰单磷酰脂质A(3D-MPL)、铝盐、含CpG的寡核苷酸、免疫刺激DNA序列、皂荚苷、油佐剂ISA 720(赛比克公司，法国)、SAF、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS-3、SB。其他优选的Th1佐剂包括SAF(Chiron公司，加利福尼亚州，美国)，佐剂SBAS系列(例如，SBAS-2或SBAS-4，可购自SmithKlineBeecham，Rixensart，比利时)，Detox(Corixa，汉密尔顿，蒙特利尔)和其他氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸盐(AGPS)，例如在美国专利号6113918和6355257中描述的，它们的全部内容纳入本文作为参考。
本发明还考虑使用刺激Th1和Th2类型的佐剂组合。在优选的实施方案中，刺激Th1和Th2型应答的佐剂是皂甙。皂甙是甾醇苷和三萜苷的异构组，可在大范围种类植物的树皮、叶、茎、根、甚至花中发现。来自莫利纳树的树皮的皂甙被作为佐剂，进行了广泛的研究。也可以商购获自菝契(沙示)，满天星(新娘的面纱)和肥皂草(肥皂根)的皂甙。皂甙佐剂配方包括纯化的制剂，如QS21，以及脂质配方，如ISCOMs。皂甙类组合物已经使用高效液相色谱法和反相高效液相色谱法纯化。采用这些技术特异性纯化的部分包括QS7、QS 17、QS 18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地皂甙是QS21。皂甙配方也可以包括固醇，如胆固醇。皂甙和胆固醇的组合可用于形成独特的称为免疫刺激复合物(ISCOMs)的粒子。ISCOMs通常还包括磷脂，如磷脂酰乙醇胺或卵磷脂。任意已知的皂甙都可用于ISCOMs。优选地，ISCOM包括一个或多个QuilA、QHA和QHC。ISCOMs在文献45-47中进行了进一步说明。任选地，ISCOMS可以没有额外的洗涤剂。基于皂苷的佐剂的发展的综述，可以在Barr等人(AdvancedDrug Delivery Reviews，1998，32：247-271)和Sjolanderet等(Advanced DrugDelivery Reviews，1998，32：321-338)中发现。
与未缀合的肽相比，本发明的缀合物可以具有改善的药代动力学性质。肽的药代动力学性质包括，例如，其吸收和分泌、其组织分布情况、其代谢率和毒性。典型地，与未缀合的肽相比，本发明的缀合物在体内分泌速度降低，和/或半衰期增加。
用于本发明的优选的缀合物包括：
  肽   载体  佐剂
  NH2-MVGGVVIA-COOH(Aβ35-42)   白蛋白  吸附氢氧化铝凝胶HPA
  NH2-GLMVGGVVIA-COOH(Aβ33-42)   白蛋白  吸附氢氧化铝凝胶HPA
  NH2-MVGGVVIA-COOH(Aβ35-42)   白蛋白  Abisco
  NH2-GLMVGGVVIA-COOH(Aβ33-42)   白蛋白   Abisco
  NH2-CMVGGVVIA-COOH(Aβ35-42Cys)   白蛋白  吸附氢氧化铝凝胶HPA
 NH2-CGLMVGGVVIA-COOH(Aβ33-42Cys)   白蛋白  吸附氢氧化铝凝胶HPA
  NH2-CMVGGVVIA-COOH(Aβ35-42Cys)   白蛋白   Abisco
 NH2-CGLMVGGVVIA-COOH(Aβ33-42Cys)   白蛋白   Abisco
  NH2-CGLMVGGVV-COOH(Aβ33-40Cys)   白蛋白  吸附氢氧化铝凝胶HPA
  NH2-CGLMVGGVV-COOH(Aβ33-40Cys)   白蛋白   Abisco
本发明的治疗方法
正如在开始的描述中就已经提到的，本发明的组合物已被证明在与淀粉样蛋白沉积有关的疾病的治疗中非常有用。因此，另一方面，本发明涉及包含源自Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白的缀合物，或包含源自Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白及佐剂的组合物用于治疗与淀粉样蛋白沉积有关的疾病。
另一方面，本发明涉及包含源自Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白的缀合物，或者包含源自Aβ(1-42的C端区域的肽和白蛋白及佐剂的组合物，所述组合物用于制备治疗与淀粉样蛋白沉积有关的疾病的药物。
另一方面，本发明涉及治疗与淀粉样蛋白沉积有关的疾病的方法，其包括向所需受试者施用包含源自Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白的缀合物，或包含源自Aβ(1-42)的C端区域的肽和白蛋白及佐剂的组合物。
本文中所使用的术语“治疗(treat)”，“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”指的是向需要所述治疗的受试者施用治疗有效量的本发明的组合物或含有该组合物的药物制剂，以缓解与疾病相关的一个或多个症状。因此，此处使用的“治疗”涵盖对哺乳动物的任何疾病、紊乱或病症的治疗，尤其是人，包括：(a)预防发生在易于患该疾病但尚未获诊的受试者中的疾病；(b)抑制疾病或病症，即遏制其发展；或(c)减轻疾病或病症，即引起疾病或病症的消退或缓解疾病或病症一个或多个症状。用该方法治疗的受试者人群包括罹患不良状况或疾病的受试者以及具有病症或疾病风险的受试者。因此，本领域技术人员认识到，治疗可改善病人的病情，但可能无法完全治愈疾病。此处使用的术语“紊乱”和“疾病”交替使用是指在受试者中异常或致病的病症，其可以损害身体机能并可能是致命的。
此处使用的短语“治疗有效量”是指使用的数量足以预防，优选地减少至少约25％，更优选地减少至少50％，最优选地减少至少90％，病理特征的临床显著改变。涉及到本发明，该术语也可以指的是数量足以改善或逆转的与淀粉样蛋白沉积有关的疾病的一个或多个症状，如阿尔茨海默氏症。特别地，治疗的“治疗有效量”可以缓解、减少或消除至少下列症状之一：记忆障碍、持续的悲伤或焦虑、感情空虚、绝望、悲观、内疚、无价值感、无助、丧失对曾经喜欢的爱好和活动的兴趣或乐趣、精力减退、或疲劳、注意力难以集中、记忆困难、或难以作出决定、失眠、清晨早醒、或睡过头、食欲和/或体重减轻或暴饮暴食和体重增加、有死亡或自杀的想法并企图自杀、烦躁、易怒以及不应答治疗的持久性的躯体症状：如头痛、消化功能紊乱、慢性疼痛等。当向个体单独施用活性成分时，该术语是单指该成分。当施用组合时，该术语指的是引起治疗效果的活性成分的组合的量，无论是相结合施用、连续施用或是同时施用。
术语“受试者”是指动物，优选包括非灵长类(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠或小鼠)的哺乳动物和灵长类动物(如猴子或人类)。在优选的实施方案中，受试者是狗。在更优选的实施方案中，受试者是灵长类动物，在还一优选的方案中，该灵长类动物是人类。
在本发明中，“淀粉样蛋白沉积有关的疾病”，包括与淀粉样蛋白的积聚相关的疾病，可以被限制在一个器官上，即“局部淀粉样变”或扩展到几个器官，其表示为“系统性淀粉样变性”。可以用根据本发明的组合物治疗的与淀粉样蛋白沉积相关的疾病包括但不限于，在表1中示出的疾病。
Figure BDA0000130806040000311
Figure BDA0000130806040000321
继发性淀粉样变性可能与慢性感染(如肺结核)或慢性炎症(如类风湿关节炎)相关，包括在家族性地中海热(FMF)中见到的继发性淀粉样变性家族性形式以及在长期血液透析患者中发现的另一种类型系统性淀粉样变性。淀粉样变性的局部形式包括，但不限于，2型糖尿病和其任何相关的疾病、神经退行性疾病如羊瘙痒病、牛海绵状脑炎、克雅氏病、阿尔茨海默氏症、淀粉样脑血管病、朊蛋白相关疾病。淀粉样疾病的特征是在主要由原纤维组成的器官沉积淀粉样蛋白斑块，反过来，其是由特征性原纤维蛋白或多肽构成的。
因此，在特别的实施方案中，与淀粉样蛋白沉积相关的疾病选自阿尔茨海默氏症、克雅氏病、脑淀粉样血管病以及朊蛋白相关疾病和肌肉退化。
本领域技术人员将会理解的是，所有关于在药物中使用的本发明的组合物或试剂盒的特别实施方案，当所述组合物或试剂盒用于淀粉样蛋白沉积有关的疾病的治疗时，也是适用的。因此关于本发明的治疗方法的特别的实施例采用的缀合物或组合物是：
·源自Aβ(1-42)的C端区域肽选自Aβ(35-42)(序列号：2)，Aβ(33-42)(序列号：3)，Aβ(33-40)(序列号：4)；
·源自Aβ(1-42)的C端区域肽进一步还包括额外的N末端半胱氨酸；
·白蛋白是牛血清白蛋白。
·佐剂，优选是Th1或Th2型佐剂，并且
·本发明的组合物或来自本发明试剂盒的活性成分是双周施用的。
这些特别的实施方案的详细描述，可以在前面的段落找到。
在另一特殊的实施方案中，与淀粉样蛋白沉积相关的疾病选自阿尔茨海默氏症、克雅氏病、脑淀粉样血管病以及朊蛋白相关疾病。
本发明缀合物或本发明的组分可以通过不同的方法施用，例如，静脉注射、腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、外用、皮下、口服、滴鼻或经气管内、以及局部地、系统地、或直接向目标部位(局部的方式)。活性成分施用的不同方法和要使用的赋形剂以及其制造过程，可以在Tratado deFarmacia Galénica，C.Faulíi Trillo，Luzán 5，S.A.de Ediciones，1993和inRemington’s Pharmaceutical Sciences(A.R.Gennaro，Ed.)，20th edition，Williams & Wilkins PA，USA(2000)中发现。
在本发明中，“局部化的方式”被理解为局部施用本发明的缀合物到人体或动物体内的具体位置。优选地，在一个有快速的血流量的位置施用，例如：静脉注射、周围或中央静脉。可能发现其他途径采用与缓慢释放技术或保护基质偶联施用。此外，通过鼻腔给药的黏膜免疫是一个合适的方法，因为已知这样的给药途径将有利于Th2型应答。
给药方案将由医生和临床因素决定。众所周知，在医药领域中，剂量取决于很多因素，包括病人的身体特性(年龄、大小、性别)、使用的施用方法、疾病的严重程度、所使用的特定化合物和个体的药代动力学性质。
在特别的实施方案中，本发明的组合物或来自本发明试剂盒的活性成分是双周施用的。
本发明的组合物或来自本发明试剂盒的活性成分已经证明其在药物中的使用是有用的。
为了在药物中使用，本发明的组合物可以是前体药物、盐、溶剂化物或包合物的形式，或者是在隔离的形式或结合额外的活性剂。根据本发明的组合物可以连同药学上可接受的赋形剂一起配制。在本发明使用中的优选的赋形剂包括糖、淀粉、纤维素、树胶和蛋白质。
本领域技术人员会理解的是，本发明的组合物可以通过本领域已知的常规过程以固体(例如：片剂、胶囊、糖衣片、颗粒剂、栓剂、可重组提供液态形式的无菌结晶或无定形固体等等)、液体的(例如：溶液、悬浮液、乳液、酏剂、洗剂、软膏等)或半固体(凝胶、软膏、乳膏和类似)的形式配制。药学上可接受的载体的例子为本领域已知，包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳状液如油/水乳剂、不同类型的润湿剂、无菌溶液等。
以下方法和例子都用于说明发明的范围而非限制其范围。
具体实施例
用具有C末端区域序列β淀粉样蛋白接种狗是安全的，并且除去了血液中的所述蛋白质。
实施例1：用Aβ(x-42)肽免疫
I.材料与方法
1.动物的特征
本发明中使用任意性别的12岁小猎犬狗。表1总结了动物的特征。他们来自商业来源，并已在圣地亚哥大学的犬舍饲养。在实验过程中，动物被安置在三个自由进出的集体狗舍，并随意提供配制好的狗粮和水。这些动物在实验之前被彻底的确认过，包括身体和神经系统检查、血液生化值和血象，并宣布是健康的。
这些动物被兽医临床医生分配在四组(A、B、C和D；N＝3)，其对最终分配给各组的治疗是不知情的。每周对有任何临床迹象应答的显症的动物进行了研究。在进行了第三次免疫接种后，又进行了一次完整的检查，包括血液生化和血象。
动物处理是根据(86/609/EU，Real Decreto 1201/2005)欧洲和西班牙的立法来进行的，并尽一切努力去减少动物的痛苦。这项研究是由圣地亚哥大学伦理委员会批准的。
2.免疫原的制备
合成的Aβ(35-42)肽(当通过SPDP缀合时具有额外的N末端半胱氨酸)作为抗原(0.4mg/注射)整合到四个不同的疫苗配方中用于动物的免疫接种。每个配方都结合了蛋白载体，或是蓝载体(BC；皮尔斯，罗克福德，白细胞介素；A组和B组)或牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司，西班牙马德里，C组和D组)；和佐剂，或者是吸附氢氧化铝凝胶HPA(RH；Quimibios(制造商Reheis)，西班牙的巴塞罗那，A组和C组)或Abisco-300(AB，Isconova AB公司，乌普萨拉科学园，SE-751 83乌普萨拉，瑞典；B组和D组)。
2.1.使用SPDP耦合合成肽与BSA
首先，准备20mM的SPDP(N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸；50mg/8ml DMSO)的储备溶液。然后，5mg的BSA溶解于1ml的pH值8的PBS/5mM EDTA，添加50μl的20mM的SPDP溶液到BSA中。溶液在室温下培养2小时。而后，用PBS/EDTA和缓冲液平衡脱盐柱，与SPDP修饰的BSA交换，从而去除反应副产物和多余的未反应SPDP试剂。
接下来，使用以下方案来测定SPDP修饰的水平：
a)用PBS稀释100μl的SPDP修饰的和脱盐的BSA到1ml。
b)测量和记录蛋白质在343nm的吸光度，简单的与PBS/EDTA空白(一式三份测试)相比。
c)添加10μl 15mg/ml的DTT到1ml SPDP修饰的蛋白质样品里，混合。
d)15分钟整后，测量和记录还原样品在343nn处的吸光度。
e)使用下列公式：
Figure BDA0000130806040000361
如果X介于5和6′5，添加2mg的合成肽到5mg的SPDP修饰的BSA中。
在SPDP修饰的水平确定后，搅拌反应混合物过夜培养18-24小时，反应混合物冷冻干燥。
2.2.使用戊二醛耦合合成肽与蓝载体
pH值10的2ml硼酸缓冲液和66μl蓝载体(200mg/ml)分别加入反应瓶并轻轻混合。然后，把12mg合成肽加入反应瓶中。同时，通过加入pH值10的硼酸缓冲液使戊二醛稀释至0.3％。
接下来，慢慢加入1ml的新鲜配制的0.3％的戊二醛溶液到反应瓶同时在室温下搅拌，使其在室温下黑暗中反应2小时(溶液变为黄色)。为了阻断未反应的戊二醛，把250μl的1M甘氨酸加入到反应瓶中同时轻轻地混合，在室温下额外培养30分钟。此后，反应混合物转移到用PBS平衡的脱盐柱上。反应混合物冷冻干燥并溶解到合适的浓度。
因此，本发明使用的四个不同的配方如下：
A)400μg Aβ35-42缀合到蓝载体加200μl吸附氢氧化铝凝胶HPA。
B)400μg Aβ35-42缀合到蓝载体加200μlAbisco-300。
C)400μg Aβ35-42缀合到BSA加200μl吸附氢氧化铝凝胶HPA。
D)400μg Aβ35-42缀合到BSA加37μlAbisco-300。
所使用的合成多肽分别为：
当缀合到蓝载体与戊二醛时：
1.狗(和小鼠，见下文)中的Aβ(35-42)(NH2-MVGGVVIA-COOH)(序列号：2)
2.兔(见下文)中的Aβ(33-42)(NH2-GLMVGGVVIA-COOH)(序列号：3)
当缀合到BSA与SPDP时：
1.狗(和小鼠；见下文)中的Aβcys(35-42)(NH2-CMVGGVVIA-COOH)(序列号：17)
2.兔(见下文)中的Aβcys(33-42)(NH2-CGLMVGGVVIA-COOH)(序列号：18)
3.接种方案和采血
动物(狗)分4组，并分配给四个疫苗配方中的任意一个。用Aβ35-42对动物的背部进行皮下接种并监测不良反应。接种和采样的时间表在图1(A)里示出。总之，动物双周注射7次。第7次注射的7个月后，C和D组的狗接受了额外的第8次接种。
在第一次免疫(W0)之前的即刻，在第三次接种后的一周(第5周：W5)，第五次注射后的一周(W9)，第七次(W13)接种(图1)的一周后用EDTA和蛋白酶抑制剂(完整的迷你mg/10ml，罗氏)把颈静脉血液样本收集到聚丙烯瓶里。C组和D组动物额外的血液样本是在第七次四个月后的免疫(W31)和加强免疫后的第一周和第三周(分别为W43和W45)获得的。
在4000g离心10分钟之前，轻轻混合样品并在4℃时保存最多2小时。然后分装和在-80℃冷冻血浆直到使用。此外，在每次提取中，为了获得血清，从每个动物身上收集1ml血到不含EDTA的聚丙烯小瓶里。该样本在室温下凝固一小时，然后4000g离心10分钟，收集血清并在-80℃保存，直到血液生化测定实验。
在全身麻醉和无菌条件下在第七次免疫后(图1)，在第一周之前的一周以及第13周采集脑脊液(CSF)样品。这些脑脊液标本被分装并在-80℃冷冻，直到使用。
4.血浆和脑脊液中抗Aβ抗体检测
抗Aβ抗体通过在96孔聚丙烯板直接进行ELISA而测定。微量板孔涂有在100mM碳酸氢钠和2M盐酸胍缓冲液(pH值9.6)中的2.5μg/ml人Aβ(1-42)肽(#24224 AnaSpec.圣何塞，CA，美国)，4℃过夜。然后用300μL洗涤液(0.5M Tris，1.5M氯化钠，0.5％吐温20；pH 8)洗涤微孔板3次；用300μL封闭液(0.5％BSA的0.05M Tris，0.2％吐温20，pH值8)在37℃封闭两个小时然后再洗三遍。涂层板在37℃与100μL三倍连续稀释的狗血浆在缓冲液媒介下(0.05M的Tris，0.5M的氯化钠，0.05％吐温20，0.05％BSA；pH值8)在一排10孔的微孔板，从第一个孔开始，以1∶30稀释血浆，并培养1小时。测定的最大血浆稀释度为1/10x310。每板的第十一和第十二行都装有不含血浆的缓冲液，作为空白对照。然后洗涤微孔板，与用溶剂缓冲液以1∶1000稀释的100μl辣根过氧化物酶缀合的兔抗狗LgG(Jackson InmunoResearch.Suffolk，UK)在37℃培养1小时，洗涤3次，与在用于ABTS(Roche，Barcelona，Spain)的缓冲液里的0.0375％ABTS(Roche，Barcelona，Spain)培养。在自动酶标仪(Synergy 4，Biotek.Winooski，Vermont，USA)上在405nm读取吸光度。
血浆抗Aβ抗体浓度通过使用6E10单克隆抗体作为标准在同一ELISA板上计算出来，并用μg/μL表示。每个血浆样品的EC50的测定是通过在每个孔(GraphPad Prism 3.02)的稀释度的对数与吸光度的非线性回归而获得的。此外，血浆终点滴度定义为最大的血浆稀释度，其吸光度比空白孔的平均吸光度高出三倍。
血浆中游离的Aβ肽的测定
血浆中Aβ(1-42)和Aβ(1-40)的水平以及狗脑脊液的CSF是使用Araclon生物技术(西班牙萨拉戈萨)ABtest-40和ABtest-42ELISA试剂盒，并遵照厂商的说明，用间接夹心ELISA来测定的。
II.结果
在整个实验的时间里，动物都保持健康和活跃的状态。特别是没有检测到对疫苗的应答的迹象。从0周到第13周的平均体重增量为1±1.7Kg(表1)。在此期间只有两只动物体重减少：(每只减少1千克，分别占他们在0周时体重的4％和7％)。
Figure BDA0000130806040000391
Figure BDA0000130806040000401
抗Aβ(1-42)抗体滴度
A组和B组
A组和B组内的动物血浆吸收率插值相对于6E10标准品，在免疫前的样品和在第5周、第9周以及第13周(表2A和图2A)收集的样品之间没有检测到一致的差异。血浆中抗体滴度的增量因素，测定为相当于μg/μL的6E10，在第三次和第七次免疫接种后(分别为第5周和第13周)，该增量因素非常低(0.8±0.2和0.8±0.2，分别为A组的增量；1.2±0.1和1.3±0.3，分别为B组的增量。表3)。A组和B组动物的特异性抗体(抗-Aβ42)血浆EC50值从第0周到第13周都非常低。事实上，除了狗B2之外，所有这些狗中的血浆EC50值从第0周到第5周一直在下降，其在这个时间点只有一个不显著的增量(表2B和图2A-C)。此外，在接受免疫后，这些狗，甚至浓度最高的血浆稀释(1∶30)都没有显示出一个比免疫前的血浆样本(表2C)高出了三倍的吸光度。因此，这两组狗被视为对其相应的疫苗配方(A和B)为不应答。
Figure BDA0000130806040000402
Figure BDA0000130806040000411
Figure BDA0000130806040000421
Figure BDA0000130806040000422
Figure BDA0000130806040000431
C组和D组
与组A和B的观察相比，进行疫苗制剂处理C和D组狗表现出其血浆抗体滴度的显著改变。用6E10标准品计算，EC50或稀释终点，这两组中所有的狗的应答遵循相同的模式，尽管观察到两组之间和组内(表2A-C)都存在着定量差异。一般模式的特征是三次免疫接种后的滴度大幅增加，而从第5周到第13周只有轻微的改变。因此，在三次免疫接种后抗体滴度大幅增加，但在随后的4次双周疫苗注射后并没有大幅增加(甚至略有下降)。具体来说，测量相当于μg/μl的6E10的滴度，在三次和七次免疫接种后(分别为第5周和第13周)分别乘以C组系数12.3±0.4和8.1±2.6；以及D组系数30.2±12.8和24.1±15.3。见表3)。
最后一次免疫后4个月(第31周)，滴度下降到非常低的水平(见表2)。然而，D组的狗仍然比在免疫前的血浆(见表3)里的滴度高出两倍。然后C组和D组的狗接受了额外的第8次免疫，这次免疫是用相应的疫苗配方在第7次免疫后的7个月后进行的。这次强化注射带来的是D组的抗体滴度大幅增加(与免疫前血浆相比增加了15.5±12.1倍，见表3)同时C组增加的幅度较小(与免疫前血浆相比增加了3.1±1.8倍，见表3)(图2A-C)。总之，在任何时间点，D组的动物的抗体滴度总是高于C组的。尽管如此，在具有较小应答的D组(案例D3)狗的滴度增量与C组(表3，图2，图3)狗滴度的增量非常相似。
2.Aβ肽滴度
在无应答的动物中，免疫前收集的血浆和第5、第9和第13周收集的血浆之间，夹心ELISA法未检测到一致的差异。在第三次和第七次免疫接种(分别为第5周和第13周)后，血浆Aβ(1-42)浓度的变化系数非常低(1.2±0.7和1.0±0.0，分别为A组的值；0.9±0.0和1.0±0.1，分别为B组的值。见表5A)。同样地，在第三次和第七次免疫接种(分别为第5周和第13周)后，血浆Aβ1-40浓度的变化系数非常低(两组两周都是0.9±0.1。见表5B)
Figure BDA0000130806040000441
Figure BDA0000130806040000461
Figure BDA0000130806040000462
与组A和B的观察相比，进行疫苗制剂处理C和D组狗表现出其血浆Aβ(1-42)浓度的显著改变。这些变化遵循的一个模式，其特征是Aβ(1-42)在第5周大幅下降，经过三次免疫接种后，达到了六只狗中的五只检测不到肽的程度(＜3.125pg/ml；表4A；图3A)。肽浓度无法检测持续到第13周；在第31周增加，第七次免疫后4个月时抗体滴度与免疫前的水平接近；然后在第42周(图1)的强化注射后(第8次)再次下降。这些变化的幅度反应在表5A中。有一点令人惊讶的是，Aβ(1-40)的血浆浓度表现出遵循与Aβ(1-42)非常相似的变化模式。图4示出了抗体滴度和肽浓度在任何时间点之间的对应关系。
尽管C组和D组之间在试验中任何时间点的血浆抗体滴度存在实质性差异，Aβ肽浓度的波动还是遵循了类似的时间过程。这表明，即使高抗体滴度也不能实现从循环中清除Aβ肽。
实施例2：用Aβ(X-40)肽免疫
I.材料与方法
1.动物的特征
在本发明中使用任意性别的6岁小猎犬狗。他们来自商业来源，并已在圣地亚哥大学的犬舍饲养。在实验过程中，动物被安置在三个自由进出的集体狗舍，并随意提供配制好的狗粮和水。这些动物在实验之前被彻底的确认过，包括身体和神经系统检查，血液生化值和血象，并宣布是健康的。
这些动物被兽医临床医生分配在两组(A和B，N＝3)，其对最终分配给各组的治疗是不知情的。每周对有任何临床迹象应答的初现的动物进行了研究。在进行了第三次免疫接种后，又进行了一次完整的检查，包括血液生化和血象。
动物处理是根据(86/609/EU，Real Decreto 1201/2005)欧洲和西班牙的立法来进行的，并尽一切努力去减少动物的痛苦。这项研究是由圣地亚哥大学伦理委员会批准的。
2.免疫原的制备
合成的Aβ(33-40)肽(当通过SPDP缀合时具有额外的N-末端半胱氨酸)作为抗原(0.4mg/注射)纳入两个不同的疫苗配方中用于动物的免疫接种。每个制剂都结合了蛋白载体，或是蓝载体(BC；皮尔斯，罗克福德，白细胞介素；A组)或牛血清白蛋白(BSA，Sigma公司，西班牙马德里，B组)；和佐剂Abisco-300(AB，Isconova AB公司，乌普萨拉科学园，SE-75183乌普萨拉，瑞典；)
如方案1相同的步骤(见材料和方法，2.1)用于包含N-末端半胱氨酸的肽与蓝载体和SPDP白蛋白缀合。
本发明使用的两个不同的配方如下：
(A)400μg合成肽缀合到蓝载体加200μlAbisco-300。
(B)400μg合成肽缀合到BSA，加37μlAbisco-300
使用的合成肽是：
当与SPDP缀合物时：
兔(见下文)中的Aβcys(33-40)(NH2-CGLMVGGVV-COOH)(序列号：19)
3.免疫方案和采血
动物分成2组，并分配给2个疫苗配方(见上文(A)和(B))中的任意一个。对动物的背部进行皮下接种并监测不良反应。免疫和采样的时间表在图1(A)中示出。简单来说，动物双周注射7次。
用EDTA和蛋白酶抑制剂(完全迷你mg/10ml，罗氏)在第一次免疫(W0)之前及在第一次免疫之后的(图1(B))一周后(第1周)、在第5周(W5)、在第7周(W7)、在第9周(W9)、在第11周(W11)以及第一次免疫之后第13周(W13)，把颈静脉血液样本收集到聚丙烯瓶里。
4000g离心10分钟之前轻轻混合样品并在4℃时保存最多2小时。然后分装并在-80℃冷冻血浆直到使用。此外，在每次提取中，为了获得血清，从每个动物身上收取1ml血到不含EDTA的聚丙烯小瓶里。这个样本在室温下凝固1小时，然后在4000g离心10分钟，收集血清并在-80℃保存，直到血液生化测定实验。
在全身麻醉和无菌条件下，在第七次免疫后(图1(B))，在第一周之前的一周(W0)以及第13周(W13)采集脑脊液(CSF)样品。这些脑脊液标本被分装并在-80℃冷冻，直到使用。
4.血浆和脑脊液中抗Aβ的抗体检测
抗Aβ抗体通过在96孔聚丙烯板直接进行ELISA而测定。微板孔涂有在100mM碳酸氢钠和2M盐酸胍缓冲液(pH值9.6)中的2.5μg/ml人类Aβ(1-40)肽(#24224 AnaSpec.圣何塞，CA，美国)，4℃过夜。然后用300μL洗涤液(0.5M Tris，1.5M氯化钠，0.5％吐温20；pH 8)洗涤微孔板3次；用300μL封闭液(0.5％BSA的0.05M Tris，0.2％吐温20，pH值8)在37℃封闭两个小时然后再洗三遍。涂层板在37℃与100μL三倍连续稀释的狗血浆在缓冲液下(0.05M Tris，0.5M的氯化钠，0.05％吐温200.05％BSA；pH值8)在一排10孔微孔板，从第一个孔开始以1∶30稀释血浆，并培养1小时。测定的最大血浆稀释为1/10x 310。每板的第十一和第十二行都装有不含血浆的缓冲液，作为空白对照。然后洗涤微孔板，微孔板与用缓冲液以1∶1000稀释液的100μl辣根过氧化物酶兔抗狗IgG在37℃培养1小时，洗涤3次，并与在ABTS(Roche，Barcelona，Spain)缓冲液里的0.0375％ABTS(Roche，Barcelona，Spain)培养。在自动酶标仪(Synergy 4，Biotek.Winooski，Vermont，USA)上405nm读取吸光度。
血浆抗Aβ抗体浓度是通过使用6E10单克隆抗体作为标准品在同一酶标板上计算出来的，并用μg/μL表示。每个血浆样品的EC50的测定是通过在每个孔(GraphPad Prism 3.02)的稀释度的对数与吸光度的非线性回归获得的。此外，血浆终点滴度定义为最大的血浆稀释度，其吸光度比空白孔的平均吸光度高出三倍。
血浆中游离的Aβ肽的测定
血浆中Aβ(1-42)和Aβ(1-40)的水平以及狗脑脊液的CSF是使用用Araclon生物技术(西班牙萨拉戈萨)ABtest-40和ABtest-42ELISA试剂盒并遵照厂商的说明，采用夹心ELISA来测定的。
II.结果
在整个实验的时间里，动物都保持健康和活跃的状态。特别是没有检测到对疫苗的应答的迹象。
抗-Aβ(1-40)抗体滴度
用疫苗配方B治疗的狗更有效，其表现出血浆抗Aβ40抗体滴度显著改变。用抗Aβ40抗体浓度和EC50或终点稀释来测量在这组中所有的狗的应答，其遵循相同的模式，虽然观察两组之间和组内(表6，组A-B)都存在着定量差异。在进行疫苗配方B治疗的狗中，其一般模式的特征是两次免疫接种后(第5周)的滴度大幅增加，从第5周到第9周(图5A)只有轻微的改变。因此，在两次免疫接种后抗体滴度大幅增加，但在后续疫苗注射后并没有增加甚至略有下降，具体来说，在第七次免疫后(第13周)滴度稍有下降到低于B组W5值的水平(表6和图5A)。
Figure BDA0000130806040000511
Figure BDA0000130806040000521
n.d.：未检出
2.Aβ肽滴度
进行疫苗配方治疗的B组的狗表现出其血浆Aβ(1-42)浓度的显著改变。这些变化遵循着一个模式，其特征是Aβ(1-42)在第5周大幅下降，经过两次免疫接种后，达到了检测不到肽的程度(＜3.125pg/ml；表7A)。肽浓度无法检测持续到第13周；然而，进行疫苗配方A治疗的狗其血浆Aβ(1-42)浓度的没有显示出任何改变。Aβ(1-40)的血浆浓度表现出遵循与Aβ(1-42)(表7B)非常相似的变化模式。
用ELISA来比较免疫前(W0)和在第13周脑脊液的水平(ELISA)之后，两组(A和B组)动物在疫苗治疗后其Aβ(1-40)和Aβ(1-42)肽的水平都在下降。出人意料的是，A组狗比在B组狗的水平更低，尽管A组狗没有出现免疫原性反应。
Figure BDA0000130806040000522
Figure BDA0000130806040000531
Figure BDA0000130806040000532
实施例3：在大脑中免疫的效果
材料与方法
为了研究大脑中免疫的效果，进行了急性实验，在试验中，接受了三次以下配方免疫接种后，处死动物：
(1)AβX-42+BSA+Th2型佐剂(吸附氢氧化铝凝胶)。
(2)AβX-42+BSA+混合Th1/Th2型佐剂(Abisco)。
(3)对照：白蛋白+Th2型佐剂。
大脑区域的额侧，内嗅区，颞区和小脑样品在pH值7.4含有蛋白酶抑制剂混合物的TBS中匀浆。然后在Beckman MLA-55旋转器里175000g，4℃，分离30分钟。由此产生的上清液被视为每个样品的可溶部分。然后，重新在pH值7.4含有蛋白酶抑制剂混合物TBS-TX里匀浆微团并以与之前相同的条件下再次离心。同样，由此产生的微团重新在TBS胍酰氯中匀浆，在旋转的搅拌器室温培养过夜，然后在贝克曼MLA-55旋转器里13000g，4℃，分离1小时30分钟。去除微团，由此产生的上清液悬浮于TBS胍氯中并被认为是不溶性部分。然后用ELISA法定量肽浓度。
结果
用Aβ(X-42)与BSA的缀合物进行的免疫接种，对肽的可溶性形式有很强的影响，与对照组相比，每个治疗组的浓度下降50％以上。不溶于水形式的浓度没有显著下降(图6)。对于不同的脑切片，Aβ40和Aβ42肽的可溶性形式(图7)在所有区域都是类似的，仅仅略有差异(图7)。
如在实施例2和例3中所发生的，与基准线和后处理的时间点相比较脑脊液中的肽浓度没有差异。
本发明获得的结果与延伸的想法是一致的，即：如果在Aβ聚集发生前施用，Aβ的免疫接种可能会更有效。
Figure IDA0000130806080000011
Figure IDA0000130806080000021
Figure IDA0000130806080000031
Figure IDA0000130806080000041
Figure IDA0000130806080000061
Figure IDA0000130806080000071
Figure IDA0000130806080000081
Figure IDA0000130806080000091
Figure IDA0000130806080000101

Claims (17)

1.一种用于药物的缀合物，包含至少一个源自Aβ（1-42）C端区域的免疫原性肽和白蛋白。
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中如果该至少一个免疫原性肽和白蛋白通过接头区域连接，所述接头区域包含连接在其上的不超过一个免疫原性肽。
3.根据权利要求2所述的缀合物，其中该至少一个免疫原性肽是通过包含半胱氨酸的接头区域与白蛋白分子连接的。
4.根据权利要求3所述的缀合物，其中所述半胱氨酸位于免疫原性肽的N 末端。
5.根据权利要求1至4所述的缀合物，其中源自 Aβ（1-42）C端区域的肽选自由一个或多个Aβ（35-42）（序列号：2）、Aβ（33-42）（序列号：3）和Aβ（33-40）（序列号：4）组成的组中 。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中所述白蛋白是牛血清白蛋白。
7.一种用于药物的组合物，包含根据权利要求1至6中任一项所述的缀合物和佐剂。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述佐剂选自由Th1型佐剂、Th2型佐剂和混合型Th1/Th2型佐剂组成的组中。
9.一种包含至少一个源自Aβ (1-42) C端区域的免疫原性肽和白蛋白的缀合物或包含至少一个源自Aβ (1-42) C端区域的免疫原性肽和白蛋白以及佐剂的组合物，所述缀合物或组合物用于治疗或预防淀粉样蛋白沉积有关的疾病。
10.根据权利要求9所述的供使用的缀合物或组合物，其中所述缀合物或组合物是双周施用的。
11.根据权利要求10所述的供使用的缀合物或组合物，其中如果至少一个免疫原性肽和白蛋白通过接头区域连接，所述接头区域包含连接在其上的不超过一个的免疫原性肽。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的供使用的缀合物或组合物，其中源自 Aβ （1-42）C端区域的所述肽选自Aβ（35-42）（序列号：2）、Aβ（33-42）（序列号：3）和Aβ（33-40）（序列号：4 ）。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的供使用的缀合物和组合物，其中所述与淀粉样蛋白沉积有关的疾病选自阿尔茨海默氏症、克雅氏病、脑淀粉样血管病和朊蛋白相关疾病。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的供使用的缀合物或组合物，其中所述白蛋白是牛血清白蛋白。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的供使用的缀合物，其进一步包含佐剂。
16.根据权利要求15所述的供使用的缀合物，其中所述佐剂选自由Th1型佐剂、Th2型佐剂和混合型Th1/Th2型佐剂组成的组中。
17.根据权利要求9至16中任一项所述的供使用的缀合物或组合物，其中所述缀合物和组合物是双周施用的。
CN201080031742.0A 2009-05-26 2010-05-26 白蛋白-淀粉样肽缀合物及其用途 Expired - Fee Related CN102458478B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09382078.5 2009-05-26
EP09382078A EP2258398A1 (en) 2009-05-26 2009-05-26 Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof
PCT/EP2010/057235 WO2010136487A1 (en) 2009-05-26 2010-05-26 Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102458478A true CN102458478A (zh) 2012-05-16
CN102458478B CN102458478B (zh) 2014-03-19

Family

ID=41022577

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080031742.0A Expired - Fee Related CN102458478B (zh) 2009-05-26 2010-05-26 白蛋白-淀粉样肽缀合物及其用途

Country Status (20)

Country Link
US (2) US9023991B2 (zh)
EP (2) EP2258398A1 (zh)
JP (2) JP5936539B2 (zh)
KR (1) KR101459080B1 (zh)
CN (1) CN102458478B (zh)
AR (1) AR076892A1 (zh)
AU (1) AU2010251961B2 (zh)
BR (1) BRPI1011314A2 (zh)
CA (1) CA2763569C (zh)
DK (1) DK2435093T3 (zh)
ES (1) ES2587962T3 (zh)
HK (1) HK1164168A1 (zh)
HU (1) HUE030218T2 (zh)
IL (1) IL216626A (zh)
MX (1) MX2011012677A (zh)
PL (1) PL2435093T3 (zh)
PT (1) PT2435093T (zh)
RU (1) RU2533806C2 (zh)
TW (1) TWI524900B (zh)
WO (1) WO2010136487A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013177922A1 (zh) * 2012-05-29 2013-12-05 四川百利药业有限责任公司 一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽及基因疫苗
CN105315361A (zh) * 2014-07-29 2016-02-10 天津大学 一种酸化白蛋白及制备方法和在抑制β-淀粉样蛋白聚集的应用
CN108633278A (zh) * 2016-02-15 2018-10-09 艾拉科隆生物技术公司 淀粉样蛋白缀合物及其用途和方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013021353A1 (en) * 2011-08-11 2013-02-14 Bar-Ilan University Surface modified proteinaceous spherical particles and uses thereof
CN115715809A (zh) * 2022-11-24 2023-02-28 武汉禾元生物科技股份有限公司 重组人血清白蛋白-药物偶联物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005072777A2 (en) * 2004-01-28 2005-08-11 Curix Aps Conjugates of amyloid proteins as vaccines for amyloid-related diseases
WO2006121656A2 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease
US20070128191A1 (en) * 2001-12-26 2007-06-07 Universidad De Zaragoza Polyclonal antibodies, preparation method thereof and use of same

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6610493B1 (en) 1993-06-17 2003-08-26 Brigham And Women's Hospital Screening compounds for the ability to alter the production of amyloid-β peptide
US5955317A (en) 1993-01-25 1999-09-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibodies to β-amyloids or their derivatives and use thereof
DE69432629T3 (de) * 1993-01-25 2008-01-17 Takeda Pharmaceutical Co. Ltd. Antikörper gegen beta-amyloid oder derivative davon und seine verwendung
JP4374316B2 (ja) * 1993-01-25 2009-12-02 武田薬品工業株式会社 β−アミロイドまたはその誘導体に対する抗体およびその用途
US7427392B1 (en) 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
EP2305709A1 (en) 1997-04-09 2011-04-06 Intellect Neurosciences, Inc. Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods for use thereof
US6809186B1 (en) 1999-01-22 2004-10-26 Martek Biosciences Corporation Simple method for labeled conjugate production
US20040010134A1 (en) * 2000-04-12 2004-01-15 Rosen Craig A. Albumin fusion proteins
US6849714B1 (en) 1999-05-17 2005-02-01 Conjuchem, Inc. Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components
US6787637B1 (en) 1999-05-28 2004-09-07 Neuralab Limited N-Terminal amyloid-β antibodies
DE60114157T2 (de) 2000-02-21 2006-06-29 Pharmexa A/S Verfahren zur herabregulierung von amyloid
US6787636B1 (en) 2000-07-14 2004-09-07 New Century Pharmaceuticals, Inc. Modified serum albumin with reduced affinity for nickel and copper
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
WO2004018997A2 (en) 2002-08-20 2004-03-04 Neurogenetics, Inc. Methods and compositions for modulating amyloid beta
EP1572242B1 (en) 2002-12-13 2014-04-16 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
DE10303974A1 (de) 2003-01-31 2004-08-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Amyloid-β(1-42)-Oligomere, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
ES2246178B1 (es) * 2003-05-08 2007-03-01 Universidad De Zaragoza. Uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades amiloideas.
US20050255042A1 (en) 2003-11-24 2005-11-17 The Regents Of The University Of California Office Of Technology Transfer, University Of California On-demand cleavable linkers for radioconjugates for cancer imaging and therapy
MY144231A (en) 2003-12-17 2011-08-15 Wyeth Corp Aß IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
CA2550050A1 (en) 2003-12-18 2005-06-30 Novo Nordisk A/S Novel glp-1 analogues linked to albumin-like agents
AU2005248377B2 (en) 2004-05-25 2011-03-24 Medimmune, Llc Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
CA2604032C (en) 2005-04-06 2017-08-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
EP1937851A4 (en) 2005-10-19 2010-08-25 Ibc Pharmaceuticals Inc METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING BIOACTIVE GROUPS OF INCREASED COMPLEXITY AND THEIR USE
WO2008133208A1 (ja) * 2007-04-20 2008-11-06 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute ペプチド免疫応答増強方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070128191A1 (en) * 2001-12-26 2007-06-07 Universidad De Zaragoza Polyclonal antibodies, preparation method thereof and use of same
WO2005072777A2 (en) * 2004-01-28 2005-08-11 Curix Aps Conjugates of amyloid proteins as vaccines for amyloid-related diseases
WO2006121656A2 (en) * 2005-05-05 2006-11-16 Merck & Co., Inc. Peptide conjugate compositions and methods for the prevention and treatment of alzheimer's disease

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MONSONEGO A ET AL: "IMMUNE HYPORESPONSIVENESS TO AMYLOID BETA-PEPTIDE IN AMYLOID PRECURSOR PROTEIN TRANSGENIC MICE:IMPLICATIONS FOR THE PATHOGENESIS AND TREATMENT OF ALZHEIMER"S DISEASE", 《PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF USA,NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE,WASHINGTON,DC,US》, vol. 98, no. 18, 28 August 2001 (2001-08-28), pages 10273 - 10278, XP001153418, DOI: doi:10.1073/pnas.191118298 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013177922A1 (zh) * 2012-05-29 2013-12-05 四川百利药业有限责任公司 一种用于治疗阿尔兹海默症的多肽及基因疫苗
CN105315361A (zh) * 2014-07-29 2016-02-10 天津大学 一种酸化白蛋白及制备方法和在抑制β-淀粉样蛋白聚集的应用
CN108633278A (zh) * 2016-02-15 2018-10-09 艾拉科隆生物技术公司 淀粉样蛋白缀合物及其用途和方法
CN108633278B (zh) * 2016-02-15 2022-09-13 艾拉科隆生物技术公司 淀粉样蛋白缀合物及其用途和方法

Also Published As

Publication number Publication date
MX2011012677A (es) 2011-12-16
IL216626A (en) 2016-10-31
CN102458478B (zh) 2014-03-19
HUE030218T2 (en) 2017-04-28
AU2010251961B2 (en) 2013-11-28
US20140086945A1 (en) 2014-03-27
RU2011153023A (ru) 2013-07-10
EP2435093A1 (en) 2012-04-04
TWI524900B (zh) 2016-03-11
RU2533806C2 (ru) 2014-11-20
JP5985589B2 (ja) 2016-09-06
JP2015096512A (ja) 2015-05-21
TW201109033A (en) 2011-03-16
ES2587962T3 (es) 2016-10-27
US9023991B2 (en) 2015-05-05
BRPI1011314A2 (pt) 2016-03-15
EP2258398A1 (en) 2010-12-08
JP2012528111A (ja) 2012-11-12
KR20120052906A (ko) 2012-05-24
CA2763569C (en) 2014-10-28
WO2010136487A1 (en) 2010-12-02
AR076892A1 (es) 2011-07-13
US20120130049A1 (en) 2012-05-24
DK2435093T3 (en) 2016-08-15
CA2763569A1 (en) 2010-12-02
AU2010251961A1 (en) 2011-12-22
EP2435093B1 (en) 2016-06-29
KR101459080B1 (ko) 2014-11-07
JP5936539B2 (ja) 2016-06-22
HK1164168A1 (zh) 2012-09-21
US9163062B2 (en) 2015-10-20
PT2435093T (pt) 2016-08-08
IL216626A0 (en) 2012-02-29
PL2435093T3 (pl) 2016-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105263958B (zh) p97片段及其应用
ES2590679T3 (es) Glicopolisialilación de proteínas diferentes a proteínas de coagulación de la sangre
JP5555230B2 (ja) β−１，６−グルコサミンオリゴ糖を合成するための方法および組成物
TW200533679A (en) Aβ immunogenic peptide carrier conjugates and methods of producing same
RO122761B1 (ro) Vaccin multivalent antimeningococic conţinând polizaharid-proteină
CN102458478B (zh) 白蛋白-淀粉样肽缀合物及其用途
JPH0648956A (ja) ヒト免疫不全ウィルス感染・増殖抑制剤
ES2389775T3 (es) Producción y purificación de la proteína A sin emplear componentes de origen animal
CN104507496A (zh) 包含与crm197载体蛋白偶联的hiv gp41肽的免疫原性化合物
US5547674A (en) Pharmaceutical preparations derived from European mistletoe
CN105218660B (zh) 重组内皮抑素的新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用
KR100599176B1 (ko) 약리학적 활성 폴리펩티드-당 결합체
US20240123062A1 (en) Bivalent dengue/hepatitus b vaccines
WO1984002912A1 (en) Protein with oncostatic effect, process for its preparation, and oncostatic drug containing it
WO2023132795A2 (en) Modified bacterial glycans and conjugates thereof
JPH03173899A (ja) 生体由来のタンパク質
PT98381A (pt) Metodo para aumentar a resposta imune a antigenios com proteina de classe ii da membrana exterior de neisseria meningitidis

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: Zaragoza

Patentee after: Araclon Biotech, S.L.

Address before: Zaragoza

Patentee before: Araclon Biotech S. L.

CP01 Change in the name or title of a patent holder
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20140319

Termination date: 20210526

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee