CN105218660B

CN105218660B - 重组内皮抑素的新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用

Info

Publication number: CN105218660B
Application number: CN201410315038.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋永平; 蒋文宏; 任志华; 丁欣欣; 戴卫
Original assignee: Suzhou Fangzhou Gene Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Suzhou Ark Biomedicine Co ltd; Suzhou Ark Pharmaceutical R&d Co ltd
Priority date: 2014-07-03
Filing date: 2014-07-03
Publication date: 2019-02-12
Anticipated expiration: 2034-07-03
Also published as: CN105218660A

Abstract

本发明涉及重组内皮抑素的新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用。首次揭示一种新的重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体的复性和纯化方法。本发明的方法可成本低廉、得率高地获得纯化的rhED蛋白，其生物活性优异，药效显著。

Description

重组内皮抑素的新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用

技术领域

本发明涉及基因工程以及生物医药领域，更具体地，本发明涉及重组内皮抑素的新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用。

背景技术

抑制血管生成已经成为临床抗肿瘤治疗的新靶点。肿瘤的发生、生长和转移依赖于肿瘤周围的血管提供营养和途径，没有正常血供的肿瘤最大生长不超过1-2mm²。切断肿瘤组织的血液供应就有可能间接杀死肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞的转移，从而达到治疗肿瘤的目的。更重要的是，传统的细胞毒性化疗药物都会因剂量累积导致严重的细胞毒效应，并且由于肿瘤细胞本身的基因异质性导致耐药性的产生，极大地限制了此类化疗药物对肿瘤的治疗效果。因此联合使用血管生成抑制药成为了目前临床研究的新热点。

目前在临床试验期的重组人血管内皮细胞生长抑制素(rhEndostatin，rhED)多来源于真核酵母表达系统，造价高且产率低，极大地限制了该蛋白药物的临床推广使用。

原核表达系统产生的内皮抑素因复性困难，可溶性蛋白的得率极低，研究实验多采用包涵体直接注射的方法进行，限制了其治疗效果的有效性。

鉴于上述现有技术中原核表达以及酵母表达重组人内皮抑素的困难因素，目前中国已经上市的一种重组人内皮抑素其半衰期很短，仅2小时，极大地限制了其抗癌活性的发挥。

综上，本领域迫切需要开发成本低廉、得率高的大规模生产内皮抑素蛋白的表达和纯化方法。

发明内容

本发明的目的在于提供重组内皮抑素的新型纯化复性方法及其抗肿瘤应用。

在本发明的第一方面，提供一种从重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体蛋白制备可溶性蛋白的方法，所述方法包括：

(1)将重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体进行变性，获得变性溶液；

(2)将(1)的变性溶液进行柱纯化，获得经过柱纯化的溶液；

(3)应用透析液将(2)的经过柱纯化的溶液进行梯度透析；透析液包括：醋酸钠、尿素、甘氨酸、EDTA，透析液PH6.0±0.3；较佳地PH6.0±0.2。

在一个优选例中，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素的N末端起始密码子之后还包括三个氨基酸，依次为：精氨酸、甘氨酸和丝氨酸。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体溶解于盐酸胍中；较佳地，所述的盐酸胍浓度为6±0.5mol/L。

在另一优选例中，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素携带His纯化标签(较佳地，His纯化标签存在于其C端；更佳地位于C端终止子之前)；

并且，步骤(2)中，采用Ni-NTA柱纯化。

在另一优选例中，步骤(2)中，Ni-NTA柱纯化方法包括：

(a)清洗亲和柱，用8mol/L的尿素(较佳地5个柱体积，溶于磷酸盐缓冲液，PH8.0)平衡系统；

(b)以5ml/min的速度上样所述的变性溶液，上样结束后以PH6.0的磷酸钠(较佳地5个柱体积)洗脱杂蛋白；和

(c)以PH4.5的磷酸钠收集目的蛋白。

在另一优选例中，步骤(3)中，以mol/L为单位，所述的透析液包括：

透析液A：醋酸钠0.25，尿素3，甘氨酸0.5，EDTA0.4；

透析液B：醋酸钠0.25，尿素2，甘氨酸0.5，EDTA0.4；

透析液C：醋酸钠0.25，尿素1.5，甘氨酸0.5，EDTA0.4；

透析液D：醋酸钠0.25，尿素1，甘氨酸0.5，EDTA0.4；

透析液E：醋酸钠0.25，尿素0.5，甘氨酸0.5，EDTA0.4；

透析液F：醋酸钠0.2，甘氨酸0.25；

透析液G：醋酸钠0.2；

依次用透析液A-G透析1次，每次24±4；较佳地24±2小时。

在另一优选例中，透析袋内外液的比例为1:4-6，最佳地为1:5。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，还包括：利用大肠杆菌，通过IPTG诱导表达重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体。

在本发明的另一方面，提供一种重组人血管内皮细胞生长抑制素的用途，用于制备与细胞毒性化疗药物或放疗疗法联合应用以抑制肿瘤的药物组合物或药盒。

在一个优选例中，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素是利用前述任一所述的方法制备的。

在本发明的另一方面，提供一种抑制肿瘤的药盒，所述药盒包括：

(i)重组人血管内皮细胞生长抑制素；和

(ii)选自下组的化疗药物：顺铂或环磷酰胺。

在一个优选例中，所述的肿瘤包括：肺癌，肝癌，乳腺癌，黑色素瘤。

在另一优选例中，所述的药盒中，按照重量比，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素与顺铂的比例是：3～30:3；较佳地5～15:3；或

按照重量比，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素与环磷酰胺的比例是：3～30:15；较佳地5～15:15。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、rhED的表达和纯化。

A、SDS-PAGE胶分析。电泳条带分别是Lane1：预染分子量标记；Lane2：His亲和柱纯化rhED蛋白；Lane3：IPTG诱导的细菌全菌裂解液；Lane4：未经IPTG诱导表达的细菌全菌裂解液。

B、免疫印迹分析。电泳条带分别是Lane1：纯化的rhED；Lane2：IPTG诱导的细菌全菌裂解液；Lane3：未经IPTG诱导的全菌裂解液。

图2、rhED体外培养对人脐带血管内皮细胞(HUVEC)的生长抑制作用。

图3、rhED鸡胚尿囊膜血管生成抑制作用。

图4、rhED单独用药对荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用。

A、人肺癌A549荷瘤小鼠的用药效果；

B、肝癌QGY-7703荷瘤小鼠的用药效果；

C、乳腺癌Bcap37荷瘤小鼠的用药效果。

图5、rhED与传统细胞毒性化疗药物顺铂(A)，环磷酰胺(B)对裸鼠肺癌A549(A)和黑色素瘤B16(B)的协同抗肿瘤作用。

图6、rhED联合放疗对裸鼠肺癌A549细胞皮下移植瘤的抗肿瘤作用。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种新的重组人血管内皮细胞生长抑制素(rhEndostatin，rhED)包涵体的纯化和复性方法。本发明的方法可成本低廉、得率高地获得纯化的rhED蛋白，其生物活性优异，药效显著。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”、“基本上由……构成”和“由……构成”。

蛋白的表达和纯化

本发明人尝试了采用多种表达系统(如酵母系统，大肠杆菌系统)来表达rhED蛋白，结果发现大肠杆菌系统可以最为高效地获得大量rhED蛋白，且成本低廉，但是表达获得的是包涵体形式的蛋白。

原核表达系统(如大肠杆菌)以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，目前仍然是生产重组蛋白的首选表达系统。但是原核表达的蛋白当高效表达时一般以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物，如何高效地复性蛋白是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步。在大肠杆菌中表达的外源重组蛋白质包涵体，其蛋白质分子间主要通过非共价作用相互结合在一起，这些非共价作用包括疏水作用、范德华力、氢键以及离子键作用。包涵体溶解变性与复性是蛋白纯化过程中的最为关键的因素。

依托原核大肠杆菌表达系统从而高效(高产量)表达rhED是已经实现的技术，但其后续的复性和纯化方法确是阻碍其大规模生产及应用的难题。蛋白质的折叠方式可以测得，但是目前本领域对蛋白质折叠和聚集的机制尚不十分清楚，每种蛋白质都有自己特有的折叠方式和途径，因此对某种蛋白质的复性必须反复试验，个性化地建立相对优化、适合生产规模的方法。目前常用的复性方法主要包括：透析、稀释和超滤复性法，添加促进剂(如共溶剂、去污剂及表面活性剂、氧化-还原剂、小分子的添加剂、分子伴侣和折叠酶)的复性方法，液相色谱(LC)复性法，反胶束复性法，双水相复性法等。

因此，本发明人致力于对rhED包涵体的复性和纯化研究，摸索适合于该包涵体的复性和纯化方法。在研究之初，本发明人曾试图通过低温、低浓度IPTG诱导表达来降低包涵体的产生，但是表达结果显示这些方法对提高rhED的可溶表达并无明显效果，也即只能采取包涵体表达，后续进行变复性获得可溶性蛋白这一途径。之后，本发明人试图通过先变复性后纯化的方案进行包涵体向可溶性蛋白的转变，但是发现复性得率很低。在反复的研究试验中本发明人意外地发现，通过先对变性的包涵体复性液进行纯化，后续再进行透析的方法，可以极大地提高复性率，获得高活性的蛋白。并且，本发明人优化了透析液(用于复性和纯化)的配方以及pH值，从而极大地提高了蛋白的得率。

rhED的原核表达方法如下：

(a)将含有rhED编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；

(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达rhED的包涵体。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有编码目的蛋白的DNA序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

在基因工程菌表达了包涵体蛋白后，通常需要进行破菌(即：破碎大肠杆菌细胞)，从而释放出包涵体蛋白。破菌的方法没有特别的限制，例如超声破菌或高压均浆破菌。分离沉淀通常采取离心的方法。

在获得含有包涵体的沉淀后，优选地还包括洗涤的步骤，这样可以去除与包涵体混合在一起的脂质体、脂多糖、核酸或杂蛋白等杂质，有利于后续变复性的进行。

作为本发明的优选方式，在重组构建时，本发明人在rhED的C末端连接了蛋白标签如组氨酸标签(较佳地为6个组氨酸(6×His))，从而通过亲和柱分离的方法提纯、浓缩，大大的提高了纯化效率。

作为本发明的更优选方式，在重组构建时，本发明人在rhED的N末端加上精氨酸、甘氨酸和丝氨酸，提高了N末端的正电荷并相应的增加了该分子结合到细胞表面受体的亲和能力，从而有效延长了rhED在生物体内的生物活性半衰期，有效提高了抑制血管生成的药效。

包涵体的变性可以采用多种蛋白变性试剂，例如尿素和盐酸胍，其都可以实现将包涵体溶解的目的。对于rhED而言，优选地是采用盐酸胍变性。

因此，作为本发明的优选方式，采用盐酸胍进行变性；较佳地，采用6±1mol/L、更优选6±0.5mol/L盐酸胍溶液对rhED的包涵体进行变性。

本发明人在摸索过程中发现，在rhED变性后、复性前进行纯化，纯化的效果更佳，且有利于后续的复性；并且，配合优化的透析液(包含复性试剂)，有利于提高后续操作的简便性以及避免杂蛋白对rhED复性可能产生的影响，并且可极大地提高蛋白得率。

因此，作为一个优选的步骤，在对rhED进行变性后，进行蛋白的纯化，可以通过将rhED与特定的纯化Tag相连接，从而实现蛋白的纯化。作为本发明的一种优选方式，所述的rhED的羧基端(或氨基端)还可含有一个多肽片段，作为蛋白标签。例如，所述的标签可以是FLAG(序列DYKDDDK，相应抗体4E11)，HA(序列YPYDVPDYA，相应抗体12Ca5)，c-Myc(序列EQKLISEEDL，相应抗体9E10)，6-His(序列HHHHHH，相应抗体BAbCO)，等等。

作为本发明的优选方式，在蛋白的C端设置His标签，从而应用Ni柱纯化。电泳结果表明，在Ni柱进行纯化后，rhED蛋白的纯化效率达到85％以上，见很少杂蛋白带。

本发明人在摸索rhED的包涵体的复性条件时，发现pH对rhED的复性影响最大，具体体现为在PH6.0±0.3的弱酸性条件下rhED的复性效率较好，而在碱性条件下复性效率较低。

作为本发明的优选方式，采用透析的方法进行复性，以表2所示梯度浓度的透析液进行透析。较佳地，所述的透析在4℃进行。

复性实验结果表明，在上述透析条件下rhED的复性效率能达到96％以上。

rhED的药学应用

本发明人应用多种荷瘤鼠药效学实验结果显示，本发明人获得的rhED具有良好的生物活性，单独或联合化疗、放疗均可获得显著的肿瘤抑制效果。尤其是当其联合化疗或放疗应用时，抑瘤效果非常理想。

在本发明的具体实施例中，本发明人验证发现：(1)所获得的rhED对人肺癌A549、肝癌QGY-7703、乳腺癌Bcap37荷瘤小鼠进行单独用药均具有显著的抑瘤效果；(2)对人肺癌A549荷瘤小鼠联合传统化疗药物顺铂用药，具有明显的协同抑瘤药效；(3)对人肺癌A549荷瘤小鼠联合放疗，具有明显的协同抑瘤效果；(4)对B16黑色素瘤荷瘤小鼠联合环磷酰胺用药，具有明显的协同抑制肿瘤转移的效果。

基于本发明人的上述新发现，本发明还提供了一种用于抑制肿瘤的药盒，其中包括：(i)重组人血管内皮细胞生长抑制素；和(ii)选自下组的化疗药物：顺铂或环磷酰胺。

所述的药盒可应用于抑制各种肿瘤，只要该肿瘤必须依赖其周围的血管提供营养。所述肿瘤包括原位肿瘤或转移肿瘤。作为本发明的优选方式，所述的肿瘤包括但不限于：肺癌，肝癌，乳腺癌，黑色素瘤。

作为本发明的优选方式，所述的药盒中还包括使用说明书，以指导本领域人员采取适合的方法给药。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、获得rhED包涵体

设计的重组rhED的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；其cDNA如SEQ ID NO:1所示。与天然的序列相比，该重组rhED的ATG后面加上“AGA GGA TCC”编码精氨酸、甘氨酸和丝氨酸。序列的3’TGA的上游添加“CAC CAT CAT CAT CAT CAC”编码6×His。

带有rhED cDNA的pQE3表达载体的构建：利用基因合成方法获得上述rhED cDNA，将之插入到pQE3(QIAGEN USA)的BamHI和HindIII位点中。

将带有rhED cDNA的pQE3表达载体转染大肠杆菌(E.Coli M15)从而获得生产rhED的菌体，并用IPTG(0.25G/L)诱导表达，37℃培养4h，低温离心30min收获菌体并裂解收获重组rhED包涵体，溶解于6M盐酸胍溶液(0.05mol/L tris，5mmol/L EDTA，6mol/L盐酸胍，1％β-巯基乙醇，pH8.0)中，1g包涵体溶解于100ml6M盐酸胍中。IPTG诱导后未经纯化的全菌裂解液中目的蛋白rhED的含量约为50％

实施例2、rhED的纯化和复性方案优化

方案1、尿素梯度溶液透析-纯化的方案A

采用尿素梯度溶液透析的复性步骤：以稀释液(0.05mol/L tris，2mmol/LEDTA，3.5mol/L尿素，4mmol/L还原性谷胱甘肽(GSH)，0.4mmol/L氧化性谷胱甘肽(GSSG)，pH8.0)稀释溶解在盐酸胍中的包涵体溶液至0.3mg/mL，在4℃下依次用表1透析液A-G透析，每种透析液透析一次，每次24h，其中透析袋内外液的比例为3:20，内液为3.5M尿素醋酸钠缓冲液，外液(透析液)成分见表1。

表1

复性结束后，10000rpm离心15min，弃沉淀，上清即为复性后的rhED蛋白。取OD₅₉₅对应标准蛋白BSA浓度绘制标准曲线，得出曲线的回归方程，计算复性结束后蛋白溶液的浓度。计算复性率：复性率＝(复性后rhED的浓度/rhED包涵体溶解并稀释后蛋白浓度)×100％，并用12％胶浓度的SDS-PAGE检测。测得复性率为36％。

本发明人尝试了不同的方式用于rhED的蛋白纯化，包括阳离子交换色谱法和Ni-NTA柱亲和纯化法。其中，阳离子交换色谱法操作如下：首先对explorer系统用pH为8.0的0.05mol/Ltris-HCl进行冲洗，并确保系统及阳离子交换柱(Hi Trap5ml sp)中无气泡。设置程序，然后用5ml/min的速度上样复性后的rhED蛋白液并平衡柱子，在20个柱体积内用0～1mol/L的NaCl梯度洗脱吸附在柱子上的蛋白，收集洗脱的蛋白液，每试管2ml。最后根据explorer系统中的色谱图上显示的吸收峰，将纯化后的蛋白液分管SDS-PAGE检测，收集杂带少较纯净的几个试管内的rhED蛋白液并超滤浓缩至0.3mg/ml，最后将浓缩的蛋白液置于-80℃低温冰箱中存放。

经计算，应用阳离子交换色谱法最终得到rhED的复性和纯化后的得率为34％，即每升发酵液中可得纯化的ED蛋白500mg。

总结上述实验，可能是由于该重组蛋白的阴离子负荷较大，阻止了目的蛋白的完全洗脱，影响了纯化蛋白的得率。

方案2、尿素梯度溶液透析-纯化的方案

采用尿素梯度溶液透析的复性步骤：以稀释液(0.25mol/L醋酸钠，0.4mmol/LEDTA，3.5mol/L尿素，pH6.0)稀释溶解在盐酸胍中的包涵体溶液至0.3mg/ml，在4℃下依次用表1透析液A-G透析，每种透析液透析一次，每次24h，其中透析袋内外液的比例为3:20，内液为3.5M尿素醋酸钠缓冲液，外液(透析液)成分见下表2

表2

复性结束后，10000rpm离心15min，弃沉淀，上清即为复性后的rhED蛋白。取OD₅₉₅对应标准蛋白BSA浓度绘制标准曲线，得出曲线的回归方程，计算复性结束后蛋白溶液的浓度。计算复性率：复性率＝(复性后rhED的浓度/rhED包涵体溶解并稀释后蛋白浓度)×100％，并用12％胶浓度的SDS-PAGE检测。测得复性率约为48％。该实施方案较前述“方案1”降低了透析液的pH值，远离rhED等电点，从而增加了复性蛋白的得率。

复性结束后对rhED进行Ni-NTA亲和柱纯化：首先对25ml Ni-NTA亲和柱(购自GE公司)系统用十个柱体积的ddH₂O进行清洗，确保系统中没有气泡，随后用8M的尿素(5个柱体积，溶于磷酸盐缓冲液，PH8.0)平衡系统，随后以5ml/min的速度上样溶解在盐酸胍中的包涵体溶液，上样结束后以PH6.0的磷酸钠(5个柱体积)洗脱杂蛋白，随后以PH4.5的醋酸钠收集目的蛋白。对纯化后包涵体沉淀进行SDS-PAGE电泳，目的蛋白rhED纯化率可达96％以上。此纯化过程中未见蛋白沉淀析出。

本方案中，复性过程中因不断有蛋白析出而造成了目的蛋白的损失，复性率低于50％，同时，纯化效率较高，达到96％以上。总体而言仍然优于“方案1”的蛋白得率。

方案3、柱纯化-尿素梯度溶液透析的方案

His亲和柱纯化：首先对25ml亲和柱(Ni-NTA柱，GE公司)系统用十个柱体积的ddH₂O进行清洗，确保系统中没有气泡，随后用8M的尿素(5个柱体积，溶于磷酸盐缓冲液，PH8.0)平衡系统，随后以5ml/min的速度上样溶解在盐酸胍中的包涵体溶液，上样结束后以PH6.0的磷酸钠(5个柱体积)洗脱杂蛋白，随后以PH4.5的醋酸钠收集目的蛋白。对纯化后包涵体沉淀进行SDS-PAGE电泳，目的蛋白rhED含量可达包涵体重量的80％以上，且无杂蛋白条带出现。SDS-PAGE电泳结果如图1A；免疫印迹分析结果如图1B。

采用尿素梯度溶液透析的复性步骤：以3M尿素(包含于醋酸钠缓冲液中，PH4.5)稀释上述经纯化的蛋白液至0.3mg/ml，在4℃下依次用表2透析液A-G各透析1次，每次24h，其中透析袋内外液的比例为1:5，内液为3.5M尿素醋酸钠缓冲液，外液(透析液)成分见表3。

表3

透析后将目的蛋白液利用低温离心机离心15000rpm，20min后，取上清液利用超滤膜(购自Pall Life Sciences公司)浓缩目的蛋白到所需浓度(3mg/ml)并经0.22μm滤膜过滤灭菌后存放于4℃冰箱。

计算rhED的复性率，复性率达到96％以上。远优于目前文献报道的该重组蛋白的复性效率。

应用本方法最终得到rhED的复性和纯化后的得率为76.8％，即每升发酵液中可得纯化的ED蛋白1152mg。

实施例3、rhED抑制HUVEC细胞生长作用和鸡胚尿囊膜血管生成抑制作用

1、rhED抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)生长作用

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)由ATCC购入，在包含有10％热灭活胎牛血清和双抗的M199基础培养基中培养。生长抑制实验中，将HUVEC按照5×10³每孔，100μl体积接种于96孔板上，并分别用下述培养液(200μl体积)进行培养72小时：(1)，M199基础培养液+bFGF(5ng/ml)；(2)，(1)+0.1μg/ml rhED；(3)，(1)+0.2μg/ml rhED；(4)，(1)+0.5μg/ml rhED；(5)，(1)+1μg/ml rhED；(6)，(1)+2μg/ml rhED；(7)，(1)+5μg/ml rhED；(8)，(1)+8μg/ml rhED；(9)，(1)+16μg/mlrhED。随后每孔加入20μl MTT(5％)，孵育4小时后弃掉，并用100μl DMSO在震荡仪上震荡15分钟，测定570nm处吸光度值(比色计，(Bio-Rad，USA))。所用rhED为前述实施例2制备及复性纯化(“方案3”)。

结果如图2所示，可见，应用本发明优化的方法纯化的rhED，其能够高效地抑制HUVEC细胞生长。

2、鸡胚尿囊膜血管生成抑制作用

购买白壳种蛋，用75％(v/v)酒精消毒蛋壳表面，鸡蛋大头端朝上与蛋托呈45°放置，于37℃，55％相对空气湿度下孵育，每天翻动3次(早中晚各一次)。

鸡胚孵育至第3天时，无菌条件下，在鸡蛋大头端非气室处开一小窗，抽取2～3ml的蛋清。抽取蛋清结束后，在开窗处加盖一玻璃小片，放回孵育温箱，大头端朝上，并与蛋托呈45°)。此后继续孵育鸡胚，但不再翻动，每天观察，及时去除死胚，以免对健康小鸡造成不良影响。

孵育至第7天，无菌条件下，扩大已开的小窗，撕去开窗处壳膜(注：勿伤及绒毛尿囊膜)。设置实验组与阴性对照组，阴性对照组为生理盐水(20μL/枚)，实验组为实施例2“方案3”纯化的rhED溶液(0.3g/L，20μL/枚)，加样载体是直径为5mm的中速定性滤纸，置该加样载体于血管较细、密度较小部位。加样完毕后，用无菌封口膜封住窗口，把对照组和实验组放回温箱，37℃，55％相对空气湿度，但不再翻动，并每天加药一次(20μL/枚)。

孵育至第10天，揭除封口膜扩大窗口，观察血管生长状况，并拍照记录结果；加入固定液(甲醇：丙酮＝1：1)，室温下固定20min，以加样小碟为中心剪下半径为1cm的绒毛尿囊膜。固定于中速定性滤纸，并于解剖镜下计数载体边缘血管数。

用SPSS16.0统计软件对所得实验组和阴性对照组的数据做单因素方差分析，以确定所得结果是否具有统计学意义。

结果如图3A-C所示，可见，用本发明的方法(实施例2“方案3”)纯化的rhED，其能够极其显著地抑制鸡胚尿囊膜血管生成。

实施例4、rhED(实施例2“方案3”制备获得)实验抗肿瘤药效

1、建立荷瘤小鼠动物模型

分别将6×10⁶个A549人肺癌细胞(购自ATCC)、肝癌QGY-7703细胞(购自中国科学院上海生化细胞所细胞库)、和乳腺癌Bcap37细胞(购自中国科学院上海生化细胞所细胞库)皮下接种到BALB/c裸鼠(4-5周龄，雄性，体重：16-25g，N＝150只/每组，上海斯莱克实验动物有限公司)中，裸鼠以每笼4-5只在恒温恒湿层流环境中生长(温度：22-26℃，湿度：55-65％，12h光照与12h黑暗循环)。接种后约14天，实体瘤体积达到170mm³左右，即开始rhED药效实验研究。

2、单独抗肿瘤药效研究

前述制备的荷瘤小鼠，在实体瘤体积达到170mm³左右时，将rhED按照2.5，5，10mg/ml的剂量进行静脉给药，每天2次，连续15天。阴性对照组给予与高剂量等体积等浓度的相应溶剂，给药方案同实验组，阳性对照为顺铂2mg/ml，每天一次，连续七天)。

结果显示，高剂量rhED组对以上三种人异种移植肿瘤均有45％左右的抑瘤效果，中等剂量组也具有35-40％之间的肿瘤抑制率，见图4。

3、联合化疗药物抑制肿瘤生长作用

荷瘤小鼠模型建立同上，A549人肺癌细胞接种20天后选取瘤体平均体积在170mm左右的90只裸鼠随机分成9组，每组均为10只按照表4方案开始治疗，记作第0天。

表4、rhED合并顺铂对裸鼠肺癌A549细胞皮下移植瘤抑制作用

的实验分组给药方法和给药方案

组别	处理因素	剂量mg/kg/d	给药方案
				1	0.9％NaCl	-	sc×15bid
2	rhED	5	sc×15bid
				3	rhED	10	sc×15bid
4	rhED	15	sc×15bid
				5	DDP+rhED	3(DDP)，5(rhED)	ip×7qod+sc×15bid
6	DDP+rhED	3(DDP)，10(rhED)	ip×7qod+sc×15bid
				7	DDP+rhED	3(DDP)，15(rhED)	ip×7qod+sc×15bid
8	Endostar	5	sc×15bid
				9	DDP	3	ip×7qod

结果显示，rhED在各个剂量(5mg/kg/d、10mg/kg/d、15mg/kg/d)联合顺铂(DDP，3mg/kg)的抑瘤率为分别是54.24％，47.26％和60.66％，远优于同等剂量单独给药组的抑瘤效果(分别是28.76％，28.88％，32.43％)，并优于市售同类药品的抑瘤率(22.49％)，DDP组的抑瘤率为45.19％，见图5A。

4、联合化疗抑制肿瘤转移作用

建立小鼠肺肿瘤转移模型：对BALB/c裸鼠尾静脉接种B16黑色素瘤细胞2.5×10⁵/ml，0.2ml/鼠，次日按照下表中的实验方案给药(表5)，并在3周后处死小鼠收集肺脏，计数每组每只小鼠肺脏所转移的集落数。

表5、rhED合并环磷酰胺对裸鼠黑色素瘤B16肺脏转移抑制作用的实验分组给药方法和给药方案

组别	处理因素	剂量mg/kg/d	给药方案
				1	0.9％NaCl	-	iv×15bid
2	rhED	2.5	iv×15bid
				3	rhED	5	iv×15bid
4	rhED	10	iv×15bid
				5	CTX+rhED	15(CTX)，5(rhED)	ip×7qod+iv×15bid
6	CTX rhED	15(CTX)，10(rhED)	ip×7qod+iv×15bid
				7	CTX+rhED	15(CTX)，15(rhED)	ip×7qod+iv×15bid

结果如图5B。结果显示，rhED在各个剂量(2.5mg/kg/d、5mg/kg/d、10mg/kg/d)联合环磷酰胺(CTX，15mg/kg)的抑瘤率为分别是65.93％，70.94％，和77.15％，远优于同等剂量单独给药组的抑瘤效果(分别是29.26％，29.66％，34.87％)，也显著优于CTX(15mg/kg)单独给药的抑瘤率(59.32％)。显示了rhED联合化疗的增效的效果。

5、联合放疗抑瘤作用

A549人肺癌细胞接种荷瘤小鼠模型建立同上，接种20天后选取瘤体平均体积在170mm左右的80只裸鼠随机分组，每组10只开始按照下表治疗，记作第0天。X射线照射：6MVX线直线加速器，源皮距100cm，剂量率2Gy/min(总剂量10Gy，一次性照射)，照射前将裸鼠以4％水合氯醛麻醉，照射时将裸鼠置于自制装置内，与外界空气隔绝，只照射裸鼠移植瘤部位，其他部位挡铅(表6)。

表6、rhED合并放疗对裸鼠肺癌A549细胞皮下移植瘤抑制作用的实验分组给药方法和给药方案

结果如图6。结果显示，放疗联合rhED在各个剂量(5mg/kg/d、10mg/kg/d、15mg/kg/d)的抑瘤率为分别是42.09％，46.56％，和60.91％，远优于同等剂量单独给药组的抑瘤效果(分别是12.76％，15.12％，11.25％)，优于单独放疗组，并显著优于rhED单独用药组，表明rhED联合放疗对人肺癌A549细胞裸鼠皮下移植瘤具有明显的抑制效应。

实施例5、药盒

制备一种药盒1，其中含有：

容器1，其中放置本发明前述制备的可溶性rhED溶液或其粉针剂；

容器2，其中放置顺铂；

其中，按照重量比，可溶性rhED溶液或其粉针剂与顺铂的比例为5:1。

制备一种药盒2，其中含有：

容器2，其中放置本发明前述制备的可溶性rhED溶液或其粉针剂；

容器2，其中放置环磷酰胺；

其中，按照重量比，可溶性rhED溶液或其粉针剂与顺铂的比例为1:1。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种从重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体蛋白制备可溶性蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体进行变性，获得变性溶液；所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示；

(2)将(1)的变性溶液进行柱纯化，获得经过柱纯化的溶液；

(3)依次应用透析液A～G将(2)的经过柱纯化的溶液进行梯度透析；透析液pH6.0±0.3；

其中，透析液A为醋酸钠、尿素、甘氨酸和EDTA组成的溶液；透析液B为醋酸钠、尿素、甘氨酸和EDTA组成的溶液；透析液C为醋酸钠、尿素、甘氨酸和EDTA组成的溶液；透析液D为醋酸钠、尿素、甘氨酸和EDTA组成的溶液；透析液E为醋酸钠、尿素、甘氨酸和EDTA组成的溶液；透析液F为醋酸钠和甘氨酸组成的溶液；透析液G为醋酸钠溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述变性是将重组人血管内皮细胞生长抑制素包涵体溶解于盐酸胍中。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的盐酸胍浓度为6±0.5mol/L。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的重组人血管内皮细胞生长抑制素携带His纯化标签；

并且，步骤(2)中，采用Ni-NTA柱纯化。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，Ni-NTA柱纯化方法包括：

(a)清洗亲和柱，用8mol/L的尿素平衡系统；

(b)以5ml/min的速度上样所述的变性溶液，上样结束后以pH6.0的磷酸钠洗脱杂蛋白；和

(c)以pH4.5的磷酸钠收集目的蛋白。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，以mol/L为单位，所述的透析液为：

透析液A：醋酸钠0.25，尿素3，甘氨酸0.5，EDTA 0.4；

透析液B：醋酸钠0.25，尿素2，甘氨酸0.5，EDTA 0.4；

透析液C：醋酸钠0.25，尿素1.5，甘氨酸0.5，EDTA 0.4；

透析液D：醋酸钠0.25，尿素1，甘氨酸0.5，EDTA 0.4；

透析液E：醋酸钠0.25，尿素0.5，甘氨酸0.5，EDTA 0.4；

透析液F：醋酸钠0.2，甘氨酸0.25；

透析液G：醋酸钠0.2；

依次用透析液A-G透析1次，每次24± 4小时。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，依次用透析液A-G透析1次，每次24± 2小时。