CN1603405A - 高纯度蚓激酶的制备方法及由其制备的药物制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高纯度蚓激酶的制备方法及以其为原料药的制剂。本发明通过采用单克隆抗体技术实现蚓激酶活性组分的再纯化，从而得到高纯度蚓激酶，该方法的特点是所获酶的专一性强，活性高，达到每毫克蛋白20万单位以上；经高效液相色谱测试为单一组分；在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带，分子量为32000±2000道尔顿；氨基酸序列分析，N－末端10个氨基酸序列为：Ile－Val－Gly－Gly－Ile－Glu－Ala－Arg－Pro－Tyr，以所述高纯度蚓激酶为原料药可以制成可供口服、肌注、以及静脉注射与静脉输液多种途径给药的制剂，用于血栓性疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及蚓激酶的制备方法，更具体地说，涉及高纯度蚓激酶的制备方法和由其制备的可供口服、肌注及静脉给药的多种剂型的药物制剂。
背景技术
血栓性疾病的高发病率、高死亡率及高致残率严重威胁人类的生存，溶栓性药物是治疗该病的首选用药。目前临床上使用的溶栓性药物中普遍存在易引起出血的副作用；有的价格昂贵，一般百姓难以承受；有的稳定性较差，保存条件要求较高，给用药者带来很多不便；有的品种给药方式单一，只有口服、或只有静脉或肌肉注射，使用药范围受到很大限制。
蚯蚓在中药中统称为地龙，可分为双胸蚓(Bimastos)、赤子爱胜蚓(Eisenia Foetida Sarigny)、锯齿远蚓(Amynthasdancataa)及参环毛蚓(广地龙)等不同种属，在我国早已被列入药源，其中作为活血化瘀应用已有几千年的历史。研究表明，新鲜的蚯蚓体内含有多种蛋白酶类，其中一组具有强烈溶解纤维蛋白及血栓作用的丝氨酸蛋白酶由日本Mihara等于八十年代首次发现，命名为蚓激酶(Thromb Heamostas 1983，50：258～263)，由此引起了国内外诸多学者的关注，开始了对蚓激酶从分离纯化和理化性质到药效学研究与临床应用等方面的广泛研究。大量的研究证实蚓激酶广泛存在于不同种属蚯蚓体内，是一组富含酸性氨基酸，等电点pl3～5，分子量20000～40000道尔顿，具有激酶和纤溶酶双重功能的丝氨酸蛋白酶：它既可类似纤溶酶直接降解纤维蛋白及纤维蛋白原，又类似尿激酶、链激酶等激活纤溶酶原形成纤溶酶，起到纤溶酶原激活剂的作用。蚓激酶的最大特点是稳定性好，纤溶活性强，药理作用明显，副作用小，可做成各种剂型的药品，且来源广泛，具有广泛开发价值。近20年来，不少单位的研究人员都在力求将蚓激酶的研究推向实际应用，先后有各种各样的分离纯化技术问世，但是直到目前为止，还没有一套成熟的制备高纯度蚓激酶技术真正转化为生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度蚓激酶的制备方法，该方法的特点是得到的高纯度蚓激酶的比活达到每毫克蛋白20万单位以上；经高效液相色谱测试为单一组分；在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带，分子量为32000±2000道尔顿；氨基酸序列分析，N-末端10个氨基酸序列为：
Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr
本发明的再一个目的在于提供以高纯度蚓激酶为原料药制成的可供口服、肌注、以及静脉注射与静脉输液多种途径给药的药物制剂。
本发明公开一种高纯度蚓激酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)蚓激酶粗品的提取：取鲜活蚯蚓用水洗净，加入食盐处理；加入pH6.8～8.3的缓冲液，用胶体磨制备匀浆；将匀浆液速冻，再融化；将匀浆液加热，去除对热不稳定的杂蛋白；将匀浆液离心，取上清液；上清液经超滤浓缩，截留分子量为10000～50000道尔顿的组分，冷冻干燥即为蚓激酶粗品。
(2)蚓激酶粗品的纯化：将步骤(1)中的蚓激酶粗品溶于缓冲液中，离心，取上清液用离子交换层析分离，得到活性组分；
(3)蚓激酶活性组分的再纯化：将步骤(2)中的蚓激酶活性组分用亲和层析平衡缓冲液溶解，用单克隆抗体亲合层析柱进行再纯化，用缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，再用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，冷冻干燥得到高纯度的蚓激酶。
本发明公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，蚯蚓包括双胸蚓、赤子爱胜蚓、参环毛蚓或锯齿远蚓。
本发明公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸。
本发明公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，步骤(2)中离子交换层析采用羧甲基葡聚糖凝胶柱、二乙氨基葡聚糖凝胶柱或琼脂糖凝胶柱层析，先用缓冲液平衡脱洗，再用含有0～0.5mol/LNaCl缓冲液进行梯度洗脱。
本发明公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，步骤(3)中单克隆抗体亲和层析柱是由蚓激酶抗体偶联到经过溴化氰活化处理的羧甲基葡聚糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶的多糖基质上制得的。
本发明公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，蚓激酶抗体由如下步骤制备得到：用高效液相色谱纯化并经定性的蚓激酶与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对小鼠皮下注射免疫；取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠骨髓瘤细胞混合，加入分子量为40000～60000聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多孔细胞培养板孔内；将接种细胞混合液的细胞培养板置于CO2培养箱内培养，按时间阶段选择不同的培养基；收集细胞分泌液，对单克隆抗体进行筛分得到稳定的蚓激酶抗体。
本发明公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠骨髓瘤细胞按5～10∶1的比例混合。
本发明公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，培养基的选择按照第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基。
按照另一方面，本发明公开一种由上述方法制得的高纯度蚓激酶，其比活达到每毫克蛋白20万单位以上；经高效液相色谱测试为单一组分；在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带，分子量为32000±2000道尔顿；氨基酸序列分析，N-末端10个氨基酸序列为：
Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr
按照又一方面，本发明还公开了由本发明的高纯度蚓激酶为原料药制备的药物制剂，其包含有治疗有效量的本发明的高纯度蚓激酶、药学上可接受的药用辅料。使用常用的药物制剂的制备方法可以制成下列剂型的药物制剂：
(1)蚓激酶口服肠溶剂(片剂、胶囊等)；
(2)蚓激酶注射液；
(3)注射用蚓激酶；
(4)静脉注射用蚓激酶；
(5)冻干静脉注射用蚓激酶。
本发明公开的高纯度蚓激酶的制备方法中，采用单克隆抗体技术实现蚓激酶活性组分的再纯化。单克隆抗体技术是将具有分泌特定抗体能力的B淋巴细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。通过有限稀释法从杂交瘤细胞中筛选出特定的一个细胞集落(即克隆)，再由该集落的细胞不断培养增殖而形成细胞系，由此细胞分泌的抗体即为单克隆抗体。单克隆抗体的主要特点是：①抗体的分子结构高度均一，甚至氨基酸序列及空间构型均相同；②抗体识别的是抗原分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此具有高度特异性；③产生抗体的细胞是无性细胞系，可长期传代并保存，因此只要该细胞系建立，便可持续稳定地生产同一性质的抗体。
通过本发明公开的制备方法得到的高纯度蚓激酶，其纤溶活性达到每毫克蛋白20万单位以上；依照电泳法(中国药典2000年版二部附录V F第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)显示为一条带，分子量应为32000±2000道尔顿；依照高效液相色谱法测定(中国药典2000年版二部附录VI H)，呈现一个峰的水平，电泳法和高效液相色谱法(HPLC)测定结果都表明高纯度蚓激酶为单一组分；氨基酸序列分析，N-末端10个氨基酸序列为：
Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr；经琼脂糖-纤维蛋白平板法测定，高纯度蚓激酶样品出现的纤溶圈比同样浓度的蚓激酶标准品更为清晰。
取高纯度蚓激酶，用氯化钠注射液制成每1ml含20000单位的溶液，按热原检查法(中国药典2000年版二部附录XI D)，家兔每1kg体重注射1.0ml，应符合规定；取高纯度蚓激酶，加氯化钠注射液制成每1ml中含20000单位的溶液，按异常毒性检查法(中国药典2000年版二部附录XI C)，静脉注射给药，应符合规定；取高纯度蚓激酶，用氯化钠注射液制成每1ml中含5000单位的溶液进行过敏试验。试验方法：取体重250-350g豚鼠6只，间日腹腔注射供试品溶液0.5ml，连续3次。然后将动物分成两组，每组3只，分别在第一次注射后第14日及第21日静脉注射供试品溶液1.0ml进行攻击。仔细观察注射后15min内豚鼠的反应，均不得出现过敏性反应。如有竖毛、呼吸困难、喷嚏、干呕或咳嗽3声等现象中的两种或两种以上者；或啰音、抽搐、虚脱或死亡现象之一者，应判为阳性。
经鉴定，高纯度蚓激酶的热原、异常毒性和过敏检查均符合规定。
附图说明
图1为蚓激酶粗品提取工艺流程图；
图2为蚓激酶粗品纯化和活性组分再纯化工艺流程图；
图3为注射用蚓激酶和冻干静脉注射用蚓激酶制剂生产工艺流程图；
图4为蚓激酶注射液和静脉注射用蚓激酶制剂生产工艺流程图；
图5为蚓激酶肠溶胶囊生产工艺流程图；
图6为蚓激酶肠溶片生产工艺流程图；
图7为蚓激酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；
图8为蚓激酶高效液相色谱图；以及
图9-A、9-B和9-C为蚓激酶效价测定琼脂糖-纤维蛋白平板图谱。
具体实施方式
实施例1～3为单克隆抗体亲和层析柱的制作方法。
实施例1
用高效液相色谱纯化并经定性的蚓激酶50μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。
取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠sp2/10骨髓瘤细胞按5∶1的比例混合，加入分子量40000的50％聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多块96孔细胞培养板孔内。
将接种细胞混合液的细胞培养板置于CO2培养箱内培养。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基培养。收集细胞分泌液，用酶联免疫法对单克隆抗体进行筛选及效价测定，将分泌特异性蚓激酶抗体的细胞挑选出来传代培养，建立细胞系，由此可获得稳定的抗体。
用溴化氰活化4B-Sepharose琼脂糖凝胶，把得到的蚓激酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成单克隆抗体亲和层析柱。
实施例2
用高效液相色谱纯化并经定性的蚓激酶250μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。
取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠sp2/10骨髓瘤细胞按8∶1的比例混合，加入分子量50000的50％聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多块96孔细胞培养板孔内。
将接种细胞混合液的细胞培养板置于CO2培养箱内培养。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基培养。收集细胞分泌液，用酶联免疫法对单克隆抗体进行筛选及效价测定，将分泌特异性蚓激酶抗体的细胞挑选出来传代培养，建立细胞系，由此可获得稳定的抗体。
用溴化氰活化二乙氨基葡聚糖凝胶，把得到的蚓激酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成单克隆抗体亲和层析柱。
实施例3
用高效液相色谱纯化并经定性的蚓激酶500μg/ml与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对7周龄的BALB/c小鼠皮下注射免疫，每次0.2ml，每周1次，共免疫6次。在融合前3天取0.2ml刺激物小鼠尾静脉注射加强免疫。
取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠sp2/10骨髓瘤细胞按10∶1的比例混合，加入分子量60000的50％聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多块96孔细胞培养板孔内。
将接种细胞混合液的细胞培养板置于CO2培养箱内培养。第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基培养。收集细胞分泌液，用酶联免疫法对单克隆抗体进行筛选及效价测定，将分泌特异性蚓激酶抗体的细胞挑选出来传代培养，建立细胞系，由此可获得稳定的抗体。
用溴化氰活化羧甲基葡聚糖凝胶，把得到的蚓激酶抗体偶联到多糖基质上，从而制成单克隆抗体亲和层析柱。
实施例4
称取10kg鲜活太平二号-赤子爱胜蚓置不锈钢桶内，用水洗净泥沙，加100g食盐搅拌10～20nin，再用水清洗干净。取出后在胶体磨中加10升0.05mol/L磷酸盐缓冲液制备匀浆。匀浆液放-20℃冷冻过夜，次日取出置水浴中尽快融化，反复3次。第3次融化后先加热至50℃保持20min，再继续加热至80℃保持5min，迅速在冰水中冷却至室温。3000rpm离心30min，取上清。沉淀加5升同样缓冲液搅拌30min，再次离心，合并两次离心得到的上清液。
先用50K超滤器超滤取透过液，再用10K超滤器超滤浓缩到1升左右，加10升0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)离子交换层析缓冲液继续超滤浓缩到500ml左右，在4℃3500rpm离心10min，取上清液上羧甲基葡聚糖凝胶离子交换层析柱，用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液平衡至基线平稳，用含有0.1mol/L氯化钠的上述缓冲液洗脱，收集各组分。经HPLC分析，取保留时间8～10min收集的各组分样品，用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测，将出现溶圈具有纤溶活性的组分合并，用10K超滤器浓缩到1升左右，加10升亲和层析平衡缓冲液，继续超滤浓缩至200～300ml，上实施例1中的亲和层析柱，再用2倍柱床体积Tris-HCl亲和层析平衡缓冲液平衡至基线平稳，改用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱。分别收集各洗脱峰。同离子交换层析法鉴定收集到的各组分的纤溶活性。
经活性检测，收集的第2峰具有很高的纤溶活性，取2峰组分适当稀释，用高效液相色谱法检测，获得单组分图谱，其保留时间为9.586min，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为33000道尔顿。
热原、异常毒性、过敏检查，均符合规定。
实施例5
称取10kg鲜活双胸蚓，用饮用水洗净泥沙，加200g食盐搅拌10～20nin，再用水洗净。取出后在胶体磨中加15升0.05mol/L Tris-HCl缓冲液制备匀浆。匀浆液放-20℃冷冻过夜，次日取出置水浴中尽快融化，反复3次。第3次融化后先加热至50℃保持25min，再继续加热至80℃保持4min，迅速在冰水中冷却至室温。3500rpm离心20min，取上清。沉淀加5升同样缓冲液搅拌30min，再次离心，合并两次离心得到的上清液。
先用50K超滤器超滤取透过液，再用10K超滤器超滤浓缩到500ml左右，调pH值至7.8，在4℃3500rpm离心10min，上清液上二乙氨基葡聚糖凝胶(DEAE-Sephadex A-50)离子交换层析柱，用0.05mol/L磷酸盐缓冲液平衡至基线平稳，用含有0.3mol/L氯化钠的上述缓冲液洗脱，收集各组分。经HPLC分析，取保留时间8～10min收集的各组分样品，用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测，将出现溶圈具有纤溶活性的组分合并，用10K超滤器浓缩到1升左右，加10升亲和层析平衡缓冲液，继续超滤浓缩至200～300ml，上实施例2中的亲和层析柱，再用2倍柱床体积Tris-HCl亲和层析平衡缓冲液平衡至基线平稳后，改用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱，分别收集各洗脱峰。同离子交换层析法鉴定收集到的各组分的纤溶活性。
经活性检测，收集的第2峰具有很高的纤溶活性，取2峰组分适当稀释，用高效液相色谱法检测，获得单组分图谱，其保留时间为9.711min，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为32000道尔顿。
热原、异常毒性、过敏检查，均符合规定。
实施例6
称取10kg鲜活钜齿远蚓，用饮用水洗净泥沙，加300g食盐搅拌10～20nin，再用水清洗干净。取出后在胶体磨中加20升0.02mol/L磷酸盐缓冲液制备匀浆。匀浆液放-20℃冷冻过夜，次日取出置水浴中尽快融化，反复3次。第3次融化后先加热至50℃保持30min，再继续加热至80℃保持2min，迅速在冰水中冷却至室温。4000rpm离心15min，取上清，沉淀加5升同样缓冲液搅拌30min，再次离心，合并两次离心得到的上清液。
先用50K超滤器超滤取透过液，再用10K超滤器超滤浓缩到1升左右，加10升0.02mol/L Tris-HCl离子交换层析缓冲液，继续浓缩至500ml左右，在4℃3500rpm离心10min。上清液上琼脂糖凝胶离子交换层析柱，用0.02mol/LTris-HCl缓冲液平衡至基线平稳，用含有0.4mol/L氯化钠的上述缓冲液洗脱，收集各组分。经HPLC分析，取保留时间8～10min收集的各组分样品，用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测，将出现溶圈具有纤溶活性的组分合并，用10K超滤器浓缩到1升左右，加10升磷酸盐亲和层析平衡缓冲液，继续超滤浓缩至200～300ml，上实施例3中的亲和层析柱，再用2倍柱床体积亲和层析平衡缓冲液平衡至基线平稳后，改用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱。分别收集各洗脱峰。同离子交换层析法鉴定收集到的各组分的纤溶活性。
经活性检测，收集的第2峰具有很高的纤溶活性，取2峰组分适当稀释，用高效液相色谱法检测，获得单组分图谱，其保留时间为9.693min，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为32200道尔顿。
热原、异常毒性、过敏检查，均符合规定。
实施例7
称取10kg鲜活参环毛蚓(广地龙)，用饮用水洗净泥沙，加500g食盐搅拌10～20nin，再用水清洗干净。取出后在胶体磨中加30升0.02mol/L磷酸盐缓冲液制备匀浆。匀浆液放-20℃冷冻过夜，次日取出置水浴中尽快融化，反复3次。第3次融化后先加热至50℃保持40min，迅速在冰水中冷却至室温。3500rpm离心25min，取上清，沉淀加5升同样缓冲液后搅拌30min，再次离心，合并两次离心得到的上清液。
先用50K超滤器超滤取透过液，再用10K超滤器超滤浓缩到500ml左右，调pH值至8.8。在4℃3500rpm离心10min，上清液上DEAE-Sephadex A-50离子交换层析柱，用0.02mol/L Tris-HCl缓冲液平衡至基线平稳，用含有0.5mol/L氯化钠的上述缓冲液洗脱，收集各组分。经HPLC分析，取保留时间8～10min收集的各组分样品，用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测，将出现溶圈具有纤溶活性的组分合并。用10K超滤器浓缩到1升左右，加10升亲和层析平衡缓冲液，继续超滤浓缩至200～300ml，上实施例3中的亲和层析柱，用2倍柱床体积Tris-HCl亲和层析平衡缓冲液平衡至基线平稳后，改用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱，分别收集各洗脱峰，同离子交换层析法鉴定收集到的各组分的纤溶活性。
经活性检测，收集的第2峰具有很高的纤溶活性，取2峰组分适当稀释，用高效液相色谱法检测，获得单组分图谱，其保留时间为9.806min，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为30500道尔顿。
热原、异常毒性、过敏检查，均符合规定。
实施例8为注射用蚓激酶与冻干静脉注射用蚓激酶制剂生产工艺。
图3为注射用蚓激酶与冻干静脉注射用蚓激酶制剂生产工艺流程图。
首先，在局部百级洁净区内按配制处方将蚓激酶原料药与白蛋白、磷酸盐、氯化钠、右旋糖酐等辅料准确称量在配液容器内；加注射用水充分溶解或稀释，搅拌混匀后，得到制剂中间体；除菌过滤，其中过滤前后应对除菌过滤系统进行完整性测试。然后，将过滤后的中间体按装量装入抗生素瓶，在分装过程中应进行至少4次装量检查，保证每一只瓶内装入的药量准确。最后，将装入药品的抗生素瓶码在冻干箱各层的隔板上，按照品种冻干曲线进行速冻至零下20～30℃，维持8小时；然后抽真空，在真空状态下缓慢升温至35～40℃，保持一定时间，再降至室温后取出。压塞、轧盖得成品。经过成品质量检验合格后，进行包装，入成品库存放。
实施例9为蚓激酶注射液与静脉注射用蚓激酶制剂生产工艺。
图4为蚓激酶注射液与静脉注射用蚓激酶制剂生产工艺流程图。
首先，在局部百级洁净区内按配制处方将蚓激酶原料药与白蛋白、磷酸盐、氯化钠等辅料准确称量在配液容器内；加注射用水充分溶解或稀释，搅拌混匀后，得到制剂中间体；除菌过滤，其中过滤前后应对除菌过滤系统进行完整性测试。然后，将过滤后的中间体按装量装入抗生素瓶同时压塞、轧盖即得成品，在分装过程中应进行至少4次装量检查，保证每一只瓶内装入的药量准确。最后，经过成品质量检验合格后，进行包装，入成品库存放。
实施例10为蚓激酶肠溶胶囊制剂生产工艺。
图5为蚓激酶肠溶胶囊制剂生产工艺流程图。
首先，在十万级洁净区内将蚓激酶原料药与淀粉、乳糖、硬酯酸、滑石粉、明胶等辅料准确称量在制剂容器内，充分混合均匀，得到制剂中间体。然后，取外观、长度、厚度、臭味、水分、脆碎度、融化时限、炽灼残渣及微生物学检查均符合规定的胶囊壳，填充中间体药粉，得到半成品。最后盖上胶囊上节、压平打光，制得成品。经过成品质量检验合格后，用玻璃瓶或塑料瓶密闭包装，入成品库，放置在阴凉干燥处，温度不得超过25℃，相对湿度不得超过45％。
实施例11为蚓激酶肠溶片生产工艺。
图6为蚓激酶肠溶片生产工艺流程图。
首先，在十万级洁净区内将蚓激酶原料药与乳糖、淀粉浆、羧甲基纤维素钠等辅料准确称量在制剂容器内，充分混合均匀，得到制剂中间体。然后，进行制粒与压片，在压片过程中随时注意片剂的外观，定时抽查药片的重量差异、硬度和崩解时限。最后，包肠溶衣得到成品。经过成品质量检验合格后，进行包装，入成品库，贮存在阴凉、通风、干燥处，注意防止受潮、发霉、变质。
Claims (10)
1.一种高纯度蚓激酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)蚓激酶粗品的提取：取鲜活蚯蚓用水洗净，加入食盐处理；加入pH6.8～8.3的缓冲液，用胶体磨制备匀浆；将匀浆液反复冻融；将匀浆液加热，去除对热不稳定的杂蛋白；将匀浆液离心，取上清液；上清液经超滤浓缩，截留分子量为10000～50000道尔顿的组分，冷冻干燥制得蚓激酶粗品；
(2)蚓激酶粗品的纯化：将步骤(1)中获得的蚓激酶粗品溶于缓冲液中，离心，取上清液用离子交换层析柱分离，得到蚓激酶活性组分；
(3)蚓激酶活性组分的再纯化：将步骤(2)中的蚓激酶活性组分用亲和层析平衡缓冲液溶解，用单克隆抗体亲合层析柱进行再纯化，用缓冲液平衡至流出液在蛋白检测仪上绘出稳定的基线后，再用含有洗脱剂的亲和层析洗脱液洗脱，收集活性洗脱峰，冷冻干燥得到高纯度的蚓激酶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，蚯蚓包括双胸蚓、赤子爱胜蚓、锯齿远蚓或参环毛蚓。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中步骤(2)中离子交换层析采用羧甲基葡聚糖凝胶柱或二乙氨基葡聚糖凝胶柱或琼脂糖凝胶柱层析，先用缓冲液平衡脱洗，再用含有0～0.5mol/LNaCl的缓冲液进行梯度洗脱。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，其中步骤(3)中单克隆抗体亲和层析柱是由蚓激酶抗体偶联到经过溴化氰活化处理的羧甲基葡聚糖凝胶、二乙氨基葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶的多糖基质上制得的。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，蚓激酶抗体由如下步骤制备得到：用高效液相色谱纯化并经定性的蚓激酶与等体积完全佐剂混合乳化作为刺激物，对小鼠皮下注射免疫；取经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠骨髓瘤细胞混合，加入分子量为40000～60000的聚乙二醇作用后，将细胞混合液分别接种在多孔细胞培养板孔内；将接种细胞混合液的细胞培养板置于CO2培养箱内培养，按时间阶段选择不同的培养基；收集细胞分泌液，对单克隆抗体进行筛分得到稳定的蚓激酶抗体。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，经免疫的小鼠脾B淋巴细胞悬液与鼠骨髓瘤细胞的混合比例按5～10∶1。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，培养基的选择按照第1～4天用含15％胎牛血清的HAT培养基，第5～10天改用HT培养基，10天后改用含10％胎牛血清的RPM1-1640培养基。
9.一种由权利要求1中所述方法制得的高纯度蚓激酶，其特征在于，所述蚓激酶的比活达到每毫克蛋白20万单位以上；经高效液相色谱测试为单一组分；在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现一条带，分子量为32000±2000道尔顿；氨基酸序列分析，N-末端10个氨基酸序列为：
Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg-Pro-Tyr
10.一种由权利要求1所述方法制得的或权利要求10所述的高纯度蚓激酶制得的药物制剂，其特征在于，其包含治疗有效量的权利要求1所述方法制得的或权利要求10所述的高纯度蚓激酶、药学上可接受的药用辅料。
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