JPH0228199A - ヒト神経成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト胎盤からの精製によって得られるヒト神
経成長因子（ｈＮＧＦ）、さらに詳しくは生物学的サブ
ユニット（β−ＮＧＦ）に関する。

［従来の技術］ 神経成長因子（ＮＧＦ）は、マウス肉腫で初めて発見さ
れ［レビーモンタルシ一二等（Ｌｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌ
ｃｉｎｉ　　Ｒ，ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、ＥＸＩ）、２０
０１．１１６　：　　３２１，１９５１）コ、　その後
、雄性マウスの顎下唾液腺から［バロン等（Ｖａｒａｎ
　　Ｓ、　　ａｔ　　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　　６　：　　２２０２，１９６７）コ、およびヘビ
毒から［アンゲレノチ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ　Ｒ，Ｈ，
。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ
Ａ　６５：６６８．１９７０）］、均質になるまで精製
された。また、その他多数のＮＧＦの比較的豊富な供給
源も報告されており、これらにはモルモット前立腺［ハ
ーバ−等（Ｈａｒｐｅｒ　Ｇ、　Ｐ。

ｅｔ　ａｌ、　、　ｆｆａｔｕｒｅ　２７９　：　１８
０．１９７９）］およびヒト胎盤［ゴールドシュタイン
等（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　Ｌ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、＋Ｎ
ｅｕｒｏｃｈｅｔ　Ｒｅｓ、　３　：　１７５．１９７
８）　；ウォーカー等（ｌｌａｌｋｅｒ　Ｐ、　ｅｔ　
ａｔ、　＋　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ　２６　：　１
９５．１９８Ｇ）　；カリサーノ等（Ｃａｌｉｓｓａｎ
ｏ　Ｐ、　　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏ
ｔ。

Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　Ｘｌｌ　：　２．１９８４）］が含
まれる。哺乳動物中枢神経系を含む他の組織に少量のＮ
ＧＦが存在していると報告されている［バロン（Ｖａｒ
ｏｎ　Ｓｌ、　Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍｏ１．　Ｉｆ、Ｎｏ、３．　１
９８５）　；ヘフチ等（Ｈｅ４ｔｉ　Ｆ、　ｅｔ　ａｌ
、、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１４　：　５５゜１９
８５）］。ＮＧＦのこれら可能性ある供給源と外見上の
作用部位の間の生理学的な関係はそれほど明確ではない
が、−射的には、ＮＧＦに応答する細胞による神経支配
を必要としている種々の末梢組織によってＮＧＦが分泌
されているものと考えられている。

また、雄性マウスの顎下腺から得られたＮＧＦの配列決
定およびクローニングが行われている［スコツト等（Ｓ
ｃｏｔｔ　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０
２　：　５３８．１９８３）；アルリッチ等（■Ｉｒ１
ｃｈ＾、　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３０３：　８
２１．１９８３）コ。さらに、ヒトβ−ＮＧＦ遺伝子が
成功裏に単離され、クローニングされている［アルリッ
チ等（Ｕｌｒｉｃｈ　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　３０３　：　８２１＋１９８３）　；欧州特許Ｎ
ｏ、　０１２１３８８１゜最も完全にその特徴が調べら
れているのはマウスの顎下腺から得られたＮＧＦである
。マウス腺由来のＮＧＦは、ｚｎ゛を含む３種の別種サ
ブユニット（α、β、γ）の７８タンパク質コンプレツ
クス（分子１約１４０，０００ダルトン）としてふるま
う。ＮＧＦの活性には、もっばら、２．５８　　ＮＧＦ
として知られているサブユニットβ、即ち分子量が約２
５，３００ダルトンであり（１００℃で５分１ｆＪ］、
β−メルカプトエタノールで還元した後、高濃度ＳＤＳ
のゲルで電気泳動すると、約１２゜６５０ダルトンの分
子量を示す）、その等電点が約９．３である塩基性の二
量体タンパク質が関係している。ヒト起源および雄性マ
ウスの顎下腺由来のβ−ＮＧＦのアミノ酸配列が報告さ
れている［スコ　ノ　ト等（Ｓｃｏｔｔ　　Ｊ、ｅＬ　
　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３０２　：　５３８，１９８
３）、アルリッチ等ＣＵｌｒｉｃｈ人、　ｅｔ　ａｌ、
、、ＮａＬｕｒｅ　３０３：　８２１．１９８３）］。

マウス顎下腺由来のＮＧＦが、インビボおよびインビト
ロでのほとんどのＮＧＦ活性の研究で用いられていた。

インビトロでのＮＧＦの生物学的活性の範囲が、−次ニ
ューロン細胞および培養物中のクローン細胞の両者で測
定されていた。インビトロでＮＧＦに応答すると報告さ
れている一次ニューロノ細胞には、を髄神経節の胎児感
覚ニューロン（胚日数８−１２）、文略神経節のノルア
ドレナリン作動性胎児ニューロン、中隔のコリン作動性
胎児ニューロン、および発生中の副腎クロム親和性細胞
が含まれる。感覚および交感神経ニューロンはその生存
および発生をＮＧＦに依存しているが、コリン作動性の
ニューロンはその生存にＮＧＦを必要とせず、その分化
（即ち、神経伝達物質に拘束される特徴的な表現型の発
現）にだけ必要としているようである。発生初期段階の
副腎クロム親和性細胞（神経堤を誘導する細胞）にＮＧ
Ｆを加えると、ニューロン表現型の発現を引き起こす。

インビトロでＮＧＦに応答すると報告されているクロー
ン細胞には、ヒト神経芽細胞腫細胞およびクロム親和細
胞腫細胞（ＰＣｌ３）として知られている神経堤の腫瘍
由来のクロム親和性の副腎細胞が含まれる。ＮＧＦで処
理した後のこれら細胞は、増殖性の高い挙動形態から有
糸分裂後のニューロン状態に変わる。

最近になって、い（つかのラット脳領域においてＮＧＦ
およびそのｍＲＮＡの両者を測定することが可能になっ
た。ＮＧＦレベルと、大形細胞コリン作動性ニューロン
の分布との注目すべき関係が見つかった。末梢交感神経
標的組織で観察されるレベル範囲のなかでも比較的高い
レベルのＮＧＦが、大形細胞コリン作動性ニューロンに
神経支配されている領域およびその細胞体を含む領域、
即ち海馬の両方で見い出された。この大形細胞コリン作
動性システムに関係していない脳領域はかなり低レベル
のＮＧＦを含んでいる。前脳基底の大形細胞コリン作動
性ニューロンは、トポロジー的に新皮質、海馬、および
嗅覚器に投射する。層歯類の学習能力および記憶は前脳
のコリン作動性機能の年齢依存性の衰退と関係しており
、最近の知見によれば、基底核人形細胞、中隔一対角帯
領域および線条のコリン作動性ニューロンは年齢依存性
の萎縮を受けることが示されている。ＮＧＦの脳室内注
射によって隙記憶を部分的に回復させることができる。

前脳基底コリン作動性システムの完全性と認識機能の間
のこの関係はヒトにも当てはまるであろう。アルツハイ
マー病の主な神経病理学的特徴の１つは大形細胞コリン
作動性ニューロンの劇的な欠損である（他の伝達系がい
くつかの変化を受けるが）。コリン作動性／ステムに′
１１１するダメージの程度と知的欠損の重篤性の間に、
ある相関関係が提案されていた。

このように、ＮＧＦと病態生理学および可能性あるアル
ツハイマー病の治療法の間の関連は、現実に考慮すべき
範囲内に入っていた。

また、アルツハイマー病の臨床発現におけるコリン作動
性／ステムの関与は、種々の実験的観察によって裏付け
されている。例えば、ラットにおいて、前脳基底核から
の上昇コリン作動性投射を遮断すると、顕著な記憶およ
び学習能力の減退につながる。これらの学習および記憶
の欠損は海馬にＮＧＦを注射することによって改善する
ことができる。アルツハイマー病の患者からの入手可能
な病態生理学的な情報、および動物実験からの補足的な
情報は、アルツハイマー病の病態生理学的な原因を解明
するための興味ある可能性、および新規治療法の可能性
を開くものである。

ヒトＮＧＦ用のｃＤＮＡプローブが利用できること、バ
イオテクノロジーによってヒトＮＧＦを製造することが
可能であること、それに続くヒトＮＧＦに特異的な抗体
の調製、および特異的な酵素免疫検定法の開発はすべて
、アルツハイマー病が本当にヒトＮＧＦ産生の欠損と関
係しているかどうかについての疑問に対して実験を行う
上で必須である。そのような欠損が見い出されたときに
は、ＮＧＦ産生の減少たけでなく、アルツハイマー病に
よって影響を受けるがＮＧＦに応答しない、ニューロン
に作用する他の未知の神経栄養因子の産生の減少もある
と仮定することも必要であろう治療学的な結果に関して
は、コリン作動性ンステムの実験的損傷の後の学習欠損
に対するＮＧＦ投与の有益性は、コリン作動性ニューロ
ンのダメージの原因が何であれ、これらニューロンのＮ
ＧＦ利用を外部適用または内部産生の刺激のいずれかに
よって増加させることが重要であることを示唆している
。

バイオテクノロジーによるヒトＮＧＦの製造が可能であ
るので、非−ヒ１−ＮＧＦによる治療の免疫学的な危険
の可能性は排除された。

長年にわたり、ＮＧＦの研究は、主として雄性マウスの
唾液腺から精製したＮＧＦおよびそれに対して調製した
抗体に基づいていた。抗−マウスＮＧＦ抗体をニワトリ
胚に注射しても、新生マウスおよびラットに抗体注射し
た後に観察されるような交感神経系の広範な破壊に至ら
ないことがＮＧＦ研究の比較的初期の段階で明らかにな
っていた。ニワトリの交感神経および感覚ニューロンは
インビボおよびインビトロでマウスＮＧＦに応答するの
で（対応するマウスニューロンと同様ニ）、その生物学
的活性の原因であるＮＧＦ分子の領域は保存されている
に違いないが、他の領域は進化の間に変化したと結論す
るのが妥当である。この仮定は、ウシＮＧＦがウシ精液
プラズマから精製され、マウスおよびウシＮＧＦの生物
学的活性の間の詳細かつ広範囲な比較が可能になったと
きにさらに立証された。これらの実験は、免疫学的な交
差反応性は極めて限定されているがマウスとウシＮＧＦ
の生物学的活性は同一であることを示した。マウス、ヒ
ト、ウシ、およびニワトリＮＧＦの分子クローニング、
並びにマウスＮＧＦのアミノ酸配列分析は、これら分子
の保存および非保存領域、およびそれらの生物学的活性
および抗原性との関係を比較することを可能にした。進
化の間のＮＧＦの全体にわたる保存は著しく高い。完熟
マウスβ−ＮＧＦの１１８個のアミノ酸のうち、ウシＮ
ＧＦでは１６個のアミノ酸だけが、ニワトリＮＧＦでは
１９個が、そしてヒトＮＧＦでは１１個が変化している
にすぎない。以前の観察から予想されるように、マウス
ＮＧＦの３つのＳ−８架橋の還元において、生物学的活
性の完全な消失を得ることができる。全体にわたるアミ
ノ酸配列の高い保存率と乏しい免疫学的交差反応性の間
の外見上の相違は、種間のアミノ酸変異がクラスター　
（ｃｌｕｓｔｅｒ）に位置しているという事実によって
いる。バイトロバシー（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）プロッ
トは、この変異が、実際上は抗原決定因子である可能性
が高いと予想される親水性領域にだけ位置していること
を示した。ある１個の親水性領域が、これまでに研究さ
れたすべての種のＮＧＦ分子において厳密に保存されて
いることがわかった。この保存領域は、部位指向性の突
然変異誘発およびこの領域に対応する合成ペプチドに指
向性の抗体による、後に行う分析に役立つ。

β−ＮＧＦの単量体サブユニット中の正しい立体配置の
３つのジスルフィド結合の存在は、このタンパク質の生
物学的活性および免疫原性についての特徴を表すもので
ある。

天然のタンパク質とＤＮＡ誘導の産物（両者共活性型）
の間の厳密な特徴付けが必須である。分子の種々物理化
学的性質、例えば、サイズ（大きさ）、電荷、等電点、
アミノ酸組成および疎水性などを利用する広範囲の分析
法を用いることに特別の注意を払うべきである。産物が
所望の立体構造および集合状態を有していることを確か
めるための適当な試験を含んでいることが望ましい。そ
のような目的に適している方法の例は、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動；等電点電気泳動：サイズ排除、逆相
、イオン交換、疎水相互作用、およびアフィニティーク
ロマトグラフィー　ペプチド配列マツピング：アミノ酸
分析；光散乱；ＵＶスペクトル；円偏光二色性、および
その他の分光学的方法である。例えば、電子顕微鏡ある
いは免疫化学的方法を用いてさらに産物の特徴を調べる
と、価値ある情報が得られよう。生物学的な、および免
疫学的な特徴付けには、予想される生物学的活性にとっ
て適切な、可能な限り広い範囲の方法が含まれているべ
きである。精製度の高い物質の比活性の測定は特に重要
である（活性単位／産物重量）。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明者等は、既述のヒ）ＮＧＦ（βサブユニット）の
医薬応用の可能性、および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）で得
られたＤＮＡ誘導の第一世代の産物に関連する問題を調
べる一方で、大スケールでの適用に有効である可能性が
高いヒト胎盤由来のＮＧＦ（βサブユニット）を精製す
るための方法を開発した。

そのような目的に適した方法および試薬を用いてこの物
質の化学的、免疫化学的および生物学的特徴を調べた。

この精製方法あるいはその１工程だけを、ヒト胎盤から
精製したＮＧＦと同一の化学的、免疫化学的および生物
学的特徴を示す組換えＤＮＡ法によって得られたヒトＮ
ＧＦの精製に応用できることは明白である。

本発明に係る医薬組成物は、ヒト組織から精製したβ−
ＮＧＦ、β−ＮＧＦ類似体、β−ＮＧＦあるいはβ−Ｎ
ＧＦ類似体の生物学的に活性なフラグメント、またはそ
れらの非毒性塩を、薬学的に許容しうる液体あるいは固
体の担体に分散させて含有している。このような医薬組
成物を、ヒト用および獣医学的臨床医薬として、免疫原
性の問題を伴わずに、診断用あるいは治療用に急性ある
いは長期投与で用いることができる。

［課題を解決するための手段］ 本発明は、 ）カチオン交換樹脂を用いてβ−ＮＧＦを単離および精
製するために、天然の７８コンプレツクスおよびβサブ
ユニットの異なる等電点、および１１）ヒトＮＧＦ（β
サブユニット）と、マウスＮＧＦ（βサブユニット）に
対して生成させたポリクローナル抗体との交差反応性、 を利用するものである。

原料および方法 インビトロでの研究は、「分１ＩｌｌＪ胎児Ｅ８ニワト
リを髄神経節細胞を用いて行った［スケイバー等（Ｓ、
　５ｋａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｕ
ｒｏｌ、　７６　：　６５５＋　１９８２）］。

ヒト胎盤から精製したＮＧＦの生物学的活性を阻害する
ネズミＮＧＦに対して生成させた抗体の研究を、上記の
インビトロのモデル系を用いて評価した。

ヒト胎盤由来のＮＧＦ（βサブユニット）の純度はＳＤ
Ｓスラブ電気泳動法によって評価した［レンムリ（Ｌａ
ｅｍｍｌｉ　Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：　
６８０．１９７０）］。

免疫反応性は免疫プロット法によって調べた［ゲルショ
ー二等（Ｊ、Ｍ、Ｇｅｒｓｈｏｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３１　：　ｌ、　１９
８３）］。

ＮＧＦに対するポリクローナル抗体は、セファロース（
Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４　Ｂに結合させた２、５Ｓ？
ウスＮＧＦを用いるアフィニティークロマトグラフィー
によって精製した［ステケル等（Ｋ、５ｔｏｅｃｋｅｌ
　ｅＬａｌ、、　Ｊｊｌｅｕｒｏｃｈｅｍ、２６：　１
２Ｇ７．１９７６）］。

］抗−マウスＮＧＦモシクローナル抗は、免疫したラッ
トの肺細胞をマウスのＰ３−Ｘ６３／ＡＧ８ミエローマ
細胞と融合させることによって得た［ケーラー等（Ｇ、
Ｋｉｊｈｌｅｒ　ｅｔ　ａｔ、、　　Ｎａｔｕｒｅ　２
５６　：　４９５、１９７５月。

衷旌男ヒトβ−ＮＣＦの精製 単離操作を次のようにして行った。

工程」 １個のヒト胎盤の胎盤葉組織を、ソーパル・アムニミキ
サー（Ｓｏｒｖａｌｌ　Ａｍｎ１ｍ１ｘｅｒ）中、高速
で１〜３分間、冷（４℃）蒸留−説イオン水とともにホ
モジナイズした。このホモジネートを３５分間遠心した
。次いで、上清を凍結乾燥し、０．０２Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ６，８）に再懸濁し、同じ緩衝液（４
Ｑ）に対して２回、４℃で１６時間、透析を行った。以
後の工程はすべて同じ温度で行った。

工程２ 透析した上清を、０．０２Ｍのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６
，８）で平衡化したＣＭ−セルロースＩ脂と混合し、こ
の固体支持体を、溶出液の２８０　ｎｍでの吸収がＯ１
１以下に低下するまで同じ緩衝液で洗浄した。次いで、
溶出液を０．２５ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，８）（
４１２）に対して２回、２４時間にわたって透析して、
この溶液の緩衝化能を減少させた。

工程１ この透析溶液に１／９量の酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
４，０）を加えて、急速にｐＨを低下させ、７８　ＮＧ
Ｆを解離させ、そして最終の緩衝液濃度を０．０５Ｍに
した。十分量の固体ＮａＣｌ２を加えてＮａＣＲの最終
濃度を０．４Ｍとした。５分間放置して沈澱を生成させ
、ペレットを捨て、溶液を２７，０００９で３０分間遠
心した。

工程Ａ 酸性化した溶液を直ちに、０゜４ＭＮａＣｌ２を含む０
．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，０）で平衡化
した第２のＣＭ−セルロースカラムにかけ、非吸着物質
を同じ緩衝液（４００ｘのでカラムから溶出させた。こ
のカラムを０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，
０）（５０ｘｇ）で洗浄した後、残留するタンパク質を
２段階で溶離した。０．０５Ｍトリス−ＨＣＱ緩衝液（
ｐＨ９，０）（約２００１ので溶離すると残留タンパク
質の半分を含む赤色のフラクション（分画）が得られた
。部分精製されたヒトＮＧＦのフラクシヨンは０．５Ｍ
ＮａＣｌを含む０．０５Ｍ）リス−ＨＣ（！（ｐＨ９，
０）ｔ’最後に溶出した。この溶出した物質を０．０５
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）、０．２ＭＮａＣｌに
対して一晩透析した。

工程下 この溶液を２７．　ＯＯＯｇで１５分間遠心し、その上
清を、０．２ＭＮａＣｌを含む０．０５Ｍ酢Ｍナトリウ
ム（ｐＨ５，０）で平衡化したＣＭ−セルロースカラム
にかけた。このカラムを、０４ＭのＮａＣｌ２および０
．５ＭのＮａＣｌを含む０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ
Ｈ５，０）で段階的に洗浄した。

生物学的活性を伴う物質を、１．０ＭＮａＣｌを含む０
．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）を用いてカラム
から溶出させた。この物質を、０．０５Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ５，５）（２ρ）に対して透析した。

工程１ 生物学的物質を０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５
）で平衡化したカチオン交換モノＳ　（Ｍｏｎｏ　Ｓ）
カラムにかけた。生物学的物質の溶離は、５０１Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ６，６）中、０〜１．０ＭのＮａＣｌ
２の勾配を用いて行った。流速はＩ　ＲＱ１分であった
。生物学的活性を伴うタンパク質は、塩濃度が０．３５
〜０．４５Ｍ　ＮａＣｌ２の、２６〜３０分の範囲の時
間に溶出した。この物質を、０．１ＭのＮａＣｌを含む
０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）に対して透析
した。

盃稈ユ 生物学的物質を、共有結合によって固体支持体に結合さ
せた抗−マウスＮＧＦポリクローナル抗体を用いるアフ
ィニティークロマトグラフィーカラムにかけた。このカ
ラムを、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）の平
衡緩衝液で徹底的に洗浄した。結合したヒトＮＧＦを、
０．０２％ヒト血清アルブミン含有のＯ，１Ｍグリシン
−ＨＣ＆（ｐＨ２，５）で溶離した。

また、別法として、 工程ｌ アフィニティーカラムにかけた生物学的物質を、４　、
５　ＭｇＣ（ｈ含有１７）０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ５，０）で溶離した。この精製したヒトＮＧＦ（βサ
ブユニット）をＱ、　１Ｍ　ＮａＣｌ含有の０．０５Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）に対して透析し、少量ず
つ使用時まで一８０℃で保存した。

ヒト胎盤から精製したｈＮＧＦ（生物学的に活性なサブ
ユニット）の化学的および免疫化学的特徴を次に挙げる
。

ａ）ＳＤＳゲル電気泳動で測定した精製物質の分子量は
、約２４．３〜２５３にダルトンである（第１図）： ｂ）その等電点は約９３〜９．８である；Ｃ）マウスＮ
ＧＦに対して生成させ、アフィニティー精製したポリク
ローナル抗体（０，５μｇ／Ｒのを用いるウェスタンプ
ロット法によれば、ヒト胎盤由来のｈＮＧＦ（βサブユ
ニット）はこの試薬に対して交差反応性を示す（第２図
）。

［同じ方法を用い、マウスＮＧＦの生物学的部位に特異
的な２．０Ｍｇ／ｘＱ’ｔ１４度のモノクローナル抗体
を用いると、この交差反応性は観察されなかっヒト胎盤
から精製したｈＮＧＦ（βサブユニット）はＤＲＧ　Ｅ
８に生物学的活性を示した（第３図）。

第３図に示されている結果は文献記載の方法（スケイバ
ー等（Ｓ、　５ｋａｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｅｘｐ
、　Ｎｅｕｒｏｌ、　７６　：　６５５、　１９ｇ２）
）によって得た。］ヒト胎盤由来のｈＮＧＦの生物学的
活性は、高濃度のアフィニティー精製ポリクローナル抗
体（第４図）、および高濃度のモノクローナル抗体（第
５図）によって阻害された。

一般的に言うと、本発明で用いる精製工程の各反応条件
は、タンパク質の精製に利用されるクロマトグラフィー
法について当分野で知られているものである。このよう
な方法は、例えば、次の文献に記載されている：　「酵
素の精製およびその関連方法Ｊ　（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｕ
ｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　Ｔｅ
ａｈｎｉｑｕｅｓ）、ジャコピー編［、Ｂ、Ｊａｋｏｂ
ｙ、　５ｅｃｔｉｏｎｏｎ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｎｄ　
Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋１ｓｔｒｙ、　Ｎ
ａｔｉｏｎａｌ　１ｃｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌ
ｔｈ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ｌＪ＋ｒｙｌａｎｄ。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９７１）］　；ゴ
ールドシュタイン等［Ｌ、　Ｄ、　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ
　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ（３）　１７５−１８３　（１９７８）
コニウォーカー等［Ｐ、　Ｗａｌｋｅｒｅｔ　ａｌ、、
　　Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ、２６．　１
９５−２００　（１９８０）］、モブレイ等［Ｗ、Ｃ，
Ｍｏｂｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、Ｖ
ｏ１１５、　Ｎｒ、　２５．５５４３−５５５１］　：
カリサー７等［Ｐｉｅｔｒ。

Ｃａ１ｉｓｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｏｒｍｏｎａｌ
　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　
Ｖｏｌ、　ＸＩ　ｌ”Ｔｈｅ　Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔ
ｈ　Ｆａｃｔｏｒ　（ＮＧＦ）］。

各精製工程は２〜１２℃の温度で行ってよい。

医薬組成物 ヒト胎盤から得られたｈＮＧＦ分子（βサブユニット）
を含有する医薬組成物（ガングリオシド類およびリン脂
質類を含むこともあるし、含まないこともある）の製剤
化には、患者への有効投与に適した薬学的に許容しつる
組成物の製造について既に知られている方法が含まれ、
この方法により有効量の１１ＮＧＦ分子が薬学的に許容
しうる担体と混合される。適当な担体およびその製剤化
（池のタンパク質を含む）は、例えば、書籍「レミント
ンの医薬の科学Ｊ（Ｒｅ＋＊ｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａ
ｒＩｌａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｅｎｃｅｓ、　Ｍａｃ
ｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｅａｓ
ｔｏｎ、　Ｐａ、。

ｔｌｓＡ　１９８５）に記載されている。これらの担体
は、注入可能な「デポジット（ｄｅｐｏｓｉｔ）製剤」
を含んでいる。

上記に基づくと、医薬製剤には、１またはそれ以上の薬
学的に許容しうる担体または希釈剤と混合され、生理的
体液と等浸透かつ適当なｐＨの緩衝化媒体に含有される
ｈＮＧＦの凍結乾燥粉末およびｈＮＧＦ溶液が含まれる
（これに限定はされない）。第１表は、神経系疾患の治
療用に溶液の形態で調製されることもある製剤の可能性
ある組成を示すものである（説明のためにだけ挙げたも
のであって、これに限定されない）。凍結乾燥調製物の
場合には、マンニトールあるいはグリシン（これに限定
されない）などの支持賦形剤が用いられてよく、所望量
の適当な緩衝溶液を用いて所望のｐＨの所望の等優性の
緩衝溶液を得る。同様の溶液を所望量の等張溶液中のｈ
ＮＧＦ分子からなる医薬組成物に用いてよ（、これには
、いつでも所望のｐＨ（例えば、中性ｐＨ）の等張の医
薬調製物が得られるよう適当な濃度のリン酸塩およびク
エン酸塩を含んでいる緩衝生理食塩水溶液を使用するこ
とが含まれるがこれに限定はされない。

また、第２表および第３表は、可能性ある神経系疾患治
療用医薬組成物のいくつかを説明のために挙げたもので
ある。第４Ａ表および第４Ｂ表に記載の医薬組成物はｌ
投与につき２つのバイアルを用いる調製物である。第１
のバイアルは約０゜０１〜５０重量％の活性物質と薬理
学的に許容しうる賦形剤（グリシンあるいはマンニトー
ルなど）からなる活性物質を含んでいる。第２のバイア
ルは所望量のリン酸塩あるいはクエン酸塩緩衝生理食塩
水で調製された溶媒を含んでいる。この２つのバイアル
の中身を投与直前に混合し、凍結乾燥の活性物質を素早
く溶解して注入用溶液を得る（システムＮｏ、５）。

また、医薬製剤には、糖−ゼラチンあるいはその他の種
類の親油性（即ち、水可溶性）自己乳化型賦形剤を用い
る直腸投与用の原剤が含まれる（これに限定はされない
）。これらの調製物では、ｈＮＧＦは全賦形剤の０．０
１〜１重量％の量で存在していてよい。この原剤形は適
切な量のアセチルサリチル酸塩を含んでいることもある
（限定はされない）。

第４表は可能な神経系疾患治療用廃剤調製物を挙げるも
のである（例示の目的で挙げた）。

さらに、凍結乾燥形および溶液の両形態のｈＮＧＦの医
薬調製物は上記のように有効用量中にリン脂質類あるい
はガングリオシド類を含んでいてもよい。用量は、例え
ば神経系の修復あるいは老化による疾患の治療において
ヒトで通常用いられている量と同様であってよく（限定
はされない）、投与経路に依存するであろう。ｈＮＧＦ
の医薬調製物の投与量および投与時期は所望の効果（臨
床試験によって決定）および投与経路に依存し、例えば
、投与量および投与時期は他のニューロン栄養薬物によ
る研究で普通に用いられているものと同様であってよい
（限定はされない）。

穀剋撚 梃上人注入溶液用医薬組成物 調製物Ｎｏ、１ ２ＲＱのアンプル１個は次の成分を含んでいる：活性物
質　　　　　　　　　　ｌμｇ（２，５００Ｂｔｌ）塩
化ナトリウム　　　　　　１６Ｒ９ 適量の非加熱蒸留水の クエン酸塩緩衝液（ｐＨ・７）　　　２ＲＱ調製物Ｎｏ
、２ ２１Ｑのアンプル１個は次の成分を含んでいる・活性物
質　　　　　　　　　ｌＯμｇ（２５，０００ＢＵ）塩
化ナトリウム　　　　　　１６ｍｇ 適型の非加熱蒸留水の クエン酸塩緩衝液（ｐＨ・７）２奸 生物学的単位（ＢＵ）はフェントンの論文［Ｆｅｎｔｏ
ｎＥ、Ｌ、、　Ｅｘｐｌ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、５９：　
３８３．１９７０］に定義されているものと同じである
。

寒ｚ去医薬組成物システム システムＮｏ、１ ａ）２ｘＱのバイアル１個は次の成分を含んでいる：凍
結乾燥の活性物質　　　　　４μ？（１０，Ｇｏｏ　Ｂ
Ｕ）グリシン　　　　　　　　　３０ｘｙ ｂ）２１Ｑの溶媒バイアル１個は次の成分を含んでいる
： 塩化ナトリウム　　　　　　１６゜ 適量の非加熱蒸留水の クエン酸塩緩衝液　　　　　　２村 ／ステムＮ０．２ ａ）２ｒ＋ｆｆのバイアル１個は次の成分を含んでいる
；凍結乾燥の活性物質　　　　　４μｇ（１０，０００
１３１１）マンニトール　　　　　　　４０１Ｉ９ｂ）
２ｉ＆の溶媒バイアル１個は次の成分を含んでいる： 塩化ナトリウム　　　　　　１６肩９ 適量の非加熱蒸留水の クエン酸塩緩衝液　　　　　　２２ρ システムＮｏ、３ ａ）３ｉ＋σのバイアル１個は次の成分を含んでいる：
凍結乾燥の活性物質　　　　１０μｇＣ２５，０００Ｔ
Ｕ）グリシン　　　　　　　　　４５所 ｂ）３ｉ（！の溶媒バイアル１個は次の成分を含んでい
る： 塩化ナトリウム　　　　　　２４肩９ 適量の非加熱蒸留水の クエン酸塩緩衝液　　　　　　３肩Ｑ 基１人医薬組成物ンステム ンステムＮｏ、４ ａ）３ｘＱのバイアル１個は次の成分を含んでいる：凍
結乾燥の活性物質　　　　１０　μｇ（２５，０００Ｂ
Ｕ）マンニトール　　　　　　　６０１９ ｂ）３ＪＩＱノ溶媒バイアル１個は次の成分を含んでい
る。

塩化ナトリウム　　　　　　２４１１ｇ適量の非加熱蒸
留水の クエン酸塩緩衝液　　　　　　３死Ｑ ンステムＮｏ、５（皮下注射用の例） ａ）　２ｘＱのバイアル１個は次の成分を含んでいる凍
結乾燥の活性物質　　　　　５μｇ（１２，５００ＢＵ
）グリンン　　　　　　　　　３０反９ ｂ＞２ＲＱの溶媒バイアル１個は次の成分を含んでいる 塩化ナトリウム　　　　　　１６度９ 適量の非加熱蒸留水の クエン酸塩緩衝液　　　　　　２Ｍ（１ｆｆｉ４ｍ直腸
経路用の廃剤の形態の医薬組成物調製物Ｎｏ、１ 活性物質　　　　　　　　　　１０μｇ（ｚｓ、ｏｏｏ
　ＢＵ）カカオ脂　　　　　　　　　　２．５９調製物
ＮＯ，２ 活性物質　　　　　　　　　　１０μｇ（２５，０００
ＢＵ）カルボワックス（Ｃａｒｂｏｗａｘ） １５４０　　　　　　　　　　１．７５　ｇカルボワッ
クス６０００　　　０．７５　ｇ調製物Ｎｏ、３ 活性物質　　　　　　　　　　１０　ｕ９（２５，００
０ＢＵ）ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）６１　　　　　２．１
２５　ｇラノリン　　　　　　　　　　　０．２５９調
製物Ｎｏ、４ 活性物質　　　　　　　　　　１０μｇ（２５，０００
ＢＵ）グリセリン　　　　　　　　１．５ｇ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　０．７５　９ゼ
ラチン　　　　　　　　　　０．２５ｇ以上に本発明を
説明したが、これらの方法に多数の変法があることは明
白であろう。そのような変法は本発明の思想および範囲
から外れるものとみなすべきではな（、当業者にとって
自明である変法のすべては本発明の範囲内に含まれる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヒト胎盤から精製したｈＮＧＦの分子量をＳ
ＤＳゲル電気泳動によって調べた結果を示す模写図であ
り、 第２図は、ヒト胎盤由来の精製ｈＮＧＦと抗−マウスＮ
ＧＦポリクローナル抗体の交差反応性をウェスタンプロ
ット法によって調べた結果を示す模写図であり、 第３図は、ヒト胎盤由来の精製ｈＮＧＦのＤＲＧＥ８に
対する生物学的活性を調べた結果を示す模写図であり、 第４図は、ヒト胎盤由来のｈＮＧＦの生物学的活性がア
フィニティー精製ポリクローナル抗体によって阻害され
る様を示すグラフであり、第５図は、ヒト胎盤由来のｈ
ＮＧＦの生物学的活性がモノクローナル抗体によって阻
害される様を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の工程： ａ）ヒト胎盤組織をホモジナイズすること、 ｂ）ｐＨ４．０で透析して７ＳＮＧＦ形を解離させるこ
   と、および ｃ）得られた溶液を３段階のカチオン交換クロマトグラ
   フィーカラムでクロマトグラフィー分画すること、 を特徴とする、ヒト胎盤由来のヒト神経成長因子（ＮＧ
   Ｆ）の生物学的に活性なサブユニット（βサブユニット
   ）の製造方法。 ２、次の工程： ｄ）得られた活性分画を塩化ナトリウム勾配およびｐＨ
   勾配のカチオン交換クロマトグラフィーで精製すること
   、 をさらに含有する請求項１記載の方法。 ３、次の工程： ｅ）得られた活性分画をマウスＮＧＦに対して生成させ
   たポリクローナル抗体のアフィニティークロマトグラフ
   ィーで精製すること、 をさらに含有する請求項１または２記載の方法。 ４、工程ｂ）をｐＨ３．５〜４．５で行う請求項１記載
   の方法。 ５、ＮａＣｌ濃度が０〜１Ｍであり、ｐＨが５．５〜６
   ．５である、０．０５Ｍ酢酸塩緩衝液に溶解した塩化ナ
   トリウムの勾配を用いて活性分画をカチオン交換クロマ
   トグラフィーカラムから溶出させる請求項２記載の方法
   。 ６、マウスＮＧＦ（βサブユニット）に対して生成させ
   た交差反応性のポリクローナル抗体のアフィニティーク
   ロマトグラフィーで活性分画を精製する請求項５記載の
   方法。 ７、各工程を２〜１２℃の温度で行う請求項１または２
   記載の方法。 ８、活性分画を集め、そして凍結乾燥する請求項１〜３
   のいずれかに記載の方法。 ９、分子量が約２４，３００〜２５，３００ダルトンの
   塩基性タンパク質であるヒト胎盤由来の生物学的に活性
   な神経成長因子（βサブユニット）。 １０、等電点が約９．３〜９．８であるヒト胎盤由来の
   ヒト神経成長因子（βサブユニット）。 １１、タンパク質１μｇにつき少なくとも約２５００Ｂ
   Ｕの生物学的活性を有する請求項８記載のヒト胎盤由来
   のニューロン栄養因子β−ＮＧＦ。 １２、精製工程の１つだけを組換えＤＮＡ法によって得
   られたｈＮＧＦの精製に適用する請求項１〜６のいずれ
   かに記載の方法。 １３、請求項１〜６のいずれかに記載の方法によって製
   造した、ニューロン細胞の生存および分化を増強しうる
   ヒト胎盤由来のニューロン栄養因子β−ＮＧＦ。 １４、分子量が約２５，０００ダルトンの塩基性タンパ
   ク質であり、かつヒトに対して免疫原性ではない、ニュ
   ーロン栄養的に活性な量のｈＮＧＦ（βサブユニット）
   と、薬学的に許容しうる賦形剤または希釈担体からなる
   医薬組成物。 １５、活性量の、請求項１４記載のヒト胎盤由来のｈＮ
   ＧＦ（βサブユニット）と、薬学的に許容しうる賦形剤
   または希釈担体からなる医薬組成物。 １６、少なくとも１種のガングリオシドあるいは少なく
   とも１種のリン脂質をさらに含有している請求項１５記
   載の医薬組成物。