CN101082043A

CN101082043A - 聚乙二醇修饰的l－门冬酰胺酶

Info

Publication number: CN101082043A
Application number: CN 200610027026
Authority: CN
Inventors: 冯军; 赵文杰; 公伟; 薛春佳; 翟宁
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2006-05-29
Filing date: 2006-05-29
Publication date: 2007-12-05
Anticipated expiration: 2026-05-29
Also published as: CN101082043B

Abstract

本发明公开了一种新的活化的聚乙二醇衍生物修饰的L－门冬酰胺酶，即式(I)结构的化合物，其中m为单甲氧基monomethoxy的缩写，R是去除一个氨基的L－门冬酰胺酶亚基分子，n是2－5的整数，j为1－300。本发明还提供了具有该修饰的L－门冬酰胺酶的制法和相应的药物组合物。本发明的化合物成份均一、抗肿瘤效果好，化学性质更稳定、免疫原性更低。

Description

聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶

技术领域

本发明涉及用聚乙二醇修饰药物，尤其涉及用聚乙二醇修饰的蛋白质及其应用。

背景技术

本发明所涉及的L-门冬酰胺酶(L-asparaginase，L-ASP)广泛存在于微生物、植物和部分啮齿类动物的血清中，具有较强的抗肿瘤作用。(Abuchow skiA，Theo V S，Palczuk N C，et al.Alteration of immunological propertiesof Bovine Serum Album in by covalent attachment of polyethylene glycol.J Biol Chem，1977，252：3578)。

L-门冬酰胺酶的活性形式为一同源四聚体，每一亚基由326个氨基酸组成。L-门冬酰胺是某些肿瘤细胞生长必不可少的氨基酸，对人体正常细胞而言，自身具有合成L-门冬酰胺的能力，而肿瘤细胞缺乏门冬酰胺合成酶不能自身合成L-门冬酰胺，其细胞需要摄取外源的L-门冬酰胺才能存活(DübbersA，Würthwein G，Müller H J.Asparagine synthetase act ivity in paediatricacute leukaemiasl.Br J Haematol，2000，109(2)：247；叶启东，顾龙君.左旋门冬酰胺酶治疗儿童白血病的研究进展.国外医学输血及血液学分册，2000，23(6)：3381)。L-门冬酰胺酶能催化水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨，因此能够有效地抑制癌细胞的生长，最终使癌细胞消亡。目前在临床上已被用于儿童急性淋巴细胞白血病(childhood acute lymphoblastic leukemia，ALL)的治疗。L-门冬酰胺酶单独使用时，对ALL的有效率为60％，与长春碱(vincristine)及皮质甾类药物(corticosteroids)联合使用时，对ALL的有效率高达95％(Iiboshi Y，Papst P J，Terada N，et al.L-asparaginase inhibitsthe Rapamycin-targeted signaling pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，1999，260(2)：534)。另外，L-门冬酰胺酶对单细胞白血病、淋巴肉瘤、白血病性网状内皮组织增多症以及慢性髓细胞白血病也有一定的疗效，对胰腺癌细胞的增多还有一定的抑制作用[Dübbers A，Wrthwein G，Müller H J.Asparaginase synthetase activity in paediatric acute leukaemias[J].BrJ Haematol，2000，109(2)：247]，是临床治疗白血病的重要药物。

但是，由于它来源于微生物，对人而言是一种外源蛋白，有较强的免疫原性，临床上常见进行性免疫反应和全身性过敏反应，而限制了其临床应用。(张丽娜，宫道华.江苏医药.左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴细胞性白血病的毒副反应.2005，31(5)：392；王宁玲，刘芝璋等.左旋门冬酰胺酶治疗儿童白血病的毒副作用及防治.中国小儿血液，2005，10(3)：133)。

为此，如何获得低免疫原性的L-门冬酰胺酶，改善该蛋白酶的药物动力学以提高耐受性及给药便利程度，一直是研究的重点。

解决上述的问题的方法之一就是对L-门冬酰胺酶进行适当的化学修饰。目前，在对蛋白质药物进行化学修饰的研究领域中，应用最多，成功率最高的是聚乙二醇(PEG)修饰技术。在蛋白质药物的PEG修饰研究中大多数是将蛋白质分子中的氨基作为修饰位点。PEG可以共价连接到L-门冬酰胺酶上与活性位点无关的其他位点上，隐蔽了该酶的抗原表位，降低其免疫原性(姜忠义，高蓉，王艳强.蛋白质和多肽药物聚乙二醇化的问题与对策[J].药学学报，2002，37(5)：396)；PEG还可以防止网状内皮系统对门冬酰胺酶的吸收，从而大大减少了生成的抗体攻击L-门冬酰胺酶的可能性，延长了这种药物的循环半衰期(AnaI，Fernandes，Gregory Gregoriadis.The effect of polysialylation on theimmunogenicity and antigenicity of asparaginase：implication in itspharmacokinetics[J].International Journal of Pharmaceutics，2001，217(1-2)：215)。

中国专利CN1498965A公开了一种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法，该专利使用聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)对门冬酰胺酶进行修饰，修饰后用中空纤维超滤对修饰产物进行分离。由于聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯属第一代活化的聚乙二醇修饰剂，具有修饰产物在体内不稳定，易水解的缺点。水解后留在蛋白质上的琥珀酸尾巴作为半抗原反而增加了门冬酰胺酶的免疫原性(参见Roberts MJ，Bentley MD，Harris JM.Chemistry for peptide andprotein PEGylation.Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54：459-476.)；另外仅用超滤是不能把单修饰、双修饰及多修饰产物分开的，从该公开专利的附图1中可看出修饰产物为多种修饰的混合物，显然使用这种修饰混合物作为药物使用具有显而易见的缺点。

因此，本领域迫切需要提供一种由新一代的聚乙二醇修饰剂的L-门冬酰胺酶，同时使用多种层析技术对修饰产物分离纯化，使其纯度高，具有出色的抗肿瘤效果，而且更稳定、免疫原性低。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种由新一代的活化的聚乙二醇修饰剂的L-门冬酰胺酶。

本发明的另一个目的是提供这种化合物的制备方法。

本发明的再一个目的是提供由上述的化合物构成的药物组合物。

本发明还要提供上述化合物的用途。

在本发明的第一方面，提供了一种聚乙二醇化L-门冬酰胺酶化合物，它具有式(I)结构

其中m为单甲氧基；

PEG为聚乙二醇；

R是去除一个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子；

n是2-5的整数；和

j为1-300。

在另一优选例中，所述的L-门冬酰胺酶是天然或重组的。

在另一优选例中，mPEG的分子量为2000-100000Da。

在本发明的第二方面，提供了一种上述的聚乙二醇化L-门冬酰胺酶化合物的制备方法，它包括步骤：

(1)在L-门冬酰胺酶溶液中，加入缓冲液，调节其pH值在5-11，然后与式II所示的活化的聚乙二醇衍生物进行反应，反应温度为4-40℃，反应时间为10-120分钟，形成含有式I化合物的反应混合物，

其中，

m为单甲氧基；

PEG为聚乙二醇；

R是去除一个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子；

R-NH₂是L-门冬酰胺酶；

n是2-5的整数；和

j为1-300；

mPEG为：CH₃O-(CH₂CH₂O)n’-CH₂CH₂OH，n’是44-2200的整数；

(2)从反应混合物分离出式I的化合物。

在另一优选例中，所述的pH值为8-10。

在另一优选例中，所述的反应温度为15-30℃。

在另一优选例中，所述的反应时间为15-45分钟。

在另一优选例中，反应中活化的聚乙二醇衍生物和L-门冬酰胺酶的摩尔比为0.1-300。

在另一优选例中，所述的摩尔比为50-280∶1，更佳地150-230∶1。

在另一优选例中，活化的聚乙二醇衍生物为甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。

在另一优选例中，所述的分离纯化采用离子交换层析和凝胶过滤层析。

在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，它含有上述的聚乙二醇化L-门冬酰胺酶化合物和药学上可接受的载体。

在本发明的第四方面，提供了一种上述药物组合物的制备方法，即将治疗有效量的上述的聚乙二醇化L-门冬酰胺酶化合物和药学上可接受的载体混合。

在本发明的第五方面，提供了上述的聚乙二醇化L-门冬酰胺酶化合物的用途，它可用于制备治疗白血病的药物。

由此，本发明提供了一种由新一代的聚乙二醇修饰剂的L-门冬酰胺酶，同时使用多种层析技术对修饰产物分离纯化，使其纯度高，具有出色的抗肿瘤效果，而且更稳定、免疫原性低。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究发现，将带有连接基团(linker)的聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶(L-ASP)，如结构式I所示：

其中m为单甲氧基monomethoxy的缩写，R是去除一个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子，n是2-5的整数，j为1-300；并且在经过了多种层析技术分离纯化后，与现有的聚乙二醇修饰的L-ASP相比，具有更为优异的综合特性，即纯度高，具有出色的抗肿瘤效果，化学性质更稳定、免疫原性更低。

在本发明中，使用以下缩写：

PEG，聚乙二醇；

mPEG，单甲氧基聚乙二醇；

L-ASP，L-门冬酰胺酶。

如本文所用，“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷和水的直链或支链形式缩聚物的混合物，由一般分子式H(OCH₂CH₂)_nOH来代表，在此n至少为4。

用“聚乙二醇”或“PEG”连同后面的数字后缀一同来表示它的大约平均分子量。例如，PEG5000是指平均分子量大约为5000的聚乙二醇。

用“活化的聚乙二醇衍生物”是指共价结合了连接基团的聚乙二醇。

用“聚乙二醇”或“PEG”连同连接基团及后面的数字后缀一同来表示它的大约平均分子量。例如，mPEG-SMB-5000是指平均分子量大约为5000的甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。

“患者”是指动物，优选是指哺乳动物，更优选指人。

本发明提供的活化的PEG修饰的L-ASP指式(I)结构的化合物：

其中m为单甲氧基monomethoxy的缩写，R是去除一个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子，n是2-5的整数，j为1-300。

本发明中，L-门冬酰胺酶及其基因可以是从任何来源得到，包括重组产生的或人工合成的。

本发明的中，聚乙二醇的平均分子量是从2000到100000；较佳地为3000-80000；更佳地为4000-80000Da。

本发明采用连接基团的聚乙二醇修饰技术，所说的聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶至少有一个亚基的结构如通式I。

本发明的特点是在L-门冬酰胺酶上连接聚乙二醇链，这种聚乙二醇链可以是线性的，也可以是带支链的。

本发明还提供了制备修饰的L-门冬酰胺酶的方法，它通常包括以下步骤：

其中，

m为单甲氧基；

PEG为聚乙二醇；

R是去除一个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子；

R-NH₂是L-门冬酰胺酶；

n是2-5的整数；和

j为1-300；

mPEG为：CH₃0-(CH₂CH₂0)n’-CH₂CH₂0H，n’是44-2200的整数；

(2)从反应混合物分离出式I的化合物。

所说的新一代活化的聚乙二醇衍生物是本领域一般技术人员所公知的(参见Roberts MJ，Bentley MD，Harris JM.Chemi stry for peptide and proteinPEGylation.Advanced Drug Delivery Reviews，2002，54：459-476.)，最优选地，使用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁醛甲氧基聚乙二醇或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯，可采用美国Nektar Therapeutics公司生产的产品。

分离纯化可以通过离子交换层析和凝胶过滤层析。

所说的离子交换层析可以是阴离子交换层析，也可以是阳离子交换层析；所使用离子交换层析介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如QSepharose系列、SP Sepharose系列，DEAE Sepharose系列、CM Sepharose系列，DEAE Sephacel系列、CM Sephacel系列，QAE Sephadex系列、SP Sephadex系列，DEAE Sephadex系列、CM Sephadex系列，SOURCE Q系列、SOURCE S系列等，其中最优的使用SOURCE Q系列和SOURCE S系列。洗脱方式采用梯度洗脱。

所说的凝胶过滤层析使用的介质为本领域所公知的各种层析介质，根据其骨架的不同可分为葡聚糖型、琼脂糖型、球状纤维素型等，如Sepharose系列、Sephacel系列、Sephadex系列、Superdex系列和Superose系列等，其中最优的使用Superdex 200 pre grade和Superose 12作为层析介质进行分离。

增加蛋白质或酶的修饰程度能增加修饰物的循环半衰期，然而增加修饰程度却会减少蛋白或酶的比活性，因而需要在这两者之间达成平衡。这一点对于本领域的专业人员来说是显而易见的。本发明中，通过调节活化的PEG或其衍生物与L-ASP的摩尔比，以及控制反应时间，可以控制修饰程度。本发明优选的修饰条件下L-ASP亚基上的1-10个伯氨基被相同数目的PEG修饰，更优选的只有1-5个伯氨基被PEG修饰。

PEG修饰的蛋白通常是不均一的，蛋白质分子可连接数量不等的PEG分子，有时需要分离纯化出更为均一的部分。本发明中，一种优选的组分是每个L-ASP亚基平均连接约1-10个活化的PEG或其衍生物分子的复合物。例如用甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯修饰L-ASP产物，随后用柱层析方法，分离分子量为160,000Da左右的组分，即可每个L-ASP亚基平均连接约1-5个活化的PEG或其衍生物分子。

本发明的化合物的治疗有效剂量是能有效的抑制肿瘤生长的剂量，一般的，治疗以小剂量开始，以便不断增加剂量直到此条件下的最适。在注射前，PEG-ADI可与磷酸盐缓冲液或为本领域的熟练人员所熟知的任何其他适合的溶液混合。PEG-ADI制剂可如需求的那样以固体(冷冻干燥)或液体制剂形式给药。

施用本发明的化合物的方法视具体情况而定。通常，施用本发明的如通式I的化合物可通过以下途径完成：口腔内、鼻腔内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴管内、肿瘤内、肌肉内、间质内、动脉内、皮下、眼内、滑膜腔内、经上皮、经皮施用。

在本发明的另一方面，还通过了一种药物组合物，它通常含有安全有效量的本发明通式I的化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的PEG-ADI还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的通式I化合物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点在于：

1、用该制备方法获得的通式I的化合物成份均一；

2、本发明提供的通式I化合物免疫原性低，抗癌效果好。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。

实施例1

甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SMB-5000)对L-门冬酰胺酶修饰条件的选择

反应pH值的选择：各取1mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液0.5ml，置于6支带塞试管中，分别加1ml不同pH值的缓冲液使溶液的pH值为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，再加入mPEG-SMB-5000固体1.773mg，溶解，混匀，于25℃反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。

结果表明：在这些条件都能得到聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，其中pH值为9.5时修饰率最高。

反应温度的选择：取2mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液2ml，加2ml硼砂-氢氧化钠缓冲液使溶液的pH值为9.5，再加入mPEG-SMB-5000固体14.2mg，溶解，混匀，各取0.5ml置于4支带塞试管中，然后分别置于4℃、10℃、25℃和37℃反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。

结果表明：在这些温度下都能得到聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，其中25℃的修饰率最高。

反应时间的选择：取2mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液2ml，加2ml硼砂-氢氧化钠缓冲液使溶液的pH值为9.5，再加入mPEG-SMB-5000固体14.2mg，溶解，混匀，各取0.5ml置于4支带塞试管中，然后于25℃分别反应5、10、15、30、60、120min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。

结果表明：在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，其中30min后的修饰率没有明显提高。

L-门冬酰胺酶同mPEG-SMB-5000反应摩尔比的选择：取2mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液2ml，加2ml硼砂-氢氧化钠缓冲液使溶液的pH值为9.5，各取0.5ml置于4支带塞试管中，然后分别加入mPEG-SMB-5000固体0.177、0.355、8.865、17.730mg(相当于mPEG-SMB-5000同L-门冬酰胺酶的摩尔比在1-200)，溶解，混匀，反应30min后终止反应。比较修饰率，确定修饰条件。

结果表明：在这些条件下都能得到聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，当mPEG-SMB-5000同L-门冬酰胺酶的摩尔比在50时修饰率已达到最高，进一步增加mPEG-SMB-5000的量修饰率也没有明显地增加。

实施例2

制备甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯5000(mPEG-SMB-5000)修饰的L-门冬酰胺酶

修饰反应：

取2mg/ml的L-门冬酰胺酶溶液2ml，加硼砂-氢氧化钠缓冲液使溶液的pH值为9.5，再加入mPEG-SMB-5000固体7.092mg，溶解，混匀，于25℃反应30min，加入100mg甘氨酸终止反应。

离子交换层析：

取上述反应液，用0.05M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.0缓冲液超滤三次，充分平衡，上柱分离。色谱条件如下：

层析填料：Source 30 Q

柱规格：5ml

流动相：

A 0.05M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.0

B 0.05M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，0.4MNaCl，pH8.0

流速：5ml/min

梯度：1-15％ 1个柱体积(柱体积)

15％-40％ 10个柱体积

40％-100％ 2个柱体积

检测波长：215nm

收集：每管2ml

通过此步离子交换层析可以将修饰的与未修饰的L-门冬酰胺酶分开，修饰产物在未修饰L-门冬酰胺酶之前出来。收集聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的峰。

凝胶过滤层析：

将上述收集液用截流分子量为10000的超滤膜浓缩至2ml，上柱分离。色谱条件如下：

层析填料：Superdex 200 pre grade

柱规格：1.6×120cm

流动相：0.05M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH8.0

流速：1ml/min

检测波长：215nm

收集：每管2ml

结果：可以得到不同洗脱峰，分别为不同数目聚乙二醇分子修饰的L-门冬酰胺酶，采用高效液相色谱(HPLC)对得到的组分峰进行分析，合并相同组分。

高效液相色谱(HPLC)条件如下：

色谱柱：TSKgel G 5000

检测波长：215nm

流动相：0.05M Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，pH7.0

流速：0.6ml/min

柱温：36℃

HPLC分析结果表明：得到的聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶和L-门冬酰胺酶的纯度均在95％以上。

实施例3

修饰产物的生物活性(比活力)测定(参见中国药典2005版：门冬酰胺酶)

用L-门冬酰胺酶标准品作为对照，测定标准品和样品催化底物生成量，然后计算样品的比活力(U/mg)。见表1。

表1：L-门冬酰胺酶及聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的生物活性

样品	比活力(U/mg)
样品	比活力(U/mg)	L-门冬酰胺酶	250
实施例2所得产物	150	L-门冬酰胺酶	250

结果表明：本发明获得的聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶生物活性高。

实施例4

聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶稳定性的研究

热稳定性：取L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶(实施例2所得产物，在液体状态，无任何保护剂)，分别置于4℃、25℃、37℃、45℃、65℃条件下，定时取样测定其生物活性。

结果表明，65℃时，修饰酶保温20min后仍可保存原始酶活力的6.3％，而自然酶在65℃时便全部失去活性；L-门冬酰胺酶在37℃的条件下酶活力仅能维持4.5h左右，而聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的酶活力3d还保留了开始酶活力的93％；在4℃的条件下，L-门冬酰胺酶的酶活力仅能维持48h，而聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的酶活力在3d内基本没有改变。

因此，可以初步认为聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶可以明显增加L-门冬酰胺酶的热稳定性。

酶稳定性测定方法：

取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.8)2.7ml，分别加入0.5mlL-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶样品，37℃水浴，于0、0.5、1、2、4h取样0.3ml，测定样品的生物活性。结果表明：L-门冬酰胺酶在0.5h内活性迅速降到原来的20％，而聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶在1h内活性仅降到原来的60％。

结果表明，聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶能明显增加L-门冬酰胺酶抵抗胰蛋白酶水解的能力。

实施例5

聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶与L-门冬酰胺酶的药效学比较研究

清洁级DBA/2小鼠，雌雄各半，体重18～22g，40只，购自中国科学院上海实验动物中心。

取DBA/2小鼠40只，雌雄各半，按移植性肿瘤研究法(徐叔云，卞如廉，陈修主编.药理学实验方法[M].第1版.北京：人民卫生出版社，1991，1424)接种淋巴细胞白血病P388细胞，接种后，随机分为4组，分别为：空白对照组、L-门冬酰胺酶组、聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶组(实施例2所得产物)和阳性对照组。每组10只，雌雄各半，各组之间动物的平均体重相差不超过1g。接种后24h开始给药，将L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶用生理盐水稀释至需要浓度3700IU·kg^-1，腹腔给药。空白对照组给予生理盐水，阳性对照组注射阿霉素(DR)(20mg/kg)连续8d。停药24h后称重，脱臼法处死小鼠，解剖取出瘤块，称瘤块重量。体内移植瘤的抑瘤率计算公式：

抑瘤率＝(1-Wt/Wc)×100％

Wc为对照组平均瘤块重量；Wt为实验组平均瘤块重量

结果见表2。

表2：rL-ASP-PEG和rL-ASP对DBA/2移植瘤小鼠的作用(x±s，n＝10)

组别	剂量	瘤体重量/g	抑瘤率/％
组别	剂量	瘤体重量/g	抑瘤率/％	对照组^c	0.9％NaCl	4.5±0.8	-
rL-ASP-PEG	3700/IU.kg^-1.d^-1	1.3±0.9	70.2	对照组^c	0.9％NaCl	4.5±0.8	-
rL-ASP-PEG	3700/IU.kg^-1.d^-1	1.3±0.9	70.2	rL-ASP^e	3700/IU.kg^-1.d^-1	2.3±0.5	48.7
DR	20/mg·kg^-1	2.1±0.6	53.8	rL-ASP^e	3700/IU.kg^-1.d^-1	2.3±0.5	48.7

与对照组比较^cP＜0.01；与L-门冬酰胺酶比较^eP＜0.05(请在相应的组别中注明c或e)

结果表明：

与注射生理盐水的对照组相比，聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶对P388实体瘤的抑瘤效果显著(P＜0.01)，药物疗效明显优于L-门冬酰胺酶组(P＜0.01)；

比较聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶与L-门冬酰胺酶对小鼠白血病细胞P388形成的移植性实体瘤的抑瘤作用，两者抑瘤效果也有差异(P＜0.05)。

聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶在体内不但保留了L-门冬酰胺酶对移植性实体瘤P338的抑制作用，而且能延长其作用时间。因此，预期在人体内聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶会有更好的抑瘤效果。

实施例6

聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶与L-门冬酰胺酶的急性毒性试验比较研究

将四种不同浓度的聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶(实施例2所得产物)和L-门冬酰胺酶注射至体重18～22g的DBA/2小鼠的腹腔内。每种浓度注射10只小鼠。计算聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶和L-门冬酰胺酶引起50％死亡的剂量(LD₅₀)。(LD₅₀计算方法参见Reed LJ and Muench H.Am.J.Hygiene，1938；27：493)

测定出L-门冬酰胺酶LD₅₀为94.104×10⁴kU·kg^-1，聚乙二醇修饰L-门冬酰胺酶实验中按100.0×10⁴kU·kg^-1为小鼠给药剂量和最大给药体积，给14d，小鼠未出现死亡和任何毒副作用。

结果表明，L-门冬酰胺酶经聚乙二醇修饰后，其毒性显著降低。

实施例7

聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶对实验动物免疫原性的研究

以家兔作为制备抗血清的实验动物，采用福氏佐剂免疫法，并分别以L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶(实施例2所得产物)作为抗原，剂量均为5U/kg/次，每周1次，共5次。

分别以L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶作为抗原，用双向免疫扩散法测定它们各自抗血清的效价，

测定结果为：L-门冬酰胺酶组抗血清的效价为1∶16；聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶组抗血清的效价测不出。

分别以L-门冬酰胺酶和聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶作为抗原，然后用L-门冬酰胺酶组的抗血清作为第一抗体，再以辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗兔IgG作为第二抗体，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定它们各自的免疫原性，

测定结果为：L-门冬酰胺酶组为阳性，聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶组为阴性。

以上结果表明：同L-门冬酰胺酶比较，聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的免疫原性显著降低。

实施例8

用甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SMB-2000)、甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SMB-10000)、甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SMB-20000)或甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SMB-30000)代替实施例1中的mPEG-SMB-5000，得到了实施例中1～6相似的结果。

实施例9

用丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯20000(mPEG-SPA-20000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯30000(mPEG-SPA-30000)代替实施例1中的mPEG-SMB-5000，得到了实施例中1～6相似的结果。

实施例10(对比试验)

按照中国专利CN1498965A公开的方法制备聚乙二醇修饰门冬酰胺酶，对得到的聚乙二醇修饰门冬酰胺酶按照实施例5和实施例7所述的方法进行试验

结果表明，该聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的抑瘤率仅为38.4％，药效较差；双向免疫扩散法免疫原性测定其抗血清的效价为1∶32，酶联免疫吸附法测定为阳性，仍然具有较强的免疫原性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种聚乙二醇化L-门冬酰胺酶化合物，其特征在于，具有式(I)结构

其中m为单甲氧基；

PEG为聚乙二醇；

R是去除一个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子；

n是2-5的整数；和

j为1-300。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的L-门冬酰胺酶是天然或重组的。

3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，式中mPEG的分子量为2000-100000Da。

4.一种如权利要求1所述的聚乙二醇化L-门冬酰胺酶化合物的制备方法，其特征在于，它包括步骤：

其中，

m为单甲氧基；

PEG为聚乙二醇；

R是去除一个氨基的L-门冬酰胺酶亚基分子；

R-NH₂是L-门冬酰胺酶；

n是2-5的整数；和

j为1-300；

mPEG为：CH₃O-(CH₂CH₂O)n’-CH₂CH₂OH，n’是44-2200的整数；

(2)从反应混合物分离出式I的化合物。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，反应中活化的聚乙二醇衍生物和L-门冬酰胺酶的摩尔比为0.1-300。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，活化的聚乙二醇衍生物为甲基丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯或丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的分离纯化采用离子交换层析和凝胶过滤层析。

8.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。

9.一种如权利要求8所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，将治疗有效量的权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体混合。

10.如权利要求1所述化合物的用途，其特征在于，用于制备治疗白血病的药物。