CN105802946A - 聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其在药物制备中的应用和临床治疗中的应用。本发明PEG修饰的门冬酰胺酶中一分子门冬酰胺酶与13-45分子聚乙二醇偶联，所述聚乙二醇为平均分子量2-20KDa的直链聚乙二醇本发明制备的PEG修饰后的门冬酰胺酶。本发明提供的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，在具有降低免疫原性、半衰期明显延长等优点的基础上，聚乙二醇与门冬酰胺酶偶联得更加稳定，和市场上已销售的PEG化门冬酰胺酶的原研药和仿制药产品相比，本发明提供的聚乙二醇化的门冬酰胺酶结构更加稳定、PEG结合牢固、不易脱落，且均一性、活性都更高。

Description

聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其应用

技术领域

本发明涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，特别是聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其在药物制备和临床治疗中的应用。

背景技术

门冬酰胺酶(Asparaginase，ASP)又名L-门冬酰胺酶、L-天冬酰胺酶或L-天门冬酰胺酶，是一种催化天冬酰胺水解成天冬氨酸的酶。门冬酰胺酶可以有效的治疗儿童或成人中的急性淋巴细胞白血病(ALL)。最近几年，含有L-天冬酰胺酶的药物已经用于联合化疗方案来治疗NK/T细胞淋巴瘤，并取得了较好的治疗效果。NK/T细胞淋巴瘤是种特殊类型的非霍奇金淋巴瘤，多见于亚洲和拉丁美洲，我国发病率相对较高。根据肿瘤发生部位，NK/T细胞淋巴瘤可分为鼻型NK/T细胞淋巴瘤和非鼻型NK/T细胞淋巴瘤。另外L-天冬酰胺酶还被用于治疗何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓单核细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤，网状细胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotziaandlabrou,J.Biotechnol.127(2007)657-669)。

L-门冬酰胺酶的活性形式为4个亚基组成的同源四聚体结构，每一亚基由326个氨基酸组成。L-天冬酰胺酶最初从若干生物体中纯化，包括大肠杆菌(E.coli)和软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)。在哺乳动物中，仅在豚鼠(Cavioidea超科)和某些阔鼻猴(NewWorldmonkey)中发现略高于痕量的L-天门冬酰胺酶。但是，由于它来源于外源生物，对人而言是一种外源蛋白，有较强的免疫原性，临床上常见进行性免疫反应和全身性过敏反应，而限制了其临床应用。(张丽娜，宫道华.江苏医药.左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴细胞性白血病的毒副反应.2005，31(5)：392；王宁玲，刘芝璋等.左旋门冬酰胺酶治疗儿童白血病的毒副作用及防治.中国小儿血液，2005，10(3)：133)。

为此，如何获得低免疫性性的L-门冬酰胺酶，改善该蛋白酶的药代动力学以提高耐受性及给药便利程度，一直是研究的重点。

解决上述问题的方法之一就是对L-门冬酰胺酶进行适当的化学修饰。

聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG修饰技术在生物医学和生物技术领域得到了广泛的应用，PEG已经被广泛地应用于蛋白质，多肽类药物的修饰研究。目前蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性，以及改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一，且已通过FDA认证可用于药物、食品和化妆品。

聚乙二醇修饰技术经历了几十年的发展，目前虽然已经比较成熟。但并不能找出一种通用的聚乙二醇修饰剂以及修饰方法来对所有的蛋白药物进行修饰。蛋白的结构以及所用PEG的分子量、形状以及修饰的位点等对聚乙二醇化的蛋白质的生物活性以及药效有很大的影响。对于特定药物的修饰，聚乙二醇修饰剂是影响修饰产物理化性质、体内外生物活性、药代动力学、药效学以及修饰产物临床表现最重要的因素。因此，修饰剂的选择(修饰剂种类、分子量大小)以及修饰反应的控制在聚乙二醇修饰技术中占有重要地位。蛋白质结构的解析并不能准确预测天然蛋白质的药代动力学行为，而在蛋白偶联上PEG以后由于引入了许多新的变量如分子量、修饰剂种类等，对于PEG偶联物的药代动力学行为预测变得更加不可能。为此，针对不同的蛋白质药物，需要通过选择不同种类以及不同分子量的修饰剂，并通过理化性质检测、动物实验评价等确定最佳方案。

例如，在大多数情况下，与未修饰的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白药物的活性会降低，一般修饰后的蛋白活性仅有原蛋白的30％-40％,甚至更低。例如Schering-Plough公司的PEG-Intron,是用分子量为5000的PEG修饰干扰素，修饰后其活性只有原蛋白的8％。又如Yoshihiro等分别用分子质量为750，1900，5000U的分支状活化PEG(2-0一methoxypolyethyleneglycol-4，6-dichloro-s-triazine)对大肠杆菌门冬酰胺酶进行修饰。其中5000u一PEG修饰了门冬酰胺酶所有92个游离氨基(88个δ-氨基与4个α-氨基)中的73个，保留原酶活性的7％，修饰后产物完全失去与门冬酰胺酶抗性血清结合能力。此外，一般随着PEG分子量的增大，修饰后的蛋白质活性降低更明显。例如用分子量为20KDa、30KDa、40KDa的PEG修饰促红细胞生成素(EPO)后，活性随着PEG分子量的增大而显著减小(Yin-jueWang,journalofcontrolledrelease,2010(145):306-313)。Bailon等采用分支型40kDaPEG修饰Interferon-α-2a，所得单修饰物获得较长的循环半衰期，但是仅仅保留了7％的体外活性(BailonP,BioconjugateChem.,2001,12:195-202.)。

目前针对L-门冬酰胺酶的聚乙二醇修饰研究已有很多。国外利用聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的产品Oncaspar(Enzoninc)早在1994年就已上市，并在2006年起被批准作为儿童和成人的ALL的一线疗法。但是Oncaspar的体外和体内的稳定性差、容易脱落，并且副作用也较大。而国内目前上市的PEG修饰的L-门冬酰胺酶只有恒瑞公司的“培门冬酶”，它是Oncaspar的仿制药，也存在着PEG容易降解脱落、均一性差、活性降低严重等的问题。

同时，目前也有一部分PEG定点修饰L-门冬酰胺酶有关论文或专利，但是这些修饰剂价格更为昂贵，且修饰工艺更为复杂，收率较低，整个制造成本较高，并不适宜产业化运用。

因此，本领域迫切需要提供一种生产成本低廉、更加稳定、PEG不易脱落的聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶。

发明内容

解决的技术问题：本发明旨在提供一种在具有长半衰期、低免疫原性、低成本等优点的基础上，PEG不易脱落、高收率、高均一性的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，及其制备治疗儿童或成人急性淋巴细胞白血病等疾病的药物中的应用。

技术方案：本发明的第一目的是提供一种聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其中一分子门冬酰胺酶与13-45分子聚乙二醇偶联，所述聚乙二醇为平均分子量2-20KDa的直链聚乙二醇。

作为优选，PEG通过与门冬酰胺酶的游离氨基形成酰胺键或脲烷键共价连接。所述游离氨基包括赖氨酸残基和/或N-末端氨基。

优选的，PEG偶联了门冬酰胺酶以后的结构通式如下：

其中ASP是L-门冬酰胺酶，PEG是聚乙二醇部分，m是13-45的整数；n是0到3的整数。

本发明的第二目的是提供一种上述的聚乙二醇化的门冬酰胺酶的制备方法，包括如下步骤：

第一步：缓冲液置换

把门冬酰胺酶原料药溶液吸入离子交换层析柱，用平衡缓冲液平衡、用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白，所述洗脱缓冲液同时为下一步修饰反应中的修饰缓冲液；

第二步：修饰反应及修饰产物纯化

将第一步中收集的门冬酰胺酶溶液按门冬酰胺酶:PEG修饰剂为1:10-1：200的摩尔比进行反应，在4℃-37℃下反应1-24h；其中PEG修饰反应中门冬酰胺酶的蛋白浓度为5-40mg/ml；

反应结束后用离子交换色谱层析进行纯化。

本发明的第三目的是提供一种聚乙二醇化的门冬酰胺酶药学上可接受的盐或其复合物。所述复合物是指两种或两种以上不同物质所形成的结合体。

药学上可接受的盐在其被施用的量和浓度存在时是非毒性的。制备此类盐可通过改变化合物的物理特征而不妨碍其发挥生理学效果来促进药物应用。在物理特性方面有用的改变包括降低熔点以促进经粘膜施用，以及增加溶解性以促进施用更高浓度的药物。

上述药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如硫酸盐、盐酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐等。上述所述的药学上可接受的盐可来自酸，包括盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等。

本发明的第四目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有上述聚乙二醇化的ASP或其药学上可接受的盐或其复合物和药学上可接受的辅料。

药学上可接受的载体和/或赋形剂也可被掺入根据本发明的药物组合物中促进特定门冬酰胺酶的施用。适于实施本发明的载体包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖类(乳糖、葡萄糖、蔗糖)，或各种淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇以及生理学上相容的溶剂(包括用于注射的无菌水溶液，盐溶液和右旋糖苷等)。

优选的，上述所述药物组合物为冻干粉针剂。

优选的，上述所述聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其药物组合物通过肌肉、静脉或皮下途径给药。

本发明的第五目的是提供一种上述聚乙二醇化的ASP在制备治疗儿童或成人急性淋巴细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、何杰金氏病、急性骨髓白血病、急性骨髓单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤或黑素肉瘤药物中的应用。

有益效果：本发明提供的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，在具有降低免疫原性、半衰期明显延长等优点的基础上，聚乙二醇与门冬酰胺酶偶联得更加稳定，和市场上已销售的PEG化门冬酰胺酶的原研药和仿制药产品相比，本发明提供的聚乙二醇化的门冬酰胺酶结构更加稳定、PEG结合牢固、不易脱落，且均一性、活性都更高。

附图说明

图1：PEG-ASP偶联物的HPLC-SEC纯度分析

通过高效凝胶过滤分析结果可以看出制备的偶联物中没有明显杂质峰，纯度均大于98％。SPA5K-ASP的分子量和Oncaspar的分子量基本一致,但高于培门冬酶。由于培门冬酶也是用分子量为5K的直链PEG进行修饰的，因此说明SPA5K-ASP的修饰度明显高于培门冬酶。

图2：SPA5K-ASP偶联物的SDS-PAGE电泳检测

PEG修饰ASP后的蛋白电泳图。第1-4泳道的样品分别是蛋白Marker、Oncaspar、SPA5K-ASP、培门冬酶。通过蛋白电泳结果可以看出SPA5K-ASP的修饰均一性优于培门冬酶，SPA5K-ASP的分子量高于培门冬酶。

图3：Oncaspar以及SPA5K-ASP和培门冬酶热处理后不同时间段的蛋白电泳考染(a)与碘染(b)结果图

图3a蛋白电泳考染(a)中，第1-19泳道的样品分别是蛋白Marker、Oncaspar0h、Oncaspar1h、Oncaspar2h、Oncaspar3h、Oncaspar4h、Oncaspar5h、SPA5K-ASP0h、SPA5K-ASP1h、SPA5K-ASP2h、SPA5K-ASP3h、SPA5K-ASP4h、SPA5K-ASP5h、培门冬酶0h、培门冬酶1h、培门冬酶2h、培门冬酶3h、培门冬酶4h、培门冬酶5h。

图3b蛋白电泳碘染(b)中，第1-20泳道的样品分别是蛋白Marker、SPA5KPEG、Oncaspar0h、Oncaspar1h、Oncaspar2h、Oncaspar3h、Oncaspar4h、Oncaspar5h、SPA5K-ASP0h、SPA5K-ASP1h、SPA5K-ASP2h、SPA5K-ASP3h、SPA5K-ASP4h、SPA5K-ASP5h、培门冬酶0h、培门冬酶1h、培门冬酶2h、培门冬酶3h、培门冬酶4h、培门冬酶5h。

通过蛋白电泳的碘染和考染结果可以看出，SPA5K-ASP的PEG没有发生脱落，而Oncaspar和培门冬酶的PEG很容易脱落，这说明SPA-5K-ASP比Oncaspar和培门冬酶的稳定性好。

图3c活性测定结果表明，在高温55℃条件下，培门冬酶在1h内基本完全失活，Oncaspar保留了30％左右的活性，而SPA5K-ASP还保留了70％左右的活性，说明其稳定性最好。

图4：不同PEG-ASP偶联物荧光光谱分析

使用荧光分光光度计对门冬酰胺酶、Oncaspar、SPA5K-ASP及培门冬酶进行内源荧光光谱扫描，结果表明PEG修饰后没有改变门冬酰胺酶的三级结构。

图5：PEG偶联物以及培门冬酶药代动力学性质比较

图5a为培门冬酶和SPA5K-ASP样品通过静脉注射(iv)药代结果，图5b为培门冬酶和SPA5K-ASP样品通过肌肉注射(im)的药代结果。

使用¹²⁵I同位素标记示踪法对PEG修饰后的门冬酰胺酶的体内血药浓度进行了研究。从结果看，与培门冬酶相比，SPA5K-ASP的药代动力学性质略优。

具体实施方式

定义：

本发明使用的缩写含义如下：

PEG，聚乙二醇；PEG修饰剂，聚乙二醇修饰剂。

聚乙二醇(PEG，HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH)是一种两端带羟基的线型聚合物，聚乙二醇是经环氧乙烷聚合而成的，由重复的氧乙烯基组成，有分支型，直链型和多臂型。PEG也被称为poly(ethyleneoxide)(PEO)，poly(oxy-ethylene)(POE)，或者polyoxirane。一般情况下，分子量低于20,000的被称为PEG，分子量更大的被称为PEO。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mPEG)，这种衍生物是蛋白质聚乙二醇化技术中最常用到。

聚乙二醇修饰剂，则是指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是指经过活化的聚乙二醇，目前主要用于蛋白质以及多肽药物修饰，又叫修饰性聚乙二醇，修饰性PEG。

M-SPA-5000，M-SPA-2000分子量分别为5000Da，2000Da的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯；M-SC-10K，M-SC-5000,分子量分别为10KDa和5000Da的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯；M-SCM-20KDa，分子量为20KDa的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯；M-SBA-5000，分子量为5000Da的直链聚乙二醇琥珀酰亚胺丁酸酯，它们的结构通式为

其中n为0时，mPEG的分子量为10KDa和5000Da时所对应的PEG类型分别是M-SC-10K，M-SC-5000；n为1时，mPEG的分子量为20KDa时所对应的PEG类型分别是M-SCM-20K；n为2时，mPEG的分子量为5000Da和2000Da时所对应的PEG类型分别是M-SPA-5000，M-SPA-2000；n为3时，mPEG的分子量为5000Da时所对应的PEG类型是M-SBA-5000；

M-NPC-5000，分子量为5000Da的直链聚乙二醇硝基苯碳酸酯；结构式如下

其中，mPEG的分子量为5000Da。

本申请中所用术语“偶联物”，是指聚乙二醇修饰门冬酰胺酶后得到的修饰产物；

几种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的修饰产物可在本申请中统称为PEG-ASP或PEG修饰ASP的偶联物。

本发明使用的聚乙二醇修饰剂优选下面几种：酯基活化的的聚乙二醇，更具体地，聚乙二醇修饰剂为琥珀酰亚胺丙酸酯活化的聚乙二醇。

在本发明中，所修饰的门冬酰胺酶蛋白，可以是任何来源的，门冬酰胺酶可从大肠杆菌中提取，包括但不限于大肠杆菌。也可以是重组表达的。在本发明的偶联物的特定实施方式中，门冬酰胺酶与包含SEQIDNO:1的序列的蛋白具有至少约60％的序列一致性。更特别地与包含SEQIDNO:1的蛋白具有至少约65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或100％的序列一致性。

在特定的实施方式中，所述蛋白为大肠杆菌来源的门冬酰胺酶，其具有SEQIDNO:1的序列。

SEQIDNO:1的蛋白的片段也被包含在本发明的偶联物中所使用的蛋白的定义中。所述的“SEQIDNO:1的蛋白的片段”是指多肽的序列可包括比SEQIDNO:1更少的氨基酸。

本领域熟知的是，可通过置换、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸来修饰多肽但同时保留其酶活性。例如，在给定的位置通过化学上等同的氨基酸来置换一个氨基酸而不影响蛋白的功能特性是常见的。因此，可预期如下改变将产生功能上等同的产物：产生以一个带负电的残基取代另一个的改变或产生一个带正电的残基取代另一个的改变。另外随着聚乙二醇合成技术的发展，可通过改变活化基团与聚乙二醇分子之间的连接基团来合成出新型的分支型聚乙二醇修饰剂。本发明专利中使用的分支型聚乙二醇修饰剂不局限于本发明中所描述的结构式。

实施例1：门冬酰胺酶的PEG偶联物的制备及分析

制备例1，本发明聚乙二醇化门冬酰胺酶通过如下方法制备、纯化、鉴定：

第一步：缓冲液置换

把门冬酰胺酶的冻干粉溶于20mM的Tris-Hcl(pH8.0)缓冲液中，配制成蛋白浓度为5mg/ml的溶液。然后把样品通过AKTA层析系统的上样泵进行上样，样品吸入到Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrapQHP5mL)上。上样结束后用平衡缓冲液A液平衡色谱柱，平衡5个柱体积后用洗脱缓冲液B液进行一步洗脱，收集洗脱峰。

(A液：20mM磷酸缓冲液(pH8.0)，B液：20mM磷酸缓冲液+0.2M氯化钠(pH7.5))

第二步：修饰反应及修饰产物纯化

用M-SPA-5000(购自北京键凯科技有限公司)作为PEG修饰剂，将第一步所收集洗脱峰的门冬酰胺酶溶液按门冬酰胺酶:PEG修饰剂为1:50的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h。其中PEG修饰反应中门冬酰胺酶的蛋白浓度为5mg/ml。反应结束后，检测结果表明门冬酰胺酶的修饰率达到了100％。

反应结束后用离子交换色谱层析进行纯化。纯化的色谱法条件：Q离子交换柱(购自GE公司，HiTrapQHP5mL)，平衡缓冲液C液：20mM的Tris-HCl(pH9.0)，洗脱缓冲液D液：含0.1MNaCl的20mM的磷酸缓冲液(pH8.0)，流速2.5mL/min，检测波长为280nm。

上样：上述修饰反应产物用0.5M的NaOH溶液调节至pH9.0，结合至Q离子交换柱。

平衡：C液冲洗5个柱体积。

洗脱：流动相配比为0-50％D液，洗脱体积为10个柱体积，洗脱时间为20分钟。

门冬酰胺酶PEG偶联物样品的HPLC检测

用Waters的HPLCBEH200(4.6×300mm)的分析柱进行分析，缓冲液为含0.1M硫酸钠的0.02M磷酸缓冲液(pH6.0)，充分平衡上样后，以0.3ml/min的流速洗脱，检测波长为280nm,一个样品检测时间为15min。结果如图1所示。

由图1可以看出，制备的偶联物中没有明显杂质，纯度均大于98％。另外，和原研药Oncaspar(由美国Enzon公司于1994年在美国上市，该产品在2009年转让给意大利的SigmaTau制药公司，本专利中所使用的Oncaspar来自于SigmaTau制药公司)相比，SPA5K-ASP的大小和Oncaspar基本相同。但和仿制药培门冬酶(购自江苏恒瑞医药股份有限公司)相比，本实施例制备的修饰产物SPA5K-ASP的出峰位置在培门冬酶出峰位置的左侧，说明其分子量大于培门冬酶，由于培门冬酶也是用分子量为5K的PEG进行修饰的，因此表明SPA5K-ASP上偶联的PEG的个数要比培门冬酶上偶联的PEG的个数多。由此可见，本发明的SPA5K-ASP以及原研药Oncaspar的修饰度要高于国内上市的培门冬酶。经过计算，本制备例中产品的总收率是80％。

制备例2-7具体参数与得率如下表所示，表1未列出的步骤、参数与制备例1相同(所用离子交换层析柱都购自GE公司，所用修饰剂均购自北京键凯科技有限公司)：

表1

实验证明，制备例2-7所制备的修饰产物相比已上市同类产品PEG与ASP结合更加牢固，不易脱落。下述实施例中所用的PEG-ASP偶联物均采用制备例一中所得的偶联物。

实施例2：PEG化ASP修饰均一性的比较

我们通过SDS-PAGE电泳比较PEG化ASP的修饰均一性。蛋白浓缩胶为5％，分离胶为8％。浓缩胶缓冲液为0.5MTris-HCl缓冲液(pH6.8)；分离胶缓冲液为1.5mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.8)。取10ug蛋白样品，与样品缓冲液等体积混合，在100℃下煮沸5min后上样运行，电泳结束后用考马斯亮蓝R250(购自国药集团)染色。

由图2可以看出，与市场上的同类产品——培门冬酶(购自江苏恒瑞医药股份有限公司)和Oncaspar(购自SigmaTau制药公司)相比，我们的修饰产物SPA5K-ASP以及Oncaspar的电泳条带相对较窄，这说明SPA5K-ASP和原研药的修饰均一性均略好于培门冬酶。但并没有达到非常均一的程度，虽然门冬酰胺酶的4个亚基相同，每个亚基上课修饰的位点是相同的，但是由于空间位阻效应的存在，在修饰的过程中，已偶联上PEG分子的部位会对邻近的可修饰位点造成屏蔽效应，阻挡其它PEG分子的修饰。并且由于4个亚基空间排列结构上有微小的差异，造成相同的可修饰位点在不同的亚基上的反应性不同，综合这两种作用因素，用随机修饰的方法对门冬酰胺酶进行修饰，基本不能达到每个亚基偶联上相同数目的PEG分子。图2中，SPA5K-ASP的电泳条带明显高于培门冬酶，这也说明SPA5K-ASP的分子量明显高于培门冬酶，和实施例1中的结果相一致。由于培门冬酶也是用分子量为5K的PEG进行修饰的，因此说明本实施例中的SPA5K-ASP的修饰度应该高于培门冬酶，但和Oncaspar基本一致。

实施例3：PEG化ASP修饰位点数的确定

精确量取实施例1中制备例纯化得到的1mg/ml门冬酰胺酶(ASP)溶液40、80、120、200、300、400μl分别置于试管中，加pH8.0的0.02mol/L的pb溶液至1ml，然后加入pH9.16NaHCO₃-Na2CO₃缓冲液1ml，再加入0.1％TNBS溶液1ml，在混合振荡器上剧烈振荡。另取1mg/ml的Oncaspar溶液、本申请的PEG-ASP偶联物(制备例1)、培门冬酶同上操作。上述样品于40℃反应1.5小时，然后分别加入10％SDS溶液1ml，再分别加入1MHCl0.5ml。于424nm处测定其OD值，绘制标准曲线。分别对Oncaspar样品、SPA5k-ASP、恒瑞培门冬酶样品进行了分析。

其中，PEG化平均修饰率的计算：

平均偶联的PEG个数的计算：平均偶联的PEG个数＝PEG平均修饰度×可修饰位点，(用分子量为5000Da的PEG修饰时，可修饰位点为33个；用分子量为2000Da的PEG修饰时，可修饰位点为55个；用分子量为10000Da的PEG修饰时，可修饰位点为20个)计算结果如表2所示。

表2平均修饰度以及偶联的PEG个数

样品	平均修饰度	偶联的PEG个数
			Oncaspar	65.6％	21.64
SPA5K-ASP	65％	21.45
			培门冬酶	57.4％	18.942

根据表2可以看出，SPA5K-ASP偶联的PEG个数高于培门冬酶样品，平均每个门冬酰胺酶的表面偶联了21.45个PEG分子，比培门冬酶多偶联2.5个PEG分子。这个结果和实施例1和2中的结果相一致，进一步确定了SPA5K-ASP的分子量大于培门冬酶。而SPA5K-ASP和Oncaspar的修饰度基本相同，这和实施例1和2中的结果也是一致的。

而制备例2-7中偶联的PEG个数分别为13.1，45.2，8.5，20.3，22.5，21.6个。偶联的PEG个数随PEG分子量的增加而减少。相同分子量不同活化基团的PEG，偶联的PEG个数略有差别。

实施例4：PEG-ASP偶联物的偶联基团的稳定性研究

将培门冬酶、Oncaspar以及SPA5K-ASP分别用Tris-HCl(9.0)的缓冲液稀释到1mg/ml。放入55℃水浴锅中，分别于0h、1h、2h、3h、4h、5h之后各取出100ul，分别用于蛋白电泳分析以及碘染分析和酶活性检测。

由图3a可以看出，和第2泳道的条带比较，第3泳道的条带明显向下迁移，说明样品的分子量出现下降，表明样品在55℃水浴条件下一个小时就出现了降解。第4-7泳道的条带继续向下迁移，说明样品不断降解。而在第8-13泳道中可以看出，蛋白的条带并没有出现显著迁移，说明样品SPA5K-ASP在此水浴条件下，5小时内并没有出现降解现象。而从14-19泳道可以看出，和Oncaspar相同，培门冬酶的样品在5h内，也出现了显著的降解，并且降解程度大于Oncaspar。

由于PEG可以和碘离子形成复合物，因此通过碘染的方法可以检测PEG分子。在图3b的碘染图中可以看出，和图3a结果类似。Oncaspar和培门冬酶的样品在5h内，出现了显著的降解，条带不断向下迁移，并且颜色变浅，说明其PEG不断脱落。在3-8以及15-20泳道的底部的颜色较深的条带是PEG条带，颜色逐渐变深，说明培门冬酶以及Oncaspar解离的PEG分子个数随着水浴处理时间的延长而增加。而在第9-14泳道的SPA5K-ASP样品中并没有出现条带降解的现象，说明并没有出现PEG分子解离。

除了进行电泳分析，对样品还进行了酶活性的检测(参照2005版药典第二部第31页所述方法进行)，结果见图3c。由图可以看出，经过水浴处理1小时，培门冬酶的活性基本完全损失，活性基本为零，Oncaspar样品的酶活略好于培门冬酶，在处理1小时后保留了30％左右的活性，而SPA5K-ASP样品在处理1小时后保留了70％左右的活性，在处理5小时后依然保持了30％左右的生物活性，稳定性显著优于培门冬酶和Oncaspar。虽然在图3a，b中，SPA5K-ASP样品并没有发生降解，但55℃加热处理，应该对门冬酰胺酶的三级结构造成了破坏，从而引起了活性降低。分析培门冬酶和Oncaspar活性显著降低的原因，应该和其PEG容易脱落有关，由于PEG分子的不断脱落，使得PEG对门冬酰胺酶的保护作用显著降低，造成活性损失较大。而SPA5K-ASP样品在处理过程中没有发生PEG脱落，PEG分子可以很好的增加门冬酰胺酶的热稳定性，因此活性损失相对较慢。

制备例2-7中的产物通过稳定性考察，都没有出现PEG脱落的现象。

实施例5：PEG-ASP偶联物和原蛋白的荧光谱图分析

修饰蛋白以及未修饰蛋白的内源荧光检测的激发波长为280nm，发射波长范围为300～400nm。扫描速度为1200nm/min。激发和发射的缝隙宽度(slitwidths)均为5nm，使用0.1cm的样品池，在室温下进行检测。待测蛋白质的浓度范围是0.1～0.2mg/ml。

通过内源荧光(IntrinsicFluorescence)来检测PEG修饰对门冬酰胺酶三级结构的影响。如图4所示，当激发波长为280nm时，门冬酰胺酶及其修饰产物的发射荧光峰值在315nm处。SPA5K-ASP样品和门冬酰胺酶以及已上市的培门冬酶和Oncaspar，其荧光光谱基本一致，在315nm处有特征吸收峰。这表明PEG对门冬酰胺酶的修饰不影响其三级结构。样品吸收值有一定的差异，这可能跟样品的蛋白浓度的差异有一定关系。

实施例6：门冬酰胺酶的PEG偶联物对不同肿瘤细胞的抑制作用比较

为了评价PEG-ASP偶联物对肿瘤细胞的抑制率，并和培门冬酶以及Oncaspar进行比较，我们选择了THP-1(来源于人的单核细胞白血病细胞系)、Raji(来源于人的淋巴瘤细胞系)、L1210(来源于小鼠的白血病细胞)这三种细胞进行评价。通过MTT法检测细胞的抑制率，考察了不同给药浓度的抑制率，并最终计算出IC₅₀值，计算结果如表3所示。

表3SPA5K-PEG-ASP偶联物及培门冬酶对肿瘤细胞的IC₅₀值

肿瘤细胞	Oncaspar	SPA5K-ASP	培门冬酶
				THP-1	7.5μmol/L	3.05μmol/L	7.9μmol/L
Raji	8.1μmol/L	2.4μmol/L	8.8μmol/L
				L1210	10.69μmol/L	7.305μmol/L	10.28μmol/L

根据实验结果，本发明的PEG修饰后的门冬酰胺酶对上述3种肿瘤细胞均表现出良好的抗肿瘤作用，而本发明的PEG修饰后的门冬酰胺酶的抗肿瘤活性明显高于培门冬酶和Oncaspar。

实施例7：PEG-ASP偶联物的药代动力学研究

我们比较了本发明专利中制备的SPA5K-ASP和已上市的同类产品培门冬酶的药代动力学特点。

我们分别考察了静脉注射和肌肉注射给药的药代动力学。对样品采用IODOGEN标记方法进行¹²⁵I标记。并对标记后的供试品进行纯化，经SHPLC验证纯度。标记后的系列样品采用BCA蛋白测定试剂盒进行蛋白浓度测定，然后分别与各自一定量的未标记的样品混合，用1×的PBS缓冲液(10×的溶媒用注射用水稀释到1×)将样品稀释1.175mg/mL的注射液，并取配制后的药物(5μL左右)，测定放射性。比活性＝放射性/蛋白浓度。给药后按照一定的时间点进行取样，如果各静脉给药组最后一个取血时间点血药浓度未低于2min时间点血药浓度的1/20，那么接下来继续取血每天一次，直至其血药浓度低于2min时间点的1/20。如果各肌肉给药组最后一个取血时间点血药浓度未低于达峰血药浓度的1/10，那么接下来继续取血每天一次，直至其血药浓度低于达峰血药浓度的1/10。取血后将血样立即置于加有肝素钠(1000IU/mL，10μL)抗凝的EP管中，颠倒5～10次，4000rpm离心5分钟分离出血浆。取50μL血浆，加入等体积的20％三氯乙酸(TCA)，涡旋混匀后，测定总放射性。之后4500rpm，常温离心10min，弃上清，测定沉淀部分放射性。

代谢动力学参数计算：采用WinNonlin6.2进行非房室模型方法(NCA)拟合计算AUC等主要代谢动力学参数；

2)浓度计算：

3)数据处理：采用Excel2007对均值、标准差等数据进行统计描述。

药代动力学各参数的计算结果见表3所示。

从图5a，b的药代动力学曲线可以看出，培门冬酶和SPA5K-ASP样品通过静脉注射(iv)和肌肉注射(im)两种注射方式后的药代动力学曲线基本一致。

相同剂量静脉注射给药后系统暴露的大小为SPA5K-ASP略大于培门冬酶；相同剂量肌肉注射给药后系统暴露的大小为SPA5K-ASP略大于培门冬酶。剂量经归一化后静脉和肌肉注射给药后系统暴露的大小均为SPA5K-ASP略大于培门冬酶。具体的药代动力学参数如下表4所示。

表4PEG-ASP偶联物和门冬酰胺酶的药代动力学参数比较

SPA5K-ASP静脉和肌肉注射给药后半衰期分别为55.8h和55.9h，培门冬酶静脉样品静脉和肌肉注射给药后半衰期分别为58.00h和46h。培门冬酶肌肉注射的半衰期略低于SPA5K-ASP。SPA5K-ASP样品的AUC都略大于培门冬酶，另外这两个样品的血浆清除率基本相同。

综合分析，由于两种样品采用的都是随机修饰方式，并且所使用的PEG分子量相同，因此药代动力学性质差异不大。由于培门冬酶存在PEG脱落的现象，因此其体外稳定性会弱于SPA5K-ASP样品。

Claims (7)

1.聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其特征在于，一分子门冬酰胺酶与13-45分子聚乙二醇偶联，所述聚乙二醇为平均分子量2-20KDa的直链聚乙二醇，所述聚乙二醇通过与门冬酰胺酶游离的氨基形成酰胺键或脲烷键来与门冬酰胺酶偶联。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，所述游离氨基包括赖氨酸残基和/或N-末端氨基。

3.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其结构通式如下所示：

其中

n是0到3的整数；m为13-45的整数；ASP是L-门冬酰胺酶。

4.根据权利要求1所述的聚乙二醇化的门冬酰胺酶，其由以下方法制备得到：

第一步：缓冲液置换

把门冬酰胺酶原料药溶液吸入离子交换层析柱，用平衡缓冲液平衡、用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱蛋白，所述洗脱缓冲液同时为下一步修饰反应中的修饰缓冲液；

第二步：修饰反应及修饰产物纯化

将第一步中收集的门冬酰胺酶溶液按门冬酰胺酶:PEG修饰剂为1:10-1：200的摩尔比进行反应，在4℃-37℃下反应1-24h；其中PEG修饰反应中门冬酰胺酶的蛋白浓度为5-40mg/ml；

反应结束后用离子交换色谱层析进行纯化；

所述PEG修饰剂结构通式如下：

其中n为0-3的整数，mPEG的分子量为5000Da-20KDa。

5.权利要求1-4任一项所述聚乙二醇化的L-门冬酰胺酶药学上可接受的盐或复合物。

6.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1～4任一项所述聚乙二醇化的门冬酰胺酶或其药学上可接受的盐或其复合物和药学上可接受的辅料。

7.权利要求1～4任一所述聚乙二醇化的门冬酰胺酶或权利要求6所述的药物组合物在制备治疗儿童或成人中的急性淋巴细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、何杰金氏病、急性骨髓白血病、急性骨髓单核细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤或黑素肉瘤的药物中的用途。