CN104046600B - 多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用 - Google Patents

多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用。本发明提供的多臂PEG修饰剂可用于加强多亚基蛋白的亚基间作用力，使多亚基蛋白保持聚合的形式，从而增加多聚体蛋白的稳定性，增强或保持多亚基蛋白的生物活性，同时减少各亚基解聚后抗原位点暴露的几率，降低免疫原性。此外，本发明中制备的PEG修饰后的门冬酰胺酶和市售的PEG化门冬酰胺酶产品“培门冬酶”相比，具有低免疫原性，高活性、高稳定性，PEG不会脱落等优点，更适用于抗肿瘤药物的制备。

Description

多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的 应用
技术领域
本发明涉及多臂聚乙二醇修饰剂的新用途及其在修饰门冬酰胺酶中的应用。
背景技术
聚乙二醇(PEG)是一种线性、在溶液中可自由卷曲的不带电荷的聚合物，具有无毒、微弱的抗原性和良好的生物相容性。用它来共价修饰蛋白质，可以增加蛋白质的体内循环半衰期和减小其抗原性，增加蛋白质的溶解性并会改变蛋白质在人体内的生物学分布。自1977年Abuchowski，Davis(J.Biol.Chem.1977,252:3578-3581.)等人首次报道用PEG修饰蛋白质以来，PEG修饰技术在生物医学和生物技术领域得到了广泛的应用，PEG已经被广泛地应用于蛋白质，多肽类药物的修饰研究。目前蛋白质PEG化技术已经成为降低蛋白质生物药物的免疫原性，以及改善其药代动力学/药效学性质最有效的方法之一，且已通过FDA认证可用于药物、食品和化妆品。
在大多数情况下，与未修饰的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白药物的活性会降低，一般修饰后的蛋白活性仅有原蛋白的30%-40%,甚至更低。例如Schering-Plough公司的PEG-Intron,是用分子量为5000的PEG修饰干扰素，修饰后其活性只有原蛋白的8%。此外，一般随着PEG分子量的增大，修饰后的蛋白质活性降低更明显。例如用分子量为20KDa、30KDa、40KDa的PEG修饰促红细胞生成素（EPO）后，活性随着PEG分子量的增大而显著减小(Yin-jueWang,journal of controlled release,2010(145):306-313)。Bailon等采用分支型40kDaPEG修饰Interferon-α-2a，所得单修饰物获得较长的循环半衰期，但是仅仅保留了7%的体外活性（Bailon P,Bioconjugate Chem.,2001,12:195-202.）。
聚乙二醇修饰技术经历了几十年的发展，目前虽然已经比较成熟。但并不能找出一种通用的聚乙二醇修饰剂以及修饰方法来对所有的蛋白药物进行修饰。蛋白的结构以及所用PEG的分子量、形状以及修饰的位点等对聚乙二醇化的蛋白质的生物活性以及药效有很大的影响。对于特定药物的修饰，聚乙二醇修饰剂是影响修饰产物理化性质、体内外生物活性、药代动力学、药效学以及修饰产物临床表现最重要的因素。因此，修饰剂的选择(修饰剂种类、分子量大小)以及修饰反应的控制在聚乙二醇修饰技术中占有重要地位。蛋白质结构的解析并不能准确预测天然蛋白质的药代动力学行为，而在蛋白偶联上PEG以后由于引入了许多新的变量如分子量、修饰剂种类等，对于PEG偶联物的药代动力学行为预测变得更加不可能。为此，针对不同的蛋白质药物，需要通过选择不同种类以及不同分子量的修饰剂，并通过理化性质检测、动物实验评价等确定最佳方案。
多亚基蛋白质（寡聚或多聚亚基蛋白质）指的是由两个以上彼此独立的亚基通过分子之间相互作用结合在一起的聚合体。其中，每个亚基一般由一条肽链组成，但也有两条以上肽链经二硫键相连组成。每个亚基自身折叠成一定的空间构型，不同亚基之间依靠疏水作用、氢键、离子键与作用力聚集在一起，形成蛋白质的四级结构，亚基之间相互作用构成有生物化学活性的整体。在自然界中，这种多亚基蛋白质在整个蛋白质家族中为数不少。例如，碱性磷酸酶由二个亚基构成，每个亚基分子量约为28KDa，整个分子的分子量约为56KDa；人肿瘤坏死因子就是三个亚基构成，每个亚基分子量约为17KDa，整个分子的分子量约为51KDa；L-门冬酰胺酶的活性形式为4个亚基组成的同源四聚体结构，每一亚基由326个氨基酸组成，整个蛋白分子的分子量约为140KDa；Hp尿素酶单体由A、B两个亚单位组成，呈六聚体，A、B两个亚单体的分子量分别为30KDa和64KDa左右，其比例为1∶1。多亚基蛋白质的生物学活性常常与其聚集体的结构有关。人肿瘤坏死因子TNF-α三聚体的生物学活性最高，是每个亚基单独存在时活性的8倍。而L-门冬酰胺酶只有在4个亚基组成的同源四聚体结构才能具有相应的生物学活性。另一方面，多亚基类蛋白解聚后不仅其活性一般会有显著降低，且作为药物在体内降解后，容易暴露出更多抗原表位，引起免疫反应，从而降低药效，引起副反应。因此，保持多亚基蛋白的生物学活性的重点在于如何防止亚基的解聚。
具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白（通常被称为L-天冬酰胺酶，L-门冬酰胺酶，或门冬酰胺酶）可以有效的治疗儿童或成人中的急性淋巴细胞白血病（ALL）。最近几年，含有L-天冬酰胺酶的药物已经用于联合化疗方案来治疗NK/T细胞淋巴瘤，并取得了较好的治疗效果。NK/T细胞淋巴瘤是中特殊类型的非霍奇金淋巴瘤，多见于亚洲和拉丁美洲，我国发病率相对较高。根据肿瘤发生部门，NK/T细胞淋巴瘤可分为鼻型NK/T细胞淋巴瘤和非鼻型NK/T细胞淋巴瘤。另外L-天冬酰胺酶还被用于治疗何杰金氏病，急性骨髓白血病，急性骨髓单核细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，淋巴肉瘤，网状细胞肉瘤和黑素肉瘤（Kotziaand labrou,J.Biotechnol.127(2007)657-669）。L-门冬酰胺酶的活性形式为4个亚基组成的同源四聚体结构，每一亚基由326个氨基酸组成。L-天冬酰胺酶最初从若干生物体中纯化，包括大肠杆菌（E.coli）和软腐欧文氏菌（Erwinia carotovora）。在哺乳动物中，仅在豚鼠(Cavioidea超科)和某些阔鼻猴(New World monkey)中发现略高于痕量的L-天门冬酰胺酶。但是，由于它来源于外源生物，对人而言是一种外源蛋白，有较强的免疫原性，临床上常见进行性免疫反应和全身性过敏反应，而限制了其临床应用。(张丽娜，宫道华.江苏医药.左旋门冬酰胺酶治疗小儿急性淋巴细胞性白血病的毒副反应.2005，31(5)：392；王宁玲，刘芝璋等.左旋门冬酰胺酶治疗儿童白血病的毒副作用及防治.中国小儿血液，2005，10(3)：133)。
目前针对L-门冬酰胺酶的聚乙二醇修饰研究已有很多。国外利用聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶的产品Oncaspar(Enzon inc)早在1994年就已上市，并在2006年起被批准作为儿童和成人的ALL的一线疗法。但是Oncaspar使用的PEG是琥珀酰亚胺琥珀酸酯（SS-PEG），这种PEG含有对酶的水解敏感的、或者在微碱性PH值时不稳定的酯键（美国专利号4670417）。这些性质显著降低了体外和体内的稳定性并且副作用也较大。而国内目前上市的PEG修饰的L-门冬酰胺酶只有恒瑞公司的“培门冬酶”，它是Oncaspar的仿制药，也存在着PEG容易降解脱落的问题。
国内相关的已授权的专利主要有两个，分别是连云港新阳医药有限公司的“聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的制备方法”（申请号02149328.6），和上海医药工业研究院的“聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶”（申请号200610027026.0）。其中连云港新阳医药有限公司的专利中所采用的修饰方法是两步反应法，首先用分子量较小的PEG修饰剂进行修饰，然后再用分子量较大的PEG修饰剂进行二次修饰。这种修饰方法步骤繁多，而且修饰产物的均一性难以控制，纯化方法复杂。而上海医药工业研究院的专利中使用的PEG修饰剂与门冬酰胺酶结合后不易水解，但修饰后活性损失较大，保留了原蛋白60%的活性。国外的阿利兹第二药物公司最近也申请了关于PEG修饰L-门冬酰胺酶的专利。这个专利中所使用的PEG修饰剂也是较常用的随机修饰氨基的修饰剂，修饰的L-门冬酰胺酶是欧文氏菌来源的。另外国内外也有多篇PEG修饰L-门冬酰胺酶的论文发表，用的都是常规的单甲氧基PEG修饰剂。所有的这些专利和文章中PEG修饰后的L-门冬酰胺酶和未修饰的原蛋白比较，免疫原性有了降低，但依然存在有免疫原性的问题。并且，这些专利和文章也都没有涉及解决多亚基蛋白质的亚基解聚的问题。
发明内容
为了克服现有技术中的上述技术问题，本发明的目的之一是提供多臂聚乙二醇修饰剂在修饰多亚基蛋白中的应用。
所述聚乙二醇修饰剂优选与多亚基蛋白质的氨基偶联。
优选的，本发明使用的聚乙二醇修饰剂为醛基活化的或酯活化的四至八臂聚乙二醇修饰剂。优选为四臂聚乙二醇修饰剂。
更优选的，本发明使用的多臂聚乙二醇修饰剂的结构式分别如式（I）或式（II）所示：
n为1到2000整数值，优选为2-500之间的整数值，更优选为25-100之间的整数；k为1或2，首选1；m为2-16之间的整数，首选4；p为1-4之间的整数，首选为2；聚乙二醇修饰剂的分子量在1～100kDa之间，优选为1～40kDa之间，更优选为5～10kDa。
更优选的，上述酯活化的聚乙二醇修饰剂是，四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯（4ARM-SCM）、四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯（4ARM-SPA）或四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯（4ARM-SC）。最优选为四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯（4ARM-SCM）。
上述醛基活化的聚乙二醇修饰剂是，四臂聚乙二醇丙醛(4ARM-PALD)、四臂聚乙二醇丁醛(4ARM-BALD)、四臂聚乙二醇乙醛(4ARM-ALD)或四臂聚乙二醇戊醛(4ARM-AALD)。最优选为四臂聚乙二醇丙醛。
聚乙二醇修饰剂分子根据聚合度不同，可以是分子量为2KDa～40KDa的任一分子，其中优选分子量为5KDa的聚乙二醇分子。所使用的多臂PEG首选上述结构式的，但不局限于上述结构式。
上述所述的多亚基蛋白质包括但不限于L-门冬酰胺酶，碱性磷酸酶以及尿素酶。
本发明的另一目的是提供一种上述的聚乙二醇化的多亚基蛋白质的制备方法，包含以下几个步骤：
（1）需要修饰的多亚基蛋白质和多臂聚乙二醇修饰剂按摩尔比1:5-1:200的比例混合，混合后在缓冲液中进行修饰反应；
（2）修饰反应结束后用离子交换层析去除掉修饰产物中未与蛋白发生反应的多臂聚乙二醇修饰剂；
（3）用凝胶过滤层析对修饰产物进行纯化，收集目的修饰产物；
其中使用的多臂聚乙二醇修饰剂和多亚基蛋白质同上所述。
优选的，当上述所述多臂聚乙二醇修饰剂为丙醛活化的多臂聚乙二醇时，所述缓冲液的pH值范围是大约5.0至6.0。
优选的，当上述所述多臂聚乙二醇修饰剂为琥珀酰亚胺乙酸酯活化的多臂聚乙二醇时，所述缓冲液的pH值范围是大约7.0至8.0。
优选的，上述步骤（1）的修饰反应在蛋白浓度为3mg/mL-15mg/mL下进行。
本发明的另一个目的是提供一种多臂聚乙二醇修饰的多亚基蛋白质。所述多臂聚乙二醇修饰剂优选与多亚基蛋白质的氨基偶联。
其中使用的多臂聚乙二醇修饰剂和多亚基蛋白同上所述。
本发明的第四个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物含有多臂聚乙二醇修饰的多亚基蛋白质或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的辅料。
优选的，上述所述药物组合物为冻干粉针剂。所述的辅料包括药学上可接受的载体和/或赋形剂等。
优选的，上述所述多臂聚乙二醇修饰的多亚基蛋白质及其药物组合物通过肌肉、静脉或皮下途径给药。
药学上可接受的盐在其被施用的量和浓度存在时是非毒性的。制备此类盐可通过改变化合物的物理特征而不妨碍其发挥生理学效果来促进药物应用。在物理特性方面有用的改变包括降低熔点以促进经粘膜施用，以及增加溶解性以促进施用更高浓度的药物。
上述所述的药学上可接受的盐包括酸加成盐，例如含有硫酸盐、盐酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐等。上述所述的药学上可接受的盐可来自酸，包括盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸等。
药学上可接受的载体和/或赋形剂也可被掺入根据本发明的药物组合物中促进特定门冬酰胺酶的施用。适于实施本发明的载体包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖类（乳糖、葡萄糖、蔗糖），或各种淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油，聚乙二醇以及生理学上相容的溶剂（包括用于注射的无菌水溶液，盐溶液和右旋糖苷等）。
本发明的第五个目的是提供一种多臂聚乙二醇修饰的门冬酰胺酶。所述聚乙二醇优选与多亚基蛋白质的氨基偶联。其中使用的多臂聚乙二醇同上所述。
本发明还提供了多臂聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶在治疗急性白血病的用途。
有益效果：
本发明中，经过申请人研究发现多亚基蛋白质各亚基解聚主要是由于蛋白亚基之间靠非共价键作用来维持其高级结构，这种作用力不如共价键稳定，因此在体内很容易降解，并且解聚后各亚基更多的抗原表位暴露，导致免疫原性较强。解决这一问题的方法就是要增强亚基之间的作用力，并且同时不影响蛋白的活性，或者是影响较小。因此申请人考虑用聚乙二醇修饰，但目前常用的单甲氧基PEG修饰剂显然无法增强亚基之间的作用力。因此需要一种修饰剂，可以与蛋白偶联的同时，增强各亚基之间的作用力。各亚基之间的作用力增强后，在体内就不易降解，从而不会暴露出抗原表位而产生免疫原性的问题。而本发明中的多臂PEG修饰剂正符合这种要求，这类PEG修饰剂的特点是：一个PEG分子上具有多个活化基团可以和蛋白的氨基酸残基进行反应。虽然，本发明中所采用的多臂PEG修饰剂都是目前现有的PEG修饰剂，但是在本发明之前并没有文献报道采用该类多臂PEG修饰剂来修饰多亚基蛋白质，以解决多亚基蛋白质中各亚基解聚而引起的稳定性降低、失活、免疫原性增强等问题。
并且，经实验验证，本发明提供的多臂PEG修饰的多亚基蛋白质，和原蛋白或者一般的聚乙二醇修饰的多亚基蛋白质相比，能够很好的把多亚基进行偶联，更有效的防止了亚基解聚的问题，稳定性更好。例如，本发明提供的多臂聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶，碱性磷酸酶以及尿素酶等，比原蛋白或者用一般PEG修饰剂修饰后，具有更高的稳定性和保持生物活性的能力，且结构稳定均一。而本发明中制备的PEG修饰后的门冬酰胺酶和市场上的PEG化门冬酰胺酶产品“培门冬酶”比较，具有低免疫原性，高稳定性，PEG不易脱落等优点，而且，本发明提供的多臂PEG修饰的门冬酰胺酶还保留了较高的生物活性，且具有半衰期明显延长、结构稳定均一的特点。
目前已有文献报道用培门冬酶联合化疗治疗NK/T细胞淋巴瘤，并取得较好疗效。培门冬酶是PEG对大肠杆菌来源的L-门冬酰胺酶进行修饰后制备得到的产品，而本发明中提供的聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶也是大肠杆菌来源的。因此也应该具有和培门冬酶相似的治疗效果。也就是说本发明中提供的多臂聚乙二醇修饰的L-门冬酰胺酶可以用于联合其它化疗药物来治疗NK/T细胞淋巴瘤。
附图说明
图1：不同PEG-ASP偶联物的蛋白电泳分析。
不同PEG修饰ASP后的蛋白电泳图。第1-6泳道的样品分别是蛋白Marker、培门冬酶、4SCM5K-ASP、8SCM10K-ASP、4PALD5K-ASP、4PALD10K-ASP。通过蛋白结果可以看出培门冬酶的分子量呈现弥散状，而多臂PEG修饰剂制备的PEG-ASP偶联物分子量较为单一，可见用多臂PEG修饰剂制备的偶联物均一性显著优于用单甲氧基PEG修饰剂进行修饰的样品。
图2：不同PEG修饰AKP和URE后的蛋白电泳图。
其中，图a中第1-3泳道的样品分别是蛋白Marker、SCM5K-AKP、4SCM5K-AKP。图b中第1-3泳道的样品分别是蛋白Marker、SCM5K-URE、4SCM5K-URE。通过蛋白电泳结果可以看出用多臂PEG修饰剂能够稳定多亚基蛋白的活性结构，多臂PEG修饰后的偶联物样品更均一。由此可见，与传统的单甲氧基PEG修饰剂相比，多臂PEG修饰剂修饰的多亚基蛋白的分子量较单一，偶联物的均一性较好。
图3：PEG-AKP,PEG-URE偶联物的热稳定性研究。
通过测定PEG-AKP,PEG-URE偶联物在60℃水浴条件下，不同时间的活性变化来评价其稳定性。其中，图a是SCM5K-AKP、4SCM5K-AKP的测试结果图，结果显示，SCM5K-AKP在2h内活性发生显著降低，5h后基本丧失全部活性，而4SCM5K-AKP在检测过程中活性降低较慢，5h后依然可保留60%的原有活性。图b是SCM5K-URE、4SCM5K-URE的测试结果图。结果显示，SCM5K-URE在1h内基本丧失活性，而4SCM5K-URE在2h后依然可保存原有活性的40%。由此可见，与传统的单甲氧基PEG修饰剂相比，多臂PEG修饰剂可以显著提高多亚基蛋白的稳定性。
图4：不同PEG-ASP偶联物的体外生物活性。
比较不同PEG-ASP偶联物的体外生物活性。生物活性检测结果表明培门冬酶的活性较低，仅有原蛋白的40%；而4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP,4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP这4种修饰产物的活性都比较高，保留了原蛋白80%的活性。
图5：不同PEG-ASP偶联物的稳定性研究。
比较了不同PEG-ASP偶联物在37℃下的稳定性，并和培门冬酶进行比较。稳定性分析结果表明4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP的稳定性较好，活性基本没有下降。4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP的活性虽有显著降低，但仍优于培门冬酶。
图6：PEG-ASP偶联物和培门冬酶的PEG蛋白电泳碘染结果。
通过蛋白电泳后的碘染结果来分析偶联物的PEG脱落情况。其中图a为培门冬酶在37℃水浴中放置不同时间后的蛋白电泳图。泳道1为蛋白Marker，泳道2为分子量为5000的单甲氧基PEG，泳道3-12分别为培门冬酶在37℃水浴中放置0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h后的蛋白电泳图；图b为4SCM5K-ASP在37℃水浴中放置不同时间后的蛋白电泳图。泳道1为蛋白Marker，泳道2为4SCM5K，泳道3-12分别为4SCM5K-ASP在37℃水浴中放置0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h后的蛋白电泳图。
根据上两图的比较结果显示培门冬酶的稳定性较差，存在明显的PEG脱落现象，并且随着时间的延长，PEG脱落进一步加剧。而4SCM5K-ASP在108小时未发生PEG脱落的现象。
图7：不同PEG-ASP偶联物和原蛋白的圆二色谱图比较。
其中图a为PEG-ASP偶联物的远紫外区圆二色谱图，图b为PEG-ASP偶联物的近紫外区圆二色谱图。
比较不同PEG-ASP偶联物和原蛋白的圆二色谱图，分析其结构上的差别。通过圆二色谱图可以看出，和培门冬酶相同，ASP用不同的多臂PEG修饰以后，其近紫外和远紫外的圆二色谱图基本没有改变，说明修饰后ASP的二级结构和三级结构没有发生改变。
图8：不同PEG-ASP偶联物的药效比较。比较了不同PEG-ASP偶联物的药效，并和原蛋白以及培门冬酶做比较。药效试验表明4SCM10K-ASP和4PALD10K-ASP对肿瘤细胞的抑制作用好于培门冬酶。
图9：不同PEG-ASP偶联物的免疫原性。
比较了不同PEG-ASP偶联物的免疫原性，并和原蛋白以及培门冬酶做比较。从结果可以看出4SCM5K-ASP和4PALD10K-ASP产生的抗体滴度低于原蛋白和培门冬酶。
具体实施例
定义：
本发明使用的缩写含义如下：
PEG，聚乙二醇；PEG修饰剂，聚乙二醇修饰剂；多臂聚乙二醇修饰剂，含有两个及以上活化基团的聚乙二醇分子。
聚乙二醇(PEG，HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH)是一种两端带羟基的线型聚合物，聚乙二醇是经环氧乙烷聚合而成的，由重复的氧乙烯基组成，有分支型，直链型和多臂型。PEG也被称为poly(ethyleneoxide)(PEO)，poly(oxy-ethylene)(POE)，或者polyoxirane。一般情况下，分子量低于20,000的被称为PEG，分子量更大的被称为PEO。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇（mPEG），这种衍生物是蛋白质聚乙二醇化技术中最常用到。
聚乙二醇修饰剂，则是指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是指经过活化的聚乙二醇，目前主要用于蛋白质以及多肽药物修饰，又叫修饰性聚乙二醇，修饰性PEG。
4SCM5K，分子量为5KDa的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯；
8SCM10K,分子量为10KDa的八臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯；
4SCM10K，分子量为10KDa的四臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯；
4PALD5K，分子量为5KDa的四臂聚乙二醇丙醛；
4PALD10K，分子量为10KDa的四臂聚乙二醇丙醛；
SCM5K,分子量为5KDa的单甲氧基琥珀酰亚胺乙酸酯；
AKP，碱性磷酸酶；ASP，门冬酰胺酶；URE，尿素酶。
本申请中所用，术语“偶联物”，是指聚乙二醇修饰门冬酰胺酶或尿素酶等多亚基蛋白质后得到的修饰产物；
几种聚乙二醇修饰门冬酰胺酶的修饰产物可在本申请中称为“4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP,4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP”统称为PEG-ASP或PEG修饰ASP的偶联物。聚乙二醇修饰碱性磷酸酶后的修饰产物可在本申请中称为“4SCM5K-AKP,SCM5K-AKP,”统称为PEG-AKP或PEG修饰AKP的偶联物。聚乙二醇修饰尿素酶后的修饰产物可在本申请中称为“4SCM5K-URE,SCM5K-URE,”统称为PEG-URE或PEG修饰URE的偶联物。
本发明的聚乙二醇修饰剂优选具有下列范围内的分子量：大约2KDa至大约40KDa。更具体地，聚乙二醇修饰剂具有选自下列的分子量：2KDa，5KDa，10KDa。在特定的实施方式中，聚乙二醇修饰剂的分子量为5KDa，10KDa。
本发明使用的聚乙二醇修饰剂优选下面几种：醛基活化的和酯活化的聚乙二醇，更具体地，聚乙二醇修饰剂为丙醛活化的和琥珀酰亚胺乙酸酯活化的聚乙二醇。
在本发明中，所修饰的蛋白，可以是任何来源的多亚基蛋白质。在特定实施例中，所修饰的多亚基蛋白为碱性磷酸酶和尿素酶。在特定实施例中，所修饰的多亚基蛋白为门冬酰胺酶，可从任何来源衍生、克隆或产生，包括来自动物或通过基因重组技术或它们的组合。例如，门冬酰胺酶可从大肠杆菌中提取，包括但不限于大肠杆菌。在本发明的偶联物的特定实施方式中，门冬酰胺酶与包含SEQ ID NO:1的序列的蛋白具有至少约60%的序列一致性。更特别地与包含SEQ ID NO:1的蛋白具有至少约65%，70%，75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或100%的序列一致性。
在特定的实施方式中，所述蛋白为大肠杆菌来源的门冬酰胺酶，其具有SEQ IDNO:1的序列。
SEQ ID NO:1的蛋白的片段也被包含在本发明的偶联物中所使用的蛋白的定义中。所述的“SEQ ID NO:1的蛋白的片段”是指多肽的序列可包括比SEQ ID NO:1更少的氨基酸。
本领域熟知的是，可通过置换、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸来修饰多肽但同时保留其酶活性。例如，在给定的位置通过化学上等同的氨基酸来置换一个氨基酸而不影响蛋白的功能特性是常见的。因此，可预期如下改变将产生功能上等同的产物：产生以一个带负电的残基取代另一个的改变或产生一个带正电的残基取代另一个的改变。
对氨基酸序列中氨基酸残基被修饰的位置以及经受修饰的氨基酸的数目没有特别的限制。技术人员能够识别可被引入而不影响蛋白活性的修饰。
用于制备偶联物的方法：
门冬酰胺酶、碱性磷酸酶或尿素酶可使用本领域已知的方法通过连接基团共价结合PEG，例如《聚乙二醇化学：生物技术和生物医学应用》，J.M.Harris编辑（1992），所揭示的纳入本文供参考。
用来使PEG共价结合多亚基蛋白的连接基团可以是任何生物相容的连接基团。“生物相容”表示化合物或基团是非毒性且可在体外或体内使用而不引起损伤、呕吐、疾病或死亡。PEG可结合连接基团，例如通过酯键、硫醇键或酰胺键。
本发明中，最优选的生物相容连接基团的共同特征是它们通过琥珀酰亚胺乙酸酯基团或丙醛基团与多亚基蛋白的氨基偶联。另外，蛋白可通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联。在一个最优实施方案中，PEG偶联门冬酰胺酶、碱性磷酸酶、尿素酶上的氨基。
一方面，本发明涉及制备偶联物的方法，所述方法包括使用一定量的多臂PEG修饰剂与一定量的门冬酰胺酶、碱性磷酸酶或尿素酶在缓溶液中反应足量时间至使PEG与之共价结合。在特定的实施方式中，所述门冬酰胺酶来自大肠杆菌，并且更特别的，所述门冬酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。在一个实施方式中，所述PEG为4SCM5K和4ALD10K。
在一个特定的实施方式中，当使用的是丙醛活化的PEG时，缓冲液的pH值在大约4.0至大约9.0的范围内。最优选的pH值范围是大约5.0至6.0，例如，pH值约为5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9或6.0。
当使用的是琥珀酰亚胺乙酸酯活化的PEG时，缓冲液的pH值在大约6.0至大约9.0的范围内。最优选的pH值范围是大约7.0至8.0，例如，pH值约为7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9或8.0。
此外，门冬酰胺酶、碱性磷酸酶、尿素酶的聚乙二醇化在下列蛋白浓度下进行：大约0.5-30mg/mL，更特别的大约2mg/mL-20mg/mL，最特别地大约3mg/mL-15mg/mL。在特定的实施方式中，在这些蛋白浓度下聚乙二醇化的门冬酰胺酶来自大肠杆菌，并且更特别的，所述门冬酰胺酶包含SEQ ID NO：1的序列。
在升高的蛋白浓度下，聚乙二醇化反应快速进行，在少于3h之内。此外，所应用的PEG与门冬酰胺酶、碱性磷酸酶、尿素酶的摩尔比至多为200：1。例如，摩尔比为200：1，150：1，100：1，80：1，70：1，60：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，5：1。
本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
实施例1：门冬酰胺酶的PEG偶联物的制备及分析
制备例1，本发明聚乙二醇化门冬酰胺酶通过如下方法制备、纯化、鉴定：
1.PEG偶联物样品制备
用50mM pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液（购自国药集团）溶解门冬酰胺酶（购自千红制药，具有SEQ ID NO:1的序列）以配制成为8mg/mL的溶液，分别用4PALD5K，4PALD10K(购自北京键凯科技有限公司)作为聚乙二醇修饰剂进行修饰，门冬酰胺酶：聚乙二醇修饰剂:还原剂（氰基硼氢化钠，购自sigma公司）为1:50:2500的摩尔比进行反应，在4℃下反应12h后，加入1M甘氨酸终止反应。
另外以50mM pH7.5的PB缓冲液（磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配置而成，试剂购自国药集团）溶解门冬酰胺酶，配制成为8mg/mL的溶液，分别用4SCM5K,8SCM10K(购自北京键凯科技有限公司)作为聚乙二醇修饰剂进行修饰，按门冬酰胺酶：聚乙二醇修饰剂为1：50的摩尔比进行反应，在4℃下反应2h。
2.PEG偶联物样品纯化
2.1色谱法去除未反应PEG
色谱法条件：Q离子交换柱（购自GE公司，HiTrap Q HP5mL），平衡缓冲液：20mM的Tris-Hcl（pH8.0），（试剂购自国药集团）。洗脱缓冲液：含1M NaCl的20mM的Tris-HCl（pH8.0），（试剂购自国药集团）。流速2.5mL/min，检测波长为280nm。
上样：上述修饰反应产物用0.5M的NaOH溶液调节至pH8.0，结合至Q离子交换柱。
平衡：平衡缓冲液液冲洗5个柱体积。
收集：50%的洗脱缓冲液洗脱，并收集洗脱峰样品。
2.2色谱法纯化单修饰PEG偶联物
色谱法条件：Hiload16/60Superdex200pg（购自GE公司）半制备型凝胶过滤柱，洗脱液为PBS，流速1.5mL/min，检测波长为280nm。
3.PEG偶联物样品的蛋白电泳检测
蛋白浓缩胶为5%，分离胶为7%。浓缩胶缓冲液为0.5M Tris-HCl缓冲液(pH6.8);分离胶缓冲液为1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.8)。取10ug蛋白样品，与样品缓冲液等体积混合，在100℃下煮沸5min后上样运行，电泳结束后用考马斯亮蓝R250(购自国药集团)染色。
由图1可以看出，修饰产物4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP,4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP的电泳条件非常均一，说明ASP的4个亚基得到了很好的偶联。而比较市场上的同类产品——培门冬酶（购自江苏恒瑞医药股份有限公司），均一性得到很大提高。
制备例2至4除了pH值、反应温度、反应时间、蛋白浓度、摩尔比不同之外，其他方法与制备例1相同，具体参数与得率如下表所示：
表1制备例2至4相关参数
反应条件 制备例二 制备例三 制备例四
pH值 6.0 7.0 8.5
修饰剂 4PALD5K 4SCM5K 8SCM10K
摩尔比（蛋白:PEG:还原剂） 1:100:5000 1:25(不加还原剂) 1:100（不加还原剂）
反应温度 25℃ 4℃ 37℃
反应时间（小时） 5 24 2
蛋白浓度（mg/mL） 15 10 1
收率(%) 80 78 85
实施例2：碱性磷酸酶和尿素酶的PEG偶联物的制备及分析
碱性磷酸酶（AKP）是广泛分布于人体各脏器器官中，碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。AKP为同源二聚体蛋白，每个亚基的分子量为28KDa。
Hp尿素酶单体由A、B两个亚单位组成，呈六聚体，A、B两个亚单体的分子量分别为30KDa和64KDa左右，其比例为1∶1，本实施例中所使用的尿素酶是不能形成的6聚体的，只是由A,B两个亚基形成的单体蛋白。
用50mM pH7.5的PB缓冲液分别溶解碱性磷酸酶（购自SIGMA）和尿素酶（购自SIGMA），配制成为8mg/mL的溶液，分别用SCM5K,4SCM5K,(购自北京键凯科技有限公司)作为聚乙二醇修饰剂进行修饰，按碱性磷酸酶或尿素酶：聚乙二醇修饰剂为1：50的摩尔比分别进行反应，在4℃下反应2h。
修饰产物的制备和蛋白电泳分析和实施例1中的制备例1相同。分析结果见图2所示。如图2可以看出，4SCM5K-AKP和4SCM5K-URE的均一性要显著高于SCM5K-AKP和SCM5K-URE，可见四臂PEG修饰剂能够很好把AKP或URE的亚基都偶联在一起，而用单甲氧基的PEG修饰剂修饰后得到的修饰产物的均一性较差，单甲氧基的PEG修饰剂无法达到聚合各亚基的作用。
通过实施例1和2可以看出，使用多臂PEG修饰剂对碱性磷酸酶、门冬酰胺酶、尿素酶蛋白进行修饰，可以把蛋白的亚基偶联在一起，使得修饰产物的均一性显著提高。其中碱性磷酸酶和尿素酶是二亚基蛋白，门冬酰胺酶是四亚基蛋白。由此可见，多臂PEG修饰剂适用于多亚基类蛋白的修饰，和单甲氧基的PEG修饰剂比较，可以把亚基之间进行偶联，从而起到提高修饰产物的均一性的目的。
实施例3：碱性磷酸酶和尿素酶的PEG偶联物的热稳定性研究
为了比较单甲氧基PEG修饰剂修饰后的碱性磷酸酶和尿素酶的稳定性和多臂PEG修饰剂修饰后的稳定性。本实施例分别检测了实施例2中的4SCM5K-AKP、4SCM5K-URE、SCM5K-AKP和SCM5K-URE这4种修饰产物在60℃水浴放置一段时间后的活性变化，以此来研究其稳定性的差别。具体方法如下：把PBS缓冲液溶解的蛋白浓度为1mg/mL的样品置于60℃水浴中，每隔一段时间取样并放入4℃冰箱备用。取样结束后测定其活性，根据其活性的变化评价其稳定性。结果如下图3所示。
由图3a可以看出，4SCM5K-AKP的稳定性显著好于SCM5K-AKP，在60℃水浴条件下120min时，4SCM5K-AKP还保留了70%的活性，而SCM5K-AKP的活性则下降到40%左右，在400min时，4SCM5K-AKP还保留了60%左右的活性，而SCM5K-AKP则基本完全失活。说明用多臂PEG对AKP的亚基进行偶联后，其稳定性要高于用常规单甲氧基PEG对其修饰的修饰产物。同样在图3b中可以看出，4SCM5K-URE的稳定性显著好于SCM5K-URE，在60℃水浴条件下120min时，4SCM5K-URE还保留了40%的活性，而SCM5K-URE则几乎完全失活。说明用多臂PEG对URE的亚基进行偶联后，其稳定性要高于用常规单甲氧基PEG对其修饰的修饰产物。由此可见，用多臂PEG对二亚基蛋白进行偶联后，其稳定性优于比用单甲氧基的PEG偶联后的产物。
实施例4：PEG-ASP偶联物的体外活性检测
门冬酰胺酶可以水解门冬酰胺的酰胺基，根据这一原理，可以对门冬酰胺酶的活性进行测定。具体测定方法参照2005版药典第二部第31页所述方法进行。测活所需的试剂都购自国药集团化学试剂有限公司。检测的样品分别是4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP,4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP以及未修饰的原蛋白和市场上的同类产品培门冬酶(购自江苏恒瑞医药股份有限公司)。它们的相对活性比较结果如图4所示。
由图4活性测定的结果可以看出，本发明的PEG修饰门冬酰胺酶后的活性和市场上的同类产品培门冬酶都有一定程度的降低，但本发明的PEG修饰门冬酰胺酶都能保持原蛋白80%左右的活性，而培门冬酶的活性显著下降，只有原蛋白50%左右的活性。
总体比较可以得出4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP,4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP这4种修饰产物的比活大于培门冬酶。
实施例5：PEG-ASP偶联物的热稳定性研究
为了验证PEG修饰后可提高门冬酰胺酶的稳定性并和培门冬酶的稳定性做比较，本实施例分别检测了实施例1中的4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP,4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP这4种修饰产物及原蛋白和培门冬酶在37℃水浴放置一段时间后的活性。具体方法如下：把PBS缓冲液溶解的蛋白浓度为1mg/mL的样品置于37℃水浴中，每隔一段时间取样并放入4℃冰箱备用。取样结束后检测其生物活性。检测结果如下图5所示。
通过活性测定的结果可以看出，原蛋白在25h后活性显著下降，48h后就已完全失活。培门冬酶的稳定性高于原蛋白，但是在75h后活性也开始显著下降，到120h时活性已完全丧失。而本发明多臂PEG修饰产物4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP,4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP的稳定性较高，活性降低较为缓慢，其中4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP的活性基本没有变化。
由此可见，本发明制备的4SCM5K-ASP，8SCM10K-ASP,4PALD5K-ASP，4PALD10K-ASP热稳定性均远高于培门冬酶。
根据实施例3、4、5的结果可以得知，用多臂PEG对多亚基类蛋白进行修饰后，其修饰产物的稳定性显著好于用常规的单甲氧基PEG进行修饰而得到的修饰产物。本发明所使用的多臂PEG适用于对所有多亚基类蛋白的修饰，通过对亚基之间进行共价键偶联后，大幅提高其稳定性，防止亚基的解离，降低由此带来的活性损失及免疫原性的产生。
实施例6：PEG-ASP偶联物的偶联基团的稳定性研究
聚乙二醇修饰剂可增强原蛋白的稳定性，但是由于偶联基团的不同，会存在偶联基团降解而引起的PEG脱落的现象，从而影响药物的稳定性及生物活性。为了比较本发明的PEG-ASP偶联物与市售培门冬酶的PEG修饰的稳定性，分别检测了4SCM5K-ASP，和培门冬酶在37℃水浴放置一段时间后的PEG脱落情况。具体方法如下：把PBS缓冲液溶解的蛋白浓度为1mg/mL的样品置于37℃水浴中，每隔一段时间取样并放入4℃冰箱备用。取样结束后进行蛋白电泳，电泳结束后用碘染色对PEG进行染色。检测结果如图6所示。
由图6a可以看出，培门冬酶样品中含有游离PEG，说明在进行稳定性考察前，PEG已开始脱落，并且随着时间的延长，PEG脱落进一步加剧。而从图6b中可以看出，4SCM5K-ASP在整个研究时间内未发生PEG脱落的现象。说明偶联的PEG与蛋白的氨基形成的共价键非常稳定，显著好于培门冬酶。PEG修饰类的蛋白药物一般都是注射剂，如果在体内发生PEG脱落，会使得蛋白的抗原决定簇暴露出来，引起显著的免疫原反应，从而导致药效降低并带来副作用。根据实验结果可知，多臂PEG修饰后的蛋白药物稳定性较高，不易发生PEG分子的脱落，从而增加了修饰后药物的稳定性，减少了药物引发机体免疫反应的几率。
实施例7：PEG-ASP偶联物和原蛋白的圆二色谱图分析
用圆二色光谱仪可以表征修饰蛋白以及未修饰蛋白的二级结构及三级结构。蛋白浓度范围是0.1～0.2mg/mL。样品加入1mm光径的圆二色比色杯，检测其远紫外区（190nm-250nm）和近紫外区（253nm-480nm）的圆二色光谱，扫描带宽为1nm，扫描速度为500nm/min。每次检测以相应缓冲液为背景，测三次取平均值。由图7可以看出，PEG-ASP偶联物的远紫外区圆二色谱图和原蛋白相比，偶联物的光谱几乎没有发生峰的位移，但峰值有一定程度的变化，这是由于PEG的修饰对其吸收值有一定的影响。但PEG-ASP偶联物和培门冬酶的图谱基本重合，说明用不同修饰剂修饰后的二级结构没有差别，这个结果符合PEG的特性，由于PEG在溶液中是一种柔性的两亲性大分子，因此偶联到蛋白表面后，不会对其结构有显著影响。说明PEG修饰没有影响KLK1的二级结构。同样的，PEG-ASP偶联物的近紫外区圆二色谱图和原蛋白相比，偶联物的光谱也几乎没有发生峰的位移，虽然峰值有一定变化，但和培门冬酶的谱图几乎重合，这说明PEG修饰没有影响ASP的三级结构。总体看来，通过不同修饰剂制备的偶联物，ASP的高级结构基本没有发生改变。由于偶联物经过PEG修饰后，其结构未变化，因此其活性和原蛋白比较，损失较少。
实施例8:不同PEG-ASP偶联物对不同肿瘤细胞的抑制作用比较
为了评价PEG-ASP偶联物对肿瘤细胞的抑制率，并和培门冬酶进行比较，我们选择了THP-1（来源于人的单核细胞白血病细胞系）、U937（来源于人的单核细胞白血病细胞系、Raji（来源于人的淋巴瘤细胞系）、Jurkat（来源人的急性T细胞白血病细胞系）、L1210（来源于小鼠的白血病细胞）、L5178Y（来源于的小鼠淋巴瘤细胞）这六种细胞进行评价。通过MTT法检测细胞的抑制率，考察了不同给药浓度的抑制率，并最终计算出IC50值，计算结果如表2所示。
表2不同PEG-ASP偶联物及培门冬酶对肿瘤细胞的IC50值
ASP 培门冬酶 4SCM5K-ASP 4PALD10K-ASP
THP-1 0.87μmol/L 0.78μmol/L 0.54μmol/L 0.13μmol/L
U937 0.05μmol/L 0.18μmol/L 0.0004μmol/L 0.06μmol/L
Raji 5.3μmol/L 2.7μmol/L 3.6μmol/L 0.8μmol/L
Jurkat 4.9μmol/L 2.4μmol/L 0.1μmol/L 0.2μmol/L
L1210 1.26μmol/L 1.92μmol/L 1.5μmol/L 0.44μmol/L
L5178Y 8.6μmol/L 2.7μmol/L 3.03μmol/L 2.1μmol/L
根据实验结果，本发明的多臂PEG修饰后的门冬酰胺酶对上述6种肿瘤细胞的杀伤性普遍高于未修饰的门冬酰胺酶，而本发明的4SCM5K-ASP和4PALD10K-ASP的抗肿瘤活性明显高于培门冬酶，对多种细胞株均表现出良好的抗肿瘤作用，特别是4PALD10K-ASP，在多种细胞株中IC50均为最低，抗肿瘤活性最高。
实施例9：不同PEG-ASP偶联物对肿瘤的体内抑制作用比较
4-6周龄裸鼠（BALB/cA-nu）32只，15-18g，雌性，分为5组，每组8只，即：培门冬酶组，ASP组，PBS组，4PALD10K-ASP,4SCM10K-ASP组。实验前，记录每只裸鼠的体重并检测肝功能。试验开始时，每只裸鼠腹腔注射环磷酰胺100mg/kg，连续4天。第五天腹腔注射约5×106个肿瘤细胞L1210。第二天给药一次，肌肉注射培门冬酶，ASP，PBS，4PALD10K-ASP，4SCM10K-ASP，按4.7mg/kg肌肉注射给药，并于注射完的第三天和第六天计算抑瘤率。实验结果如图8和表3所示。
表3 PEG修饰物对肿瘤接种小鼠抑瘤率的影响
由图8和表3可以得出，PEG修饰后的门冬酰胺酶对肿瘤的抑制率显著高于修饰之前，门冬酰胺酶组的第3天和第6天的抑制率都低于其它PEG修饰组的。另外，4PALD10K-ASP和4SCM10K-ASP组对肿瘤的抑瘤率好于培门冬酶组，特别是第3天的抑瘤率。说明用多臂PEG修饰后的门冬酰胺酶的药效优于用传统的单甲氧基的PEG修饰的门冬酰胺酶。这可能和4PALD10K-ASP以及4SCM10K-ASP的稳定性更高有关。本实施例初步说明4SCM10K-ASP和4PALD10K-ASP对肿瘤的抑制效果优于市场上的同类产品培门冬酶。
实施例10：PEG-ASP偶联物的免疫原性
PEG分子的结构特异性可以降低或者消除诱导产生中和抗体和与抗体结合的能力，使其难以被免疫系统识别和清除，因此PEG修饰的蛋白可以一定程度上降低免疫原性。
本实施例测定了不同PEG-ASP偶联物的对小鼠的相对免疫原性，并和原蛋白以及培门冬酶进行了比较。试验分4PALD10K-ASP组、4SCM5K-ASP组、培门冬酶组及原蛋白组，以每2周1次的频率，连续8周的方法给小鼠尾静脉注射2mg/kg（按蛋白的量计算）的上述蛋白。在给药结束后1周从眼眶取血。通过间接ELISA测定血清中抗门冬酰胺酶抗体的水平。（所使用的二抗购自SIGMA公司）结果如图9中所示。
从结果可以得出，4PALD10K-ASP组、4SCM5K-ASP组对小鼠的抗体滴度均远远低于原蛋白以及培门冬酶组。说明PEG修饰后能够明显降低蛋白的免疫原性。并且由于4PALD10K-ASP组、4SCM5K-ASP组是用多臂PEG进行修饰的，亚基得到了充分的偶联。因此在体内不容易降解，从而不易发生免疫反应。培门冬酶虽然也是用PEG进行了修饰，但是由于其各亚基没有充分偶联，分子稳定性较低，容易在体内发生亚基的解离，从而暴露了抗原表位，导致免疫反应。
实施例11：PEG-ASP偶联物的药代动力学研究
PEG的空间阻碍作用使得被修饰蛋白对蛋白酶酶解的抵抗能力大为提高，同时被修饰蛋白的分子排阻体积明显增大，使得其肾脏过滤清除率降低显著，从而可以提高原蛋白的体内半衰期。
本实施例采用125I同位素标记示踪法对PEG修饰后的门冬酰胺酶的体内血药浓度进行了研究。其中，为了减少大鼠甲状腺对标记药物的吸收，实验前约8h腹腔注射1%KI溶液1mL饱和大鼠的甲状腺。将大鼠随机分为4SCM5K-ASP组、培门冬酶组，每组8只，雌雄各半。具体操作方法如下：
1.放射性碘取代蛋白质分子中氨基酸残基苯环上的羟基，得到具有放射性示踪作用的125I蛋白。
2.用苦味酸在其身上按照编号规则进行编号，称重。用大鼠固定器固定后，由尾静脉注射给药（1.5U/kg）。给药后立即放开大鼠，自由活动，自由饮水和喂食。
3.分别于给药后1min，5min、10min、20min、30min、60min、3h、6h、12h、24h、48h、84h、96h、144h、168h、192h、216h、264h从眼眶取血约0.2mL，并加入EDTA抗凝。
4.5000rpm/3min离心分离大鼠血浆，用伽马计数器（安可中佳，GC-911）测定血浆放射性活度，测量时间为1min。
5.放射性活度测量完毕后回收血浆，HPLC（岛津LC-20AT）分离未降解的蛋白原性药物。
动物实验结束后经过数据处理等，可以得到每个时间点的SD大鼠的血药浓度。通过时间和对应的血药浓度，用药动学专用软件DAS计算该药物的药动学参数。
实验结果表明，培门冬酶以及4SCM5K-ASP药物药动学模型属于三房室模型。各参数的计算结果见表4所示。
表4 PEG-ASP偶联物和培门冬酶的药代动力学参数比较
4SCM5K-ASP的药代参数与培门冬酶的参数相比，半衰期明显延长，从25h左右提高到了45h，并且药时曲线下面积（AUC）有了显著提高，从459mg/L*h提高到805mg/L*h.其次，4SCM5K-ASP在血液中的清除速率也低于培门冬酶。由此可见，用多臂PEG修饰后的门冬酰胺酶和培门冬酶相比，在体内的稳定性显著增强，因此其半衰期显著提高，血液中代谢速度明显降低，有效的延长了药物的药效时间。可以合理推测，本发明中所使用的多臂PEG修饰门冬酰胺酶后，由于其能够增强蛋白亚基间的作用力，因此提高了稳定性，药代实验的结果也验证了这一点。由于4SCM10K-ASP活化基团和4SCM5K-ASP相同，并且PEG的链更长，因此可以根据4SCM5K-ASP组的数据推测4SCM10K-ASP组的半衰期会显著大于45.90h，另外AUC值也更高，其药代数据应显著优于4SCM5K-ASP组。

Claims (18)

1.多臂PEG在修饰多亚基蛋白中的应用，其特征在于：所述的多臂PEG选自以下任意一种结构所示的PEG：
其中n选自1到2000整数值，k为1或2，m选自2～16之间的整数，p选自1～4之间的整数，多臂PEG的分子量在1～100kDa之间。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的n选自2～500之间的整数值；所述的k为1,m为4，p为2；多臂PEG的分子量在1～40kDa之间。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的n选自25～100之间的整数值；所述多臂PEG的分子量在5～10kDa之间。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述的多臂PEG为醛基活化的或酯活化的多臂聚乙二醇衍生物；其中酯活化的聚乙二醇衍生物选自4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯中的任意一种；醛基活化的聚乙二醇衍生物选自4臂聚乙二醇丙醛、4臂聚乙二醇丁醛、4臂聚乙二醇乙醛、4臂聚乙二醇戊醛中的任意一种。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的多臂PEG为4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯或4臂聚乙二醇丙醛。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的多亚基蛋白选自碱性磷酸酶、门冬酰胺酶或尿素酶中的任意一种。
7.一种利用多臂PEG修饰多亚基蛋白的方法，其特征在于包含以下步骤；
(1)需要修饰的蛋白和PEG修饰剂按比例混合后在缓冲液中进行修饰反应；
(2)修饰反应结束后用离子交换层析去除掉修饰产物中未与蛋白发生反应的PEG修饰剂；
(3)用凝胶过滤层析对修饰产物进行纯化，收集目的修饰产物；
其中所述的PEG修饰剂选自以下任意一种结构所示的PEG：
其中n选自1到2000整数值，k为1或2，m选自2～16之间的整数，p选自1～4之间的整数，多臂PEG的分子量在1～100kDa之间。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的n选自2～500之间的整数值；所述的k为1,m为4，p为2；多臂PEG的分子量在1～40kDa之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的n选自25～100之间的整数值；所述多臂PEG的分子量在5～10kDa之间。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述的多臂PEG为醛基活化的或酯活化的多臂聚乙二醇衍生物；其中酯活化的聚乙二醇衍生物选自4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯、4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯中的任意一种；醛基活化的聚乙二醇衍生物选自4臂聚乙二醇丙醛、4臂聚乙二醇丁醛、4臂聚乙二醇乙醛、4臂聚乙二醇戊醛中的任意一种。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的多臂PEG为4臂聚乙二醇琥珀酰亚胺乙酸酯或4臂聚乙二醇丙醛。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的多亚基蛋白选自碱性磷酸酶、门冬酰胺酶或尿素酶中的任意一种。
13.多臂PEG修饰的多亚基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白按照权利要求7～12中任一项所述的方法获得。
14.根据权利要求13所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白，其特征在于所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白为多臂PEG修饰的门冬酰胺酶。
15.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物含有如权利要求14所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白和药学上可接受的辅料。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物的剂型为冻干粉针制剂。
17.权利要求14所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白或权利要求15所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
18.权利要求14所述的多臂PEG修饰的多亚基蛋白或权利要求15所述的药物组合物在制备治疗急性白血病的药物中的应用。
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