CN109152818A - 具有降低的抗原性的聚合物结合物及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于降低分子的抗原性的组合物和方法。分子的抗原性可以通过使至少一个支化聚合物与所述分子结合形成分子‑聚合物结合物来降低或消除。支化聚合物可以包括主链和多个侧链，每个侧链共价连接于所述主链。

Description

具有降低的抗原性的聚合物结合物及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下专利申请的优先权：2015年12月21日提交的美国临时专利申请号62/270,401；2016年3月18日提交的美国临时专利申请号62/310,534；2016年4月29日提交的美国临时专利申请号62/329,800；以及2016年10月12日提交的美国临时专利申请号62/407,403，所述专利申请各自通过全文引用的方式并入本文中。
关于联邦资助的研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的资助R01-DK092665、R01-GM061232、5T32-GM008487、R01-GM061232和R01-AI46611的政府支持下进行。美国政府在本发明中享有一定的权利。
技术领域
本公开涉及具有降低或消除的抗原性的分子-聚合物结合物。
背景技术
因为FDA批准超过一百种肽和蛋白质用于治疗各种疾病并且在临床和临床前开发中尚有更多的肽和蛋白质，所以治疗性肽和蛋白质是当今一类重要的药物。然而，肽和蛋白质的临床应用常常受到其短暂的血浆半衰期的挑战，从而可能需要频繁注射并引起体内药物浓度的不希望的峰谷波动以及降低患者依从性并增加治疗成本。肽和蛋白质治疗剂的其他局限性可能包括不良的稳定性、低的溶解度和免疫原性。为了解决这些局限性，已经开发了多种递送策略来持续递送肽和蛋白质治疗剂，范围从颗粒系统、贮库至与长循环聚合物如聚(乙二醇)(PEG)的化学结合或与长循环蛋白质如白蛋白或抗体的Fc结构域的重组融合。
治疗剂的聚乙二醇化或与“隐形”聚合物PEG的共价结合是增加生物分子治疗剂如多肽和多核苷酸的循环半衰期和稳定性并降低免疫原性的最广泛使用的方法之一。然而，在近四十年的研究和超过二十年的临床使用之后，聚乙二醇化的缺点已经开始出现。用于合成聚乙二醇化的结合物的常规方法具有显著局限性：(1)结合涉及蛋白质排斥性PEG链与生物大分子之间的反应，使得即使具有大量过量的聚合物，空间位阻仍导致结合物的产率低，通常在10-20％的范围内；(2)大量过量的未反应聚合物的存在使得产物纯化变得重大；以及(3)结合通常涉及使聚合物的链端与生物分子上往往混杂地分布的赖氨酸和半胱氨酸残基上的反应性侧基反应，从而产生化学非均质产物，所述化学非均质产物可能显著危害药物的生物活性并且使监管批准大大复杂化。
此外，PEG的免疫原性近来引起了很多关注。在用一些聚乙二醇化酶治疗的患者中以及在PEG-尿酸酶和PEG-天冬酰胺酶的临床试验中已经产生了抗PEG抗体，这些抗PEG抗体显著加速了血液清除率，废除了临床功效并且增加了输注反应的风险和严重性。在未使用过聚乙二醇化物质的个体中也发现了循环抗PEG抗体，所述抗体可能是由于长期暴露于常用消费品中存在的游离PEG而诱导的。最近已将高水平的这种预先存在的抗PEG抗体与对聚乙二醇化RNA适体的严重的首次暴露过敏反应联系起来，所述过敏反应导致临床试验提前中止。
需要修饰生物分子治疗剂来增加其循环半衰期和稳定性并降低其抗原性或结合预先存在的抗体的能力。
发明内容
一方面，本公开涉及降低分子的抗原性的方法。所述方法可以包括使至少一个支化聚合物与分子结合形成分子-聚合物结合物，其中所述分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合，其中所述支化聚合物包含主链和多个侧链，每个侧链共价连接于主链，其中主链包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、碳酸酯、磷酸酯、唑啉或其组合中的至少一种，并且其中分子-聚合物结合物与对照相比具有降低或消除的抗原性。在一些实施方式中，分子与支化聚合物的主链结合。在一些实施方式中，分子经由连接物与支化聚合物的主链结合。在一些实施方式中，每个侧链具有第一末端和第二末端，其中第一末端共价连接于主链，并且其中第二末端独立地包含烷基、酯、胺、酰胺或羧基基团。在一些实施方式中，每个侧链具有第一末端和第二末端，其中第一末端共价连接于主链，并且其中第二末端不包括羟基基团。在一些实施方式中，每个侧链是线性聚合物。在一些实施方式中，至少一个侧链包含1个单体。在一些实施方式中，每个侧链包含至少2个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含少于25个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3至9个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链的单体独立地选自甜菜碱、磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、肌氨酸、乙二醇或其组合。在一些实施方式中，甜菜碱包含羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或其组合。在一些实施方式中，至少一个侧链的单体包含乙二醇。在一些实施方式中，每个侧链的单体包含乙二醇。在一些实施方式中，超过一个支化聚合物与分子结合，每个支化聚合物结合于分子的不同位点。在一些实施方式中，分子包含多肽，并且其中一个支化聚合物在选自多肽的C末端、N末端和内部氨基酸的位点处与多肽结合。在一些实施方式中，分子包含多肽，并且其中超过一个支化聚合物与多肽结合，每个支化聚合物结合于多肽的选自C末端、N末端、内部氨基酸或其组合的不同位点。
在一些实施方式中，分子包含含有分选酶A识别位点的多肽，并且其中将支化聚合物和多肽与分选酶A一起在使支化聚合物与多肽的分选酶识别位点结合的条件下温育。在一些实施方式中，分子包含含有分选酶A识别位点的多肽，并且其中结合包含：a)使分子与分选酶A和引发剂在允许引发剂连接于分选酶A识别位点的条件下接触以形成大分子引发剂；和b)将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸。在一些实施方式中，在步骤(b)中将大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。在一些实施方式中，步骤(b)中的单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。在一些实施方式中，方法还包括将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离。在一些实施方式中，合成支化聚合物并随后将所述支化聚合物接枝到分子上以形成分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，结合包含使引发剂连接于分子以形成大分子引发剂；和将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，使用自由基聚合来合成支化聚合物。在一些实施方式中，使用至少一种选自离子开环聚合(离子ROP)、开环易位聚合、离子聚合、缩聚和配位聚合的方法来合成支化聚合物。
另一方面，本公开涉及从包含具有分选酶A识别位点的多肽的分子制备与对照相比具有降低或消除的抗原性的分子-聚合物结合物的方法。方法可以包括a)使分子与分选酶A和引发剂在允许引发剂连接于分选酶A识别位点的条件下接触以形成大分子引发剂；和b)将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物，其中支化聚合物包含主链和多个侧链，每个侧链共价连接于主链。在一些实施方式中，分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸。在一些实施方式中，在步骤(b)中将大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。在一些实施方式中，步骤(b)中的单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。在一些实施方案中，方法还包括将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离，其中分子-聚合物结合物的产率为分离的总结合物和大分子引发剂的至少约50％。在一些实施方式中，通过色谱法分离分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，色谱法包含尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法或疏水相互作用色谱法或其组合。在一些实施方式中，色谱法包含尺寸排阻色谱法。在一些实施方式中，自由基聚合包含以下中的至少一种：原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)、自由基开环聚合(自由基ROP)、氮氧基介导的自由基聚合(NMP)、iniferter聚合、自由基聚合、钴介导的自由基聚合、碲介导的聚合和锑介导的聚合。在一些实施方式中，分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合。
本公开的另一方面提供一种与对照相比具有降低或消除的抗原性的分子-聚合物结合物。分子-聚合物结合物可以包括：支化聚合物，所述支化聚合物包含主链和多个侧链，每个侧链共价连接于主链；和与支化聚合物的主链结合的分子，其中分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合，其中每个侧链是线性聚合物，其中主链包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、碳酸酯、磷酸酯、唑啉或其组合中的至少一种。在一些实施方式中，分子经由连接物与支化聚合物的主链结合。在一些实施方式中，每个侧链具有第一末端和第二末端，其中第一末端共价连接于主链，并且其中第二末端独立地包含烷基、酯、胺、酰胺或羧基基团。在一些实施方式中，每个侧链具有第一末端和第二末端，其中第一末端共价连接于主链，并且其中第二末端不包括羟基基团。在一些实施方式中，至少一个侧链包含1个单体。在一些实施方式中，每个侧链包含至少2个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含少于25个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3至9个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链的单体独立地选自甜菜碱、磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、肌氨酸、乙二醇或其组合。在一些实施方式中，甜菜碱包含羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或其组合。在一些实施方式中，至少一个侧链的单体包含乙二醇。在一些实施方式中，每个侧链的单体包含乙二醇。在一些实施方式中，超过一个支化聚合物与分子结合，每个支化聚合物结合于分子的不同位点。在一些实施方式中，分子包含多肽，并且其中一个支化聚合物在选自多肽的C末端、N末端和内部氨基酸的位点处与多肽结合。在一些实施方式中，分子包含多肽，并且其中超过一个支化聚合物与多肽结合，每个支化聚合物结合于多肽的选自C末端、N末端、内部氨基酸或其组合的不同位点。在一些实施方式中，支化聚合物包含聚[低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯](POEGMA)，并且其中POEGMA包含：包含聚(甲基丙烯酸甲酯)的主链；和共价连接于主链的多个侧链，每个侧链包含至少1个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，至少一个侧链包含1个乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含至少2个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含至少10个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含少于25个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3至9个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，分子-POEGMA结合物不与受试者中预先存在的抗PEG抗体反应。
在一些实施方式中，分子包含一种或多种选自以下的肽或蛋白质治疗剂：单克隆抗体、血液因子、β萎缩素(betatrophin)、exendin、酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶(glutamase)、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶(ADA)、ADA-2、核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、生长因子、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、纤维母细胞生长因子(FGF)、生长抑素、促生长素(somatotropin)、生长素(somatropin)、人蛋氨生长素(somatrem)、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子(CSF)、凝血因子、肿瘤坏死因子(TNF)、胃肠肽、血管活性肠肽(VIP)、胆囊收缩素(CCK)、胃泌素、胰泌素、促红细胞生成素、生长激素、GRF、血管加压素、奥曲肽(octreotide)、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺素释放激素(TRH)、甲状腺刺激激素、黄体化激素、黄体化激素释放激素(LHRH)、生长激素释放激素(GHRH)、组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素、白细胞介素-1、白细胞介素-15、白细胞介素-2、白细胞介素-10、集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、艾塞那肽(exenatide)、GLP-1R多激动剂(GLP-1R multi-agonist)、GLP-1R拮抗剂、GLP-2、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、瘦素、饥饿素、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素、干扰素-α、干扰素-γ、人生长激素(hGH)和拮抗剂、巨噬细胞活化剂、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、松弛素、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体(affibody)、活化素受体2A细胞外结构域、α-2巨球蛋白、α-黑素细胞、爱帕琳肽(apelin)、缓激肽B2受体拮抗剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、弹力素(elafin)、因子IX、因子VIIa、因子VIII、铁调素(hepcidin)、infestin-4、激肽释放酶抑制剂、L4F肽、催泪蛋白、甲状旁腺激素(PTH)、肽YY(PYY)、硫氧还蛋白、胸腺素B4、尿酸氧化酶、尿舒张肽、适体、沉默RNA、微RNA、长非编码RNA、核酶、其类似物和衍生物以及其组合。在一些实施方式中，分子包含多肽，并且其中多肽包含His标签、刺激响应性多肽或其组合。在一些实施方式中，刺激响应性多肽选自弹性蛋白样多肽、包含重复基序的多肽和节肢弹性蛋白样多肽。在一些实施方式中，分子-聚合物结合物具有以下性质：体内半衰期比分子自身的体内半衰期长至少25％；或对组织、器官或疾病位点的体内生物分布比分子自身的体内生物分布多至少25％；或与对照相比，与抗PEG抗体的结合降低；或与对照相比，免疫反应降低；或其组合。在一些实施方式中，分子-聚合物结合物的体内半衰期比分子自身的体内半衰期长至少80％。在一些实施方式中，对照包含与非支化聚合物结合的分子。在一些实施方式中，对照包含分子自身。在一些实施方式中，对照包含与线性聚合物结合的分子。在一些实施方式中，对照包含与非支化PEG结合的分子。在一些实施方式中，分子包含多肽，并且其中多肽的至少约20％仅在C末端具有结合的支化聚合物。在一些实施方式中，多肽的至少约75％仅在C末端具有结合的支化聚合物。在一些实施方式中，多肽的至少约90％仅在C末端具有结合的支化聚合物。在一些实施方式中，分子-聚合物结合物的产率为至少约75％。在一些实施方式中，分子-聚合物结合物的产率为至少约85％。
本公开提供了根据以下详细描述和附图将显而易见的其它方面和实施方式。
附图说明
图1：exendin-C-POEGMA的合成方案。a)重组表达分选酶A底物exendin-srt-His6-ELP，并通过ITC纯化。b)分选酶催化的使ATRP引发剂AEBMP与exendin的C末端位点特异性连接以产生exendin-C-Br。c)从exendin-C-Br进行OEGMA的原位ATRP，产生exendin-C-POEGMA。ITC：反转变循环，ELP：弹性蛋白样多肽，srt：分选酶A识别序列“LPETG”(SEQ IDNO：2)，AEBMP：N-(2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙基)-2-溴-2-甲基丙酰胺。来自RCSB PDB(www.rcsb.org)的图像：PDB ID 1T2P(分选酶A)；PDB ID 1JRJ(exendin-4)。
图2：exendin-C-Br大分子引发剂和EG9exendin-C-POEGMA结合物的表征。a)exendin上通过分选酶A进行的引发剂连接的考马斯(Coomassie)染色的SDS-PAGE分析。泳道1：MW标记，泳道2：反应18h后的分选酶反应混合物，泳道3：纯化的exendin-C-Br大分子引发剂。b)进行EG9POEGMA与exendin-C-Br接枝0.5h、1h、1.25h、2h和3h的ATRP反应混合物的SEC迹线，其通过280nm下的UV-vis吸光度进行检测。c)在表达GLP-1R的幼仓鼠肾(BHK)细胞中，天然exendin和Mn为25.4kDa、54.6kDa、66.2kDa、97.2kDa和155.0kDa的EG9exendin-C-POEGMA结合物的环腺苷单磷酸(cAMP)响应。结果以平均值±平均值的标准误差(SEM)的形式绘制，n＝3。半数最大有效浓度(EC50)值如表1中所总结。
图3：EG9exendin-C-POEGMA结合物的MW依赖性体内功效的评定。与PBS对照相比，在单次皮下注射a)未修饰的exendin或b-e)25.4kDa、54.6kDa、97.2kDa和155.0kDaEG9exendin-C-POEGMA结合物之前和之后测量餐后小鼠的血液葡萄糖水平。在t＝0h时以25nmol/kg施用肽和结合物并以相等体积注射PBS。血液葡萄糖水平被标准化为在注射前24h和临注射之前测量的平均葡萄糖水平。利用重复测量两因素方差分析(ANOVA)，然后利用事后Dunnett多重比较检验来分析数据。f)随结合物Mn变化的血液葡萄糖曲线(0h至144h，相对于0％基线)的曲线下面积(AUC)。使用单因素ANOVA，然后使用事后Tukey多重比较检验来比较AUC。在所有图中，结果以平均值±SEM的形式绘制，n＝6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，并且****P<0.0001。
图4：EG9exendin-POEGMA在小鼠中的腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)。与相等体积的PBS相比，在以25nmol/kg单次皮下注射a)和b)54.6kDa EG9exendin-POEGMA结合物或c)和d)未修饰的exendin后24h和72h进行的IPGTT中测量的小鼠血液葡萄糖水平。将小鼠禁食6h，然后通过腹膜内(i.p.)注射1.5g/kg葡萄糖进行葡萄糖挑战。结果以平均值±SEM的形式绘制，在图a)和b)中n＝5，在图c和d中n＝3。使用不成对的参数双尾t检验比较处理组和PBS组的AUC(**P<0.01，并且****P<0.0001)。在任一时间点，exendin都是不显著的。
图5：exendin-C-POEGMA结合物对患者血浆样品中抗PEG抗体的反应性的评定。a)直接ELISA，其中用稀释剂(1％BSA的PBS溶液)、抗PEG阴性患者血浆样品或两个抗PEG阳性血浆样品中的一个探测54.6kDa EG9exendin-C-POEGMA结合物、天然exendin、腺苷脱氨酶(ADA)、牛血清白蛋白(BSA)、(PEG-尿酸酶)和(PEG-ADA)。b)竞争性ELISA，其中使各种量的exendin、54.6kDa EG9exendin-C-POEMGA、ADA和与竞争合阳性血浆样品中的抗PEG抗体。c)和d)用55.6kDa EG3 exendin-C-POEGMA结合物进行的图a和b中描述的直接和竞争性测定。在所有测定中，在聚合物修饰的样品的情况下对每孔相同的未修饰肽/蛋白质含量或类似的PEG/OEG含量进行比较。详情请参见方法部分。结果以平均值±SEM的形式绘制，在图a和b中n＝3，在图c和d中n＝5。利用两因素ANOVA，然后利用事后Dunnett多重比较检验来分析数据(**P<0.01，并且****P<0.0001)。
图6：exendin-C-POEGMA结合物的体内功效和药代动力学的评定。在t＝0h时以25nmol/kg单次皮下注射a)55.6kDa和b)71.6kDa EG3 exendin-C-POEGMA结合物或以相等体积施用PBS之前和之后测量的餐后小鼠的血液葡萄糖水平。血液葡萄糖水平被标准化为在注射前24h和临注射之前测量的平均葡萄糖水平。利用重复测量两因素ANOVA，然后利用事后Dunnett多重比较检验来分析数据(n＝5，*P<0.05，**P<0.01，并且****P<0.0001)。用Alexa488荧光标记c)exendin和d)exendin-C-POEGMA结合物(54.6kDa EG9、55.6kDaEG3和71.6kDa EG3)，并且以75nmol/kg(45nmol/kg荧光团)皮下注射到小鼠(n＝3)中。在不同时间点经由尾静脉收集血液样品用于荧光定量。使用非房室拟合(实线)来分析数据以获得表2中所示的药代动力学参数。所有图中的结果以平均值±SEM的形式绘制。
图7：通过反转变循环(ITC)进行a)exendin-srt-His6ELP纯化的CuCl2染色的SDS-PAGE分析。泳道1：标记，泳道2：大肠杆菌(E.coli)裂解物，泳道3和4：在一个和两个ITC循环后的可溶性蛋白质(产率：约60mg/L培养物)。ELP：弹性蛋白样多肽。b)通过固定化金属亲和色谱法(IMAC)进行His6-分选酶A纯化。泳道1：标记，泳道2：大肠杆菌裂解物，泳道3和4：用咪唑进行的第一和第二洗脱洗涤液(产率：约400mg/L培养物)。His6：六组氨酸。
图8：液相色谱电喷雾电离质谱法(LC/ESI-MS)表征OEGMA单体，其中a)平均质量为约500Da或具有约9个侧链乙二醇重复单元(EG9)，并且b)质量为232Da或具有3个侧链EG重复单元(EG3)。检测到峰为[M+Na]+。
图9：EG9exendin-C-POEGMA结合物的物理表征。a)进行EG9POEGMA与exendin-C-Br大分子引发剂接枝不同时间的ATRP反应混合物的利用RI检测获得的SEC迹线。由于残余exendin-C-Br的小尺寸和低浓度，所以来自残余exendin-C-Br的信号太低而不能通过RI检测观察到。b)通过单轮制备型SEC纯化的EG9exendin-C-POEGMA结合物的考马斯染色的SDS-PAGE分析。泳道1：标记，泳道2-6中从左至右：纯化的155.0kDa、97.2kDa、66.2kDa、54.6kDa和25.4kDa EG9结合物。
图10：EG9exendin-C-POEGMA的体内剂量依赖性功效的评定。维持60kcal％饮食的6周龄雄性C57BL/6J小鼠(n＝3)的重叠的a)标准化和b)未标准化血液葡萄糖水平，所述血液葡萄糖水平是在t＝0h时以25、50、80nmol/kg单次皮下注射66.2kDa EG9exendin-C-POEGMA结合物或施用相等体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照之前和之后测量的。图中的血液葡萄糖水平被标准化为在注射前24h和临注射之前测量的平均葡萄糖水平。c)所有处理组和对照组的重叠重量曲线。重量以与0h时间点的变化％形式报告。所有图中的结果以平均值±SEM的形式绘制。
图11未修饰的exendin的体内功效的评定。与在t＝0h时注射的相等体积的PBS对照相比，接受以25nmol/kg施用的未修饰的exendin的单次皮下注射的餐后小鼠(n＝6)的a)标准化和b)未标准化的血液葡萄糖曲线。图中的血液葡萄糖水平被标准化为在注射前24h和临注射之前测量的平均葡萄糖水平。结果以平均值±SEM的形式绘制。
图12：EG9exendin-C-POEGMA结合物的体内MW依赖性功效的评定。与t＝0h时注射的相等体积的PBS对照相比，以25nmol/kg接受25.4kDa、54.6kDa、97.2kDa、155.0kDaEG9exendin-POEGMA结合物的单次皮下注射之前和之后测量的小鼠(n＝6)的重叠的a)标准化和b)未标准化餐后血液葡萄糖水平。图中的血液葡萄糖水平被标准化为在注射前24h和临注射之前测量的平均葡萄糖水平。c)所有处理组和对照组的重叠重量曲线。重量以与0h时间点的变化％形式报告。对于exendin组，未测量t＝144h的重量。所有图中的结果以平均值±SEM的形式绘制。
图13：在表达胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)的幼仓鼠肾(BHK)细胞中，天然exendin和Mn为26.3kDa、55.6kDa和71.6kDa的EG3exendin-C-POEGMA结合物的环腺苷单磷酸(cAMP)响应。结果以平均值±SEM的形式绘制。半数最大有效浓度(EC50)值如表1中所总结。
图14：EG3exendin-C-POEGMA结合物的体内功效的评定。与在t＝0h时施用的相等体积的PBS对照相比，以25nmol/kg接受a)55.6kDa和b)71.6kDa EG3exendin-POEGMA结合物的单次皮下注射之前和之后测量的餐后小鼠(n＝3)的未标准化血液葡萄糖水平。c)55.6kDa和d)71.6kDa EG3exendin-C-POEGMA和PBS对照组的重量曲线。重量以与0h时间点的变化％形式报告。所有图中的结果以平均值±SEM的形式绘制。
图15：exendin-C-Br大分子引发剂的MALDI-MS谱。5,132.55Da处的主峰与对应于与exendin连接的单个AEBMP引发剂的理论质量5,131.44Da非常一致。
图16：exendin-C-Br的LC/MS-MS分析。a)在胰蛋白酶消化exendin-C-Br后通过LC/MS-MS检测的C末端肽[NGGPSSGAPPPSLPET-“AEBMP”，SEQ ID NO：8]2+的同位素分布。b)通过分子质量计算器软件(Pacific Northwest National Laboratory)产生的胰蛋白酶消化后exendin-C-Br的C末端肽的理论同位素分布。
图17：EG3exendin-C-POEGMA结合物的物理表征。通过原位ATRP进行2.5h、5.5h和8h合成的EG3exendin-C-POEGMA结合物的通过a)280nm下的UV-vis吸光度和b)RI而检测到的SEC迹线。由于残余exendin-C-Br的小尺寸和低浓度，所以来自残余exendin-C-Br的信号太低而不能通过RI检测观察到。c)通过单轮制备型SEC纯化的EG3exendin-C-POEGMA结合物的考马斯染色的SDS-PAGE分析。泳道1：标记，泳道2-4中从左至右：纯化的26.3、55.6和71.6kDa EG3结合物。
具体实施方式
本文描述了通过将支化聚合物与分子结合形成分子-聚合物结合物来降低或消除分子的抗原性的方法。支化聚合物可以通过各种方式与分子结合。如本文所详述，可以使用分选酶催化的聚合物结合来产生分子-聚合物结合物。该策略利用了分选酶A这一酶的C末端天然肽连接机制。在结合的POEGMA上分解和附加具有优化长度的短低聚侧链形式的PEG不仅保留了POEGMA结合物的长循环，而且消除了其对患者来源的PEG抗体的反应性。这些结果证实，附加于分子的PEG的结构在调节其抗原性中起作用。本文详述的组合物和方法可以用于递送具有降低或消除的抗原性的分子，从而解决普通群体中预先存在的抗PEG抗体的日益盛行，抗PEG抗体的日益盛行越来越不利于聚乙二醇化治疗剂的安全性和功效。
1.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。如有冲突，以本文件为准，包括定义在内。下文描述了优选的方法和材料，但与本文所述相似或等效的方法和材料也可用于实践或测试本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过全文引用的方式并入。本文公开的材料、方法和实施例仅是说明性的并且并非是限制性的。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“可以”、“包含”以及其变体意欲是开放式的过渡短语、术语或词语，其不排除其他行为或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则不带具体数量的指称物包括复数指称物。本公开还涵盖“包含”本文示出的实施方式或要素、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施方式，无论所述实施方式或要素是否明确阐述。
对于本文叙述的数字范围，明确涵盖所述范围之间具有相同精确度的每个中间数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9之外，还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
如本文所用，应用于一个或多个感兴趣的值的术语“约”是指与所陈述的参考值类似的值。在某些方面，除非另外说明或从上下文明显看出属于另外的情况，否则术语“约”指落在所陈述的参考值沿任何方向(大于或小于)的20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的范围内的值范围(除了这样的数字会超过可能值的100％的情形)。
如本文所用，“氨基酸”是指天然存在的和非天然的合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。在本文中，氨基酸可以通过其公知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来提及。氨基酸包括侧链和多肽主链部分。
“抗原”是指能够被抗体或T细胞受体结合的分子。如本文所用，术语“抗原”还涵盖T细胞表位。此外，抗原能够被免疫系统识别和/或能够诱导引起B淋巴细胞和/或T淋巴细胞活化的体液免疫反应和/或细胞免疫反应。在一些实施方式中，抗原含有Th细胞表位或连接于Th细胞表位。抗原可以具有一个或多个表位(B表位和T表位)。抗原可以包括多肽、多核苷酸、糖类、脂质、小分子以及其组合。抗原也可以是数种单独抗原的混合物。“抗原性”是指抗原与T细胞受体或抗体特异性结合的能力，并且包括抗原对受试者中预先存在的抗体的反应性。“免疫原性”是指任何抗原诱导免疫反应的能力，并且包括抗原在受试者中产生抗体的固有能力。如本文所用，术语“抗原性”和“免疫原性”是不同的且不可互换。
术语“对照”、“参考水平”和“参考”在本文中可互换使用。参考水平可以是预定值或范围，其被用作评定测量结果的基准。本文使用的“对照组”是指对照受试者组。预定水平可以是来自对照组的截止值。预定水平可以是来自对照组的平均值。截止值(或预定截止值)可以通过自适应指数模型(AIM)方法来确定。截止值(或预定截止值)可以通过来自患者组的生物样品的接受者操作曲线(ROC)分析来确定。在生物学领域中通常已知的ROC分析是确定试验区分一种病状与另一种病状(例如确定每种标志物在鉴定患有CRC的患者中的表现)的能力。P.J.Heagerty等人(Biometrics 2000,56,337-44)提供了关于ROC分析的描述，其公开内容在此通过全文引用的方式并入。或者，截止值可以通过患者组的生物样品的四分位分析来确定。例如，可以通过选择对应于第25-第75百分位范围内的任何值的值，优选地对应于第25百分位、第50百分位或第75百分位，并且更优选第75百分位的值来确定截止值。这些统计学分析可以使用本领域已知的任何方法进行并且可以通过任何数量的可商购软件包(例如，来自Analyse-it Software Ltd.,Leeds,UK；StataCorp LP,CollegeStation,TX；SAS Institute Inc.,Cary,NC.)来实施。靶或蛋白质活性的健康或正常水平或范围可以根据标准实践来定义。对照可以是分子或包含分子的样品，其未结合支化聚合物。对照可以是分子或包含分子的样品，其结合有不同于本文详述的支化聚合物的聚合物。对照可以是疾病状态已知的受试者或来自所述受试者的样品。受试者或来自所述受试者的样品可以是健康的、患病的、治疗前患病的、治疗期间患病的或治疗后患病的或其组合。对照可以包括例如单独的分子或分子自身、与不同聚合物结合的分子、与非支化聚合物或非分支的聚合物结合的分子、与PEG结合的分子、与非支化PEG结合的分子、与线性聚合物直接结合的分子或与侧链直接结合的分子(无支化聚合物)。
术语“表达载体”指示本领域已知的质粒、病毒或其他介质，可以向其中插入或引入用于编码所需蛋白质的核酸序列。
术语“宿主细胞”是易于用核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、与所述核酸构建体或表达载体结合等的细胞。宿主细胞可以来源于植物、细菌、酵母、真菌、昆虫、动物等。在一些实施方式中，宿主细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)。
“调理”指分子、微生物或凋亡细胞被化学修饰成与吞噬细胞和自然杀伤(NK)细胞上的细胞表面受体具有更强的相互作用的分子机制。分子、微生物或凋亡细胞上的抗原被包覆在调理素中。调理素提高与免疫细胞如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的结合。调理还通过信号级联从细胞表面受体介导吞噬作用。
“聚合物”或“合成聚合物”是指通过化学方法从至少一个单体产生的聚合物。合成聚合物不是由活生物体直接产生的。合成聚合物包括均聚物、杂聚物、嵌段聚合物、共聚物、三元聚合物等以及其掺合物、组合和混合物。合成聚合物的实例包括但不限于官能化聚合物，如包含5-乙烯基四唑单体单元并且分子量分布小于2.0的聚合物。合成聚合物可以是或含有以下中的一种或多种：星形嵌段共聚物、线性聚合物、支化聚合物、超支化聚合物、树枝状聚合物、梳形聚合物、接枝聚合物、刷形聚合物、瓶刷共聚物和交联结构，如包含5-乙烯基四唑单体单元嵌段的嵌段共聚物。合成聚合物包括但不限于聚酯、聚(甲基)丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酸酯、聚醚、聚苯乙烯、聚降冰片烯以及具有不饱和键的单体。例如，在美国专利申请公布号2007/0087114和Mayes等人的美国专利号6,207,749中描述了两亲性梳形聚合物，所述公布和专利各自的公开内容通过全文引用的方式并入本文中。两亲性梳型聚合物可以以共聚物的形式存在，所述共聚物含有由疏水性水不溶性的聚合物形成的主链和由短的亲水性非细胞结合聚合物形成的侧链。其他合成聚合物的实例包括但不限于聚亚烷基，如聚乙烯和聚丙烯以及聚乙二醇(PEG)；聚氯丁烯；聚乙烯醚，如聚(乙酸乙烯酯)；聚乙烯基卤化物，如聚(氯乙烯)；聚硅氧烷；聚苯乙烯；聚氨基甲酸酯；聚丙烯酸酯，如聚((甲基)丙烯酸甲酯)、聚((甲基)丙烯酸乙酯)、聚((甲基)丙烯酸正丁酯)、聚((甲基)丙烯酸异丁酯)、聚((甲基)丙烯酸叔丁酯)、聚((甲基)丙烯酸己酯)、聚((甲基)丙烯酸异癸酯)、聚((甲基)丙烯酸月桂酯)、聚((甲基)丙烯酸苯酯)、聚(丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸异丙酯)、聚(丙烯酸异丁酯)和聚(丙烯酸十八烷酯)；聚丙烯酰胺，如聚(丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酰胺)、聚(乙基丙烯酰胺)、聚(乙基甲基丙烯酰胺)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(正丁基丙烯酰胺)、聚(异丁基丙烯酰胺)和聚(叔丁基丙烯酰胺)；以及其共聚物和混合物。这些合成聚合物可以包括有用的衍生物，包括具有取代、化学基团(如烷基基团、亚烷基基团)的添加、羟基化、氧化以及本领域技术人员常规进行的其它修饰的合成聚合物。合成聚合物可以包括两性离子聚合物，如聚磷酸胆碱、聚羧基甜菜碱和聚磺基甜菜碱。合成聚合物可能具有甜菜碱、羧基甜菜碱、磺基甜菜碱、低聚乙二醇(OEG)、肌氨酸或聚乙二醇(PEG)的侧链。
如本文所用，“多核苷酸”可以是单链或双链的，或可以含有双链和单链两种序列的部分。多核苷酸可以是核酸、天然或合成的DNA、基因组DNA、cDNA、RNA或杂交体，其中多核苷酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤，异胞嘧啶和异鸟嘌呤。多核苷酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
“肽”或“多肽”是通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的连接序列。多肽可以是天然的，合成的或天然和合成多肽的修饰或组合。肽和多肽包括蛋白质，如结合蛋白、受体和抗体。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用。“一级结构”是指特定肽的氨基酸序列。“二级结构”是指多肽内的局部有序的三维结构。这些结构通常称为结构域，例如酶结构域、细胞外结构域、跨膜结构域、孔结构域和细胞质尾结构域。结构域是形成多肽紧密单元的多肽部分，并且通常长度为15至350个氨基酸。示例性结构域包括具有酶活性或配体结合活性的结构域。典型的结构域由组织化较低的区段如β-折叠和α-螺旋的延伸段组成。“三级结构”是指多肽单体的完整三维结构。“四级结构”是指由独立三级单元非共价结合形成的三维结构。“基序”是多肽序列的一部分并且包括至少两个氨基酸。基序的长度可以是2至20、2至15或2至10个氨基酸。在一些实施方式中，基序包括3、4、5、6或7个连续氨基酸。
如本文所用，“药代动力学”是指药物或分子在体内的循环及其生物利用度、分布和排泄。
在提及例如细胞或核酸、蛋白质或载体的情况下使用时，“重组”指示细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源核酸或蛋白质或通过改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或指示细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或表达原本异常表达、表达不足或完全不表达的天然基因。
如本文所用，“样品”或“测试样品”可指将要对其中靶的存在和/或水平进行检测或测定的任何样品或包含本文所述的分子或结合物的任何样品。样品可以包括液体、溶液、乳液或悬浮液。样品可以包括医学样品。样品可以包括任何生物流体或组织，如血液、全血、血液级分如血浆和血清、肌肉、间质液、汗液、唾液、尿液、眼泪、滑液、骨髓、脑脊髓液、鼻分泌物、痰、羊水、支气管肺泡灌洗液、胃灌洗液、呕吐物、粪便、肺组织、外周血单核细胞、全白细胞、淋巴结细胞、脾细胞、扁桃体细胞、癌细胞、肿瘤细胞、胆汁、消化液、皮肤或其组合。在一些实施方式中，样品包含等分试样。在其他实施方式中，样品包含生物流体。样品可以通过本领域已知的任何方式获得。样品可以以从患者获得的形式直接使用，或可以例如通过过滤、蒸馏、萃取、浓缩、离心、使干扰组分失活、添加试剂等进行预处理，从而以本文讨论的某种方式或本领域已知的其他方式改变样品的特征。
“分选酶”是指如下多肽，其识别蛋白质中的分选酶识别位点并切割其中的肽键，从而形成稳定的中间体，所述中间体经由硫酯键将分选酶的催化性硫醇与识别位点内的氨基酸的羧基基团连接。这种中间体经历肽聚糖中低聚甘氨酸分支的α-氨基基团的亲核攻击，产生将底物蛋白锚定到细胞壁的天然肽键。分选酶A(SrtA)可以识别分选酶A识别位点，如由LPXZG(SEQ ID NO：3，其中X和Z独立地为任何氨基酸)组成的氨基酸序列，并且切割LPXZG的Z氨基酸与甘氨酸之间的肽键，并且在SrtA中的催化性硫醇与Z氨基酸的羧基基团之间形成硫酯键。SrtA中的催化性硫醇与Z氨基酸的羧基基团之间的硫酯键形成中间体，并且中间体经历第一多肽的赖氨酸的ε-氨基基团的亲核攻击而在赖氨酸的ε-氨基基团与LPXZG的Z氨基酸之间形成异肽键。在一些实施方式中，SrtA在第一多肽的任何溶剂可接近的亲核赖氨酸的ε-氨基基团与LPXZG的Z氨基酸之间形成异肽键。在一些实施方式中，分选酶A识别位点包括LPXTG(SEQ ID NO：1，其中X是任何氨基酸)。SrtA可以是任何SrtA，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)SrtA。SrtA可以来自革兰氏阳性细菌，如选自葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、肠球菌(Enterococcus)、芽孢杆菌(Bacillus)、棒状杆菌(Corynebacterium)、诺卡氏菌(Nocardia)、梭菌(Clostridium)、放线菌(Actinobacteria)和李斯特菌(Listeria)的属中的细菌。在一些实施方式中，SrtA来自金黄色葡萄球菌。SrtA可以是野生型SrtA或其变体。分选酶在如下申请中进一步详述：2015年2月25日提交的国际专利申请号PCT/US2015/017601(作为WO 2015/130846公布)和2014年5月30日提交的国际专利申请号PCT/US2014/040319(以WO 2014/194244公布)，所述申请通过引用的方式并入本文中。
“隐形”或“隐形聚合物”是指可以长时间保持不被血流中的免疫细胞检测到的分子-聚合物结合物或其聚合物。隐形分子-聚合物结合物至少部分抵抗如蛋白酶对结合物或其多肽的酶促降解和调理作用，调理作用是免疫系统用于识别外来颗粒的常用方法。因此，相对于其他聚合物、结合物、非隐形聚合物和/或非隐形结合物，隐形分子-聚合物结合物可能具有降低的抗原性、降低的免疫原性、增加的稳定性、增加的半衰期和增加的生物利用度中的一种或多种。延迟、降低或防止调理作用、被免疫系统识别或结合物(或其多肽或分子)从体内清除的能力在本文中可以被称为隐形特性。
如本文所用，“受试者”可以指想要或需要本文所述的结合物的哺乳动物。受试者可以是患者。受试者可以是人或非人动物。受试者可以是哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类或非灵长类。哺乳动物可以是灵长类，如人；非灵长类，如狗、猫、马、牛、猪、小鼠、大鼠、骆驼、美洲驼、山羊、兔、绵羊、仓鼠和豚鼠；或非人灵长类，如猴子、黑猩猩、大猩猩、猩猩和长臂猿。受试者可以是任何年龄或发育阶段，如成人、青少年或婴儿。
如本文所使用，“靶”可以指分子结合的实体。靶可以包括例如小分子、蛋白质、多肽、多核苷酸、糖类或其组合。
当提及保护受试者免于疾病时，“治疗”是指预防、抑制、抑止、改善或完全消除疾病。预防疾病包括在疾病发作之前向受试者施用本发明的组合物。抑制疾病包括在疾病诱发之后但在其临床表现之前向受试者施用本发明的组合物。抑止或改善疾病包括在疾病临床表现之后向受试者施用本发明的组合物。
如本文关于多核苷酸所使用的“变体”是指(i)所参考的核苷酸序列的部分或片段；(ii)所参考的核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与所参考的多核苷酸或其互补序列基本上相同的多核苷酸；或(iv)在严格条件下与所参考的多核苷酸、其互补序列或与其基本上相同的序列杂交的多核苷酸。
“变体”还可以定义为因氨基酸插入、缺失或保守取代而具有不同氨基酸序列，但保留至少一种生物学活性的肽或多肽。“生物学活性”的代表性实例包括被特定抗体或多肽结合或促进免疫反应的能力。变体可以指基本上相同的序列。变体可以指其功能片段。变体还可以指多肽的多个拷贝。多个拷贝可以串联或由连接物分隔开。变体还可以指氨基酸序列与所参考的多肽基本上相同的多肽，所参考的多肽的氨基酸序列保留至少一种生物学活性。本领域中认为氨基酸的保守取代，即用具有类似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，通常涉及较小的变化。这些较小的变化可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定。参见Kyte等人,J.Mol.Biol.1982,157,105-132。氨基酸的亲水指数基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知具有类似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一种情况下，亲水指数为±2的的氨基酸被取代。氨基酸的疏水性也可以用于揭示会产生保留生物学功能的多肽的取代。考虑多肽情形下的氨基酸的亲水性允许计算该多肽的最大局部平均亲水性，这是已报道的与抗原性和免疫原性良好相关的有用度量，如美国专利号4,554,101中所讨论的，该专利通过引用的方式完全并入本文中。如本领域所理解的，具有类似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物学活性例如免疫原性的多肽。可以用亲水性值在彼此±2内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的特定侧链影响。与该观察结果一致，与生物学功能相容的氨基酸取代被认为取决于氨基酸、特别是氨基酸的侧链的相对相似性，如由疏水性、亲水性、电荷、尺寸和其他特性所揭示的。
变体可以是在完整基因序列的全长或其片段上基本上相同的多核苷酸序列。多核苷酸序列可以在基因序列的全长或其片段上是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的。变体可以是在氨基酸序列的全长或其片段上基本上相同的氨基酸序列。氨基酸序列可以在氨基酸序列的全长或其片段上是80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的。
术语“酰基”或“羰基”是指基团-C(O)R，其中R选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基和杂环基烷基，其中的任一种可以任选地例如被一个或多个取代基取代。例如，当R是烷基时，所述基团可以称为烷基羰基基团。
术语“烷氧基”是指基团-O-R，其中R是烷基、烯基、炔基、环烷基或杂环基，其中的任一种可以任选地例如被一个或多个取代基取代。
术语“烷基”是指含有指定数目的碳原子的直链或支化的烃链。例如，C1-C12烷基指示该烷基基团可以具有1至12(包括1和12)个碳原子，并且C1-C4烷基指示该烷基基团可以具有1至4(包括1和4)个碳原子。烷基基团可以任选地被取代。C1-C4烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。
术语“烯基”是指具有一个或多个双键的直链或支化的烃链。烯基基团的实例包括但不限于烯丙基、丙烯基、2-丁烯基、3-己烯基和3-辛烯基基团。双键碳中的一个可以任选地作为烯基取代基的连接点。烯基基团可以任选地被取代。
术语“炔基”是指具有一个或多个三键的直链或支化的烃链。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、炔丙基和3-己炔基。三键碳中的一个可以任选地作为炔基取代基的连接点。炔基基团可以任选地被取代。
术语“芳基”是指芳族单环、双环或三环烃环系统，其中能够取代的任何环原子可以被(例如，被一个或多个取代基)取代。芳基部分的实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。芳族胺是被一个或多个氨基基团取代的芳基基团。芳族醇是被一个或多个羟基基团取代的芳基基团。芳族胺和芳族醇还可以被其他取代基取代。
术语“芳基烷基”是指其中烷基氢原子被芳基基团替代的烷基部分。芳基烷基包括其中超过一个氢原子已经被芳基基团替代的基团。芳基烷基基团的实例包括苯甲基、2-苯基乙基、3-苯基丙基、9-芴基、二苯甲基和三苯甲基基团。
术语“羧基”是指基团-C(＝O)OR，其中R选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基和杂环基烷基，其中的任一种可以任选地例如被一个或多个取代基取代。
术语“羧酸根”是指基团-C(＝O)O(-)。
术语“羰基氨基”或“酰胺基”是指基团-C(O)NR'R”，其中R'和R”独立地选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基和杂环基烷基，或者R'和R”可以与它们所连接的氮一起形成环。基团R'和R”可以任选地例如被一个或多个取代基取代，或者当R'和R”与它们所连接的氮一起形成环时，该环可以任选地例如被一个或多个取代基取代。
术语“酰胺”是指基团-C(O)NR，其中R选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基和杂环基烷基，其中的任一种可以任选地例如被一个或多个取代基取代。
术语“胺”是指基团-NH2。
如本文所用，术语“环烷基”是指具有3至12个碳(例如3、4、5、6或7个碳原子)的非芳族、饱和或部分不饱和的环状、双环、三环或多环烃基。任何环原子可以被取代(例如被一个或多个取代基取代)。环烷基基团可以含有稠环。稠环是具有一个或多个共同碳原子的环。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环己二烯基、甲基环己基、金刚烷基、降冰片基和降冰片烯基。
术语“酯”是指基团-C(O)OR，其中R选自氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、杂环基、杂芳基、芳基烷基、环烷基烷基、杂芳基烷基和杂环基烷基，其中的任一种可以任选地例如被一个或多个取代基取代。
如本文所用，术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘的任何基团。
如本文所用，术语“杂芳基”是指在单环的情况下具有1-3个杂原子，在双环的情况下具有1-6个杂原子，或者在三环的情况下具有1-9个杂原子的芳族5-8元单环、8-12元双环或11-14元三环系统，所述杂原子独立地选自O、N、S、P和Si(例如，碳原子和在单环、双环或三环的情况下分别1-3、1-6或1-9个独立地选自O、N、S、P和Si的杂原子)。任何环原子可以被取代(例如被一个或多个取代基取代)。杂芳基基团可以含有稠环，稠环是具有一个或多个共同原子的环。杂芳基基团的实例包括但不限于以下的基团：吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪、吡咯、咪唑、吡唑、唑、异唑、呋喃、噻唑、异噻唑、噻吩、喹啉、异喹啉、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、吲哚、异吲哚、吲嗪、吲唑、苯并咪唑、酞嗪、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、吩嗪、萘啶和嘌呤。
如本文所用，术语“杂环基”是指在单环的情况下具有1-3个杂原子，在双环的情况下具有1-6个杂原子，或者在三环的情况下具有1-9个杂原子的非芳族、饱和或部分不饱和的3-10元单环、8-12元双环或11-14元三环系统，所述杂原子选自O、N、S、Si和P(例如，碳原子和在单环、双环或三环的情况下分别1-3、1-6或1-9个O、N、S、Si和P的杂原子)。任何环原子可以被取代(例如被一个或多个取代基取代)。杂环基基团可以含有稠环，稠环是具有一个或多个共同原子的环。杂环基基团的实例包括但不限于以下的基团：四氢呋喃、四氢噻吩、四氢吡喃、哌啶、哌嗪、吗啉、吡咯啉、嘧啶、吡咯烷、二氢吲哚、四氢吡啶、二氢吡喃、噻蒽、吡喃、苯并吡喃、氧杂蒽、氧硫杂蒽、吩噻嗪、呋咱、内酯、内酰胺如氮杂环丁酮和吡咯烷酮、磺内酰胺、磺内酯等。
术语“羟基”是指-OH基团。术语“烷氧基”是指-O-烷基基团。术语“芳氧基”是指-O-芳基基团。术语“卤代烷氧基”是指-O-卤代烷基基团。
当化学基团由其从左至右书写的常规化学式指定时，其任选涵盖由从右向左书写结构而产生的取代基，例如-CH2O-任选地还表示-OCH2-。
2.结合物
本文提供一种分子-聚合物结合物。分子-聚合物结合物包括支化聚合物和与其共价连接的分子。分子-聚合物可以包括超过一个与分子结合的支化聚合物。在一些实施方式中，超过一个支化聚合物与分子结合，每个支化聚合物结合于分子的不同位点。
a.支化聚合物
支化聚合物包括主链和多个侧链。每个侧链共价连接于主链。支化聚合物可以包括具有主链和侧链的任何支化的非线性结构。例如，支化聚合物包括诸如以下的结构，刷形聚合物、梳形聚合物、星形聚合物、树枝状聚合物或超支化聚合物。刷形聚合物可具有四通分支点，主链和侧链在所述分支点处连接。梳形聚合物可具有三通分支点，主链和侧链在所述分支点处连接。对于星形聚合物、超支化聚合物和树枝状聚合物来说，主链可能是单个点。星形聚合物可具有单个点(主链)，多个侧链连接到所述单个点。超支化聚合物和树枝状聚合物都是重复支化的聚合物，其中侧链源自于单个点。树枝状聚合物可以是对称的，其在每个分支处具有相同的侧链，而超支化聚合物可以在一个或多个分支处具有任意和/或不规则长度和尺寸的侧链。在一些实施方式中，支化聚合物包含聚[低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯](POEGMA)。
i)主链
主链包含任何适当的聚合物。在一些实施方式中，主链包含线性聚合物。在一些实施方式中，主链包含以下中的至少一种：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、碳酸酯、磷酸酯、唑啉或其组合。在一些实施方式中，主链包含聚(甲基丙烯酸甲酯)。分子可以与支化聚合物的主链结合。
ii)侧链
侧链是聚合物，每个侧链共价连接于主链。在一些实施方式中，侧链是线性聚合物。在一些实施方式中，侧链是线性低聚物。在一些实施方式中，低聚物是包含25个单体或更少单体的聚合物。在一些实施方式中，每个侧链是线性聚合物。在一些实施方式中，每个侧链是低聚物。在一些实施方式中，侧链是包含串联的两个或更多个低聚物的嵌段共聚物，其中每个低聚物的单体是相同的。每个侧链包括至少1个单体。单个侧链的单体可以是相同的。单个侧链的单体可以是彼此不同的。每个侧链的单体可以独立地选自甜菜碱、磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、肌氨酸、乙二醇或其组合中的至少一种。甜菜碱可以是本领域的任何甜菜碱。例如，甜菜碱可以包含羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或其组合。
每个侧链可以包括串联重复的约1至20个单体、约2至20个单体、约3至20个单体、约3至9个单体、约4至20个单体、约5至20个单体、约8至20个单体、约3至10个单体、约3至9个单体或约3至5个单体。每个侧链可以包括串联重复的至少3个单体、至少4个单体、至少5个单体、至少6个单体、至少7个单体、至少8个单体、至少9个单体或至少10个单体。每个侧链可以包括串联重复的少于25个单体、少于20个单体、少于15个单体、少于10个单体、少于9个单体、少于8个单体、少于7个单体、少于6个单体、少于5个单体、少于4个单体或少于3个单体。在一些实施方式中，每个侧链包含至少2个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含少于25个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含至少3个串联重复的单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3个串联重复的单体。
在一些实施方式中，至少一个侧链的单体包含乙二醇。在一些实施方式中，每个侧链的单体包含乙二醇。在一些实施方式中，每个侧链包括至少2个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含至少10个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含少于25个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3个串联重复的乙二醇(EG)单体。在一些实施方式中，每个侧链包含3至9个串联重复的乙二醇(EG)单体。相邻的侧链可以是相同的。相邻的侧链可彼此不同。
每个侧链具有第一末端和第二末端。第一末端共价连接于主链。第二末端是游离的。在一些实施方式中，第二末端独立地包含烷基、酯、胺、酰胺或羧基基团。在一些实施方式中，每个侧链的第二末端不包括羟基基团。
在一些实施方式中，每个侧链的末端单独地包含酯、胺、酰胺、烷基或羧基。在一些实施方式中，每个侧链的末端不包括羟基基团。末端可以被修饰。末端可以是天然的或未修饰的。每个侧链的末端可以与相邻侧链的末端相同或不同。在一些实施方式中，每个侧链的末端与相邻侧链的末端相同。在一些实施方式中，每个侧链的末端与相邻侧链的末端不同。
b.分子
分子可以包括待降低或消除其抗原性的任何适合的分子。分子可以选自核苷酸、多核苷酸、蛋白质、肽、多肽、糖类、脂质、小分子或其组合。在一些实施方式中，分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合。在一些实施方式中，分子包含一种或多种肽或蛋白质治疗剂。在一些实施方式中，分子包含多肽。在一些实施方式中，分子包含小分子。在一些实施方式中，分子包含蛋白质。在一些实施方式中，分子包含药物。在一些实施方式中，分子包含治疗剂。在一些实施方式中，分子包含癌症治疗剂。在一些实施方式中，分子包含抗体。在一些实施方式中，分子包含exendin。
分子可以包括例如单克隆抗体、血液因子、β萎缩素、exendin、酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶(ADA)、ADA-2、核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、生长因子、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、纤维母细胞生长因子(FGF)、生长抑素、促生长素、生长素、人蛋氨生长素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子(CSF)、凝血因子、肿瘤坏死因子(TNF)、胃肠肽、血管活性肠肽(VIP)、胆囊收缩素(CCK)、胃泌素、胰泌素、促红细胞生成素、生长激素、GRF、血管加压素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺素释放激素(TRH)、甲状腺刺激激素、黄体化激素、黄体化激素释放激素(LHRH)、生长激素释放激素(GHRH)、组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素、白细胞介素-1、白细胞介素-15、白细胞介素-2、白细胞介素-10、集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、艾塞那肽、GLP-1R多激动剂、GLP-1R拮抗剂、GLP-2、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、瘦素、饥饿素、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素、干扰素-α、干扰素-γ、人生长激素(hGH)和拮抗剂、巨噬细胞活化剂、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、松弛素、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体、活化素受体2A细胞外结构域、α-2巨球蛋白、α-黑素细胞、爱帕琳肽、缓激肽B2受体拮抗剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、弹力素、因子IX、因子VIIa、因子VIII、铁调素、infestin-4、激肽释放酶抑制剂、L4F肽、催泪蛋白、甲状旁腺激素(PTH)、肽YY(PYY)、硫氧还蛋白、胸腺素B4、尿酸氧化酶、尿舒张肽、适体、沉默RNA、微RNA、长非编码RNA、核酶、其类似物和衍生物以及其组合。
分子可以包括分选酶A识别位点、His标签、刺激响应性多肽或其组合。刺激响应性多肽可以包括环境响应性多肽。刺激响应性多肽可以包括例如弹性蛋白样多肽、包含重复基序的多肽(如例如2014年12月16日提交的US 2015/0112022中所公开的，该专利通过引用的方式并入本文中)或节肢弹性蛋白样多肽或其组合。在一些实施方式中，分子包含含有分选酶A识别位点的多肽。在一些实施方式中，分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸。
支化聚合物可以与分子上任何位置的任何位点结合。例如，当分子包含多肽时，支化聚合物可以在C末端、N末端或内部氨基酸或其组合处与多肽结合。在一些实施方式中，分子包含多肽，其中支化聚合物与多肽的C末端结合。一个支化聚合物可以与分子结合。超过一个支化聚合物可以与分子结合，每个支化聚合物结合于分子的不同位点。在一些实施方式中，分子包含多肽，并且其中超过一个支化聚合物与多肽结合，每个支化聚合物结合于多肽的选自C末端、N末端、内部氨基酸或其组合的不同位点。至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的多肽具有仅从C末端起始的结合的聚合物。在一些实施方式中，至少约50％的多肽具有仅从C末端起始的结合的聚合物。在一些实施方式中，至少约75％的多肽具有仅从C末端起始的结合的聚合物。在一些实施方式中，至少约90％的多肽具有仅从C末端起始的结合的聚合物。
c.结合物特性
与对照相比，结合物可能具有改变的药理学特性。所述特性可以包括例如与对照相比，抗原性降低；抗原性消除；分子的调理作用降低；与抗PEG抗体的结合降低；免疫反应减少；与受试者中预先存在的抗PEG抗体无反应性；体内半衰期长至少25％；或对组织、器官或疾病位点的体内生物分布多至少25％。
在一些实施方式中，结合物的体内半衰期比单独的分子或其他分子-聚合物结合物的体内半衰期长至少25％；或对组织、器官或疾病位点的体内生物分布比单独的分子或其他分子-聚合物结合物的体内生物分布多至少25％。在一些实施方式中，与单独的分子或与线性聚合物结合的分子相比，结合物的抗原性降低。在一些实施方式中，与其他分子-聚合物结合物相比，所述结合物具有降低的抗原性。在一些实施方式中，与其他分子-聚合物结合物或分子相比，所述结合物与抗PEG抗体的结合降低。在一些实施方式中，与其他分子-聚合物结合物或分子相比，所述结合物诱导降低的免疫反应。在一些实施方式中，结合物不与受试者中预先存在的抗PEG抗体反应。在一些实施方式中，结合物的体内半衰期比分子的体内半衰期长至少25％。在一些实施方式中，结合物对组织、器官或疾病位点的体内生物分布比分子的体内生物分布多至少25％。在一些实施方式中，结合物的体内半衰期比分子的体内半衰期长至少80％。在一些实施方式中，支化聚合物包含POEGMA，并且所述分子-聚合物结合物不与受试者中预先存在的抗PEG抗体反应。
本文详述的方法可以控制支化聚合物与分子结合的位点和化学计量。本文详述的方法可以使与分子结合的支化聚合物具有高度的分子量可调性和低分散性，这可以转化为与治疗性生物分子的其他聚合物结合物相比更可预测的治疗性能。就结合位点、支化聚合物的分子量或其组合而言，本文详述的分子-聚合物结合物可以比常规聚乙二醇化分子更均匀。
本文详述的分子-聚合物结合物可以促进较不频繁的施用，防止体内药物浓度的不希望的峰谷波动，增加患者依从性和降低治疗成本，或其组合。
3.结合物的合成
制备结合物的方法可以包括例如2014年5月30日提交的国际专利申请号PCT/US2014/040319(以WO 2014/194244公布)中详述的方法，所述专利申请通过引用的方式并入本文中。
在一些实施方式中，分子经由连接物与支化聚合物的主链结合。分子可以经由超过一个连接物与支化聚合物的主链结合。分子可以经由至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10个连接物与支化聚合物的主链结合。分子可以经由少于20、少于15、少于10或少于5个连接物与支化聚合物的主链结合。分子可以经由1至20、5至15或1至5个连接物与支化聚合物的主链结合。连接物可以是任何氨基酸序列和长度的多肽。连接物可以用作间隔肽。在一些实施方式中，连接物包含带电的氨基酸。在一些实施方式中，连接物包含不带电的氨基酸。在一些实施例中，连接物是柔性的。在一些实施方式中，连接物包含一个或多个半胱氨酸。在一些实施方式中，连接物包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：4(GGC)、SEQ ID NO：5((GGC)8)、SEQ ID NO：6((G4S)3)和SEQ ID NO：7((VPGXG)16，其中X是以1:1的比率存在的缬氨酸或半胱氨酸)。连接物可以用作分子与支化聚合物的连接位点。分子可以通过本领域已知的任何适合方式连接于连接物。分子可以通过硫醇反应性连接基团连接于连接物。在一些实施方式中，分子经由连接物连接于一个或多个支化聚合物。在一些实施方式中，分子通过连接物中的硫醇反应性基团连接于支化聚合物。
结合物可以通过用分选酶将支化聚合物与多肽连接或结合来制备。在一些实施方式中，分子包含包括分选酶A识别位点的多肽，并且将支化聚合物和多肽与分选酶A一起在使支化聚合物与多肽的分选酶A识别位点结合的条件下温育。在一些实施方式中，结合包括使分子与分选酶A和引发剂在允许引发剂连接于分选酶A识别位点的条件下接触以形成大分子引发剂；和将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，将大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。单体可以包括丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。
在一些实施方式中，合成支化聚合物并随后将所述支化聚合物接枝到分子上以形成分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，使用自由基聚合来合成支化聚合物。在一些实施方式中，使用至少一种选自离子开环聚合(离子ROP)、开环易位聚合、离子聚合、缩聚和配位聚合的方法来合成支化聚合物。
在一些实施方式中，自由基聚合包含以下中的至少一种：原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)、自由基开环聚合(自由基ROP)、氮氧基介导的自由基聚合(NMP)、iniferter聚合、自由基聚合、钴介导的自由基聚合、碲介导的聚合和锑介导的聚合。
分子-聚合物结合物的产率可以是至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％。在一些实施方式中，分子-聚合物结合物的产率为至少约75％。在一些实施方式中，分子-聚合物结合物的产率为至少约85％。
在其中分子包含多肽的一些实施方式中，多肽的至少约20％仅在C末端具有结合的支化聚合物。多肽的至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％仅在C末端具有结合的支化聚合物。
在一些实施方式中，分子-聚合物结合物通过色谱法分离，色谱法例如为尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法或疏水相互作用色谱法或其组合。在一些实施方式中，色谱法包含尺寸排阻色谱法。
4.施用
组合物可以包含结合物。如上详述的结合物可以根据药学领域技术人员众所周知的标准技术配制成组合物。组合物可以被制备成施用于受试者。包含结合物的这种组合物可以利用医学领域技术人员众所周知的剂量和技术在考虑诸如特定受试者的年龄、性别、重量和状况以及施用途径的因素的情况下进行施用。
结合物可以预防性或治疗性地施用。在预防性施用时，结合物可以以足以诱导响应的量施用。在治疗性应用时，结合物以足以引起治疗效果的量施用于有需要的受试者。足以实现这一效果的量被定义为“治疗有效剂量”。有效用于这种用途的量取决于例如所施用的结合物方案的特定组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的一般健康状态以及处方医师的判断。
结合物可以通过本领域中众所周知的以下文献中所述的方法施用：Donnelly等人(Ann.Rev.Immunol.1997,15,617-648)；Felgner等人(美国专利号5,580,859,1996年12月3日授权)；Felgner(美国专利号5,703,055,1997年12月30日授权)；和Carson等人(美国专利号5,679,647,1997年10月21日授权)，所有这些专利的内容通过全文引用的方式并入本文中。结合物可以与可以例如使用疫苗枪施用于个体的颗粒或珠粒复合。本领域技术人员将会知道，药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于例如施用途径。
结合物可以经由各种途径来递送。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如皮内、肌内或皮下递送。其他途径包括口服施用、鼻内、阴道内、透皮、静脉内、动脉内、肿瘤内、腹膜内和表皮途径。在一些实施方式中，将结合物静脉内、动脉内或腹膜内施用于受试者。
结合物可以是液体制剂，如悬浮液、糖浆或酏剂。可以将结合物并入脂质体、微球体或其他聚合物基质中(如通过Felgner等人,美国专利号5,703,055；Gregoriadis,Liposome Technology,第I至III卷(第2版,1993)中所述的方法，所述参考文献的内容通过全文引用的方式并入本文中)。脂质体可以由磷脂或其他脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒、生理学上可接受和可代谢的载体。
结合物可以用作疫苗。疫苗可以经由电穿孔来施用，如通过美国专利号7,664,545中描述的方法，该专利的内容通过引用的方式并入本文中。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874；5,676,646；6,241,701；6,233,482；6,216,034；6,208,893；6,192,270；6,181,964；6,150,148；6,120,493；6,096,020；6,068,650；和5,702,359中所述的方法和/或仪器来进行，所述专利的内容通过全文引用的方式并入本文中。电穿孔可以经由微创装置来进行。
在一些实施方式中，结合物以控释制剂施用。例如，结合物可以释放到循环或肿瘤中。在一些实施方式中，结合物可以在至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约1周、至少约1.5周、至少约2周、至少约2.5周、至少约3.5周、至少约4周或至少约1个月的时间内释放。
5.方法
a.降低分子的抗原性的方法
本文提供了降低分子的抗原性的方法。所述方法可以包括使至少一个支化聚合物与分子结合形成分子-聚合物结合物，如本文所详述的。
在一些实施方式中，分子包含含有分选酶A识别位点的多肽，并且将支化聚合物和多肽与分选酶A一起在使支化聚合物与多肽的分选酶A识别位点结合的条件下温育。在一些实施方式中，分子包含含有分选酶A识别位点的多肽，并且结合包括(a)使分子与分选酶A和引发剂一起在允许引发剂连接于分选酶A识别位点的条件下接触以形成大分子引发剂；和(b)将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQID NO：1)，其中X是任何氨基酸。在一些实施方式中，在步骤(b)中将大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。在一些实施方式中，步骤(b)中的单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。在一些实施方式中，方法还包括将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离。
方法还可以包括将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离。在一些实施方式中，分子-聚合物结合物的产率为分离的总结合物和大分子引发剂的至少约50％。在一些实施方式中，通过色谱法分离分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，色谱法包含尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法或疏水相互作用色谱法或其组合。在一些实施方式中，色谱法包含尺寸排阻色谱法。
在一些实施方式中，合成支化聚合物并随后将所述支化聚合物接枝到分子上以形成分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，使用自由基聚合来合成支化聚合物。在一些实施方式中，使用至少一种选自离子开环聚合(离子ROP)、开环易位聚合、离子聚合、缩聚和配位聚合的方法来合成支化聚合物。
在一些实施方式中，使至少一个支化聚合物与分子结合形成分子-聚合物结合物包含使引发剂连接于分子以形成大分子引发剂；和将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，将大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。在一些实施方式中，单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。在一些实施方式中，方法还包括将分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离。
在一些实施方式中，自由基聚合包含以下中的至少一种：原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)、自由基开环聚合(自由基ROP)、氮氧基介导的自由基聚合(NMP)、iniferter聚合、自由基聚合、钴介导的自由基聚合、碲介导的聚合和锑介导的聚合。
b.制备分子-聚合物结合物的方法
本文提供了制备与对照相比具有降低或消除的抗原性的分子-聚合物结合物的方法。分子可以包括具有分选酶A识别位点的多肽。方法可以包括(a)使分子与分选酶A和引发剂在允许引发剂连接于分选酶A识别位点的条件下接触以形成大分子引发剂；和(b)将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合的条件下温育以形成分子-聚合物结合物。
在一些实施方式中，分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸。在一些实施方式中，在步骤(b)中将大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。在一些实施方式中，步骤(b)中的单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。在一些实施方式中，自由基聚合包含以下中的至少一种：原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)、自由基开环聚合(自由基ROP)、氮氧基介导的自由基聚合(NMP)、iniferter聚合、自由基聚合、钴介导的自由基聚合、碲介导的聚合和锑介导的聚合。在一些实施方式中，自由基聚合包含以下中的至少一种：离子开环聚合(离子ROP)、开环易位聚合、离子聚合、缩聚和配位聚合。
在一些实施方式中，自由基聚合包含以下中的至少一种：原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)、自由基开环聚合(自由基ROP)、氮氧基介导的自由基聚合(NMP)、iniferter聚合、自由基聚合、钴介导的自由基聚合、碲介导的聚合和锑介导的聚合。
方法还可以包括将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离。在一些实施方式中，分子-聚合物结合物的产率为分离的总结合物和大分子引发剂的至少约50％。在一些实施方式中，通过色谱法分离分子-聚合物结合物。在一些实施方式中，色谱法包含尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法或疏水相互作用色谱法或其组合。在一些实施方式中，色谱法包含尺寸排阻色谱法。
6.实施例
实施例1
材料和方法
实验设计：所有的体外和体内实验都包括适合的对照；在适用的情况下，PBS用作阴性对照，并且未修饰的exendin用作阳性对照。基于先前进行的类似研究选择体内研究的样本大小(Amiram,M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.2013,110,2792-2797；Schellenberger,V.等人,Nat.Biotechnol.2009,27,1186-1188)。关于所用动物模型的详情，请参见下面的动物研究部分。在每个实验开始前将小鼠随机分组。调查员对分组情况知情。对于体内餐后葡萄糖测量研究，测量小鼠血液葡萄糖水平，直到与PBS对照组相比，所有实验组的葡萄糖减少不再显示出统计学显著性。所有收集的数据点都被包括在数据分析中。
克隆、表达和纯化：除非另外说明，否则所有分子生物学试剂都购自New EnglandBiolabs。pMA-T载体中编码exendin的基因经密码子优化并由Life Technologies合成。在大肠杆菌中重组表达的蛋白质中，编码翻译起始密码子的第一个甲硫氨酸残基需要在翻译后被切割掉以获得蛋白质的适当功能和稳定性。然而，exendin的第一个氨基酸是组氨酸，并且我们过去的经验和文献中的报告均表明，具有组氨酸作为紧邻甲硫氨酸后的残基阻止正确的甲硫氨酸切割。因此，在肽的N末端处并入二丙氨酸前导序列以促进甲硫氨酸切割。一旦在体内后，二丙氨酸前导序列可以被二肽基肽酶4(DPP4)切割掉，DPP4是切割含脯氨酸或丙氨酸作为第二残基的N末端二肽的外切肽酶，露出exendin的N末端用于GLP-1R结合。使用正向和反向引物通过聚合酶链反应(PCR)扩增exendin基因，所述正向和反向引物含有NdeI突出端，并且在反向引物中依序并入分选酶A识别基序“LPETG”(为了简便起见，称为“srt”)的序列以及His6-标签。将扩增的“exendin-srt-His6”片段插入到修饰的pET-24a+载体中紧邻序列为(VPGVG)60的ELP上游的NdeI限制性位点处，产生“exendin-srt-His6-ELP”。
四元融合蛋白的表达和纯化遵循具有微小改变的先前描述的程序(Qi,Y.等人,Macromol.Rapid Commun.2013,34,1256-1260)。简言之，将细胞在25℃下在补充有45μg/mL卡那霉素的Terrific肉汤(TB，MoBio Laboratories,Inc.)中培养。一旦培养物在600nm下的光密度(OD600)达到0.6后，将温度降至16℃，并且添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，AMRESCO)至终浓度为0.1mM来诱导蛋白质表达。在诱导后15h通过在700×g下离心10min收获细胞，并通过在Misonex超声波液体处理器(Qsonica,LLC.)上利用10sec开和40sec关的循环以振幅85超声处理3min对所述细胞进行裂解。通过添加1vol％聚乙烯亚胺(PEI，Acros)，随后在4℃和21,000×g下离心10min从粗提取物中去除核酸。ELP标签使得能够通过ITC纯化融合蛋白，ITC是我们以前开发的用于纯化ELP融合蛋白的非色谱方法，其利用ELP赋予的反相变行为(Meyer,D.E.和Chilkoti,A.Nat.Biotechnol.2009,14,1112-1115)。通过添加0.1M硫酸铵触发融合体的反相变后，通过在～30℃和21,000×g下离心10min收集聚集的蛋白质。然后将沉淀物重新溶解于冷PBS中，并将所得溶液在4℃和21,000×g下离心10min来去除任何剩余的不溶物质。通常再重复最后两个步骤一次来获得均匀的蛋白质，如通过SDS-PAGE所证实的。在最终步骤中，将蛋白质重新溶解在分选酶缓冲液(50mM Tris，150mM NaCl，10mM CaCl2，pH调节至7.5)中，为分选酶催化的引发剂连接做好准备。
pET15b载体中具有59个N末端氨基酸截短(据先前显示，不影响分选酶A的转肽酶活性)并且具有N末端His6-标签的分选酶A的基因可从先前的研究中获得。如前述进行His6-分选酶A的表达和纯化(Qi,Y.等人,Macromol.Rapid Commun.2013,34,1256-1260)。
分选酶催化的引发剂连接和大分子引发剂纯化：exendin-C-Br大分子引发剂按照具有微小改变的先前所述的程序进行合成和纯化(Qi,Y.等人,Macromol.RapidCommun.2013,34,1256-1260)。简言之，将由2:1:60比率的exendin-srt-His6-ELP、His6-分选酶A和AEBMP在分选酶缓冲液中组成的反应混合物在20℃下温育18h。反应后，使用反向His-标签纯化来分离exendin-C-Br大分子引发剂，这是通过利用如下事实来实现的：exendin-C-Br大分子引发剂是混合物中唯一没有His6-标签的物质。在配备有设定在280nm的光电二极管检测器和HisTrapHP柱的AKTA纯化器(GE Healthcare)上进行纯化。用PBS洗脱通过柱子在洗脱物中得到纯exendin-C-Br，而所有其他不需要的物质仍结合在树脂上。将收集的exendin-C-Br在PBS(pH 7.4)中透析过夜以去除残余的游离引发剂。
大分子引发剂表征：在Voyager-DE Pro质谱仪(Life Technologies)上进行MALDI-MS。将PBS中约25μM的样品用90:10水/乙腈中的10mg/mL芥子酸进行1:10稀释，其中利用0.1vol％三氟乙酸(TFA)作为电离基质。以线性模式运行仪器，其中使用N2激光来产生正离子。使用泛素作为分子量标准物来校准仪器。
为了进行LC/MS-MS分析以证实引发剂连接的位点特异性，将100μL在PBS中的约8μM exendin-C-Br在ZebaSpin脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)上溶剂交换为50mM碳酸氢铵(pH8.0)，接着在37℃下直接在柱中进行胰蛋白酶(测序级，Promega)消化18小时。通过离心收集消化混合物，通过真空离心进行干燥，然后重新悬浮于20μL 2％乙腈和0.1％甲酸水溶液中。使用由(A)0.1％甲酸水溶液和(B)0.1％甲酸的乙腈溶液组成的流动相，在配备有BEH130C18反相柱(Waters)的NanoAquity超高效液相色谱(UPLC，Waters)系统上分离1μL样品。在60分钟内以400nL/min进行5％B至40％B的线性梯度，并且通过电喷雾电离(ESI)来电离分离的肽，接着在Synapt G2HDMS QToF质谱仪(Waters)上进行MS分析。选择四种最丰富的离子用于MS/MS。用Mascot Distiller(Matrix Science)处理质谱，然后针对附有定制exendin-C-Br序列的SwissProt_Ecoli数据库进行Mascot搜索(Matrix Science)。将搜索结果输入Scaffold(v4.0，Proteome Software)中，并且将评分阈值设定成产生最低的99％蛋白质置信度用于蛋白质鉴定。在MassLynx(v4.1)中进行提取的离子色谱。将胰蛋白酶消化的溴化C末端肽的实验同位素分布与在分子量计算器(v.6.49，Pacific NorthwestNational Laboratory，ncrr.pnl.gov/software)中建模的理论同位素分布进行比较。
原位ARGET-ATRP：除非另外说明，否则所有化学试剂都购自Sigma Aldrich并按原样使用。使EG9OEGMA单体(平均地，Mn为约500Da或约9个侧链EG重复单元，Sigma Aldrich，#447943)和EG3OEGMA单体(三乙二醇甲基醚甲基丙烯酸酯，232Da，Sigma Aldrich，#729841)穿过碱性氧化铝柱以去除抑制剂。
在典型的反应中，将216μmol OEGMA和21.6μL在含5％二甲基甲酰胺(DMF)的MilliQ水中包含预复合的200mM CuBr2和1.6M三(2-吡啶基甲基)胺(TPMA)的储备溶液与1mL含500μM exendin-C-Br的PBS溶液在Schlenk烧瓶中混合。在单独的烧瓶中制备3.2mM抗坏血酸的MilliQ水溶液。通过用氩气鼓泡30min将两种溶液脱气，之后通过以1.6nmol/min的速率使用注射泵将抗坏血酸溶液连续注入反应介质中来启动并维持活化剂再生电子转移(ARGET)ATRP。允许在20℃下在氩气下进行特定时间的聚合，并通过用空气鼓泡来淬灭。用443μmol单体在20v/v％甲醇的PBS溶液中完成EG3OEGMA的反应，而所有其他条件保持相同。在反应结束时，将反应混合物用PBS透析过夜来去除残留的小分子试剂，为下游的表征和纯化做好准备。
OEGMA单体的表征：在配备有Zorbax Eclipse Plus C18柱(Agilent)的Agilent1100LC系统上，使用由(A)0.3％甲酸的水溶液和(B)0.3％甲酸的乙腈溶液组成的流动相分离用甲醇1:20,000稀释的单体。在50℃下在10分钟内进行50％B至95％B的线性梯度。通过ESI电离分离的样品，接着在Agilent MSD离子阱质谱仪上进行MS分析。
exendin-C-POEGMA结合物的物理表征：在配备有在280nm下操作的UV-vis检测器(SPD-10A VP)的Shimadzu高效液相色谱(HPLC)系统上进行分析型SEC。在蛋白质KW-803柱(Shodex)上，在25℃下以0.5mL/min的流速使用0.1M Tris-HCl(pH 7.4)作为流动相来分离50μL约2mg/mL的样品。通过定量在280nm下检测的峰的AUC来计算来自exendin的原位ATRP的结合效率。每个色谱中对应于未反应的大分子引发剂和结合物的两个峰的AUC的总和被认为是100％，并且计算结合物峰的％分数作为该特定聚合反应的结合效率。
将分析型HPLC系统的流体管线在下游串联连接到DAWN HELEOS II MALS检测器，然后是Optilab T-rEX折射计(均来自WyattTechnology)，以进行SEC-MALS分析。将系统用甲苯校准并用2.0mg/mL牛血清白蛋白(BSA，Pierce)标准化。注射前使样品穿过0.1μm过滤器。在Anton Paar Abbemat 500折射计(Anton Paar)上测定结合物的dn/dc值。在ASTRA(v.6.0，Wyatt Technology)中分析数据以计算结合物的Mw、Mn和
通过在配备有设定在280nm的光电二极管检测器和HiLoad 26/600Superdex200PG柱的AKTA纯化器上，在4℃下使用PBS作为流动相并且使用2.0mL/min的流速进行单轮制备型SEC来纯化结合物。
在DynaPro板读取器(Wyatt Technology)上进行DLS。制备25μM的样品并在分析前用0.1μm过滤器过滤。在831.95nm的激光波长、90°的散射角和25℃下操作该仪器。使用Dynamics 6.12.0.3以Dynals模式分析数据。
一般生化分析：通过UV-vis吸收光谱法在ND-1000Nanodrop分光光度计(ThermoScientific)上测量融合蛋白的浓度。根据制造商的说明书，使用二辛可宁酸(BCA，Pierce)测定法来评定用于体外测定和体内研究的exendin和结合物的浓度。使用预制的4-20％Tris-HCl凝胶(Bio-Rad)进行分选酶A的SDS-PAGE分析。使用预制的Tris/Tricine凝胶(Bio-Rad)进行所有exendin衍生物的SDS-PAGE分析。通过使用Image Lab(v.4.0.1，Bio-Rad)中的内建函数进行凝胶密度测定分析来完成分选酶反应转化的定量。
体外cAMP ELISA：通过在稳定转染有大鼠GLP-1R的BHK细胞(来自Drucker组,University of Toronto,Toronto,Canada的慷慨捐赠)中对作为GLP-1R活化的结果的细胞内cAMP释放进行定量来体外评定天然exendin和结合物的活性(Drucker,D.J.和Nauck,M.A.Lancet2006,368,1696-1705)。使细胞在24孔板中达到70-80％汇合。在测定之前，将约20μg的肽或等当量的结合物用0.5μg DPP4(ProSpect)处理过夜以去除二丙氨酸前导序列。在测定当天，将细胞与3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX，EMD Millipore)一起温育1h来防止cAMP降解，接着与不同浓度(0.001-1000nM，以对数级递增)的exendin(Genscript)或结合物一起温育10min来触发GLP-1R活化。接着添加0.1M HCl来破坏细胞并释放细胞内cAMP。根据制造商的方案(Enzo Life Sciences)通过竞争性cAMP ELISA测量cAMP浓度。将每个样品一式三份进行测定，并且在Igor Pro(v.6.2，Wavemetrics)中使用Hill方程拟合来分析数据以确定每种构建体的EC50(Goutelle,S.等人,Fundam.Clin.Pharmacol.2008,22,633-648)。
动物研究：用购自Jackson Laboratories的6周龄雄性C57BL/6J小鼠(库存号000664)进行体内实验。抵达后，小鼠开始60kCal％脂肪饮食(#D12492，Research DietsInc.)以诱导糖尿病表型。先前的研究已建立了高脂肪喂养的C57BL/6J小鼠作为2型糖尿病的适当模型，因为在高脂肪饮食一周后，小鼠表现出升高的血液葡萄糖、逐渐增加的胰岛素水平和严重受损的胰岛素响应和葡萄糖耐受性(Winzell,M.S.和Ahren,B.Diabetes 2004,53,S215-S219；Surwit,R.S.等人,Diabetes 1988,37,1163-1167)。将小鼠置于12h光照/12h黑暗循环的受控光照下，自由获取食物和水。在开始实验之前，使所有小鼠适应高脂肪饮食和所述设备10天。用于EG3结合物的餐后葡萄糖测量研究的小鼠保持高脂肪饮食3周并在8周龄时使用。所有的动物护理和实验程序都得到Duke机构动物护理和使用委员会的批准。
体内餐后葡萄糖测量：在单次皮下注射每种样品后测量天然exendin和结合物对餐后血液葡萄糖水平的影响。在血液葡萄糖测量之前，将尾巴用杀菌的酒精溶液擦拭并擦干。使用一次性采血针在小鼠尾静脉上形成小切口，并将第一滴1μL血液擦掉。使用手持糖度计(AlphaTrack，Abbott)将第二滴1-2μL血液用于葡萄糖测量。在实验前1天测量血液葡萄糖水平。在注射当天，测量重量和血液葡萄糖，并皮下注射等体积的样品溶液或PBS对照。在注射后立即将小鼠放回笼中使其可自由获取食物和水，并在注射后1、4、6(仅exendin)、8、24、48、72、96、120和144h时测量血液葡萄糖。每天监视重量。在EG9剂量依赖性研究中，以25、50和85nmol/kg小鼠体重将66.2kDaEG9exendin-C-POEGMA结合物注射到小鼠(n＝3)中。在EG9MW依赖性研究中，将25.4、54.6、97.2和155.0kDa Mn的EG9结合物以25nmol/kg注射到小鼠(n＝6)中。在EG3餐后葡萄糖研究中，以25nmol/kg将55.6kDa和71.6kDa EG3exendin-C-POEGMA结合物注射到小鼠(n＝5)中。通过注射前24小时和临注射前测量的平均葡萄糖水平将血液葡萄糖水平标准化，以反映血液葡萄糖变化百分比并校正葡萄糖的瞬时变化。
体内IPGTT：将小鼠随机分组(图4a和图4b中n＝5，图4c和图4d中n＝3)。在第一天，各两组小鼠接受54.6kDa EG9 exendin-C-POEGMA结合物、作为阳性对照的exendin、或等体积的作为阴性对照的PBS的皮下注射。以25nmol/kg注射exendin和结合物。注射后18h，通过去除食物使每个类别中的一组小鼠禁食6h。在禁食阶段结束时(注射后24h)，通过腹膜内注射给予小鼠1.5g/kg葡萄糖(10w/v％无菌葡萄糖溶液，Sigma)。通过在葡萄糖施用后0、20、40、60、90和120min切割尾静脉并使用糖度计测量血液中的葡萄糖水平来监测血液葡萄糖水平。注射后66h，对其余组的小鼠进行相同的方案并且在注射后72h类似地进行IPGTT。
体内药代动力学：Exendin、54.6kDa EG9、55.6kDa EG3和71.6kDa EG3exendin-C-POEGMA结合物根据制造商的方案，经由其赖氨酸残基和N末端上的溶剂可接近的伯胺，用Alexa488NHS酯(Thermo Fisher Scientific)进行荧光标记。使用ZebaSpin脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)去除未反应游离荧光团。将小鼠随机分成四组(n＝3)。注射之前将动物称重。每组小鼠以75nmol/kg(45nmol/kg荧光团)接受标记样品之一的单次皮下注射。在注射后40s、40min、2.5h、4.5h、8h、24h、48h、72h、96h和120h，从尾静脉收集10μL血液样品到100μL肝素溶液(1kU/ml的PBS溶液，Sigma Aldrich)中。将血液样品在4℃和20,000×g下离心10min来提取血浆，以在Victor多标记板读取器(Perkin Elmer)上在485nm激发和535nm发射下进行荧光读取。使用表征曲线的吸收和消除相的非房室分析(PKSolutions 2.0，Summit Research Services)来拟合构建体的血浆浓度随时间变化的曲线，以得到药代动力学参数。
体外抗PEG ELISA：在直接ELISA中，用(Crealta Pharmaceuticals)、ADA(Sigma-Tau Pharmaceuticals)、 (Sigma-Tau Pharmaceuticals)、exendin(Genscript)、54.6kDa EG9 exendin-C-POEGMA结合物、55.6kDa EG3exendin-C-POEGMA结合物或BSA(Sigma Aldrich)包被96孔微量滴定板(CoStar)的列。在PBS中制备用于板包被的抗原溶液，以在每孔添加50μL后，每孔产生约2μg的未修饰肽/蛋白质或在聚合物修饰的抗原的情况下约5μg的PEG/OEG。如下计算聚合物修饰的抗原的PEG/OEG含量：由四聚体尿酸酶(总共125kDa)组成，其中四个亚基各自上的10-11个赖氨酸侧链氨基基团与10kDa PEG对硝基苯基碳酸酯反应，得到约76％的PEG含量。根据制造商的说明书(Sigma-Tau Pharmaceuticals)，由ADA(40.8kDa)组成，其中溶剂可接近的赖氨酸上的侧链氨基基团中的11-17个用5kDa单甲氧基琥珀酰基PEG官能化。为进行我们的计算，我们假设平均每个结合物有14个PEG链，得到约60％PEG含量。在exendin-C-POEGMA结合物的情况下，减去聚(甲基丙烯酸甲酯)主链(对于EG9POEGMA来说约17％，并且对于EG3POEGMA来说约37％)，得到对于54.6kDa EG9结合物来说约75％的OEG含量和对于55.6kDa EG3结合物来说约58％的OEG含量。在4℃下过夜温育包被的板后，用PBS洗涤，并用1％BSA的PBS溶液封闭所有孔。将先前测试为PEG抗体阴性的一个患者血浆样品和两个测试为阳性的患者血浆样品用1％BSA的PBS溶液1:400v/v稀释。两个阳性患者血浆样品来自的II期临床试验期间产生抗PEG抗体的两个不同个体。在另一轮PBS洗涤之后，添加100μL各稀释的血浆样品和1％BSA的PBS溶液来复制每种抗原的孔。接着将板在室温下温育2h。再次用PBS洗涤孔，并向各孔中添加100μL用1％BSA的PBS溶液1:5250稀释的碱性磷酸酶结合的山羊抗人IgG(Sigma)。在室温下温育1h后，用PBS，然后用Tris缓冲的盐水洗涤孔。根据供应商的指导，通过与磷酸对硝基苯酯(Sigma)一起温育来检测结合的碱性磷酸酶。通过添加50微升/孔的10％NaOH来终止磷酸酶反应，并在板读取器(Tecan InfiniteM200Pro，Tecan Austria)上测量405nm下的吸光度。
在竞争性ELISA中，通过在4℃下温育过夜，将微量滴定板用每孔50μL 100μg/mL进行包被。用PBS稀释不同量的ADA、exendin、54.6kDa EG9exendin-C-POEGMA结合物和55.6kDaEG3exendin-C-POEGMA结合物，以在每孔添加50μL之后每孔产生0、0.5、2、5、10和20μg竞争性抗原。制备和exendin-C-POEGMA结合物的稀释液，使得在每种竞争性抗原浓度下，比较类似的PEG/OEG含量，如表5所示。将稀释的竞争性抗原与等体积的测试为PEG抗体阳性的患者血浆样品(用1％BSA的PBS溶液1:200v/v稀释)混合并在4℃下温育过夜。第二天早晨，用PBS洗涤后，将所有孔用1％BSA的PBS溶液封闭。封闭后用PBS洗涤孔，并在重复孔中添加100μL各浓度的竞争性抗原-血浆混合物。在室温下温育2h后，添加碱性磷酸酶结合的IgG以在405nm下获得比色读数，如上所述。
表5.在竞争性ELISA中每个孔中作为竞争性抗原载入的不同量的和exendin-C-POEGMA结合物及其相应的PEG/OEG含量。的PEG含量通过假设每个结合物具有14个PEG链来近似计算，而exendin-C-POEGMA结合物的OEG含量通过减去聚(甲基丙烯酸甲酯)主链来直接计算。
图5a和图5b中的测定在n＝3的情况下进行，图5c和图5d中的测定在n＝5的情况下进行。
统计学分析：数据以平均值±标准误差(SE)的形式呈现。餐后葡萄糖测量研究(n＝6)中的血液葡萄糖水平用在注射前24h和临注射前测量的平均葡萄糖水平标准化。使用重复测量两因素ANOVA，然后使用事后Dunnett多重比较检验来分析对餐后葡萄糖水平的处理效果，以评估每个时间点处理组与PBS对照组之间的个体差异。使用单因素ANOVA，然后使用事后Tukey多重比较检验来比较餐后葡萄糖曲线的AUC(n＝6)。为了评估IPGTT的AUC(n＝5)，使用不成对的参数双尾t检验来比较处理组与PBS组。使用两因素ANOVA，然后使用事后Dunnett多重比较检验来分析直接和竞争性抗PEG ELISA(n＝3)，以评估每个血浆样品(直接)或抗原浓度(竞争)下exendin-C-POEGMA与其他组之间的个体差异。如果P值小于0.05，则认为检验是显著的。使用Prism 6(GraphPad software Inc.)进行统计学分析。
实施例2
分选酶催化的引发剂与exendin C末端的连接
我们利用分选酶A的C末端天然肽连接机制将ATRP引发剂N-(2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰胺基)乙酰氨基)乙基)-2-溴-2-甲基丙酰胺(AEBMP)位点特异性地连接于exendin的C末端(图1)。重组表达缩写为“exendin-srt-His6-ELP”的四元融合蛋白以用作分选酶A底物(图1a)。如先前研究中所解释的，“srt”表示天然分选酶A识别序列“LPETG”，并且ELP指刺激响应性弹性蛋白样多肽，并入ELP使得能够通过反转变循环(ITC，图7a)来容易地纯化融合蛋白，ITC是我们以前开发的非色谱蛋白质纯化方法(Meyer,D.E.和Chilkoti,A.Nat.Biotechnol.1999,14,1112-1115)。故意使识别序列位于蛋白质与ELP之间，以使得通过分选酶A进行的转肽化不仅将引发剂连接于exendin，而且方便地释放纯化标签。具有N末端六组氨酸标签(His6-标签)的分选酶A从早期研究中构建的质粒重组表达，并通过固定金属亲和色谱法(IMAC，图7b)纯化。化学合成的ATRP引发剂AEBMP(图1)具有用作亲核剂的N末端(Gly)3基序，因为据报告在存在两个或更多甘氨酸的情况下分选酶催化的C末端连接具有最大反应速率(Mao,H.等人,J.Am.Chem.Soc.2004,126)。
成功的分选酶催化的引发剂连接(图1b)使得exendin-LPETG-His6-ELP被切割为exendin-LPET和G-His6-ELP，接着AEBMP连接于exendin-LPET产生大分子引发剂产物(exendin-C-Br)。如通过凝胶密度法测定所评定的，反应混合物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析(图2a)显示>90％的exendin-C-Br转化。类似于先前的研究，在exendin-srt-His6-ELP融合体上的“srt”与ELP之间有意插入His6-标签，使得通过His6-分选酶A进行转肽化后，除了期望产物exendin-C-Br以外的所有残余反应物、酶和副产物都携带His6-标签。因此，通过IMAC柱洗脱在洗脱物中产生纯exendin-C-Br(图2a)，而所有其他不想要的物质仍结合于树脂。
实施例3
exendin-C-POEGMA结合物的合成和表征
接下来，进行原位活化剂再生电子转移(ARGET)ATRP(Jakubowski,W.和Matyjaszewski,K.Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,4482-4486)以使POEGMA与exendin-C-Br接枝(图1c)。如通过液相色谱电喷雾电离质谱法(LC/ESI-MS)分析(图8a)所示，使用平均质量为约500Da或具有约9个侧链EG重复单元(EG9)的OEGMA单体。改变反应时间来产生具有一定MW范围的EG9exendin-C-POEGMA结合物。exendin-C-Br在聚合前通过280nm下的UV-vis吸光度检测的尺寸排阻色谱法(SEC)分析(图2b)显示出在23.7min洗脱的单个峰。在聚合之后，大分子引发剂峰的强度大大降低，并且伴随着在21.3、19.5、17.8、16.5和15.0min处出现峰，所述峰对应于随着反应时间增加具有增加的MW的EG9exendin-C-POEGMA结合物。UV-vis检测结果与折射率(RI)检测结果(图9a)一致。在UV-vis色谱中峰面积的积分显示平均结合产率为约80％。如表1所示，合成的结合物的Mn在25.4至155.0kDa范围内，并且所有结合物具有非常窄的分散性()。结合物可以通过单轮制备型SEC容易且完全地纯化(图9b)。
表1.exendin和exendin-C-POEGMA结合物的物理性能和生物学活性。MW和通过尺寸排阻色谱法多角度光散射(SEC-MALS)来测定。通过动态光散射(DLS)测量Rh。EG9和EG3结合物的EC50值分别从图2c和图13中的cAMP响应曲线获得。Rh和EC50值以平均值±SEM形式报告，对于Rh来说n＝10，对于EC50来说n＝3。Mw：重均MW，Mn：数均MW，：分散性，Rh：流体动力学半径，EC50：半数最大有效浓度。a由氨基酸序列计算。b由于肽的单分子性质产生的缺省值。
exendin通过结合和活化G蛋白偶联的GLP-1受体(GLP-1R)起作用，这导致释放环腺苷单磷酸(cAMP)作为下游信号转导级联中的第二信使，最终引起胰岛素分泌来调节血液葡萄糖。接着通过在稳定转染有大鼠GLP-1R的幼仓鼠肾(BHK)细胞中对作为GLP-1R活化的结果的细胞内cAMP释放进行定量来评定天然exendin和EG9exendin-C-POEGMA结合物的效力。如图2c和表1所示，使EG9POEGMA与exendin接枝以总MW依赖性方式增加肽的EC50，这表明，作为由附加的POEGMA链施加的空间位阻的结果，受体结合随着聚合物MW的增加而减少。
实施例4
EG9exendin-C-POEGMA的体内治疗功效
在维持60kCal％脂肪饮食以产生糖尿病表型的雄性C57BL/6J小鼠中评定EG9exendin-C-POEGMA结合物的体内功效(Winzell,M.S.和Ahren,B.Diabetes 2004,53,S215-S219；Surwit,R.S.等人,Diabetes 1988,37,1163-1167)。首先进行剂量依赖性研究来确定适当的剂量。经由以25、50和85nmol/kg小鼠体重单次皮下注射66.2kDa EG9exendin-C-POEGMA结合物，将所述结合物施用于小鼠。在注射后不同时间点测量的餐后血液葡萄糖水平显示，与磷酸盐缓冲盐水(PBS)对照相比，葡萄糖减少的持续时间随着结合物剂量的增加而总体略微增加(图10a和图10b，表3)。在小鼠体重方面观察到类似的趋势，其中用最高剂量处理的小鼠显示出比两个较低剂量显著更多的重量减轻(图10c)。虽然已明确确定了exendin的重量下降益处，但过度给药可能引起恶心，从而可能导致啮齿类动物的急性重量减轻。在接受最高剂量的小鼠中观察到的过度重量减轻表明存在恶心的可能性，因此所有后续研究都以25nmol/kg的剂量进行。
表3.与PBS对照相比，图10a中所示的EG9exendin-C-POEGMA的剂量依赖性餐后血液葡萄糖测量的统计学显著性水平的总结。利用重复测量两因素方差分析(ANOVA)，然后利用事后Dunnett检验来分析数据，以评估在每个时间点处理组与PBS对照组之间的个体差异(n＝3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001并且****P<0.0001)。
为了研究MW对EG9exendin-C-POEGMA结合物的葡萄糖调节作用的影响，以25nmol/kg小鼠体重单次皮下注射来测试天然exendin和四种不同MW(Mn＝25.4、54.6、97.2和155.0kDa)的结合物。虽然相对于PBS对照，未修饰的exendin仅能够降低血液葡萄糖达6h(图3a，图11中的全葡萄糖曲线)，但用EG9POEGMA修饰显著延长了exendin的葡萄糖降低作用长达120h，其中对作用的开始、幅度和持续时间具有MW依赖性(图3b-e，表4)。从图12a中重叠的葡萄糖曲线明显看出(图12b中重叠的未标准化的葡萄糖曲线)，MW的增加延迟了葡萄糖降低的开始但延长了其持续时间，并且两种较高MW的结合物显示出葡萄糖降低的总体幅度较小。处理动物的重量曲线也反映了这种趋势(图12c)。两种较高MW的结合物也显示出平坦和稳定得多的葡萄糖曲线。155.0kDa结合物的葡萄糖曲线特别类似于持续释放储库的葡萄糖分布，没有可能引起不期望的副作用的峰谷效应。
表4.与PBS对照相比，图3中所示的EG9exendin-C-POEGMA结合物的MW依赖性餐后血液葡萄糖测量的统计学显著性水平的总结。使用重复测量两因素ANOVA，然后使用事后Dunnett多重比较检验来分析数据，以评估在每个时间点处理组与PBS对照组之间的个体差异(n＝6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，并且****P<0.0001)。---用结合物处理的组在t＝6h时未进行测量。
体外cAMP结果和体内MW依赖性餐后葡萄糖测量共同显示，结合聚合物的MW增加降低了EG9exendin-POEGMA结合物的效力，但增加了其循环持续时间。因此，我们假设存在最佳的结合物MW，其能最好地平衡这两种相反的效应。餐后葡萄糖曲线相对于0％基线的曲线下面积(AUC)表示总葡萄糖暴露，其解释了葡萄糖降低的幅度和持续时间，因此是两种相反因素的组合效应的表现。绘制餐后葡萄糖水平的AUC随结合物Mn变化的曲线确实产生了在54.6kDa下具有最小值的大致倒钟形分布(图3f)。这表明，在平衡受体活化效力和作用的持续时间方面，54.6kDa结合物在所测试的EG9结合物中是最佳的。因此我们在后续的实验中进一步研究了54.6kDa EG9结合物。
为了验证餐后葡萄糖测量的结果并获得EG9exendin-C-POEGMA结合物的功效的其它证据，在以25nmol/kg单次皮下注射54.6kDa EG9结合物或未修饰的exendin后24h和72h进行腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)。IPGTT证实结合物在循环中延长的存在时间以及其对葡萄糖控制的显著效应：在注射后24h，葡萄糖挑战后2h内血液葡萄糖水平的AUC降低68％(P<0.0001，图4a)，并且在注射后72h，与PBS对照相比，结合物处理的小鼠的AUC降低48％(P<0.01，图4b)。这与未修饰的exendin组形成鲜明对比，未修饰的exendin组在两个时间点都不显著(图4c和图4d)。
实施例5
EG9exendin-C-POEGMA结合物的抗原性
我们使用酶联免疫吸附测定(ELISA)测试了54.6kDa EG9 exendin-C-POEGMA结合物对先前用聚乙二醇化蛋白质处理的患者的血浆样品中抗PEG抗体的反应性。在直接ELISA中，将54.6kDa EG9 exendin-C-POEGMA结合物和各种对照(包括两种FDA批准的药物，(用于治疗严重联合免疫缺陷病(SCID)的聚乙二醇化腺苷脱氨酶)和(用于治疗慢性难治性痛风的聚乙二醇化尿酸酶))直接包被在板上，并用稀释剂、抗PEG阴性患者血浆样品或两种抗PEG阳性患者血浆样品中的一种进行探测。如图5a所示，尽管EG9exendin-C-POGEMA结合物确实显示少量结合于阳性血浆样品中的抗PEG抗体，但结合程度显著小于两种聚乙二醇化阳性对照的结合程度。这个结果通过竞争性ELISA来证实，其中将包被在孔上，并且在溶液中添加不同量的54.6kDa EG9exendin-C-POEGMA和对照来竞争结合于抗PEG阳性血浆样品中的抗PEG抗体。从图5b中可以看出，在所有测试的竞争性抗原量下，与阳性对照相比，54.6kDa EG9exendin-C-POEGMA显示出显著降低的抗体结合。
实施例6
具有较短侧链长度的exendin-C-POEGMA
这些结果使我们假设EG9exendin-C-POEGMA结合物的PEG抗原性降低是由于结合的POEGMA的支化结构和短侧链长度两者引起的。由于可能需要最小长度的PEG用于抗体识别和结合，所以我们假设优化侧链OEG长度可以进一步降低或可能消除POEGMA结合物对抗PEG抗体的抗原性。为了检验这一假设，我们接下来使用具有精确的3个EG侧链重复单元的OEGMA单体合成了exendin-C-POEGMA结合物，如通过LC/ESI-MS所见(图8b)，因为文献中的证据表明，PEG的抗原决定簇可能是约6-7个EG重复单元。合成了Mn为26.3、55.6和71.6kDa的三种不同EG3exendin-C-POEGMA结合物(表1)。通过细胞内cAMP ELISA评定结合物效力(图13)显示，与EG9结合物类似，EG3POEGMA与exendin C末端的结合使EC50增加(表1)，表明结合物的受体活化减少，但具有不太显著的MW依赖性。
实施例7
EG3exendin-C-POEGMA结合物的抗原性和功效
我们接着测试了55.6kDa EG3exendin-C-POEGMA结合物对患者血浆样品中的抗PEG抗体的反应性。包括54.6kDa EG9结合物作为对照来证实测定法的可重复性。明显地，直接和竞争性抗PEG ELISA(图5c和图5d)都显示，将结合的POEGMA的侧链长度减少到3个EG重复单元完全消除了结合物对患者血浆样品中存在的抗PEG抗体的反应性。
由于POEGMA上的OEG侧链主要负责聚合物及其结合物的“隐形”行为，因此侧链长度的改变可影响POEGMA结合物的体内行为。所以，我们接着研究了EG3 exendin-C-POEGMA的体内功效。经由以25nmol/kg小鼠体重单次皮下注射向餐后小鼠施用55.6kDa和71.6kDaEG3 exendin-C-POEGMA结合物。从图6a和图6b中的注射后葡萄糖曲线(图14中未标准化的葡萄糖曲线和重量曲线)可以看出，与PBS对照相比，两种结合物都显著降低小鼠血液葡萄糖长达96h。与EG9对应物相比，EG3结合物似乎具有稍低的葡萄糖降低幅度和更平坦的葡萄糖曲线。
实施例8
exendin-C-POEGMA结合物的药代动力学
为了进一步证实exendin-C-POEGMA结合物的延长的循环并寻求EG9和EG3结合物的葡萄糖曲线之间差异的一些答案，用荧光标记的exendin、54.6kDa EG9、55.6kDa EG3和71.6kDa EG3结合物执行药代动力学研究。测试了两种MW的EG3结合物，因为EG3和EG9结合物在相同MW下具有不同的Rh。选择MW使得54.6kDa EG9结合物(Rh＝5.4±0.6nm)与55.6kDaEG3结合物具有相似的MW，并且与71.6kDa EG3结合物(Rh＝5.6±0.5nm)具有类似的Rh。使用表征药代动力学曲线的吸收和消除相的非房室拟合来分析血浆浓度-时间过程(图6c和图6d)，以近似计算表2中所示的参数。
表2.皮下注射的exendin和exendin-C-POEGMA结合物的药代动力学参数来自用图6c和图6d中的非房室拟合分析的数据。值以平均值±SEM的形式报告。t1/2a：吸收半衰期，t1/2el：消除半衰期，Cmax：最大血浆浓度，tmax：达到Cmax的时间。a来自曲线拟合。b根据曲线拟合从t＝0到∞计算。
t<sub>1/2a</sub>(h) t<sub>1/2el</sub>(h) C<sub>max</sub>(nM)<sup>a</sup> t<sub>max</sub>(nM)<sup>a</sup> AUC(h*nM)<sup>b</sup>
exendin 0.7±0.1 1.7±0.2 37.1±3.8 1.78±0.1 217.5±36.5
54.6kDa EG9 6.2±0.5 42.4±2.9 56.4±3.9 20.1±0.4 4,795.5±440.7
55.6kDa EG3 7.6±0.7 61.2±5.0 44.0±2.7 28.5±2.3 4,775.0±482.9
71.6kDa EG3 9.0±1.7 61.5±3.2 37.7±5.0 32.4±3.9 4,411.2±499.6
皮下注射之后，未修饰的exendin在循环中具有非常短的停留时间，具有快速吸收相(t1/2a＝0.7±0.1h)和短的终末消除相(t1/2el＝1.7±0.2h)。相比之下，所测试的exendin-C-POEGMA结合物使吸收时间增加约9-13倍，其中两种EG3结合物比EG9结合物花费更长时间来吸收进入循环。类似地，54.6kDa EG9结合物使exendin的消除相延长约25倍，而两种EG3结合物提供约36倍的更大增加。与未修饰的exendin相比，药代动力学的这些差异使结合物的AUC增加约20倍，表明POEGMA与exendin的C端结合显著增强了肽在循环中的累积暴露。尽管两种EG3结合物的Cmax明显低于EG9结合物的Cmax，与餐后血液葡萄糖研究中观察到的EG3结合物的葡萄糖降低幅度较低相一致(图6a和图6b)，但鉴于EG3结合物的吸收和消除半衰期较长，所测试的三种结合物的AUC是相当的。
实施例9
大分子引发剂表征
纯化的exendin-C-Br大分子引发剂通过基质辅助激光解吸电离质谱法(MALDI-MS)进行表征以证实引发剂连接(图15)。在5,132.55Da下检测到主峰，其与对应于与exendin连接的单个N-(2-(2-(2-(2-氨基乙酰氨基)乙酰氨基)乙酰氨基)乙基)-2-溴-2-甲基丙酰胺(AEBMP)引发剂分子的理论质量5,131.44Da非常一致。为了验证引发剂连接的位点特异性，将exendin-C-Br进行胰蛋白酶消化，并通过液相色谱/串联质谱法(LC-MS/MS)分析肽片段。仅检测到单溴化阳离子形式的C末端肽片段，并且其实验同位素分布(图16a)显示出与其理论分布几乎完美重叠(图16b)，证明单个引发剂分子仅连接于exendin的C末端。
实施例10
EG3exendin-C-POEGMA结合物的表征
通过改变原子转移自由基聚合(ATRP)反应时间合成了三种具有不同分子量(MW)的EG3exendin-C-POEGMA结合物。通过在280nm下的UV-vis吸光度(图17a)和折射率(RI，图17b)检测，从17.2、18.2和20.3min洗脱的尺寸排阻色谱(SEC)峰可明显看出结合物的不同MW。UV-vis色谱中峰面积的积分显示，结合物构成聚合产物的平均约65％。据推测，EG3结合物与其EG9对应物相比结合效率相对较低是由于EG3OEGMA单体的水溶性显著较低引起的，但这种产率仍远高于通常用常规聚乙二醇化获得的产率。通过单轮制备型SEC纯化结合物(图17c)。
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具体方面的前述描述如此充分地揭示出本发明的一般性质，使得在不脱离本公开的一般构思的情况下，其他人无需过度实验即可通过应用本领域技术范围内的知识，容易地修改和/或改变这些具体的方面来用于各种应用。因此，基于本文示出的教导和指导，这些改变和修改意欲落在所公开方面的等效物的含义和范围内。应理解，本文中的措辞或术语是为了描述而不是限制的目的，因此本说明书的术语或措辞由技术人员根据教导和指导来解释。
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出于所有目的，本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件以全文引用的方式并入，其程度就如同单独指出每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文件出于所有目的通过引用的方式并入一样。
出于完整性的原因，本发明的各个方面在以下编号的条款中列出：
条款1.一种降低分子的抗原性的方法，所述方法包含使至少一个支化聚合物与分子结合形成分子-聚合物结合物，其中所述分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合，其中所述支化聚合物包含主链和多个侧链，每个侧链共价连接于主链，其中所述主链包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、碳酸酯、磷酸酯、唑啉或其组合中的至少一种，并且其中所述分子-聚合物结合物与对照相比具有降低或消除的抗原性。
条款2.根据条款1所述的方法，其中所述分子与支化聚合物的主链结合。
条款3.根据条款1所述的方法，其中所述分子经由连接物与支化聚合物的主链结合。
条款4.根据条款1所述的方法，其中每个侧链具有第一末端和第二末端，其中第一末端共价连接于主链，并且其中第二末端独立地包含烷基、酯、胺、酰胺或羧基基团。
条款5.根据条款1所述的方法，其中每个侧链具有第一末端和第二末端，其中第一末端共价连接于主链，并且其中第二末端不包括羟基基团。
条款6.根据条款1所述的方法，其中每个侧链是线性聚合物。
条款7.根据前述条款任一项所述的方法，其中至少一个侧链包含1个单体。
条款8.根据条款1至6任一项所述的方法，其中每个侧链包含至少2个串联重复的单体。
条款9.根据条款1至6任一项所述的方法，其中每个侧链包含少于25个串联重复的单体。
条款10.根据条款1至6任一项所述的方法，其中每个侧链包含3至9个串联重复的单体。
条款11.根据条款1至6任一项所述的方法，其中每个侧链包含3个串联重复的单体。
条款12.根据前述条款任一项所述的方法，其中每个侧链的单体独立地选自甜菜碱、磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、肌氨酸、乙二醇或其组合。
条款13.根据条款12所述的方法，其中甜菜碱包含羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或其组合。
条款14.根据前述条款任一项所述的方法，其中至少一个侧链的单体包含乙二醇。
条款15.根据前述条款任一项所述的方法，其中每个侧链的单体包含乙二醇。
条款16.根据前述条款任一项所述的方法，其中超过一个支化聚合物与分子结合，每个支化聚合物结合于分子的不同位点。
条款17.根据前述条款任一项所述的方法，其中所述分子包含多肽，并且其中一个支化聚合物在选自多肽的C末端、N末端和内部氨基酸的位点处与多肽结合。
条款18.根据前述条款任一项所述的方法，其中所述分子包含多肽，并且其中超过一个支化聚合物与多肽结合，每个支化聚合物结合于多肽的选自C末端、N末端、内部氨基酸或其组合的不同位点。
条款19.根据条款1至18任一项所述的方法，其中所述分子包含含有分选酶A识别位点的多肽，并且其中将支化聚合物和多肽与分选酶A一起在使支化聚合物与多肽的分选酶识别位点结合的条件下温育。
条款20.根据条款1至18任一项所述的方法，其中所述分子包含含有分选酶A识别位点的多肽，并且其中结合包含：a)使分子与分选酶A和引发剂一起在允许引发剂连接于分选酶A识别位点的条件下接触以形成大分子引发剂；和b)将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物。
条款21.根据条款19或20所述的方法，其中分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQ IDNO：1)，其中X是任何氨基酸。
条款22.根据条款20或21所述的方法，其中在步骤(b)中将大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。
条款23.根据条款20至22任一项所述的方法，其中步骤(b)中的单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。
条款24.根据条款19至23任一项所述的方法，所述方法还包含将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离。
条款25.根据条款1至18任一项所述的方法，其中合成支化聚合物并随后将所述支化聚合物接枝到分子上以形成分子-聚合物结合物。
条款26.根据条款1至18任一项所述的方法，其中结合包含使引发剂连接于分子以形成大分子引发剂；以及将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物。
条款27.根据条款25或26所述的方法，其中使用自由基聚合来合成支化聚合物。
条款28.根据条款25或26所述的方法，其中使用至少一种选自离子开环聚合(离子ROP)、开环易位聚合、离子聚合、缩聚和配位聚合的方法来合成支化聚合物。
条款29.一种从包含具有分选酶A识别位点的多肽的分子制备与对照相比具有降低或消除的抗原性的分子-聚合物结合物的方法，所述方法包含a)使分子与分选酶A和引发剂一起在允许引发剂连接于分选酶A识别位点的条件下接触以形成大分子引发剂；和b)将大分子引发剂与单体一起在允许从引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成分子-聚合物结合物，其中支化聚合物包含主链和多个侧链，每个侧链共价连接于主链。
条款30.根据条款29所述的方法，其中分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸。
条款31.根据条款29或30所述的方法，其中在步骤(b)中将大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。
条款32.根据条款29至31任一项所述的方法，其中步骤(b)中的单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。
条款33.根据条款29至32任一项所述的方法，所述方法还包含将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离，其中分子-聚合物结合物的产率为分离的总结合物和大分子引发剂的至少约50％。
条款34.根据条款33或24所述的方法，其中分子-聚合物结合物通过色谱法分离。
条款35.根据条款34所述的方法，其中色谱法包含尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法或疏水相互作用色谱法或其组合。
条款36.根据条款35所述的方法，其中色谱法包含尺寸排阻色谱法。
条款37.根据条款20至24、27和29至36任一项所述的方法，其中自由基聚合包含以下中的至少一种：原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)、自由基开环聚合(自由基ROP)、氮氧基介导的自由基聚合(NMP)、iniferter聚合、自由基聚合、钴介导的自由基聚合、碲介导的聚合和锑介导的聚合。
条款38.根据条款29至37任一项所述的方法，其中分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合。
条款39.一种与对照相比具有降低或消除的抗原性的分子-聚合物结合物，所述分子-聚合物结合物包含：包含主链和多个侧链的支化聚合物，每个侧链共价连接于主链；和与支化聚合物的主链结合的分子，其中分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合，其中每个侧链是线性聚合物，其中主链包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、碳酸酯、磷酸酯、唑啉或其组合中的至少一种。
条款40.根据条款39所述的结合物，其中分子经由连接物与支化聚合物的主链结合。
条款41.根据条款39至40任一项所述的结合物，其中每个侧链具有第一末端和第二末端，其中第一末端共价连接于主链，并且其中第二末端独立地包含烷基、酯、胺、酰胺或羧基基团。
条款42.根据条款39至41任一项所述的结合物，其中每个侧链具有第一末端和第二末端，其中第一末端共价连接于主链，并且其中第二末端不包括羟基基团。
条款43.根据条款39至42任一项所述的结合物，其中至少一个侧链包含1个单体。
条款44.根据条款39至42任一项所述的结合物，其中每个侧链包含至少2个串联重复的单体。
条款45.根据条款39至42任一项所述的结合物，其中每个侧链包含少于25个串联重复的单体。
条款46.根据条款39至42任一项所述的结合物，其中每个侧链包含3至9个串联重复的单体。
条款47.根据条款39至42任一项所述的结合物，其中每个侧链包含3个串联重复的单体。
条款48.根据条款39至47任一项所述的结合物，其中每个侧链的单体独立地选自甜菜碱、磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、肌氨酸、乙二醇或其组合。
条款49.根据条款48所述的结合物，其中甜菜碱包含羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或其组合。
条款50.根据条款39至49任一项所述的结合物，其中至少一个侧链的单体包含乙二醇。
条款51.根据条款39至49任一项所述的结合物，其中每个侧链的单体包含乙二醇。
条款52.根据条款39至51任一项所述的结合物，其中超过一个支化聚合物与分子结合，每个支化聚合物结合于分子的不同位点。
条款53.根据条款39至51任一项所述的结合物，其中所述分子包含多肽，并且其中一个支化聚合物在选自多肽的C末端、N末端和内部氨基酸的位点处与多肽结合。
条款54.根据条款39至51任一项所述的结合物，其中所述分子包含多肽，并且其中超过一个支化聚合物与多肽结合，每个支化聚合物结合于多肽的选自C末端、N末端、内部氨基酸或其组合的不同位点。
条款55.根据条款1至54任一项所述的方法或结合物，其中支化聚合物包含聚[低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯](POEGMA)，并且其中POEGMA包含：包含聚(甲基丙烯酸甲酯)的主链；和共价连接于主链的多个侧链，每个侧链包含至少1个串联重复的乙二醇(EG)单体。
条款56.根据条款55所述的方法或结合物，其中至少一个侧链包含1个乙二醇(EG)单体。
条款57.根据条款55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含至少2个串联重复的乙二醇(EG)单体。
条款58.根据条款55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含至少10个串联重复的乙二醇(EG)单体。
条款59.根据条款55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含少于25个串联重复的乙二醇(EG)单体。
条款60.根据条款55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含3个串联重复的乙二醇(EG)单体。
条款61.根据条款55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含3至9个串联重复的乙二醇(EG)单体。
条款62.根据条款55至61任一项所述的方法或结合物，其中所述分子-POEGMA结合物不与受试者中预先存在的抗PEG抗体反应。
条款63.根据前述条款任一项所述的方法或结合物，其中分子包含一种或多种选自以下的肽或蛋白质治疗剂：单克隆抗体、血液因子、β萎缩素、exendin、酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶(ADA)、ADA-2、核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、生长因子、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、纤维母细胞生长因子(FGF)、生长抑素、促生长素、生长素、人蛋氨生长素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子(CSF)、凝血因子、肿瘤坏死因子(TNF)、胃肠肽、血管活性肠肽(VIP)、胆囊收缩素(CCK)、胃泌素、胰泌素、促红细胞生成素、生长激素、GRF、血管加压素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺素释放激素(TRH)、甲状腺刺激激素、黄体化激素、黄体化激素释放激素(LHRH)、生长激素释放激素(GHRH)、组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素、白细胞介素-1、白细胞介素-15、白细胞介素-2、白细胞介素-10、集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、艾塞那肽、GLP-1R多激动剂、GLP-1R拮抗剂、GLP-2、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、瘦素、饥饿素、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素、干扰素-α、干扰素-γ、人生长激素(hGH)和拮抗剂、巨噬细胞活化剂、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、松弛素、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体、活化素受体2A细胞外结构域、α-2巨球蛋白、α-黑素细胞、爱帕琳肽、缓激肽B2受体拮抗剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、弹力素、因子IX、因子VIIa、因子VIII、铁调素、infestin-4、激肽释放酶抑制剂、L4F肽、催泪蛋白、甲状旁腺激素(PTH)、肽YY(PYY)、硫氧还蛋白、胸腺素B4、尿酸氧化酶、尿舒张肽、适体、沉默RNA、微RNA、长非编码RNA、核酶、其类似物和衍生物以及其组合。
条款64.根据前述条款任一项所述的方法或结合物，其中分子包含多肽，并且其中多肽包含His标签、刺激响应性多肽或其组合。
条款65.根据条款64所述的方法或结合物，其中刺激响应性多肽选自弹性蛋白样多肽、包含重复基序的多肽和节肢弹性蛋白样多肽。
条款66.根据前述条款任一项所述的方法或结合物，其中分子-聚合物结合物具有以下性质：体内半衰期比分子自身的体内半衰期长至少25％；或对组织、器官或疾病位点的体内生物分布比分子自身的体内生物分布多至少25％；或与对照相比，与抗PEG抗体的结合降低；或与对照相比，免疫反应降低；或其组合。
条款67.根据条款66所述的方法或结合物，其中分子-聚合物结合物的体内半衰期比分子自身的体内半衰期长至少80％。
条款68.根据条款1至67任一项所述的方法或结合物，其中对照包含与非支化聚合物结合的分子。
条款69.根据条款1至67任一项所述的方法或结合物，其中对照包含分子自身。
条款70.根据条款1至67任一项所述的方法或结合物，其中对照包含与线性聚合物结合的分子。
条款71.根据条款1至67任一项所述的方法或结合物，其中对照包含与非支化PEG结合的分子。
条款72.根据前述条款任一项所述的方法或结合物，其中所述分子包含多肽，并且其中多肽的至少约20％仅在C末端具有结合的支化聚合物。
条款73.根据条款72所述的方法或结合物，其中多肽的至少约75％仅在C末端具有结合的支化聚合物。
条款74.根据条款72所述的方法或结合物，其中多肽的至少约90％仅在C末端具有结合的支化聚合物。
条款75.根据前述条款任一项所述的方法或结合物，其中分子-聚合物结合物的产率为至少约75％。
条款76.根据前述条款任一项所述的方法或结合物，其中分子-聚合物结合物的产率为至少约85％。
序列
SEQ ID NO：1
分选酶A识别位点，多肽
LPXTG(其中X是任何氨基酸)
SEQ ID NO：2
分选酶A识别位点，多肽
LPETG
SEQ ID NO：3
分选酶A识别位点，多肽
LPXZG，其中X和Z独立地为任何氨基酸
SEQ ID NO：4
连接物，多肽
(GGC)
SEQ ID NO：5
连接物，多肽
(GGC)8
SEQ ID NO：6
连接物，多肽
(G4S)3
SEQ ID NO：7
连接物，多肽
(VPGXG)16，其中X是以1:1的比率存在的缬氨酸或半胱氨酸。
SEQ ID NO：8
“AEBMP”，多肽
NGGPSSGAPPPSLPET

Claims (76)

1.一种降低分子的抗原性的方法，所述方法包含使至少一个支化聚合物与分子结合形成分子-聚合物结合物，
其中所述分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合，
其中所述支化聚合物包含主链和多个侧链，每个侧链共价连接于所述主链，
其中所述主链包含以下中的至少一种：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、碳酸酯、磷酸酯、唑啉或其组合，并且
其中所述分子-聚合物结合物与对照相比具有降低或消除的抗原性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子与所述支化聚合物的主链结合。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子经由连接物与所述支化聚合物的主链结合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中每个侧链具有第一末端和第二末端，其中所述第一末端共价连接于所述主链，并且其中所述第二末端独立地包含烷基、酯、胺、酰胺或羧基基团。
5.根据权利要求1所述的方法，其中每个侧链具有第一末端和第二末端，其中所述第一末端共价连接于所述主链，并且其中所述第二末端不包括羟基基团。
6.根据权利要求1所述的方法，其中每个侧链是线性聚合物。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中至少一个侧链包含1个单体。
8.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中每个侧链包含至少2个串联重复的单体。
9.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中每个侧链包含少于25个串联重复的单体。
10.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中每个侧链包含3至9个串联重复的单体。
11.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中每个侧链包含3个串联重复的单体。
12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中每个侧链的单体独立地选自甜菜碱、磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、肌氨酸、乙二醇或其组合。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述甜菜碱包含羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或其组合。
14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中至少一个侧链的单体包含乙二醇。
15.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中每个侧链的单体包含乙二醇。
16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中超过一个支化聚合物与所述分子结合，每个支化聚合物结合于所述分子的不同位点。
17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述分子包含多肽，并且其中一个支化聚合物在选自所述多肽的C末端、N末端和内部氨基酸的位点处与所述多肽结合。
18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述分子包含多肽，并且其中超过一个支化聚合物与所述多肽结合，每个支化聚合物结合于所述多肽的选自C末端、N末端、内部氨基酸或其组合的不同位点。
19.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述分子包含含有分选酶A识别位点的多肽，并且其中将所述支化聚合物和所述多肽与分选酶A一起在使所述支化聚合物与所述多肽的分选酶识别位点结合的条件下温育。
20.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述分子包含含有分选酶A识别位点的多肽，并且其中所述结合包含：
a)使所述分子与分选酶A和引发剂一起在允许所述引发剂与所述分选酶A识别位点连接的条件下接触以形成大分子引发剂；和
b)将所述大分子引发剂与单体一起在允许从所述引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成所述分子-聚合物结合物。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQ IDNO：1)，其中X是任何氨基酸。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中在步骤(b)中将所述大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。
23.根据权利要求20至22任一项所述的方法，其中步骤(b)中的单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。
24.根据权利要求19至23任一项所述的方法，所述方法还包含将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离。
25.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中合成所述支化聚合物并随后将所述支化聚合物接枝到所述分子上以形成所述分子-聚合物结合物。
26.根据权利要求1至18任一项所述的方法，其中所述结合包含使引发剂连接于所述分子以形成大分子引发剂；以及将所述大分子引发剂与单体一起在允许从所述引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成所述分子-聚合物结合物。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中使用自由基聚合来合成所述支化聚合物。
28.根据权利要求25或26所述的方法，其中使用至少一种选自离子开环聚合(离子ROP)、开环易位聚合、离子聚合、缩聚和配位聚合的方法来合成所述支化聚合物。
29.一种从包含具有分选酶A识别位点的多肽的分子制备与对照相比具有降低或消除的抗原性的分子-聚合物结合物的方法，所述方法包含：
a)使所述分子与分选酶A和引发剂一起在允许所述引发剂与所述分选酶A识别位点连接的条件下接触以形成大分子引发剂；和
b)将所述大分子引发剂与单体一起在允许从所述引发剂发生自由基聚合和支化聚合物形成的条件下温育以形成所述分子-聚合物结合物，其中所述支化聚合物包含主链和多个侧链，每个侧链共价连接于所述主链。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述分选酶A识别位点包含LPXTG(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中在步骤(b)中将所述大分子引发剂和单体与催化剂一起温育。
32.根据权利要求29至31任一项所述的方法，其中步骤(b)中的单体包含丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺中的至少一种。
33.根据权利要求29至32任一项所述的方法，所述方法还包含将步骤(b)中形成的分子-聚合物结合物与未反应的大分子引发剂分离，其中分子-聚合物结合物的产率为分离的总结合物和大分子引发剂的至少约50％。
34.根据权利要求33或24所述的方法，其中所述分子-聚合物结合物通过色谱法分离。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述色谱法包含尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法或疏水相互作用色谱法或其组合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述色谱法包含尺寸排阻色谱法。
37.根据权利要求20至24、27和29至36任一项所述的方法，其中所述自由基聚合包含以下中的至少一种：原子转移自由基聚合(ATRP)、可逆加成-断裂链转移(RAFT)、自由基开环聚合(自由基ROP)、氮氧基介导的自由基聚合(NMP)、iniferter聚合、自由基聚合、钴介导的自由基聚合、碲介导的聚合和锑介导的聚合。
38.根据权利要求29至37任一项所述的方法，其中所述分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合。
39.一种与对照相比具有降低或消除的抗原性的分子-聚合物结合物，所述分子-聚合物结合物包含：
包含主链和多个侧链的支化聚合物，每个侧链共价连接于所述主链；和
与所述支化聚合物的主链结合的分子，其中所述分子包含多肽、多核苷酸、小分子或其组合，
其中每个侧链是线性聚合物，
其中所述主链包含以下中的至少一种：丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、碳酸酯、磷酸酯、唑啉或其组合。
40.根据权利要求39所述的结合物，其中所述分子经由连接物与所述支化聚合物的主链结合。
41.根据权利要求39至40任一项所述的结合物，其中每个侧链具有第一末端和第二末端，其中所述第一末端共价连接于所述主链，并且其中所述第二末端独立地包含烷基、酯、胺、酰胺或羧基基团。
42.根据权利要求39至41任一项所述的结合物，其中每个侧链具有第一末端和第二末端，其中所述第一末端共价连接于所述主链，并且其中所述第二末端不包括羟基基团。
43.根据权利要求39至42任一项所述的结合物，其中至少一个侧链包含1个单体。
44.根据权利要求39至42任一项所述的结合物，其中每个侧链包含至少2个串联重复的单体。
45.根据权利要求39至42任一项所述的结合物，其中每个侧链包含少于25个串联重复的单体。
46.根据权利要求39至42任一项所述的结合物，其中每个侧链包含3至9个串联重复的单体。
47.根据权利要求39至42任一项所述的结合物，其中每个侧链包含3个串联重复的单体。
48.根据权利要求39至47任一项所述的结合物，其中每个侧链的单体独立地选自甜菜碱、磷酸胆碱、磷酸乙醇胺、肌氨酸、乙二醇或其组合。
49.根据权利要求48所述的结合物，其中所述甜菜碱包含羧基甜菜碱、磺基甜菜碱或其组合。
50.根据权利要求39至49任一项所述的结合物，其中至少一个侧链的单体包含乙二醇。
51.根据权利要求39至49任一项所述的结合物，其中每个侧链的单体包含乙二醇。
52.根据权利要求39至51任一项所述的结合物，其中超过一个支化聚合物与所述分子结合，每个支化聚合物结合于所述分子的不同位点。
53.根据权利要求39至51任一项所述的结合物，其中所述分子包含多肽，并且其中一个支化聚合物在选自所述多肽的C末端、N末端和内部氨基酸的位点处与所述多肽结合。
54.根据权利要求39至51任一项所述的结合物，其中所述分子包含多肽，并且其中超过一个支化聚合物与所述多肽结合，每个支化聚合物结合于所述多肽的选自C末端、N末端、内部氨基酸或其组合的不同位点。
55.根据权利要求1至54任一项所述的方法或结合物，其中所述支化聚合物包含聚[低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯](POEGMA)，并且其中所述POEGMA包含：
包含聚(甲基丙烯酸甲酯)的主链；和
共价连接于所述主链的多个侧链，每个侧链包含至少1个串联重复的乙二醇(EG)单体。
56.根据权利要求55所述的方法或结合物，其中至少一个侧链包含1个乙二醇(EG)单体。
57.根据权利要求55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含至少2个串联重复的乙二醇(EG)单体。
58.根据权利要求55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含至少10个串联重复的乙二醇(EG)单体。
59.根据权利要求55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含少于25个串联重复的乙二醇(EG)单体。
60.根据权利要求55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含3个串联重复的乙二醇(EG)单体。
61.根据权利要求55所述的方法或结合物，其中每个侧链包含3至9个串联重复的乙二醇(EG)单体。
62.根据权利要求55至61任一项所述的方法或结合物，其中所述分子-POEGMA结合物不与受试者中预先存在的抗PEG抗体反应。
63.根据前述权利要求任一项所述的方法或结合物，其中所述分子包含一种或多种选自以下的肽或蛋白质治疗剂：单克隆抗体、血液因子、β萎缩素、exendin、酶、天冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、精氨酸酶、精氨酸脱氨酶、腺苷脱氨酶(ADA)、ADA-2、核糖核酸酶、胞嘧啶脱氨酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、生长因子、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、纤维母细胞生长因子(FGF)、生长抑素、促生长素、生长素、人蛋氨生长素、降钙素、甲状旁腺激素、集落刺激因子(CSF)、凝血因子、肿瘤坏死因子(TNF)、胃肠肽、血管活性肠肽(VIP)、胆囊收缩素(CCK)、胃泌素、胰泌素、促红细胞生成素、生长激素、GRF、血管加压素、奥曲肽、胰腺酶、超氧化物歧化酶、促甲状腺素释放激素(TRH)、甲状腺刺激激素、黄体化激素、黄体化激素释放激素(LHRH)、生长激素释放激素(GHRH)、组织纤溶酶原活化剂、白细胞介素、白细胞介素-1、白细胞介素-15、白细胞介素-2、白细胞介素-10、集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、艾塞那肽、GLP-1R多激动剂、GLP-1R拮抗剂、GLP-2、TNF相关的凋亡诱导配体(TRAIL)、瘦素、饥饿素、粒细胞单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素、干扰素-α、干扰素-γ、人生长激素(hGH)和拮抗剂、巨噬细胞活化剂、绒毛膜促性腺激素、肝素、心房利钠肽、血红蛋白、松弛素、环孢菌素、催产素、疫苗、单克隆抗体、单链抗体、锚蛋白重复蛋白、亲和体、活化素受体2A细胞外结构域、α-2巨球蛋白、α-黑素细胞、爱帕琳肽、缓激肽B2受体拮抗剂、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白(CTLA-4)、弹力素、因子IX、因子VIIa、因子VIII、铁调素、infestin-4、激肽释放酶抑制剂、L4F肽、催泪蛋白、甲状旁腺激素(PTH)、肽YY(PYY)、硫氧还蛋白、胸腺素B4、尿酸氧化酶、尿舒张肽、适体、沉默RNA、微RNA、长非编码RNA、核酶、其类似物和衍生物以及其组合。
64.根据前述权利要求任一项所述的方法或结合物，其中所述分子包含多肽，并且其中所述多肽包含His标签、刺激响应性多肽或其组合。
65.根据权利要求64所述的方法或结合物，其中所述刺激响应性多肽选自弹性蛋白样多肽、包含重复基序的多肽和节肢弹性蛋白样多肽。
66.根据前述权利要求任一项所述的方法或结合物，其中所述分子-聚合物结合物具有以下性质：
体内半衰期比所述分子自身的体内半衰期长至少25％；或
对组织、器官或疾病位点的体内生物分布比所述分子自身的体内生物分布多至少25％；或
与对照相比，与抗PEG抗体的结合降低；或
与对照相比，免疫反应降低；或
其组合。
67.根据权利要求66所述的方法或结合物，其中所述分子-聚合物结合物的体内半衰期比所述分子自身的体内半衰期长至少80％。
68.根据权利要求1至67任一项所述的方法或结合物，其中所述对照包含与非支化聚合物结合的分子。
69.根据权利要求1至67任一项所述的方法或结合物，其中所述对照包含所述分子自身。
70.根据权利要求1至67任一项所述的方法或结合物，其中所述对照包含与线性聚合物结合的分子。
71.根据权利要求1至67任一项所述的方法或结合物，其中所述对照包含与非支化PEG结合的分子。
72.根据前述权利要求任一项所述的方法或结合物，其中所述分子包含多肽，并且其中所述多肽的至少约20％仅在C末端具有结合的支化聚合物。
73.根据权利要求72所述的方法或结合物，其中所述多肽的至少约75％仅在C末端具有结合的支化聚合物。
74.根据权利要求72所述的方法或结合物，其中所述多肽的至少约90％仅在C末端具有结合的支化聚合物。
75.根据前述权利要求任一项所述的方法或结合物，其中分子-聚合物结合物的产率为至少约75％。
76.根据前述权利要求任一项所述的方法或结合物，其中分子-聚合物结合物的产率为至少约85％。
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