CN106536548A - Dr3变体及其用途 - Google Patents

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CN106536548A CN201580026317.5A CN201580026317A CN106536548A CN 106536548 A CN106536548 A CN 106536548A CN 201580026317 A CN201580026317 A CN 201580026317A CN 106536548 A CN106536548 A CN 106536548A
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Abstract

本发明提供了具有与TL1A增加的结合亲和力的死亡结构域受体3(DR3)变体以及包含其的组合物。此外,本发明提供了所述肽或组合物的使用方法,包括但不限于自身免疫疾病和/或炎性疾病的治疗。

Description

DR3变体及其用途
技术领域
本发明尤其涉及来源于在减少干扰素(IFN)-γ分泌中有效的死亡结构域受体3(DR3)的肽,及其使用方法,包括但不限于自身免疫疾病和/或炎性疾病的治疗。
背景技术
哺乳动物免疫系统是通过信号调节的复杂细胞网络,所述信号通过许多分泌蛋白质和受体蛋白质传递。人肿瘤坏死因子(TNF)超家族包括至少19个成员,并且代表主要类别的刺激蛋白质。TNF-样1A(TL1A)是新近描述的TNF超家族的成员,其显示涉及一系列自身免疫炎性疾病,包括炎性肠病(IBD)、类风湿性关节炎(RA)和哮喘。TL1A是目前唯一已知的死亡结构域受体3(DR3)的配体,其占优势地由活化T细胞和内皮细胞表达。TL1A与DR3的结合很可能通过NF-κB相关途径的活化来触发增殖信号。显示TL1A通过与白细胞介素(IL)-12和IL-18协同作用来增加干扰素(IFN)-γ生产,并且因此可使免疫应答偏向1型T辅助细胞(TH1)样应答。首先显示TL1A由内皮细胞表达,并且它在这些细胞中的表达通过用TNF-α或IL-16处理得到显著增强。后续研究已显示TL1A也在尤其是来自患有炎性肠病(IBD)的患者的肠组织中的淋巴细胞浆细胞和单核细胞中表达。
DR3,TL1A的受体,由CD4+T细胞和天然杀伤细胞表达,并且它的表达在T细胞活化后增加。尽管DR3具有可导致细胞凋亡的细胞内死亡结构域,但功能数据提示DR3的活性主要是促炎。有趣的是,TL1A的另一种天然受体是诱饵受体3(DcR3),编码可以高亲和力结合TL1A的可溶性蛋白质。这种可溶性受体显示出广泛特异性,并且可结合其他TNF配体包括FasL和LIGHT。因此,由于三种TNF配体的多样化功能,难以限定DcR3对宿主免疫的贡献。
使用克罗恩氏病(CD)的两种不同动物模型,显示肠道炎症的诱导与发炎粘膜中TL1A和DR3的显著上调有关。使用DR3缺陷小鼠的后续研究显示DR3表达是关于T细胞的免疫病理学所需的,包括实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和过敏性肺炎症疾病模型中的局部T细胞累积和细胞因子生产。免疫病理学和临床疾病在肺炎症和EAE的小鼠模型两者中的DR3缺陷小鼠中急剧减少。另外,显示TL1A基因中的遗传变异促成日本和欧洲人口中对IBD的敏感性。最后,使用RA的实验模型的几项研究已显示TL1A-DR3相互作用对于该疾病的发病机理是关键的。
TL1A途径在介导炎症和自身免疫病症中的作用致使它成为有吸引力的干预靶。TL1A与其内源DR3受体结合的阻断可导致下游信号传导效应的取消,并且因此预防各种炎性病症。
存在治疗或改善炎性疾病或自身免疫疾病的更有效手段的长期需要。能够抑制TL1A诱导的IFN-γ分泌的试剂的开发因此是期望的。
发明内容
本发明在其一些实施例中提供了死亡结构域受体3(DR3)变体以及包含其的药物组合物。在一些实施例中,本发明的变体和组合物在减少TL1A诱导的IFN-γ分泌中是有效的。在一些实施例中,本发明的DR3变体可用于治疗或改善自身免疫疾病或病症和/或炎性疾病或病症。
本发明部分基于下述出乎意料的发现:如本文公开的包含位点特异性氨基酸修饰(例如置换)的DR3变体具有增加的对TL1A的结合亲和力。像这样,示例性肽显示出相对于野生型(WT)DR3 5倍增加的TL1A结合亲和力。令人惊讶的是,DR3变体在抑制TL1A诱导的IFN-γ分泌中高度有效。
根据一个方面,本发明提供了包含SEQ ID NO:13(GGTRSPRCDCAGDFHKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLVCPQDTFLAWENHHNSECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCKPGWFVECQVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF)的氨基酸的氨基酸分子或者其类似物或片段,其中所述氨基酸分子包含在选自下述的位置处的至少一个氨基酸置换:H15、I18、E38、V47、D51、W56、N61、A65、K93、Q101、Q104和L129。
在一个实施例中,氨基酸分子包含SEQ ID NO:1的氨基酸:GGTRSPRCDCAGDFX1KKX2GLFCCRGCPAGHYLKAPCTX3PCGNSTCLX4CPQX5TFLAX6ENHHX7SECX8RCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCX9PGWFVECX10VSX11CVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLX12CSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF;其中:X1是H或Q;X2是I、T或Y;X3是E或K;X4是V或P;X5是D或G;X6是W或R;X7是N或E;X8是A或T;X9是K、E或A;X10是Q或S;X11是Q或P;并且X12是L或P。
根据一些实施例,氨基酸分子包含选自SEQ ID NO:2-9的氨基酸序列。根据另一个实施例,氨基酸分子包含SEQ ID NO:2的氨基酸。根据另一个实施例,氨基酸分子包含SEQID NO:3的氨基酸。根据另一个实施例,氨基酸分子包含SEQ ID NO:4的氨基酸。根据另一个实施例,氨基酸分子包含SEQ ID NO:5的氨基酸。根据另一个实施例,氨基酸分子包含SEQID NO:6的氨基酸。根据另一个实施例,氨基酸分子包含SEQ ID NO:7的氨基酸。根据另一个实施例,氨基酸分子包含SEQ ID NO:8的氨基酸。根据另一个实施例,氨基酸分子包含SEQID NO:9的氨基酸。
根据另一个实施例,氨基酸分子还包含抗体的可结晶片段(Fc)区的肽。根据另一个实施例,抗体的可结晶片段(Fc)区的所述肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
根据另一个实施例,氨基酸分子还包括包含SEQ ID NO:11(IEGRMDRS)的氨基酸序列的接头,其中所述接头融合至SEQ ID NO:1的所述氨基酸的羧基末端以及抗体的Fc区的所述肽的氨基末端。
根据另一个方面,本发明提供了包含本发明的氨基酸分子和运载体的组合物。
根据另一个方面,本发明提供了多核苷酸分子,所述多核苷酸分子包含编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸分子的编码部分。根据另一个方面,本发明提供了包含多核苷酸分子的表达载体,所述多核苷酸分子包括编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸分子的编码部分。在另一个实施例中,本发明提供了包含多核苷酸分子的表达载体,所述多核苷酸分子包含如SEQID NO:12中所示的核酸序列。根据另一个方面,本发明提供了包含本发明的表达载体的细胞。
根据另一个方面,本发明提供了包含本发明的表达载体和运载体的组合物。
根据另一个方面,本发明提供了用于减少或抑制有此需要的受试者中的炎症、免疫应答或两者的方法,所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的氨基酸分子或包含所述氨基酸分子的组合物的步骤,由此抑制所述受试者中的炎症、免疫应答或两者。
根据另一个实施例,所述减少或抑制炎症、免疫应答或两者是减少或抑制所述受试者中TL1A诱导的IFN-γ分泌。根据另一个实施例,所述受试者患有炎性肠病。根据另一个实施例,所述受试者患有牛皮癣。根据另一个实施例,所述受试者患有自身免疫疾病。根据另一个实施例,所述受试者患有哮喘。根据另一个实施例,所述受试者患有关节炎。
本发明的更多实施例和可应用性的完全范围由于下文给出的详述将变得显而易见。然而,应当理解详述和具体例子虽然指出了本发明的优选实施例,但仅给出作为例子,因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修饰根据该详述对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
图1.用于生成具有改善的TL1A亲和力、稳定性和生物活性的DR3突变体的定向进化过程的图解,包括:(A)文库生成,(B)筛选,和(C)表征。
图2A-B.(A)哺乳动物DR3蛋白质的比对鉴定来源于家族共有区的残基。突出显示的是人DR3中来源于家族共有区的V44、D48和W53。(B)用于获得DR3基因中的回复共有突变的寡核苷酸掺料过程。
图3A-B.使用酵母表面展示(YSD)筛选改善的DR3突变体。(A)DR3的YSD;DR3在酵母的表面上作为Aga2融合物进行展示。表达和TL1A结合分别通过荧光抗体和链霉抗生物素蛋白进行检测。(B)在关于与TL1A结合的两轮(R2)和三轮(R3)富集后,展示WT DR3、DR3突变体文库的细胞群的流式细胞术直方图分析。缺乏表面展示的细胞群以黑色显示。细胞的分析在与0.2μM TL1A一起温育后执行。
图4.在HEK293T细胞中的DR3表达的最佳化。在蛋白G富集之前和蛋白G富集之后,使用SDS PAGE分析含有不同引导肽(SP1-5)的分泌DR3的水平。大多数条件显示DR3表达的高得率。
图5A-B.用于检测DR3-TL1A相互作用的ELISA实验。(A)关于DR3结合TL1A的ELISA的示意图。ELISA板用抗TL1A抗体进行涂布,并且随后用TL1A进行涂布。随后将不同的DR3变体加入板中,并且使用作为一抗的特异性生物素化的抗DR3抗体和链霉抗生物素蛋白-HRP检测与TL1A的结合。(B)DR3校准曲线。以五个不同浓度的商购可得的WT DR3用于TL1A结合ELISA测定中。
图6.用于鉴定具有改善的结合亲和力或稳定性的候选突变体的代表性DR3突变体筛选。筛选在HEK293T细胞中的DR3突变体转染和表达后执行。含有DR3变体的培养基直接应用于含有固定的TL1A的ELISA板,以检测TL1A-DR3相互作用的水平。具有如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的变体以大规模进行表达,并且纯化用于后续分析(表2),而突变体C10含有截短且从进一步分析中弃去。
图7A-D.温度对变体活性的作用。(A)在37℃下的结合活性温育。将3ug/ml具有SEQID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的DR3突变体溶解于PBS,2mM DTT中,在37℃下温育所示时间,并且以最大速度离心5分钟。随后如材料与方法中所述,100ul上清液用于ELISA测定。在37℃下温育所示时间的变体的结合作为在T=0时温育的每种变体的结合的部分(fraction)进行标绘。(B)3ug/ml DR3 W.T以及具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5的氨基酸序列的突变体在所示温度下温育15分钟,并且以最大速度离心5分钟。随后,如上所述,100ul上清液用于ELISA测定。在所示温度下温育的变体的结合作为在T=0时温育的每种变体的结合的部分进行标绘。(C)在25℃下的结合活性温育。3ug/ml具有SEQ ID NO:2和SEQID NO:5的氨基酸序列的DR3突变体溶解于PBS中,1mM DTT在25℃下温育所示时间,并且随后以最大速度离心5分钟。随后,如上所述,100ul上清液用于ELISA测定。在25℃下温育所示时间的变体的结合作为在T=0时温育的每种变体的结合的部分进行标绘。(D)在4℃、37℃、47℃下温育35分钟后的结合活性。3ug/ml DR3和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的突变体溶解于PBS中,1mM DTT在所示温度下温育~35分钟,并且以最大速度离心5分钟。随后,如上所述,100ul上清液用于ELISA测定。在37℃和47℃下温育的变体的结合作为在4℃下温育的每种变体的结合的部分进行计算。
图8.TL1a增强来自CD4细胞的IL-12/IL-18依赖性IFN-γ分泌。人CD4+细胞与100ng/ml TL1A、2ng/ml IL-12和50ng/ml IL-18一起温育24小时。通过ELISA就IFN-γ检测分析1∶10稀释的细胞上清液。
图9A-B.本发明的变体对TL1A诱导的人CD4+中的IFN-γ分泌的作用。CD4+细胞与100ng/ml TL1A、2ng/ml IL-12和50ng/ml IL-18以及不同浓度的(A)可溶性DR3WT(矩形)、具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的变体(三角形)和具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的变体(圆形);或(B)具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的变体一起温育24小时。通过ELISA就IFN检测分析1∶10稀释的细胞上清液。数据代表每次实验的两个独立重复的平均值。
具体实施方式
本发明在一些实施例中提供了包含死亡结构域受体3(DR3)的变体的多肽,特别是包含至少一个位点特异性氨基酸修饰(例如置换)的多肽,以及包含多肽的药物组合物。在一些实施例中,本发明的肽在预防、治疗或改善自身免疫疾病和/或炎性疾病中有效。
如本文下文例示的,可溶性DR3变体以高亲和力结合TL1A,由此阻止配体与内源受体结合。不希望受任何作用机制束缚,由于DR3细胞外配体结合结构域的小分子量及其TL1A结合表面的完美识别,可溶性DR3受体的使用是有利的。在另外的实施例中,具有增加的稳定性和与TL1A的亲和力的DR3变体增加DR3变体与内源DR3受体竞争的能力,导致在施用后增加的生物活性和血清半衰期。
根据一些实施例,本发明提供了用于减少或抑制有此需要的受试者中的炎症、免疫应答或两者的方法,所述方法包括给所述受试者施用包含有效量的本发明的氨基酸分子的组合物的步骤,由此减少或抑制所述受试者中的炎症、免疫应答或两者。在其他实施例中,本发明的方法可用于治疗T细胞介导的疾病,特别是Th1细胞介导的的疾病。
根据另一个实施例,所述炎性疾病包括但不限于炎性疾病或过敏性疾病如哮喘,超敏性肺疾病,超敏性肺炎,迟发型超敏反应,间质性肺病(ILD)(例如特发性肺纤维化或者与类风湿性关节炎或其他炎性疾病相关的ILD);硬皮病;牛皮癣(包括T-细胞介导的牛皮癣);皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎),虹膜炎,结膜炎,角膜结膜炎,皮肤红斑狼疮,硬皮病,阴道炎,直肠炎,药疹,过敏性脑脊髓炎,急性坏死性出血性脑病,特发性双侧进行性感觉神经性听力损失,再生障碍性贫血,纯红细胞贫血,特发性血小板减少症,多软骨炎,格雷夫斯眼病和原发性胆汁性肝硬化。每种可能性代表本发明的一个分开实施例。
在其他实施例中,组合物可用于治疗自身免疫疾病,包括但不限于:多发性硬化(MS)、自身免疫性神经炎、系统性红斑狼疮(SLE)、牛皮癣、I型糖尿病(IDDM)、斯耶格伦氏病、甲状腺疾病、重症肌无力、结节病、自身免疫性葡萄膜炎、炎性肠病(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、动脉粥样硬化、原发性胆汁性肝硬化(PBC)或自身免疫性肝炎、类类风湿性关节炎。每种可能性代表本发明的一个分开实施例。
在其他实施例中,组合物可用于治疗移植排斥,包括同种异体移植排斥或移植物抗宿主病。
根据另一个实施例,所述减少或抑制炎症、免疫应答或两者是抑制TL1A介导的疾病。
根据另一个实施例,所述减少或抑制炎症、免疫应答或两者是抑制所述受试者中TL1A诱导的IFN-γ分泌。如本文使用的,术语“减少炎症”指统计上显著的炎症减少。
根据另一个实施例,所述受试者患有炎性肠病。根据另一个实施例,所述受试者患有牛皮癣。根据另一个实施例,所述受试者患有自身免疫疾病。根据另一个实施例,所述受试者患有哮喘。根据另一个实施例,所述受试者患有关节炎。根据另一个实施例,所述受试者患有结肠炎。
根据一些实施例,本发明的DR3变体包含SEQ ID NO:13(GGTRSPRCDCAGDFHKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLVCPQDTFLAWENHHNSECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCKPGWFVECQVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF)的氨基酸或者其类似物或片段,其中所述氨基酸分子包含在选自下述的位置处的至少一个氨基酸置换:H15、I18、E38、V47、D51、W56、N61、A65、K93、Q101、Q104和L129。在一个实施例中,SEQ ID NO:13的氨基酸分子或者其类似物或片段包含在选自下述的位置处的至少2、或可替代地至少3、或可替代地至少4、或可替代地至少5、或可替代地至少6、或可替代地至少7、或可替代地至少8、或可替代地至少9、或可替代地至少10、或可替代地至少11、或可替代地至少12个氨基酸置换:H15、I18、E34、E38、V47、D51、W56、N61、A65、K93、Q101、Q104和L129。
根据一些实施例,本发明的DR3变体包含SEQ ID NO:1的氨基酸:
GGTRSPRCDCAGDFX1KKX2GLFCCRGCPAGHYLKAPCTX3PCGNSTCLX4CPQX5TFLAX6ENHHX7SECX8RCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCX9PGWFVECX10VSX11CVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLX12CSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF;其中:X1是H或Q;X2是I、T或Y;X3是E或K;X4是V或P;X5是D或G;X6是W或R;X7是N或E;X8是A或T;X9是K、E或A;X10是Q或S;X11是Q或P;并且X12是L或P。
根据一些实施例,氨基酸分子包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列,以及任选地,选自下述的至少一个氨基酸置换:在DR3的第47位处Val(V)至Pro(P)的置换;在第61位处Asn(N)至Glu(E)的置换;以及在第104位处Gln(Q)至Pro(P)的置换,其中每种可能性代表本发明的一个分开的实施例。
术语“DR3变体”和“DR3突变体”可互换使用,以指包含一个或多个置换的DR3的核酸序列和/或核苷酸序列。应当了解DR3ECD的野生型序列(例如SEQ ID NO:13)或其片段不包括在本发明的范围内。
根据本发明的一个实施例,本发明的DR3变体具有对TL1A增加的选择性。如本文使用的,术语“选择性”指具有的与TL1A的结合亲和力基本上大于对于野生型(WT)TL1A的所述结合亲和力。如与选择性结合亲和力结合使用的,“基本上更大的”意指在与TL1A的选择性中的至少1.5倍、至少两倍、至少三倍、至少四倍或至少五倍增加。
在一些实施例中,与DR3WT相比较,本发明的DR3变体显示出在不同温度(例如至少25℃、至少40℃、至少41℃、至少42℃、至少43℃、至少44℃、至少45℃、至少46℃、至少47℃、至少48℃、至少49℃、至少50℃、至少51℃或至少52℃)下的结合活性的稳定性增加。如本文使用的,术语“增加的稳定性”指具有的稳定性基本上大于DR3WT的稳定性。在一些实施例中,与DR3WT相比较,所述增加的稳定性为至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少六倍增加。
在一些实施例中,DR3变体在抑制TL1A诱导的IFN-γ分泌中具有比DR3WT增加的效力。如本文使用的,术语“增加的效力”指具有的效力基本上大于DR3WT的效力。在一些实施例中,所述增加的效力为与DR3WT相比较在效力中的至少两倍、至少三倍、至少四倍、至少五倍或至少六倍增加。
在一些实施例中,DR3变体减少TL1A介导的抗炎细胞因子(例如IL-13和IL-5)的分泌。在一些实施例中,所述减少为TL1A介导的抗炎细胞因子分泌中的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、或至少70%减少。
如本文使用的,术语“肽”涵盖天然肽(降解产物、合成肽或重组肽)、拟肽(通常包括非肽键或其他合成修饰)以及肽类似物类肽和半类肽,并且可具有例如致使肽在体内时更稳定或更能够穿透到细胞内的修饰。
术语“多肽”、“氨基酸分子”和“蛋白质”在本文中可互换使用,以指氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物,以及天然存在的氨基酸聚合物。
术语“经分离的”肽指基本上不含污染细胞组分的肽,所述污染细胞组分例如碳水化合物、脂质或在自然界中与肽结合的其他蛋白质性杂质。通常,经分离的肽的制备物含有以高度纯化形式,即至少约80%纯、至少约90%纯、至少约95%纯、大于95%纯、或大于99%纯的肽。每种可能性代表本发明的一个分开的实施例。
本发明还提供了本发明的DR3变体的片段、类似物和化学修饰,只要它们能够结合TL1A和/或调节(例如减少或抑制)TL1A诱导的IFN-γ分泌。
肽可包含在肽的N末端、肽的C末端或两者处的另外的氨基酸。根据另一个实施例,氨基酸分子还包含抗体的可结晶片段(Fc)区的肽。根据另一个实施例,抗体的Fc区的所述肽包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。根据另一个实施例,氨基酸分子还包含在氨基酸分子和Fc区之间的接头。在一些实施例中,所述接头具有不超过20个氨基酸、不超过19个氨基酸、不超过18个氨基酸、不超过17个氨基酸、不超过16个氨基酸、不超过15个氨基酸、不超过14个氨基酸、不超过13个氨基酸或不超过12个氨基酸、不超过11个氨基酸、不超过10个氨基酸、不超过9个氨基酸、不超过8个氨基酸、不超过7个氨基酸、不超过6个氨基酸、不超过5个氨基酸、不超过4个氨基酸、不超过3个氨基酸、不超过2个氨基酸或具有一个氨基酸的长度。在一些实施例中,接头包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(IEGRMDRS)。在示例性实施例中,所述接头融合至SEQ ID NO:1的所述氨基酸的羧基末端以及Fc区的所述肽的氨基末端。
如本领域技术人员已知的,保守氨基酸置换在本发明的范围内。保守氨基酸置换包括一个氨基酸由具有相同类型的官能团或侧链(例如脂肪族、芳香族、带正电、带负电)的另一个氨基酸的替换。技术人员将认识到改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸的对肽、多肽或蛋白质序列的个别置换、缺失或添加是“保守修饰的变体”,其中改变导致氨基酸由化学上相似的氨基酸的置换。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域众所周知的。
下述六组各自含有其为彼此的保守置换的氨基酸:1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(参见例如Creighton,Proteins,1984)。
术语“类似物”包括具有基本上等同于本文具体显示的序列之一的氨基酸序列的任何肽,其中一个或多个残基已由功能上相似的残基保守置换且其展示如本文描述的能力。保守置换的例子包括一个非极性(疏水性)残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个非极性(疏水性)残基,一个极性(亲水)残基置换另一个极性(亲水)残基,例如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间,一个碱性残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸置换另一个碱性残基,或一个酸性残基例如天冬氨酸或谷氨酸置换另一个酸性残基。每种可能性代表本发明的一个分开的实施例。
短语“保守置换”还包括化学上衍生的残基代替非衍生残基的使用,条件是此类肽如本文指定的展示调节免疫系统的先天性应答的必要功能。
术语“来源于”或“对应于”指使用本领域技术人员已知的合适手段中的任何一种,例如根据本领域的标准方案的化学合成,基于序列的了解构建氨基酸序列。
根据另一个实施例,本发明的DR3变体与SEQ ID NO:1-9中的任何一个具有至少75%序列同一性。根据另一个实施例,所述DR3变体与SEQ ID NO:1-9中的任何一个具有至少80%序列同一性。根据另一个实施例,所述DR3变体与SEQ ID NO:1-9中的任何一个具有至少85%序列同一性。根据另一个实施例,所述DR3变体与SEQ ID NO:1-9中的任何一个具有至少90%序列同一性。根据另一个实施例,所述DR3变体与SEQ ID NO:1-9中的任何一个具有至少95%序列同一性。
在比对序列以提供最大同源性后,序列同一性百分比可例如通过由Needleman等人描述的算法(Needleman等人,J.Mol.Biol.48:443-453(1970))的Fitch等人版本(Fitch等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:1382-1386(1983))进行测定。可替代地,两个序列之间的同一性百分比的测定可使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877的数学算法来完成。此类算法掺入Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215,403-410的BLASTP程序内。BLAST蛋白质搜索用BLASTP程序执行,以获得与SEQ ID NO:4同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对,如Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402中所述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时,使用分别程序(例如XBLAST)的缺省参数。
通常,本发明涵盖DR3肽的衍生物。术语“衍生物”或“化学衍生物”包括具有通过侧链或官能团的反应而化学衍生的一个或多个残基的肽的任何化学衍生物。此类衍生分子包括例如其中游离氨基已衍生以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可衍生以形成盐、甲基酯和乙基酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可衍生以形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可衍生以形成N-im-苄基组氨酸。还包括作为化学衍生物的是含有二十种标准氨基酸残基的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如:4-羟基脯氨酸可置换脯氨酸;5-羟基赖氨酸可置换赖氨酸;3-甲基组氨酸可置换组氨酸;高丝氨酸可置换丝氨酸;并且鸟氨酸可置换赖氨酸。
另外,肽衍生物可通过化学修饰(包括但不限于末端-NH2酰化、乙酰化或巯基乙醇酸酰胺化),以及通过例如用氨、甲胺等等的末端羧基酰胺化,而不同于本发明的肽的天然序列。肽可为线性、环状或分支的等等,所述构象可使用本领域众所周知的方法来实现。
根据本发明的原理的肽衍生物和类似物还可包括侧链键修饰,包括但不限于-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S=0、OC-NH-、-CH2-O-、-CH2-CH2-、S=C-NH-和-CH=CH-,以及主链修饰例如经修饰的肽键。肽内的肽键(-CO-NH-)可例如通过N-甲基化键(-N(CH3)-CO-);酯键(-C(R)H-C-0-0-C(R)H-N);酮亚甲基键(-CO-CH2-);a-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)置换,其中R是任何烷基例如甲基;卡巴键(-CH2-NH-);羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-);硫代酰胺键(-CS-NH);烯烃双键(-CH=CH-);以及肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-),其中R是碳原子上天然存在的“正常”侧链。这些修饰可在沿肽链的一个或多个键上发生,并且甚至同时在几个(例如2-3个)键上发生。
本发明还涵盖肽衍生物和类似物,其中游离氨基已衍生以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰氨基、苄氧羰基氨基、叔丁氧羰基氨基、氯乙酰氨基或甲酰氨基。游离羧基可衍生以形成例如盐、甲基酯和乙基酯或者其他类型的酯或酰肼。组氨酸的咪唑氮可衍生以形成N-im-苄基组氨酸。
肽类似物还可含有非天然氨基酸。非天然氨基酸的例子包括但不限于肌氨酸(Sar)、正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高丝氨酸、异丙基Lys、3-(2′-萘基)-Ala、烟酰基Lys、氨基异丁酸和3-(3′-吡啶基-Ala)。
此外,肽类似物可含有其他衍生的氨基酸残基,包括但不限于甲基化氨基酸、N-苄基化氨基酸、O-苄基化氨基酸、N-乙酰化氨基酸、O-乙酰化氨基酸、苄氧羰基取代氨基酸等等。具体实例包括但不限于甲基-Ala(Me Ala)、MeTyr、MeArg、MeGlu、MeVal、MeHis、N-乙酰基-Lys、O-乙酰基-Lys、苄氧羰基-Lys、Tyr-O-苄基、Glu-O-苄基、苄基-His、Arg-甲苯磺酰基、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸等等。
本发明还包括肽类似物,其可含有氨基酸的一种或多种D-异构体形式。其中至少一个氨基酸且可能所有氨基酸为D-氨基酸的逆-反式D-氨基酸肽的生产是本领域众所周知的。当肽中的所有氨基酸均为D-氨基酸,并且分子的N末端和C末端为反转的时,结果是在相同位置处具有与分子的L-氨基酸形式相同的结构基团的分子。然而,分子对蛋白水解降解更稳定,并且因此可用于本文叙述的许多应用中。由于其更高的水溶性、更低的免疫原性以及对蛋白水解降解的更低易感性,非对映体肽可超过具有相同氨基酸序列的所有L-氨基酸肽或所有D-氨基酸肽高度有利。如本文使用的,术语“非对映体肽”指包含L-氨基酸残基和D-氨基酸残基两者的肽。本发明的非对映体肽中的D-氨基酸残基的数目和位置可改变,只要肽能够展示必要的结合TL1A和/或调节(例如减少或抑制)TL1A诱导的IFN-γ分泌的功能,如本文指定的。
本发明的肽可通过本领域众所周知的技术进行合成或制备。肽可通过Merrifield的固相肽合成方法(参见J.Am.Chem.Soc,85:2149,1964)进行合成。可替代地,本发明的肽可使用本领域众所周知的标准溶液方法(参见例如Bodanszky,M.,Principles of PeptideSynthesis,Springer-Verlag,1984)或通过本领域已知的用于肽合成的任何其他方法进行合成。
一般而言,这些方法包括一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸序贯添加至与合适树脂结合的增长中的肽链。
通常,第一个氨基酸的氨基或羧基受合适的保护基团保护。在有助于形成酰胺键的条件下,通过在序列中添加具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的下一个氨基酸,保护或衍生的氨基酸随后可附着至惰性固体支撑物(树脂)或在溶液中利用。保护基团随后从这个新近添加的氨基酸残基中去除,并且加入下一个氨基酸(适当保护的),等等。在所有所需氨基酸已以适当序列连接后,序贯或同时去除任何剩余保护基团,并且如果通过固相方法合成,则从固体支撑物中切割肽链,以提供最终肽。
在固相肽合成方法中,氨基酸的α-氨基受酸或碱敏感基团保护。此类保护基团应具有对肽键形成的条件稳定的特性,同时可容易去除,而不破坏增长中的肽链。合适的保护基团是叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基(Cbz)、联苯基异丙氧羰基、叔戊氧羰基、异冰片氧羰基、(α,α)-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧羰基、邻硝基苯氧硫基(o-nitrophenylsulfenyl)、2-氰基叔丁氧羰基、9-芴甲氧羰基(FMOC)等等。
在固相肽合成方法中,C末端氨基酸附着至合适的固体支撑物。可用于上文合成的合适的固体支撑物是这样的材料,所述材料对逐步缩合-脱保护反应的试剂和反应条件惰性,以及在使用的溶剂介质中是不溶性的。合适的固体支撑物是氯甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物、羟甲基-聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物等等。偶联反应在溶剂例如乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等等中完成。如本领域众所周知的,相继受保护氨基酸的偶联可在自动多肽合成仪中进行。
本发明的肽可替代地可这样合成,使得连接肽的氨基酸残基的键中的一个或多个是非肽键。这些可替代非肽键包括但不限于亚氨基键、酯键、酰肼键、氨基脲键和偶氮键,所述非肽键可通过本领域技术人员众所周知的反应形成。
在一些实施例中,重组蛋白质技术用于生成本发明的蛋白质。在一些实施例中,重组蛋白质技术用于生成相对长的肽(例如长于18-25个氨基酸)。在一些实施例中,重组蛋白质技术用于生成大量本发明的蛋白质。在一些实施例中,重组技术通过Bitter等人,(1987)Methods in Enzymol.153:516-544,Studier等人(1990)Methods in Enzymol.185:60-89,Brisson等人(1984)Nature310:511-514,Takamatsu等人(1987)EMBO J.6:307-311,Coruzzi等人(1984)EMBO J.3:1671-1680和Brogli等人,(1984)Science 224:838-843,Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach&Weissbach,1988,Methods forPlant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,第421-463页描述。
通过重组技术产生的本发明的肽、其类似物或衍生物可这样纯化,使得肽当施用于受试者时是基本上纯的。术语“基本上纯的”指已与天然伴随其的组分分开的化合物例如肽。
通常,当样品中的至少50%、优选至少75%、更优选至少90%且最优选至少99%的总材料(按体积计、按湿重或干重计、或按摩尔百分比或摩尔分数计)是目的肽时,肽是基本上纯的。纯度可通过任何适当方法进行测量,例如在肽的情况下通过HPLC分析进行测量。
根据另一个方面,本发明提供了编码本发明的多肽、或者其类似物或缀合物的经分离的多核苷酸序列。编码融合至Fc区的DR3ECD的多核苷酸序列的非限制性例子包含SEQID NO:12的核酸序列。基于SEQ ID NO:12生成本发明的DRS突变体在技术人员的能力内。
术语“多核苷酸”意指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或其组合的聚合物,所述聚合物可来源于任何源,可为单链或双链的,并且可任选含有合成、非天然或改变的核苷酸,其能够掺入DNA或RNA聚合物内。
“经分离的多核苷酸”指多核苷酸区段或片段,其已与在天然存在的状态中侧接其的序列分开,例如已从序列中取出的DNA片段,所述序列通常与片段邻接,例如它天然存在于其中的基因组中与片段邻接的序列。该术语还应用于多核苷酸,所述多核苷酸基本上纯化掉在细胞中天然伴随多核苷酸的其他组分,例如RNA或DNA或蛋白质。术语因此包括例如重组DNA,其掺入载体、自主复制的质粒或病毒、或者原核生物或真核生物的基因组DNA内,或作为分开的分子(例如作为cDNA或者通过PCR或限制性酶消化产生的基因组片段或cDNA片段)存在,不依赖于其他序列。它还包括其为编码另外多肽序列的杂合基因的部分的重组DNA,以及RNA例如mRNA。
术语“编码”指经分离的多核苷酸例如基因、cDNA或mRNA中的特异性核苷酸序列的固有特性,以在生物过程中充当用于合成具有限定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定氨基酸序列以及起因于其的生物特性的其他聚合物和大分子的模板。因此,如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生肽或蛋白质,则该基因编码肽或蛋白质。用作基因或cDNA转录的模板,其核苷酸序列等同于mRNA序列且通常在序列表中提供的编码链和非编码链两者,均可被称为编码肽或蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
考虑到遗传密码的简并性,以及如由所谓的“摆动规则”给出的允许密码子的第三个位置中的经典碱基配对的例外,本领域技术人员应了解超过一种多核苷酸可编码任何给定肽或蛋白质。预期本发明涵盖编码本发明的肽以及其类似物的多核苷酸。
本发明的多核苷酸可作为分泌肽进行表达,其中本发明的多肽或其类似物从含有多核苷酸的宿主细胞在其中生长的培养基中分离,或多核苷酸可通过缺失引导肽或其他肽作为细胞内多肽进行表达,在所述情况下,本发明的多肽或其类似物从宿主细胞中分离。本发明的多肽或其类似物随后通过本领域已知的标准蛋白质纯化方法进行纯化。
通过将包含编码本发明多肽或其类似物的经分离的多核苷酸的表达载体转移至与目的组织相关的细胞,还可将本发明的多肽、其类似物或衍生物提供给目的组织。细胞这样产生肽,使得它适当地提供给组织内的细胞,以发挥生物活性,例如以减少或抑制目的组织内的炎性过程。
根据本发明的原理的表达载体还包含启动子。在本发明的上下文中,启动子必须能够驱动肽在细胞内的表达。许多病毒启动子适用于此类表达载体(例如逆转录病毒ITR、LTR、立即早期病毒启动子(IEp)(例如疱疹病毒IEp(例如ICP4-IEp和ICPO-IEp)和巨细胞病毒(CMV)IEp)、以及其他病毒启动子(例如晚期病毒启动子、潜伏活性启动子(LAP)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子和鼠白血病病毒(MLV)启动子)。其他合适的启动子是真核生物启动子,其含有增强子序列(例如兔β-珠蛋白调节元件)、组成型活性启动子(例如β-肌动蛋白启动子等)、信号和/或组织特异性启动子(例如诱导型和/或阻遏型启动子,例如响应TNF或RU486的启动子、金属硫蛋白启动子等)、以及肿瘤特异性启动子。
在表达载体内,编码本发明的多肽或其类似物的多核苷酸和启动子可操作地连接,使得启动子能够驱动多核苷酸的表达。只要这种可操作地连接得到维持,表达载体就可包括超过一种基因,例如通过内部核糖体进入位点(IRES)分开的多重基因。此外,表达载体可任选包括其他元件,例如剪接位点、多聚腺苷酸化序列、转录调节元件(例如增强子、沉默子等)或其他序列。
表达载体以这样的方式引入细胞内,使得它们能够表达其中包含的编码本发明的多肽或其类似物的经分离的多核苷酸。任何合适的载体均可如此采用,其中许多是本领域已知的。此类载体的例子包括裸露DNA载体(例如寡核苷酸或质粒)、病毒载体例如腺伴随病毒载体(Berns等人,1995,Ann.N.Y.Acad.Sci.772:95-104,所述参考文献的内容以引用的方式在此全文并入)、腺病毒载体、疱疹病毒载体(Fink等人,1996,Ann.Rev.Neurosci.19:265-287)、包装扩增子(Federoff等人,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1636-1640,所述参考文献的内容以引用的方式在此全文并入)、乳头状瘤病毒载体、微小核糖核酸病毒载体、多瘤病毒载体、逆转录病毒载体、SV40病毒载体、牛痘病毒载体和其他载体。另外,载体还可包括其他遗传元件,例如编码可选择标记物(例如β-gal或赋予对毒素的抗性的标记物)的基因、药理学活性蛋白、转录因子或其他生物活性物质。
用于操作包含经分离的多核苷酸的载体的方法是本领域众所周知的(例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Press,所述参考文献的内容以引用的方式在此全文并入),并且包括直接克隆、使用重组酶的位点特异性重组、同源重组和构建重组载体的其他合适方法。以这种方式,表达载体可这样构建,使得它可在任何所需细胞中复制,在任何所需细胞中表达,并且甚至可变得整合到任何所需细胞的基因组内。
包含目的多核苷酸的表达载体通过对于将DNA转移到细胞内适当的任何手段引入细胞内。许多此类方法是本领域众所周知的(例如Sambrook等人,同上;还参见Watson等人,1992,Recombinant DNA,第12章,第2版,Scientific American Books,所述参考文献的内容以引用的方式在此全文并入)。因此,在原核细胞的情况下,载体引入可例如通过电穿孔、转化、转导、缀合或移动来完成。对于真核细胞,载体可通过使用例如电穿孔、转染、感染、DNA包被的微弹或原生质体融合引入。表达载体可引入其内的真核细胞的例子包括但不限于卵子、干细胞、胚细胞等等。
需要时,多核苷酸在诱导型启动子的控制下转移到其内的细胞可用作瞬时转化体。此类细胞自身随后可转移到受试者内用于其中的治疗利益。因此,细胞可转移至受试者中的部位,使得本发明的肽在其中表达且由其分泌,并且因此例如减少或抑制T细胞介导的过程,使得受试者的临床状况得到改善。可替代地,特别是在载体已在体外加入其中的细胞的情况下,细胞可首先经历几轮克隆选择(通常通过在载体中使用可选择标记物序列得到促进),以选择稳定的转化体。此类稳定的转化体随后转移至受试者优选人,用于其中的治疗利益。
在细胞内,编码本发明的肽或其类似物的多核苷酸得到表达且任选被分泌。多核苷酸的成功表达可使用标准分子生物学技术(例如RNA杂交、蛋白质印迹、免疫沉淀、酶免疫测定等)进行评价。
本发明涵盖包含编码本发明肽的经分离的多核苷酸的转基因动物。
本发明的药物组合物
在一些实施例中,本发明提供了包含治疗有效量的本发明的氨基酸分子(即多肽)(例如SEQ ID NO:1)作为活性成分和药学可接受的运载体的组合物(即药物组合物)。
本发明的药物组合物可以本发明的多肽或者其类似物或其衍生物的药学可接受的盐形式进行配制。药学可接受的盐包括由游离氨基形成的那些盐,例如来源于无毒无机酸或有机酸(例如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等等)的盐,以及由游离羧基形成的那些盐,例如来源于无毒无机碱或有机碱(例如钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等)的盐。在一个实施例中,本发明的药物组合物通过本领域众所周知的过程进行制造,所述过程例如借助于常规混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、水飞、乳化、封装、包埋或冻干过程。
术语“药学可接受的”意指适合于施用于受试者例如人。例如,术语“药学可接受的”可意指由联邦政府或州政府的管理机构批准或者美国药典或其他一般公认药典中列出用于在动物中且更具体而言在人中使用。术语“运载体”指治疗化合物与其一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药学运载体可为无菌液体,例如水和油,包括石油、动物、植物或合成起源的那些,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等,聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶剂。当药物组合物静脉内施用时,水是优选运载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体运载体,特别是用于可注射溶液。合适的药学赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。需要时,组合物还可含有少量湿润剂或乳化剂,或者pH缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。还设想了抗菌剂例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯;抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠;以及用于调整张力的试剂例如氯化钠或右旋糖。
组合物可采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、乳膏、软膏、泡沫、糊剂、持续释放制剂等等的形式。组合物可用常规粘合剂和运载体例如甘油三酯、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶配制为栓剂。经口制剂可包括标准运载体,例如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药学运载体的例子在下述中描述:通过E.W.Martin的Remington′s Pharmaceutical Sciences″,所述参考文献的内容以引用的方式在此并入本文。此类组合物含有治疗有效量的本发明的肽,优选以基本上纯化的形式,连同合适量的运载体,以便提供用于适当施用于受试者的形式。
本发明的一个实施例涉及以单位剂型呈现的多肽,并且通过药学领域众所周知的方法中的任一种进行制备。在本发明的一个实施例中,单位剂型采取片剂、胶囊、锭剂、薄片、贴片、安瓿、小瓶或预填充注射器的形式。另外,体外测定可任选用于帮助鉴定最佳剂量范围。在制剂中要采用的精确剂量还取决于施用途径以及疾病或病症的性质,并且应当根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可由来源于体外或体内动物模型测试生物测定或系统的剂量应答曲线外推。
取决于目的组织的位置,本发明的多肽可以适合于将肽提供给目的组织内的细胞的任何方式供应。因此,例如,含有多肽的组合物可例如引入体循环内,所述体循环将所述肽分配至目的组织。可替代地,组合物可局部应用于目的组织(例如注射,或作为连续输注泵送,或作为组织内的推注,应用于皮肤表面的全部或一部分等)。
在本发明的一个实施例中,多肽经由经口、直肠、阴道、局部、鼻、眼、透皮、皮下、肌内、腹膜内或静脉内施用途径进行施用。药物组合物的施用途径将取决于要治疗的疾病或状况。合适的施用途径包括但不限于肠胃外注射,例如皮内、静脉内、肌内、损伤内、皮下、鞘内、以及如本领域已知的任何其他注射模式。尽管通过其他途径施用的肽的生物利用度可低于经由肠胃外注射施用时,通过使用适当制剂,设想能够经由经皮、经口、直肠、阴道、局部、鼻、吸入和眼部治疗模式施用本发明的组合物。另外,可能期望通过任何合适途径引入本发明的药物组合物,包括心室内和鞘内注射;心室内注射可通过例如附着至储库的心室内导管得到促进。肺施用还可例如通过使用吸入器或喷雾器采用。
对于局部应用,本发明的肽、其衍生物、类似物或片段可与药学可接受的运载体组合,使得基于所需活性递送有效剂量。运载体可采用例如但不限于下述形式:软膏、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫、气雾剂、栓剂、垫或凝胶棒。
对于经口应用,药物组合物可采取片剂或胶囊的形式,所述片剂或胶囊可含有下述成分中的任一种或相似性质的化合物:粘合剂如微晶纤维素,黄蓍胶或明胶;赋形剂如淀粉或乳糖;崩解剂如海藻酸、Primogel或玉米淀粉;润滑剂如硬脂酸镁;或助流剂如胶体二氧化硅。当剂量单位形式是胶囊时,除上文类型的材料之外,它还可含有液体运载体例如脂肪油。另外,剂量单位形式可含有修饰剂量单位的物理形式的各种其他材料,例如糖包衣、虫胶或其他肠试剂。本发明的片剂还可以是薄膜包衣的。
对于肠胃外施用的目的,可采用芝麻油或花生油或者水性丙二醇中的溶液,以及相应的水溶性盐的无菌水性溶液。需要时,此类水性溶液可为适当缓冲的,并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖致使等渗。这些水溶液尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射目的。
本发明的组合物一般以药物组合物的形式施用,所述药物组合物包含本发明的活性组分中的至少一种连同药学可接受的运载体或稀释剂。因此,本发明的组合物可个别或一起在任何常规经口、肠胃外或经皮剂型中施用。
根据本发明的实施例的药物组合物可含有0.1%-95%本发明的活性组分,优选1%-70%。在任何情况下,要施用的组合物或制剂可含有一定数量的根据本发明的实施例的活性组分,以有效治疗被治疗的受试者的状况或疾病的量。
组合物还包含防腐剂,例如苯扎氯铵和硫柳汞等等;螯合剂,例如EDTA钠及其他;缓冲剂,例如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐;张力剂,例如氯化钠、氯化钾、丙三醇、甘露醇及其他;抗氧化剂,例如抗坏血酸、乙酰半胱氨酸、偏亚硫酸氢钠及其他;芳香剂;粘度调节剂,例如聚合物,包括纤维素及其衍生物;以及聚乙烯醇以及酸和碱,以根据需要调整这些水性化合物的pH。组合物还可包含局部麻醉剂或其他活性剂。
另外,组合物还可包含粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、淀粉羟乙酸钠)、各种pH和离子强度的缓冲液(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、添加剂例如白蛋白或明胶以防止吸收至表面、去污剂(例如Tween 20、Tween 80、Pluronic F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠)、渗透促进剂、增溶剂(例如甘油、聚乙烯甘油)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁基羟基茴香醚)、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、粘度增加剂(例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜、柠檬酸)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、流动助剂(例如胶体二氧化硅)、增塑剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)、聚合物包衣(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)、包衣和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
本发明的多肽、其衍生物或类似物可在控制释放系统中递送。因此,输液泵可用于施用肽例如用于例如将胰岛素或化学疗法递送至特定器官或肿瘤的那种。在一个实施例中,本发明的肽与生物可降解、生物相容性聚合物埋植剂组合施用,所述埋植剂在所选位点处经过控制时间段释放肽。优选聚合物材料的例子包括但不限于聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯、其共聚物和共混物(参见Medical applications ofcontrolled release,Langer和Wise(编辑),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Fla.,所述参考文献的内容以引用的方式在此全文并入)。在另外一个实施例中,控制释放系统可置于治疗靶附近,因此仅需要全身剂量的部分。
在一个实施例中,本发明的组合物在包或分配器装置例如FDA批准的试剂盒中呈现,所述包或分配器装置包含含有活性成分的一种或多种单位剂型。在一个实施例中,包或分配器装置伴随施用说明书。
在一个实施例中,应了解本发明的多肽可与另外的活性剂一起提供给个体,以实现与每种试剂单独治疗相比较改善的疗效。在另一个实施例中,采取针对与组合疗法相关的不良副作用的措施(例如补充试剂的给药和选择)。
肽的“治疗有效量”是足以对肽施用于其的受试者提供有利效应的肽量。更具体而言,治疗有效量意指有效预防、减轻或改善被治疗的受试者的组织损害或疾病症状的肽量。
在一些实施例中,有效量或剂量的制备可最初由体外测定进行估计。在一个实施例中,剂量可在动物模型中配制,并且此类信息可用于更精确地测定在人中的有用剂量。
在一个实施例中,本文描述的活性成分的毒性和治疗功效可通过标准药学程序在体外、在细胞培养物或实验动物中进行测定。在一个实施例中,得自这些体外和细胞培养测定和动物研究的数据可用于配制用于在人中使用的一系列剂量。在一个实施例中,剂量取决于采用的剂型和利用的施用途径而改变。在一个实施例中,确切制剂、施用途径和剂量可通过个别医生考虑到患者的条件加以选择。[参见例如Fingl等人,(1975)″ThePharmacological Basis of Therapeutics″,第1章,第1页]。
在一个实施例中,取决于要治疗的状况的严重性和应答性,给药可为单次施用或多次施用,其中疗程从几天持续到几周,或直至实现治愈或实现疾病状态的缩小。在一个实施例中,要施用的组合物的量当然取决于被治疗的受试者、痛苦的严重性、施用方式、开处方医生的判断等。在一个实施例中,还可制备包括在相容的药学运载体中配制的本发明制备物的组合物,置于适当容器中,并且标记用于所示状况的治疗。
在说明书中,除非另有说明,否则修饰本发明的一个实施例的一个或多个特征特有的条件或关系的形容词例如“基本上”和“约”理解为意指条件或特征定义为在容许量内,所述容许量对于它预期用于其的应用的实施例操作是可接受的。除非另有说明,否则在说明书和权利要求中的单词“或”视为包括性“或”,而不是排他性或,并且指示它结合的项目中的至少一个或任何组合。
在本专利申请的说明书和权利要求中,动词“包含”、“包括”和“具有”及其缀合物各自用于指示动词的一个或多个宾语不一定是动词的一个或多个对象的组分、元素或部分的完全列表。
在检查并非预期是限制性的下述实例后,本发明的另外目的、优点和新型特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。另外,如上文描述和如下文权利要求部分中请求保护的本发明的各个实施例和方面各自在下述实例中找到实验支持。
实例
一般地,本文使用的命名法和本发明中利用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物和重组DNA技术。此类技术在文献中得到充分说明。参见例如″Molecular Cloning:Alaboratory Manual″Sambrook等人,(1989);″Current Protocols in MolecularBiology″第I-III卷,Ausubel,R.M.,编辑(1994);Ausubel等人,″Current Protocols inMolecular Biology″,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,″APractical Guide to Molecular Cloning″,John Wiley&Sons,New York(1988);Watson等人,″Recombinant DNA″,Scientific American Books,New York;Birren等人(编辑)″Genome Analysis:A Laboratory Manual Series″,第1-4卷,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York(1998);如美国专利号4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中所示的方法;″Cell Biology:A Laboratory Handbook″,第I-III卷Cellis,J.E.,编辑(1994);Freshney的″Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique″,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版;″Current Protocols in Immunology″第I-III卷Coligan J.E.,编辑(1994);Stites等人(编辑),″Basic and Clinical Immunology″(第8版),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);Mishell和Shiigi(编辑),″Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual″CSHLPress(1996);所有这些参考文献以引用的方式并入。其他一般参考文献在本文件自始至终提供。
材料与方法
质粒和细胞培养
人DR3细胞外结构域由购自Open Biosystems的人DR3的EST cDNA克隆进行扩增。大肠杆菌(E.coli)E.Cloni菌株(Lucigen)用于克隆和质粒提取。对于酵母表面展示,使用NheI和BamHI位点将变体克隆到pCTCON质粒内。对于在哺乳动物细胞中的表达,使用pFUSE(Invivogen)载体,以获得与人IgG1Fc融合的DR3-ECD变体。
HEK293T在补充有10%FBS(Biological Industries,Beit-Haemek,Israel)、2mM谷氨酰胺、1x青霉素/链霉素溶液(Biological Industries,Beit-Haemek,Israel)的DMEM中生长,在转染前3小时,培养基更换为Freestyle无血清培养基(Invitrogen)。H293F在不含任何补充物的Freestyle培养基中生长。PBL和CD4+T细胞亚群以1*106/ml的浓度在RPMI1640中生长,所述RPMI 1640具有10%FBS 2mM谷氨酰胺、1x青霉素/链霉素溶液(Biological Industries,Beit-Haemek,Israel),补充有10%热灭活的FBS(BiologicalIndustries,Beit-Haemek,Israel)。
酵母表面展示
DR3变体在EBY100菌株细胞的酵母细胞表面上展示(Chao,G.等人Nat Protoc 1,755-68,2006),并且基本上如所述的通过流式细胞术分析。简言之,用含有所需克隆的质粒pCTCON转化的EBY100细胞在SDCAA培养基(20g蔗糖、6.7g酵母氮源、5g酪蛋白氨基酸、5.4gNa2HPO4和8.56g NaH2PO4*H2O)中在30℃下生长至对数期。随后,将2*106细胞洗涤,重悬浮于SGCAA诱导培养基(类似于SDCAA,但含有半乳糖代替蔗糖)中,并且在30℃下伴随振荡生长另外18小时。经诱导的细胞(1*106)通过离心收集,用PBSF(PBS+1g/L BSA)洗涤,并且在25℃下与0.2μM TL1A(R&D Systems)一起温育1小时,所述TL1A根据制造商的程序,使用生物素标记试剂盒(Pierce)进行生物素化。细胞随后洗涤且在25℃下与小鼠α-myc抗体(Santa Cruz Biotechnology,1μl/50μl PBSF)一起温育1小时。随后,细胞再次洗涤且与FITC缀合的α-小鼠IgG(Sigma,1μl/50μl PBSF)和别藻蓝蛋白缀合的链霉抗生物素蛋白(Jackson Immunoresearch,1μl/50μl PBSF)一起在冰上温育另外一小时,伴随频繁混合。将标记的细胞洗涤,用PBSF重悬浮,并且通过流式细胞术(FACS Calibur,BD)分析。
文库生成
对于DR3回复共有区文库的生成,人DR3基因通过PCR进行扩增,并且5μg用DNA酶I进行消化,以获得50-125bp片段,如先前描述的28。如在DNA改组31中,在16种短寡核苷酸(各4-6nM)的混合物的存在下,将片段重装配,导致在每种基因中含有3-8个突变的文库,具有~4的平均突变数目(Stemmer,W.P.,1994,Proc Natl Acad Sci USA 91,10747-51;Aharoni等人,2004,Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 101,482-487)。基于下述等式,估计的文库复杂性为~170,000种突变体:N!/(N-K)!*K,其中N是位置总数目,并且K是插入基因内的平均突变数目(Bamias,G.等人2006,Proc Natl Acad Sci USA103,8441-6)。如所述的(Chao,G.等人2006,Nat Protoc,1,755-68),反应混合物还通过嵌套PCR进行扩增。将文库连接到pCTCON载体内用于酵母表面展示,或通过重组克隆到酵母内。
使用酵母表面展示的文库选择
如上所述,将文库诱导且用c-myc和生物素化的TL1A进行标记。将展示DR3文库的EBY100细胞(1*107)标记,分析且使用FACS(Synergy iCyt)分选。执行三个迭代富集循环。在每个循环中,将对应于在顶部1-2%的绿色和红色荧光强度区域内发现的细胞的多重‘阳性’事件(3-5*104)收集到生长培养基内,并且在琼脂上铺平板用于新的富集循环。对于首次用于实验的文库的初始分选,使用顶部5%的荧光细胞的分选门。选择循环继续直至未获得进一步富集。
在哺乳动物表达后使用ELISA筛选富集的DR3文库
将来自最后一轮FACS富集的质粒库PCR扩增,克隆到如上所述的pFUSE质粒内,并且转化到HEK293T细胞内。转染后两至三天,含有分泌的DR3变体的培养基使用ELISA就DR3-TL1A相互作用进行测试。为了进行测定,ELISA板(Griener Microlon 96W)与100μl 0.66μg/ml单克隆小鼠α-TL1A抗体(Santa Cruz)一起温育1小时,用补充有0.05%Tween-80的PBS(PBST)洗涤,并且将100μl 0.6μg/ml TL1A(Cam Bio)加入板中,共另外一小时。板随后用PBST进行洗涤,并且通过与150μl补充有3%脱脂乳的PBS一起温育1小时进行封闭。在封闭后,将板洗涤且与用WT或DR3突变体转染的100μl HEK293T培养基一起温育,所述WT或DR3突变体在转染后48或72小时收获,使ELISA板振荡另外一小时。DR3-Fc(R&D Systems)以2μg/ml的浓度加入作为阳性对照,并且补充有1%BSA的PBS充当阴性对照。板随后用PBST洗涤,与100μl 0.05μg/ml生物素化的山羊多克隆α-DR3抗体(R&D Systems)一起温育,随后与次级过氧化物酶缀合的链霉抗生物素蛋白(Jackson,1∶10000稀释度)一起温育。最后,加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)生色3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液(Dako)。反应通过加入1M硫酸得到停止,并且使用Tecan Infinite M200板阅读器在450nm下进行记录。
在哺乳动物细胞中的大规模蛋白质表达和纯化
根据制造商的程序,将含有DR3变体的pFUSE转移至Freestyle培养基中的500ml293F细胞。转染后六天,收集培养基,并且使用10K Amicon超滤装置浓缩五倍,随后浓缩的上清液用30mM Tris pH 8.3(缓冲液A)稀释六倍。最终pH测量为8.25,并且将上清液装载到MonoQ柱(GE)上。接下来,柱用20柱体积的缓冲液A进行洗涤,并且通过应用20柱体积从缓冲液A到缓冲液B(30mM Tris pH 8.3和0.5M NaCl)的梯度来洗脱蛋白质,在整个洗脱过程期间收集级分。级分活性通过ELISA进行测量,将活性级分合并在一起,针对含有1.5mM DTT的PBS进行透析,并且随后十倍稀释到50mM NaCitrate 25mM NaCl pH 5.8(缓冲液C)内。稀释的活性级分直接装载到SP柱(GE)上,并且柱用缓冲液C洗涤直至OD 280是稳定的。SP柱通过应用从缓冲液C到含有50mM NaCitrate 450mM NaCl pH 5.8的缓冲液(缓冲液D)的梯度进行洗脱,具有23柱体积的梯度长度,在整个洗脱过程期间收集级分。样品在SDS PAGE凝胶上运行,并且合并含有对应于DR3-Fc融合蛋白的大约47kDa的主要条带的级分。
合并的级分两倍稀释到2M NH3SO450mM Tris pH 7.3内,并且随后装载到丁基HIC柱(GE)上。丁基柱用1M NH3SO4 200mM NaCl 25mM NaCitrate pH 5.8洗涤超过20柱体积,并且通过应用21柱体积梯度至含有50mM柠檬酸盐25mM NaCl pH 5.8的缓冲液进行洗脱,收集洗脱级分且通过SDS PAGE凝胶进行分析。将含有以90%或更高纯度的DR3-FC的级分合并在一起,针对含有1.5mM DTT的PBS透析,并且在液氮中以小等分试样冲洗冻干用于未来使用。
用于抑制TL1A诱导的IFN--γ分泌的基于CD4+细胞的测定
根据制造商说明书,使用LymphoprepTM(Axis shield,Oslo,Norway),从正常健康志愿者的血液中分离PBMC,在烧瓶中在37℃下温育PBMC三小时后分离PBL级分,并且非贴壁级分指定为PBL。如通过制造商描述的,非接触CD4+T细胞亚群的分离使用CD4+或T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)执行。PBL与IL-12(2ng/ml)和IL-18(50ng/ml)一起温育72小时,连同或不连同TL1A(100ng/ml)或以不同浓度的DR3变体。收集培养基,并且根据制造商说明书,通过使用ELISA试剂盒(PeproTech)定量IFN-γ的水平。
使用表面等离子体共振的亲和力测量
TL1A与DR3变体结合的亲和力通过在ProteOn XPR36(Bio-Rad)仪器上的表面等离子体共振(SPR)测量进行测定。所有样品均在含有2mM DTT的PBS中。GLC Chip进行空气初始化,并且用EDC/S-NHS进行活化。来自DR3变体各自的5μg在乙酸盐缓冲液,pH 5.5中稀释,并且固定到芯片上作为参考,并且BSA也装载到芯片上。在用乙醇胺封闭芯片上的可用的未结合位点后,芯片用HBST缓冲液进行洗涤且旋转。TL1A以30μl/分钟以各种浓度(100、50、25、12.5和6.25nM)运行300秒,随后为10分钟解离步骤。使用Bio-Rad的proteOn Manager软件V2.1.2.05,用Langmuir单结合位点模型测定结合参数。
定向进化方法
在过去几年中,定向进化方法已证明对于生成具有改善功能的蛋白质是高度有价值的。定向进化方法基于天然达尔文进化的原理,并且由两个主要步骤组成:(i)以基因文库形式在靶基因中产生遗传多样性,和(ii)就所需活性有效选择或筛选那些文库。定向进化已用于改善酶的催化活性,用于改变底物特异性,用于增强热稳定性和用于加强重组系统中的表达。另外,这种方法用于生成对于各种配体具有显著增强的亲和力的蛋白质。
实例1
DR3-ECD基因文库的生成
DR3受体是跨膜蛋白质,含有N末端信号肽,随后为长171个氨基酸(aa)的ECD(其中aa 35-141与肿瘤坏死因子受体1同源)、跨膜结构域和含有死亡结构域的细胞质尾部(aa343-419)。由171个残基组成的受体的全长ECD在DR3突变体文库的生成中作为第一步进行克隆。接下来,DR3ECD的多重序列比对用于生成聚焦回复共有区DR3文库(图2)。近年来,已开发几种方法,以基于靶蛋白的结构、功能和进化生成小型和功能上富集的基因文库。这些方法之一是通过残基的靶向诱变,所述残基来源于基因家族的共有序列,以生成回复共有区文库。这种文库方法显示为增强靶蛋白的稳定性和活性。
为了鉴定来源于DR3ECD中的家族共有区的靶残基,比对12种哺乳动物DR3序列。我们鉴定了来源于DR3家族共有区的13个不同位置(表1)。为了生成含有回复共有区突变的DR3基因文库,我们采用新近开发的称为ISOR(经由基因重装配掺入合成核苷酸)的方法,用于靶位置的部分诱变(Herman,A.&Tawfik,D.S.(2007).Protein Eng Des Sel 20,219-26)。这种方法是基因改组的修改,并且通过在基因装配期间用含有所需突变的合成寡核苷酸掺料,允许特异性残基的同时多样化(图2B)。在文库生成后,6种随机DR3文库变体的测序指示3-8个回复共有区突变/基因的插入,具有~4个突变/基因的平均值。每种文库变体携带突变残基的随机和不同子集(数据未示出)。
表1:DR3蛋白质中的氨基酸残基频率。
a氨基酸残基位置根据人DR3蛋白质序列显示。
b基于来自不同物种的12种同源DR3(ECD)蛋白质的比对,同源DR3蛋白质中的给定残基频率。
c掺料到DR3(ECD)内的氨基酸突变,以生成‘回复共有区’文库(关于细节参见正文和材料与方法)
实例2
使用酵母表面展示的DR3文库富集
酵母表面展示(YSD)是用于改造具有增加的亲和力、特异性和稳定性的蛋白质的强大方法。YSD方法提供了对于大型突变体文库的高流通量筛选超过其他方法的几个优点。这种方法允许通过使用荧光激活细胞分选定量筛选大型文库,从而允许“实时”分析文库特征和选择阈值的细调。YSD方法用于在酵母细胞表面上展示DR3,并且检查其与TL1A的结合(图3)。DR3的展示水平使用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗体进行监测,所述抗体针对在蛋白质的C末端处引入的myc标签。与TL1A的结合使用生物素化的α-DR3抗体进行监测,随后与缀合至别藻蓝蛋白(APC)的链霉抗生物素蛋白一起温育。为了就具有对TL1A增强的展示水平和亲和力的突变体富集文库,展示DR3文库的酵母细胞与TL1A一起温育,并且分析超过5*106个细胞,并且基于荧光表达和结合信号,通过荧光激活细胞分选(FACS)进行分选。执行三个迭代富集循环,导致群的平均荧光中的连续增加(图3B)。
实例3
使用ELISA筛选富集的DR3文库
为了鉴定对于TL1A具有增强的结合亲和力的单一DR3突变体候选物,将FACS富集的文库亚克隆到含有引导肽的哺乳动物载体内,并且与人IgG1Fc融合。先前显示许多受体的细胞外结构域是高度糖基化的,并且此类糖基化可显著促成受体构象和结合靶配体。因此,可溶性DR3受体的基于哺乳动物的表达提供维持天然蛋白质翻译后修饰包括糖基化的优点。为了获得在哺乳动物细胞中高水平的DR3表达,将引导肽序列最佳化(图4),转染和在HEK293F细胞中的表达条件(关于细节参见实验程序)。为了促进相对大数目的DR3突变体的筛选,细胞在24板形式中进行转染,并且使用ELISA就TL1A相互作用检查分泌的DR3。开发快速灵敏的ELISA,其基于在多孔板上固定TL1A且使用特异性抗体检测DR3结合(图5)。为了检查用于检测DR3-TL1A相互作用的动态范围,改变应用于板的DR3浓度,并且发现测定是高度灵敏的,允许检测大范围的DR3浓度(图5B)。使用这种测定,来自FACS富集文库的~250种DR3突变体在HEK293F细胞中表达,并且筛选与TL1A的结合。总之,这种筛选努力允许分离7种候选突变体,其显示出在筛选实验期间相对于WT DR3增加的结合(图6)。
实例4
八种所选DR3突变体的表征
为了表征,将七种所选DR3突变体测序,在哺乳动物细胞中表达且纯化蛋白质(关于突变列表,参见表2)。对于哺乳动物表达和纯化,将HEK293F细胞瞬时转染,并且在七天后收集培养基。当尝试使用蛋白A亲和层析纯化DR3变体时,发现在来自蛋白A树脂的洗脱步骤后DR3活性的显著丧失。这种丧失是由于洗脱缓冲液的低pH。因此,开发用于获得高度纯的DR3蛋白质的DR3变体的可替代纯化方案。这种纯化方案基于离子交换层析,随后为疏水柱纯化(关于细节参见实验程序)。
表2:所选DR3变体中的突变列表
接下来,使用表面等离振子共振表征不同DR3变体的TL1A结合亲和力(表3)。WTDR3与TL1A的亲和力为45nM,是与先前报告的TL1A结合亲和力良好一致的值。有趣的是,具有SEQ ID NO:2的DR3变体显示出相对于WT DR3增加5倍的TL1A结合亲和力。具有SEQ IDNO:3的DR3变体显示出相对于WT DR3增加6.6倍的TL1A结合亲和力,具有SEQ ID NO:5的DR3变体显示出相对于WT DR3增加1.7倍的TL1A结合亲和力,并且具有SEQ ID NO:2的DR3变体显示出相对于WT DR3增加4.6倍的TL1A结合亲和力(表3)。
表3:如通过SPR测定的,TL1A细胞因子与DR3-Fc变体结合的动力学速率常数
接下来,测试相对于DR3WT蛋白质,所选DR3变体在不同温度下与TL1A结合的能力。首先,与DR3WT相比较,发现包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的DR3变体在37℃下的延长温育后显示出更高的结合活性(图7A)。接下来,发现包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5的DR3变体与TL1A结合的能力在不同温度下是稳定的,而DR3WT与TL1A结合的能力下降(图7B)。另外,在25℃下温育后,与包含SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:5的DR3变体相比较,DR3WT与TL1A结合的能力更快速下降(图7C)。DR3WT的结合活性在47℃下的35分钟温育后基本上下降,而包含SEQ ID NO:4的DR3变体显示稳定的结合活性(图7D)。为了检查经改造的DR3突变体抑制TL1A与细胞中的内源DR3受体结合的能力,我们建立基于细胞的测定。测定基于在与IL-12和IL-18结合的TL1A加入人CD4+细胞后测量IFN-γ分泌。先前,显示TL1A与IL-12和IL-18合作,以在T细胞中诱导IFN-γ,并且IFN-γ分泌的程度在CD4+细胞中更高。此外,TL1A证实增强CD4+细胞中IL-12/IL-18依赖性的IFN-γ分泌(图8)。
由于竞争,可溶性DR3连同TL1A的添加阻止配体与内源DR3受体结合,因此导致减少的IFN-γ分泌。我们发现高浓度DR3连同100ng/ml TL1A一起加入CD4+T细胞足以抑制TL1A诱导的IFN-γ分泌。检查本发明的变体对人CD4+中TL1A诱导的IFN-γ分泌的作用。在包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的DR3变体的存在下,TL1A诱导的IFN-γ分泌显著下降。此外,高浓度DR3变体证实抑制IFN-γ的分泌(图9A、B)。
虽然本发明已得到具体描述,但本领域技术人员应了解可作出许多变化和修饰。因此,本发明不应解释为限制于具体描述的实施例,并且本发明的范围和概念通过参考下文权利要求更容易得到理解。
实例5
体内试验
腹腔TL1a和DR3注射
以范围为0.5至20mg/kg的不同浓度的DR3WT以及包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4的变体或PBS注射到腹腔,在注射30分钟后,将0.2mg/kg人TL1A或PBS注射到模型动物(例如C57BL/6或Balb/c小鼠)的腹腔内,在人TL1A注射后六小时,腹腔用1ml PBS进行洗涤,并且通过ELISA分析IL-13和IL-5的水平。这种测定可如Yu X等人,2014,MucosalImmunol;7(3):730-40中所述执行,所述参考文献的内容以引用的方式在此全文并入。
在另一个实验中,0.2mg/kg人TL1A以及一系列20mg/kg-0.5mg/kg DR3WT或包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的DR3变体或PBS混合在一起,并且将混合物注射到模型动物的腹腔内,在初始注射后六小时,腹腔用PBS进行洗涤,并且通过ELISA分析IL-13和IL-5的水平。
过继转移模型
产生通过慢病毒转染在诱导条件下过表达TL1A的人基因的干细胞。在一个例子中,这种测定可通过使用如Pan H等人,2008,J Immunol Methods.329(1-2):31-44中所述的诱导系统来执行,所述参考文献的内容以引用的方式在此全文并入。本领域技术人员应了解可使用本领域已知的其他诱导系统。例如,将500,000个CD45RDhi/人TL1A或CD45RDhi细胞注射到Rag1-/-小鼠的腹腔内,并且在使处死的小鼠经历组织学分析之前,监测疾病严重性共八周。
实验分析利用关于改变细胞效应的评分系统。评分系统包括0至4的得分,代表关于下述中的变化的异常:体重(0,无重量减轻;1,1%至5%重量减轻;2,5%至10%重量减轻;3,10%至15%重量减轻;4,超过15%重量减轻)、大便稠度(0,坚硬干燥大便;1,湿粪;2,柔软粘连大便;3,稀便;4,液体大便)、使用Hemoccult II SENSA的粪便隐血试验(BeckmanCoulter,Brea,CA;0,无色;1,蓝色斑点;2,最多50%蓝色;3,超过50%蓝色;4,肉眼可见的红色血液),这三个标准总计为最终得分。另外,执行结肠和小肠的肉眼可见炎症以及十二指肠、空肠和回肠的定量组织学评分:A)炎症:0,正常;1,轻度;2,中度;3,重度;B)隐藏损害:0,无一;1,基底三分之一损害;2,基底三分之二损害;3,超过三分之二损害;C)绒毛变化:0,正常;1,变形;2,分支;3,萎缩和变钝。
在第二阶段中,用500,000个CD45RDhi/hTL1a细胞注射的小鼠用在0.5mg/kg-20mg/kg范围内的PBS、DR3WT或本文公开的变体(例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4)进一步注射到腹腔内,一周两次。小鼠就疾病严重性进行评分,并且组织学得分如上文公开的进行指定。
在转基因小鼠中硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的结肠炎
产生在CD11c的启动子或任何其他合适的启动子下过表达TL1A的人基因(hTL1a)的转基因小鼠品系。在实验第1至5、8至12、15至19、以及22至26天时,转基因小鼠用3%DSS(w/v)水进行施用,以与Takedatsu等人2008,Gstroentrology,135(2):552-567类似的方式。可替代地,在转基因小鼠不耐受3%DSS的情况下,将2%或1.5%DSS的剂量加入饮用水中。
实验结果的分析利用关于下述中的变化的异常的0至4评分系统:体重:重量(0,无重量减轻;1,1%至5%重量减轻;2,5%至10%重量减轻;3,10%至15%重量减轻;4,超过15%重量减轻)、大便稠度(0,坚硬干燥大便;1,湿粪;2,柔软粘连大便;3,稀便;4,液体大便)、使用Hemoccult II SENSA的粪便隐血试验(Beckman Coulter,Brea,CA;0,无色;1,蓝色斑点;2,最多50%蓝色;3,超过50%蓝色;4,肉眼可见的红色血液),这三个标准总计为最终得分。另外,结肠和小肠的肉眼可见炎症。正常肠形态的宏观证据将指定得分0;无充血的轻度肠壁增厚指定得分1;具有充血的中度肠壁增厚指定得分2;具有僵化和充血的重度肠壁增厚指定得分3;并且具有僵化、充血和粘连的重度肠壁增厚指定得分4。执行十二指肠、空肠和回肠的定量组织学评分:A)炎症:0,正常;1,轻度;2,中度;3,重度;B)隐藏损害:0,无一;1,基底三分之一损害;2,基底三分之二损害;3,超过三分之二损害;C)绒毛变化:0,正常;1,变形;2,分支;3,萎缩和变钝。
这些转基因人TL1A小鼠通过以范围为0.5至20mg/kg的各种浓度的PBS、DR3WT或DR3变体(例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)的一周两次腹膜内注射进行施用,一周两次。在小鼠被处死且指定肉眼可见炎症和组织学评分之前,它们就疾病严重性评分26天。
慢性硫酸葡聚糖钠(DSS)模型
在实验第1至5、8至12、15至19、以及22至26天时,模型动物(例如C57BL/6小鼠)用3%DSS(w/v)水进行施用,以与Takedatsu等人2008,Gstroentrology,135(2):552-567类似的方式。
关于下述中的变化的异常的0至4评分系统:体重:重量(0,无重量减轻;1,1%至5%重量减轻;2,5%至10%重量减轻;3,10%至15%重量减轻;4,超过15%重量减轻)、大便稠度(0,坚硬干燥大便;1,湿粪;2,柔软粘连大便;3,稀便;4,液体大便)、使用Hemoccult IISENSA的粪便隐血试验(Beckman Coulter,Brea,CA;0,无色;1,蓝色斑点;2,最多50%蓝色;3,超过50%蓝色;4,肉眼可见的红色血液),这三个标准总计为最终得分。另外,结肠和小肠的肉眼可见炎症。正常肠形态的宏观证据将指定得分0;无充血的轻度肠壁增厚指定得分1;具有充血的中度肠壁增厚指定得分2;具有僵化和充血的重度肠壁增厚指定得分3;并且具有僵化、充血和粘连的重度肠壁增厚指定得分4。执行十二指肠、空肠和回肠的定量组织学评分:A)炎症:0,正常;1,轻度;2,中度;3,重度;B)隐藏损害:0,无一;1,基底三分之一损害;2,基底三分之二损害;3,超过三分之二损害;C)绒毛变化:0,正常;1,变形;2,分支;3,萎缩和变钝。
DSS诱导的小鼠用以范围为0.5至20mg/kg的各种浓度的PBS、DR3 WT或者具有SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的DR3变体的一周两次腹膜内注射进行施用,一周两次。小鼠就疾病严重性评分26天。其后,将小鼠处死且指定肉眼可见炎症和组织学评分。
急性结肠炎模型:2,4,6三硝基苯磺酸(TNBS)
实验室小鼠(例如C57BL/10)通过在50%乙醇的TNBS或仅50%乙醇的直肠内施用进行诱导,如Scheiffele F等人,2002,Curr Protoc Immunol.2002,第15章:Unit 15.19中所述。在第-1和0天时,小鼠用与DR3-Fc变体的腹膜内(IP)注射组合的急性TNBS-结肠炎进行诱导,如Meylan,F等人,2011,Mucosal Immunol;4(2):172-85中先前描述的。
为了评价在抑制TNBS诱导的结肠炎中的受体功效,将DR3WT、DR3变体和小鼠IgG(对照)以不同浓度(例如2.5、5、10和20mg/kg)注射到实验室小鼠(例如C57BL/10小鼠)的腹腔内。为了测量针对重量减轻的保护水平和经处理的小鼠相对于未经处理的小鼠的死亡率,小鼠每天进行称重共五天,并且0至4的评分系统指定至关于下述中的变化的异常:体重:重量(0,无重量减轻;1,1%至5%重量减轻;2,5%至10%重量减轻;3,10%至15%重量减轻;4,超过15%重量减轻)、大便稠度(0,坚硬干燥大便;1,湿粪;2,柔软粘连大便;3,稀便;4,液体大便)。在五天后,小鼠被安乐死,并且收获其结肠用于组织学分析。将从这些小鼠中分离的结肠样品切片且用苏木精和伊红(H&E)染色,以鉴定严重炎症的区域。每个切片根据炎症的严重性以不知情方式进行评分。

Claims (26)

1.一种包含SEQ ID NO:13(GGTRSPRCDCAGDFHKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLVCPQDTFLAWENHHNSECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCKPGWFVECQVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF)的氨基酸的氨基酸分子或者其类似物或片段,其中所述氨基酸分子包含在选自下述的位置处的至少一个氨基酸置换:H15、I18、E38、V47、D51、W56、N61、A65、K93、Q101、Q104和L129。
2.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列
GGTRSPRCDCAGDFX1KKX2GLFCCRGCPAGHYLKAPCTX3PCGNSTCLX4CPQX5TFLAX6ENHHX7SECX8RCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCX9PGWFVECX10VSX11CVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLX12CSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF
其中:
X1是H或Q;
X2是I、T或Y;
X3是E或K;
X4是V或P;
X5是D或G;
X6是W或R;
X7是N或E;
X8是A或T;
X9是K、E或A;
X10是Q或S;
X11是Q或P;和
X12是L或P。
3.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:2GGTRSPRCDCAGDFHKKYGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLPCPQGTFLAWENHHNSECTRCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCAPGWFVECSVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLPCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF的氨基酸。
4.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:3GGTRSPRCDCAGDFHKKTGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLPCPQGTFLAWENHHESECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCEPGWFVECQVSPCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLPCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF的氨基酸。
5.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:4GGTRSPRCDCAGDFHKKYGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLVCPQGTFLAWENHHNSECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCEPGWFVECQVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLPCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF的氨基酸。
6.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:5GGTRSPRCDCAGDFHKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTKPCGNSTCLPCPQDTFLARENHHNSECTRCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCAPGWFVECSVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLPCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF的氨基酸。
7.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:6GGTRSPRCDCAGDFQKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLPCPQDTFLARENHHNSECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCKPGWFVECQVSPCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF的氨基酸。
8.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:7GGTRSPRCDCAGDFHKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTKPCGNSTCLPCPQDTFLAWENHHNSECTRCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCKPGWFVECSVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF的氨基酸。
9.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:8GGTRSPRCDCAGDFQKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTKPCGNSTCLPCPQGTFLAWENHHESECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCAPGWFVECSVSQCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLLCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF的氨基酸。
10.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子包含SEQ ID NO:9GGTRSPRCDCAGDFQKKIGLFCCRGCPAGHYLKAPCTEPCGNSTCLPCPQDTFLAWENHHESECARCQACDEQASQVALENCSAVADTRCGCEPGWFVECSVSPCVSSSPFYCQPCLDCGALHRHTRLPCSRRDTDCGTCLPGFYEHGDGCVSCPTSTLGSCPERCAAVCGWRQMF的氨基酸。
11.根据权利要求1所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子还包含抗体的可结晶片段(Fc)区的肽。
12.根据权利要求11所述的氨基酸分子,其中抗体的可结晶片段(Fc)区的所述肽包含SEQ ID NO:10(VECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEGLHNHYTQKSLSLSPGK)的氨基酸序列。
13.根据权利要求11所述的氨基酸分子,所述氨基酸分子还包括包含SEQ ID NO:11(IEGRMDRS)的氨基酸序列的接头,其中所述接头融合至SEQ ID NO:1的所述氨基酸的羧基末端以及抗体的Fc区的所述肽的氨基末端。
14.一种组合物,所述组合物包含根据权利要求1所述的蛋白质和运载体。
15.一种多核苷酸分子,所述多核苷酸分子包含编码根据权利要求1所述的氨基酸分子的编码部分。
16.根据权利要求15所述的多核苷酸,所述多核苷酸包含SEQ ID NO:12的核酸序列。
17.一种表达载体,所述表达载体包含根据权利要求15或16所述的多核苷酸。
18.一种细胞,所述细胞包含根据权利要求17所述的表达载体。
19.一种组合物,所述组合物包含根据权利要求17所述的表达载体和运载体。
20.一种用于抑制有此需要的受试者中的炎症、免疫应答或两者的方法,所述方法包括给所述受试者施用组合物的步骤,所述组合物包含有效量的包含SEQ ID NO:1的氨基酸的氨基酸分子,由此抑制有此需要的受试者中的炎症、免疫应答或两者。
21.根据权利要求20所述的方法,其中所述抑制炎症、免疫应答或两者是抑制所述受试者中的IFN-γ分泌。
22.根据权利要求20所述的方法,其中所述受试者患有炎性肠病。
23.根据权利要求20所述的方法,其中所述受试者患有牛皮癣。
24.根据权利要求20所述的方法,其中所述受试者患有自身免疫疾病。
25.根据权利要求20所述的方法,其中所述受试者患有哮喘。
26.根据权利要求20所述的方法,其中所述受试者患有关节炎。
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