TW201538168A - 包含紅血球生成素及分支聚合物結構之共軛物 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示包含紅血球生成素(erythropoietin)(EPO)和不對稱分支聚合物結構之共軛物，以及含彼之醫藥組成物，該不對稱分支聚合物結構包含二個單甲氧基聚乙二醇(mPEG)之分支，其中這些mPEG分支的其中之一的分子質量係介於10kDa和14kDa之間，而mPEG之另一分支的分子質量係介於17kDa和23kDa之間。本發明亦提供用於製備聚乙二醇化之EPO的方法，其中該蛋白質係與具有二個具上述分子質量之mPEG分支的不對稱分支聚合物結構共軛結合。
Description
本發明關於生物技術、生命科學及製藥工業的領域，尤其是關於分子修飾，以改善分子之藥物動力學，增加其在血液中之半衰期及其生物活性。
近年來，生物分子在人類之治療劑中的用途已增加，主要原因是：(1)發現新的蛋白質及肽分子，(2)對體內作用機制有較多的理解，(3)蛋白質之表現系統及肽合成方法改善，及(4)增強藥效和藥物動力學性質之調製或分子修飾技術改善。
在經修飾之藥物遞送領域中的技術發展已允許將大量之能夠改變注射藥物釋出的系統引入，以改善該治療劑之藥效和藥物動力學性質。新藥物遞送系統可經由改變調製(例如連續產物釋放或脂質體)或經由將藥物分子，諸如聚乙二醇化(其僅將藥物與一或多個聚乙二醇(PEG)分子共價結合)來製造。
新的釋放型導致半衰期增加、不良反應降低、藥效提
高及患者之生活品質改善。連續釋放系統以控制和預定的方式釋出藥物，且特別適合那些避免血漿濃度大幅波動對其而言很重要的藥物。
使用可生物降解之微球來系統性釋出分子已被廣泛研究，因為其保護易於降解之蛋白質及延長或修飾釋出(Sinha,V.R.and Trehan,A.(2003).Biodegradable microspheres as protein delivery,J.Controlled Release,90(3)：261-280)。
聚乙二醇化提供用於修飾治療性蛋白質之方法，以將許多生物分子之藥理學侷限性盡可能減少。例如，血液中半衰期增加有幾個原因，包括：聚合物殘基可防止蛋白酶攻擊及藥物被免疫系統辨識，而該共軛物相對於天然蛋白質而言明顯較高之流體力學體積顯著地減少腎臟所進行之過濾。雖然在許多情況中，蛋白質之體外生物活性受聚乙二醇化影響；在血液中之壽命期大幅增加使其治療作用更有效(Harris J.M.and Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals Nat Rev Drug Discov 2：214-221)。
聚乙二醇化之另一益處為增加物理穩定性，因為其空間上阻斷由疏水性交互作用所引起之降解途徑，並產生非特異性空間障礙，此空間障礙減少涉及蛋白質之熱不穩定性的分子間交互作用。增加物理穩定性可允許更穩定之調製劑(Harris J.M.and Chess R.B.(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals Nat Rev Drug Discov 2：214-
221)。
藉著第二代經活化之PEG的出現，可取得能允許更多選擇性聚乙二醇化作用(例如：優先結合蛋白質之N-端的醛基)和分支結構(Roberts M.J.,Bentley M.D.,Harris J.M.(2002)Chemistry for peptide and protein PEGylation Adv Drug Deliv Reviews.54：459-476)的基團。所開發之分支PEG包括二分支單官能(美國專利US5932462)、四分支四官能及八分支八官能。為了共軛結合治療性蛋白，該單官能之經活化的PEG更有用，因為其避免蛋白質與PEG聚合物之間的交聯。分支PEG亦具有傘型效果，其對蛋白質表面之保護更佳。
該二分支單官能PEG已允許取得顯示出較天然蛋白更佳之臨床效果的共軛結合之α-2a干擾素(Rajender Reddy K.,Modi M.W.,Pedder S.(2002).Use of peginterferon alfa-2a(40 KD)(Pegasys)for the treatment of hepatitis C.Adv Drug Deliv Reviews.54：571-586)。
已報導之應用不同的修飾釋放技術的蛋白質有很多，包括重組人紅血球生成素(EPO)(rh EPO)。EPO為具有165個胺基酸的醣蛋白。根據其醣苷化之程度，其使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳法(縮寫為SDS-PAGE)所估計之分子量係介於27和39kDa之間(Mikaye,T.et al.(1977).Purification of Human erythropoietin J Biol Chem 252：5558-5564)。實驗中已證明藉由除去低氧刺激；血液中之EPO信使核糖核酸
(mRNA)快速減少且可能在3小時變成無法檢測，這表明其半衰期短(Lacombe,C.et al(1988)Peritubular cells are the site of erythropoietin synthesis in the murine hypoxic kidney J.Clin Invest 81：620-623；Koury,S.T.et al.(1989)Quantitation of erythropoietin producing cells in kidneys of mice by in situ hybridation：Correlation with hematocrit,renal erythropoietin mRNA and serum erythropoietin concentration.Blood 74：645-651)。據估計，血漿中之EPO的半衰期係在4至13小時之範圍內；當與其他具治療用途的分子相比較時，此時間非常短。這造成需要規律使用激素之患者必須頻繁地注射，以維持紅血球水準接近正常(Spivak,J.L.1992 The mechanism of action of erythropoietin：Erythroid cell response.In J.W.Fisher(Ed.)Biochemical Pharmacology of Blood and Blood-Forming Organs Springer-Verlag Berlin Handbook of Experimental Pharmacology 101：49-114；Jelkmann,W.(1986)Renal Erythropoietin：Properties and Production Rev Physiol Biochem Pharmacol 104：139-205)。
為了增加rh EPO之半衰期，在分子上進行突變以增加N-醣苷化之位點(Burke,Paul(2003).Device for the sustained release of aggregation-stabilized,biologically active agent.美國專利申請案第20030133979號)，其被包封在微球(Morlock M,et al(1998).Erythropoietin loaded microspheres prepared from biodegradable LPLG-
PEO-LPLG triblock copolymers：protein stabilization and in-vitro release properties.J Control Release,56(1-3)：105-115)及脂質體中(Moriya H,et al.(1997).Pharmacokinetic and pharmacological profiles of free and liposomal recombinant human erythropoietin after intravenous and subcutaneous administrations in rats.Pharm Res 14(11)：1621-1628)，據報導，所取得之rh EPO二聚體的生物活性增加(Bruno D.,et al(2001).Dimeric erythropoietin fusion protein with enhanced erythropoietic activity in vitro and in vivo.Blood,Vol.97,No.12,3776-3782)。
在臨床中具有最多結果的修飾之一為rh EPO與聚合物之化學共軛結合(Jolling K.et al.(2005).Mixed-Effects Modelling of the Interspecies Pharmacokinetic Scaling of Pegylated Human Erythropoietin.Eur J Pharm Sci；24：465-475)。研發此聚乙二醇化之rh EPO時所發現的困難為共軛結合過程之產量低，這是因為形成單聚乙二醇化和二聚乙二醇化物種，而後者構成該過程之污染物。
由於所有上述內容，取得可提供優於未經修飾之分子的治療益處的EPO和聚合物之新共軛物仍是令人關注的。
本發明藉由提供包含EPO及不對稱分支聚合物結構(其包含二個單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分支)的共軛物來解決上述問題，其中這些mPEG分支的其中之一的分子質量係介於10kDa和14kDa之間，而另一mPEG分支的分子質量係介於17kDa和23kDa之間。
以此方式，本發明提供包含單官能分支PEG結構之共軛物，該PEG結構之分子大小類似於Papadimitriou所使用者(美國專利7202208)，但其採用帶有二個具有不同分子質量的PEG鏈之結構。令人意外的，此替代法賦予該藥物新益處。在本發明之共軛物中，該二個分支PEG聚合物結構的總分子質量係介於27和37kDa之間。於本發明之一實施態樣中，該mPEG1之分子質量為12kDa且mPEG2之分子質量為20kDa。
使用具有指明之分子質量的不對稱分支PEG鏈來取代線性PEG鏈能減少二聚乙二醇化之污染物形成，且令人意外地，顯著增加該分子之半衰期及其物理化學穩定性。
另一令人意外的結果是該具有不對稱分支之單官能PEG的聚乙二醇化分子之生物活性保持完整。文獻中已廣泛地報導由聚乙二醇化引起之生物分子的生物活性損失(Harris JM and Chess RB(2003)Effect of pegylation on pharmaceuticals Nat Rev Drug Discov 2：214-221)。
具有二個不對稱分支之單官能PEG係經由將二個具有不同分子大小的線性PEG鏈結合在一個核心上來取
得。其他作者曾使用類似的過程取得良好的結果(美國專利5932462)。為了將二個線性PEG鏈結合至一個核心，需要彼等具有活性基團。此基團可從本技藝中已知之各種基團選擇。例如，此活性基團可為琥珀醯亞胺基琥珀酸酯、琥珀醯亞胺基碳酸酯、對-硝苯基碳酸酯、琥珀醯亞胺基丙酸酯、琥珀醯亞胺基丁酸酯等等。較佳地，本發明中之線性PEG係藉由琥珀醯亞胺基碳酸酯活化。此係由於二個主要原因：a)介於其和胺基之間的反應的產率良好，及b)取得此官能化之PEG的過程很容易。取得此官能化之PEG的過程為本技術領域中之工作人員所周知(Miron T,Wilchek M.(1993).A Simplified Method for the Preparation of Succinimidyl Carbonate Polyethylene Glycol for Coupling to Proteins.Bioconjugate Chem.4：568-569)。一旦該線性PEG被活化，其隨後被允許與該選定之核心分子反應。
於本發明之一較佳實施態樣中，該核心為L-離胺酸，由於其為生物相容分子，具有稍後可被活化之二個游離胺基團及羧酸基。因此，於本發明之一種實施態樣中，EPO係與不對稱之分支聚合物結構共軛結合，該不對稱之分支聚合物結構係由下式代表：
於一特殊之實施態樣中，在形成該共軛物之一部分的聚合物結構中，mPEG1的分子質量為12kDa，而mPEG2之分子質量為20kDa，或者mPEG1之分子質量為20kDa，而mPEG2之分子質量為12kDa。
該二個不對稱分支之衍生物可使用色層分析法純化，接著使用用於共軛結合至生物分子的不同反應性基團活化。用於活化其他PEG結構之任何官能基均可用於本發明中所描述之不對稱分支PEG。這些官能基之實例為：N-羥基琥珀醯亞胺酯、琥珀醯亞胺基碳酸酯、不同類型之醛、馬來醯亞胺等等。另一種允許此種結構結合蛋白質之官能基類型為螯合基團，諸如氮基三醋酸酯(nitrilotriacetate)，其可藉由過渡金屬共軛結合至存在於該肽骨幹中之組胺酸。欲使用之反應性基團的選擇係取決於該PEG所結合之蛋白質殘基。
在Huang提交之專利申請案(EP 1479711 A1)的實施例中，所顯示之PEG分支結構在每個分支中具有不同的分子質量；但該分支之分子大小較本發明中之分支小。在專利申請案EP 1479711 A1號中，發明者提出相對於未經修飾之藥物的生物活性而言，該共軛物之生物活性降
低。然而，令人意外地，在本發明中，該與總分子質量介於27和37kDa之間，具有二個不對稱分支之單官能PEG共軛結合的EPO之生物活性類似於未經修飾之EPO的生物活性。另一方面，本發明中顯示根據Huang提交之專利申請案的PEG結構(其具有二個分子質量較低之分支)的半衰期短於本發明之EPO共軛物(其具有二個分支分別為12kDa和20kDa的PEG)之半衰期。
本發明中所取得之結果令人意外。藉著該包含不對稱聚合結構(PEG2,32K)之共軛物，不會限制生物活性之分子空間分佈可改善會減少聚乙二醇化產物形成之共軛結合反應，並顯著改善所取得之藥物動力學參數。這允許降低需要該治療之患者的治療劑量。
用於取得本發明之不對稱二分支PEG結構的基本原料為12kDa mPEG(12K PEG)及20kDa mPEG(20K PEG)。這些mPEG之分子量的範圍係由製造商建立，因為PEG為多分散(polydisperse)聚合物。例如，如製造商之一所具體指明者，多分散度應低於1.1%。在該情況中，製造商所報告之12K PEG的分子量範圍將為12.0±1.2kDa；且PEG 20K將為20.0±2.0kDa。
為了測定每批PEG起始材料之間的分子量差異是否影響藥物動力學結果，以具有對應於該具體指明之極限值的分子量之PEG批次進行實驗(實施例11)。使用具有11kDa分子量之12K PEG及具有18kDa分子量之20K PEG來形成具有總分子量為29kDa之二分支PEG結構的
EPO共軛物(PEG2,29K-EPO)。亦使用分子量為13kDa之12K PEG及分子量為22kDa之20K PEG來形成具有總分子量為35kDa之二分支PEG結構的EPO共軛物(PEG2,35K-EPO)。結果顯示出當使用12K PEG和20K PEG之不同初始批次時，藥物動力學參數類似。因此，由PEG2,29K-EPO和PEG2,35K-EPO結構所形成之共軛物基本上被視為與那些由具有製造商指明之理論重量的結構所形成的共軛物(PEG2,32K-EPO)(其為EPO與二分支PEG之共軛物，該二個分支之一為12kDa，另一為20kDa)相同。
蛋白質與活化之PEG共軛結合係在合適之緩衝劑內發生。除了其他因素外，緩衝劑之特性取決於該聚合物之官能基及共軛結合之目的。例如，若想要藉由游離胺基與如N-羥基琥珀醯亞胺酯之官能化的PEG共軛結合，該共軛結合位點可根據共軛結合反應之pH值而預測到一定程度。介於8.0和9.0之間的pH值可促進藉由離胺酸之ε-胺基團共軛結合。
在取得共軛物之後，使用各種技術來將其表徵。分析該共軛物之化學、物理和生物性質，以將該純化之共軛物最充分地表徵。例如，該共軛物之濃度通常可藉由紫外光譜(280nm吸光率)測定，因為PEG殘基實際上不影響該蛋白質之莫耳消光係數。較佳地，該純化之產物的純度係藉由SDS-PAGE測定，因為色層分析法(像凝膠過濾色層分析法)對該對應於所欲之共軛物和污染物的信號的辨
別力不佳。其他物理化學性質可藉由熟習本技藝之人士已知之平常方法進行研究。
在本發明之背景下，術語紅血球生成素(EPO)係指能維持EPO分子之生物活性的任何其變體；例如截短的分子。EPO可藉由重組去氧核糖核酸(DNA)技術，使用本技術領域中之技藝熟習人士已知的表現和純化系統來取得。因此，於本發明之一實施態樣中，該共軛物包含rh EPO。以先前技藝之任何方法(諸如胺基酸取代)修飾後，本發明之共軛物亦包含藉由上述方法取得之任何EPO的變異體。
包含本發明之任何PEG-EPO共軛物及醫藥上可接受之賦形劑的醫藥組成物亦為本發明的目的。
本發明之另一態樣為用於取得聚乙二醇化之EPO的方法，其中該蛋白質與包含二個mPEG分支之不對稱分支聚合物結構(其中該mPEG的分支之一的分子質量係介於10kDa和14kDa之間，而mPEG之另一分支的分子質量係介於17kDa和23kDa之間)共軛結合。與未經共軛結合之EPO產生之半衰期相比較，透過本發明的方法可增加在投服該蛋白質之哺乳動物的血液中之EPO半衰期。因此，本發明提供用於改善該蛋白質之藥物動力學的方法，以減少投予需要該蛋白質之個體的劑量。在本發明的背景下，EPO藥物動力學參數的改善應被理解為是該蛋白質之半衰期及/或平均滯留時間增加。因此，本發明揭示該EPO分子之化學修飾，以增加該分子之半衰期的方
法，其中該蛋白質係與包含二個mPEG分支之不對稱分支聚合物結構共軛結合，其中這些mPEG分支的其中之一的分子質量係介於10kDa和14kDa之間，而另一mPEG分支的分子質量係介於17kDa和23kDa之間。於本發明之一實施態樣中，該不對稱分支聚合物結構之mPEG分支的其中之一的分子質量為12kDa，而另一mPEG分支的分子質量為20kDa。於本發明之一實施態樣中，在本發明的方法中，該與EPO共軛結合之不對稱分支聚合物結構係由下式代表：
於本發明方法的較佳實施態樣中，在與EPO共軛結合之不對稱分支聚合物結構中，該mPEG1分子質量為12kDa且mPEG2分子質量為20kDa，或者該mPEG1分子質量為20kDa且mPEG2分子質量為12kDa。於更佳之實施態樣中，在本發明的方法中，該EPO為rh EPO。
第1圖. 該EPO與PEG2,32K之共軛結合反應的產物之SDS-PAGE雙重染色(考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)和碘)的結果。樣本1對應於EPO陽性對照組，樣本2對應於EPO與PEG2,32K之共軛結合反應的
產物。
第2圖. 該EPO與PEG2,40K之共軛結合反應的產物之SDS-PAGE雙重染色(考馬斯亮藍和碘)的結果。樣本1對應於EPO陽性對照組，樣本2對應於EPO與PEG2,40K之共軛結合反應的產物。
第3圖. 藉由凝膠過濾色層分析法取得以評估不同之PEG-EPO共軛物的色層分析圖。
第4圖.藉由正常紅血球小鼠之方法測定之天然EPO和單聚乙二醇化之EPO的體內生物活性。
第5圖.由共軛物PEG2,32K-EPO、PEG2,40K-EPO及未經修飾之EPO的胰蛋白酶降解分析所取得之結果。表示SDS-PAGE前之降解動力學。
第6圖. 藉由正常紅血球小鼠之方法測定的不同PEG-EPO共軛物及未經修飾之EPO的生物活性。
將50克分子量為20kDa之未經活化的mPEG(mPEG20K-OH)在450毫升甲苯中共沸乾燥3小時。在此時間後，除去200毫升溶劑並令溶液冷卻至室溫。接著，加入60毫升作為共溶劑之無水二氯甲烷(DCM)。稱量二琥珀醯亞胺基碳酸酯(4.9克)之重量並將其溶解於40mL之二甲基甲醯胺中。將上述溶液加入含有
mPEG20K-OH之燒瓶中。稱量二甲胺基吡啶(2.5克)之重量並將其溶解在20mL之DCM中。將上述溶液加入含有mPEG20K-OH之燒瓶中並開始攪拌。令其在室溫下反應一整夜。
使用玻璃纖維膜將反應混合物過濾，以除去固體產物。以1.5L之無水二乙醚使濾液沉澱出並在真空下過濾。藉由真空收集沉澱物，在高度真空下乾燥4小時並儲存在-20℃。初始mPEG20K-OH質量中有96%係以PEG琥珀醯亞胺基碳酸酯(PEG20K-SC)之形式回收，活化程度為96.0±0.8%。
依照mPEG20K-OH活化反應之相同程序進行，但在本情況中係使用分子量為12kDa之未經活化的mPEG(mPEG12K-OH)作為起始原料。
稱量L-離胺酸(9.1g)之重量並將其溶解於30mL之0.1M硼酸；pH 8.0中。將20克之PEG20K-SC加入15毫升在硼酸中之L-離胺酸溶液中。將溶液持續攪拌12小時。
接著，以300mL之蒸餾水將反應混合物稀釋，並以鹽酸溶液之混合物將其調節成pH3.5。將混合物轉移至分液漏斗中，將100mL DCM加入此分液漏斗中。手動攪拌
並除去下方相(有機相)。共進行5次荦取。將二十克之硫酸鈉加入含有該有機相之瓶子中，並手動攪拌直至該有機相完全透明。使用玻璃纖維膜將其進行真空過濾。將濾液在旋轉蒸發器上盡最大可能濃縮。然後，加入500mL之二乙醚並手動攪拌之，以使產物沉澱。進行真空過濾並將該產物(20K單聚乙二醇化之L-離胺酸)在真空下，旋轉蒸發器中乾燥1小時。
在第二個反應步驟中，將9g之PEG12K-SC加入15g之20K單聚乙二醇化之L-離胺酸中。將反應物溶解在215mL之DCM中並加入0.14mL之三乙胺。使用玻璃纖維濾膜將該反應混合物進行真空過濾。將濾液在旋轉蒸發器中盡最大可能濃縮。然後，加入300mL之二乙醚並手動攪拌2分鐘，以沉澱出該產物。在真空下過濾並將所取得之產物(具有二個不對稱分支之PEG，該分支之一為12kDa，另一為20kDa(PEG2,32K-COOH))在真空下，旋轉蒸發器中乾燥1小時。該方法之總產量高於70%。
PEG2,32K-COOH之純化係在80cm高之DEAE-Sepharose柱中，使用40mL/min之體積流量進行。將凝膠預先以4.5L之0.2M氫氧化鈉溶液淨化。以50mM硼酸溶液，pH 9.0平衡該柱。接著，以5L蒸餾水清洗該柱。施加該溶解在水中之PEG2,32K-COOH樣本，使導電率為40mS/cm，超過水的導電率。施加樣本後，以3L純水清
洗該柱。以5L之10mM氯化鈉溶液進行樣本洗提。收集500mL之餾分。接著，以3L之1M氯化鈉溶液重建該柱。從該過程中回收之總產量高於90%，純度高於95%。
將1克之PEG2,32k-COOH溶解在DCM中；加入0.01g之N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)及0.02g之二環己基碳二亞胺。將反應混合物攪拌12小時。接著，以5mL DCM將其稀釋並通過玻璃纖維膜過濾。將濾液在旋轉蒸發器中濃縮，再將其加入400mL之二乙醚中以沉澱產物。將混合物進行真空過濾，收集該固體產物(PEG2,32K-NHS)並將其在真空下，旋轉蒸發器中乾燥1小時。取得之活化度高於95%且回收之初始聚合物質量高於90%。
將6克之PEG2,32K-NHS加入在50mM硼酸鹽溶液，pH8.0中之含有1g rh EPO的溶液中，該溶液之初始濃度為5mg/mL。將反應物保持在4℃下2小時並緩慢地攪拌之。以50mM硼酸，pH8.0將反應物稀釋成最終蛋白質濃度為0.9mg/mL，以停止反應。如第1圖中所示，藉由SDS-PAGE凝膠光密度分析法(densitometry)測定反應產量。總回收率超過40%，聚乙二醇化之產物不到3%。
為了將rh EPO與PEG之共軛結合反應的產物分離出，亦即，將單聚乙二醇化之EPO從游離EPO和二聚乙二醇化之EPO分離出，設計藉由陰離子交換色層分析進行之純化方案。使用裝填12cm高之Q-Sepharose的柱進行該分離過程。將凝膠預先以22mL之0.2M氫氧化鈉淨化。然後，通過33mL之純水，稍後，再通過33mL之50mM硼酸，pH 8.0的平衡溶液。施放該來自共軛結合反應，在平衡溶液中稀釋成濃度為0.9mg/mL的樣本。使用氯化鈉濃度從0.175M增加至0.5M之相同的平衡緩衝液，依序洗提出含有該具有PEG2,32K-NHS之EPO共軛物(PEG2,32K-EPO)的樣本。體積流量為1.2mL/min且填充量為0.58mg之蛋白質/毫升凝膠。該過程之回收率為40%，純度為97%。
為了取得PEG2,40K-NHS，依照實施例1中描述的程序製備，但在與離胺酸反應的第二步驟中係使用PEG20K-SC。取得之總產量超過50%，取得之活化度高於90%。
將6克之PEG2,40K-NHS加入在50mM硼酸鹽緩衝液，pH8.0中，含有1g之rh EPO的溶液中，該溶液係初始濃度為5mg/mL。將反應物保持在4℃下2小時並緩慢地攪拌之。以50mM硼酸，pH8.0將反應物稀釋成蛋白質濃最終度為0.9mg/mL，以停止反應。如第2圖中所示，藉由SDS-PAGE凝膠光密度分析法測定反應產量。總回收率超過40%，聚乙二醇化之產物不到1%。
為了將EPO與PEG之共軛結合反應的產物分離出，亦即，將單聚乙二醇化之EPO從游離EPO和二聚乙二醇化之EPO分離出，設計藉由陰離子交換色層分析進行之純化方案。使用裝填12cm高之Q-Sepharose的柱進行該分離過程。將凝膠預先以22mL之0.2M氫氧化鈉淨化。然後，通過33mL之蒸餾水，稍後，通過33mL之50mM硼酸，pH 8.0的平衡溶液。施放來自該共軛結合反應，在平衡溶液中稀釋成濃度為0.9mg/mL的樣本。使用氯化鈉濃度從0.175M增加至0.5M之相同的平衡緩衝液，依序將該含有與PEG2,40K-NHS共軛結合之EPO(PEG2,40K-EPO)的樣本洗提出。體積流量為1.2mL/min且填充量為0.58mg之蛋白質/毫升凝膠。該過程之回收率為40%，所取得之純度為97%。
藉由在分光光度計中280nm處測量吸光率來測定共軛物的濃度。使用EPO之莫耳消光係數0.743計算蛋白質濃度。
使用高效液相色層分析(HPLC)泵及具有226nm濾波器之UV檢測器進行色層分析分離。施用質量為100μg之蛋白質。以Superdex-200基質進行色層分析。分析聚乙二醇化之EPO的兩種變異體(PEG2,32K-EPO及PEG2,40K-EPO)及未經修飾之EPO。
第3圖顯示出各變異體之估計的分子質量和所得之滯留時間之間的對應關係。藉著所具有之較短的滯留時間，PEG2,40K-EPO共軛物先洗提出，因為其具有較大之分子尺寸，然後PEG2,32K-EPO共軛物再洗提出，最後洗提出未經修飾之EPO。
藉由正常紅血球小鼠的方法完成聚乙二醇化之EPO效力測定。以每組三隻動物的比率為B6D2F1系(16-18克)之雌性，處女小鼠皮下接種0.2mL之PEG2,40K-EPO、PEG2,32K-EPO樣本的不同稀釋液(300、450及600IU/mL，相當於3、4.5和6μg/小鼠)、參考物質(為陽性對照組)和陰性對照組(僅稀釋液)。另外使用兩隻動
物，為其接種50mM硼酸鹽緩衝溶液，pH 8.0，以評估其毒性。接種後72小時，藉由眶後穿刺從每隻動物收集血液樣本，並存放於含有4μL肝素鈉(5000IU)的小瓶中。收集40μL來自周圍血液之樣本並與120μL由下列物質形成的溶液混合：0.3mM甲基藍溶液、1.29mM檸檬酸鈉、5mL生理鹽水及10mL蒸餾水。將其在37℃之水浴中培育1小時。之後，以由下列物質所組成之溶胞溶液處理6分鐘以進行選擇性溶血：0.08mM之EDTA四鈉；0.15mM之氯化銨；及9.98mM之碳酸氫鈉。以生理鹽水溶液過度稀釋來停止紅血球溶解，並在Neubauer室中目視計算網狀紅血球數。使用隨機設計之平行線和未知樣式進行數據處理及效力計算，以檢測在α=0.05之顯著性水準下，線性和平行性的有效性。所取得之數值必須符合歐洲藥典的規定，歐洲藥典中指出該假設項之計算出的效力比的數值(以百分比表示)應不低於80%，亦不超過125%，且該計算出之效力的置信極限應在64%和156%之間的範圍內。
第4圖中，該圖形可觀察到從網狀紅血球計數實驗直接取得之數據，該實驗中應用增加之EPO量，效力以IU測量。應用用於比較平均值之統計性Tukey-Kramer試驗，以分析體內活性數值。數據之統計分析證明數值之間沒有顯著差異(P<0.05)。聚乙二醇化之EPO和作為陽性對照組之未經修飾的EPO之間的生物活性中之差異係在該分折的變化範圍內(±50%)。
強調該用於執行分析之劑量的效力為300、450和600IU是很重要的。這些為已建立之用於檢測天然EPO的生物活性之劑量，然而使用Amgen公司之產品，MirceraTM(其為與分子質量30kDa之線性聚合物結構共軛結合的EPO(PEG1,30K-EPO))進行的分析需要效力為6000IU之最小劑量。然而，在本發明進行之測試中，藉由低20倍之劑量可檢測到該聚乙二醇化之EPO的體內生物活性。
為了證明不同PEG-EPO分子對由蛋白酶所引起之降解的抗性，進行體外實驗，在該體外實驗中係以胰蛋白酶分解聚乙二醇化之EPO及天然蛋白質(作為對照組)。兩種聚乙二醇化之EPO變異體均顯示出較天然EPO更強之對蛋白酶降解的抗性。第5圖中顯示作為對照組之EPO及該二個聚乙二醇化之變異體PEG2,32K-EPO和PEG2,40K-EPO的降解動力學結果。其中可以看出，該二個聚乙二醇化之EPO變異體顯現出較天然EPO更強之對降解的抗性。
經由比較未經修飾之EPO、PEG2,32K-EPO共軛物、PEG2,40K-EPO共軛物和PEG1,30K-EPO共軛物來進行藥物動力學研究。使用2公斤重之紐西蘭品種兔子。半衰期時
間(t½)、曲線下面積(縮寫為AUC)及平均滯留時間(縮寫為MRT)的結果顯示於表1中。
可觀察到所有聚乙二醇化之EPO具有較未經修飾之EPO更長的半衰期時間。PEG2,32K-EPO共軛物之半衰期時間較PEG1,30K-EPO共軛物之半衰期時間長得多(2.4倍)。考慮到二種共軛物顯現出非常相似之分子大小，此結果是令人意外的。此不對稱分支分子亦顯現出較PEG2,40K-EPO共軛物所具者更長的半衰期時間，該PEG2,40K-EPO共軛物亦具有分支且具有較高之分子量，此結果亦令人意外。
比較下列四種共軛物來進行此藥物動力學研究：PEG2,32K-EPO共軛物，其具有一個分子質量為12kDa的分支及另一分子質量為20kDa的分支；與不對稱PEG結構共軛結合的EPO，其具有一個分子質量為5kDa的分支及另一分子質量為7kDa的分支(PEG2,12K-EPO)；與具有二個各為7kDa之分支的對稱結構共軛結合之EPO共軛物(PEG2,14K-EPO)；及與分子質量為12kDa之線性
PEG共軛結合的EPO(PEG1,12K-EPO)。在此研究中，以類似於取得PEG2,32K-EPO共軛物之方式取得PEG2,12K-EPO共軛物，但使用具較低分子質量之mPEG。以類似於取得PEG2,40K-EPO共軛物之方式取得PEG2,14K-EPO共軛物，但使用具較低分子質量之mPEG。依實施例1開始時之描述活化分子質量為12kDa之mPEG來取得PEG1.12K-EPO共軛物，之後，依實施例2中之描述，進行與rh EPO的共軛結合。使用質量為2公斤之紐西蘭品種的兔子進行比較。結果顯示於表2中。本發明之共軛物(PEG2,32K-EPO)顯示出具有較其餘分析之共軛物更長的半衰期時間。
以類似於實施例6中之描述的方式測量該共軛物之生物活性。比較所取得之共軛物的結果：(1)PEG2,32K-EPO；(2)PEG2,12K-EPO；(3)PEG2,14K-EPO；及(4)PEG1,12K-EPO。使用未經修飾之rh EPO作為對照組。第6圖中可以看出本發明之共軛物(PEG2,32K-EPO)保持該未經修飾之蛋白質的生物活性，不像其餘分析之共軛物，其中該生物活性在聚乙二醇化時降低。
由於PEG為多分散且用於形成不對稱PEG、PEG2,32K結構的起始物質可能與12kDa和20kDa之分子質量的理論值有些不同，進行分子質量為29kDa(PEG2,29K-EPO)及35kDa(PEG2,35K-EPO)之具有PEG不對稱結構的EPO共軛物的藥物動力學研究。這些為形成部份本發明之EPO共軛物的PEG總分子質量之極限。以類似於PEG2,32K-EPO共軛物之方式取得PEG2,29K-EPO和PEG2,35K-EPO共軛物。使用質量為2kg之紐西蘭品種兔子。結果顯示於表3中。從表3中可以觀察到所研究之共軛結合的變異體之藥物動力學參數並無差異。
Claims (11)
- 一種包含紅血球生成素(erythropoietin)(EPO)和不對稱分支聚合物結構之共軛物，該不對稱分支聚合物結構包含二個單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分支，其中該mPEG分支的其中之一的分子質量係介於10kDa和14kDa之間，而mPEG之另一分支的分子質量係介於17kDa和23kDa之間。
- 如申請專利範圍第1項之共軛物，其中該mPEG分支的其中之一的分子質量為12kDa，而另一mPEG分支的分子質量為20kDa。
- 如申請專利範圍第1項之共軛物，其中該不對稱分支聚合物結構係以下列結構代表：
- 如申請專利範圍第3項之共軛物，其中該mPEG1分子質量為12kDa且該mPEG2分子質量為20kDa，或者該mPEG1之分子質量為20kDa且該mPEG2分子質量為12kDa。
- 如申請專利範圍第1至4項中任一項之共軛物，其中該EPO為重組之人EPO(rh EPO)。
- 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至5項中任一項之共軛物及醫藥上可接受之賦形劑。
- 一種用於取得聚乙二醇化之紅血球生成素(EPO)的方法，其中該蛋白質係與包含二個單甲氧基聚乙二醇(mPEG)分支的不對稱分支聚合物結構共軛結合，其中該mPEG分支的其中之一的分子質量係介於10kDa和14kDa之間，而mPEG之另一分支的分子質量係介於17kDa和23kDa之間。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該mPEG分支的其中之一的分子質量為12kDa，而另一mPEG分支的分子質量為20kDa。
- 如申請專利範圍第7項之方法，其中該不對稱分支聚合物結構係以下列結構代表：
- 如申請專利範圍第9項之方法，其中該mPEG1分子質量為12kDa且mPEG2分子質量為20kDa，或者該mPEG1分子質量為20kDa且mPEG2分子質量為12kDa。
- 如申請專利範圍第7至10項中任一項之方法， 其中EPO為重組之人EPO(rh EPO)。
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