KR20160105811A - 에리트로포이에틴을 포함하는 컨쥬게이트 및 분지형 폴리머 구조 - Google Patents

에리트로포이에틴을 포함하는 컨쥬게이트 및 분지형 폴리머 구조 Download PDF

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롤란도 파에즈 메이르레스
다니엘 엔리큐 아마로 곤잘레스
피델 라울 카스트로 오디오
예니셀 에르난데스 발데스
글라디스 아말리아 루이즈 에스트라다
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센트로 데 인제니에리아 제네티카 와이 바이오테크놀로지아
센트로 데 인뮤놀러지아 모레큘러
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Abstract

본 발명은 에리트로포이에틴(EPO), 및 모노메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG)의 2개 분지를 포함하는 비대칭 분지형 폴리머 구조를 포함하는 컨쥬게이트로서, mPEG의 분지중의 하나의 분자 질량이 10 kDa 내지 14 kDa이고, mPEG의 다른 분지의 분자 질량이 17 kDa 내지 23 kDa인 컨쥬게이트, 및 이를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 페길화 EPO의 제조방법으로서, 상기 단백질이 상기 기재된 분자 질량을 갖는 2개 분지의 mPEG를 갖는 비대칭 분지형 폴리머 구조에 컨쥬게이트화되는 방법을 제공한다.

Description

에리트로포이에틴을 포함하는 컨쥬게이트 및 분지형 폴리머 구조{CONJUGATE COMPRISING ERYTHROPOIETIN AND A BRANCHED POLYMER STRUCTURE}
본 발명은 생물 공학, 생명 과학 및 제약업 분야, 특히 약동학을 향상시키고, 혈중 반감기 및 생물학적 활성을 증가시키기 위한 분자 개질에 관한 것이다.
인간의 치료를 위한 생체 분자의 사용은, 주로 (1) 새로운 단백질 및 펩티드 분자의 발견, (2) 생체 내 작용의 메커니즘에 대한 더 좋은 이해, (3) 단백질 및 펩티드 합성의 발현 시스템에 대한 개선 및 (4) 약역학적 및 약동학적 특성을 증강시키는 제형 또는 분자 개질 기술의 향상으로 인하여, 최근 수년 내에 증가되어 왔다.
개질된 약물 전달 분야의 기술적 발달은 치료제의 약역학적 및 약동학적 특성을 향상시키는 목적으로, 주사 가능한 약물의 방출을 변경하는 다수의 시스템의 도입을 가능하게 하였다. 새로운 약물 전달 시스템은 제형의 변화 (예를 들어, 연속적인 생성물 방출 또는 리포좀), 또는 약물 분자에 첨가, 예컨대 약물을 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 하나 이상의 분자에 단지 공유결합시키는 것인 페길화에 의해 제조할 수 있다.
새로운 형태의 방출은 반감기 증가, 부작용 감소, 약물 효능 증가, 및 환자의 삶의 질 향상을 유도한다. 연속 방출 시스템은 제어되고 미리 결정된 방식으로 약물을 방출하고, 혈장 농도의 큰 변동을 피하는 것이 중요한 약물에 특히 적합하다.
생분해성 마이크로스피어를 사용하는 분자의 전신 방출은 분해, 및 연장 또는 변형 방출에 민감한 단백질의 보호로 인하여 광범위하게 연구되어 왔다(Sinha, V.R. and Trehan, A. (2003). Biodegradable microspheres as protein delivery, J. Controlled Release, 90 (3): 261-280).
페길화는 생체 분자의 많은 약리학적 한계들을 최소화하기 위한 치료 단백질의 개질 방법을 제공한다. 예를 들어, 혈중 반감기는 다음을 포함하는 여러 가지 이유 때문에 증가한다: 폴리머의 잔기가 면역계에 의한 약물의 프로테아제 공격 및 인지를 막을 수 있고, 천연 단백질 대비 컨쥬게이트의 유의적으로 더 높은 유체 역학적 부피가 신장에 의한 여과를 유의적으로 감소시킨다. 비록 많은 경우에 단백질의 시험관 내 생물학적 활성은 페길화에 의해 영향을 받는다; 혈액 수명시간의 실질적인 증가는 이의 치료 작용을 더욱 유효하게 만든다(Harris J.M. and Chess R.B. (2003) Effect of pegylation on pharmaceuticals Nat Rev Drug Discov 2:214-221).
페길화의 또 다른 이점은 물리적 안정성의 증가이며, 이것은 소수성 상호작용에 의해 유도되는 분해 경로를 입체적으로 차단하고 단백질의 열 불안정성에 관련된 분자간 상호작용을 감소시키는 비특이적 입체 장애를 발생시키기 때문이다. 물리적 안정성 증가는 더욱 안정한 제형을 허용한다(Harris J.M. and Chess R.B. (2003) Effect of pegylation on pharmaceuticals Nat Rev Drug Discov 2:214-221).
2세대의 활성화된 PEG의 출현에 따라, 더욱 선택적인 페길화 (예를 들어: 단백질의 N-말단 끝에 우선적으로 결합하는 알데하이드기) 및 분지형 구조(Roberts M.J., Bentley M.D., Harris J.M. (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation Adv Drug Deliv Reviews. 54:459-476)를 허용한 기들이 이용가능하게 되었다. 개발된 분지형 PEG는 이분지형 단일작용기(미국특허 제5932462호), 사분지형 사작용기, 및 팔분지형 팔작용기를 포함한다. 치료 단백질의 컨쥬게이트화에서는 단일작용성 활성화된 PEG가 더욱 유용한데, 그 이유는 이들이 단백질과 PEG 폴리머 간의 가교를 회피하기 때문이다. 또한 분지형 PEG는 우산 타입 효과를 가지며, 이것은 단백질 표면의 더 양호한 보호를 가능하게 한다.
이분지형 단일작용기의 PEG는 천연 단백질보다 더 우수한 임상 결과를 나타내는 컨쥬게이트화 알파-2a 인터페론을 얻는 것이 가능하였다(Rajender Reddy K., Modi M.W., Pedder S. (2002). Use of peginterferon alfa -2a (40 KD) (Pegasys) for the treatment of hepatitis C. Adv Drug Deliv Reviews. 54:571-586).
재조합 인간 에리트로포이에틴(EPO), (rh EPO)을 포함하여, 다양한 개질된 방출 기술이 적용된 다수의 단백질에 대한 보고들이 있다. EPO는 165개의 아미노산을 갖는 당단백질이다. 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법(SDS-PAGE로 약칭됨)을 사용한 이의 예상 분자량은 이의 글리코실화 정도에 따라 27 내지 39 kDa이다 (Mikaye, T. et al. (1977). Purification of Human erythropoietin J Biol Chem 252:5558-5564).
실험에서, 저산소증 자극을 제거함으로써; EPO 전령 리보핵산(mRNA)이 혈액 중에서 급속하게 감소하고 3시간째에 검출할 수 없다는 것이 입증되었으며, 이것은 이의 반감기가 짧다는 것을 나타낸다(Lacombe, C. et al (1988) Peritubular cells are the site of erythropoietin synthesis in the murine hypoxic kidney J. Clin Invest 81:620-623; Koury, S.T. et al. (1989) Quantitation of erythropoietin producing cells in kidneys of mice by in situ hybridation: Correlation with hematocrit, renal erythropoietin mRNA and serum erythropoietin concentration. Blood 74:645-651). 혈장 중 EPO 반감기는 4 내지 13시간 범위인 것으로 예상되었으며; 치료적 용도의 다른 분자와 비교했을 때, 이 시간은 매우 짧다. 이는 규칙적인 호르몬 사용을 필요로 하는 환자가 정상에 가까운 적혈구 수준을 유지하기 위하여 자주 주사를 맞아야만 하는 원인이 된다(Spivak, J.L. 1992 The mechanism of action of erythropoietin: Erythroid cell response. In J.W. Fisher (Ed.) Biochemical Pharmacology of Blood and Blood-Forming Organs Springer-Verlag Berlin Handbook of Experimental Pharmacology 101: 49-114; Jelkmann, W. (1986) Renal Erythropoietin: Properties and Production Rev Physiol Biochem Pharmacol 104:139-205).
rh EPO의 반감기를 증가시키기 위한 목적으로, N-글리코실화의 부위를 증가시키도록 분자에 대한 변형을 수행하였며(Burke, Paul (2003). Device for the sustained release of aggregation-stabilized, biologically active agent. 미국특허출원 제20030133979호), 마이크로스피어 내에서 캡슐화하고(Morlock M, et al (1998). 생분해성 LPLG-PEO-LPLG 트리블록 공중합체로부터 제조된 에리트로포이에틴 부하된 마이크로스피어: 단백질 안정화 및 in- vitro 방출 특성. J Control Release, 56 (1-3): 105-115) 또한 리포좀 내에서 캡슐화하였으며(Moriya H, et al. (1997). 정맥내 및 피하 투여 후 유리 및 리포좀 재조합 인간 에리트로포이에틴의 약동학적 및 약리학적 프로파일. Pharm Res 14 (11): 1621- 1628), 수득된 rh EPO 이량체가 이의 생물학적 활성을 증가시키는 것으로 보고되었다(Bruno D., et al (2001). Dimeric erythropoietin fusion protein with enhanced erythropoietic activity in vitro and in vivo. Blood, Vol. 97, No. 12, 3776-3782).
임상에서 최고의 결과를 갖는 개질 중의 하나는 폴리머로 rh EPO를 화학적으로 결합시키는 것이다 (Jolling K. et al. (2005). Mixed-Effects Modelling of the Interspecies Pharmacokinetic Scaling of Pegylated Human Erythropoietin. Eur J Pharm Sci ; 24: 465-475). 이러한 rh 페길화 EPO의 개발에서 발견된 어려움은, 모노페길화 및 비페길화 종의 형성으로 인한, 컨쥬게이트화 공정의 낮은 수율이었으며, 후자는 상기 공정의 오염물질에 해당한다.
상기 언급된 바를 고려할 때, 비개질된 분자 이상의 치료적 이점을 제공하는, EPO와 폴리머의 새로운 컨쥬게이트를 얻는 것에 관심이 있다.
본 발명은 EPO, 및 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)의 2개 분지를 포함하는 비대칭 분지형 폴리머 구조를 포함하는 컨쥬게이트로서, mPEG의 분지중의 하나의 분자 질량이 10 kDa 내지 14 kDa이고, mPEG의 다른 분지의 분자 질량이 17 kDa 내지 23 kDa인 컨쥬게이트를 제공함으로써, 상기 기술된 문제를 해결한다.
이러한 방식으로, 본 발명은 파파디미트리우(Papadimitriou)(미국특허 제7202208호)에 의해 사용된 것과 유사한 분자 크기를 갖는 단일작용성 분지형 PEG 구조를 포함하는 컨쥬게이트를 제공하나, 상이한 분자 질량의 2개의 PEG 가닥 구조를 이용한다. 이러한 대체물은, 예기치 않게, 약물에 새로운 이점을 부여한다. 본 발명의 컨쥬게이트에서, 이분지형 PEG 폴리머 구조의 전체 분자 질량은 27 내지 37 kDa이다. 본 발명의 일 실시형태에서, mPEG1의 분자 질량은 12 kDa이고 mPEG2의 분자 질량은 20 kDa이다.
지정된 분자 질량을 갖는, 선형 PEG 사슬 대신에, 비대칭 분지형 PEG 사슬을 사용하는 것은 비페길화 오염 물질의 형성을 감소시키고, 분자의 반감기 및 이의 물리화학적 안정성을 예기치 않게 유의적으로 증가시켰다.
또 다른 예기치 않은 결과는 비대칭 분지형 단일작용성 PEG로 페길화된 분자의 생물학적 활성이 온전하게 유지되었다는 점이었다. 페길화에 의해 야기된 생체 분자의 생물학적 활성의 손실은 문헌에 광범위하게 보고되어 왔다(Harris JM and Chess RB (2003) Effect of pegylation on pharmaceuticals Nat Rev Drug Discov 2:214-221).
2개 비대칭 분지를 갖는 단일작용성 PEG는 코어에 상이한 분자 크기를 갖는 2개의 선형 PEG 사슬을 결합시켜 얻는다. 유사한 방법은 우수한 결과로 다른 발명자에 의해 사용되었다(미국특허 제5932462호). 코어에 2개의 선형 PEG 사슬을 결합시키기 위하여 이들은 활성 기를 가져야 할 필요가 있다. 이러한 기는 당업계에 알려져 있는 다양한 기로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 이러한 활성 기는 그 중에서도 숙신이미딜 숙시네이트, 숙신이미딜 카보네이트, p-니트로페닐카보네이트, 숙신이미딜 프로파노에이트, 숙신이미딜 부타노에이트일 수 있다. 본 발명에서 바람직하기로, 선형 PEG는 숙신이미딜 카보네이트로 활성화된다. 이것은 다음의 2가지 주요 원인으로 기인한다: a) 이것과 아미노기 사이의 반응의 우수한 수율 및 b) 이러한 작용화된 PEG를 얻기 위한 공정의 용이성. 이러한 작용화된 PEG를 얻는 공정은 당해 기술분야의 업자에게 알려져 있다 (Miron T, Wilchek M. (1993). A Simplified Method for the Preparation of Succinimidyl Carbonate Polyethylene Glycol for Coupling to Proteins. Bioconjugate Chem. 4:568-569). 일단 선형 PEG가 활성화되면, 이어서 선택된 코어 분자와 반응하는 것이 가능하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 코어는 L-라이신이며, 이것은 이후에 활성화되는데 사용될 수 있는 2개의 유리 아미노기와 카르복실기를 갖는, 생체적합성 분자이기 때문이다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, EPO는 하기 화학식으로 표시되는 비대칭 분지형 폴리머 구조에 결합된다:
Figure pct00001
특별한 실시형태에서, 컨쥬게이트의 형성 부분인 상기 폴리머 구조에서, mPEG1 분자 질량이 12 kDa이고 mPEG2 분자 질량이 20 kDa이거나, 또는 mPEG1의 분자 질량이 20 kDa이고 mPEG2 분자 질량이 12 kDa이다.
2개의 비대칭 분지의 유도체는 크로마토그래피 방법을 사용하여 정제하고, 이어서 생체 분자에 컨쥬게이트화 하기 위한 상이한 반응성 기를 사용하여 활성화할 수 있다. 다른 PEG 구조의 활성화를 위해 사용되는 임의의 작용기가 본 발명에 기재된 비대칭 분지형 PEG를 위해 사용될 수 있다. 이들 작용기의 예로는 그 중에서도 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, 다양한 유형의 알데히드, 말레이미드가 있다. 단백질에 상기 구조를 결합할 수 있게 하는 또 다른 유형의 작용기는 킬레이트 기, 예컨대 니트릴로트리아세테이트가 있으며, 이것은 전이금속에 의하여 펩티드 골격에 존재하는 히스티딘에 결합될 수 있다. 사용되는 반응성기의 선택은 PEG가 결합되는 단백질의 잔기에 의존한다.
후앙(Huang)에 의해 출원된 특허출원(유럽특허공개 제1479711 A1호)의 실시예에서는, PEG 분지형 구조가 각각의 분지에서 상이한 분자 질량을 갖는 것을 나타내고 잇으나; 분지의 분자 크기가 본 발명보다 더욱 작다. 유럽특허공개 제1479711 A1호에서, 발명자는 컨쥬게이트의 생물학적 활성이 비개질된 약물의 생물학적 활성에 대해 감소한다는 것을 제안한다. 그러나 본 발명에서, 예기치 않게, 27 내지 37 kDa의 전체 분자 질량의, 2개의 비대칭 분지를 갖는 단일작용기 PEG와 컨쥬게이트화된 EPO의 생물학적 활성은 비개질된 EPO와 유사하였다. 다른 한편으로, 본 발명에서는, 후앙에 의해 출원된 특허출원에 따른, 더욱 낮은 분자 질량을 갖는, 2개의 분지를 갖는 PEG 구조의 반감기가 본 발명의, 각각 12 kDa 및 20 kDa의 2개의 분지의 PEG와의 EPO 컨쥬게이트의 반감기 시간보다 더욱 짧은 것으로 나타났다.
본 발명에서 얻어진 이러한 결과는 예기치 않은 것이었다. 비대칭 폴리머 구조(PEG2,32K)를 포함하는 컨쥬게이트 때문에, 생물학적 활성을 제한하지 않는 분자의 공간 분포가 폴리페길화 생성물의 형성을 감소시키는 컨쥬게이션 반응을 향상시키고, 달성되는 약동학적 파라미터를 유의적으로 향상시킨다. 이것은 이를 필요로 하는 사람을 위한 치료 용량의 감소를 가능하게 한다.
본 발명의 비대칭의 2개의 분지형 PEG 구조를 얻기 위한 기본적인 원료는 12 kDa mPEG (12K PEG) 및 20 kDa mPEG (20K PEG)이다. PEG가 다분산 폴리머이기 때문에, 이들 mPEG의 분자량은 제조사에 의해 규정된 범위를 갖는다. 예를 들어, 제조사 중의 하나에 의해 명시된 바와 같이, 다분산도가 1.1% 미만이어야 한다. 이러한 경우에, 제조사에 의해 보고된 분자량 범위는 12K PEG는 12.0 ± 1.2 kDa이고; PEG 20K는 20.0 ± 2.0 kDa이었다.
PEG 초기 물질의 각각의 배치 간의 이러한 분자량 차이가 약동학적 결과에 영향을 주는지 여부를 결정하기 위하여, 명세의 극값에 해당하는 분자량을 갖는 PEG의 배치를 사용한 실험(실시예 11)을 수행하였다. 11 kDa 분자량을 갖는 12K PEG 및 18 kDa 분자량을 갖는 20K PEG가 29 kDa 전체 분자량의 2개의 분지형 PEG 구조를 갖는 EPO 컨쥬게이트(PEG2,29K-EPO)를 형성하기 위해 사용되었다. 또한, 13 kDa 분자량을 갖는 12K PEG 및 22 kDa 분자량을 갖는 20K PEG가 35 kDa 전체 분자량의 2개의 분지형 PEG 구조를 갖는 EPO 컨쥬게이트(PEG2,35K-EPO)를 형성하기 위해 사용되었다. 그 결과 약동학적 파라미터가 12K PEG 및 20K PEG의 상이한 초기 배치가 사용된 경우 유사한 것으로 나타났다. 따라서, PEG2 ,29K-EPO 및 PEG2 ,35K-EPO 구조에 의해 형성된 컨쥬게이트는, 하나는 12 kDa이고 다른 하나는 20 kDa인 2개의 분지형 PEG와 EPO의 컨쥬게이트(PEG2,32K-EPO)인, 제조사에 의해 표시된 이론적 중량을 갖는 구조에 의해 형성된 것과 실질적으로 동일한 것으로 고려된다.
활성화된 PEG를 사용한 단백질의 컨쥬게이션은 적절한 버퍼 내에서 수행한다. 버퍼의 특징은, 다른 인자들 중에서도, 폴리머의 작용기 및 컨쥬게이션의 목적에 따라 달라진다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 에스테르로서 작용화된 PEG를 사용한 자유 아미노기에 의한 컨쥬게이션을 원하는 경우, 컨쥬게이션 부위는 컨쥬게이션 반응의 pH에 따라, 어느 정도는 예측할 수 있다. 8.0 내지 9.0의 pH는 라이신의 ε-아미노기에 의한 컨쥬게이션을 촉진한다.
컨쥬게이트를 얻은 후, 이는 다양한 기법을 사용하여 특징화된다. 컨쥬게이트의 화학적, 물리적 및 생물학적 특성들은 정제된 컨쥬게이트의 가능한 완전한 특징화를 달성하기 위하여 분석된다. 예를 들어, PEG 잔기가 실질적으로 단백질의 몰 흡광계수에 영향을 주지 않기 때문에, 컨쥬게이트의 농도는 일반적으로 자외선 분광법(280 nm 흡광도)으로 측정할 수 있다. 겔여과 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법이 목적한 컨쥬게이트 및 오염물질에 해당하는 신호를 잘 식별하지 못하기 때문에, 정제된 생성물의 순도는 SDS-PAGE로 결정하는 것이 바람직하다. 다른 물리화학적 특성들은 당업자에게 알려진 일반적인 방법들로 조사할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 에리트로포이에틴(EPO)은 생물학적 활성을 유지하는 EPO 분자의 임의의 변형; 예를 들어, 절단형 분자(truncated molecule)를 언급한다. EPO는, 기술분야에 숙련된 자에게 공지된 발현 및 정제 시스템을 사용하여, 재조합 데옥시리보핵산(DNA) 기술로 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시형태에서, 컨쥬게이트는 rh EPO를 포함한다. 또한 본 발명의 컨쥬게이트는 종래 기술의 임의의 방법, 예컨대 아미노산 치환으로 개질된 후, 상기 기술된 방법으로 수득된 EPO의 임의의 변형을 포함한다.
또한, 본 명세서에 기술된 임의의 PEG-EPO 컨쥬게이트 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본 발명의 목적이다.
본 발명의 또 다른 양태는 페길화된 EPO를 얻는 방법이며, 여기서 상기 단백질이 2개의 mPEG 분지를 포함하는 비대칭 분지형 폴리머 구조에 컨쥬게이트화되고, 여기서 mPEG 분지 중 하나의 분자 질량은 10 kDa 내지 14 kDa이고, mPEG의 다른 분지의 분자 질량은 17 kDa 내지 23 kDa이다. 본 발명의 방법을 통해, 비컨쥬게이트형 EPO 반감기와 비교하여, 단백질이 투여되는, 포유동물의 혈중 EPO 반감기의 증가가 일어난다. 따라서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상에게 투여되는 용량을 감소시키는 목적을 위하여, 단백질의 약동학을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 맥락에서, EPO 약동학적 파라미터의 향상은 상기 단백질의 반감기 및/또는 평균 체류 시간의 증가로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 분자의 반감기를 증가시키기 위하여, EPO 분자를 화학적으로 개질하는 방법을 개시하며, 여기서 단백질이 2개의 mPEG 분지를 포함하는 비대칭 분지형 폴리머 구조에 컨쥬게이트화되고, 여기서 mPEG 분지 중 하나의 분자 질량은 10 kDa 내지 14 kDa이고, mPEG의 다른 분지의 분자 질량은 17 kDa 내지 23 kDa이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 비대칭 분지형 폴리머 구조의 mPEG 분지 중 하나의 분자 질량은 12 kDa이고 다른 mPEG 분지의 분자 질량은 20 kDa이다. 본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 방법의, EPO에 컨쥬게이트화되는 비대칭 분지형 폴리머 구조는 다음과 같다:
Figure pct00002
본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에서, EPO에 컨쥬게이트화되는 비대칭 분지형 폴리머 구조에 있어서, mPEG1 분자 질량은 12 kDa이고 mPEG2 분자 질량은 20 kDa이거나, 또는 mPEG1 분자 질량은 20 kDa이고 mPEG2 분자 질량은 12 kDa이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법에서, EPO는 rh EPO이다.
도 1. PEG2 ,32K와 EPO의 결합 반응의 생성물에 대한 SDS-PAGE 이중 염색(쿠마씨 브릴리언트 블루 및 요오드) 결과. 샘플 1은 EPO 양성 대조군에 해당하고 샘플 2는 PEG2,32K와 EPO의 결합 반응의 생성물에 해당한다.
도 2. PEG2 ,40K와 EPO의 결합 반응의 생성물에 대한 SDS-PAGE 이중 염색(쿠마씨 브릴리언트 블루 및 요오드) 결과. 샘플 1은 EPO 양성 대조군에 해당하고 샘플 2는 PEG2,40K와 EPO의 결합 반응의 생성물에 해당한다.
도 3. 다양한 PEG-EPO 컨쥬게이트를 평가하기 위한 겔 여과 크로마토그래피로 수득한 크로마토그램.
도 4. 정적혈구성 마우스의 방법으로 측정된 천연 EPO 및 모노페길화 EPO의 생체 내 생물학적 활성.
도 5. 컨쥬게이트 PEG2 ,32K -EPO, PEG2 ,40K-EPO 및 비개질 EPO의 트립신 분해 분석으로 수득한 결과. 분해 동역학 이후 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 6. 정적혈구성 마우스의 방법으로 측정된, 다양한 PEG-EPO 컨쥬게이트 및 비개질 EPO의 생물학적 활성.
실시예 1. N - 히드록시숙신이미드 에스테르로서 활성화된 PEG의 제조
mPEG 20K - OH의 활성화 반응
활성화하지 않은 20 kDa 분자량의 mPEG(mPEG20K-OH) 50 그램을 3시간 동안 450 mL의 톨루엔 중에서 공비적으로 건조시켰다. 상기 시간 이후에, 200 mL의 용매를 제거하고 상기 용액을 상온으로 냉각시켰다. 이어서, 60 mL의 건조 디클로로메탄(DCM)을 공용매로서 첨가하였다. 디숙신이미딜 카보네이트(4.9 g)를 칭량하고 40 mL의 디메틸포름아미드 중에 용해시켰다. 상기 용액을, mPEG20K-OH를 함유하는 플라스크에 첨가하였다. 디메틸아미노피리딘(2.5 g)을 칭량하고 20 mL의 DCM 중에 용해시켰다. 상기 용액을, mPEG20K-OH를 함유하는 플라스크에 첨가하고 교반을 시작하였다. 이를 상온에서 하룻밤 반응시켰다.
상기 반응 혼합물을 유리섬유막을 사용하여 여과하여 고체 생성물을 제거하였다. 여과액을 1.5 L의 건조 디에틸 에테르로 침전시키고 진공 하에 여과하였다. 침전물을 진공으로 수집하고, 4시간 동안 고진공 하에 건조시키고 -20℃에서 보관하였다. mPEG20K-OH의 초기 질량 중에, 96%가 96.0 ± 0.8%의 활성화도를 갖는 PEG 숙신이미딜 카보네이트(PEG20K-SC)로서 회수되었다.
mPEG 12K - OH의 활성화 반응
mPEG20K-OH의 활성화 반응에 사용된 동일한 과정을 수반하였으나, 이 경우에는 분자량 12 kDa의 비활성화 mPEG(mPEG12K-OH)를 출발 원료 물질로서 사용하였다.
PEG 20K -SC 및 PEG 12K -SC와 L - 라이신의 반응
L-라이신(9.1 g)을 칭량하고 30 mL의 0.1 M 붕산 중에 용해시켰다(pH 8.0). 20 그램의 PEG20K-SC를 붕산 중의 L-라이신 용액 15 mL에 첨가하였다. 상기 용액을 12시간 동안 교반 하에 두었다.
이어서, 상기 반응 혼합물을 300 mL의 증류수로 희석시키고 염산 용액의 혼합물을 사용하여 pH 3.5로 조정하였다. 상기 혼합물을 분액 깔대기로 옮기고, 여기에 100 mL의 DCM을 첨가하였다. 이를 손으로 교반하고 하부 상(유기 상)을 제거하였다. 전체 5번의 추출을 수행하였다. 20 그램의 소듐 설페이트를 유기 상을 함유하는 병에 첨가하고 상기 상이 전체적으로 맑아질 때까지 손으로 교반하였다. 이를 유리섬유막을 사용하여 진공 여과하였다. 여과액을 회전 증발기 상에서 가능한 최대로 농축시켰다. 이어서, 500 mL의 디에틸 에테르를 첨가하고 손으로 교반하여 생성물을 침전시켰다. 이를 진공 여과하고 생성물(20K 모노페길화 L-라이신)을 회전 증발기 내에서 진공 하에 1시간 동안 건조시켰다.
두 번째 반응 단계에서, 9 g의 PEG12K-SC를 15 g의 20K 모노페길화 L-라이신에 첨가하였다. 반응물을 215 mL의 DCM 중에 용해시키고 0.14 mL의 트리에틸아민을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 유리섬유막을 사용하여 진공 여과하였다. 여과액을 회전 증발기 상에서 최대로 농축시켰다. 이어서, 300 mL의 디에틸 에테르를 첨가하고 2분 동안 손으로 교반하여 생성물을 침전시켰다. 이를 진공 하에 여과하고 수득된 생성물(2개의 비대칭 분지를 갖는 PEG, 하나는 12 kDa이고 다른 하나는 20 kDa임(PEG2 ,32K-COOH))을 회전 증발기 내에서 진공 하에 1시간 동안 건조시켰다. 상기 과정의 전체 수율은 70%이상이었다.
PEG 2 ,32K - COOH의 정제
PEG2 ,32K-COOH의 정제를 40 mL/min의 체적 흐름을 사용하여, 80 cm 높이의 DEAE-세파로즈 컬럼 내에서 수행하였다. 겔을 0.2 M 소듐 하이드록사이드의 4.5 L의 용액으로 미리 살균하였다. 컬럼을 50 mM 붕산 용액으로 평행화하였다(pH 9.0). 이어서, 컬럼을 5 L의 증류수로 세척하였다. 물 중에 용해된 PEG2 ,32K-COOH 샘플을 물의 전도도 이상인 40 mS/cm의 전도도로 적용하였다. 샘플을 적용한 후에, 컬럼을 3 L의 정제수로 세척하였다. 샘플 용리를 10 mM 소듐 클로라이드의 5 L 용액으로 수행하였다. 500 mL의 분획을 수집하였다. 이어서, 컬럼을 1M 소듐 클로라이드의 3 L 용액으로 재생시켰다. 상기 과정으로부터 회수된 전체 수율은 95% 이상이고, 90% 이상의 순도를 가졌다.
N - 히드록시숙신이미드의 에스테르로서 분지형 활성화된 PEG ( PEG 2 ,32K - NHS )의 제조
1 그램의 PEG2 ,32K-COOH를 DCM 중에 용해시키고; 0.01 g의 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 0.02 g의 디시클로헥실카보디이미드를 첨가하였다. 반응 혼합물을 12 시간 동안 교반하였다. 이어서, 이를 5 mL의 DCM으로 희석시키고 유리섬유막을 통해 여과하였다. 여과액을 회전 증발기 상에서 농축시키고 400 mL의 디에틸 에테르에 첨가하여 생성물을 침전시켰다. 상기 혼합물을 진공 여과하고 고체 생성물(PEG2,32K-NHS)을 수집한 후 회전 증발기 내에서 진공 하에 1시간 동안 건조시켰다. 95% 이상의 활성화도 및 90% 이상의 초기 폴리머 질량의 회수율을 달성하였다.
실시예 2. PEG 2 ,32K - NHS로 컨쥬게이트화 된 EPO의 제조
컨쥬게이션 반응
6 그램의 PEG2 ,32K-NHS를, 50 mM 붕산염 용액(pH 8.0) 중의 5 mg/mL의 초기 농도의 1 g의 rh EPO 함유 용액에 첨가하였다. 반응을 서서히 교반하면서 4℃에서 2시간 동안 유지하였다. 반응을 50 mM 붕산(pH 8.0)으로 0.9 mg/mL의 최종 단백질 농도로 희석시켜 중단시켰다. 반응 수율을 도 1에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 겔의 농도계측법으로 측정하였다. 전체 회수율은, 폴리페길화 생성물의 3% 미만으로, 40%보다 컸다.
모노페길화 EPO의 정제
PEG와 rh EPO의 컨쥬게이션 반응의 생성물을 분리하기 위하여, 즉 유리 EPO 및 비페길화 EPO로부터 모노페길화 EPO를 분리하기 위하여, 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제 플랜을 설계하였다. 분리 과정을 12 cm 높이의 Q-세파로즈로 충진된 컬럼을 사용하여 수행하였다. 겔을 22 mL의 0.2 M 소듐 하이드록사이드로 미리 살균하였다. 이어서, 33 mL의 정제수를 통과시키고 이후 33 mL의 50 mM 붕산(pH 8.0)의 평형 용액을 통과시켰다. 0.9 mg/mL의 농도로 평형 용액으로 희석시킨, 컨쥬게이션 반응의 샘플을 적용하였다. PEG2 ,32K-NHS와의 EPO 컨쥬게이트(PEG2,32K-EPO)를 함유하는 샘플의 용리를, 0.175 M로부터 0.5 M의 소듐 클로라이드의 증가 농도로 동일한 평형 버퍼를 사용하여 연속적으로 수행한다. 체적 흐름은 1.2 mL/min이었고 부하(load)는 0.58 mg의 단백질/겔의 mL이었다. 상기 공정 회수율은 40%이었고 순도는 97%이었다.
실시예 3. N - 히드록시숙신이미드 에스테르로서 분지형 활성화된 PEG ( PEG 2 ,40K - NHS) 의 제조
PEG2 ,40K-NHS를 수득하기 위하여, 실시예 1에 기재된 과정을 수반하였으나, 라이신과의 반응의 두 번째 단계에서, PEG20K-SC를 사용하였다. 90% 이상의 활성화와 50% 이상의 전체 수율을 달성하였다.
실시예 4. PEG 2 ,40K - NHS와 컨쥬게이트화된 EPO의 제조
컨쥬게이션 반응
6 그램의 PEG2 ,40K-NHS를, 50 mM 붕산염 용액(pH 8.0) 중의 5 mg/mL의 초기 농도의 1 g의 rh EPO 함유 용액에 첨가하였다. 반응을 서서히 교반하면서 4℃에서 2시간 동안 유지하였다. 반응을 50 mM 붕산(pH 8.0)으로 0.9 mg/mL의 최종 단백질 농도로 희석시켜 중단시켰다. 반응 수율을 도 2에 나타낸 바와 같이, SDS-PAGE 겔의 농도계측법으로 측정하였다. 전체 회수율은, 폴리페길화 생성물의 1% 미만으로, 40%보다 컸다.
모노페길화 EPO의 정제
PEG와 rh EPO의 컨쥬게이션 반응의 생성물을 분리하기 위하여, 즉 유리 EPO 및 비페길화 EPO로부터 모노페길화 EPO를 분리하기 위하여, 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 정제 플랜을 설계하였다. 분리 과정을 12 cm 높이의 Q-세파로즈로 충진된 컬럼을 사용하여 수행하였다. 겔을 22 mL의 0.2 M 소듐 하이드록사이드로 미리 살균한 다음; 33 mL의 정제수를 통과시키고 이후 33 mL의 50 mM 붕산(pH 8.0)의 평형 용액을 통과시켰다. 0.9 mg/mL의 농도로 평형 용액으로 희석시킨, 컨쥬게이션 반응의 샘플을 적용하였다. PEG2 ,40K-NHS와의 EPO 컨쥬게이트(PEG2,40K-EPO)를 함유하는 샘플의 용리를, 0.175 M로부터 0.5 M의 소듐 클로라이드의 증가 농도로 동일한 평형 버퍼를 사용하여 연속적으로 수행하였다. 체적 흐름은 1.2 mL/min이었고 부하는 0.58 mg의 단백질/겔의 mL이었다. 상기 공정 회수율은 40%이었고 97%의 순도가 얻어졌다.
실시예 5. 페길화 EPO의 물리화학적 특징화
컨쥬게이트 농도의 결정
컨쥬게이트 농도는 분광광도계로 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 단백질 농도의 계산은 EPO에 대한 0.743의 몰흡광계수를 사용하여 수행하였다.
겔 여과 크로마토그래피에 의한 특징화
크로마토그래피적인 분리를, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프 및 226 nm 필터를 구비한 UV 검출기를 사용하여 수행하였다. 적용 질량은 100 ㎍의 단백질이었다. 크로마토그래피는 슈퍼덱스-200 매트릭스로 수행하였다. 페길화 EPO의 2개의 변형(PEG2,32K-EPO 및 PEG2,40K-EPO) 및 비개질된 EPO를 분석하였다.
도 3은 각각의 변형에 대한 예측 분자 질량과 얻어진 체류 시간 간의 일치를 보여준다. 체류 시간이 더 짧은 경우에, PEG2,40K-EPO 컨쥬게이트는 더 큰 분자 크기를 갖기 때문에 용리되었으며, 이어서 PEG2 ,32K-EPO 컨쥬게이트가 용리되고 마지막으로 비개질 EPO가 용리되었다.
실시예 6. PEG 2 ,32K -EPO 컨쥬게이트의 생물학적 특징화
페길화 EPO 효능의 측정은 정적혈구성 마우스의 방법으로 수행하였다. B6D2F1 라인(16-18 g) 암컷의 처녀종 마우스에, 그룹 당 3마리의 동물의 비율로 PEG2,40K-EPO, PEG2 ,32K-EPO, 기준 물질(양성 대조군으로서) 및 음성 대조군(희석제 단독)의 샘플의 0.2 mL의 다양한 희석액(300, 450 및 600 IU/mL, 3, 4.5 및 6 ㎍/마우스 당량)을 피하로 접종하였다. 2마리의 동물을 추가로 사용하여, 이의 독성을 평가하기 위하여, 50 mM 붕산염 버퍼(pH 8.0)의 용액을 접종하였다. 접종 72시간 후에, 혈액 샘플을 각각의 동물로부터 안구 뒤 찌르기로 수집하고, 4㎕의 소듐 헤파린(5000 IU)을 함유하는 바이알에 넣었다. 말초 혈액으로부터, 40㎕를 수집하고 0.3 mM 메틸렌 블루 용액, 1.29 mM 소듐 시트레이트, 5 mL의 생리식염수, 및 10 mL의 증류수에 의해 형성된 용액의 120㎕와 혼합하였다. 이들을 37℃의 물 배쓰에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 선택적 용혈을, 0.08 mM의 테트라소듐 EDTA; 0.15 mM 암모늄 클로라이드; 및 9.98 mM 소듐 바이카보네이트로 이루어진 용해 용액으로 처리하여 6분 동안 수행하였다. 적혈구 용해를 식염수 용액으로 과희석시켜 중단하고, 망상 적혈구를 뉴바우어 챔버(Neubauer chamber)에서 눈으로 계수하였다. 데이터 가공 및 효능 계산을, α = 0.05의 유의성 수준으로 직선성 및 평행성의 유효성을 검출하기 위하여, 평행선 및 미지의 패턴의 랜덤 설계를 사용하여 수행하였다. 얻어진 값은 유럽 약전의 규정에 부합해야 하며, 이것은 퍼센트로 표현된, 추정값에 대한 계산된 효능의 비율의 값이 80% 미만이거나 125% 초과이지 않아야 하며, 계산된 효능의 기준 한계는 64% 내지 156% 범위 내에 있는 것이다.
도 4에서, 그래프는 망상 적혈구 계수 실험으로부터 직접 얻어진 데이터를 나타낼 수 있으며 여기서 증가하는 EPO 양을 적용하였고, IU의 효능으로 측정하였다. 생체 내 활성 값을 분석할 목적으로, 평균 비교를 위한 통계학적 터키-크래머(Tukey-Kramer) 테스트를 적용하였다. 데이터의 통계학적 분석은 P< 0.05에 대한 값들 간의 유의적인 차이가 없는 것을 나타냈다. 페길화 EPO와 양성 대조군으로서 사용된 비개질 EPO 간의 생물학적 활성의 차이는 분석의 변화량 범위 내에 있었다(± 50%).
분석을 수행하기 위해 사용된 용량이 300, 450 및 600 IU의 효능을 가진다는 점을 강조하는 것이 중요하다. 이들은 천연 EPO의 생물학적 활성을 검출하기 위해 확립된 용량이지만, 분자 질량 30 kDa의 선형 폴리머 구조와 컨쥬게이트화된 EPO(PEG1,30K-EPO)인, 암젠 컴퍼니(Amgen Company)의 제품인 미세라™(Mircera™)를 사용하여 수행된 분석은 6000 IU의 효능의 최소 용량을 필요로 한다. 그러나, 본 발명에서 수행된 테스트에서는, 20배 더 낮은 용량으로, 페길화 EPO의 생체 내 생물학적 활성을 검출하였다.
실시예 7. 프로테아제 분해에 대한 저항성
다양한 PEG-EPO 분자의 프로테아제에 의한 분해에 대한 저항성을 확인하기 위하여, 시험관 내 실험을 수행하였으며, 여기서 페길화 EPO 및 천연 단백질(대조군으로서)을 트립신으로 소화시켰다. 둘 모두의 페길화 EPO 변형은 천연 EPO보다 프로테아제 분해에 대한 저항성이 더욱 크게 나타내었다. 도 5에, 대조군으로서 사용된 EPO의 분해 동역학의 결과를 나타내고, 2개의 페길화 변형 PEG2 ,32K -EPO 및 PEG2,40K -EPO의 분해 동역학의 결과를 나타낸다. 2개의 페길화 EPO 변형이 천연 EPO보다 프로테아제에 의한 분해에 대한 저항성을 더욱 크게 나타낸다는 점을 볼 수 있다.
실시예 8. PEG 2 ,32K -EPO 컨쥬게이트의 약동학
약동학적 분석을, 비개질 EPO, PEG2 ,32K-EPO 컨쥬게이트, PEG2 ,40K-EPO 컨쥬게이트 및 PEG1 ,30K-EPO 컨쥬게이트를 비교하여 수행하였다. 2 kg 체중의 뉴질랜드 계통의 토끼를 사용하였다. 반감기(t½), 곡선 아래 면적(AUC로 약기됨) 및 평균 체류 시간(MRT로 약기됨)의 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1. EPO, PEG 2 ,32K -EPO 컨쥬게이트 , PEG 2 ,40K -EPO 컨쥬게이트 , 및 PEG 1 ,30K -EPO 컨쥬게이트의 약동학 비교
약동학적 파라미터 PEG2 ,32K-EPO PEG2 ,40K-EPO PEG1 ,30K-EPO 비개질 EPO
t½ 165.93 +/- 74.41 131.24 +/- 6.70 68.33 +/- 5.42 4.86 +/- 1.27
AUC (IU/mL·h) 83.59 +/- 44.63 23.32 +/- 14.92 242.44 +/-95.53 15.89 +/- 2.31
MRT (h) 238.94 +/- 12.05 199.62 +/- 4.22 95.87 +/-15.89 6.62 +/- 1.95
모든 페길화 EPO가 비개질 EPO보다 더 긴 반감기 시간을 가진다는 점을 관찰할 수 있다. PEG2 ,32K-EPO 컨쥬게이트의 반감기 시간이 PEG1 ,30K-EPO에서 얻어진 것보다 훨씬 더 길었다(2.4배). 둘 모두의 컨쥬게이트가 매우 유사한 분자 크기를 나타낸다는 점을 고려할 때, 이러한 결과는 예기치 못한 것이다. 또한, 이러한 비대칭 분지형 분자는, 또한 분지되고 더 높은 분자량을 갖는, PEG2 ,40K-EPO 컨쥬게이트보다 더 긴 반감기를 나타내었고, 이것 또한 예기치 못한 것이었다.
실시예 9. 다양한 EPO 컨쥬게이트의 약동학적 결과의 비교
본 약동학적 분석은, 분자 질량 12 kDa의 하나의 분지 및 20 kDa의 다른 분지를 갖는, PEG2 ,32K-EPO 컨쥬게이트; 분자 질량 5 kDa의 하나의 분지 및 7 kDa의 다른 분지를 갖는 비대칭 PEG 구조와 컨쥬게이트화된 EPO(PEG2 ,12K-EPO); 각각 7 kDa의 2개의 분지의 대칭 구조를 갖는 EPO 컨쥬게이트(PEG2 ,14K-EPO); 및 12kDa 분자 질량의 선형 PEG에 컨쥬게이트화된 EPO(PEG1 ,12K-EPO)를 비교하여 수행하였다. 이러한 분석을 위하여, PEG2 ,12K-EPO 컨쥬게이트는 PEG2 ,32K-EPO 컨쥬게이트와 유사한 방식으로 얻었으나, 더욱 낮은 분자 질량의 mPEG를 사용하였다. PEG2 ,14K-EPO 컨쥬게이트는 PEG2,40K-EPO 컨쥬게이트와 유사하게 얻었으나, 더욱 낮은 분자 질량의 mPEG를 사용하였다. PEG1 ,12K-EPO 컨쥬게이트는 실시예 1의 처음에 기재된 바와 같이 12 kDa 분자 질량의 mPEG를 활성화시켜 얻었으며, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 이후 hr EPO와의 컨쥬게이션을 수행하였다. 2 kg의 체중을 갖는, 뉴질랜드 계통의 토끼를 비교를 위해 사용하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다. 본 발명의 컨쥬게이트(PEG2,32K-EPO)는 나머지의 분석된 컨쥬게이트 보다 더 긴 반감기를 나타내었다.
표 2. 다양한 EPO 컨쥬게이트의 약동학적 파라미터
파라미터 PEG2 ,32K-EPO (비대칭, 12 및 20 kDa) PEG2 ,12K-EPO (비대칭, 5 및 7 kDa) PEG1 ,12K-EPO PEG2 ,14K-EPO
t½(h) 165.93 +/- 74.41 89.72 +/- 7.87 38.33 +/- 10.97 81.63 +/- 10.31
AUC (IU/mL·h) 83.59 +/- 44.63 31.89 +/- 10.57 110.32 +/- 87.04 28.12 +/- 7.71
MRT (h) 238.94 +/- 12.05 87.14 +/- 17.54 46.41 +/-17.82 80.01 +/- 14.93
실시예 10. 다양한 EPO 컨쥬게이트의 생물학적 활성의 비교
컨쥬게이트의 생물학적 활성을 실시예 6에 기재된 바와 유사한 방식으로 측정하였다. (1) PEG2 ,32K-EPO; (2) PEG2 ,12K-EPO; (3) PEG2 ,14K-EPO; 및 (4) PEG1 ,12K-EPO 컨쥬게이트에 대해 얻어진 결과를 비교하였다. 비개질 rh EPO를 대조군으로 사용하였다. 도 6에서, 본 발명의 컨쥬게이트(PEG2,32K-EPO)가, 생물학적 활성이 페길화에 따라 감소하는, 분석된 나머지의 컨쥬게이트와 달리, 비개질 단백질의 생물학적 활성을 유지한다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 11. PEG 2 ,32K -EPO 컨쥬게이트의 2개의 비대칭 분지를 형성하는 mPEG의 분자 질량의 말단 한계를 사용한 약동학적 분석
PEG가 다분산성이고, 비대칭 PEG의 구조를 형성하기 위해 사용되는 출발 물질인 PEG2 ,32K가 12 kDa 및 20 kDa의 분자량의 이론적 값으로부터 변화를 가질 수 있기 때문에, 29 kDa (PEG2 ,29K-EPO) 및 35 kDa (PEG2 ,35K-EPO)의 분자 질량을 갖는 PEG 비대칭 구조와 EPO 컨쥬게이트의 약동학적 분석을 수행하였다. 이들은 본 발명의 EPO 컨쥬게이트의 PEG 형성 부분의 전체 분자 질량의 한계이다. PEG2 ,29K-EPO 및 PEG2 ,35K-EPO 컨쥬게이트를 PEG2 ,32K-EPO 컨쥬게이트와 유사한 방식으로 얻었다. 2 kg의 체중을 갖는 뉴질랜드 계통의 토끼를 사용하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다. 관찰할 수 있는 바와 같이, 분석된 컨쥬게이트화된 변형의 약동학적 파라미터에 차이가 없다.
표 3. 다양한 분자량의 PEG를 갖는 컨쥬게이트의 약동학적 파라미터의 결과
파라미터 PEG2 ,32K-EPO PEG2 ,29K-EPO PEG2 ,35K-EPO
t½(h) 165.93 +/- 74.41 159.24 +/- 19.84 174.01 +/- 25.66
AUC (IU/mL·h) 83.59 +/- 44.63 79.76 +/- 21.67 85.55 +/- 34.75
MRT (h) 238.94 +/- 12.05 243.42 +/- 18.54 235.34 +/-12.43

Claims (11)

  1. 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)의 2개 분지를 포함하는 비대칭 분지형 폴리머 구조 및 에리트로포이에틴(EPO)을 포함하는 컨쥬게이트로서, mPEG의 분지중의 하나의 분자 질량이 10 kDa 내지 14 kDa이고, mPEG의 다른 분지의 분자 질량이 17 kDa 내지 23 kDa인 컨쥬게이트.
  2. 제1항에 있어서, mPEG의 분지중의 하나의 분자 질량이 12 kDa이고 다른 mPEG의 분자 질량이 20 kDa인 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 분지형 폴리머 비대칭 구조가 하기 화학식으로 표시되는 컨쥬게이트.
    Figure pct00003
  4. 제3항에 있어서, mPEG1의 분자 질량이 12 kDa이고 mPEG2의 분자 질량이 20 kDa이거나, 또는 mPEG1의 분자 질량이 20 kDa이고 mPEG2의 분자 질량이 12 kDa인 컨쥬게이트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EPO가 재조합 인간 EPO (rh EPO)인 컨쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 컨쥬게이트 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  7. 페길화 에리트로포이에틴(EPO)을 수득하는 방법이며, 단백질이 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG)의 2개 분지를 포함하는 비대칭 분지형 폴리머 구조에 컨쥬게이티화되며, 여기서 mPEG의 분지중의 하나의 분자 질량이 10 kDa 내지 14 kDa이고, mPEG의 다른 분지의 분자 질량이 17 kDa 내지 23 kDa인 방법.
  8. 제7항에 있어서, mPEG의 분지중의 하나의 분자 질량이 12 kDa이고 다른 mPEG의 분자 질량이 20 kDa인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 비대칭 분지형 폴리머 구조가 하기 화학식으로 표시되는 방법.
    Figure pct00004
  10. 제9항에 있어서, mPEG1 분자 질량이 12 kDa이고 상기 mPEG2 분자 질량이 20 kDa이거나, 또는 mPEG1 분자 질량이 20 kDa이고 상기 mPEG2 분자 질량이 12 kDa인 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EPO가 재조합 인간 EPO (rh EPO)인 방법.
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