CN101837130B - 聚乙二醇-二肽-抗肿瘤药物复合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚乙二醇-二肽-抗肿瘤药物复合物及其在用途，其特征在于采用组织蛋白酶B敏感的二肽将PEG和抗肿瘤药物进行偶联，即保留了PEG修饰的优势，同时又发挥了组织蛋白酶B敏感的二肽在肿瘤部位特异性降解的特点，可以克服PEG修饰对药物活性的影响，不失为一种较好的肿瘤治疗解决方案。
Description
技术领域
本发明属于化学制药领域，具体涉及聚乙二醇-二肽-抗肿瘤分子复合物及其在肿瘤治疗中的应用。
技术背景
恶性肿瘤一直是困扰人类的严重疾病，大多数癌症目前尚无治愈的方法。化疗是治疗恶性实体瘤的传统方法之一，在临床上占在重要地位。
现在临床上应用的化疗药物存在着一些重要缺陷。其中，有的溶解度差(如紫杉醇，多烯紫杉醇)，为解决溶解度问题，注射剂中加入了大量表面活性剂，带来了明显的副作用等新的问题；有的半衰期太短(如肿瘤坏死因子的血浆清除半衰期为6min，体内代谢半衰期为27min)，进入体内后很快被代谢清除，即体内稳定性差，不能充分发挥作用；大部分的化疗药物对恶性肿瘤没有明显的选择性，这些药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常的细胞产生杀伤作用，因此会产生严重的副作用(如阿霉素的心脏毒性比较大等)。
以肿瘤坏死因子(TNF-α)为例，它是一种特异性攻击肿瘤的细胞因子，对多种肿瘤有细胞毒作用。便由于体内稳定性差以及作用的多效性，要求连续灌输或频繁给药才能获得理想的治疗效果，然而，高剂量的全身治疗时副作用较大，如引起发烧、血压降低和内毒素样休克等副作用，限制了其用药剂量，临床用药一般被限制为有效抗肿瘤剂量的1/5-1/25。关于TNF-α的基础与临床应用研究的基本结论有两条：第一，TNF-α对肝癌有确切疗效；第二，局部应用效果较好，全身用药疗效较差。加之TNF-α对环境的耐受力较差，在体内很快失活(血浆清除半衰期为6min，体内代谢半衰期为27min)，全身用药很难在肿瘤部位达到有效浓度，如提高剂量势必增加全身毒副反应(Creagan ET，et al：Cancer，1988，62(12)：2467-71；Moritz T，et al，.Cancer Immunol Immunother，1989，29(2)：144-50)。为了克服上述缺点，国内外许多学者进行了优化TNF-α抗肿瘤疗法的研究，包括与其它化疗药物或细胞分子联合用药，肝动脉导管导入及在分子水平改建和TNF-α基因疗法等。其中比较有效的手段之一是采用聚乙二醇(PEG)进行化学修饰。
亲水性聚乙二醇(PEG)修饰即可解决难溶性药物溶解度问题，又可大幅度增加药物的体内稳定性，明显延长其体内作用时间。事实上，PEG已被广泛用于某些药物分了特别是蛋白类药物的修饰。因为PEG化后分子量增加，空间位阻增加，体内稳定性得到提高，这样可以减缓药物特别是蛋白分子在体内的清除率，大大延长药物在体内的代谢半衰期，从而降低给药剂量(Zalipsky S：Bioconjug Chem，1995，6：150-165)；PEG化后，药物分子量变大，EPR效应(增强的渗透与滞留效应)明显增加，有利对恶性肿瘤的治疗；对蛋白药物而言，PEG化后药物的周围有一层特殊的“壳”，可以进一步减少异源蛋白引起的抗原性和免疫原性，降低体内蛋白酶对蛋白的降解作用(Cunningham-Rundles C，J.Immunol.Methods，1992，152：177-190)，并保留蛋白原有生物学活性(Harris JM，Clin Pharmacokinet，2001，40(7)：539-551)。目前，已经批准上市的PEG化蛋白类药物主要有：天冬酰胺酶
(1994年)、腺苷脱氨酶(1990年)、α-2a干扰素(2002年)、α-2b干扰素(PEG-
)(2000年)、G-SCF(pegfilgrastim，
)(2002年)以及生长激素受体激动剂(Pegvisomant，)(2002年)。
但目前PEG修饰也存在一些重要的问题。活化的PEG与药物的特定基团反应时，作为链状高分子的PEG不可避免地会在一定程度上破坏或遮蔽药物的活性位点，影响其体内的生物活性。以蛋白分子为例，PEG化最常用的方法是通过胺反应，将蛋白的巯基通过NHS的功能基团链接于PEG分子的末端，因此PEG不可避免地链接于蛋白的活性部位，导致蛋白药物的活性不同程度的下降甚至失活。最典型的例子是，PEG化的a-干扰素其抗病毒活性仅为天然干扰素的7％(Bailon P，Bioconjug.Chem.2001，12：195-202)。虽然国外一些学者通过基因工程的方法(Shibata H，Clin.Cancer Res.2004，10：8293-8300；Yoshioka Y，Biochem.Biophys.Res.Commun.2004，315：808-814)，使蛋白药物TNF-α活性部位中的Lys缺失，再将PEG特异性连接于其非活性部位，其抗肿瘤活性也受PEG的大小和结构的影响。PEG化药物的生物活性与链接PEG的分子量大小和数量多少成反相关，其关键因素在于PEG化后的药物分子是否能在作用部位被及时地释放。目前PEG化的主要障碍在于：维持血浆半衰期与蛋白药物在作用部位的生物活性之间的平衡。
组织蛋白酶B(Cathepsin B，CB)是一种溶酶体内的半胱氨酸蛋白水解酶，属于木瓜蛋白酶家族，在pH3.0-7.0都具有活性，其水解位点为-Arg-Arg-/-Xaa(Vito T，The Embo J，2001，20(17)：4629-4633)。在体内主要参与溶酶体内物质降解、骨重建及呈递抗原等生理过程。在病理情况下，由于肿瘤细胞内CB的运输机制失调，不能进入溶酶体，而分泌到肿瘤细胞外(Roshy S，et al：Cancer Metastasis Rev，2003，22(223)：271-286)，而正常细胞并不分泌(Sinha AA，et al：Prostate，2001，49：172-184)。
近年来研究发现，在肝细胞癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胃癌、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤组织中，CB表达及CB活性均成倍甚至3-9倍高于邻近正常组织(Scorilas A，et al：Biol Chen，2002，383：1297-1303；Kayser K，et al：Anticancer Res，2003，23：2767-2772)。利用CB可以选择性地降解一些多肽片段的特点，可以构建CB敏感的药物输送系统。近年来国外有一些文献报道，如利用CB敏感的Gly-Phe-Leu-Gly和Ala-Leu-Ala-Leu两个四肽，但该四肽的天然疏水性可能会引起药物的聚集。
Dubowchik等(Dubowchik GM，et al：Bioconjugate Chem.2002，13：855-869)合成了一系列CB敏感的二肽用于递送阿霉素(DOX)，这些二肽包括Phe-Lys、Val-Lys、Ala-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Ile-Cit、Phe-Arg等，用这些二肽将嵌合型单抗BR96与DOX进行偶联，结果表明，该偶联物具有血浆稳定性，并且对肿瘤细胞表现更强的细胞毒性。最引人注目的是，Doronina等(Doronina SO，et al：Natur Biothech，2003，21(7)：778-784)采用Val-Cit将Aurstatin E和Monomethylauristaitin E两种肿瘤化疗药物与单抗进行偶联，结果证明该偶联物在人和鼠的血浆血浆稳定性明显提高，对其它正常组织的毒副作用明显降低(2003年发表在NatureBiotechnology杂志上)。但通过二肽偶联单抗和抗肿瘤药物形成的偶联物，可能引起体内的免疫反应，降低偶联物的在血浆中半衰期，因此效果也有限。
基于以上背景，用组织蛋白酶B敏感的二肽将PEG和抗肿瘤药物进行偶联，即保留了PEG修饰的优势(增加难溶性药物溶解度、提高药物的体内稳定性、增加EPR效应等)，同时又发挥了组织蛋白酶B敏感的二肽在肿瘤部位特异性降解的特点，可以克服PEG修饰对药物活性的影响，不失为一种较好的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种聚乙二醇-二肽-抗肿瘤药物分子复合物。本发明的进一步目的在于提供上述药物分子复合物在肿瘤治疗中的用途。
本发明以二肽为偶联基团，将PEG与抗肿瘤药物结合制成分子复合物。
聚乙二醇-二肽-抗肿瘤药物分子复合物，其结构如下：
PEG-X-Y-R，
其中，PEG为聚乙二醇及衍生物(如聚乙二醇，甲氧基化聚乙二醇，乙氧基化聚乙二醇)，所述的聚乙二醇及其衍生物，平均分子量为1000~40000。所述的聚乙二醇及其衍生物可按常规化学方法与二肽-X-Y-上X的氨基端共价结合。
X-Y为二肽，其中X和Y为任意天然氨基酸或其衍生物，且两者以共价键结合。这些二肽包括Val-Cit、Phe-Lys、Val-Lys、Ala-Lys、Val-Lys、Phe-Cit、Ile-Cit、Leu-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg，其中Y的羧基末端可通过常规化学方法与抗肿瘤药物共价结合。
其中所述R为抑制或杀灭肿瘤细胞的抗肿瘤药物，并具有可与Y端羧基共价结合的羟基、氨基或巯基。这些抗肿瘤药物包括TNF-α、紫杉醇、多烯紫杉醇、阿霉素。
本发明的PEG-X-Y-R分子复合物，可用常规化学方法进行制备。即选用适当方法对某个基团进行活化，然后与另一化合物的相应基团进行联接，直到获得最后的PEG-X-Y-R分子复合物。活化基团包括但不限于琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺丁酸酯(SBA)、琥珀酰亚胺酯(NHS)、双三氯甲基碳酸酯(BTC)和马来酰亚胺酯(MAL)。
上述所制得的PEG-X-Y-R分子复合物经凝胶过滤色谱分离得到纯化的PEG-X-Y-R分子复合物。
本发明PEG-X-Y-R分子复合物可采用药剂学上允许的赋型剂、pH调节剂、渗透压调节剂等辅料配伍，按照药学领域的常规或用特定的生产方法制备成相应的药物组合制剂。所述药物组合制剂包括PEG-X-Y-R分子复合物的水针剂、输液、冻干粉针剂、片剂和胶囊剂。所述药物组合制剂的给方式包括静脉注射、肿瘤内注射和口服给药。
以下以聚乙二醇-X-Y-TNF-α复合物为例，通过试验说明本发明的有益效果：
聚乙二醇-X-Y-TNF-α复合物的血浆稳定性和CB敏感性检测：
采用FITC荧光标价法，检测不同时相内血浆和含CB液中的荧光强度，了解聚乙二醇-X-Y-TNF-α复合物在血浆中的稳定情况以及对CB的敏感性。
聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物的细胞毒性检测：
采用CCK-8法，检测聚乙二醇-X-Y-TNF-α对L929细胞的细胞毒性。
聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物在模型动物体内药物动力学和药效学检测：
采用同位素示踪法，检测不同时相内聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物在正常大鼠中的血浆浓度，了解其在动物体内的动力学。采用Meth-A实体瘤动物模型，分别尾部注射P聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物、PEG-TNF-α、TNF-α和生理盐水后，在不同时间下测定肿瘤体积大小，计算肿瘤抑制率，与原药和PEG-TNF-α比较，评价聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物的抗肿瘤效果。
本发明所涉及的实验方法属于本领域已知方法，实验所采用的试剂为市售。
经上述实验结果证实，本发明即具有常规PEG化TNF-α的优点，又具有肿瘤部位药物特异性释放的特点。与TNF-α相比，聚乙二醇-X-Y-TNF-α复合物血浆半衰期显著延长，与常规PEG化TNF-α相比，PEG-X-Y-TNF-α分子复合物的生物活性显著提高。此分子复合物具有被动靶向和肿瘤细胞定位释放的双重功能，可产生高效、安全的抗肿瘤疗效。
聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物一方面具有PEG化药物的优点，即可提高药物的稳定性，延长药物的血浆半衰期，通过被动靶向肿瘤作用增加药物在肿瘤组织中的摄取量；另一方面利用肿瘤部位高浓度表达的组织蛋白酶B作用于二肽位点，酶解并释放药物分子，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤组织生长，同时又不损伤正常组织。实验结果表明：聚乙二醇-二肽-TNF-α分子复合物进入血液系统后，与过度表达的CB识别，TNF-α分子释放，与原药和常规的PEG化TNF-α相比，抗肿瘤作用显著增强，毒副作用显著下降。
附图说明：
图1显示：PEG-TNF-α和PEG-X-Y-TNF-α分别在人血浆和鼠血浆中的稳定性结果
图2显示：PEG-TNF-α和PEG-X-Y-TNF-α分别对CB敏感性实验结果
图3显示：TNF-α、PEG-TNF-α和PEG-X-Y-TNF-α对L929细胞株的细胞毒性结果
图4显示：尾静脉注射后，TNF-α、PEG-TNF-α和PEG-X-Y-TNF-α在正常大鼠体内的药动学曲线
图5显示：尾静脉注射后，TNF-α、PEG-TNF-α和PEG-X-Y-TNF-α抑制Meth-A纤维肉瘤生长曲线
具体实施方式
以下借助非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例1活化的PEG-X-Y的制备，X-Y为Val-Cit
采用常规的酰胺缩合反应合成，将易购得的mPEG-NHS(PEG的平均分子量为4kD)与二肽(Val-Cit)按投料比为2∶1，加入pH7.5的磷酸盐、HEPES或Tris-HCl等缓冲液溶解，反应温度25℃，缓慢搅拌60分钟，加入5倍PEG摩尔量的甘氨酸结束反应。透析纯化后冻干即得mPEG-Val-Cit分子复合物。然后采用常规的EDC和NHS试剂活化mPEG-Val-Cit分子复合物的末端羧基，即得mPEG-Val-Cit-NHS。
实施例2活化的PEG-X-Y的制备，X-Y为Ala-Lys
采用常规的酰胺缩合反应合成，将易购得的mPEG-NHS与二肽(Ala-Lys)，按投料比为2∶1，加入pH7.5的磷酸盐、HEPES或Tris-HCl等缓冲液溶解，反应温度25℃，缓慢搅拌60分钟，加入5倍PEG摩尔量的甘氨酸结束反应。透析纯化后冻干即得mPEG-Ala-Lys分子复合物。然后采用常规的EDC和NHS试剂活化mPEG-XX分子复合物的末端羧基，即得mPEG-Ala-Lys-NHS。
实施例3活化的PEG-X-Y的制备，X-Y为Val-Lys
采用常规的酰胺缩合反应合成，将易购得的mPEG-NHS与二肽(Val-Lys)，按投料比为1∶1，加入pH7.5的磷酸盐、HEPES或Tris-HCl等缓冲液溶解，反应温度25℃，缓慢搅拌60分钟，加入5倍PEG摩尔量的甘氨酸结束反应。透析纯化后冻干即得mPEG-Val-Lys分子复合物。然后采用常规的EDC和NHS试剂活化mPEG-Val-Lys分子复合物的末端羧基，即得mPEG-Val-Lys-NHS。
实施例4制备聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(I)其中为X为Ala，Y为Lys
取PEG-Ala-Lys-NHS(PEG的平均分子量为40kD)400nmol和20nmolTNF-α，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为7.5)溶解，4℃下，缓慢搅拌30分钟，加入5倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-X-Y-TNF-α组分，分别测定PEG-Y-X-Y-NHS和TNF-α的含量，得到PEG和TNF-α的摩尔比1.3∶1，收率为31.04％。
实施例5制备聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(II)X-Y为Phe-Cit
取PEG-Phe-Cit-NHS(PEG的平均分子量为40kD)100nmol和20nmolTNF-α，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为7.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌1小时，加入10倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-X-Y-TNF-α组分，分别测定PEG-X-Y-NHS和TNF-α的含量，得到PEG和TNF-α的摩尔比2.1∶1，收率为24.55％。
实施例6制备聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(III)X-Y为Val-Cit
取PEG-Val-Cit-NHS(PEG的平均分子量为40kD)800nmol和20nmolTNF-α，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-X-Y-TNF-α组分，分别测定PEG-X-Y-NHS和TNF-α的含量，得到PEG和TNF-α的摩尔比3.4∶1，收率为30.67％。
实施例7聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(III)(具体为：聚乙二醇-Val-Cit-TNF-α)的体外血浆稳定性和CB敏感性评价
1、聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(III)的体外血浆稳定性实验，
取一定量的FITC标记的聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(含17μg的TNF-α)，置于1mL预先孵育的新鲜提取的鼠或人血浆中，37℃孵育，每隔一定时间取样100μL，测荧光强度，并折算成TNF-α的含量。结果如图1所示，PEG-TNF-α和PEG-vc-TNF-α在两种血浆中TNF-α的释放率都很慢，120h内，在鼠血浆中TNF-α释放不到10％，而在人血浆中TNF-α释放不到20％，说明PEG-TNF-α和聚乙二醇-X-Y-TNF-α在人血浆和鼠血浆中都比较稳定。
2、聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(III)(具体为：聚乙二醇-Val-Cit-TNF-α)对CB的敏感性实验
取一定量的FITC标记的聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(含17μg的TNF-α)，置于1mL预先孵育含不同浓度CB的血浆背景溶液中，37℃孵育，每隔一定时间取样100μL，测荧光强度，并折算成TNF-α的含量。结果如图2所示，PEG-X-Y-TNF-α在CB的作用下，TNF-α能够释放，并受CB抑制剂的抑制，而常规的PEG-TNF-α并不释放，说明聚乙二醇-X-Y-TNF-α对CB具有敏感性。
实施例8聚乙二醇-X-Y-TNF-α复合物(III)(具体为：聚乙二醇-Val-Cit-TNF-α)的体外细胞毒性实验
取对数生长期L929细胞，以2×104/孔细胞接种于96孔板，100μl/well，每组设6个平行孔。在含10％FBS的DMEM的培养液中培养24h后(5％CO2、37℃)，加入含不同浓度的TNF-α，PEG-TNF-α，PEG-vcTNF-α的上述培养液100μl，有些组加入CB溶液，继续培养2h、24h或48h。加入CCK-8液，培养4h后，弃上清液，按照CCK-8的操作说明，微量振荡仪振荡5min，按参考波长492nm、参比波长630nm应用酶标仪测定各孔吸光度值(A值)。按下列公式计算细胞生长抑制率：IR＝[(正常对照组A值-用药组A值)/正常对照组A值]×100％。结果如图3所示，聚乙二醇-X-Y-TNF-α的细胞毒作用远强于PEG-TNF-α；在CB存在的条件下，PEG-X-Y-TNF-α的细胞毒作用与TNF-α接近。
实施例9聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(III)(具体为：聚乙二醇-Val-Cit-TNF-α)在正常大鼠内的药物动力学试验
SD雄性大鼠15只，随机分成3组，每组5只，将无菌条件下制备的三种125I标记的TNF-α、PEG-TNF-α和PEG-vcTNF-α制备成7μg/ml注射液，剂量3.5μg/200g体重，静脉给药后，分别于0.25、0.5、1、2、3、6、12、24和48h，眼眶取血0.1ml，离心取血浆100μl，加0.5ml三氯醋酸，振荡1分钟，离心(3500rpm)3min，取沉淀测定cpm。用3P87软件处理数据，计算药动学参数。结果表明，聚乙二醇-X-Y-TNF-α和PEG-TNF-α一样，能够延长体内的半衰期。
实施例10聚乙二醇-X-Y-TNF-α分子复合物(III)(具体为：聚乙二醇-Val-Cit-TNF-α)体内抗肿瘤活性试验
取于温度25±2℃、相对湿度75±5％和自然光条件下，将饲养一周的Meth-A实体瘤昆明种雌性小鼠肿瘤模型32只，随机分成4组，每组6只。将无菌条件下制备的TNF-α、PEG-TNF-α、聚乙二醇-X-Y-TNF-α主要组份用灭菌PBS(pH7.4)制成TNF-α浓度为2.5μg/ml的注射液。每组尾静脉注射1种形式的TNF-α注射液，剂量为0.5μg/20g体重。取最后1组，尾静脉注射生理盐水，0.2ml/鼠。再于首次给药后的第4，8和11天依法各给药1次。并于首次给药的当日和预定的时间测量肿瘤的大小，按下式计算瘤体积V＝(a2×b)/2(a，肿瘤的宽度；b，肿瘤的长度)，测得的瘤体积与首次给药当日测得瘤体积的比值，即为相对瘤体积的大小，再按t-检验法进行统计分析处理数据，并将PEG-TNF-α和对照TNF-α的抗肿瘤效果进行比较。结果表明，聚乙二醇-X-Y-TNF-α的肿瘤抑制率分别是TNF-α和PEG-TNF-α的50倍和10倍。
实施例11PEG-X-Y-紫杉醇的制备，X-Y为Val-Cit
取PEG-Val-Cit-NHS(PEG的平均分子量为4kD)800nmol和20nmol紫杉醇(PCT)，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Val-Cit-PCT组分并测定其含量。
实施例12制备聚乙二醇-X-Y-PCT分子复合物(III)X-Y为Ala-Lys
取PEG-Ala-Lys-NHS(PEG的平均分子量为4kD)800nmol和20nmol紫杉醇(PCT)，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Ala-Lys-PCT组分并测定其含量。
实施例13制备聚乙二醇-X-Y-PCT分子复合物(III)X-Y为Val-Lys
取PEG-Val-Lys-NHS(PEG的平均分子量为40kD)800nmol和20nmolPCT，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Val-Lys-PCT组分并测定其含量。
实施例14制备聚乙二醇-X-Y-多烯紫杉醇分子复合物(III)X-Y为Val-Cit
取PEG-Val-Cit-NHS(PEG的平均分子量为4kD)800nmol和20nmol多烯紫杉醇(DTX)，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Val-Cit-DTX组分并测定含量。
实施例15制备聚乙二醇-X-Y-多烯紫杉醇分子复合物(III)X-Y为Ala-Lys
取PEG-Ala-Lys-NHS(PEG的平均分子量为40kD)800nmol和20nmol多烯紫杉醇(DTX)，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Ala-Lys-DTX组分并测定含量。
实施例16制备聚乙二醇-X-Y-多烯紫杉醇分子复合物(III)X-Y为Phe-Lys
取PEG-Phe-Lys-NHS(PEG的平均分子量为40kD)800nmol和20nmol多烯紫杉醇(DTX)，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Phe-Lys-DTX组分并测定含量。
实施例17制备聚乙二醇-X-Y-阿霉素分子复合物(III)X-Y为Val-Cit
取PEG-Val-Cit-NHS(PEG的平均分子量为40kD)800nmol和20nmol阿霉素(DOX)，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Val-Cit-DOX组分并测定含量。
实施例18制备聚乙二醇-X-Y-阿霉素分子复合物(III)X-Y为Ala-Lys
取PEG-Ala-Lys-NHS(PEG的平均分子量为40kD)800nmol和20nmol阿霉素(DOX)，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Ala-Lys-DOX组分并测定含量。
实施例19制备聚乙二醇-X-Y-阿霉素分子复合物(III)X-Y为Phe-Lys
取PEG-Phe-Lys-NHS(PEG的平均分子量为40kD)800nmol和20nmol阿霉素(DOX)，在1mL的磷酸盐缓冲液(pH为6.5)溶解，25℃下，缓慢搅拌15分钟，加入8倍PEG摩尔量的6-氨基正己酸结束反应。一次上样0.5mL于阳离子交换柱，紫外检测器进行分离纯化，收集PEG-Phe-Lys-DOX组分并测定含量。
实施例20含PEG-Val-Cit-PCT组分的注射剂的制备
取PEG-Val-Cit-PCT分子复合物，溶于无菌注射用水中，必要时加入相关添加剂，按注射剂常规工艺和质量要求制备成静脉注射剂。
实施例21含PEG-Val-Cit-DTX组分的注射剂的制备
取PEG-Val-Cit-DTX分子复合物，溶于无菌注射用水中，必要时加入相关添加剂，按注射剂常规工艺和质量要求制备成静脉注射剂。
实施例22含PEG-Val-Cit-DOX组分的注射剂的制备
取PEG-Val-Cit-DOX分子复合物，溶于无菌注射用水中，必要时加入相关添加剂，按注射剂常规工艺和质量要求制备成静脉注射剂。
实施例23含PEG-Val-Cit-TNF-α组分的注射剂的制备
取PEG-Val-Cit-TNF-α分子复合物，溶于无菌注射用水中，必要时加入相关添加剂，按注射剂常规工艺和质量要求制备成静脉注射剂。
实施例24含PEG-Val-Cit-PCT组分的片剂的制备
取PEG-Val-Cit-PCT分子复合物，加入填充剂等相应的辅料，按片剂的常规工艺和质量要求制备成片剂。
实施例25含PEG-Val-Cit-DTX组分的胶囊剂的制备
取PEG-Val-Cit-DTX分子复合物，加入填充剂等相应的辅料，按胶囊剂的常规工艺和质量要求制备成胶囊剂。
实施例26含PEG-Val-Cit-DOX组分的胶囊的制备
取PEG-Val-Cit-DOX分子复合物，加入填充剂等相应的辅料，按胶囊剂的常规工艺和质量要求制备成胶囊。
Claims (5)
1.一种具有特异性释药功能的聚乙二醇修饰的抗肿瘤药物复合物，其结构特征在于，具有如下通式：PEG-X-Y-R
其中，PEG为聚乙二醇或甲氧基化聚乙二醇，平均分子量为1000～40000；
其中，X-Y为二肽，其中X和Y为任意天然氨基酸，且两者以共价键结合形成二肽，所述-X-Y-为Val-Cit；
其中，R为抗肿瘤药物TNF-a；
其中，所述的PEG只能与二肽-X-Y-中X的氨基端共价结合；
其中，所述的抗肿瘤药物只能与二肽-X-Y-中Y的羧基端共价结合。
2.权利要求1所述的复合物的制备方法，其特征在于，步骤是，先制备PEG-X-Y，然后再制备PEG-X-Y-R分子复合物。
3.一种用于肿瘤治疗的药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的PEG-二肽-抗肿瘤药物分子复合物。
4.按照权利要求3所述的组合物，其特征在于，含有常规的药用辅料。
5.按照权利要求3所述的组合物，其特征在于，该组合物用常规方法制备成适当的剂型，所述剂型选自：注射剂、片剂和胶囊剂。
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