CN109745558A - 一种稳定的抗vegf单克隆抗体制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种稳定的抗VEGF单克隆抗体制剂。更具体地，本发明公开了一种包含包含抗VEGF单克隆抗体、明胶、甘氨酸、透明质酸酶、糖、缓冲剂和表面活性剂，该制剂具有良好的稳定性，尤其适合于皮下注射。

Description

一种稳定的抗VEGF单克隆抗体制剂

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种抗VEGF单克隆抗体制剂。

背景技术

血管内皮生长因子(英文：vascular endothelial growth factor，简称：VEGF)，亦称作血管通透因子(英文：vascular permeability factor，简称：VPF)，是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子。VEGF是针对内皮细胞特异性最高，促血管生长作用最强的关键调节因子(Ferrara N.Endocr Rev，1997，18(1)：4)，在多种原发性恶性肿瘤组织中均呈高表达(Brown L F等Human Pathol，1995，26(1)：86)。有研究表明多种血管生长因子是通过直接或间接诱导、刺激VEGF表达而发挥作用的，如TGF-α、bFGF、TGF-β、TNF-α、KGF等均可上调VEGF的表达(Li J，Hampton T等，J Clin Invest，1997，100(1)：18；Brown L F等，Detmar M，Claffey K，et al.Vascular permeability factor/vascular endothelialgrowth factor：a multifunctional angiogenic cytokine.Exs，1997，79：233)。目前已经有多种抗VEGF单克隆抗体被研发，并显示出了良好的抗肿瘤效果。例如，CN98805914.2公开了一种抗VEGF抗体，其对VEGF有很强的结合亲和力,可在体外抑制VEGF诱导的内皮细胞增殖,并且可在体内抑制肿瘤生长；CN02111093.X公开了一种人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体及其制法和药物组合物。

贝伐单抗(bevacizumab，Avastin，阿瓦斯汀，CN98805914.2)是被美国FDA批准的第一款人源化抗VEGF单克隆抗体，其主要通过抑制新生血管的形成，减少肿瘤的血供、氧供和其他营养物质而抑制肿瘤生长，临床应用显示，贝伐单抗与标准IFL方案(依立替康+5-氟尿嘧啶+亚叶酸钙)联用，可显著延长结直肠癌患者的生存期。

目前上市的贝伐单抗制剂配方：bevacizumab 25mg/ml，D-海藻糖60mg/ml，一水磷酸二氢钠5.8mg/ml，无水磷酸氢二钠1.2mg/ml，聚山梨醇酯20 0.4mg/ml，PH值为6.2组成。但是，bevacizumab属于大分子蛋白质，长时间放置容易发生变性。目前常见策略之一是通过添加赋形剂至蛋白质溶液，常使用的稳定剂包括糖、盐、游离氨基酸、多元醇、聚乙二醇(PEG)和可以减少蛋白质-蛋白质相互作用的其他聚合物，如聚山梨酯(polysorbates)或泊洛沙姆(Nema,S.^A,PDAJournal of Pharmaceutical Science and Technology 51:166-171(1997))。但是，随着bevacizumab抗体浓度的增加，上述策略并不能有效解决抗体常温存储的稳定性问题。

因此，如何配制一种稳定的抗VEGF单克隆抗体制剂仍然是目前急需解决的问题。

发明内容

本发明的申请人经过大量的实验研究，研发了一种稳定的高浓度抗VEGF单克隆抗体制剂，该制剂包含抗VEGF单克隆抗体、明胶、甘氨酸、透明质酸酶、糖、缓冲剂和表面活性剂；该制剂尤其适合于皮下注射。具体地，本发明公开了：

1、一种稳定的抗体制剂，其包含抗VEGF单克隆抗体、明胶、甘氨酸、透明质酸酶、糖、缓冲剂和表面活性剂。

2、上述1所述的制剂，其中所述明胶含量为1～5wt.％，优选1.5～3.5wt.％，最优选2.0wt.％。

3、上述1所述的制剂，所述甘氨酸含量为2～4wt.％，优选3wt.％。

4、上述1所述的制剂，其中所述糖为蔗糖、海藻糖或麦芽糖，优选10-150mM海藻糖，最优选100mM海藻糖。

5、上述1所述的制剂，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲液、Tris或组氨酸缓冲液，优选1-150mM磷酸盐缓冲液，最优选100mM磷酸盐缓冲液。

6、上述1所述制剂，所述表面活性剂为：聚山梨酯20、聚山梨酯80、或聚乙烯-聚丙烯共聚物，优选0.02-0.2wt.％的聚山梨酯80，最优选0.09wt.％的聚山梨酯80。

7、上述1-6任一所述的制剂，其中所述抗VEGF单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示；或所述抗VEGF单克隆抗体是贝伐单抗。

8、一种稳定抗体制剂，其包含：

a.70-200mg/ml的抗VEGF单克隆抗体，优选重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示的抗VEGF单克隆抗体；

b.1.5～3.5wt.％的明胶；

c.2～4wt.％的甘氨酸；

d.40000个U/ml以上的透明质酸酶；

e.10-150mM海藻糖；

f.0.02-0.2wt.％的聚山梨酯80；和

g.1-150mM磷酸盐缓冲液。

9、上述9所述制剂，其包含：

a.100mg/ml的抗VEGF单克隆抗体，所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示；

b.2.0wt.％的明胶；

c.3wt.％的甘氨酸；

d.60000个U/ml以上的透明质酸酶；

e.100mM海藻糖；

f.0.09wt.％的聚山梨酯80；和

g.50mM磷酸盐缓冲液。

10、上述1-9任一所述制剂在制备抑制VEGF的药物中的应用，例如在制备治疗结直肠癌、湿性年龄相关的黄斑变性疾病的药物中的应用。

实验结果表明，本发明的制剂可有效防止高浓度抗体在长期储存过程中发生聚集，即使在常温下也具有良好的稳定性。同时，本发明的制剂具有良好的通透性，非常适于皮下注射，可充装在预充式注射器中通过皮下注射使用。

具体实施方式

下面的实施例是为了举例说明本发明并帮助本领域技术人员进行和使用本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中，抗VEGF单克隆抗体(以下简写Anti-VEGF)参照中国专利号CN02111093.X中公开的方法制备得到，所得抗VEGF单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

其它未标注来源的材料均是通过公开的商业途径购买得到。

以下实施例中，稳定性试验，相关生物学检验按照中国药典的规范进行。

SDS PAGE【聚集(非还原)和片段化(还原)】：SDS-PAGE被用作一种分析技术，可以根据分子量从天然蛋白质中分离出游离的和高分子量的种类。由于在高浓度的大分子蛋白的情况下具有高的聚集倾向，非还原SDS-PAGE被用来评定共价聚集体。由于抗体结构轻重链之间，包括铰链区存在许多二硫键，在还原SDS-PAGE下检查蛋白质的片段化。

SE-HPLC【聚集和片段化】：用尺寸排阻色谱法分离蛋白质及其有关杂质(基于它们的尺寸)，上述技术对于检测单克隆抗体的聚集和片段化是有用的。

DSC【差示扫描量热法】：DSC是一种用来测定蛋白质的热力学稳定性的技术。单克隆抗体具有三个过渡区，Tm 1相对于Fab部分，Tm 2相对于Fc部分的CH2结构域，Tm 3相对于Fc部分的CH3结构域(较高的Tm决定了较高的稳定性)。

实施例1明胶对抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂的影响

观察添加不同含量明胶的抗VEGF单克隆抗体制剂在储存过程中的聚集情况的不同，分析其对制剂稳定性的影响。制剂配方如表1所示。

表1：抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂配方

按上述配方配制抗VEGF单克隆抗体制剂，在40℃下孵育12个月，通过SE-HPLC法检测不同时间溶液聚集体情况，观察明胶对抗VEGF单克隆抗体制剂的影响。

表2：明胶对抗VEGF单克隆抗体制剂稳定性的影响

结果表明，明胶可减少抗VEGF单克隆抗体制剂聚集体的产生，有效提高制剂的稳定性，明胶含量为2.0wt.％时效果更佳。

实施例2甘氨酸对抗VEGF单克隆抗体制剂的影响

观察添加不同含量甘氨酸的抗VEGF单克隆抗体蛋白制剂在储存过程中的聚集情况的不同，分析其对制剂稳定性的影响。

将抗VEGF单克隆抗体分别配制为：70mg/ml的抗VEGF单克隆抗体(抗VEGF单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示)、2.0wt.％的明胶、40000个U/ml以上的透明质酸酶、150mM海藻糖、0.2wt.％的聚山梨酯80、150mM磷酸盐缓冲液、以及0wt.％、1wt.％、2wt.％、3wt.％、4wt.％的甘氨酸、且PH6.8的溶液制剂。过滤每种制剂并填充入2mL中性硼硅玻璃管制注射剂瓶中，然后将样品放置于30℃，60％湿度的条件下并在不同时间点通过SE-HPLC方法检测制剂中蛋白质的聚集化情况。

表3：甘氨酸对抗VEGF单克隆抗体制剂稳定性的影响

由表3可知，甘氨酸对抗VEGF单克隆抗体制剂稳定性有很大影响。当甘氨酸为2wt.％时，30℃、60％湿度的条件下贮存一年半，蛋白纯度仍可达到96.5％以上，具有较佳的稳定性。

实施例4抗VEGF单克隆抗体制剂的配制及稳定性试验

表4：抗VEGF单克隆抗体溶液制剂配方

序号	组分	含量
			1	Anti-VEGF	100mg/ml
2	甘氨酸	3.0wt.％
			3	透明质酸酶	60000个U/ml
4	海藻糖	100mM
			5	明胶	2.0wt.％
6	聚山梨酯80	0.09wt.％
			7	磷酸盐缓冲液	50mM
8	PH	6.8

按表4中除抗体以外的赋形剂浓度配置溶液，使各赋形剂组分充分溶解在水溶液中；然后加入纯化后的抗体蛋白原液，调整浓度至100mg/ml，并定容至100％。然后在-20℃、4℃和25℃下储存抗VEGF单克隆抗体溶液制剂，在储存0时间、1个月、6个月以及12个月之后，通过SE-HPLC分析该溶液制剂的稳定性。结果见表5。

表5：溶液制剂稳定性试验结果

(备注：每个温度测定3组平行制剂取平均值)

由上述表5可知，本发明的抗VEGF单克隆抗体溶液制剂稳定性较好，即使在25℃常温下仍具有较好的稳定性。

序列表

<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司

<120> 一种稳定的抗VEGF单克隆抗体制剂

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Pro Ser Ile Tyr Tyr Gly Ser Asn His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Ser Val Thr Val Ser

115 120

<210> 2

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Phe Pro Ala Ser Leu Ser Val Phe Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Phe Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg

85 90 95

Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims (10)

1.一种稳定的抗体制剂，其包含：抗VEGF单克隆抗体、明胶、甘氨酸、透明质酸酶、糖、缓冲剂和表面活性剂。

2.根据权利要求1所述的制剂，其中所述明胶含量为1～5wt.％。

3.根据权利要求1所述的制剂，所述甘氨酸含量为2～4wt.％。

4.根据权利要求1所述的制剂，其中所述糖为蔗糖、海藻糖或麦芽糖。

5.根据权利要求1所述的制剂，其中所述缓冲剂为磷酸盐缓冲液、Tris或组氨酸缓冲液。

6.根据权利要求1所述制剂，所述表面活性剂为：聚山梨酯20、聚山梨酯80、或聚乙烯-聚丙烯共聚物。

7.根据权利要求1-6任一所述的制剂，其中所述抗VEGF单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示。

8.一种稳定抗体制剂，其包含：

a.70-200mg/ml的抗VEGF单克隆抗体；

b.1.5～3.5wt.％的明胶；

c.2～4wt.％的甘氨酸；

d.40000个U/ml以上的透明质酸酶；

e.10-150mM海藻糖；

f.；0.02-0.2wt.％的聚山梨酯80；和

g.1-150mM磷酸盐缓冲液。

9.根据权利要求9所述制剂，其包含：

a.100mg/ml的抗VEGF单克隆抗体，所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQIDNO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示；

b.2.0wt.％的明胶；

c.3wt.％的甘氨酸；

d.60000个U/ml以上的透明质酸酶；

e.100mM海藻糖；

f.；0.09wt.％的聚山梨酯80；和

g.50mM磷酸盐缓冲液。

10.根据权利要求1-9任一所述制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。