CN112512561A - 稳定的融合蛋白制剂 - Google Patents

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CN112512561A CN201980049001.6A CN201980049001A CN112512561A CN 112512561 A CN112512561 A CN 112512561A CN 201980049001 A CN201980049001 A CN 201980049001A CN 112512561 A CN112512561 A CN 112512561A
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L·卡纳卡杜尔加姆
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Abstract

本发明公开了融合蛋白的稳定药物制剂，其中所述制剂包含缓冲剂、糖、氨基酸和表面活性剂，并且任选地包含盐。公开的融合蛋白制剂是也适合冻干的液体制剂。

Description

稳定的融合蛋白制剂
技术领域
本发明涉及融合蛋白分子的稳定制剂。具体地，本发明公开了稳定的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4-免疫球蛋白(CTLA4-Ig)融合蛋白制剂，其中该制剂包含缓冲系统和稳定剂。
背景技术
在过去的二十年中，重组DNA技术已导致许多蛋白质的商业化，特别是抗体治疗剂和融合蛋白分子。
融合蛋白，特别是Fc融合蛋白分子(其中人免疫球蛋白(Ig)的Fc部分与受体的特定部分缀合)变得重要，因为它们在治疗多种肿瘤疾病和免疫疾病中的广泛应用。依那西普(TNFR-IgFc)、阿柏西普(VEGFR-IgFc)和阿巴西普和贝拉西普(CTLA4-IgFc)是属于食品和药物管理局(FDA)批准的治疗多种疾病的那些Fc融合蛋白。融合蛋白分子的有效性主要取决于稳定性、给药途径以及它们的剂型和浓度。这进而使得这些蛋白质分子被适当配制以保持稳定性和活性成为必要。
通常，蛋白质(特别是Fc融合蛋白)典型地在溶液中是不稳定的，并且对pH、温度和氧化敏感，因此会在溶液中经历各种共价和非共价反应、修饰或降解。较常见的蛋白质降解途径包括聚集、脱酰胺和/或氧化，并且已知这些降解途径受pH、温度和储存条件包括制剂条件和赋形剂的影响。因此，这些途径导致溶液中蛋白质的物理和化学不稳定性。
治疗性蛋白质中的聚集特别令人关注，因为它通常会导致一段时间内的生物活性降低/活性丧失，并且当向患者给药时可能具有免疫原性。在融合蛋白的情况下，聚集是显著的，因为它们涉及两种或更多种蛋白质的融合，是大且复杂的结构，并且与简单的多肽或抗体相比倾向于以快速的速率形成聚集物。
除了聚集以外，多聚体蛋白的不稳定性的另一种类型(特别是在两种或更多种蛋白质融合的区域发生)是片段化/截断，这可能是脱酰胺、氧化、异构化和/或水解的结果。脱酰胺可发生在天冬酰胺或谷氨酰胺残基，从而导致蛋白质的一个或多个电荷变体。融合蛋白的氧化主要涉及甲硫氨酸残基，并且通常受外部因素影响，例如暴露于光和过渡金属离子或赋形剂的降解产物(例如，聚山梨酸酯降解产生的过氧化氢)。已知在治疗性蛋白质分子中这些氧化产物和电荷变体的存在会增加不稳定性，并因此降低蛋白质的生物活性。
因此，必须开发合适的一种或多种制剂组分的混合物，以使治疗性(融合)蛋白分子对许多物理和化学不稳定性诱导因素稳定。此外，开发的制剂应在储存条件下保持胶体稳定性，因为其可以衡量并确保蛋白质分子在平衡时在水溶液中保持悬浮。
存在许多种类的赋形剂，例如糖(糖或糖醇)、氨基酸和表面活性剂，其可用于稳定蛋白质和融合蛋白分子。然而，在配制蛋白质时，赋形剂的选择受多种其他因素(例如它们与制剂中的蛋白质和其他组分的相容性，(预期的)给药方式和治疗性蛋白质的剂量等)的控制。因此，制剂开发背后的挑战涉及筛选和选择合适的缓冲条件和赋形剂(包括其浓度)，以获得稳定制剂。此外，还期望所开发的制剂在室温下是稳定的并且适合以冻干或液体形式给药。
发明概述
本发明公开了融合蛋白分子的稳定药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖、氨基酸和表面活性剂，其中所述融合蛋白是CTLA4-Ig分子。
具体地，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白的稳定药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖、氨基酸和表面活性剂，其中所述制剂任选地包含药学上可接受的赋形剂(例如盐)。
另外，本发明公开了通过在制剂中配制包含氨基酸和糖，减少CTLA4-Ig融合蛋白的聚集和/或片段化的方法。更具体地，本发明包含通过组氨酸和糖的组合稳定的CTLA4-Ig融合蛋白制剂。糖和组氨酸的这种组合为存在于制剂中的融合蛋白分子赋予了胶体稳定性。
同样且特别地，本发明的制剂不含精氨酸或赖氨酸或甘氨酸或甲硫氨酸；或不需要或不包含除组氨酸以外的任何其他通常在治疗性蛋白质制剂中用作稳定剂的氨基酸。
另外，本发明还公开了增加包含组氨酸和糖的CTLA4-Ig融合蛋白制剂的稳定性的方法，其中所述组氨酸和糖组分也在工艺步骤(即，特别是在切向流过滤工艺步骤(制剂步骤之前的步骤))中添加。在该工艺中的这样的添加为制剂赋予了显著的稳定性。
所述制剂中的CTLA4-Ig融合蛋白在多种温度下在较低以及较高浓度(从10mg/ml至200mg/ml)下都是稳定的。该制剂当在25℃下储存时稳定至少四周，或在30℃下储存时稳定至少两周，并且包含低于10％的处于聚集物形式的蛋白质分子。
发明详述
定义
术语“融合蛋白”是指通过将两个不同的多肽的全部或部分融合(即连接)而形成的蛋白质。通常，融合蛋白是使用重组DNA技术通过将编码两个多肽的多核苷酸端到端(endto end)连接而制备的。
术语“CTLA4-Ig”或“CTLA4-Ig分子”或“CTLA4Ig分子”可互换地使用，并且是指蛋白质分子，其包含具有CTLA4细胞外结构域或其部分的多肽，和免疫球蛋白恒定区或其部分。细胞外结构域和免疫球蛋白恒定区可以是野生型、突变体或经修饰的，是哺乳动物的，包括人或小鼠。多肽还可以包含另外的蛋白质结构域。CTLA4-Ig分子也可以指多肽的多聚体形式，例如二聚体、四聚体和六聚体。CTLA4-Ig分子还能够与CD80和/或CD86结合。
术语“稳定”制剂是指如下制剂，其中在制剂中的抗体在储存时保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性。
配制前(pre-formulation)步骤是指在将蛋白质配制成治疗性产品之前进行的任何或多个步骤。这样的步骤的实例包括色谱法、过滤(超滤、无菌过滤、纳米过滤、渗滤、深度过滤)或为浓缩蛋白质或将缓冲剂与不同/合适的缓冲剂交换而进行的任何其他步骤。本文提及的过滤步骤可以切向流过滤方式进行。
稳定性研究提供了一段时间内在多种环境因素影响下抗体质量的证据。ICH的“Q1A：新药原料和产品的稳定性测试”指出了来自加速稳定性研究的数据可用于评价抗体运输过程中可能发生的高于或低于标记储存条件的短期偏移的影响。
有多种分析方法可用于测量药物制剂中融合蛋白的物理和化学降解。如果融合蛋白在肉眼检查颜色和/或透明度、或通过UV光散射、或通过体积排阻色谱测量时基本上未显示出聚集、沉淀和/或变性迹象，则所述融合蛋白在药物制剂中“保持了其物理稳定性”。当融合蛋白显示无产物变体形成或最小量的产物变体形成时，则称所述融合蛋白在药物制剂中“保持了其化学稳定性”，所述产物变体可包括由于对融合蛋白的化学修饰(如脱氨、氧化等)而导致的变体。诸如离子交换色谱和疏水离子色谱等的分析方法可用于研究化学产物变体。
可以通过体积排阻色谱法(SEC)分离CTLA4Ig分子的单体、二聚体和高分子量(HMW)物质。SEC根据分子大小分离分子。随分子沿着色谱柱的长度方向迁移，通过差异的分子排阻或包含来实现分离。因此，分离度作为色谱柱长度的函数而增加。为维持融合蛋白的适当活性，期望减少产物的聚集物形成或片段化(单体/低分子量物质)，并因此将二聚体含量控制在目标值。二聚体是融合蛋白中存在的主要形式，并且在体积排阻色谱法中作为主要峰洗脱。可以使用装备有TSK
Figure BDA0002910895270000041
G3000SWXL(300mm×7.8mm)和TSK
Figure BDA0002910895270000042
G3000SWXL(40mm×6.0mm)色谱柱(Tosoh Bioscience,Montgomery,Pa.)的2695Alliance HPLC(Waters,Milford,Mass.)分离CTLA4Ig分子样品。
蛋白质的胶体稳定性提供了关于在含水环境中蛋白质分子与自身的相互作用以及与周围分子之间的相互作用的信息。溶液中蛋白质分子胶体稳定性的常见指标或预测指标是通过动态光散射(DLS)技术测量的扩散系数(kD)值。扩散系数值越高，排斥力越大，蛋白质分子的溶解性越高，聚集物形成越少，并因此蛋白质表现出胶体稳定性。胶体稳定性是蛋白质溶解性、粘性、蛋白质聚集物类型等的指标。
药学上可接受的赋形剂是指添加剂或载体，所述添加剂或载体可以有助于抗体在制剂中的稳定性。赋形剂可包含稳定剂和张力调节剂。稳定剂和张力调节剂的实例包括但不限于糖、盐、表面活性剂以及它们的衍生物和组合。
本文的一种或多种糖包括糖和糖醇(例如多元醇)。糖可以指单糖、二糖和多糖。糖的实例包括但不限于蔗糖、海藻糖、葡萄糖、右旋糖、棉子糖等。多元醇的实例包括但不限于甘露醇、山梨糖醇及其它等。
表面活性剂是指用于保护蛋白质制剂免受多种压力条件(例如搅动、剪切、暴露于高温等)的药学上可接受的赋形剂。合适的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯(例如Tween 20TM或Tween 80TM)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(例如泊洛沙姆，普朗尼克)、十二烷基硫酸钠(SDS)等或它们的组合。
盐的实例包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌和/或乙酸钠。
通过参考以下实施例更全面地描述了本发明的某些特定方面和实施方式。然而，这些实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的范围。
实施方式的详细描述
本发明公开了融合蛋白的稳定药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖、氨基酸和表面活性剂。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白的稳定药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖、氨基酸和表面活性剂。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白的稳定药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖、组氨酸和表面活性剂，其中所述制剂还不包含精氨酸或赖氨酸或甘氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白的稳定药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖、组氨酸和表面活性剂，并且其中所述制剂不需要任何其他通常用于使治疗性蛋白质制剂稳定的氨基酸。
在以上任一实施方式中，糖是蔗糖或甘露醇。
在上述实施方式中，在制剂中存在的糖的浓度低于约125mg/ml，优选约100mg/ml或约90mg/ml、或约80mg/ml，并且在制剂中存在的氨基酸的浓度低于约20mg/ml、优选低于15mg/ml和更优选10mg/ml。
在上述任一实施方式中，制剂中融合蛋白的浓度为约10mg/ml至200mg/ml、优选20mg/ml至150mg/ml、更优选25mg/ml至125mg/ml。
在上述任一实施方式中，CTLA4-Ig融合蛋白制剂的粘度低于20cp、优选地低于10cp、更优选地低于5cp。
在本发明的上述任一实施方式中，CTLA4-Ig融合蛋白制剂的pH为6.0-8.0，优选6.5至7.5。
在本发明的上述任一实施方式中，制剂中的糖可以是蔗糖、海藻糖、山梨糖醇或甘露醇或其组合。
在上述实施方式中，制剂中所述的缓冲剂是有机缓冲剂、无机缓冲剂和/或其组合。
在本发明的上述任一实施方式中，所述有机缓冲剂是柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂或乙酸盐缓冲剂。
在本发明的又另一个实施方式中，制剂中所述的无机缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。
在上述任一实施方式中，制剂任选地包含药学上可接受的赋形剂(例如盐)。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白的稳定药物制剂，所述制剂包含磷酸盐缓冲剂、糖、组氨酸和表面活性剂，其中融合蛋白与糖的比率是1:0.8或更低。
在上述实施方式中，融合蛋白与氨基酸的比率是1:0.1或更低。
在上述实施方式中，CTLA4-Ig融合蛋白与糖与氨基酸的比率(例如1:0.7:0.1)导致该融合蛋白，甚至在压力条件下，与在融合蛋白制剂中包含更高的糖比率(即，融合蛋白与糖的比率为1:1.3或更高)的CTLA4-Ig制剂相当的稳定性。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白的稳定药物制剂，所述制剂包含磷酸盐缓冲剂、蔗糖、组氨酸和表面活性剂。
在另一个实施方式中，本发明公开了稳定的融合蛋白制剂，所述制剂包含CTLA4-Ig融合蛋白分子、磷酸盐缓冲剂、甘露醇、组氨酸和表面活性剂。
在上述实施方式中，当在30℃下储存四周时，所述稳定制剂包含低于10％的处于聚集物形式的蛋白质。
在上述任一实施方式中，制剂不需要精氨酸或赖氨酸或甘氨酸或脯氨酸或甲硫氨酸。更具体地，在上述任一实施方式中，制剂不需要除组氨酸以外的任何其他一种或多种氨基酸。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白分子的稳定药物制剂，所述制剂包含柠檬酸盐-磷酸盐缓冲剂、甘露醇、组氨酸和表面活性剂。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白分子的稳定药物制剂，所述制剂包含125mg/ml CTLA4-Ig融合蛋白、磷酸盐缓冲剂、75mg/ml甘露醇、15mg/ml组氨酸和8mg/ml泊洛沙姆。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白分子的稳定药物制剂，所述制剂包含125mg/ml CTLA4-Ig融合蛋白、磷酸盐缓冲剂、85mg/ml甘露醇、10mg/ml组氨酸和8mg/ml泊洛沙姆。
在一个实施方式中，本发明公开了CTLA4-Ig融合蛋白分子的稳定药物制剂，所述制剂包含125mg/ml CTLA4-Ig融合蛋白、磷酸盐缓冲剂、100mg/ml蔗糖、10mg/ml组氨酸和8mg/ml泊洛沙姆。
在一个实施方式中，本发明公开了获得CTLA4-Ig融合蛋白的稳定制剂的方法，所述方法包括添加缓冲剂、糖、组氨酸和表面活性剂，并且其中组氨酸和糖也添加至切向流过滤配制前工艺步骤(以超滤[UF]和渗滤[DF]进行)，并且通常进行超滤用于蛋白质浓缩和缓冲剂交换。
在另一个实施方式中，本发明公开了增加CTLA4-Ig融合蛋白组合物的稳定性的方法，其中所述方法包括在工艺步骤中添加组氨酸和糖，特别是在切向流过滤步骤中[以超滤(UF)和渗滤(DF)进行用于产物浓缩和缓冲剂交换]。更特别地，组氨酸和糖添加至在渗滤步骤中使用的缓冲剂中。
在又另一个实施方式中，本发明公开了增加CTLA4-Ig融合蛋白的稳定性的方法，所述方法包括如下步骤：表达和纯化CTLA4-Ig融合蛋白；随后通过UF-DF-UF对蛋白质进行浓缩和/或缓冲剂交换，其中在UF-DF-UF步骤的任一步骤中使用的缓冲剂包含组氨酸和糖；并且随后在包含组氨酸、糖和表面活性剂的缓冲剂中配制蛋白质；其中与通过在其任一缓冲剂中不包含组氨酸和糖的UF-DF-UF步骤加工的蛋白质的制剂相比，所述蛋白质的稳定性增加。
在一个实施方式中，本发明公开了制备稳定的高浓度CTLA4-Ig融合蛋白制剂的方法，所述方法包括：
a)从色谱法步骤获得纯化的CTLA4-Ig融合蛋白分子；
b)使从步骤a)获得的CTLA4-Ig融合蛋白进行超滤[UF]以浓缩蛋白质；
c)使用包含糖和组氨酸的缓冲剂使从步骤b)获得的浓缩的CTLA4-Ig融合蛋白进行渗滤；和
d)使来自步骤c)的CTLA4-Ig融合蛋白分子进行第二超滤，以获得进一步且高度浓缩的CTLA4-Ig融合蛋白药物原料，其中在步骤d)中获得的制剂的浓度为高达200mg/ml，并且如通过标准稳定性研究测量发现是稳定的。
当在切向流过滤步骤中添加组氨酸和糖组分时，发现蛋白质分子的稳定性在热稳定性和胶体稳定性方面显著提高。并且即使在进行加速稳定性研究后，在UF或DF步骤中添加组氨酸和糖导致％HMW始终低于10的稳定的产物。
在上述的实施方式中，从以上工艺获得的药物原料是稳定的，并且由该药物原料制备的药物产品在加速稳定性条件下是稳定的，其中该药物产品的浓度高达140mg/ml，优选130mg/ml。在TFF工艺的DF步骤中添加组氨酸和糖有助于实现稳定且可溶的较高浓度的CTLA4-Ig融合蛋白分子(高达约200mg/ml)，进而有助于通过简单的稀释技术以商业规模制备期望浓度的药物产品。这另外节省了时间和资源。
在上述实施方式中，其中组氨酸和糖也添加至UF或DF配制前工艺步骤，即使在30℃下储存至少两周，配制的蛋白质也包含低于10％的处于聚集物形式的蛋白质。
在另一个实施方式中，本发明公开了稳定的融合蛋白制剂，所述制剂包含CTLA4-Ig融合蛋白分子、磷酸盐缓冲剂、蔗糖、组氨酸、氯化钠和表面活性剂。
在上述任一实施方式中，制剂具体地不包含精氨酸和/或赖氨酸。
在一个实施方式中，本发明公开了减少CTLA4-Ig融合蛋白制剂中(在储存时)聚集的方法，所述方法包括向所述融合蛋白制剂中添加组氨酸和糖。
在另外的实施方式中，本发明公开了抑制CTLA4-Ig融合蛋白制剂中(在储存时)片段化的方法，所述方法包括向所述制剂中添加组氨酸和糖。
在另一个实施方式中，本发明公开了维持制剂中CTLA4-Ig融合蛋白的胶体稳定性的方法，所述方法包括向包含所述融合蛋白的所述制剂中添加组氨酸和糖。
在另一个实施方式中，本发明公开了减少制剂中CTLA4-Ig融合蛋白的氧化的方法，其中所述方法包括添加氨基酸和糖，其中所述氨基酸是组氨酸。组氨酸和糖的组合保护CTLA4-Ig融合蛋白分子中存在的甲硫氨酸残基免受氧化。
在上述实施方式中，所述稳定制剂任选地包含抗氧化剂。
在本发明的以上任一实施方式中，稳定制剂是液体/含水制剂，并且适合于并且可以冻干为冻干粉末。另外，可以用适当的稀释剂重构CTLA4-Ig融合蛋白的冻干制剂以获得适合于给药的液体制剂。
在上述任一实施方式中，CTLA4-Ig融合蛋白是阿巴西普或贝拉西普。
在上述任一实施方式中，添加至制剂的氨基酸组氨酸作为稳定剂起作用，并且不形成缓冲剂的一部分。
在上述任一实施方式中，CTLA4-Ig融合蛋白的制剂是稳定的液体(含水)制剂，其可以用于肠胃外给药。肠胃外给药包括静脉内、皮下、腹膜内、肌内给药或任何其他通常认为属于肠胃外给药范围且本领域技术人员熟知的递送途径。
本发明公开的制剂使用较少量的糖或糖醇来稳定治疗性融合蛋白分子。并且所公开的包含缓冲剂、糖、氨基酸和表面活性剂的CTLA4-Ig融合蛋白制剂的制剂是稳定的，并且可以经受多个冻融循环以及搅动引起的压力。
所公开的融合蛋白CTLA4-Ig的制剂主要通过组氨酸和糖的组合来稳定，并且不需要通常用于稳定治疗性制剂的任何其他氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、脯氨酸、甘氨酸或甲硫氨酸。令人惊讶地，向该制剂中添加任何其他氨基酸或氨基酸的组合实际上使蛋白质不稳定。CTLA4-Ig(例如阿巴西普)是融合蛋白，本质上是二聚体，其是复合分子，易于聚集和氧化，然而预料不到地仅由氨基酸组氨酸(和糖)稳定。
实施例
通过本领域已知的标准方法生产本发明药物组合物中合适于储存的CTLA4-Ig融合蛋白分子(阿巴西普)。例如，通过在哺乳动物宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)中，重组表达与人IgG的CH2和CH3部分融合的CTLA4来制备阿巴西普。另外，将表达的阿巴西普收获，并对粗获取物进行标准的下游工艺步骤(包括纯化、过滤和任选的稀释或浓缩步骤)。例如，可以使用标准色谱技术(例如亲和色谱、离子交换色谱及其组合)对阿巴西普的粗获取物进行纯化。纯化的阿巴西普溶液可另外进行一个或多个过滤步骤，并对获得的溶液进行进一步的制剂研究。
实施例1：筛选和选择合适的缓冲剂以配制阿巴西普
为选择合适的一种或多种缓冲剂用于稳定阿巴西普，制备了多种缓冲剂。将获得自下游色谱法工艺的在磷酸盐缓冲剂背景中的40mg/ml阿巴西普进行缓冲剂交换，并在各自不同的一种或多种缓冲剂背景中稀释至25mg/ml。表1给出了制剂的细节。
在25℃和40℃下对所有阿巴西普制剂进行加速稳定性研究，持续四周。之后，使用体积排阻色谱法(SEC)分析样品的高分子量(HMW)物质和低分子量(LMW)物质[结果示于表2和3中]，并且还检查样品pH[表4]和肉眼观察[表5]的变化。
表1：根据实施例1的不同缓冲剂中的多种阿巴西普制剂的组成
样品名称 组成
Aba-IV-1 25mg/ml阿巴西普、10mM磷酸盐缓冲剂、pH 7.2
Aba-IV-2 25mg/ml阿巴西普、20mM组氨酸缓冲剂、pH 7.1
Aba-IV-3 25mg/ml阿巴西普、20mM柠檬酸盐缓冲剂、pH 7.1
Aba-IV-4 25mg/ml阿巴西普、20mM组氨酸-磷酸盐缓冲剂、pH 7.1
Aba-IV-5 25mg/ml阿巴西普、20mM琥珀酸盐缓冲剂、pH 7.1
Aba-IV-6 25mg/ml阿巴西普、20mM乙酸钠缓冲剂、pH 7.2
表2：根据实施例1制备的阿巴西普(25mg/ml)制剂的SEC数据
Figure BDA0002910895270000101
Figure BDA0002910895270000111
W表示周，T0表示‘零’时间点，Δ(δ)表示从零时间点至指定时间点的变化值
表3：根据实施例1制备的阿巴西普(25mg/ml)制剂的SEC数据
Figure BDA0002910895270000112
W表示周，T0表示‘零’时间点，Δ(δ)表示从零时间点至指定时间点的变化值
表4：在40℃和25℃下，根据实施例1制备的阿巴西普(25mg/ml)制剂的pH
Figure BDA0002910895270000113
Figure BDA0002910895270000121
W表示周，T0表示‘零’时间点，Δ(δ)表示从零时间点至指定时间点的变化值
表5：根据实施例1制备的阿巴西普(25mg/ml)制剂的肉眼观察数据
Figure BDA0002910895270000122
W表示周，T0表示‘零’时间点
实施例2：在一种或多种糖和一种或多种氨基酸的存在下的高浓度阿巴西普(约125mg/ml)制剂
将获得自下游工艺的切向流过滤(TFF)步骤的磷酸盐缓冲剂背景中的大约120mg/ml阿巴西普在各缓冲剂背景中进行缓冲剂交换。之后，将多种赋形剂(例如糖和氨基酸)以不同的组合和浓度添加至高浓度的阿巴西普制剂。表6给出了制剂的细节。FDA批准的阿巴西普皮下制剂含有磷酸盐缓冲剂、170mg/ml蔗糖和泊洛沙姆。因此，为保持参考标准，对于磷酸盐缓冲剂背景中约120mg/ml的内部阿巴西普，向制剂中添加170mg/ml蔗糖和8mg/ml泊洛沙姆。
在30℃下，对所有高浓度的阿巴西普制剂进行加速稳定性研究，持续四周。之后，使用体积排阻色谱法(SEC)分析样品的高分子量(HMW)物质[结果示于表7中]，并且还检查样品pH[表8]和肉眼观察[表9]的变化。
表6：根据实施例2制备的多种高浓度阿巴西普制剂(约120mg/ml)的组成
Figure BDA0002910895270000131
Figure BDA0002910895270000141
表7：根据实施例2制备的高浓度阿巴西普(约120mg/ml)制剂的SEC数据
Figure BDA0002910895270000142
W表示周；NM-由于样品变得完全混浊，未测量，
Δ(δ)表示从零时间点至指定时间点的变化值
表8：在30℃下根据实施例2制备的高浓度阿巴西普制剂的pH
Figure BDA0002910895270000151
W表示周；Δ(δ)表示从零时间点至指定时间点的变化值
表9：根据实施例2制备的阿巴西普(25mg/ml)制剂的肉眼观察数据
Figure BDA0002910895270000152
Figure BDA0002910895270000161
W表示周
实施例3：高浓度阿巴西普(约125mg/ml)制剂
将获得自下游工艺的切向流过滤(TFF)步骤的磷酸盐缓冲剂背景中的大约120mg/ml阿巴西普在各缓冲剂背景中进行缓冲剂交换。之后，将多种赋形剂(例如糖、氨基酸和氯化钠)以不同的组合和浓度添加至高浓度的阿巴西普制剂。表10给出了制剂的细节。FDA批准的阿巴西普皮下制剂含有磷酸盐缓冲剂、170mg/ml蔗糖和泊洛沙姆。因此，为保持对于磷酸盐缓冲剂背景中的约120mg/ml的内部阿巴西普的参考标准，向制剂中添加170mg/ml蔗糖和8mg/ml泊洛沙姆。
在30℃下，对所有高浓度的阿巴西普制剂进行加速稳定性研究，持续两周。之后，使用体积排阻色谱法(SEC)分析样品的高分子量(HMW)物质和活性二聚体形式[结果示于表11中]，并且还检查样品pH[表12]和肉眼观察[表13]的变化。
还使用nano drop检查了在333nm处的蛋白质样品的光散射，结果示于表14。
表10：根据实施例3制备的多种高浓度阿巴西普制剂的组成
Figure BDA0002910895270000162
Figure BDA0002910895270000171
表11：根据实施例3制备的阿巴西普(约120mg/ml)制剂的二聚体含量的SEC数据
Figure BDA0002910895270000172
W表示周
表12：在30℃下根据实施例3制备的高浓度阿巴西普制剂的pH
Figure BDA0002910895270000181
W表示周；Δ(δ)表示从零时间点至指定时间点的变化值
表13：在30℃下根据实施例3制备的高浓度阿巴西普制剂的肉眼观察数据
Figure BDA0002910895270000182
表14：在30℃下根据实施例3制备的高浓度阿巴西普制剂在333nm(A333)下的光散射数据
Figure BDA0002910895270000191
实施例4：为高浓度CTLA4-Ig融合蛋白的稳定性，在切向流过滤(TFF)步骤中添加赋形剂
在实施例2和3中，将获得自下游色谱法步骤的纯化的阿巴西普进一步缓冲剂交换为磷酸盐缓冲剂，并且通过切向流过滤(TFF)浓缩(以一系列超滤、渗滤和超滤步骤进行)。之后，将赋形剂添加至制剂。但是不同于该常规策略，在TFF本身期间(即，在制剂步骤之前或在将蛋白质配制为药物产品之前)掺入多种糖(例如蔗糖和甘露醇)和氨基酸(例如组氨酸和甘氨酸)。对获得自色谱法步骤的8-15mg/ml浓度的乙酸盐缓冲剂中的阿巴西普融合蛋白进行超滤以浓缩至60mg/ml。之后，对样品进行渗滤，其中渗滤介质包含具有赋形剂(例如糖和一种或多种氨基酸)的磷酸盐缓冲剂(制剂缓冲剂)，并且在另一个单独的实验中，对磷酸盐缓冲剂中不含糖和一种或多种氨基酸的渗滤介质进行实验。渗滤后，对样品进行第二次超滤，以浓缩至180mg/ml至200mg/ml。发现这些高浓度样品是稳定的，没有任何可见的颗粒/聚集物。将高度浓缩的样品进一步稀释至125mg/ml，并添加一些赋形剂(例如糖、表面活性剂和任选存在的氨基酸(例如甘氨酸))以制备最终制剂。将8mg/ml的泊洛沙姆添加至所有的最终制剂。表15给出了制剂的细节。在30℃下，对所有样品进行加速稳定性研究，持续2周。使用体积排阻色谱法(SEC)分析样品的高分子量(HMW)物质和活性二聚体形式[结果示于表16中]，并且还检查样品pH[表17]和肉眼观察[表18]的变化。
表15：根据实施例4制备的多种高浓度阿巴西普制剂的组成
Figure BDA0002910895270000201
Figure BDA0002910895270000211
Figure BDA0002910895270000221
表16：根据实施例4制备的高浓度阿巴西普制剂的SEC数据
Figure BDA0002910895270000222
Figure BDA0002910895270000231
W表示周
表17：在30℃下根据实施例4制备的高浓度阿巴西普制剂的pH
Figure BDA0002910895270000232
Figure BDA0002910895270000241
W表示周；NT-由于样品限制未测试；Δ(δ)表示从零时间点至指定时间点的变化值
表18：在30℃下根据实施例4制备的高浓度阿巴西普制剂的肉眼观察数据
Figure BDA0002910895270000242
Figure BDA0002910895270000251
W表示周；
使用
Figure BDA0002910895270000252
粘度计测量根据实施例4制备的一些阿巴西普制剂的粘度。结果在表19中给出。
表19：高浓度阿巴西普制剂的粘度
样品名称 粘度(mPa/S)
Aba-SC-24 10.9
Aba-SC-26 9.2
Aba-SC-34 9.0
Aba-SC-38 9.0
可选地，将氨基酸甲硫氨酸添加至组氨酸和糖组合的阿巴西普制剂，并评估其对稳定性的作用。在30℃下，对样品(在制剂中含有或不含有甲硫氨酸)进行加速稳定性研究持续一周。使用体积排阻色谱法(SEC)分析样品的高分子量(HMW)物质和活性二聚体形式[结果示于表20中]。
表20：含有和不含有甲硫氨酸制备的阿巴西普制剂的SEC数据
Figure BDA0002910895270000253
Figure BDA0002910895270000261
W表示周
实施例5：高浓度阿巴西普制剂的长期稳定性数据
从上述实验明显看出，在TFF中添加糖和一种或多种氨基酸在稳定阿巴西普方面起着重要作用。因此，在30℃下进一步观察来自以上实验的进一步的一些制剂直到4周。使用体积排阻色谱法(SEC)分析样品的高分子量(HMW)物质和活性二聚体形式[结果示于表21]中。
表21：在30℃下持续四周的根据实施例4制备的高浓度阿巴西普制剂的SEC数据
Figure BDA0002910895270000262
W表示周；
在30℃下，对阿巴西普制剂(A′(125mg/ml阿巴西普、100mg/ml蔗糖、15mg/ml组氨酸、10mg/ml甘氨酸和8mg/ml泊洛沙姆)和B′(125mg/ml阿巴西普、75mg/ml甘露醇、15mg/ml组氨酸、10mg/ml甘氨酸和8mg/ml泊洛沙姆))进行加速稳定性研究持续四周，之后进行基于CD28受体配体的试验以表明和证明该稳定的阿巴西普制剂具有功能活性。发现该制剂具有功能活性，并且表现出90.7％的效力(A′)和93.6％的效力(B′)。
实施例6：评价高浓度阿巴西普制剂的氧化
对根据实施例4制备的一些阿巴西普融合蛋白制剂进行质谱，以了解赋形剂对阿巴西普氧化位点的作用效果。阿巴西普融合蛋白包含七个甲硫氨酸残基。来自实施例4的一些含有糖和一种或多种氨基酸的阿巴西普制剂在30℃下持续四周进行加速稳定性研究直至4周，在‘0’和4周时间点处进行收集。将在30℃下在‘0’和‘4’周时间点处收集的阿巴西普制剂使用缓冲剂(8.2M盐酸胍、1mM EDTA和0.1M Tris、pH 7.5)进行变性，并使用10mM二硫苏糖醇还原，并使用碘乙酰胺进行烷基化。将烷基化的样品经PD-10色谱柱以除去消化缓冲剂。在37℃下，将获得自PD-10色谱柱的蛋白质级分用胰蛋白酶和N-聚糖酶处理过夜。将获得自以上步骤的肽片段进行质谱分析，以了解赋形剂对阿巴西普氧化位点的影响。表22给出了研究结果，氧化％表明甲硫氨酸残基受到保护免受氧化。
表22：在30℃下储存的阿巴西普制剂中甲硫氨酸的氧化百分比
Figure BDA0002910895270000271
T0表示在‘0’时间点处的数据点。

Claims (9)

1.CTLA4-Ig融合蛋白的稳定制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖、组氨酸和表面活性剂。
2.如权利要求1所述的制剂，其中所述制剂不需要任何其他的一种或多种氨基酸作为稳定剂。
3.如权利要求1所述的制剂，其中CTLA4-Ig融合蛋白的浓度为约20mg/ml至约200mg/ml。
4.如权利要求1所述的制剂，其中CTLA4-Ig融合蛋白与糖的比率为1:0.8或更低，并且所述CTLA4-Ig融合蛋白与氨基酸的比率为1:0.1或更低。
5.如权利要求1所述的制剂，其中所述制剂当在25℃下储存时稳定至少四周，或在30℃下储存时稳定至少两周，并且包含低于10％的处于聚集物形式的蛋白质分子，并且所述制剂还保护CTLA4-Ig融合蛋白免受氧化。
6.如权利要求1所述的制剂，其中所述制剂的pH为6.0-8.0，优选6.5至7.5。
7.获得CTLA4-Ig融合蛋白的稳定制剂的方法，所述方法包括添加缓冲剂、糖、组氨酸和表面活性剂，并且其中组氨酸和糖也添加至超滤和/或渗滤配制前工艺步骤。
8.增加CTLA4-Ig融合蛋白的稳定性的方法，所述方法包括如下步骤：表达和纯化CTLA4-Ig融合蛋白；通过超滤和渗滤(UF-DF)对蛋白质进行浓缩和/或缓冲剂交换，其中在UF和/或DF步骤中使用的缓冲剂包含组氨酸和糖；随后在包含组氨酸、糖和表面活性剂的缓冲剂中配制蛋白质；其中与通过在其缓冲剂中不包含组氨酸和糖的UF-DF步骤加工的蛋白质的制剂相比，所述蛋白质的稳定性增加。
9.如权利要求1或7或8所述的制剂，其中所述制剂的粘度低于15cp，优选低于10cp。
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