DE69835515T2 - Modifizierte arginindeiminase - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft mit Polyethylenglycol modifizierte Arginindeiminase, ihre Verwendung zur Herstellung eine pharmazeutischen Zubereitung für die Behandlung von Krebs und für die Behandlung und Inhibierung von Metastasen.
  • Malignes Melanom (3. Stadium) und Hepatom sind folgenschwere Erkrankungen, an denen die meisten Patienten innerhalb eines Jahres nach erfolgter Diagnose sterben. In den USA sterben jährlich ca. 16.000 Menschen an diesen Krankheiten. Die Zahl der Melanomfälle nimmt in den USA rasch zu und ist in anderen Ländern wie z.B. in Australien sogar noch höher. Die Zahl der Hepatomfälle ist in manchen Teilen der Welt, in denen Hepatitis endemisch ist, sogar noch größer. So z.B. ist Hepatom eine der vorherrschenden Formen von Krebs in Japan und auf Taiwan. Es besteht somit ein starker Bedarf an wirksamen Behandlungen dieser Krankheiten.
  • Zur Behandlung bestimmter Krebsformen hat man bisher bestimmte essentielle Aminosäuren selektiv entzogen. Das beste bekannte Beispiel dafür ist die Verwendung von L-Asparaginase zur Verminderung der Konzentration an Asparagin als Behandlungsmethode bei akuter lymphoblastischer Leukämie. Die am häufigsten verwendete L-Asparaginase wird aus E. coli isoliert. Die klinische Verwendung dieses Enzyms wird jedoch durch seine Antigenität und kurze Kreislaufhalbwertszeit beeinträchtigt, wie dies z.B. Y.K. Park, et al., Anticancer Res., 1: 373–376(1981), beschreibt. Die kovalente Modifizierung von E. coli-L-Asparaginase mit Polyethylenglycol vermindert ihre Antigenität und verlängert ihre Kreislaufhalbwertszeit, wie dies z.B. Park, Anticancer Res. ibid.; Y. Kamisaki et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 216: 410–414 (1981 und Y. Kamisaki et al., Gann., 73: 47–474 (1982) beschreiben. PEG-hGH ergab einen erhöhten EC50-Wert bei einem Clearance- Wert, der sich zur wirksamen Molekularmasse umgekehrt proportional verhält (Clark R. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271, 21969–77). Kita Y. et al. (Drug Design and Delivery, 1990, 6, 157–167) konnten zeigen, dass mit PEG konjugiertes rekombinantes menschliches γ-Interferon eine erhöhte Halbwertszeit hat, wobei fast keine Clearance festgestellt wurde. Obwohl große Anstrengungen unternommen wurden, um weitere essentielle Aminosäuren abbauende Enzyme für die Behandlung von Krebs zu finden, hat sich keines von ihnen bewährt, vor allem deshalb, weil der Entzug essentieller Aminosäuren per definitionem zahlreiche schwerwiegende Nebenwirkungen zeitigt.
  • Es wurde auch berichtet, dass nichtessentielle Aminosäuren wie Arginin abbauende Enzyme ein wirksames Mittel zur Bekämpfung bestimmter Krebsformen abgeben können. So z.B. beschrieb J.B. Jones in "The Effect of Arginine Deiminase on Murine Leukemic Lymphoblasts" Ph.D. Dissertation, The University of Oklahoma, SS. 1–165 (1981) aus Pseudomonas pudita isolierte Arginindeiminase (ADI). Obwohl aus Pseudomonas pudita isolierte ADI bei der Abtötung von Tumorzellen in vitro wirksam ist, zeigte es jedoch in vivo keine Wirkung, da es bei neutralem pH nur eine geringe Enzymaktivität entwickelte und aus dem Kreislauf der Versuchstiere rasch entfernt wurde. Die aus Mycoplasma arginini gewonnene Arginindeiminase haben z.B. Takaku et al., Int. J. Cancer, 51: 244–249 (1992) und die US-PS Nr. 5 474 928 beschrieben.
  • Ein Problem im Zusammenhang mit der therapeutischen Verwendung eines derartigen heterologen Proteins ist seine Antigenität. Die chemische Modifizierung von Arginindeiminase aus Mycoplasma arginini über Cyanursäurechlorid als Verknüpfungsgruppe mit Polyethylenglycol wurde von Takaku et al., Jpn. J. Cancer Res., 84: 1195–1200 (1993) beschrieben. Das modifizierte Protein war jedoch bei der Metabolisierung infolge der Freisetzung von Cyanid aus dem Cyanursäurechlorid als Verknüpfungsgruppe toxisch.
  • Es besteht somit ein Bedarf an Zubereitungen, welche nichtessentielle Aminosäuren abbauen, dabei jedoch nicht die mit dem Stand der Technik verbundenen Probleme aufweisen. Diesen Zweck und andere Zwecke erfüllt die vorliegende Erfindung.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Verbindung, die über eine Verknüpfungsgruppe an Polyethylenglycol kovalent gebundene Arginindeiminase umfasst, wobei das Polyethylenglycol eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse im Bereich von 16.000 bis 40.000 aufweist.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der Verbindung für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung von Tumoren, wie z.B. von Sarkomen, Hepatomen und Melanomen. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Verbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung und Inhibierung der Metastasierung von Tumorzellen.
  • Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung erhellen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung die Erfindung.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 beschreibt die Aminosäuresequenzen der aus Mycoplasma arginini geklonten Arginindeiminase (die obere Aminosäuresequenz, SEQ ID NO:1, identifiziert als ADIPROT), Mycoplasma arthritides (die mittlere Aminosäuresequenz, SEQ ID NO:2, identifiziert als ARTADIPRO) und Mycoplasma hominus (die untere Aminosäuresequenz, SEQ ID NO:3, identifiziert als HOMADIPRO).
  • 2A und 2B stellen Diagramme dar, welche die Wirkung einer Einzeldosis nativer Arginindeiminase und mit Polyethylenglycol modifizierter Arginindeiminase (z.B. mit einem Molekulargewicht von 5.000) auf den Serumargininspiegel und den Serumcitrullinspiegel bei Mäusen zeigen.
  • 3 stellt ein Diagramm dar, welches die Wirkungen auf die Serum-Arginin-Konzentrationen zeigt, wenn PEG 10.000 über verschiedene Verknüpfungsgruppen kovalent an ADI gebunden ist.
  • 4 stellt ein Diagramm dar, welches die Wirkung, welche die Verknüpfungsgruppe und das Molekulargewicht des Polyethylenglycols auf die Citrullinproduktion bei Mäusen haben, denen eine einzige Dosis PEG-ADI injiziert wurde.
  • 5A und 5B stellen Diagramme dar, welche die Dosiswirkung zeigen, welche ADI-SS-PEG 5.000 auf die Serum-Arginin- und Citrullin-Konzentrationen hat.
  • 5C und 5D stellen Diagramme dar, welche die Dosiswirkung zeigen, welche ADI-SS-PEG 20.000 auf die Serum-Arginin- und Citrullin-Konzentrationen hat.
  • 6 stellt ein Diagramm dar, welches die Antigenität von nativer ADI, ADI-SS-PEG 5.000 und ADI-SS-PEG 20.000 zeigt.
  • 7 stellt ein Diagramm dar, welches die Wirkung zeigt, welche die Behandlungen mit ADI-SS-PEG 5,000, ADI-SS 12.000 oder ADI-SS-PEG 20.000 auf die Tumorgröße bei Mäusen haben, denen menschliche SK-mel 2-Melanomzellen injiziert wurden.
  • 8 stellt ein Diagramm dar, welches die Wirkung zeigt, welche die Behandlungen mit ADI-PEG 20.000 auf die Tumorgröße bei Mäusen haben, denen menschliche SK-mel 28-, SK-mel 2 oder M24-met-Melanomzellen injiziert wurden.
  • 9 stellt ein Diagramm das, welches die Wirkung zeigt, welche die Behandlungen mit ADI-PEG 5.000, ADI-PEG 12.000 oder ADI-PEG 20.000 auf das Überleben von Mäusen haben, denen menschliche Hepatom-SK-Hep1-Zellen injiziert wurden.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Normale Zellen bedürfen für ihr Wachstum kein Arginin, da sie dieses aus Citrullin in einem zweistufigen, durch Arginosuccinatsynthase und Arginosuccinatlyase katalysierten Verfahren selbst zu synthetisieren vermögen. Im Gegensatz dazu exprimieren Melanome, Hepatome und einige Sarkome keine Arginosuccinatsynthase und sind daher Arginin-auxotroph. Diesen Unterschied im Stoffwechsel kann man sich soweit zunutze machen, dass es gelingt, eine sichere und wirksame Therapie zur Behandlung der genannten Krebsformen zu entwickeln. Arginindeiminase katalysiert die Umwandlung von Argininin zu Citrullin und kann zur Entfernung von Arginin verwendet werden. Arginindeiminase kommt somit für die Behandlung von Melanomen, Hepatomen und bestimmten Sarkomen in Frage.
  • Native Arginindeiminase findet sich in Mikroorganismen, ist antigen und wird aus dem Kreislauf eines Patienten rasch ausgeschieden. Diese Probleme können durch kovalente Modifizierung von Arginindeiminase mit Polyethylenglycol (PEG) beseitigt werden. Mit Polyethylenglycol (über eine Verknüpfungsgruppe) kovalent modifizierte Arginindeiminase wird nachfolgend als "ADI-PEG" bezeichnet). Im Vergleich zu nativer Arginindeiminase behält ADI-PEG seine enzymatische Aktivität zum größten Teil bei, ist weniger antigen, weist eine weit höhere Kreislaufhalbwertszeit auf und ist weit wirksamer bei der Behandlung von Tumoren.
  • "Polyethylenglycol" ("PEG") bedeutet hier Gemische verzweigter oder geradkettiger Kondensationspolymere von Ethylenoxid mit Wasser der allgemeinen Formel H(OCH2CH2)nOH, worin n wenigstens 4 bedeutet. Der Ausdruck "PEG" ist hier immer mit einer Zahl verbunden, um seine massegemittelte Molekülmasse anzugeben. So z.B. bedeutet PEG 20.000 Polyethylenglycol mit einer massegemittelten Gesamtmolekularmasse von ca. 20.000.
  • Der Ausdruck "Melanom" bedeutet hier einen malignen oder benignen Tumor, der aus dem Melanocytensystem der Haut und anderer Organe, einschließlich der Mundhöhle, der Speiseröhre, des Afters, der Vagina, der Leptomeningen und/oder der Conjunctivae der Augen entsteht. Der Ausdruck "Melanom" umfasst z.B. acral-lentigines Melanom, amelanotisches Melanom, benignes juveniles Malanom, Lentigo maligna-Melanom, malignes Melanom, Nodularmelanom, subluinguales Melanom und oberflächlich sich ausbreitendes Melanom.
  • Der Ausdruck "Hepatom" bedeutet einen malignen oder benignen Lebertumor, wie z.B. Hepatocellularkarzinom.
  • Der Ausdruck "Patient" bedeutet ein Tier, vorzugsweise ein Säugetier, insbesondere jedoch einen Menschen.
  • Der Ausdruck "bioverträglich" bedeutet Stoffe bzw. Verbindungen, welche im allgemeinen biologische Funktionen nicht schädigen und nicht zu einem inakzeptablen Grad an Toxizität einschließlich allergener Zustände und Erkrankungen führen.
  • In der vorliegenden Anmeldung werden folgende Abkürzungen verwendet: PEG für Polyethylenglycol, ADI für Arginindeiminase, SS für Succinimidylsuccinat, SSA für Succinimidylsuccinamid, SPA für Succinimidylpropionat und NHS für N-Hydroxysuccinimid.
  • Die vorliegende Erfindung beruht auf der überraschenden Entdeckung, dass mit Polyethylenglycol modifizierte ADI zu ausgezeichneten Ergebnissen bei der Behandlung bestimmter Krebstypen und zur Inhibierung der Metastasierung von Krebs führt. ADI kann über eine Verknüpfungsgruppe oder ohne eine solche kovalent an Polyethylenglycol gebunden werden, obwohl gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eine Verknüpfungsgruppe verwendet wird.
  • Erfindungsgemäß kann das Arginindeiminase-Gen aus jeder be liebigen Quelle einschließlich z.B. Mikroorganismen durch rekombinante Biotechnologie oder entsprechende Kombinationen gewonnen, geklont oder produziert werden. Vorzugsweise wird Arginindeiminase aus Mikroorganismen der Gattung Mycoplasma geklont. Insbesondere wird die Arginindeiminase aus Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominus, Mycoplasma arthritides oder einer Kombination davon geklont. Die erfindungsgemäß verwendete Arginindeiminase kann insbesondere eine oder mehrere Aminosäuresequenzen, wie sie in 1 dargestellt sind, aufweisen.
  • Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung hat das PEG eine massegemittelte Gesamtmolekularmasse von 16.000–40.000, insbesondere von 16.000–30.000, bevorzugt von 16.000–28.000, besonders bevorzugt von 16.000–24.000, ganz besonders bevorzugt von 18.000–22.000, vor allem bevorzugt von 19.000–21.000 und schließlich besonders bevorzugt von ca. 20.000. Polyethylenglycol mit einer Molekülmasse von 30.000 oder mehr ist im Allgemeinen schwer zu lösen und die Ausbeuten an formuliertem Produkt sind stark herabgesetzt. Das Polyethylenglycol kann verzweigt oder geradkettig sein, bevorzugt jedoch geradkettig. Mit zunehmender Molekularmasse des Polyethylenglycols nimmt im allgemeinen die Immunogenität der ADI ab. Polyethylenglycol mit einer Molekularmasse, wie sie in dieser Ausführungsform beschrieben wird, kann in Verbindung mit ADI und einer biokompatiblen Verknüpfungsgruppe zur Behandlung von Krebs, einschließlich z.B. Melanome und Sarkome, vorzugsweise Melanome, verwendet werden.
  • Die zur kovalenten Verknüpfung von ADI mit PEG verwendete Verknüpfungsgruppe kann eine beliebige biokompatible Verknüpfungsgruppe sein. Der Ausdruck "biokompatibel" bedeutet, dass die Verbindung oder die Gruppe nichttoxisch ist und in vitro oder in vivo verwendet wird, ohne dass dies zu Verletzungen, Übelkeit, Krankheit oder zum Tode führt. PEG kann z.B. über eine Ether-, eine Ester-, eine Thiol- oder eine Amidbindung mit der Verknüpfungsgruppe verbunden sein. Ge eignete Verknüpfungsgruppen sind z.B. eine Ester-, eine Amid-, eine Imid-, eine Carbamat-, eine Carboxyl-, eine Hydroxylgruppe, ein Kohlenhydrat, eine Maleimidgruppe (einschließlich z.B. Succinimidylsuccinat (SS), Succinimidylpropionat (SPA), Succinimidylcarboxymethylat (SCM), Succinimidylsuccinamid (SSA) oder N-Hydroxysuccinimid (NHS)), eine Epoxidgruppe, eine Oxycarbonylimidazolgruppe (einschließlich z.B. Carbonyldimidazol (CDI), eine Nitrophenylgruppe (einschließlich z.B. Nitrophenylcarbonat (NPC) oder Trichlorphenylcarbonat (TPC)), eine Trysylatgruppe, eine Aldehydgruppe, eine Isocyanatgruppe, eine Vinylsulfongruppe, eine Tyrosingruppe, eine Cysteingruppe, eine Histidingruppe oder ein primäres Amin. Vorzugsweise ist die biokompatible Verknüpfungsgruppe eine Estergruppe und/oder eine Maleimidgruppe. Die Verknüpfungsgruppe ist insbesondere SS, SPA, SCM, SSA oder NHS, vorzugsweise SS, SPA oder NHS, und insbesondere SS oder SPA.
  • Die ADI kann über eine biokompatible Verknüpfungsgruppe nach bekannten Methoden, wie z.B. nach Park et al. (1981) Anticancer Res. 1: 373–376, und Zaplipsky and Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J.M. Harris, ed., Plenum Press, NY, Chapter 21 (1992), mit dem PEG kovalent verbunden werden.
  • Die Verknüpfung der PEG mit der ADI erhöht die Kreislaufhalbwertszeit der ADI. Im Allgemeinen wird das PEG mit einem primären Amin der ADI verknüpft. Die Wahl der Stelle der Verknüpfung des PEG mit der Arginindeiminase, hängt von der Rolle der jeweiligen Stelle innerhalb des aktiven Bereichs des Proteins ab, was dem Fachmann bekannt ist. Das PEG kann mit dem primären Amin der Arginindeiminase ohne erheblichen Verlust an enzymatischer Aktivität verknüpft werden. So z.B. weist aus Mycoplasma arginini, Mycoplasma arthritides und Mycoplasma hominus geklonte ADI ca. 17 Lysine auf, die nach diesem Verfahren modifiziert werden können. Diese stellen mit anderen Worten alle möglichen Stellen dar, an denen die ADI mit PEG über eine biokompatible Verknüpfungsgruppe, wie z.B. SS, SPA, SCM, SSA und/oder NHS, verknüpft werden kann. PEG kann auch mit anderen Stellen an der ADI verknüpft werden, was dem Durchschnittsfachmann auf dem vorliegenden Gebiet anhand der vorliegenden Erfindung leicht festgestellt werden kann.
  • 1–30 PEG-Moleküle können an die ADI kovalent gebunden werden. Vorzugsweise wird ADI mit 7–15 PEG-Molekülen, vorzugsweise jedoch mit 9–12 PEG-Molekülen modifiziert. Mit anderen Worten werden 30–70 % der primären Aminogruppen in der Arginindeiminase werden vorzugsweise 40–60 % und insbesondere 45–55 % und ganz besonders ca. 50 % mit PEG modifiziert. Wird der PEG kovalent mit dem Ende der ADI verbunden, wird vorzugsweise lediglich ein PEG-Molekül eingesetzt. Steigert man die Zahl der PEG-Einheiten an der ADI, nimmt auch die Kreislaufhalbwertszeit des Enzyms zu. Steigert man die Zahl der PEG-Einheiten an der ADI, nimmt allerdings auch die spezifische Aktivität des Enzyms ab. Zwischen diesen beiden Werten muss daher ein Gleichgewicht erzielt werden, was für den Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet aus der vorliegenden Beschreibung hervorgeht.
  • Erfindungsgemäß besteht ein gemeinsames Merkmal der am meisten bevorzugten biokompatiblen Verknüpfungsgruppen darin, dass sie über eine Maleinidgruppe miteinem primären Amin der Arginindeiminase verknüpft werden.
  • Ist das SS-PEG einmal mit Arginindeiminase verknüpft, weist er eine dem PEG nächstliegende Verknüpfung auf, welche diese Stelle der Serumesterase gegenüber empfindlich machen kann, wodurch das PEG von der ADI im Körper freigesetzt werden kann. SPA-PEG und PEG1-NHS weisen jedoch keine Esterbindung auf, so dass sie gegenüber Serumesterase nicht empfindlich sind.
  • Die konkreten Verknüpfungsgruppen scheinen erfindungsgemäß die Umlaufhalbwertszeit der PEG-ADI bzw. ihre spezifische Enzymaktivität nicht zu beeinflussen. Dennoch ist die Verwendung einer biokompatiblen Verknüpfungsgruppe erfindungsgemäß entscheidend. Der PEG, der mit dem Protein verknüpft wird, kann entweder einkettig sein, wie dies bei SS-PEG, SPA-PEG und SC-PEG der Fall ist, oder verzweigtkettig wie PEG2-NHS. Die Strukturformeln der bevorzugten erfindungsgemäßen Verknüpfungsgruppen sind:
    SS-PEG
  • Eine therapeutisch wirksame Menge einer der erfindungsgemäßen Verbindungen ist eine solche Menge, die wachstumshemmend auf den Tumor wirkt. Im Allgemeinen beginnt man die Behandlung mit kleineren Dosen, die dann in kleineren Schritten bis zur optimalen Wirkung unter den gegebenen Umständen angehoben werden können. Im Allgemeinen liegt die therapeutisch wirksame Dosierung der erfindungsgemäßen Verbindungen in einem Bereich zwischen 1 und 200 mg/kg zweimal wöchentlich bis zu ca. einmal alle zwei Wochen. Die Dosierung kann z.B. in einem Bereich von ca. 1 mg/kg einmal die Woche in Form einer intravenösen Injektion (2 ml) bis zu ca. 20 mg/kg einmal alle 3 Tage liegen. Die optimale Dosierung bei ADI-SS-PEG 5.000 kann bei ca. zweimal die Woche liegen, während die optimale Dosierung bei ADI-SS-PEG 20.000 zwischen einmal die Woche bis ca. einmal alle zwei Wochen liegen kann. Die PEG-ADI kann mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung oder jeder anderen geeigneten, einem Fachmann bekannten Lösung vor der Injizierung gemischt werden. Die PEG-ADI-Formulierung kann je nach dem als Feststoff (Lyophalat) oder als Flüssigformulierung verabreicht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Verfahren sehen sowohl in vitro-Applikation als auch in vivo-Applikation vor. Im Fall von in vitro-Applikationen einschließlich der Applikation von Zellkulturen können die oben beschriebenen Verbindungen mit den in Kulturen vorliegenden Zellen zugesetzt und dann inkubiert werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zur Unterstützung der Produktion monoklonaler und/oder polyklonaler Antikörper unter Einsatz allgemein bekannter Techniken zur Produktion von Antikörpern verwendet werden. Die monoklonalen und/oder polyklonalen Antikörper kommen dann für einen großen Bereich diagnostischer Anwendungsgebiete in Frage, was für einen Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet einsichtig ist.
  • Die in vivo-Mittel für die Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen hängen vom jeweils ins Auge gefassten Verwendungszweck ab. Wie ein Fachmann auf dem vorliegenden Gebiet erkennen wird, kann die Verabreichung der erfindungsgemäßen PEG-ADI-Zubereitung z.B. oral, intranasal, intraperitoneal, parenteral, intravenös, intralymphatisch, intratumoral, intramuskulär, interstitiell, intraarteriell, subkutan, intraokular, intrasynovial, transepithelial und transdermal erfolgen.
  • Beispiele
  • Die Erfindung wird ferner durch die nachfolgenden Beispiele illustriert, ohne dass der Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschränkt wird.
  • Beispiel 1: Produktion von rekombinanter ADI
  • Von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland wurden Kulturen von Mycoplasma arginini (ATCC 23243), Mycoplasma hominus (ATCC 23114) und Mycoplasma arthritides (ATCC 23192) bezogen.
  • Arginindeiminase wurde aus Mycoplasma arginini, Mycoplasma hominus und Mycoplasma arthritides geklont und in E. coli, wie oben von S. Misawa et al., J. Biotechnology, 36: 145–155 (1994), beschrieben, exprimiert, wobei sich die vorliegende Anmeldung auf diese Druckschrift in ihrer Ganzheit bezieht. Die Aminosäuresequenzen von Arginindeiminase jeder der genannten Arten sind in 1 dargestellt. Die obere Aminosäuresequenz (ADIPROT) stammt aus Mycoplasma arginini, die mittlere (ARTADIPRO) aus Mycoplasma arthritides und die untere (HOMADIPRO) aus Mycoplasma hominus. Jede Aminosäuresequenz wird zu mehr als 96 % konserviert. Die Kennzeichnung jedes der Proteine nach dem Fachmann bekannten Methoden im Hinblick auf die spezifische Enzymaktivität durch Km, Vmax und die pH-Optima ergab, dass diese Proteine biochemisch nicht voneinender unterschieden werden konnten. Die pH-Optima ermittelte man mit Hilfe eines Citratpuffers (pH 5–6,5), eines Phosphatpuffers (pH 6,5–7,5) und eines Boratpuffers (pH 7,5–8,5). Die Km- und Vmax-Werte ermittelte man durch Inkubation des Enzyms mit mehreren Konzentrationen an Arginin und unter Quantifizierung der Citrullinproduktion. Der Km-Wert für die einzelnen Enzyme lag bei ca. 0,02–0,06 μM und der Vmax-Wert betrug ca. 15–20 μmol/min/mg, wobei die Werte innerhalb des jeweiligen Standardfehlers lagen.
  • Die Arginindeiminase-Gene wurden durch Polymerasekettenreaktion amplifiziert, wobei das nachfolgende Primerpaar verwendet wurde, das aus der veröffentlichen Sequenz von M. arginini stammte, beschrieben z.B. von T. Ohno et al., Infect. Immun., 58: 3788–3795 (1990):
    5'-GCAATCGATGTGTATTTGACAGT-3' (SEQ ID NO:4)
    5'-TGAGGATCCTTACTACCACTTACCATCTTACG-3' (SEQ ID NO:5)
  • Das PCR-Produkt wurde als Bam H1-HindIII-Fragment in das Expressionsplasmid pQE16 geklont. Die DNA-Sequenzanalyse ergab, dass dieses Fragment dieselbe Sequenz für das Arginindeiminase-Gen hatte, wie von Ohno et al., Infect. Immun., ibidem, beschrieben. Die fünf TGA-Codons im ADI-Gen, die Tryptophan im Mycoplasma codieren, wurden vor der Genexpression in E. coli durch Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese in TGG-Codons verändert, beschrieben z.B. von J.R. Sayers et al., Biotechniques, 13: 592–596 (1992). Die rekombinante ADI wurde in Einschlusskörpern in Konzentrationen von 10 %, bezogen auf das Gesamtprotein, exprimiert.
  • Die Proteine aus allen drei Arten von Mycoplasma zeigen ca. 95 %-ige Homologie und sind durch Säulenchromatographie leicht zu reinigen. Aus 1 l Fermentationsbrühe können ca. 1,2 g reines Protein isoliert werden. Rekombinante ADI ist ca. 2 Wochen bei 37°C beständig und wenigstens 8 Monate bei einer Lagerung bei 4°C. Die Proteine zeigten, wie sich mit dem Fachmann bekannten Methoden nachweisen ließ, hohe Affi nität gegenüber Arginin (0,04 μM) und physiologische pH-Optima von ca. 7,2 bis ca. 7,4.
  • Beispiel 2: Renaturierung und Reinigung der rekombinanten ADI
  • Das ADI-Protein wurde unter geringen Modifizierungen nach Misawa et al., J. Biotechnology, 36: 145–155 (1994) renaturiert, wobei sich die vorliegende Anmeldung auf die Gesamtheit dieser Druckschrift bezieht. 100 g Zellpaste wurde in 800 ml 10 mM K2PO4 pH 7,0, 1 mM EDTA (Puffer 1) renaturiert, wonach die Zellen durch zwei Durchgänge in einem Microfluidizer (Mikrofluidics Corporation, Newton, MA) aufgebrochen wurden. Zur Erzielung einer Endkonzentration von 4 % (V/V) wurde Triton X-100 zugesetzt. Das Homogenat wurde dann 30 min bei 4°C gerührt und dann 30 min bei 13.000 zentrifugiert. Das Pellet wurde dann gesammelt und in 1 Liter 0,5 Triton X-100 enthaltendem Puffer resuspendiert. Die Lösung wurde dann diafiltriert, gegen 5 Volumen Denaturierungspuffer (50 mM Tris HCl, pH 8,5, 10 mM DTT) unter Verwendung von Hohlfaserkartuschen mit einem Rückhaltevermögen von 100 kD (Microgon Inc., Laguna Hills, CA) diafiltriert. Zur Erzielung einer Endkonzentration von 6 M wurde Guanidin-HCl zugesetzt, wonach die Lösung 15 min bei 4°C gerührt wurde. Diese Lösung wurde dann 100-fach in einem Rückfaltungspuffer 1 (10 mm K2PO4 bei pH 7,0 verdünnt und 48 Stunden bei 15°C gerührt. Die Feststoffteilchen wurden durch Zentrifugieren bei 15.000 × g entfernt.
  • Der erhaltene Überstand wurde an einer in einem Rückfaltungspuffer prääquilibrierten Q Sepharose Past Flow-Säule (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) eingeengt. Die ADI wurde unter Verwendung eines Rückfaltungspuffers mit 0,2 M NaCl eluiert. Die Reinigung ergab ADI-Protein, das aufgrund der SDS-PAGE-Analyse zu über 95 % als rein bewertet wurde. Aus 1 kg Zellbrei wurden 8 g reines renaturiertes ADI-Protein hergestellt, was 200 mg gereinigtes ADI-Protein pro Liter Fermantationsbrühe entspricht.
  • Die ADI-Aktivität wurde unter minimaler Modifizierung gemäß der Methode von Oginsky et al., Meth. Enzymol., (1957) 3: 639–642 ermittelt. 10 μl-Proben in 0,1 m Na2PO4, pH 7,0 (BUN-Testpuffer) wurden auf eine 96 Mulden-Mikrotiterplatte gegeben, wonach 40 μl 0,5 mM Arginin in BUN-Testpuffer zugesetzt wurden. Dann wurde die Platte zugedeckt und bei 37°C 15 min inkubiert. Dann wurden 20 μl vollständiges BUN-Reagens (Sigma Diagnostics) zugegeben und die Platte wurde 10 min bei 100°C inkubiert. Die Platte wurde dann auf 22°C abgekühlt und bei 490 nm von einem Mikrotiterplattenlesegerät (Molecular Devices, Inc.) analysiert. 1,0 IE beträgt die Menge an Enzym, das pro Minute L-Arginin in L-Citrullin umwandelt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit Hilfe des Pierce Coomassie Blue Protein Assay Reagent (Pierce Co., Rockford, IL) mit Rinderserumalbumin als Standard ermittelt.
  • Die Enzymaktivität der gereinigten ADI-Präparate betrug 17–25 IE/mg.
  • Beispiel 3: Verknüpfung von PEG mit ADI
  • PEG wurde in einem 100 nM-Phosphatpuffer bei pH 7,4 kovalent an ADI gebunden. ADI wurde dann rasch in einem Phosphatpuffer mit einem 100 M-Überschuss an PEG gemischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt, wonach das Gemisch zur Entfernung des nicht aufgenommenen PEG stark dialysiert wurde.
  • Es wurde ein erster Versuch durchgeführt, bei dem die Wirkung der Verknüpfungsgruppe, wie sie bei den PEG-ADI-Zubereitungen verwendet wurden, bewertet. Das PEG wurde mit der ADI über vier unterschiedliche Verknüpfungsgruppen kovalent gebunden, und zwar eine Ester- oder Maleimidgruppe, die SS, SSR, SPA und SSPA umfasste, wobei das PEG eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse von 5.000, 10.000, 12.000, 20.000, 30.000 und 40.000 hatte, eine Epoxygruppe (PEG-Epoxy), wobei der PEG eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse von 5.000 hatte, und eine verzweigte PEG-Gruppe (PEG2-NHS), wobei der PEG eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse von 10.000, 20.000 und 40.000 hatte.
  • 5,0 IE der erhaltenen Zubereitungen wurden in Mäuse injiziert (5 Mäuse für jede Gruppe). Zur Ermittlung der Serumkonzentration an Arginin wurde den Mäusen aus dem Retroorbitalplexus 100 μl Blut entnommen. Unmittelbar nach der Blutentnahme wurde ein gleiches Volumen an 50 % (M/V) Trichloressigsäure zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren (13.000 × g während 30 Minuten) entfernt, wonach der entfernte Überstand entfernt und bei –70°C tiefgefroren wurde. Die Proben wurden dann unter Verwendung eines automatisierten Aminosäureanalysators analysiert, wobei man Reagenzien von Beckman Instruments verwendete, und zwar anhand der vom Hersteller zur Verfügung gestellten Protokolle. Die Empfindlichkeits-Grenzen für Citrullin lagen bei dieser Methode bei ca. 2–6 μM und die Reproduzierbarkeit der Messungen lag innerhalb eines Bereichs von ca. 8 %. Die Menge an Serumarginin wurde durch Aminosäureanalyse ermittelt. Wie 3 zeigt, hatte die Verknüpfungsgruppe, welche den PEG mit der ADI kovalent verband, keine erhebliche Wirkung auf das Vermögen von ADI, das Serumarginin in vivo zu reduzieren. Diese Verknüpfungsgruppe ist somit mit anderen Worten nicht entscheidend für die Versuchsergebnisse, wenn man davon absieht, dass eine nichttoxische Verknüpfungsgruppe für in vivo-Applikationen verwendet werden muss.
  • Es wurde dann ein zweiter Versuch durchgeführt, bei dem die Wirkung der Verknüpfungsgruppe und die Molekularmasse von PEG auf die Citrullinkonzentrationen im Serum in vivo bewertet wurden. Mäusen (5 für jede Gruppe) wurden unterschiedliche Zubereitungen von ADI und PEG-ADI in einer Menge von 5,0 IE wurden in Mäusen injiziert (5 Mäuse für jede Gruppe). Zur Ermittlung der Serumkonzentration an Citrullin wurde den Mäusen aus dem Retroorbitalplexus 100 μl Blut entnommen. Unmittelbar nach der Blutentnahme wurde ein gleiches Volumen an 50 % (M/V) Trichloressigsäure zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren (13.000 × g während 30 Minuten) entfernt, wonach der entfernte Überstand entfernt und bei –70°C tiefgefroren wurde. Die Proben wurden dann unter Verwendung eines automatisierten Aminosäureanalysators analysiert, wobei man Reagenzien von Beckman Instruments verwendete, und zwar anhand der vom Hersteller zur Verfügung gestellten Protokolle. Die Empfindlichkeitsgrenzen für Citrullin lagen bei dieser Methode bei ca. 2–6 μM und die Reproduzierbarkeit der Messungen lag innerhalb eines Bereichs von ca. 8 %. Es wurde die Menge an Citrullin ermittelt. Dann wurde die Fläche unter der Kurve annähernd ermittelt und als μM/Tage zum Ausdruck gebracht.
  • In 4 zeigen die leeren Kreise die Menge an von der nativen ADI produziertem Citrullin an, die schwarzen Kreise die ADI-SC-PEG, die leeren Quadrate die ADI-SS-PEG, die leeren Dreiecke die ADI-SPA-PEG und die schwarzen Dreiecke das verzweigtkettige PEG-NHS-PEG2. Die Ergebnisse in 4 zeigen, dass die Molekularmasse des PEG die Wirksamkeit der PEG-ADI bestimmt. Die Wirksamkeit der PEG-ADI-Zubereitungen beruht nicht notwendigerweise auf der Methode der Verknüpfung des PEG mit der ADI, nur muss eine biokompatible Verknüpfungsgruppe für in vivo-Verwendungszwecke verwendet werden.
  • Die Ergebnisse in 4 zeigen auch, dass die optimale Molekularmasse 20.000 ist. Obwohl PEG 30.000 im Hinblick auf die Pharmakodynamik besser als PEG 20.000 zu sein scheint, ist dieser doch weniger löslich, weshalb er schwerer zu handhaben ist. Die Ausbeuten, die aus der Gewinnung der Enzymaktivität beruhten, lagen bei ca. 90 % für PEG 5.000 und PEG 12.000, bei ca. 85 % für PEG 20.000 und bei ca. 40 % für PEG 30.000. PEG 20.000 ist daher der beste Kompromiss zwischen Ausbeute und Umlaufhalbwertszeit, was durch die Citrullinproduktion ermittelt wurde.
  • Bei einem dritten Versuch wurde die Dosiswirkung der Abreicherung von Serumarginin und der Produktion von Citrullin mit ADI-SS-PEG 5.000 und ADI-SS-PEG 20.000 ermittelt. Mäusen (5 in jeder Gruppe) wurde eine Einzelinjektion von 0,05 IE, 0,5 IE oder 5,0 IE von ADI-SS-PEG 5.000 bzw. ADI-SS-PEG 20.000 verabreicht. Zu den angeführten Zeitpunkten wurde das Serum gesammelt, wie das oben beschrieben wurde, wonach eine Aminosäureanalyse zur Quantifizierung des Serumarginins (5A und 5C) und Serumcitrullins (54B und 5D) durchgeführt wurde. Beide Formulierungen verursachten eine dosisabhänige Abnahme an Serumarginin und eine Zunahme an Serumcitrullin. Die von ADI-SS-PEG 20.000 induzierten Wirkungen waren jedoch stärker und von längerer Dauer als die durch ADI-SS-PEG 5.000 induzierten Wirkungen.
  • Beispiel 4: Selektivität der durch ADI vermittelten Zytotoxizität
  • Die Selektivität der durch Arginindeiminase vermittelte Zytotoxizität wurde an einer Reihe von menschlichen Tumoren nachgewiesen. Insbesondere wurden menschliche Tumoren in vitro auf Empfindlichkeit gegen ADI-SS-PEG 5.000 (50 ng/ml) getestet. Die Lebensfähigkeit der Kulturen wurde nach 7 Tagen ermittelt. Damit eine Kultur als "inhibiert" definiert werden konnte, mussten mehr als 95 % der Zellen Trypanblau aufgenommen haben. Als Wirt wurden auch normale Zellen getestet, einschließlich Endothelzellen, glatte Muskelzellen, Epithelzellen und -fibroblasten. Keiner dieser Zelltypen wurde jedoch durch ADI-SS-PEG 5.000 inhibiert. Obwohl Arginindeiminase keine spürbare Toxizität auf normale Zellen und die meisten Tumorzellen ausübte, inhibierte ADI-SS-PEG 5.000 weitgehend alle menschlichen Melanome und Hepatome, wie sie handelsüblich von ATCC, MSKCC bzw. aus Europa zu beziehen sind.
  • Tabelle 1: Spezifität der Arginindeiminase-Zytotxizität
    Figure 00190001
  • In einer parallelen Versuchsreihe wurde aus den Tumoren mRNA isoliert. Northern-Blot-Analysen unter Verwendung menschlicher Arginosuccinatsynthase-cDNA als Probe ergaben eine vollständige Übereinstimmung zwischen der Empfindlichkeit gegenüber der Arginindeiminase-Behandlung und einer Unfähigkeit, Arginosuccinatsynthase zu exprimieren. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass die Toxizität der ADI auf dem Unvermögen, Arginosuccinatsynthase zu induzieren beruht. Diese Zellen können daher aus Citrullin nicht Arginin synthetisieren und vermögen auch nicht, die für das Wachstum nötigen Proteine zu synthetisieren.
  • Beispiel 5: Kreislaufhalbwertszeit
  • Mäusen der Rasse Balb C (5 für jede Gruppe) wurde intravenös eine Einzeldosis von 5,0 IE an nativer Arginindeiminase oder verschiedenen Formulierungen von Arginindeiminase, modifiziert mit Polyethylenglycol, wie in 3A und 3B angegeben, injiziert. Zur Ermittlung der Serumkonzentration an Arginin und Citrullin wurde den Mäusen aus dem Retroorbitalplexus 100 μl Blut entnommen. Unmittelbar nach der Blutentnahme wurde ein gleiches Volumen an 50 % (M/V) Trichlores sigsäure zugesetzt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren (13.000 × g während 30 Minuten) entfernt, wonach der entfernte Überstand entfernt und bei –70°C tiefgefroren wurde. Die Proben wurden dann unter Verwendung eines automatisierten Aminosäureanalysators analysiert, wobei man Reagenzien von Beckman Instruments verwendete, und zwar anhand der vom Hersteller zur Verfügung gestellten Protokolle. Die Empfindlichkeitsgrenzen für Citrullin lagen bei dieser Methode bei ca. 2–6 μM und die Reproduzierbarkeit der Messungen lagen innerhalb eines Bereichs von ca. 8 %.
  • Die Verabreichung einer Einzeldosis an nativer ADI (schwarze Kreise) oder ADI-SS-PEG (leere Dreiecke) ergab eine dosisabhängige Abnahme an Serumargininkonzentrationen (schwarze Kreise in 2A) und eine Zunahme des Serumcitrullins (leere Dreiecke in 2B). Die Abnahme an Serumarginin und Zunahme an Serumcitrullin waren jedoch nur kurzzeitig und es stellten sich bald wieder die Normalwerte ein. Die Halbwertszeit für die Argininerschöpfung ist in der nachfolgenden Tabelle angeführt.
  • Tabelle 2: Halbwertszeit für die Serumargininerschöpfung
    Figure 00200001
  • Dieses Experiment zeigt, dass normale Zellen und Gewebe in der Lage sind, Citrullin in Arginin intrazellulär zurückzuverwandeln, während Melanome und Hepatome dazu nicht in der Lage sind, da ihnen Arginosuccinatsynthetase fehlt.
  • Beispiel 6: Antigenität der PEG-modifizierten ADI
  • Zur Ermittlung der Antigenität von nativer ADI, ADI-SS-PEG 5.000 und ADI-SS-PEG 20.000 wurden z.B. die von Park, Anticancer Res., ibid., und Kamisaki, J. Pharmacol. Exp. Ther., ibid., beschriebenen Verfahren durchgeführt. Balb C-Mäuse (5 in jeder Gruppe) wurden wöchentlich während 12 Wochen ca. 0,5 IE (100 μg Protein) an nativer ADI, ADI-SS-PEG 5.000 und ADI-SS-PEG 20.000 intravenös injiziert. Den Tieren wurde zu Beginn des Versuchs sowie in der 4., 8. und 12. Woche jeweils 0,05 ml aus dem Retroorbitalpexus entnommen. Das Serum wurde dann isoliert und bei –70°C gelagert. Die Anti-ADI IgG-Titer wurde durch ELISA ermittelt. In jede Mulde einer 96 Mulden-Mikrotiterplatte wurden 50 μg ADI gegeben und bei Raumtemperatur während 4 Stunden inkubiert. Die Platten wurden dann mit PBS gespült und dann mit Rinderserumalbumin (1 mg/ml) beschichtet, um die nichtspezifischen Proteinbindungsstellen zu blockieren, und über Nacht bei 4°C gelagert. Tags darauf wurde das Serum aus den Mäusen verdünnt und in die Mulden gegeben. Nach 1 Stunde wurden die Platten mit PBS gespült, wonach in die Mulden Kaninchen-Antimaus-IgG, gekoppelt mit Peroxidase, gegeben wurde. Die Platten wurden dann 30 min inkubiert, wonach die erhaltene UV-Absorption unter Verwendung eines Mikrotiterplattenlesegeräts gemessen wurde. Der Titer wurde als die höchste Serumverdünnung definiert, die zu einem doppelten Anstieg ausgehend von der Untergrundbsorption (ca. 0,50 OD) führte.
  • Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Die leeren Kreise stehen für die Daten, die aus Tieren erhalten wurden, denen man sehr stark antigene native ADI injiziert hatte. Die schwarzen Kreise stehen für die Daten, die aus Tieren erhalten wurden, denen ADI-SS-PEG 5.000 injiziert wurde, während die leeren Dreiecke für die Daten stehen, die aus Tieren erhalten wurden, denen ADI-SS-PEG 20.000 injiziert wurde. Wie aus 6 hervorgeht, sind ADI-SS-PEG 5.000 und ADI-SS- PEG 20.000 deutlich weniger antigen als native ADI. So z.B. führten bloß 4 Injektionen an nativer ADI zu einem Titer von ca. 106, während 4 Injektionen jeder der PEG-ADI-Formulierungen keinerlei messbare Antikörper ergaben. Nach 8 Injektionen zeigte ADI-PEG 5.000 jedoch einen Titer von ca. 102, während ADI-PEG 20.000 bis nach 12 Injektionen eine Immunreaktion weitgehend nicht induzierte. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verknüpfung von PEG mit ADI die Immunraktion auf das Protein abschwächt.
  • Beispiel 7: Tumorinhibierung bei menschlichem Melanom
  • Ermittelt wurde die Wirkung von PEG-ADI auf das Wachstum von menschlichem Melanom (SK-Mel 28) an nackten Mäusen. Diesen (5 in jeder Gruppe) wurden 106 menschliche SK-mel2-Melanomzellen injiziert, die man wachsen ließ, bis die Tumore einen Durchmesser von ca. 3–5 mm erreicht hatten. Die Mäuse ließ man unbehandelt (leere Kreise) oder sie wurden einmal wöchentlich im Verlauf von 12 Wochen mit 5,0 IE ADI-SS-PEG 5.000 (schwarze Dreiecke), ADI-SS-PEG 12.000 (leere Dreiecke) oder mit ADI-SS-PEG 20.000 (schwarze Kreise) behandelt. Der durchschnittliche Tumordurchmesser ist in 7 dargestellt.
  • 8 zeigt die Wirksamkeit von ADOI-SS-PEG 20.000 auf drei menschliche Melanome (SK-mel 2, SK-mel 28, M24-met), die man in vivo in nackten Mäusen hatte wachsen lassen. Nackten Mäusen (5 in jeder Gruppe) wurden 106 SK-mel 2, SH-mel 28 oder M24-met menschliche Melanomzellen injiziert. Die Tumore ließ man wachsen, bis sie einen Durchmesser von ca. 3–5 mm erreicht hatten. Danach wurden den Tieren einmal wöchentlich 5,0 IE ADI-SS-PEG 20.000 injiziert. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt. Sie zeigen das mit PEG-ADI inhibierte Tumorwachstum und dass es gegebenenfalls zu einer Rückbildung und zu einem Verschwinden der Tumore kommen kann. Da die Tumore keine Argininsuccinatsynthetase aufwiesen, konnten sie auch keine Proteine synthetisieren, da die ADI das Arginin eliminierte und die Tumore dieses nicht herstellen konnten, so dass die Zellen verhungerten.
  • Da menschliches M24-met-Melanom stark metastatisch wirkt, wurden die Tiere, denen man menschliche 24-met-Melanomzellen injiziert hatte, nach 4-wöchiger Behandlung getötet und es wurde die Zahl der Lungenmetastasen festgestellt. Die Kontrolltiere zeigten durchschnittlich 32 Metastasen, während die mit ADI-SS-PEG 20.000 behandelten Tiere keine Metastasen aufwiesen. Die Ergebnisse scheinen darauf hinzudeuten, dass ADI-SS-PEG 20.000 nicht nur das Wachsen von primären Melanomtumoren, sondern auch die Bildung von Metastasen inhibierte.
  • Interessant ist festzustellen, dass bei über 200 getesteten Tieren die durchschnittliche Zahl der Metastasen in der Kontrollgruppe bei 49 ± 18 lag, während lediglich bei einem behandelten Tier eine einzige Metastase festgestellt wurde.
  • Beispiel 8; Tumorinhibierung von menschlichen Hepatomen
  • Getestet wurde in vivo das Vermögen von PEG 5.000-ADI, das Wachstum eines menschlichen Hepatoms zu inhibieren. Nackten Mäusen (5 in jeder Gruppe) wurden 106 menschliche Hepatom SK-hep1-Zellen injiziert. Die Tumore ließ man zwei Wochen wachsen, wonach die Tiere einmal wöchentlich mit 5,0 IE SS-PEG 5.000-ADI (schwarze Kreise), SS-PEG 12.000-ADI (schwarze Dreiecke) oder SS-PEG 20.000-ADI (leere Dreiecke) behandelt wurden. Die Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Die unbehandelten Tiere (leere Kreise) starben alle innerhalb von 3 Wochen. Im Gegensatz dazu hatten die mit ADI behandelten Tiere eine weit höhere Lebenserwartung, was aus 9 hervorgeht. Alle überlebenden Mäuse wurden dann nach 6 Monaten getötet. Die Nekropsie ergab dann, dass sie alle tumorfrei waren.
  • Überraschenderweise ist PEG 5.000-ADI am wirksamsten bezüglich der Inhibierung des Hepatomwachstums in vivo. Der genaue Mechanismus, auf dem das beruht, ist unbekannt. Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, scheint es doch, dass die mit SS-PEG 5.000-ADI formulierten Proteines in der Leber entfernt werden. Höhere Molekülmassen an PEG haben keine Wirkung, was auf der Ungleichheit des Leberendothels und der Zwischenräume (fenestrae) beruhen könnte, die eine Größe aufweisen, dass höhere Molekularmassen an PEG-ADO-Konjugaten ausgeschlossen sind.
  • Beispiel 9: Anwendung auf den Menschen
  • PEG 5.000-ADI und PEG 20.000-ADI wurden ex vivo mit normalem menschlichen Serum inkubiert, wonach die Wirkung auf die Argininkonzentration durch Aminosäureanalyse ermittelt wurde. Es stellte sich dabei heraus, dass das Enzym voll aktiv war und in der Lage war, sämtliches nachweisbares Arginin mit derselben Kinetik wie bei den Mäuseexperimenten abzubauen. Die Reaktion wurde bei einem Volumen von 0,1 ml während 1 Stunde bei 37°C durchgeführt. Außerdem waren die Arginin- und Citrullinkonzentrationen im menschlichen Serum identisch mit denen bei Mäusen. PEG-Proteine zirkulieren beim Menschen längere Zeit als bei Mäusen. So z.B. war die Kreislaufhalbwertszeit von mit PEG konjugierter Adenosindeiminase, Asparaginase, Glucocerebrocidase, Uricae, Hämoglobulin und Superoxiddismutase 5–10 mal höher als bei denselben Formulierungen im Falle von Mäusen. Das bedeutet, dass die für den Menschen notwendige Dosis meist nur 1/5 bis 1/10 derjenigen für Mäuse ausmacht. PEG-ADI sollte demnach beim Menschen eine längere Umlaufzeit haben als bei Mäusen.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00250001
  • Figure 00260001
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001

Claims (22)

  1. Verbindung, die über eine Verknüpfungsgruppe an Polyethylenglycol kovalent gebundene Arginindeiminase umfasst, wobei das Polyethylenglycol eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse im Bereich von 16.000 bis 40.000 aufweist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, bei der die Verknüpfungsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Succinnimidgruppe, einer Amidgruppe, einer Imidgruppe, einer Carbamatgruppe, einer Estergruppe, einer Epoxygruppe, einer Carboxylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einem Kohlehydrat, einer Tyrosingruppe, einer Cysteingruppe, einer Histidingruppe und Kombinationen davon.
  3. Verbindung nach Anspruch 2, wobei die Verknüpfungsgruppe eine Succinimidgruppe ist.
  4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei die Succinimidgruppe Succinimidylsuccinat, Succinimidylpropionat, Succinimidylcarboxymethylat, Succinimidylsuccinamid, N-Hydroxysuccinimid oder Kombinationen davon darstellt.
  5. Verbindung nach Anspruch 4, wobei die Succinimidgruppe Succinimidylsuccinat, Succinimidylpropionat oder Kombinationen davon darstellt.
  6. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Arginindeiminase aus einem Mikroorganismus der Gattung Mycoplasma gewonnen wird.
  7. Verbindung nach Anspruch 6, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Mycoplasma ar ginini, Mycoplasma hominus, Mycoplasma arthritides und Kombinationen davon.
  8. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Arginindeiminase an 7 bis 15 Polyethylenglycolmoleküle kovalent gebunden ist.
  9. Verbindung nach Anspruch 8, wobei die Arginindeiminase an 9 bis 12 Polyethylenglycolmoleküle kovalent gebunden ist.
  10. Verbindung nach Anspruch 1, wobei das Polyethylenglycol eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse im Bereich von 16.000 bis 30.000 aufweist.
  11. Verfahren zur Erhöhung der Halbzeit der zirkulierenden Halbwertszeit der Arginindeiminase, das die Modifizierung der Arginindeiminase durch ihre kovalente Bindung über eine Verknüpfungsgruppe an Polyethylenglycol umfasst, wobei das Polyethylenglycol eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse im Bereich von 16.000 bis 40.000 aufweist.
  12. Verwendung einer Verbindung, die über eine Verknüpfungsgruppe an Polyethylenglycol kovalent gebundene Arginindeiminase umfasst, wobei das Polyethylenglycol eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse im Bereich von 16.000 bis 40.000 aufweist, für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung für die Behandlung eines Tumors eines Patienten.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Tumor ein Melanom ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Polyethylenglycol eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse im Bereich von ca. 20.000 aufweist.
  15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Verknüpfungsgruppe eine Succinimidgruppe ist.
  16. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Succinimidgruppe Succinimidylsuccinat, Succinimidylpropionat, Succinimidylcarboxymethylat, Succinimidylsuccinamid, N-Hydroxysuccinimid oder Kombinationen davon darstellt.
  17. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Tumor ein Hepatom ist.
  18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die Verknüpfungsgruppe eine Succinimidgruppe ist.
  19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Succinimidgruppe Succinimidylsuccinat, Succinimidylpropionat, Succinimidylcarboxymethylat, Succinimidylsuccinamid, N-Hydroxysuccinimid oder Kombinationen davon darstellt.
  20. Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Tumor ein Sarcom ist.
  21. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 für die Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung und Inhibierung von Metastasen eines Patienten.
  22. Verfahren zur Erhöhung der tumoriziden Aktivität der Arginindeiminase, das die Modifizierung der Arginindeiminase durch ihre kovalente Bindung über eine Verknüpfungsgruppe an Polyethylenglycol umfasst, wobei das Polyethylenglycol eine massegemittelte Gesamtmolekülmasse im Bereich von 16.000 bis 40.000 aufweist und die Verknüpfungsgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einer Succinnimidgruppe, einer Amidgruppe, einer Imidgruppe, einer Carbamatgruppe, einer Estergruppe, einer Epoxygruppe, einer Carboxylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einem Kohlehydrat, einer Tyrosingruppe, einer Cysteingruppe, einer Histidingruppe und Kombinationen davon.
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US09/023,809 US6183738B1 (en) 1997-05-12 1998-02-13 Modified arginine deiminase
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EP (1) EP0981607B1 (de)
JP (1) JP4456184B2 (de)
CN (1) CN1169951C (de)
AT (1) ATE335814T1 (de)
AU (1) AU724907B2 (de)
CA (1) CA2288948C (de)
CY (1) CY1105758T1 (de)
DE (1) DE69835515T2 (de)
DK (1) DK0981607T3 (de)
ES (1) ES2270515T3 (de)
PT (1) PT981607E (de)
TW (1) TW368504B (de)
WO (1) WO1998051784A1 (de)

Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5545553A (en) * 1994-09-26 1996-08-13 The Rockefeller University Glycosyltransferases for biosynthesis of oligosaccharides, and genes encoding them
US6183738B1 (en) 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
US6635462B1 (en) 1997-05-12 2003-10-21 Phoenix Pharmacologies, Inc. Mutated form of arginine deiminase
US5985263A (en) * 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
CN1328152A (zh) * 2000-06-14 2001-12-26 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人nrd转化酶10.01和编码这种多肽的多核苷酸
US20040096437A1 (en) * 2000-07-27 2004-05-20 Bon-Hong Min Pharmaceutical composition comprising arginine deiminasa for inhibiting angio-genesis
AU2001275810A1 (en) * 2000-07-27 2002-02-13 Angiolab, Inc. The pharmaceutical composition comprising arginine deiminase for inhibiting angiogenesis
KR20040004449A (ko) * 2000-11-28 2004-01-13 휘닉스 파머컬러직스, 인크. 변형된 아르기닌 데이미나제
US20050063942A1 (en) * 2001-02-02 2005-03-24 Clark Mike A. Methods for predicting sensitivity of tumors to arginine deprivation
US7795210B2 (en) * 2001-10-10 2010-09-14 Novo Nordisk A/S Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods
US8008252B2 (en) * 2001-10-10 2011-08-30 Novo Nordisk A/S Factor VII: remodeling and glycoconjugation of Factor VII
US7696163B2 (en) * 2001-10-10 2010-04-13 Novo Nordisk A/S Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
WO2004099231A2 (en) * 2003-04-09 2004-11-18 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7265084B2 (en) * 2001-10-10 2007-09-04 Neose Technologies, Inc. Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods
US7173003B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-06 Neose Technologies, Inc. Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF
US7399613B2 (en) * 2001-10-10 2008-07-15 Neose Technologies, Inc. Sialic acid nucleotide sugars
US7416858B2 (en) * 2001-10-10 2008-08-26 Neose Technologies, Inc. Pharmaceutical compositions of glycoconjugates
US7157277B2 (en) 2001-11-28 2007-01-02 Neose Technologies, Inc. Factor VIII remodeling and glycoconjugation of Factor VIII
US7214660B2 (en) * 2001-10-10 2007-05-08 Neose Technologies, Inc. Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin
US7179617B2 (en) * 2001-10-10 2007-02-20 Neose Technologies, Inc. Factor IX: remolding and glycoconjugation of Factor IX
US7473680B2 (en) 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
MXPA04012496A (es) * 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
CN100405906C (zh) * 2002-10-09 2008-07-30 尼奥斯技术有限公司 促红细胞生成素:促红细胞生成素的重构和糖缀合
CA2506244C (en) * 2002-11-18 2012-10-30 Phoenix Pharmacologics, Inc. Methods for inhibiting viral replication in vivo
JP4490290B2 (ja) * 2002-12-31 2010-06-23 ネクター セラピューティクス アラバマ，コーポレイション 加水分解安定性マレイミド末端ポリマー
US7329721B2 (en) 2002-12-31 2008-02-12 Nektar Therapeutics Al, Corporation Maleamic acid polymer derivatives and their bioconjugates
US7432331B2 (en) * 2002-12-31 2008-10-07 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
JP2006523211A (ja) * 2003-03-14 2006-10-12 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 分岐水溶性ポリマーとその複合物
CN100522988C (zh) * 2003-04-09 2009-08-05 诺和诺德公司 糖peg化方法及由该方法生产的蛋白质/肽
EP1613261A4 (de) * 2003-04-09 2011-01-26 Novo Nordisk As Intrazelluläre bildung von peptidkonjugaten
US8791070B2 (en) 2003-04-09 2014-07-29 Novo Nordisk A/S Glycopegylated factor IX
BRPI0410164A (pt) 2003-05-09 2006-05-16 Neose Technologies Inc composições e métodos para preparação de mutantes de glicosilação de hormÈnio do crescimento humano
US9005625B2 (en) 2003-07-25 2015-04-14 Novo Nordisk A/S Antibody toxin conjugates
CA2547140A1 (en) * 2003-11-24 2005-06-09 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US8633157B2 (en) * 2003-11-24 2014-01-21 Novo Nordisk A/S Glycopegylated erythropoietin
US20080305992A1 (en) * 2003-11-24 2008-12-11 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated erythropoietin
US7956032B2 (en) * 2003-12-03 2011-06-07 Novo Nordisk A/S Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
US20060040856A1 (en) 2003-12-03 2006-02-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated factor IX
US7790835B2 (en) * 2003-12-03 2010-09-07 Nektar Therapeutics Method of preparing maleimide functionalized polymers
EP1694274B1 (de) * 2003-12-03 2013-04-24 BioGeneriX AG Glykopegylierter Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor
US20080318850A1 (en) * 2003-12-03 2008-12-25 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated Factor Ix
US8361961B2 (en) * 2004-01-08 2013-01-29 Biogenerix Ag O-linked glycosylation of peptides
US9085659B2 (en) 2004-05-03 2015-07-21 Nektar Therapeutics Polymer derivatives comprising an imide branching point
RU2006138181A (ru) 2004-05-04 2008-06-10 Ново Нордиск Хелс Кеа Аг (Ch) О-связанные гликоформы полипептидов и способ их изготовления
WO2006010143A2 (en) 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
CN1745847A (zh) * 2004-09-08 2006-03-15 康达医药科技有限公司 用精氨酸酶治疗肝炎的药物组合物和方法
EP1799249A2 (de) * 2004-09-10 2007-06-27 Neose Technologies, Inc. Glycopegyliertes interferon alpha
WO2006035057A1 (en) * 2004-09-29 2006-04-06 Novo Nordisk Health Care Ag Modified proteins
PL2586456T3 (pl) 2004-10-29 2016-07-29 Ratiopharm Gmbh Remodeling i glikopegilacja czynnika wzrostu fibroblastów (FGF)
JP2008526864A (ja) * 2005-01-06 2008-07-24 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 糖断片を用いる糖結合
EP2514757A3 (de) 2005-01-10 2014-03-05 ratiopharm GmbH Glycopegylierter Granulozyten-Kolonie stimulierende Faktor
JP2008538181A (ja) * 2005-03-30 2008-10-16 ネオス テクノロジーズ インコーポレイテッド 昆虫細胞系において増殖させたペプチドを生産するための製造方法
EP1871795A4 (de) * 2005-04-08 2010-03-31 Biogenerix Ag Zusammensetzungen und verfahren zur herstellung von glycosylierungsmutanten eines proteaseresistenten menschlichen wachstumshormons
FR2884717B1 (fr) * 2005-04-25 2009-07-03 Erytech Pharma Soc Par Actions Erythrocytes renfermant de l'arginine deiminase
EP1888098A2 (de) * 2005-05-25 2008-02-20 Neose Technologies, Inc. Glykopegylierte erythropoetin-formulierungen
EP1891231A4 (de) 2005-05-25 2011-06-22 Novo Nordisk As Glykopegylierter faktor ix
DE602006013151D1 (de) 2005-07-19 2010-05-06 Nektar Therapeutics Verfahren zur herstellung von polymermaleimiden
US20070105755A1 (en) * 2005-10-26 2007-05-10 Neose Technologies, Inc. One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides
CN102719508A (zh) * 2005-08-19 2012-10-10 诺和诺德公司 糖基聚乙二醇化的因子vii和因子viia
US20090048440A1 (en) 2005-11-03 2009-02-19 Neose Technologies, Inc. Nucleotide Sugar Purification Using Membranes
CN101002945B (zh) * 2006-01-20 2012-09-05 清华大学 一种用于肿瘤治疗的新型复合物
US7982010B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-19 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
US7645860B2 (en) * 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
US7985839B2 (en) * 2006-03-31 2011-07-26 Baxter International Inc. Factor VIII polymer conjugates
EP2010222A1 (de) 2006-03-31 2009-01-07 Baxter International Inc. Pegylierter faktor viii
US7534595B2 (en) * 2006-06-12 2009-05-19 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US7531341B1 (en) 2006-06-12 2009-05-12 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of using compositions thereof
US9187532B2 (en) * 2006-07-21 2015-11-17 Novo Nordisk A/S Glycosylation of peptides via O-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) * 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
PT2068907T (pt) * 2006-10-04 2018-01-15 Novo Nordisk As Açúcares e glicopéptidos peguilados ligados a glicerol
WO2008073620A2 (en) * 2006-11-02 2008-06-19 Neose Technologies, Inc. Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines
EP2101821B1 (de) 2006-12-15 2014-08-13 Baxter International Inc. Faktor-viia-(poly)sialsäurekonjugat mit verlängerter in-vivo-halbwertszeit
KR20150064246A (ko) * 2007-04-03 2015-06-10 바이오제너릭스 게엠베하 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법
US20090053167A1 (en) * 2007-05-14 2009-02-26 Neose Technologies, Inc. C-, S- and N-glycosylation of peptides
US20080292609A1 (en) * 2007-05-21 2008-11-27 Ning Man Cheng Use of Arginase in Combination with 5FU and Other Compounds for Treatment of Human Malignancies
CN101778937A (zh) * 2007-06-04 2010-07-14 诺和诺德公司 使用n-乙酰葡糖胺转移酶的o-联糖基化
EP2170919B8 (de) * 2007-06-12 2016-01-20 ratiopharm GmbH Verbessertes verfahren zur herstellung von nukleotidzuckern
FR2919804B1 (fr) 2007-08-08 2010-08-27 Erytech Pharma Composition et vaccin therapeutique anti-tumoral
US7537923B2 (en) * 2007-08-17 2009-05-26 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase and methods of treating cancer using compositions thereof
US8207112B2 (en) * 2007-08-29 2012-06-26 Biogenerix Ag Liquid formulation of G-CSF conjugate
CA2711503A1 (en) * 2008-01-08 2009-07-16 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
WO2009108806A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Novo Nordisk A/S Conjugated factor viii molecules
WO2010014225A2 (en) 2008-07-30 2010-02-04 Biomarin Pharmaceutical Inc. Assays for detection of phenylalanine ammonia-lyase and antibodies to phenylalanine ammonia-lyase
WO2010023195A2 (en) 2008-08-26 2010-03-04 Kyon Biotech Ag Compositions and methods for treating cancer
US20100150949A1 (en) * 2008-12-16 2010-06-17 Oncopharmacologics, Inc. Methods and compositions for modulating proline levels
CN104530182A (zh) 2009-07-27 2015-04-22 利普森技术有限公司 非凝血蛋白的糖基多唾液酸化
US8809501B2 (en) 2009-07-27 2014-08-19 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
AU2010281453C1 (en) * 2009-07-27 2019-08-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Blood coagulation protein conjugates
SG178051A1 (en) 2009-07-27 2012-03-29 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
US8642737B2 (en) 2010-07-26 2014-02-04 Baxter International Inc. Nucleophilic catalysts for oxime linkage
EP2295560A1 (de) 2009-09-14 2011-03-16 RWTH Aachen University Zielgerichtete Evolution von Arginindeiminase zur erhöhten Aktivität im physiologischen pH
CA2782444C (en) 2010-02-04 2018-10-23 Biomarin Pharmaceutical Inc. Compositions of prokaryotic phenylalanine ammonia-lyase variants and methods of using compositions thereof
CN101812438B (zh) * 2010-03-25 2014-08-27 江苏泰康生物医药有限公司 一种精氨酸脱亚氨酶突变体及其制备与应用
US20120148559A1 (en) 2010-12-01 2012-06-14 Board Of Regents The University Of Texas System Compositions and method for deimmunization of proteins
EA032056B1 (ru) 2010-12-22 2019-04-30 Баксалта Инкорпорейтид Конъюгат терапевтического белка и производного жирной кислоты, способы получения конъюгата терапевтического белка и производного жирной кислоты (варианты)
AU2012330497B2 (en) * 2012-04-04 2016-08-04 Polaris Group Methods of treating with arginine deiminase
WO2014001956A2 (en) * 2012-06-25 2014-01-03 Ning Man Cheng Combinational use of pegylated recombinant human arginase with chemotherapeutic/target therapeutic drug in cancer treatment
US9255262B2 (en) 2013-03-06 2016-02-09 Vision Global Holdings Ltd. Albumin-binding arginine deminase and the use thereof
USRE48805E1 (en) 2013-03-06 2021-11-02 Vision Global Holdings Ltd. Method for cancer targeting treatment and detection of arginine using albumin-binding arginine deiminase fusion protein
CA2901795C (en) * 2013-03-15 2022-08-02 Polaris Group Arginine deiminase with reduced cross-reactivity toward adi - peg 20 antibodies for cancer treatment
EP3052116B1 (de) 2013-10-04 2021-05-05 Ann, David K. Arginase i, arginase ii oder adi in kombination mit doxorubicin zur verwendung bei der behandlung von brustkrebs
TWI676683B (zh) * 2014-03-14 2019-11-11 開曼群島商瑞華藥業集團 用於癌症治療之對ａｄｉ－ｐｅｇ２０抗體交叉反應性降低之精胺酸去亞胺酶
KR102353046B1 (ko) 2014-03-18 2022-01-19 티디더블유 그룹 조작된 키메라성 페길화된 ａｄｉ 및 사용 방법
CN103923898A (zh) * 2014-04-17 2014-07-16 江南大学 一种peg修饰的重组精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和应用
WO2016007625A1 (en) 2014-07-08 2016-01-14 Tdw Group Antibodies to argininosuccinate synthase and related methods
JP6782230B2 (ja) 2014-09-16 2020-11-11 ティーディーダブリュー グループ 癌治療のためのａｄｉ−ｐｅｇ２０抗体に対する交差反応性が低減したアルギニンデイミナーゼ
CN104726478A (zh) * 2015-03-09 2015-06-24 武汉远大弘元股份有限公司 表达精氨酸脱亚胺酶基因的重组大肠杆菌及其应用
WO2017041051A1 (en) 2015-09-04 2017-03-09 Sqz Biotechnologies Company Intracellular delivery of biomolecules to cells comprising a cell wall
TWI784982B (zh) * 2016-11-02 2022-12-01 開曼群島商北極星藥業集團股份有限公司 聚乙二醇化精胺酸脫亞胺酶之調配物
CN106591271B (zh) * 2017-03-02 2019-07-16 江南大学 一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
WO2019042628A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Erytech Pharma ARGININE DEIMINASE ENCAPSULATED WITHIN ERYTHROCYTES AND THEIR USE IN THE TREATMENT OF CANCER AND ARGINASE-1 DEFICIENCY
EP3449935A1 (de) 2017-08-31 2019-03-06 Erytech Pharma In erythrozyten eingekapselte arginin-deiminase und deren verwendung zur behandlung von krebs und arginase-1-mangel
CA3101667A1 (en) * 2018-05-31 2019-12-05 The Hong Kong Polytechnic University Composition and application of arginine-depleting agents for cancer, obesity, metabolic disorders, and related complications and comorbidities
CN118497178A (zh) * 2023-02-15 2024-08-16 重庆派金生物科技有限公司 精氨酸脱亚胺酶突变体、共价二聚体及其偶联物和应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US5447722A (en) 1983-12-12 1995-09-05 University Of Manitoba Method for the suppression of an immune response with antigen-MPEG conjugates in nonsensitized individuals
DE3678702D1 (de) * 1985-12-28 1991-05-16 Ohgen Research Lab Ltd Antitumorprotein-gen von streptococcus pyogenes su, plasmide, die das gen enthalten, transformantenzellen, die die plasmide beherbergen, und verfahren zur herstellung des antitumorproteins.
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
JPH0253490A (ja) 1988-08-16 1990-02-22 Agency Of Ind Science & Technol アルギニン・デイミナーゼ遺伝子
WO1990005534A1 (en) 1988-11-23 1990-05-31 Genentech, Inc. Polypeptide derivatives
JP2900279B2 (ja) 1989-08-02 1999-06-02 株式会社ジャパンエナジー 新規なアルギニンデイミナーゼ、その製造法及び該酵素を有効成分とする制癌剤
JP2736145B2 (ja) 1990-01-11 1998-04-02 関東電化工業株式会社 パーハロゲン化エチレンの製造法
JPH04218000A (ja) * 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
JP3209338B2 (ja) 1990-09-10 2001-09-17 株式会社ジャパンエナジー ポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミナーゼおよびその製造法
US5372942A (en) * 1992-02-10 1994-12-13 Coriell Institute For Medical Research Protease K resistant arginine deiminase, its method of preparation and its use as an anti-neoplastic agent
WO1994005332A2 (en) 1992-09-01 1994-03-17 Berlex Laboratories, Inc. Glycolation of glycosylated macromolecules
US5695760A (en) 1995-04-24 1997-12-09 Boehringer Inglehiem Pharmaceuticals, Inc. Modified anti-ICAM-1 antibodies and their use in the treatment of inflammation
US5804183A (en) 1997-01-31 1998-09-08 Enzon, Inc. Arginine deminase derived from mycoplasma arthritidis and polymer conjugates containing the same
US6183738B1 (en) 1997-05-12 2001-02-06 Phoenix Pharamacologics, Inc. Modified arginine deiminase
US6180387B1 (en) 1997-08-11 2001-01-30 Smithkline Beecham Corporation Arginine deiminase

Also Published As

Publication number Publication date
WO1998051784A1 (en) 1998-11-19
DE69835515D1 (de) 2006-09-21
ES2270515T3 (es) 2007-04-01
AU724907B2 (en) 2000-10-05
CA2288948A1 (en) 1998-11-19
JP4456184B2 (ja) 2010-04-28
AU7479898A (en) 1998-12-08
EP0981607A1 (de) 2000-03-01
ATE335814T1 (de) 2006-09-15
US20050129706A1 (en) 2005-06-16
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