PT2158923E - Conjugados de peg-urato oxidase e sua utilização - Google Patents

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PT2158923E
PT2158923E PT91753038T PT09175303T PT2158923E PT 2158923 E PT2158923 E PT 2158923E PT 91753038 T PT91753038 T PT 91753038T PT 09175303 T PT09175303 T PT 09175303T PT 2158923 E PT2158923 E PT 2158923E
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uricase
peg
kda
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conjugates
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PT91753038T
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Michael S Hershfield
Susan J Kelly
Merry R Sherman
Mark G P Saifer
David L Williams
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Univ Duke
Mountain View Pharmaceuticals
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Description

DESCRIÇÃO
CONJUGADOS DE PEG-URATO OXIDASE E SUA UTILIZAÇÃO
Campo da Invenção A presente invenção refere-se à modificação química das proteínas para prolongar as suas vidas médias em circulação e para reduzir a sua capacidade imunogénica. Mais especificamente, a invenção refere-se à conjugação de poli (etileno glicóis) ou de poli(etileno óxidos) em urate oxidases, que elimina substancialmente a capacidade imunogénica da urate oxidase sem comprometer a sua actividade uricolítica.
Fundamentos da Invenção
As indicações contidas nesta secção de fundamentos não constituem uma admissão da técnica anterior, mas, pelo contrário, refletem os próprios comentários subjetivos dos autores da invenção e as interpretações do estado da técnica no momento em que a invenção foi feita. Essas interpretações podem incluir deduções pessoais dos inventores até ao momento não divulgadas, deduções essas que não faziam parte da arte anterior.
As urate oxidases (uricases; E.C. 1.7.3.3) são enzimas que catalisam a oxidação do ácido úrico num produto mais solúvel, a alantoína, um metabolito da purina que é excretado mais rapidamente. Os seres humanos não produzem a uricase enzimaticamente ativa, em consequência de diversas mutações no gene para a uricase adquiridas durante a evolução de primatas superiores. Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34:78-84. Consequentemente, em indivíduos susceptíveis, as concentrações excessivas do ácido úrico no sangue (hiperuricemia) e na urina (hiperuricosúria) podem conduzir à artrite dolorosa (gota), desfigurando depósitos de urate (cálculos artríticos), e à falha renal. Em alguns indivíduos afetados, as drogas disponíveis, tais como o alopurinol (um inibidor da síntese de ácido úrico), 1 produzem efeitos adversos limitadores do tratamento ou não aliviam essas condições adequadamente. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Baillière's Clin Rheumatol 4:177-192. As injecções de uricase podem diminuir a hiperuricemia e o hiperuricosúria, pelo menos temporariamente. Uma vez que a uricase é uma proteina estranha nos seres humanos, até mesmo a primeira injecção da proteina não modificada de Aspergillus flavus pode induzir reacções anafiláticas em várias percentagens de pacientes tratados (Pui, C_H, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816), e as respostas imunológicas limitam a sua utilidade para o tratamento crónico ou intermitente. Donadio, D, et ai., (1981) Nouv Presse Méd 10:711-712; Leaustic, M, et ai., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554. 0 desempenho sub-óptimo de tratamentos disponíveis para a hiperuricemia é reconhecido há diversas décadas. Kissel, P, et ai., (1968) Nature 217:72-74. Analogamente, a possibilidade de que determinados grupos de pacientes com gota grave possam beneficiar de uma forma segura e eficaz da uricase injetável tem sido reconhecida ao longo de muitos anos. Davis, FF, et al., (1978) in GB Broun, et ai., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169-173)
New York, Plenum Press; Nishimura, H, et al., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2(8241):281-283;
Abuchowski, A, et al., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352- 354; Chen, RH-L, et al., (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298; Chua, CC, et al., (1988) Ann Int Med 109:114-117; Greenberg, ML, et al., (1989) Anal Biochem 176:290- 293. As uricases derivadas dos órgãos de animais são quase insolúveis nos solventes que são compatíveis com a administração segura por meio de injeção. Patente Estados Unidos 3.616.231. Determinadas uricases derivadas de plantas ou de microorganismos são mais solúveis em solventes medicamente aceitáveis. Entretanto, a injecção das enzimas microbianas induz rapidamente as respostas imunológicas que podem conduzir a reações alérgicas que ameaçam a vida ou à inativação e/ou ao aclaramento acelerado da uricase de circulação. Donadio, et al., (1981); Leaustic, et al., (1983). As enzimas baseadas nas sequências de aminoácidos deduzidas de uricases de mamíferos, incluindo o porco e o babuíno, ou de insectos, 2 tais como, por exemplo, Drosophila melanogaster ou Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, et al., (1990) Mol Cell Biol 10:5114-5127), não têm sido candidatos apropriados para o uso clinico, devido aos problemas da capacidade imunogénica e da insolubilidade em pH fisiológico. A modificação covalente das proteinas com poli(etileno glicol) ou poli(etileno óxido) (ambos indicados como PEG) , tem sido empregada para aumentar a semi-vida da proteina e reduzir a capacidade imunogénica. Patentes Estados Unidos 4.179.337, 4.766.106. e 4.847.325; Saifer, MGP, et al. , (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387. O acoplamento de PEG de peso molecular elevado para produzir conjugados com vidas em circulação prolongadas e/ou capacidade imunogénica diminuída, embora conservando a atividade funcional, foi demonstrado anteriormente para uma outra enzima, a dismutase de superóxido (Somack, R, et al., (1991) Free Rad Res Commun 12-13:553_562; Patentes Estados Unidos 5.283.317 e 5.468.478) e para outros tipos de proteinas, por exemplo, citocinas (Saifer, MGP, et al., (1997) Polym Preprints 38:576-577; Sherman, MR, et al., (1997) in JM Harris, et al., (Eds.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 155-169) Washington, D.C.: American Chemical Society). Os conjugados de uricase com polímeros com excepção de PEG também foram descritos. Patente Estados Unidos 4.460.683.
Em quase todas as tentativas relatadas para PEGilar a uricase (isto é, para acoplar covalentemente a PEG à uricase), o PEG foi ligado primeiramente aos grupos amino, incluindo o resíduo do terminal amino e os resíduos de lisina disponíveis. Nas uricases normalmente utilizadas, o número total de lisinas em cada uma das quatro subunidades idênticas fica entre 25 (Aspergillus flavus (Patente Estados Unidos 5.382.518)) e 29 (porco (Wu, X, et al., (1989) Proc Natl Acad Sei USA 86:9412-9416)). Algumas das lisinas não estão disponíveis para a PEGilação na conformação nativa da enzima. A abordagem mais comum para reduzir a capacidade imunogénica da uricase tem sido o acoplamento de grandes números de filamentos de PEG de baixo peso molecular. Isto resulta invariavelmente em grandes diminuições na actividade enzimática dos conjugados resultantes. 3
Os pesquisadores anteriores utilizaram a uricase injetada para catalisar a conversão do ácido úrico em alantoina in vivo. Veja Pui, et ai., (1997). Esta é a base para o uso, em França e na Itália, da uricase do fungo Aspergillus flavus (Uricozyme®) para impedir ou corrigir temporariamente a hiperuricemia associada com a terapia citotóxica para malignidades hematológicas e reduzir temporariamente a hiperuricemia grave nos pacientes com gota. Potaux, L, et al., (1975) Nouv Presse Méd 4:1109-1112; Legoux, R, et al., (1992) J Biol Chem 267:8565-8570; Patentes Estados Unidos 5.382.518 e 5.541.098. Por causa da sua vida em circulação curta, a Uricozyme® requer injecções diárias. Além disso, não se adequada bem a terapia a longo prazo por causa da sua capacidade imunogénica.
Uma única injeção intravenosa de um preparado de uricase de Candida utilis acoplada a PEG de 5 kDa reduziu a urate do soro a niveis não detetáveis em cinco individuos humanos, cuja concentração média da urate do soro da pré-injecção era de 6,2 mg/dL , que está dentro da faixa normal. Davis, et al., (1981). Aos individuos foi aplicada uma injeção adicional quatro semanas mais tarde, mas as suas respostas não foram relatadas. Não foi detectado nenhum anticorpo para a uricase depois da segunda (e última) injeção, quando se fez um ensaio de difusão de gel relativamente insensível. Esta referência não relatou nenhum resultado dos tratamentos crónicos ou subcrónicos de pacientes humanos ou de animais experimentais.
Um preparado da uricase de Arthrobacter protomorfiae acoplada a PEG de 5 kDa foi usado para controlar temporariamente a hiperuricemia num único paciente com linfoma, cuja concentração da urate do soro da pré-injecção era de 15 mg/dL . Chua, et ai., (1988) . Devido à condição crítica do paciente e à curta duração do tratamento (quatro injecções durante catorze dias), não foi possível avaliar a eficácia ou a segurança do conjugado a longo prazo.
No presente pedido, a expressão "capacidade imunogénica" refere-se à indução de uma resposta imunológica por um preparado injectado de uricase modificada por PEG ou não modificada (o antígeno) , ao passo que "capacidade 4 antigénica" refere-se à reacção de um antígeno com anticorpos pré-existentes. Colectivamente, a capacidade antigénica e a capacidade imunogénica são indicadas como "imunoreactividade". Em estudos precedentes da PEG-uricase, a imunoreactividade foi avaliada através de uma variedade de métodos, incluindo: 1) a reacção in vitro de PEG-uricase com anticorpos pré-formados; 2) medições da sintese de anticorpo induzida; e 3) taxas de aclaramento aceleradas depois de injeções repetidas.
As tentativas precedentes de eliminar a capacidade imunogénica das uricases de diversas fontes mediante o acoplamento de vários números de filamentos de PEG com vários ligantes, atingiram um sucesso limitado. As PEG-uricases foram apresentadas primeiramente por FF Davis e por Y Inada e seus colegas. Davis, et al., (1978); Patente Estados Unidos 4.179.337; Nishimura et al., (1979); Patentes Japonêsas 55-99189 e 62-55079. O conjugado apresentado na patente '337 foi sintetizado ao fazer reagir a uricase de origem não especificada com um excesso molar de 2.000 vezes de PEG de 750 daltons, indicando que um grande número de moléculas de polímero foi provavelmente ligado a cada subunidade de uricase. A patente '337 apresenta o acoplamento de PEG ou de poli(propileno glicol) com pesos moleculares de 500 a 20.000 daltons, de preferência de aproximadamente 500 a 5.000 daltons, para se obter conjugados activos solúveis em água não imunogénicos de vários hormónios de polipeptídeos e enzimas, incluindo as oxidareductases, das quais a uricase é um de três exemplos. Além disso, a patente '337 enfatiza o acoplamento de 10 a 100 filamentos de polímero por molécula de enzima, e a retenção de pelo menos 40% da actividade enzimática. Nenhum resultado de teste foi relatado para a extensão do acoplamento de PEG aos grupos amino disponíveis de uricase, a actividade uricolítica específica residual, ou a imunoreactividade do conjugado.
Os dados de 13 citações que se referem à PEGilação da uricase são resumidos na Tabela 1. Alguns destes resultados são apresentados também graficamente nas Figuras 1A-2B. Sete dessas publicações descrevem diminuições significativas na atividade uricolítica medida in vitro, causadas pelo acoplamento de vários números de filamentos de PEG à uricase de Candida utilis. O acoplamento de um 5 grande número de filamentos de PEG de 5 kDa à uricase do fígado de suíno acarretou resultados similares, tal como descrito na publicação de Chen e num relatório de simpósio pelo mesmo grupo. Chen, et al., (1981); Davis, et al.r (1978) .
Entre os estudos resumidos na Tabela 1, a imunoreactividade da uricase foi relatada como sendo diminuída pela PEGilação em sete deles e eliminada em cinco deles. Em três dos últimos cinco estudos, a eliminação da imunoreatividade foi associada às diminuições profundas na actividade uricolítica - até no máximo 15%, 28%, ou 45% da actividade inicial. Nishimura, et al., (1979) (15% actividade); Chen, et al., (1981) (28% actividade); Nishimura, et al., (1981) (45% actividade). No quarto relatório, o PEG foi relatado como sendo acoplado a 61% dos resíduos de lisina disponíveis, mas a actividade específica residual não foi indicada. Abuchowski, et al., (1981). Entretanto, uma equipe de pesquisa que incluía dois dos mesmos cientistas e utilizou os mesmos métodos, relatou noutra parte que essa extensão do acoplamento deixou uma actividade residual de somente 23% a 28%. Chen, et al, (1981). As publicações de 1981 de Abuchowski et al. e de Chen et al., indicam que, para reduzir substancialmente a capacidade imunogénica da uricase, o PEG deve ser acoplado a aproximadamente 60% dos resíduos de lisina disponíveis (Tabela 1). A quinta publicação em que a imunoreactividade da uricase foi relatada como tendo sido eliminado, não divulga a extensão do acoplamento do PEG, a actividade uricolítica residual, ou a natureza da ligação de PEG-proteína. Veronese, FM, et al., (1997) in JM Harris, et al., (Eds.), Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 182-192) Washington, DC: American Chemical Society. A conjugação de PEG a uma fracção menor dos resíduos de lisina em uricase reduziu, mas não eliminou, a sua imunoreatividade em animais experimentais. Tsuji, J, et al, (1985) Int J Imunopharmacol. 7:725-730 (28% a 45% dos grupos amino acoplados); Yasuda, Y, et al, (1990) Chem Pharm Buli 38:2053-2056 (38% dos grupos amino acoplados). As actividades uricolíticas residuais dos adutos correspondentes variaram de <33% (Tsuji, et al.) a 60% (Yasuda, et al) dos seus valores iniciais. Tsuji, et al. 6 sintetizaram conjugados de PEG-uricase com PEGs de 7,5 kDa e 10 kDa, além de PEG de 5 kDa. Todos os conjugados resultantes eram um pouco imunogénicos e antigénicos, ao mesmo tempo que apresentavam actividades enzimáticas bastante reduzidas (Tabela 1; Figuras 1A-1B).
Um preparado de uricase PEGilada de Candida utilis que foi administrado com segurança duas vezes a cada um de cinco seres humanos, foi relatado como tendo retido somente 11% de sua actividade inicial. Davis, et al., (1981). Diversos anos mais tarde, a uricase modificada com PEG de Arthrobacter protomorfiae foi administrada quatro vezes a um paciente com linfoma avançado e hiperuricemia grave. Chua, et al., (1988). Embora a actividade residual desse preparado de enzima não tenha sido medida, Chua, et al., demonstraram a ausência de anticorpos antiuricase no soro do paciente, 26 dias depois da primeira injecção de PEG-uricase, num ensaio de imunosorvente ligado por enzima (ELISA).
Conforme resumido na Tabela 1, os estudos precedentes da uricase PEGilada mostram que a actividade catalítica é bastante reduzida mediante o acoplamento de um número suficiente de filamentos de PEG, de modo a diminuir substancialmente a sua imunoreactividade. Além disso, a maioria dos preparados precedentes de PEG-uricase era sintetizada ao utilizar-se PEG activado com cloreto cianúrico, um derivado de triazina (2,4,6-tricloro-l,3,5-triazina) que demonstrou introduzir novas determinantes antigénicas e induzir a formação de anticorpos em coelhos. Tsuji, et al., (1985). 7 TABELA 1:
Caracteristicas de PEG-uricases dos Estudos Precedentes Fonte de Ligação de Peso Percentagem Actividade Capacidade Referência Uricase Acopla- Molecular de Lisinas Uricolitica antigénica mento do PEG com PEG Residual ou (kDa) Ligado (%) imunogénica Comentários Não Azida 0,7 Não Não Não Patente relatada (diol) relatada relatada relatada Estados Unidos 4.179.337 Candida Triazina 5 % de "98" Capacidade Nishimu, H, utilis (cloreto antigénica et al., cianúrico) com soro de coelho (% da enzima 1979 não 20 31 modificada) 26 21 70% 43 15 6% 48 5 0 0 Candida peg2 2x5 22 87 86% Nishimura, utilis Triazina 25 70 49% H, et al., 1981 36 45 0 46 31 0 50 27 0 Candida Triazina 5 71 11 Cinco Davis, S, utilis homens et al., toleraram duas injecções em trinta dias. 1981
Candida Triazina 5 49 Não Capacidade Abuchowski, utilis de acordo relatada imunogénica A, et ai., com Chen, similar à 1981 R H-L, uricase et ai., 61 nativa, em 1981 Não aves relatada Capacidade imunogénica negativa Fígado Triazina 5 37 60 Aclaramento Chen, R H- de suíno acelerado L, et ai., 47 45 em 1981 camundongos 58 28 Aclaramento acelerado em camundongos Aclaramento constante (semi-vida de aprox. 8 horas) Candida Triazina 5 57 23 Aclaramento utilis constante (semi-vida de aprox. 8 horas) Candida Triazina 5 35 Não 0 PEG Savoca, KV, utilis de acordo relatada reduziu a et ai., com Chen, capacidade (1984) Int R H-L, imunogénica Arch et ai., 70 em coelhos Allergy 1981 Não 0 PEG Appl relatada reduziu a Immunol capacidade 75:58-67 imuno- génica em coelhos 9 TABELA 1: (continuação)
Caracteristicas de PEG-uricases dos Estudos Precedentes
Fonte de Uricase Ligação de Acopla mento Peso Molecular do PEG (kDa) Percentagem de Lisinas com PEG Ligado Actividade Uricolítica Residual (%) Capacidade antigénica ou imunogénica Comentários Referên cia Candida utilis Triazina 5 Não relatada Não relatada A PEG-uricase foi administrada oralmente a frangos, em lipossomas (uma vez) Nishida , Y, et al.r (1984) J Pharm Pharmac ol 36:354- 355 Candida utilis Triazina 5 7,5 10 44 45 28 37 41 45 9,4 7,8 32 11 3 7,3 Capacidade imunogénica reduzida, mas positiva em coelhos. (Anticorpos não para a uricase; eles reagem bilateralmente com PEG- dismutase de superóxido). A capacidade antigénica testada com anticorpos de porqui nhos da índia foi reduzida. Tsuj i, J, et al., 1985 Arthrobacter protoformiae Não relatada 5 Não relatada Não relatada Nenhum anticorpo foi Chua, CC, et al., 10
Candida utilis peg2 triazina 2 x 5 10 90 12 89 15 80 21 70 38 60 detectado por ELISA 26 dias depois da primeira de quatro injeções de PEG-uricase. 1988 Não Não Não relatada relatada relatada Não relatada A capacidade antigénica testada com soro de coelho foi reduzida em 75%.
Yasuda Y, et ai. 1990 r
Candida utilis PEG2 triazina 2 x 5 22 68
Uma só injeção. O PEG aumentou a semi-vida de aprox. uma hora para aprox. oito horas em camundongos.
O PEG bloqueou o aclaramento pelo fígado, baço e rim (duração do estudo de 24 horas)
Fuj ita T, et ai. 1991 r 11 TABELA 1: (continuação)
Caracteristicas de PEG-uricases dos Estudos Precedentes Fonte de Ligação Peso Percentagem Actividade Capacidade Referência Uricase de Molecular de Lisinas Uricolitica antigénica Acopla- do com PEG Residual ou mento PEG (kDa) Ligado (%) imunogénica Comentários Não PEG Não Não Não A Veronese, relatada relatada relatada relatada capacidade FM, imunogénica et al., em 1997 peg2 Relatada Não camundongos foi como a relatada reduzida em Ligação mesma que 98% (PEG) não declarada para 0 PEG ou 100% (peg2) . A patente japonesa 3-148298, concedida a A. Sano, et ai., apresenta proteínas modificadas, incluindo a uricase, derivatizadas com PEG, que tem um peso molecular de 1-12 kDa que mostra uma capacidade antigénica reduzida e uma acção "prolongada e melhorada", e métodos de produção de tais peptídeos derivatizados. Entretanto, não há nenhuma descrição a respeito das contagens de filamentos, ensaios de enzima, testes biológicos ou sobre o significado de "prolongada e melhorada". As patentes japonesas 55-99189 e 62-55079, ambas concedidas a Y Inada, apresentam conjugados de uricase preparados com PEG-triazina ou jbis-PEG-triazina (indicado como PEG2 na Tabela 1), respectivamente. Veja Nishimura, et ai., (1979 e 1981). No primeiro tipo de conjugado, os pesos moleculares dos PEGS eram de 2 kDa e 5 kDa, ao passo que no segundo apenas o PEG de 5 kDa foi utilizado. Nishimura, et ai., (1979) relataram a recuperação de 15% da actividade uricolitica após a modificação de 43% das lisinas disponíveis com o PEG linear de 5 kDa, ao passo que Nishimura, et ai. (1981) relataram a recuperação de 31% ou 45% da actividade uricolitica após a modificação de 46% ou de 36% das lisinas, respectivamente, com PEG2 · 12
Sumário da Invenção
Os estudos precedentes ensinam que, quando uma redução significativa na capacidade imunogénica e/ou na capacidade antigénica da uricase é obtida por meio da PEGilação, ela é associada invariavelmente a uma perda substancial da actividade uricolitica. A segurança, a conveniência e a economia dos produtos biofarmacêuticos são adversamente afectadas por diminuições das suas potências e pela consequente necessidade de aumentar a dose administrada. Assim, há necessidade de encontrar um meio seguro e eficaz alternativo para baixar os níveis elevados de ácido úrico nos fluidos corpóreos, incluindo o sangue e a urina. A presente invenção apresenta uma PEG-uricase substancialmente não imunogénica que retém toda, ou quase toda, a actividade uricolitica da enzima não modificada.
Uma das formas de manifestação da presente invenção é um conjugado de urate oxidase (uricase) conforme definido na reivindicação 1. Outras manifestações estão definidas nas reivindicações 2 a 6. A uricase deste aspecto da invenção pode ser recombinante. Quer seja recombinante ou não, a uricase pode ser de origem de mamíferos. Num aspecto desta forma de manifestação, a uricase pode ser uricase de fígado de suínos, bovinos ou ovinos. Num outro aspecto desta forma de manifestação, a uricase pode ser quimérica. A uricase quimérica pode conter partes da uricase de fígado de suíno e/ou de fígado de babuíno. Por exemplo, a uricase quimérica pode ser uricase quimérica de porco-babuíno (uricase de PBC) ou uricase de suíno que contém as mutações R291K e T301S (uricase de PKS) (veja as sequências na Figura 6 e os resultados dos estudos fisiológicos e imunológicos nas Figuras 7-12). Alternativamente, a uricase pode ser uricase de fígado de babuíno onde a tirosina 97 foi substituída pela histidina, através da qual a actividade específica da uricase pode ser aumentada em, pelo menos, aproximadamente 60%. A uricase da invenção, qualquer que seja a origem, também pode estar numa forma truncada, no terminal amino ou no terminal carboxila, ou em ambos os terminais. Analogamente, a uricase pode ser uricase fúngica ou microbiana. Num aspecto desta forma de manifestação, a uricase fúngica ou microbiaana pode ser uma forma natural ou recombinante da uricase de Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis ou Candida utilis. 13
Alternativamente, a uricase pode ser uma uricase de invertebrado tal como, por exemplo, uma forma natural ou recombinante da uricase de Drosophila melanogaster ou Drosophila pseudobscura. A uricase da invenção também pode ser uma uricase de planta, por exemplo, uma forma natural ou recombinante da uricase do nódulo da raiz de soja (Glycine max) . 0 PEG pode ter um peso molecular médio entre aproximadamente 5 kDa e 100 kDa; de preferência, o PEG pode ter um peso molecular médio entre aproximadamente 10 kDa e 60 kDa; de maior preferência, o PEG pode ter um peso molecular médio entre aproximadamente 20 kDa e aproximadamente 40 kDa tal como, por exemplo, 30 kDa. O número médio de filamentos covalentemente ligados do PEG pode ser de dois a dez por subunidade de uricase; de preferência, o número médio de filamentos covalentemente ligados pode ser de três a oito por subunidade; de maior preferência, o número médio dos filamentos do PEG pode ser de quatro a seis por subunidade. Num aspecto desta forma de manifestação, a uricase pode ser tetramérica. Os filamentos de PEG podem ser covalentemente ligados à uricase através das ligações uretano (carbamato), ligações amina secundária, e/ou ligações amida. Quando a uricase é uma forma recombinante de qualquer das uricases aqui mencionadas, a forma recombinante pode ter substancialmente a sequência da forma de ocorrência natural.
Uma outra forma de manifestação da presente invenção é uma composição farmacêutica conforme definido na reivindicação 1. A composição pode ser estabilizada através de liofilização, e também se pode dissolver imediatamente com a reconstituição para que se obtenha soluções apropriadas para a administração parenteral.
Está previsto um uso de PEG-uricase para baixar os niveis de ácido úrico nos fluidos corpóreos e tecidos de um mamífero. O uso inclui a administração, a um mamífero, de uma quantidade redutora de ácido úrico eficaz de PEG-uricase. A PEG-uricase pode ser uma uricase purificada de duas ou mais subunidades, na qual cada subunidade pode ser covalentemente ligada a uma média de dois a dez filamentos de PEG linear ou ramificado, podendo cada molécula de PEG ter um peso molecular entre aproximadamente 5 kDa e 100 kDa, num veículo farmaceuticamente aceitável. O mamífero pode ser um ser humano. A etapa da administração 14 pode ser, por exemplo, injecção por via intravenosa, intradérmica, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal, ou pela inalação de um preparado em aerossol. Os níveis de ácido úrico elevados podem estar no sangue, na urina e/ou noutros fluidos corpóreos e tecidos, e podem ser associados à gota, cálculos artríticos, insuficiência renal, transplante de órgãos ou uma doença maligna.
Um método pode incluir as etapas de: aplicação da solução a, pelo menos, uma coluna de separação a um pH entre aproximadamente 9 e 10,5 tal como, por exemplo, 10,2; a recuperação das fracções do eluato e a identificação daqueles que podem conter uricase tetramérica isolada, sendo as fracções substancialmente livres de agregados de uricase; e o agrupamento das fracções da uricase tetramérica isolada. A coluna de separação pode ser baseada na troca de íons, na exclusão de tamanho, ou em qualquer outra propriedade de separação eficaz. O método também pode incluir a análise das fracções para determinar a presença de uricase tetramérica e/ou da ausência de agregados de uricase. Por exemplo, essa análise pode incluir a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), outros métodos cromatográficos, dispersão luminosa, centrifugação e/ou electroforese. Num aspecto desta forma de manifestação, a uricase tetramérica purificada pode conter menos de aproximadamente 10% de agregados de uricase.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura IA mostra a retenção da actividade pela uricase PEGilada de Candida utilis, em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. A Figura 1B mostra a retenção da actividade pela uricase PEGilada de Candida utilis, em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A Figura 2A mostra a retenção da actividade pela uricase PEGilada do fígado de suíno, em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. A Figura 2B mostra a retenção da actividade pela uricase PEGilada do fígado de suíno, em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. 15 A Figura 3A mostra a retenção da actividade pela uricase quimérica de porco-babuíno (PBC) PEGilada, em função do número de filamentos acoplados por subunidade. A Figura 3B mostra a retenção da actividade pela uricase de PBC PEGilada, em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A Figura 4A mostra a retenção da actividade pela uricase PEGilada de Aspergillus flavus, em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. A Figura 4B mostra a retenção da actividade pela uricase PEGilada de Aspergillus flavus, em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A Figura 5A mostra a retenção da actividade pela uricase de nódulo de raiz de soja recombinante PEGilada, em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. A Figura 5B mostra a retenção da actividade pela uricase de nódulo de raiz de soja recombinante PEGilada em função da massa total de PEG acoplada por subunidade. A Figura 6 mostra as sequências de aminoácidos deduzidas da uricase quimérica de porco-babuíno (uricase de PBC), da uricase de PBC que é truncada nos terminais amino e carboxila (PBC-NT-CT) e da uricase de suíno que contém as mutações R291K e T301S (uricase de PKS), comparadas com as sequências de suíno e babuíno. A Figura 7 mostra a actividade da uricase no soro de camundongo, 24 horas depois de cada uma (entre quatro ou cinco) das injecções intraperitoneais de uricase de PBC modificada com PEG, em relação ao valor 24 horas depois da primeira injecção. A Figura 8 mostra a relação inversa entre a actividade da uricase de PBC modificada com PEG, injectada no soro de um camundongo com deficiência de uricase, e as concentrações de ácido úrico no soro e na urina. A Figura 9 mostra a gravidade decrescente de um defeito de concentração na urina, em camundongos com deficiência em uricase (uox -/-), que foram tratados com uricase de PBC modificada com PEG. A Figura 10 mostra a gravidade decrescente de diabetes insipidus nefrogénica em camundongos com deficiência de uricase (uox que foram tratados com uricase de PBC modificada com PEG. A Figura 11 mostra a gravidade decrescente da nefropatia induzida por ácido úrico, tal como visualizada pela microscopia de ressonância magnética, em camundongos com 16 deficiência em uricase (uox -/-) que foram tratados com uricase de PBC modificada com PEG. A Figura 12 mostra o aclaramento acelerado da circulação de camundongos BALB/c do octâmero de uricase de PBC injectado, comparado com o tetrâmero, quando ambos foram acoplados a cinco a seis filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade.
Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas A presente invenção apresenta conjugados aperfeiçoados de polímeros,de preferência de poli(etioleno glicóis) ou de poli (etileno óxidos) solúveis em água, com uricases. A invenção também apresenta composições farmacêuticas dos conjugados aperfeiçoados. Esses conjugados são substancialmente não imunogénicos e retêm pelo menos 75%, de preferência 85%, e de maior preferência 95% ou mais, da actividade uricolítica da enzima não modificada. As uricases apropriadas para a conjugação em polímeros solúveis em água incluem as urate oxidases naturais isoladas de bactérias, fungos e tecidos das plantas e animais vertebrados e invertebrados, assim como as formas recombinantes de uricase, incluindo as variantes mutadas, híbridas, e/ou truncadas enzimaticamente activas da uricase. Os polímeros solúveis em água apropriados para o uso na presente invenção incluem poli(etileno glicóis) ou poli(etileno óxidos) lineares e ramificados, todos geralmente conhecidos como PEGS. Os exemplos de PEG ramificado são o objecto da Patente Estados Unidos 5.643.575. Um exemplo preferido de PEG linear é monometóxi-PEG, de estrutura geral CH30- (CH2CH2O) nH, onde n varia de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.300.
Uma uricase de mamífero preferida é a uricase quimérica de porco-babuíno recombinante, composta por partes das sequências de uricase de fígado de porco e fígado de babuíno, tendo sido ambas determinadas primeiramente por Wu, et al., (1989). Um exemplo dessa uricase quimérica contém os primeiros 225 aminoácidos da sequência de uricase de suíno (SEQ ID NO.: 1) e os últimos 79 aminoácidos da sequência de uricase de babuíno (SEQ ID NO.: 2) (uricase de porco-babuíno, ou uricase de PBC; veja a Figura 6) . Um outro exemplo dessa uricase quimérica contém os resíduos 7- 17 225 da sequência de suíno (SEQ ID NO.: 1) e os resíduos 226-301 da sequência de babuíno (SEQ ID NO.: 2); isto é equivalente à uricase de PBC que é truncada nos terminais amino e carboxila (PBC-NT-CT; veja a Figura 6) . Um outro exemplo dessa uricase quimérica contém os primeiros 288 aminoácidos da sequência de suíno (SEQ ID NO.: 1) e os últimos 16 aminoácidos da sequência de babuíno (SEQ ID NO.: 2) . Uma vez que a última sequência difere da sequência de suíno em somente duas posições, tendo uma lisina (K) no lugar da arginina no resíduo 291 e uma serina (S) no lugar da treonina no resíduo 301, este mutante é indicado como uricase de porco-K-S ou PKS. Cada uma das uricases de PKS, PBC e PBC-NT-CT tem mais um resíduo de lisina e, desse modo, um outro sítio com potencialidade de PEGilação do que a sequência de suíno ou de babuíno.
Os ADNs para várias uricases de mamíferos, incluindo a uricase de PBC, a uricase de PKS e uma do tipo de babuíno recombinante, foram subclonados, e as condições óptimas foram determinadas para a expressão em E. coli, ao serem utilizados métodos-padrão. Veja Erlich, HA, (Ed.) (1989) PCR Technology. Principies and Applications for ADN Amplification. New York: Stockton Press; Sambrook, J, et ai., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. As uricases recombinantes foram extraídas e purificadas, e as suas estabilidade e actividade foram avaliadas usando uma modificação de ensaios-padrão. Veja Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240:2491-2494; Nishimura, et al., (1979), e o Exemplo 1.
Numa das formas de manifestação da invenção, a uricase pode ser conjugada através de uma ligação covalente atóxica biologicamente estável, a um número relativamente pequeno de filamentos de PEG. Essas ligações podem incluir ligações uretano (carbamato), ligações amina secundára, e ligações amido. Vários PEGs activados apropriados para essa conjugação estão disponíveis comercialmente na Shearwater Polymers, Huntsville, AL.
Por exemplo, as ligações uretano para a uricase podem ser formadas mediante a incubação da uricase na presença do derivado de carbonato de succinimidila (SC) ou de carbonato 4-nitrofenila (NPC) de PEG. A SC-PEG pode ser sintetizada 18 usando o procedimento descrito na patente Estados Unidos 5.612.460, que está aqui incorporada a titulo de referência. A NPC-PEG pode ser sintetizada ao fazer reagir o PEG com cloroformato de 4-nitrofenila, de acordo com os métodos descritos em Veronese, FM, et al., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11:141-152, e na patente Estados Unidos 5.286.637, que está aqui incorporada a titulo de referência. Os métodos descritos na patente '637 são adaptados a PEGs de um peso molecular mais elevado, mediante o ajuste das concentrações dos reagentes para manter uma estequiometria semelhante. Um método alternativo da sintese de NPC-PEG é descrito por Buttner, W., et al., Relatório Descritivo de Patente Alemã 279 486 Al.
As ligações amido para a uricase podem ser obtidas usando um éster de N-hidróxi succinimida de um derivado de ácido carboxilico de PEG (Shearwater POlymers). As ligações amina secundária podem ser formadas usando 2,2,2-trifluoro etano sulfonil PEG (tresil PEG; Shearwater Polymers) ou mediante a alquilação redutiva usando o aldeido de PEG (Shearwater Polymers) e cianoboridreto de sódio.
Nos conjugados que contêm PEGs com pesos moleculares entre 5 kDa e 30 kDa, o número máximo de filamentos do PEG que foram acopladas por subunidade, ao reter pelo menos 75% da actividade uricolitica da enzima não modificada, variou de uma média de dois filamentos para a uricase de soja a mais de dez filamentos para a uricase de PBC (veja as condições do ensaio no Exemplo 1 e os resultados nas Figuras 1A-5B). A última extensão de PEGilação corresponde a aproximadamente um terço dos grupos amino totais. Numa das formas de manifestação da invenção, o número médio de filamentos de PEG acoplados por subunidade de uricase fica entre dois e dez. Numa forma de manifestação preferida, o número médio de filamentos de PEG acoplados por subunidade de uricase fica entre três e oito. Numa forma de manifestação mais preferida, o número médio de filamentos covalentemente ligados de PEG por subunidade de uricase fica entre quatro e seis. Numa outra forma de manifestação, o peso molecular do PEG utilizado para a reacção de acoplamento fica entre 5 kDa e 100 kDa, de preferência entre 10 kDa e 60 kDa, e de maior preferência entre 20 kDa e 40 kDa tal como, por exemplo, 30 kDa. 19 Há diversos factores que podem afectar a escolha do peso molecular e o número óptimo de filamentos de PEG para acoplar a uma determinada forma de uricase. Geralmente, a redução ou a eliminação da capacidade imunogénica sem perda substancial da actividade uricolitica pode requerer o acoplamento de relativamente mais filamentos de PEG com um peso molecular mais baixo, em comparação a relativamente poucos filamentos de PEG com um peso molecular mais elevado. Por exemplo, seis filamentos de PEG de 20 kDa por subunidade ou quatro filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade puderam ter uma eficácia óptima. Do mesmo modo, cada forma diferente de uricase pode ter um valor óptimo diferente no que diz respeito ao tamanho e ao número de filamentos. Veja as Figuras 1A-5B. A conjugação de PEG tornou todas as uricases testadas solúveis e estáveis nos tampões ao pH fisiológico, sem a adição de um análogo ou inibidor de substrato, tal como a 8-azaxantina, que é utilizada como um estabilizante na uricase fúngica (Uricozyme®) vendida pela Sanofi Winthrop em França e na Itália. Dois conjugados diferentes de uricase de PBC, um contendo aproximadamente seis filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade e o outro contendo aproximadamente dois filamentos de PEG de 19 kDa por subunidade, retiveram uma actividade significativa após a incubação em soro de camundongo por mais de um mês a 37°C. Além disso, diversos conjugados da presente invenção tiveram uma semi-vida em circulação nos camundongos superiores a dois dias, ao contrário das vidas médias de aproximadamente oito horas ou 24 horas previamente relatadas para as uricases de mamíferos e microbianas modificadas com PEG. Chen, et al., (1981); Fuertges, F, et al., (1990) J Contr Release 11: 139-148; Fujita, T, et al., (1991) J Pharmacoblodyn 14:623_629. Semi-vidas mais longas de drogas injectadas de proteína tornam estas mais económicas e podem levar a uma melhor compatibilidade com o paciente. A semi-vida prolongada é também indicativa de produtos que são melhor tolerados pelo corpo.
Quando os conjugados de PEG da uricase de PBC foram preparados a partir da forma tetramérica purificada da enzima (quatro subunidades de 35 kDa), apresentaram uma capacidade imunogénica muito reduzida em camundongos 20 (Figura 7), ao contrário da capacidade imunogénica moderada dos conjugados de PEG de formas maiores de enzima (por exemplo, octâmeros da subunidade de 35 kDa; veja a Figura 12), e a capacidade imunogénica muito elevada da enzima não modificada. As injecções repetidas em camundongos com deficiência em uricase com a PEG-uricase da presente invenção eliminaram a sua hiperuricemia por mais de dois meses e protegeram a estrutura e o funcionamento dos seus rins contra os danos relacionados com o ácido úrico (Figuras 8-11).
As injeções de conjugados inteiramente activos da uricase de PBC com o PEG de 10 kDa (Figuras 3A-3B) reduziram drasticamente a hiperuricemia de camundongos com deficiência de uricase homozigóticos (Figura 8). Os niveis de ácidos úrico na urina foram também drasticamente reduzidos em todos os camundongos com deficiência em uricase, tratados com a uricase de PBC modificada com PEG. Os camundongos com deficiência em uricase receberam uma série de injecções com um preparado de PEG-uricase, semelhante ao utilizado para obter os dados na Figura 8. Esse tratamento reduziu a gravidade de um defeito de concentração na urina, tal como foi demonstrado por medições da osmolalidade da urina em condições normais e após um período de doze horas sem água (Figura 9) , e pelo seu consumo de água e saída na urina (Figura 10), em comparação com as mediçõess correspondentes em camundongos geneticamente semelhantes não tratados. Também foi demonstrado que dez semanas de tratamento, iniciado nos primeiros dez dias de vida, de camundongos knockout (de queda) com deficiência em uricase homozigóticos (uox -/-) com uma PEG-uricase da presente invenção, diminuíram a gravidade da rotura da arquitectura renal induzida por urate, tal como foi visualizado pela microscopia de ressonância magnética (Figura 11) . Para os métodos de microscopia, veja Hedlund, LW, et al., (1991) Fund Appl
Toxicol 16:787-797; Johnson, GA, et al., (1992) in JC Gore, (Ed.), Reviews of Magnetic Resonance in Medicine, Vol. 4 (pp. 187-219) New York: Pergamon Press.
Os preparados purificados de uricases naturais e recombinantes contêm geralmente uma mistura de agregados de enzima, além da forma (140 kDa) tetramérica. A percentagem de cada preparado de uricase que está na forma tetramérica 21 varia geralmente de, aproximadamente, 20% a 90%. Apesar da evidência que os agregados não PEGilados de diversas outras proteínas são altamente imunogénicos (veja, por exemplo, Moore, WV, et al., (1980) J Clin Endocrinol Metab. 51:691-697), os estudos precedentes de PEG-uricase não descrevem nenhum esforço para limitar o teor dos agregados, sugerindo que a capacidade imunogénica potencial dos agregados modificados pela PEG não foi levada em consideração. Com base nas observações dos autores da presente invenção, parece provável que esses agregados estejam presentes nos preparados de enzima utilizados para as sínteses precedentes de PEG-uricase. A sua presença pode ter dificultado a tarefa de preparar conjugados não imunogénicos. Também parece que as grandes perdas da actividade uricolítica, observadas em esforços precedentes para PEGilar a uricase, estavam relacionadas com o grande número de filamentos de PEG de baixo peso molecular que foram acoplados. Por outro lado, os métodos de purificação e PEGilação da uricase aqui descritos permitem a ligação covalente de até dez filamentos de PEG por subunidade ao passo que retêm mais de 75% da actividade uricolítica, pelo menos para determinadas uricases, por exemplo, a uricase quimérica de porco-babuíno e a enzima de A. flavus (veja as Figuras 3A e 4A).
Numa outra forma de manifestação preferida, substancialmente todos os agregados da forma tetramérica da enzima podem ser removidos através de cromatografia de troca de íons ou de exclusão de tamanho, a um pH entre aproximadamente 9 e 10.5, de preferência de 10.2, antes da conjugação do preparado de uricase resultante, substancialmente tetramérico. O peso molecular da uricase em cada fracção da coluna preparativa pode ser monitorado por qualquer técnica analítica dependente de tamanho, incluindo, por exemplo, a HPLC, a cromatografia de exclusão de tamanho convencional, a centrifugação, a dispersão luminosa, a eletroforese capilar ou a eletroforese com gel num tampão não desnaturante. Para a uricase tetramérica isolada usando a cromatografia de exclusão de tamanho, as fracções que contêm somente a forma de 140 kDa da enzima podem ser agrupadas e utilizadas para a conjugação em PEG. Para a uricase tetramérica isolada usando a cromatografia de troca de íons, as fracções da coluna de troca de íons podem ser analisadas quanto ao tamanho para se determinar 22 quais as fracções que contêm quantidades substanciais da forma tetramérica sem aqregados detectáveis. Da uricase agrupada dessa maneira, pelo menos 90% podem estar na forma tetramérica; os agregados indesejáveis podem, desse modo, apresentar valores tão reduzidos como aproximadamente 10%, 5%, 2%, ou menos, da uricase isolada total.
Os resultados aqui apresentados indicam que, mesmo quando extensivamente PEGiladas, as formas da uricase de PBC maiores do que o tetrâmero são altamente imunogénicas nos camundongos (Figura 12). Além disso, nos camundongos que tinham sido injectados uma vez com os conjugados de PEG de agregados de uricase, a actividade uricolitica nas injecções subsequentes, tanto de tetrâmeros PEGilados quanto de agregados PEGilados, foi retirada rapidamente de circulação. Por outro lado, os conjugados preparados a partir de uricase contendo menos de 5% de agregados podiam ser reinjectados muitas vezes sem nenhuma aceleração das suas taxas de aclaramento (Figura 7) e sem a formação detectável de anticorpos, conforme medido por um imunoensaio ligado por enzima sensivel. O emprego de uricase tetramérica altamente purificada distingue ainda mais os conjugados aperfeiçoados da presente invenção dos preparados de PEG-uricase descritos anteriormente. Por outro lado, a presença de uma proporção significativa (por exemplo, > 10%) dos agregados nos preparados de uricase utilizados por alguns pesquisadores precedentes pode ter conduzido ao acoplamento de um grande número de filamentos de PEG nos esforços para suprimir a capacidade imunogénica. Consequentemente, a actividade enzimática dos conjugados resultantes foi diminuída substancialmente. Noutras formas de manifestação, a presente invenção contempla expressamente a uricase PEGilada na forma não tetramérica, tais como, por exemplo, dímeros de uricase, contanto que os preparados de tal uricase conjugada retenham, pelo menos, aproximadamente 75% da sua actividade uricolitica e sejam substancialmente não imunogénicos.
Numa outra forma de manifestação da presente invenção, é apresentada uma uricase de fígado de babuíno mutada de potência inesperadamente aumentada, em relação à da enzima não mutada. Essa uricase de primata aperfeiçoada foi preparada através de técnicas de ADN recombinante convencionais. Foi particularmente inesperado que a 23 substituição de um único resíduo de aminoácido (histidina em lugar de tirosina na posição 97) na uricase de babuíno resultaria num aumento substancial na actividade enzimática específica. Quando expressa em E. coli, verificou-se que essa proteína mutante apresenta, pelo menos, uma actividade específica 60% mais elevada do que a enzima de babuíno recombinante da qual ela foi derivada.
Numa outra forma de manifestação, a actividade específica é aumentada e/ou a solubilidade da enzima não PEGilada é aumentada mediante a expressão de variantes truncadas das uricases quiméricas de suíno ou de de suíno-babuíno, das quais, pelo menos, os primeiros seis aminoácidos no terminal amino e/ou, pelo menos, os últimos três aminoácidos no terminal carboxila são suprimidos das proteínas expressas (veja a Figura 6). As uricases recombinantes com o truncamento do terminal carboxila podem ter uma melhor solubilidade antes da PEGilação devido à remoção da sequência- alvo peroxisomal. Veja Miura, S, et al., (1994) Eur J Biochem 223:141-146.
Os conjugados de PEG-uricase da presente invenção são úteis para baixar os níveis de ácido úrico nos fluidos corpóreos e tecidos dos mamíferos, de preferência dos seres humanos, e desse modo podem ser utilizados para o tratamento dos níveis elevados de ácido úrico associados às condições que incluem a gota, cálculos artríticos, insuficiência renal, transplante de órgãos e doença maligna. Os conjugados de PEG-uricase podem ser injetados num mamífero que tem níveis de ácido úrico excessivos, por uma de várias vias, incluindo as vias intravenosa, subcutânea, intradérmica, intramuscular e intraperitoneal. Alternativamente, podem ser ministrados em aerossol e inalados. Veja Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19:3-36 e a patente Estados Unidos 5.458.135. A dose eficaz de PEG-uricase da presente invenção vai depender do nível de ácido úrico e do tamanho do indivíduo. Numa forma de manifestação deste aspecto da invenção, a PEG-uricase é administrada num excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável, numa quantidade que varia entre aproximadamente 10 μρ e aproximadamente 1 g. Numa forma de manifestação preferida, a quantidade administrada fica entre aproximadamente 100 μg e 500 mg. De maior preferência, a uricase conjugada é administrada numa quantidade entre 1 mg e 100 mg tal como, por exemplo, 24 5 mg, 20 mg ou 50 mg. As massas fornecidas para as quantidades de dosagem das formas de manifestação referem-se à quantidade de proteína no conjugado.
As formulações farmacêuticas que contêm PEG-uricase podem ser preparadas através de técnicas convencionais, por exemplo, conforme descritos em Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Easton, PA: Mack Publishing Co. Os excipientes apropriados para a preparação de soluções injetáveis incluem, por exemplo, soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de Ringer lactada, água, polióis e glicerol. As composições farmacêuticas para a injecção parenteral compreendem líquidos aquosos e não aquosos estéreis, dispersões, suspensões e emulsões farmaceuticamente aceitáveis, bem como pós estéreis para a reconstituição em soluções ou dispersões injectáveis estéreis, imediatamente antes do uso. Essas formulações podem conter componentes adicionais tais como, por exemplo, conservantes, solubilizantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, tampões, antioxidantes e diluentes. A PEG-uricase pode também ser ministrada sob a forma de composições de liberação controlada para implante num indivíduo, para controlar continuamente os níveis de ácido úrico elevados nos fluidos corpóreos. Por exemplo, o ácido poliláctico, ácido poliglicólico, colágeno regenerado, poli-L-lisina, alginato de sódio, goma de gelana, quitosana, agarose, lipossomas multilamelares e muitas outras formulações de armazenagem convencionais compreendem materiais bioerodíveis ou biodegradáveis que podem ser formulados com composições biologicamente activas. Estes materiais, quando implantados ou injectados, enfraquecem e liberam gradualmente o material activo no tecido circunvizinho. Por exemplo, um método de encapsulação de PEG-uricase compreende o método apresentado na patente Estados Unidos 5.653.974. O emprego de formulações bioerodíveis, biodegradáveis e outras de armazenagem é contemplado expressamente na presente invenção. O uso de bombas de infusão e de sistemas de captura de matriz para a administração de PEG-uricase também é englobado dentro do âmbito da presente invenção. A PEG-uricase também pode ser vantajosamente incluída nas micelas ou nos lipossomas. A tecnologia de encapsulação de lipossoma é bem conhecida no 25 estado da técnica. Veja, por exemplo, Lasic, D, et al.r (Eds.) (1995) Stealth Liposomes. Boca Raton, F1: CRC Press.
As composições farmacêuticas de PEG-uricase da invenção irão diminuir a necessidade de hemodiálise nos pacientes com risco elevado de falha renal induzida por urate, por exemplo, os receptores de transplantes de órgãos (veja Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron. 56:317-321) e os pacientes com algumas doenças malignas. Nos pacientes com grandes acúmulos de urate cristalino (cálculos artríticos), essas composições farmacêuticas irão melhorar a qualidade de vida mais rapidamente do que os tratamentos actualmente disponíveis.
Os seguintes exemplos ilustram os vários aspectos acima apresentados. Estes exemplos descrevem PEG-uricases preparadas através do acoplamento de derivados de PEG (ou seja, eletrofílicos) de diversos tamanhos e composições com as uricases de suíno, fúngicas ou bacterianas de ocorrência natural, ou com as uricases quiméricas de soja, suíno ou porco-babuíno recombinantes. Os resultados dos estudos da actividade, da solubilidade, da estabilidade, farmacocinéticos, farmacodinâmicos e imunológicos estão incluídos. Os dados nas Figuras 8-11 fornecem a evidência da capacidade da uricase de PBC modificada com PEG da presente invenção, corrigir a hiperuricemia e a hiperuricosúria e preservar a estrutura e a função renal num modelo animal, em que a hiperuricemia e a hiperuricosúria ocorrem e causam graves danos renais. Wu, X, et al., (1994) Proc Natl Acad Sei USA 91:742-746. Estes exemplos fornecem a orientação a um elemento versado na técnica para a produção dos conjugados substancialmente não imunogénicos de uricase, que retêm pelo menos aproximadamente 75% da actividade uricolítica da enzima não modificada. EXEMPLO 1
Purificação da forma tetramérica de uricase A forma tetramérica de uricase (peso molecular de aproximadamente 140 kDa) foi purificada a partir de uma solução de uricase de fígado de suíno, através de 26 cromatografia preparatória de exclusão de tamanho ou de troca iónica, seguida por cromatografia analítica de exclusão de tamanho. A uricase de figado de suino foi obtida na Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, catálogo número U2350 ou U3377; e na Boebringer Mancheim, Indianopolis, IN.
As cromatografias preparatória e analítica de exclusão de tamanho foram realizadas a um pH de 10-10,5, de preferência de 10,2, em 10 mM de tampão de carbonato de sódio contendo NaCl 0,1M em colunas Superdex 200, as quais foram calibradas previamente com proteínas de peso molecular conhecido. As Superdex foram obtidas na Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. Qualquer tampão pode ser utilizado, desde que seja capaz de manter o pH desejado e seja compatível com a química a ser utilizada para o acoplamento subsequente de PEG. Tais tampões são bem conhecidos no estado da técnica. A absorbância ultravioleta do eluato proveniente da coluna preparatória foi monitorada a 280 nm, e porções contendo uricase do eluato correspondente ao peso molecular da forma tetramérica desejada, mas sem uma espécie de peso molecular mais elevado, foram colectadas para o uso na síntese de PEG-uricase substancialmente não imunogénica, conforme descrição no Exemplo 2. Alternativamente, as formas tetraméricas de uricase podem ser isoladas através do uso de outros meios de exclusão de tamanho tais como, por exemplo, Superose 12 (Amersham Pharmacia) ou algum outro meio que seja compatível com soluções moderadamente alcalinas e que tenha uma capacidade apropriada de fracionamento de tamanho. Tais meios são de disponibilidade imediata e são bem conhecidos no estado da técnica. A cromatografia de troca iónica foi executada a um pH de 10-10,5, de preferência de 10,2, em colunas Mono Q (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) , as quais foram equilibradas com tampão de carbonato de sódio 0,1 M. Qualquer tampão que seja compatível com a química do acoplamento de PEG e que seja capaz de manter o pH desejado pode ser utilizado a uma intensidade iónica suficientemente baixa, para permitir a adsorção de uricase à coluna. Tais tampões são bem conhecidos no estado da técnica. A absorbância ultravioleta do eluato foi monitorada a 280 nm, durante a eluição de uricase da resina de troca iónica, pelo aumento da força iónica da solução de tampão aplicada, 27 como por exemplo, por um gradiente linear de 0 a 0,5 M NaCl no tampão de carbonato de sódio. A HPLC por exclusão de tamanho foi então utilizada para identificar as frações do eluato que contêm a forma tetramérica desejada de uricase, sem agregados detectáveis, para a sintese de uricase-PEG substancialmente não imunogénica. Alternativamente, a forma tetramérica de uricase pode ser isolada através do uso de outros meios de troca iónica, tal como Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) ou qualquer outro meio que seja compatível com soluções moderadamente alcalinas. Tais meios são de disponibilidade imediata e são bem conhecidos no estado da técnica. A atividade de uricase foi analisada através do uso de uma modificação de métodos-padrão. Vide, por exemplo, Fridovich (1965); Nishimura, et al., (1979). As soluções de ácido úrico foram preparadas na hora, diariamente, em tampão de borato de sódio 50 mM, a um pH de 9,2, para se obter concentrações finais na análise de 6-150 μΜ. Os preparados de uricase foram diluídos neste tampão de borato que contém albumina de soro bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, catálogo No. A-7030), de modo que a concentração final de albumina na análise ficou sendo de 0,1 mg/mL. Após a mistura de várias diluições da enzima com o substrato nas cavidades de uma placa de microtitulação num leitor de microplacas, a taxa de desaparecimento do ácido úrico a 25°C foi monitorada a 292 nm, de quatro em quatro segundos, durante três minutos. Das amostras, entre as quais 10% e 40% do substrato foram consumidos dentro de três minutos, pelo menos 20 pontos de dados foram utilizados para calcular a taxa máxima de diminuição na absorbância por minuto. Uma unidade internacional (IU) da atividade da uricase é definida como a quantidade de enzima que consome um micromole de ácido úrico por minuto; as atividades específicas são expressas como IU/mg de proteína. Alguns dos dados para as atividades relativas de uricase das Figuras 1A-5B foram obtidos através do uso de 100 μΜ de ácido úrico na análise. Outros resultados para a velocidade em 100 μΜ de ácido úrico (Vi0o) foram calculados a partir dos valores da constante de Michaelis (Km) e da velocidade máxima (Vmax) para as respectivas preparações da enzima, através do uso da fórmula:
Vioo= 100 x Vmax / (KM+ 100) 28 onde KM é expresso em unidades micromolares. EXEMPLO 2
Acoplamento de PEG à uricase tetramérica de suino A uma solução de uricase tetramérica em tampão de carbonato de sódio 0,1 M, a um pH de 10,2, de 10 a 200 moles de um derivado activo de monometóxi PEG, como por exemplo, o carbonato 4-nitrofenil (NPC-PEG), de vários tamanhos (de 5 kDa a 30 kDa) , foi adicionado para cada mole de subunidade de uricase (peso molecular de 35 kDa) . Estes e outros PEGs ativos apropriados estão disponíveis na Shearwater Polymers. As instruções para acoplar estes PEGs às proteínas são fornecidas no catálogo da Searwater Polymers, no endereço da Internet www.swpolymers.com, e por JM Harris, et al. , (Eds.) (1997 ) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Washington, DC: American Chemical Society. A reação do acoplamento foi continuada a 0-8°C, até a extensão do acoplamento de PEG que não mudou mais de forma significativa com o tempo. O PEG que não reagiu foi então removido do produto da reação por meio de cromatografia e/ou de ultrafiltração. O número de filamentos de PEG acoplado por subunidade de uricase foi determinado através de uma adaptação dos métodos descritos por Kunitani, M, et al., (1991) J Chromatogr 588:125-137; Saifer, et al., (1997) e Sherman, et al., (1997) . Em suma, as aliquotas das misturas da reacção de PEGilação ou fracções das colunas preparatórias de troca iónica ou por exclusão de tamanho, foram caracterizadas por meio de HPLC analítica por exclusão de tamanho numa coluna de TSK 5.000 PWXL à temperatura ambiente, em tampão de carbonato de sódio 10 mM, a um pH de 10,2, contendo NaCl 0,1M. A coluna da HPLC foi obtida na TosoHaas, Montgomeryville, PA. As proteínas e os PEGs foram monitorados por detectores de índice de refracção e de absorbância de radiação ultravioleta. A quantidade de proteína no conjugado foi calculada a partir da absorbância de radiação ultravioleta em relação à da uricase-padrão não 29 modificada apropriada. A quantidade de PEG no conjugado foi então calculada, a partir da área do pico do índice de refracção, corrigida para a contribuição da proteína no índice de refracção, em relação à área do pico do índice de refracção-padrão apropriado de PEG. A Figura 2A mostra a retenção de atividade pela uricase de fígado de suíno PEGilada, como uma função do número de filamentos de PEG acoplado por subunidade. Os dados dos autores da presente invenção (A,D) são comparados com os de Chen, et al., (1981). 0 ponto de dados dentro de um círculo grande denota um conjugado relatado para ser não imunoreativo, por Chen, et al., (1981). Conforme mostrado na Figura 2A, os conjugados de uricase tetramérica de suino com até seis filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade ou até sete filamentos de PEG de 5 kDa por subunidade retiveram pelo menos 75% da atividade da enzima não modificada. O aumento aparente na atividade específica, com um número crescente de filamentos de PEG de 5 kDa ou de 30 kDa (até aproximadamente quatro filamentos por subunidade) pode reflectir a insolubilidade ou a instabilidade relativa da enzima não modificada, em comparação com os conjugados. Conforme mostrado na Figura 2B, os conjugados de uricase de suino com uma média de mais de três filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade contêm uma massa maior de PEG do que foi considerado suficiente para impossibilitar a capacidade reactiva, por Chen, et al. (1981). EXEMPLO 3
Propriedades dos conjugados de PEG de uricase de PBC tetramérica recombinante O ADN da uricase quimérica de porco babuíno (PBC) foi subclonado no vector de expressão pET3d (Novagen, Madison, WI) e a construção resultante de plasmídeo foi transformada e expressada num filamento de Escherichia coli 30 BL21(DE3)pLysS (Novagen). Estes procedimentos foram realizados através do uso de métodos bem conhecidos no estado da técnica da biologia molecular. Vide Erlich (1989); Sambrook, et al., (1989); Ausubel, F, et al., (Eds.), (1997) Short Protocols in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons. A Figura 6 mostra a sequência de aminoácidos deduzida de uricase de PBC (aminoácidos 1-225 da SEQ. ID. No.: 1 e aminoácidos 226-304 da SEQ. ID. No.: 2), em comparação com as sequências de suino (SEQ. ID. No.: 1) e de babuino (SEQ. ID. No.: 2) . Os residuos na sequência de babuino que diferem dos que estão presentes na sequência de suino, são mostrados em negrito. As sequências de suino e de babuino foram primeiramente determinadas por Wu, et al., (1989) e confirmadas pelos autores da presente invenção. A SEQ. ID. No. 1 é idêntica ao Número de Acesso pl6164 do GenBank, com exceção da ausência do resíduo inicial de metionila na sequência do GenBank. A SEQ. ID. No. 2 é idêntica ao Número de Acesso p25689 do GenBank, com exceção da ausência do resíduo inicial de metionila e de uma substituição de histidina por treonina, no resíduo 153 na sequência do GenBank (resíduo 154, na Figura 6). A forma tetramérica de uricase de PBC foi isolada e acoplada aos PEGs de vários pesos moleculares, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Os conjugados preparados com o PEG de 5 kDa, de 10 kDA, de 19 kDa ou de 30 kDa continham até dez filamentos de PEG, por subunidade. Os conjugados preparados com os PEGs de, pelo menos, 10 kDa, retiveram mais do que 95% da actividade específica inicial da uricase recombinante (Figuras 3A-3B).
As seguintes propriedades de um conjugado de uricase tetramérica de PBC com, aproximadamente, seis filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade, são ilustradas nas figuras indicadas: a falta do capacidade imunogénica (Figura 7) e a eficácia em camundongos com deficiência de uricase em: 1) correção de hiperuricemia e hiperuricosúria (Figura 8); 2) diminuição da gravidade de um defeito de concentração de urina (Figura 9), e 3) diminuição da gravidade de diabetes insipidus nefrogénico (Figura 10). Adicionalmente, essa PEG-uricase diminuiu a gravidade dos danos renais relacionados com o ácido úrico, conforme visualização por 31 microscopia por ressonância magnética (Figura 11). A Figura 7 mostra a actividade de uricase de PBC no soro de camundongo, 24 horas após cada uma das quatro ou cinco injeções intraperitoneais de PEG-uricase, em relação ao valor de 24 horas após a primeira injeção. Os conjugados de PEG foram preparados a partir de três preparados diferentes de uricase de PBC, através do uso de duas técnicas diferentes para a ativação de PEG. Um preparado (·) foi testado em camundongos com deficiência de uricase (uox -/-); os outros dois (Δ,·) foram testados em camundongos normais BALB/c. 0 preparado mais imunoreativo (Δ) foi preparado a partir de uricase purificada de PBC, que contém uma quantidade desconhecida de agregados de uricase, acoplada a uma média de sete filamentos de PEG de 5 kDa por subunidade, através do uso do derivado do carbonato de succinimidila de PEG (SC-PEG). Zalipsky, patente dos Estados Unidos 5.612.460, aqui incorporada a titulo de referência. O preparado moderadamente imunoreativo () foi preparado por meio do acoplamento de um preparado de uricase de PBC que contém 11% dos agregados numa média de dois filamentos de PEG de 19 kDa por subunidade, através do uso de um derivado de carbonato de 4-nitrofenila de PEG (NPC-PEG). Sherman, et al., (1997). O conjugado menos imunoreativo (·) foi preparado por meio do acoplamento de uma média de seis filamentos NPC-PEG de 10 kDa por subunidade, numa preparação de uricase de PBC, que contém a uricase agregada inferior a 5%. A Figura 8 mostra a relação inversa entre as concentrações do ácido úrico no soro e na urina e a atividade de PEG-uricase injetada no soro (uox -/-) de um camundongo com deficiência de uricase. Injeções no tempo zero e depois de 72 horas continham 0,43 IU de uricase de PBC conjugado a uma média de seis filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade da enzima. A Figura 9 mostra que o tratamento de camundongos com deficiência de uricase com a uricase de PBC modificado pela PEG diminuiu a gravidade de um defeito de concentração de urina. O desvio médio e padrão dos dados para a osmolalidade da urina é mostrado para dois camundongos, que contêm uma cópia do gene de uricase de murino normal (uox +/-) , seis camundongos com deficiência de uricase 32 homozigóticos não tratados (uox -/-) e seis camundongos com deficiência de uricase homozigóticos que foram injetados dez vezes, entre o terceiro e o septuagésimo segundo (72-) dia de vida, ou com 95 ou 190 mIU de PEG-uricase. Os camundongos de cada base genética ou receberam água ad libitum (barras sólidas) ou foram privados de água durante doze horas (barras hachuriadas) antes da coleta de sua urina. A Figura 10 mostra que o tratamento de camundongos com deficiência de uricase com a uricase de PBC modificada por PEG diminuiu a gravidade de diabetes insipidus nefrogénico, caracterizada pelo consumo anormalmente elevado de água e pela saida anormalmente elevada de urina. Os conteúdos genéticos dos camundongos e o protocolo de tratamento foram os mesmos que os da Figura 9. 0 desvio médio e padrão de consumo diário de água (barras sólidas) e a saida de urina (barras hachuriadas) são mostrados para três grupos de seis camundongos. A Figura 11 mostra que o tratamento de camundongos com deficiência de uricase de PBC modificada por PEG diminuiu a gravidade da nefropatia induzida por ácido úrico, conforme visualização por microscopia por ressonância magnética. Os conteúdos genéticos dos três grupos de camundongos e o protocolo de tratamento foram os mesmos que aqueles da Figuras 9 e 10. A microscopia por ressonância magnética foi executada no Center for in vivo Microscopy, Duke University Medicai Center, Durham, North Carolina.
Além dos resultados resumidos nas Figuras de 8 a 11, foi demonstrado que os niveis de ácido úrico na urina de todos os camundongos com deficiência de uricase diminuíram drasticamente, após o tratamento com a uricase de PBC modificada por PEG. Finalmente, a Figura 12 mostra que, ao contrário da forma tetramérica de uricase de PBC modificada por PEG, a forma octamérica (peso molecular = 280 kDa) , mesmo quando extensivamente PEGilada, é imunogénica em camundongos. Esta propriedade reflete-se no aclaramento acelerado do octâmero modificado pela PEG, dentro de cinco dias após uma única injeção intraperitoneal. Os mesmos camundongos foram novamente injetados com a mesma dose dos mesmos preparados de PEG-uricase, no oitavo e no décimo quinto dia. Vinte e quatro horas após a segunda e a 33 terceira injeções, a atividade uricolitica não foi detectável nos soros dos camundongos injetados com o octâmero PEGilado, mas foi detectada prontamente nos soros dos que foram injetados com o tetrâmero PEGilados. Estes resultados, em combinação com o aclaramento acelerado do octâmero PEGilado, observado após a primeira injeção (Figura 12), confirmam a utilidade da remoção de todas as formas de uricase maiores do que o tetrâmero, antes da PEGilação da enzima. EXEMPLO 4
Conjugação de PEG da uricase de Candida utilis A uricase de Candida utilis foi obtida na Sigma-Aldrich (St. Louis MO; catálogo No. U1878) ou na Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; catálogo No. URYW). Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, a forma tetramérica foi isolada e os conjugados de PEG foram sintetizados com o PEG de 5 kDa, de 10 kDa ou de 30 kDa (Figuras 1A-1B) . A Figura IA mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada de Candida utilis em função do número de filamentos de PEG acoplados por subunidade. Os dados dos autores da presente invenção (A,·,□) são comparados com aqueles de Nishimura, et al., (1979); Nishimura, et al., (1981); Chen, et al., (1981);
Davis, et al., (1981); Tsuji, et al., (1985); Yasuda, et al., (1990), e Fujita, et al., (1991). Os pontos de dados dentro dos circulos grandes denotam os conjugados relatados como sendo não antigénicos, por Nishimura, et al., (1979 ou 1981) ou não imunorreativos, por Chen, et al., (1981). A Figura 1B mostra a retenção da atividade pela uricase PEGilada de Candida utilis em função da massa total de PEG acoplado por subunidade. Os dados dos autores da presente invenção (Α,·,Π) são comparados com os dos mesmos relatórios, conforme a Figura IA. Os pontos de dados dentro dos circulos grandes têm o mesmo significado que na Figura IA. 34
Conforme mostrado nas Figuras IA e 1B, os conjugados com uma média de até seis filamentos de PEG de 5 kDa ou de 30 kDa ou de nove filamentos de PEG de 10 kDa por subunidade retiveram, pelo menos, 75% da atividade da enzima não modificada. O aumento aparente na atividade especifica quando um número crescente de filamentos de PEG de 30 kDa é ligado (até cinco ou seis filamentos por subunidade), pode refletir a insolubilidade ou a instabilidade relativa da enzima não modificada, em comparação com os conjugados. EXEMPLO 5
Conjugação de PEG de uricase de Aspergillus flavus A uricase de Aspergillus flavus foi obtida na Sanofi Winthrop (Gentilly Cédex, France). Através do mesmo procedimento, conforme descrição no Exemplo 2, os conjugados com os PEGs de vários pesos moleculares foram sintetizados (Figuras 4A-4B). Os conjugados preparados pelo acoplamento da enzima de A. flavus, com uma média de até doze filamentos de PEG de 5 kDa ou de até sete filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade, retiveram pelo menos 75% da atividade especifica inicial dessa uricase fúngica. EXEMPLO 6
Conjugação de PEG de uricase de soja A uricase recombinante do nódulo da raiz da soja (chamado também de nodulin 35) foi preparada e purificada, conforme descrição por Kahn e Tipton (Kahn, K, et ai., (1997) Biochemistry 36:4731-4738), e foi apresentada pelo Dr. Tipton (University of Missouri, Columbia, MO) . Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, a forma tetramérica foi isolada e os conjugados foram preparados com os PEGs de vários pesos moleculares (Figuras 5A-5B). Ao contrário da uricase de Candida utilis 35 (Figura ΙΑ), da uricase de suíno (Figura 2A), da uricase quimérica de porco-babuíno (Figura 3A) e da uricase de Aspergillus flavus (Figura 4A) , a enzima de soja tolerou o acoplamento de somente cerca de dois filamentos de PEG de 5 kDa ou de 30 kDa por subunidade, com retenção de, pelo menos, 75% da atividade uricolítica inicial. EXEMPLO 7
Conjugação de PEG de uricase de Arthrobacter globiformis A uricase de Arthrobacter globiformis foi obtida na Sigma-Aldrich (catálogo No. U7128). Vide a Patente Japonesa 9-154581. Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, a forma tetramérica foi isolada e os conjugados com 5 kDa e o PEG de 30 kDa foram preparados. Ao passo que os conjugados com uma média de mais de três filamentos de PEG de 5 kDa por subunidade retiveram menos do que 60% da actividade específica inicial, os conjugados com uma média de aproximadamente dois filamentos de PEG de 30 kDa por subunidade retiveram, pelo menos, 85% da atividade especifica inicial. EXEMPLO 8
Conjugação de PEG de uricases de PBC e de suino truncadas por amino
As uricases recombinantes de suíno e de PBC, a partir das quais os primeiros seis aminoácidos no terminal de carboxila são suprimidos, são expressas e purificadas de E. coli, por técnicas-padrão, conforme descrição no Exemplo 3. Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, conjugados de PEG de uricases de PBC truncadas por amino foram sintetizados para produzir os conjugados substancialmente não imunogénicos, os quais retêm, pelo menos, 75% da atividade específica inicial. 36 EXEMPLO 9
Conjugação de PEG de uricases de PBC e de suino truncadas no terminal carboxila ou em ambos os terminais carboxila e amino
As uricases recombinantes de suíno e de PBC, a partir das quais os últimos três aminoácidos no terminal carboxila são eliminados, são expressas e purificadas de E. coli por técnicas-padrão, conforme descrição no Exemplo 3. Esta remoção do terminal carboxila pode aumentar a solubilidade das enzimas não modificadas, uma vez que remove o sinal alvo peroxisomal. Vide Miura, et al., (1994). Através do mesmo procedimento, conforme descrição nos Exemplos 1 e 2, os conjugados de PEG de uricases truncadas de carboxila são sintetizados para produzir os conjugados substancialmente não imunogénicos, os quais retêm, pelo menos, 75% da atividade específica inicial. A sequência de uricase recombinante de PBC truncada por seis resíduos no terminal amino e por três resíduos no terminal carboxila (PBC-NT-CT) é mostrada na Figura 6. Esta uricase é expressada, purificada e PEGilizada, conforme descrição nos Exemplos 1, 2 e 3, para produzir os conjugados substancialmente não imunogénicos, os quais retêm, pelo menos, 75% da atividade específica inicial. EXEMPLO 10
Conjugação de PEG de mutantes de uricase de suino que contém um número elevado de pontos de ligação de PEG
As uricases de suínos recombinantes são preparadas conforme descrito no Exemplo 3, no qual o número potencial de pontos de ligação de PEG é aumentado pela substituição de um ou mais resíduos de arginina por lisina. Vide Hershfield, MS, et al., (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:7185-7189. A sequência de aminoácidos de um exemplo da tal mutante (uricase de PKS) , em que a arginina no resíduo 291 é 37 substituída por lisina e a treonina no resíduo 301 é substituída por serina, é mostrada na Figura 6. Através do mesmo procedimento, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2, o PEG é conjugado a esta uricase para produzir os conjugados substancialmente não imunogénicos, os quais retêm, pelo menos, 75% da atividade específica inicial de uricase recombinante. EXEMPLO 11
Conjugação de PEG de um mutante de uricase de babuíno recombinante
Através do uso de métodos-padrão da biologia molecular, tal como no Exemplo 3, a uricase de babuíno recombinante é construída por intermédio de uma substituição de aminoácidos (histidina em lugar de tirosina) na posição 97 (vide a sequência de babuíno na Figura 6). Através do mesmo procedimento, conforme descrito nos Exemplos 1 e 2, os conjugados de PEG da forma tetramérica do mutante de uricase de babuíno recombinante foram sintetizados para produzir os conjugados de capacidade imunogénica substancialmente reduzida, os quais retêm, pelo menos, 75% da atividade específica inicial de uricase recombinante. EXEMPLO 12
Capacidade imunogénica dos conjugados de PEG provenientes de Candida utilis, Aspergilllus flavus e Arthrobacter globiformis A uricase de Candida utilis, Aspergillus flavus e Arthrobacter globiformis é obtida conforme descrito nos Exemplos 4, 5 e 7, respectivamente. Através do mesmo procedimento, de acordo com a descrição nos Exemplos 1 e 2, os conjugados de PEG foram sintetizados com o PEG de 5 kDa, de 10 kDa, de 20 kDa ou de 30 kDa. A capacidade imunogénica destes conjugados é substancialmente reduzida ou eliminada. 38 São divulgadas formas de realização preferidas da presente divulgação e são designadas como forma de realização EI a E8 .
El. Um conjugado compreendendo uricase conjugada com PEG, em que o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 10.000 a cerca de 100.000 Daltons, e em que a uricase retém pelo menos cerca de 75% da atividade da uricase uricolitica não conjugada, e em que a imunogenicidade da uricase é substancialmente reduzida. conjugado de E2, em que peso molecular médio de conjugado de E2, em que peso molecular médio de conjugado de E2, em que peso molecular médio de conjugado de El, em que composição farmacêutica para diminuir os niveis de nnum fluido corporal ou tecido, que compreende de El e um transportador farmaceuticamente E2. O conjugado de El, em (etileno-glicol). E3. 0 tem um E4. 0 tem um E5. 0 tem um
E 6. O E7. Uma ácido úrico o conjugado aceitável. que o referido PEG é poli o dito poli (etileno-glicol) cerca de 20.000 Daltons o dito poli (etileno-glicol) cerca de 10.000 Daltons. o dito poli (etileno-glicol) cerca de 30.000 Daltons. a uricase é tetramérica. E8. Um método para isolar uma forma tetramérica de uricase de uma solução de uricase, compreendendo uricase tetramérica e agregados de uricase, que compreende as etapas de: aplicar a referida solução a pelo menos uma coluna de separação, a um pH entre cerca de 9,0 e 10,5; e 39 recuperação a partir da referida coluna de uma ou mais frações que contêm ditas uma ou mais agregados de uricas uricase frações e. tetramérica isolada, são substancialmente em que isentas as de 40
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Met X Ala His Tyr Arg 5 Asn Asp Tyr Lys Lys Asn Asp Glu 10 Val Glu 15 Phe Vai Arg Thr Gly Tyr 20 Gly Lys Asp Met Ile Lys Vai Leu 25 His 30 Ue Gin Arg Asp Gly Lys Tyr 35 His Ser lie 40 Lys Glu Vai Ala Thr 45 Ser Val Gin Leu Thr 50 Leu Ser Ser Lys Lys 55 Asp Tyr Leu Mis Gly Asp 60 Asn Ser Asp Vai 65 Xle Pro Thr Asp Thr Ile 70 Lys Asn Thr Val Asn Val 75 Leu Ala Lys 80 Phe Lys Gly Ile Lys 85 Ser Ile Glu Thr Phe Ala Val Thr 90 Ile Cys 95 Glu Mis The Leu Ser Ser 100 Phe Lys His Val Ile Arg Ala Gin 105 Val 110 Tyr val Glu Glu Vai Pro Trp 115 Lys Arg Phe 120 Glu Lys Asn Gly Val 125 Lys His val His Ala 130 Phe lie Tyr Thr Pro 135 Thr Gly Thr His Phe Cys 140 Glu Val Glu Gin 145 ne Arg Asn Gly Pro Pro ISO Vai Ile His Ser Gly Ile 155 Lys Asp Leu 160 Lys Vai Leu Lys Thr 165 Thr Gin Ser Gly Phe Glu Gly Phe 170 Xle Lys 175 Asp Gin Phe Thr Thr Leu 180 Pro Glu Vai Lys Asp Arg Cys Phe 185 Ala 190 Thr Gin Vai Tyr Cys Lys Trp Arg Tyr 195 His 200 Gin Gly Arg Asp Val 205 Asp Phe Glu Ala Thr 210 Trp Asp Thr vai Arg 215 Ser Ue val Leu Gin Lys 220 Phe Ala Gly Pro Tyr 225 Asp Lys Gly Glu Tyr 230 Ser Pro Ser val Gin Lys 235 Thr Leu Tyr 240 Asp Ile Gin Vai Leu 245 Thr Leu Gly Gin val Pro Glu Ile 250 Glu ASp 255 Met Glu Ile Ser Leu Pro 260 Asn lie His Tyr Leu Asn Ile Asp 265 Met 270 Ser Lys Mec Gly' Leu Ile Asn 215 Lys Glu Glu 280 val Leu Leu Pro Leu 285 Asp Asn Pro Tyr Gly 230 Arg lie Thr Gly Thr 295 Vai Lys Arg Lys Leu Thr 300 Ser Arg Leu
<210>2 <211> 304 <212> PRT <213> Papio hamadryas <400» 2 42
Met Ala Asp Tyr Mis Asn 1 5
Vai Arg Thr Giy Tyr Giy 20
Arg Asp Giy Lys Tyr Hi» 35
Leu Thr Leu Ser Ser Lys $0 lie lie Pro Thr Asp Thr 65 70
Phe Lys Giy Xle Lys Ser 85
Tyr Phe Leu Ser Ser Phe 100
Glu Giu Xle Pro Trp Lys 115
His Ale Phe Xle His Thr 130
Gin Leu Arg Ser Giy Pro 145 150
Lys Vai Leu Lys Thr Thr 165
Cln Phe Thr Thr Lys Pro 180
Vai Tyr Cys Lys Trp Arg 195 AXa Thr Trp Giy Thr Xle 210
Pro Tyr Asp Lys Giy Glu 225 230
Asp Xle Gin Val Leu Ser 245
Glu Xle Ser Leu Pro Asn 260
Met Giy Leu Xle Asn Lys 275
Tyr Giy Lys Ile Thr 290
Asn Tyr Lys Lys Asn Asp 10
Lys Asp Met Vai Lys Vai 25
Ser Xle Lys Glu Vai Ala 40
Lys Asp Tyr Leu His Giy 55 60
Xle Lys Asn Thr Vai His 75
Xle Giu Ala Phe Giy Vai 90
Asn Mis Vai Xle Arg Ala 105
Arg Leu Glu Lys Asn Giy 120
Pro Thr Giy Thr His Phe 135 140
Pro Vai Xle His Ser Giy 155
Gin Ser Giy Phe Glu Giy 170
Glu val Lys Asp Arg Cys 185
Tyr His Gin Cys Arg Asp 200
Arg Asp Leu Val Leu Glu 215 220
Tyr Ser Pro Ser Val Gin 235
Leu Ser Arg Val Pro Glu 250
Ile His Tyr Phe Asn Xle 265
Glu Glu Val Leu Leu Pro 280
Thr Val Lys Arg Lys Leu 295 .300
Glu Leu Glu Phe 15 Leu His Xle Gin 30 Thr Ser Val Gin 45 Asp Asn Ser Asp Val Leu Ala Lys 80 Asn Xle Cys Glu 95 Gin Val Tyr Val 110 Val Lys His Val 125 Cys Glu Val Glu Ile Lys Asp Leu 160 Phe Xle Lys Asp 175 Phe Ala Thr Gin 190 Val Asp Phe Glu 205 Lys Phe Ala Giy Lys Thr Leu Tyr 240 Xle Glu Asp Met 255 Asp Met Ser Lys 270 Leu Asp Asn Pro 285 Ser Ser Arg Leu 43

Claims (6)

  1. REIVINDICAÇÕES Conjugado incluindo uma uricase purificada conjugada a poli(etilenoglicol) (PEG), em que pelo menos 90% da dita uricase se encontra numa forma tetramérica em que o referido PEG tem um peso molecular médio de cerca de 10. 0 0 0 a cerca de 60.000 Daltons.
  2. 2. Conjugado da Reivindicação 1, em que o referido PEG tem um peso molecular médio de cerca de 30.000 Daltons.
  3. 3. Conjugado da Reivindicação 1, em que o referido PEG tem uma massa molecular média de cerca de 20.000 Daltons.
  4. 4. Conjugado da Reivindicação 1, em que o referido PEG tem um peso molecular médio de cerca de 10.000 Daltons.
  5. 5. Conjugado da Reivindicação 1, em que uma média de 2 a 10 filamentos de PEG está ligada covalentemente a cada subunidade da dita uricase.
  6. 6. Composição farmacêutica apropriada para reduzir os niveis de ácido úrico nnum fluido corporal ou tecido, que compreende o conjugado de qualquer uma das reivindicações 1-5. 3
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