RU2443426C2 - Конъюгаты уратоксидазы, фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты и способ получения вышеупомянутых конъюгатов - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области фармакологии и медицины и представляет собой конъюгаты уратоксидазы (уриказы) для снижения повышенных уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани тела млекопитающего, включающие в себя очищенную уриказу и полиэтиленгликоль (ПЭГ), в которых, по меньшей мере, 90% упомянутой уриказы представляет собой тетрамер и каждая субъединица упомянутой уриказы ковалентно связана, в среднем, с, по большей мере, 12 нитями полиэтиленгликоля, имеющего молекулярный вес приблизительно от 5 кДа до приблизительно 100 кДа. Изобретение обеспечивает устранение иммуногенности уратоксидазы без ухудшения активности в разложении мочевой кислоты. 3 н. и 28 з.п. ф-лы, 12 пр., 1 табл., 17 ил.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к химической модификации белков для продления времени их циркулирования и уменьшения их иммуногенности. Конкретнее изобретение относится к процессу выделения тетрамерной формы уриказы из раствора уриказы и выделенной тетрамерной уриказы, полученной данным способом, которая практически устраняет иммуногенность уратоксидазы без ухудшения ее активности в разложении мочевой кислоты.

Уровень техники

Известные уратоксидазы (уриказы; Е.С. 1.7.3.3) являются ферментами, которые катализируют окисление мочевой кислоты в более растворимый продукт, аллантоин, пуриновый метаболит, который лучше выделяется. Люди не вырабатывают ферментно активной уриказы в результате нескольких мутаций в гене для уриказы, произошедших в ходе эволюции высших приматов. Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34:78-84. Вследствие этого у восприимчивых индивидов избыточные концентрации мочевой кислоты в крови (гиперурикемия) и в моче (гиперурикозурия) могут приводить к болезненным артритам (подагре), обезображивающим уратным отложениям (подагрическим узлам) и отказу почек. У некоторых больных доступные лекарства, такие как аллопуринол (ингибитор синтеза мочевой кислоты), дают ограничивающие лечение побочные эффекты либо не лечат данные состояния адекватно. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:47-56; Fam, AG, (1990) Bailliere's Clin Rheumatol 4:177-192. Инъекции уриказы могут уменьшить гиперурикемию и гиперурикозурию, по крайней мере, временно.

Поскольку уриказа является для человека чужеродным белком, даже первая инъекция немодифицированного белка из Aspergillus flavus вызвала анафилактические реакции у определенного процента пациентов (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816), а иммунологические реакции ограничивают ее полезность при хроническом или периодическом лечении. Don-adio, D, et al., (1981) NowPresse Med 10:711-712; Leaustic, M, et al., (1983) RevRhum Mai Osteoartic 50:553-554.

Неоптимальная эффективность доступных способов лечения гиперурикемии известна уже несколько десятилетий. Kissel, P, et al., (1968) Nature 217:72-74. Аналогично возможность того, что определенным группам пациентов с тяжелой подагрой будет полезна безопасная и эффективная форма инъецируемой уриказы, известна много лет. Davis, FF, et al., (1978) в GB Broun et al., (ред) Enzyme Engineering, Vol.4 (стр.169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, et al., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2(8241):281-283; Abuchowski, A, et al., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352-354; Chen, RH-L, et al., (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298; Chua, CC, et al., (1988) Ann Int Med 109:114-117; Greenberg, ML, et al., (1989) Anal Biochem 176:290-293. Уриказы из животных органов почти нерастворимы в растворителях, которые совместимы с безопасным инъекционным введением. Патент США №3616231. Некоторые уриказы из растений или микроорганизмов более растворимы в медицински приемлемых растворителях. Однако инъекция микробных ферментов быстро вызывает иммунологические реакции, которые могут привести к опасным для жизни аллергическим реакциям или к инактивации и/или ускоренному элиминированию свободно циркулирующей уриказы. Donadio, et аl., (1981); Leaustic, et al., (1983). Ферменты, основанные на аминокислотных последовательностях уриказ млекопитающих, в том числе свиньи и бабуина, или насекомых, например, таких как Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, et al., (1990) Moll Cell Bio) 10:5114-5127), так и не стали пригодными кандидатами для клинического использования из-за проблем иммуногенности и растворимости при физиологическом рН.

Ковалентная модификация белков с поли(этилен гликолем) или полиэтилен оксидом) (оба обозначаются как ПЭГ) была использована для увеличения полужизни белка и уменьшения иммуногенности. Патенты США №4179337, 4766106 и 4847325; Saifer, MGP, et al., (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387. Связывание ПЭГ с высоким молекулярным весом для получения конъюгатов с увеличенным временем циркуляции и/или уменьшенной иммуногенности при сохранении функциональной активности было ранее продемонстрировано для другого фермента супероксиддисмутазы (Somack, R. et al., (1991) Free RadRes Commun 12-13:553-562; патенты США №5283317 и 5468478) и для других типов белков, например, цитокинов (Saifer, MGP, et al., (1997) Polym Preprints 38:576-577; Sherman, MR, et al., (1997) в JM Harris, et al., (ред), Poly(ethylene glicol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (стр.155-169) Washington, DC: American Chemical Society). Конъюгаты уриказы с полимерами, отличными от ПЭГ, также описаны. Патент США №4460683.

Почти во всех известных и упомянутых выше попытках ПЭГ-илировать уриказу (т.е. ковалентно связать ПЭГ с уриказой), ПЭГ первично присоединялся к аминогруппам аминоконцевых остатков и доступных лизиновых остатков. В общеиспользуемых уриказах общее количество лизинов в каждой из четырех идентичных субъединиц находится в интервале от 25 (Aspergillus flavus (патент США №5382518)) до 29 (свинья (Wu, X, et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416)). Некоторые из лизинов недоступны для ПЭГ-илирования в присущей ферменту конформации. Наиболее общим подходом к уменьшению иммуногенности уриказы было связывание большого количества нитей ПЭГ с низким молекулярным весом. Это стабильно приводило к большим уменьшениям ферментной активности получаемых конъюгатов.

Прежде исследователи использовали инъекции уриказы для катализа превращения мочевой кислоты в аллантоин in vivo. См. Pui, et al., (1997). Это основа использования уриказы из гриба Aspergillus flavus (Uricozyme^®) во Франции и Италии для предотвращения или временной коррекции гиперурикемии, связанной с цитотоксической терапией гематологических нарушений и для временного уменьшения тяжелой гиперурикемии у пациентов с подагрой. Potaux, L, et al., (1975) Nouv Presse Med 4: 1109-1112; Legoux, R, et al., (1992) J Biol Chem 267:8565-8570; патенты США №5382518 и 5541098. Из-за своего быстрого разрушения при циркуляции Uricozyme^® требует ежедневных инъекций. Более того, он не очень хорошо подходит для долговременной терапии из-за своей иммуногенности.

Одна внутривенная инъекция препарата уриказы из Candida utilis, связанной с 5 кДа ПЭГ, снижала урат сыворотки до нефиксируемых уровней у пяти человек, у которых средняя концентрация урата сыворотки до инъекции составляла 6,2 мг/дл, что в пределах нормы. Davis, et al., (1981). Субъектам давали дополнительную инъекцию четыре недели спустя, но их реакция не была засвидетельствована. После второй (и последней) инъекции не было обнаружено антител к уриказе при использовании относительно низкочувствительного теста гелевой диффузии. Этот источник не содержит сведений о хроническом или субхроническом лечении пациентов-людей или экспериментальных животных.

Препарат уриказы из Arthrobacter protoformiae, связанной с 5 кДа ПЭГ, использовался для временного контроля гиперурикемии у одного пациента с лимфомой, у которого концентрация урата сыворотки до инъекции составляла 15 мг/дл. Chua, et al., (1988). Из-за критического состояния пациента и короткой продолжительности лечения (четыре инъекции за 14 дней) было невозможно оценить долговременную эффективность или безопасность этого конъюгата.

В данной заявке термин "иммуногенность" означает индукцию иммунной реакции инъецированным препаратом ПЭГ-модифицированной или немодифицированной уриказы (антигеном), а "антигенность" означает реакцию антигена с ранее существовавшими антителами. Антигенность и иммуногенность совместно обозначаются как "иммунореактивность". В предшествующих исследованиях ПЭГ-уриказы иммунореактивность определяли различными способами, в том числе: (1) реакцией in vitro ПЭГ-уриказы с ранее сформированными антителами, (2) измерением индуцированного образования антител и (3) повышенными скоростями очистки крови после повторных инъекций.

Предшествующие попытки устранения иммуногенности уриказ по разным источникам путем связывания различных количеств нитей ПЭГ через различные линкеры имели ограниченный успех. ПЭГ-уриказы впервые рассмотрели FF Davis и Y Inada и их коллеги. Davis, et al., (1978); патент США №4179337; Nishimura, et al., (1979); патенты Японии №55-99189 и 62-55079. Конъюгат, раскрытый в патенте '337, был синтезирован по реакции уриказы из неспецифицированного источника с 2000-кратным молярным избытком ПЭГ с молекулярным весом 750 Да. Это показывает, что большое количество молекул полимера с большей вероятностью соединялось с каждой субъединицей уриказы. Патент '337 раскрывает связывание либо ПЭГ, либо поли(пропилен гликоля) с молекулярными весами от 500 до 20000 Да, предпочтительно от 500 до 5000 Да, для получения активных, водорастворимых, неиммуногенных конъюгатов различных полипептидных гормонов и ферментов, содержащих оксидоредуктазы, одним из трех примеров которых является уриказа. Кроме того, патент '337 подчеркивает связывание от 10 до 100 нитей полимера с каждой молекулой фермента и сохранение, по меньшей мере, 40% ферментной активности. Однако при этом не сообщали результаты тестирования по объему связывания ПЭГ с доступными аминогруппами уриказы, остаточной специфической уриколитической активности или иммунореактивности конъюгата.

Данные из 13 процитированных источников относительно ПЭГ-илирования уриказы собраны в Таблице 1. Некоторые из этих результатов также представлены графически на фиг.1-4. Семь из этих публикаций описывают значительное снижение уриколитической активности, измеренной in vitro, при связывании различного количества нитей ПЭГ с уриказой из Candida utilis. Связывание большого количества нитей ПЭГ весом 5 кДа с уриказой свиной печени дало подобные результаты, какописано в публикации Chen и в сделанном той же группой авторов докладе на симпозиуме. Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1978).

Среди исследований, собранных в таблице 1, уменьшение иммунореактивности уриказы отмечено в семи из них, а устранение иммунореактивности - в пяти. В трех из последних пяти исследований устранение иммунореактивности было связано с серьезным уменьшением уриколитической активности, самое большее до 15, 28 или 45% от начальной активности. Nishimura, et al., (1979) (15% активности); Chen, et al., (1981) (28% активности); Nishimura, et al., (1981) (45% активности). В четвертом докладе сообщалось, что ПЭГ связывался с 61% доступных лизиновых остатков, но не была установлена остаточная специфическая активность. Abuchowski et al., (1981). Однако команда исследователей, содержавшая двух из этих же ученых и использовавшая те же способы, в другом источнике сообщила о том, что этот объем связывания составлял лишь 23-28% остаточной активности. Chen, et al., (1981). Публикации 1981 года Abuchowski et al. и Chen et al., показывают, что для значительного уменьшения иммуногенности уриказы ПЭГ должен связываться приблизительно с 60% доступных лизиновых остатков (Таблица 1). Пятая публикация, в которой сообщается об устранении иммунореактивности уриказы, не раскрывает степень ПЭГ-илирования, остаточной уриколитической активности или природы связи ПЭГ-белок. Veronese, FM, et аl., (1997) в JM Harris, et al., (ред), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (стр.182-192) Washington, DC: American Chemical Society.

Конъюгирование ПЭГ с меньшей частью лизиновых остатков в уриказе уменьшает, но не устраняет ее иммунореактивность у экспериментальных животных. Tsuji, J, et al., (1985) Int J Immunopharmacol 7:725-730 (28-45% связанных аминогрупп); Yasuda, Y, et al., (1990) Chem Pharm Bull 38:2053-2056 (38% связанных аминогрупп). Остаточные уриколитические активности соответствующих аддуктов находятся в диапазоне от менее 33% (Tsuji, et al.) до 60% (Yasuda, et al.) от их начальных значений. Tsuji, et al., синтезировали конъюгаты ПЭГ-уриказы с ПЭГ весом 7,5 до 10 кДа в дополнение к ПЭГ с весом 5 кДа. Все готовые конъюгаты были несколько иммуногенны и антигенны, в то же время проявляя заметно уменьшенные ферментные активности (Таблица 1; фиг.1-2).

Сообщалось, что ПЭГ-илированный препарат уриказы из Candida utilis, который безопасно дважды вводился каждому из пяти людей, сохранял только 11% своей начальной активности. Davis, et al., (1981). Несколькими годами позже ПЭГ-модифицированную уриказу из Arthrobacter protoformiae четырежды вводили одному пациенту с лимфомой и тяжелой гиперурикемией. Chua, et al., (1988). Хотя остаточная активность этого ферментного препарата не была измерена, Chua, et al. продемонстрировали отсутствие антиуриказных антител в сыворотке пациента через 26 дней после первой инъекции ПЭГ-уриказы при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

Как показано в таблице 1, предыдущие исследования ПЭГ-илированной уриказы показывают, что каталитическая активность заметно снижается при связывании значительного количества нитей ПЭГ для значительного уменьшения ее иммунореактивности. Более того, наиболее ранние препараты ПЭГ-уриказы синтезировали с помощью ПЭГ, активированного цианурхлоридом - производным триазина (2,4,6-трихлор-1,3,5-триазина), который, как было показано, вводит новые антигенные детерминанты и вызывает образование антител у кроликов. Tsuji, et al., (1985).

Японский патент №3-148298 (A Sano, et at.) раскрывает модифицированные белки, в том числе уриказу, дериватизированные ПЭГ, с молекулярным весом 1÷12 кДа, которые проявляют уменьшенную антигенность и "улучшенное продленное" действие, и способы получения таких дериватизированных пептидов. Однако не раскрывается количество нитей, ферментные тесты, биологические тесты и значение выражения "улучшенное продленное". Японские патенты №№55-99189 и 62-55079, оба выданы Y. Inada, раскрывают конъюгаты уриказы, полученные с помощью ПЭГ-триазина или бис-ПЭГ-триазина (обозначенного ПЭГ2 в таблице 1), соответственно. См. Nishimura, et al., (1979 и 1981). В конъюгате первого типа молекулярные веса ПЭГ составляли 2 и 5 кДа, в то время, как в конъюгате второго типа использовался только ПЭГ с весом 5 кДа. Nishimura, et al., (1979) сообщает о восстановлении 15% уриколитической активности после модификации 43% доступных лизинов с помощью линейного ПЭГ с весом 5 кДа, в то время, как Nishimura, et al., (1981) сообщает о восстановлении 31 или 45% уриколитической активности после модификации 46 или 36% лизинов с помощью соответственно ПЭГ2.

Раскрытие изобретения

Анализ предшествующего уровня техники показывает, что когда достигается значительное снижение иммуногенности и/или антигенности уриказы путем ПЭГ-илирования, это обязательно связано со значительной потерей уриколитической активности. На безопасность, удобство и стоимостную эффективность биомедикаментов негативно влияет уменьшение потенциала биомедикаментов и возникающая из-за этого потребность в увеличении вводимой дозы. Таким образом, существует необходимость в безопасном и эффективном альтернативном средстве для снижения повышенных уровней мочевой кислоты в жидкостях тела, в том числе в крови и моче. Одним из таких средств в соответствии с настоящим изобретением может быть практически неиммуногенная ПЭГ-уриказа, которая сохраняет всю или почти всю уриколитическую активность немодифицированного фермента.

Конъюгат уратоксидазы (уриказы) сохраняет по меньшей мере 75% уриколитической активности неконъюгированной уриказы и имеет значительно сниженную иммуногенность. В соответствии с изобретением создана очищенная уриказа, в которой каждая субъединица может ковалентно связываться со в среднем от 2 до 10 нитей ПЭГ, которые могут быть линейными или разветвленными, причем каждая молекула ПЭГ может иметь молекулярный вес от приблизительно 5 до 100 кДа. Уриказа также может быть рекомбинантной. Независимо от того является ли уриказа рекомбинантной, уриказа может иметь происхождение от млекопитающего. Т.е. уриказа может быть из свиной, бычьей или овечьей печени. Уриказа может быть химерной. Химерная уриказа может содержать части уриказы свиной печени и/или печени бабуина. Например, химерная уриказа может быть свино-бабуиновой химерной уриказой (СБХ-уриказой) или свиной уриказой, содержащей мутации R291K и T301S (C-KS-уриказой) (см. последовательности на фиг.11 и результаты физиологических и иммунологических исследований на фиг.12-17). Альтернативно уриказа может быть уриказой печени бабуина, в которой тирозин 97 замещен гистидином, за счет чего специфическая активность уриказы может быть увеличена по меньшей мере на приблизительно 60%. Уриказа независимо от происхождения может быть укороченной с амино- либо карбоксильного конца, либо с обоих концов. Подобным же образом уриказа может быть грибной или микробной уриказой. Грибная или микробная уриказа может быть встречающейся в природе или рекомбинантной формой уриказы из Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis или Candida utilis. Альтернативно уриказа может быть уриказой беспозвоночного, такой как, к примеру, встречающаяся в природе или рекомбинантная форма уриказы из Drosophila melanogaster или Drosophila pseudoobscura. Уриказа может быть также растительной уриказой, например, встречающейся в природе, или рекомбинантной формой уриказы из узелка корня сои (Gtycine max). ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно 5÷100 кДа; предпочтительно ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно 10÷60 кДа; более предпочтительно ПЭГ может иметь средний молекулярный вес приблизительно 20÷40 кДа, например, 30 кДа. Среднее количество ковалентно связанных нитей ПЭГ может составлять от 2 до 10 нитей на одну субъединицу уриказы; предпочтительно среднее количество ковалентно связанных нитей может составлять от 3 до 8 на субъединицу; более предпочтительно среднее количество нитей ПЭГ может быть от 4 до 6 на субъединицу. Уриказа может быть тетрамерной. Нити ПЭГ могут быть ковалентно связаны с уриказой через уретановые (карбаматные) связи, вторично-аминные связи и/или амидные связи. Если уриказа является рекомбинантной формой любой подразумеваемой здесь уриказы, то эта рекомбинантная форма может иметь в значительной мере ту же последовательность, что и встречающаяся в природе форма.

ПЭГ-уриказа может быть очищенной уриказой из двух или более субъединиц, в которой каждая субъединица может быть ковалентно связана со в среднем от 2 до 10 нитей линейного или разветвленного ПЭГ, причем каждая молекула ПЭГ может иметь молекулярный вес между приблизительно 5 и 100 кДа, в фармацевтически приемлемом носителе. Млекопитающим может быть человек. Уриказу можно вводить инъекцией, например, внутривенно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно или внутрибрюшинно или ингаляцией препарата в виде аэрозоля. Повышенные уровни мочевой кислоты могут существовать в крови, моче и/или прочих жидкостях и тканях тела и могут быть связаны с подагрой, подагрическими узлами, почечной недостаточностью, трансплантацией органа или злокачественным заболеванием.

Существом настоящего изобретения является получение перечисленных выше биомедикаметов, а конкретно - способ выделения тетрамерной формы уриказы из раствора, содержащего несколько форм уриказы, и продукт этого способа. Изначально раствор может содержать тетрамерную уриказу и агрегаты уриказы. Способ может содержать следующие шаги: подача раствора в по меньшей мере одну сепарационную колонну при рН от приблизительно 9 до приблизительно 10,5, например, 10,2; восстановление фракций элюата и идентификации тех из них, которые могут содержать выделенную тетрамерную уриказу, причем фракции практически свободны от агрегатов уриказы; и объединение фракций выделенной тетрамерной уриказы. Сепарационная колонна может быть основана на ионном обмене, исключении по размеру или любом другом эффективном сепарационном свойстве. Способ может также содержать анализ фракций для определения наличия тетрамерной уриказы и/или отсутствия агрегатов уриказы. Например, такой анализ может содержать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), прочие хроматографические способы, рассеивание света, центрифугирование и/или электрофорез. Водном из аспектов данного выполнения очищенная тетрамерная уриказа может содержать менее 10% агрегатов уриказы.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказы из Candida utilis от количества нитей ПЭГ, связанных с субъединицей.

Фиг.2 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказы из Candida utilis от общей массы ПЭГ, связанного с субъединицей.

Фиг.3 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказы из свиной печени от количества нитей ПЭГ, связанных с субъединицей.

Фиг.4 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказы из свиной печени от общей массы ПЭГ, связанного с субъединицей.

Фиг.5 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной свино-бабуиновой химерной (СБХ) уриказы от количества нитей, связанных с субъединицей.

Фиг.6 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной СБХ-уриказы от общей массы ПЭГ, связанного с субъединицей.

Фиг.7 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказы из Aspergillus flavus от количества нитей ПЭГ, связанных с субъединицей.

Фиг.8 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказы из Aspergillus flavus от общей массы ПЭГ, связанного с субъединицей.

Фиг.9 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной рекомбинантной уриказы узелка соевого корня от количества нитей ПЭГ, связанных с субъединицей.

Фиг.10 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной рекомбинантной уриказы узелка соевого корня от общей массы ПЭГ, связанного с субъединицей.

Фиг.11 показывает установленные аминокислотные последовательности свино-бабуиновой химерной уриказы (СБХ-уриказы), СБХ-уриказы, которая укорочена как со стороны аминоконца, так и со стороны карбоксильного конца (СБХ-NT-CT), и свиной уриказы, содержащей мутации R291K и T301S (CKS-уриказы), в сравнении с последовательностями свиньи и бабуина.

Фиг.12 показывает активность уриказы в сыворотке мыши через 24 часа после каждой из четырех или пяти внутрибрюшинных инъекций ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы по сравнению со значением, полученным через 24 часа после первой инъекции.

Фиг.13 показывает обратную зависимость между активностью инъецированной ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы в сыворотке уриказо-дефицитной мыши и концентрациями мочевой кислоты в сыворотке и моче.

Фиг.14 показывает уменьшение тяжести дефекта концентрирования мочи у уриказо-дефицитных (uox-/-) мышей, которых лечили с помощью ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы.

Фиг.15 показывает уменьшение тяжести нефрогенного несахарного диабета у уриказо-дефицитных (uox-/-) мышей, которых лечили с помощью ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы.

Фиг.16 показывает уменьшение тяжести вызванной мочевой кислотой нефропатии, по показаниям магнитно-резонансной микроскопии, у уриказо-дефицитных (uox-/-) мышей, которых лечили с помощью ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы.

Фиг.17 показывает ускоренное элиминирование из кровообращения мыши BALB/c инъецированного октамера СБХ-уриказы по сравнению с тетрамером, причем оба они были связаны с 5-6 нитями ПЭГ весом 10 кДа на субъединицу.

Осуществления изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает улучшенные конъюгаты водорастворимых полимеров, предпочтительно поли(этилен гликолей) или поли(этилен оксидов) с уриказами. Эти конъюгаты практически неиммуногенны и сохраняют по меньшей мере 75%, предпочтительно 85% и более предпочтительно 95% и более уриколитической активности немодифицированного фермента. Уриказы, пригодные для конъюгации с водорастворимыми полимерами, включают в себя встречающиеся в природе уратоксидазы, выделяемые из бактерий, грибов и тканей растений и животных, как позвоночных, так и беспозвоночных, а также рекомбинантные формы уриказы, в том числе мутированные, гибридные и/или укороченные ферментативно-активные варианты уриказы. Водорастворимые полимеры, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают в себя линейные или разветвленные поли(этилен гликоли) или поли(этилен оксиды), общеизвестные как ПЭГ. Разветвленный ПЭГ раскрыт, например, в патенте США №5643575. Одним из предпочтительных примеров линейного ПЭГ является монометокси PEG с общей структурой CH₃O-(CH₂CH₂O)_nH, где n варьирует от 100 до 2300.

Одной из предпочтительных уриказ млекопитающих является рекомбинантная свино-бабуиновая химерная уриказа, составленная из частей последовательностей уриказы свиной печени и печени бабуина, обе из которых были впервые определены Wu, et al., (1989). Один из примеров такой химерной уриказы содержит первые 225 аминокислот из последовательности свиной уриказы (SEQ ID NO: 1) и последние 79 аминокислот из последовательности уриказы бабуина (SEQ ID NO: 2) (свино-бабуиновая уриказа, или СБХ-уриказа; см. фиг.11). Еще один пример такой химерной уриказы содержит остатки 7-225 свиной последовательности (SEQ ID NO: 1) и остатки 226-301 последовательности бабуина (SEQ ID NO: 2); это эквивалентно СБХ-уриказе, усеченной как со стороны аминотерминала, так и со стороны карбоксилового терминала (СБХ-NT-CT; см. фиг.11). Еще один пример такой химерной уриказы содержит первые 288 аминокислот из свиной последовательности (SEQ ID NO: 1) и последние 16 аминокислот из последовательности бабуина (SEQ ID NO: 2). Поскольку последняя последовательность отличается от последовательности свиньи только в двух позициях, то есть содержит лизин (K) вместо аргинина в остатке 291 и серин (S) вместо треонина в остатке 301, мутант обозначается как свиная-K-S или CKS-уриказа. Каждая из CKS-, СБХ- и CBX-NT-CT-уриказ содержит на один лизиновый остаток больше, и, следовательно, на одно потенциальное место для ПЭГ-илирования больше, чем последовательность свиньи или бабуина.

Кодирующие ДНK (кДНK) для различных уриказ млекопитающих, в том числе СБХ-уриказы, CKS-уриказы и рекомбинантной бабуино-подобной уриказы, были частично клонированы и были определены оптимальные условия для экспрессии в Е. coli с помощью стандартных способов. См. Erlich, НА, (ред.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification. New York: Stockton Press; Sambrook, J, et al., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Рекомбинантные уриказы были экстрагированы, очищены и их стабильность и активность протестирована с помощью модифицированных стандартных тестов. См. Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240:2491 - 2494; Nishimura, et al., (1979), и Пример 1.

Уриказа может конъюгироваться через биологически стабильные, нетоксичные, ковалентные линкеры относительно небольшого количества нитей ПЭГ. Такие связки могут содержать уретановые (карбаматные) связки, вторично-аминные связки и амидные связки. Различные активированные ПЭГ, пригодные для такой конъюгации, коммерчески доступны у фирмы Shearwater Polymers, Huntsville, AL.

Например, уретановые линкеры с уриказой могут формироваться путем инкубирования уриказы в присутствии сукцинимидил карбоната (CK) или 4-нитрофенил карбоната (НФK), производного от ПЭГ. CK-ПЭГ может синтезироваться с помощью процедуры, описанной в патенте США №5612460, включенном сюда посредством ссылки. НФK-ПЭГ может синтезироваться путем реагирования ПЭГ с 4-нитрофенил хлор-форматом в соответствии со способами, описанными у Veronese, FM, et al., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11:141-152 и в патенте США №5286637, включенном сюда посредством ссылки. Способы, описанные в патенте '637, адаптируются для ПЭГ с высоким молекулярным весом путем регулирования концентраций реагентов для поддержания подобной стехиометрии. Альтернативный способ синтеза НФК-ПЭГ описан в Btittner, W, et al., описание патента ГДР № DD 279486 А1.

Амидные линкеры с уриказой могут быть получены с помощью N-гидроксисукцинимидного сложного эфира карбоксиловой кислоты, производного от ПЭГ (Shearwater Polymers). Вторичные аминовые линкеры могут формироваться с помощью 2,2,2-трифторэтансульфонилового ПЭГ (тресил ПЭГ; Shearwater Polymers) или путем восстановительного алкилирования с помощью ПЭГ-альдегида (Shearwater Polymers) и циан-боргидрида натрия.

В конъюгатах, содержащих ПЭГ с молекулярными весами 5÷30 кДа, максимальное количество нитей ПЭГ, связанных с одной субъединицей при сохранении по меньшей мере 75% уриколитической активности немодифицированного фермента, находится в диапазоне от 2 нитей для уриказы соевых бобов до более 10 нитей для СБХ-уриказы (см. условия теста в Примере 1 и результаты на фиг.1-10). Последняя степень ПЭГ-илирования соответствует приблизительно одной трети всех аминогрупп. В одном из вариантов осуществления среднее количество нитей ПЭГ, связанных с каждой субъединицей уриказы, находится в пределах от 2 до 10. В предпочтительном выполнении среднее количество нитей ПЭГ, связанных с каждой субъединицей уриказы, находится в пределах от 3 до 8. В еще более предпочтительном выполнении среднее количество нитей ПЭГ, ковалентно связанных с каждой субъединицей уриказы, находится в пределах от 4 до 6. В еще одном выполнении молекулярный вес ПЭГ, используемого для реакции связывания, находится в пределах от 5 до 100 кДа, предпочтительно от 10 до 60 кДа и более предпочтительно от 20 до 40 кДа, например, равен 30 кДа.

Как известно существует несколько факторов, которые могут влиять на выбор оптимального молекулярного веса и количества нитей ПЭГ для связывания сданной формой уриказы. В общем, уменьшение или устранение иммуногенности без значительной потери уриколитической активности может требовать связывания относительно большого количества нитей ПЭГ более низкого молекулярного веса по сравнению с относительно меньшим числом нитей ПЭГ с более высокой молекулярной массой. Например, оптимально эффективными могут быть либо 6 нитей ПЭГ с весом 20 кДа на субъединицу, либо 4 нити ПЭГ с весом 30 кДа на субъединицу. Сходным образом, каждая отличная форма уриказы может иметь другие оптимальные значения размера и количества нитей. См. фиг.1-10.

Конъюгирование с ПЭГ делает все протестированные уриказы растворимыми и стабильными в буферах при физиологическом рН, без добавления аналога субстрата или ингибитора, такого как 8-азаксантин, который используется в качестве стабилизатора в грибной уриказе (Uricozyme^®). Два различных конъюгата СБХ-уриказы - один, содержащий 6 нитей ПЭГ весом 10 кДа на субъединицу, и другой, содержащий 2 нити ПЭГ весом 19 кДа на субъединицу, - сохраняли значительную активность после инкубации в сыворотке мыши в течение более чем одного месяца при 37°С. Вдобавок, несколько конъюгатов имели период полураспада при циркуляции у мышей свыше двух дней, в отличие от периодов полураспада продолжительностью 8 часов или 24 часа, о которых сообщалось ранее в отношении ПЭГ-модифицированных уриказ млекопитающего и микробного происхождения. Chen, et al., (1981); Fuertges, F, et al., (1990) J Contr Release 11:139-148; Fujita, T, et al., (1991) J Pharmacobidyn 14:623-629. Повышение периода полураспада инъецируемых белковых лекарств делает их более экономичными и, следовательно, более привлекательными для пациентов. Более продолжительный период полураспада показывает также, что эти продукты лучше переносятся организмом.

Когда ПЭГ-конъюгаты СБХ-уриказы были приготовлены из очищенной тетрамерной формы белка (четыре субъединицы по 35 кДа), они имели намного меньшую иммуногенность у мышей (фиг.12), в отличие от умеренной иммуногенности ПЭГ-конъюгатов с крупными формами фермента (например, с октамерами по 35 кДа на субъединицу; см. фиг.17), и очень высокой иммуногенности немодифицированного фермента. Повторные инъекции ПЭГ-уриказы по настоящему изобретению уриказо-дефицитным мышам устраняли у них гиперурикемию более чем на 2 месяца и защищали структуру и функцию их почек от разрушения, связанного с мочевой кислотой (фиг.13-16).

Инъекции полностью активных конъюгатов СБХ-уриказы с ПЭГ весом 10 кДа (фиг.5-6) сильно уменьшали гиперурикемию у гомозиготных уриказо-дефицитных мышей (фиг.13). Уровни мочевой кислоты в моче были также сильно снижены у всех уриказо-дефицитных мышей, которых лечили ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказой. Уриказо-дефицитным мышам вводили ряд инъекций с препаратом ПЭГ-уриказы, подобным использованному для получения данных фиг.13. Это лечение снижало тяжесть дефекта концентрирования мочи, как показано, во-первых, измерениями осмоляльности мочи при нормальных условиях и после 12-часового периода водной депривации (фиг.14) и, во-вторых, измерением потребления ими воды и диуреза (фиг.15) по сравнению с соответствующими измерениями для генетически подобных мышей, не получавших лечения. Также было продемонстрировано, что десять недель лечения, начатого в первые десять дней жизни, гомозиготных уриказо-дефицитных (uox-/-) "нокаутированных" мышей с помощью ПЭГ-уриказы по настоящему изобретению уменьшило тяжесть вызванного уратом нарушения структуры почек, как показано с помощью магнито-резонансной микроскопии (фиг.16). См. способы микроскопии в Hedlund, LW, et al., (1991) Fund Appl Toxicol 16:787-797; Johnson, GA, et al., (1992) в JC Gore, (ред.), Reviews of Magnetic Resonance in Medicine, Vot.4 (стр.187-219) New York: Pergamon Press.

Очищенные препараты встречающихся в природе и рекомбинантных уриказ обычно содержат смесь агрегатов фермента в дополнение к тетрамерной (140 кДа) форме. Процент тетрамерной формы в каждом препарате уриказ обычно варьируется от 20 до 90%. Несмотря на имеющиеся доказательства высокой иммуногенности агрегатов многих других неПЭГ-илированных белков (см., например, Moore, WV, et al., (1980) J Clin Endocrinol Metab 51:691-697), предыдущие исследования ПЭГ-уриказы не описывают никаких усилий по ограничению содержания агрегатов. Это показывает, что потенциальную иммуногенность ПЭГ-модифицированных агрегатов не учитывали. По данным заявителей, весьма вероятно, что такие агрегаты присутствовали в препаратах ферментов, использовавшихся для предшествующих синтезов ПЭГ-уриказы. Их присутствие могло усложнить задачу приготовления неиммуногенных конъюгатов. Также представляется, что большие потери уриколитической активности, наблюдавшиеся в предшествующих исследованиях по ПЭГ-илированиюуриказы, были связаны с большим количеством связываемых нитей ПЭГ с низким молекулярным весом. С другой стороны, способы очистки и ПЭГ-илирования уриказы, описанные здесь, обеспечивают ковалентное присоединение 10 нитей ПЭГ на субъединицу при сохранении более 75% уриколитической активности, по меньшей мере для некоторых уриказ, например, свино-бабуиновой химерной уриказы и фермента из A.flavus (см. фиг.5 и 7).

В еще одном предпочтительном варианте осуществления практически все агрегаты тетрамерной формы фермента могут быть удалены ионообменной или эксклюзионной хроматографией при рН от 9 до 10,5, предпочтительно 10,2, до конъюгации с ПЭГ результирующего практически полностью тетрамерного препарата уриказы. Молекулярный вес уриказы в каждой фракции, выходящей из препаративной колонны, может контролироваться посредством любой аналитической технологии зависимости от размера, в том числе, к примеру, ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии), традиционной эксклюзионной хроматографии, центрифугирования, светорассеивания, капиллярного электрофореза или гелевого электрофореза в неденатурирующем буфере. Для тетрамерной уриказы, выделенной с помощью эксклюзионной хроматографии, фракции, содержащие только форму фермента с весом 140 кДа, могут объединяться и использоваться для конъюгации с ПЭГ. Для тетрамерной уриказы, выделенной с помощью ионообменной хроматографии, размер во фракциях, выходящих из ионообменной колонки, может анализироваться для определения, какие фракции содержат значительные количества тетрамерной формы без обнаруживаемых агрегатов, из объединенной таким образом уриказы по меньшей мере 90% может находиться в тетрамерной форме; нежелательные агрегаты, таким образом, составляют приблизительно 10, 5, 2% или менее от всей выделенной уриказы.

Представленные здесь результаты показывают, что даже при сильном ПЭГ-илировании формы СБХ, большие, чем тетрамер, являются сильно иммуногенными для мышей (фиг.17). Более того, у мышей, которые один раз были инъецированы с помощью ПЭГ-илированных агрегатов уриказы, уриколитическая активность при последующих инъекциях либо ПЭГ-илированных тетрамеров, либо ПЭГ-илированных агрегатов быстро падала в кровотоке. В противоположность этому конъюгаты, приготовленные из уриказы, содержащей менее 5% агрегатов, могли многократно повторно инъецироваться без какого-либо ускорения их элиминирования (фиг.12) и без обнаруживаемого образования антител, что показал чувствительный твердофазный иммуноферментный анализ. Применение высокоочищенной тетрамерной уриказы дополнительно отличает улучшенные конъюгаты по настоящему изобретению от ранее описанных препаратов ПЭГ-уриказы. Напротив, присутствие значительной доли (например, свыше 10%) агрегатов в уриказных препаратах, использовавшихся некоторыми предшествующими исследователями, заставляло их связывать большое количество нитей ПЭГ, чтобы снизить иммуногенность. Следовательно, ферментативная активность полученных ими конъюгатов была значительно снижена. Изобретение охватывает ПЭГ-илированную уриказу в нететрамерной форме, например, такую, как димер уриказы, если такая конъюгированная уриказа сохраняет по меньшей мере 75% своей уриколитической активности и является практически неиммуногенной.

В другом варианте осуществления изобретения предложен мутеин уриказы из печени бабуина с неожиданно высокой активностью по сравнению с нативным ферментом. Эта улучшенная уриказа примата получена общепринятым способом рекомбинантных ДНK. Особенно неожиданным было то, что к существенному увеличению специфичесой активности уриказы бабуина могла привести замена только одного аминокислотного остатка (гистидина на тирозин в положении 97). Найдено, что при экспрессии в Е. coli этот мутеин имеет по меньшей мере на 60% большую специфическую активность, чем его предшественник - рекомбинантный фермент бабуина.

В другом варианте осуществления увеличена специфическая активность и/или растворимость неПЭГ-илированного фермента за счет того, что экспрессируют укороченные варианты уриказы свиньи или свино-бабуиновой химерной уриказы, в которых из экспрессируемых белков делегированы по меньшей мере последние три аминокислотных остатка на карбокси-конце (см. фиг.11). Рекомбинантные уриказы с укороченным карбокси-концом могут быть лучше растворимы до ПЭГ-илирования вследствие исключения сигнальной последовательности пероксисомальной локализации. См. Miura, S, et al., (1994) Eur J Biochem 223:141-146.

Конъюгаты уриказ с ПЭГ настоящего изобретения полезны для снижения уровней мочевой кислоты в жидкостях тела и в тканях млекопитающих, предпочтительно в организме человека, и, следовательно, могут быть использованы для терапии при повышенных уровнях мочевой кислоты, связанных с такими состояниями, как подагра, подагрические узлы, почечная недостаточность, при пересадке органов и при тяжелых заболеваниях. Конъюгаты уриказы и ПЭГ можно вводить инъекцией млекопитающему с повышенным уровнем мочевой кислоты любым из следующих путей: внутривенно, подкожно, внутрикожно, внутримышечно и интраперитонеально. Альтернативно их можно вводить ингаляцией аэрозоля. См. Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19:3-36 и патент США №5458135. Эффективная доза ПЭГ-уриказы настоящего изобретения будет зависеть от уровня мочевой кислоты и массы тела индивидуума. В одном из вариантов осуществления ПЭГ-уриказы вводят в фармацевтически приемлимом эксципиенте или разбавителе в количестве от примерно 10 микрограмм до примерно 1 г. В предпочтительном варианте осуществления вводят от примерно 100 микрограмм до примерно 500 миллиграмм. Более предпочтительно вводят примерно 1÷100 миллиграмм, например, 5 мг, 20 мг или 50 мг. Массы, указанные для доз в вариантах осуществления, относятся к количеству белка в конъюгате.

Фармацевтические составы, содержащие ПЭГ-уриказу, можно изготовить общепринятыми способами, например, как описано в Gennaro, AR (Ed.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition Easton, PA: Mack Publishing Co. Подходящие эксципиенты для изготовления инъецируемых растворов включают, например, забуференный фосфатом раствор соли, раствор Рингера с лактатом, воду, полиолы и глицерин. Фармацевтические композиции для парентерального инъецирования включают фармацевтически приемлемые стерильные водные или неводные жидкости, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки для восстановления непосредственно перед использованием в стерильные инъецируемые растворы или дисперсии. Эти составы могут содержать дополнительные компоненты, такие как, например, консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, увлажняющие агенты, эмульгаторы, буферы, интиоксиданты и разбавители.

ПЭГ-уриказы можно обеспечить в композициях с контролируемым высвобождением для имплантации индивидууму, чтобы непрерывно контролировать повышенные уровни мочевой кислоты в жидкостях тела. Например, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, регенерированный коллаген, поли-L-лизин, альгинат натрия, желирующая смола, хитозан, агароза, многослойные липосомы и многие другие депо-составы, включающие биоэрозивные или биоразлагаемые материалы, которые могут быть составлены с биологически активными композициями. При имплантации или инъекции эти материалы постепенно разрушаются и высвобождают активный компонент в окружающие ткани. Например, один способ инкапсулирования ПЭГ-уриказы включает способ, раскрытый в патенте США №5653974, включенный здесь посредством ссылки. Применение биоэрозивных или биодеградируемых материалов и других депо-составов недвусмысленно охватывается настоящим изобретением. Применение инфузионных помп и систем матриксных ловушек (matrix entrapment) для доставки ПЭГ-уриказы также охватывается настоящим изобретением. Может быть предпочтительно заключить ПЭГ-уриказу в мицеллы или липосомы. Технология инкапсулирования в липосомы хорошо известна в уровне техники. См., например, Lasic, D, et al., (Eds.) (1995) Stealth Liposomes. Boca Raton, FL: CRC Press.

Фармацевтические композиции ПЭГ-уриказ согласно изобретению будут снижать необходимость гемодиализа у пациентов с высоким риском урат-индуцированного отказа почек, например, у реципиентов при трансплантации органов (см. Venkataseshan, VS, et al., (1990) Nephron 56:317-321) и у пациентов с некоторыми тяжелыми заболеваниями. У пациентов, имеющих значительные отложения кристаллического урата (подагрические узлы), такие фармацевтические композиции будут улучшать качество жизни более эффективно, чем доступные в настоящее время способы лечения.

Следующие примеры, которые никоим образом не должны рассматриваться как ограничение изобретения, иллюстрируют различные раскрытые выше аспекты. Эти примеры описывают ПЭГ-уриказы, приготовленные путем связывания активированных (т.е. электрофильных) производных ПЭГ различных размеров и составов с встречающимися в природе свиной, грибной или бактериальной уриказами, либо с рекомбинантными соевой, свиной или свино-бабуиновой химерной уриказами. Результаты исследований активности, растворимости, стабильности, фармакокинетики, фармакодинамики и иммунологических исследований содержатся в примерах. Данные на фиг.13-16 делают очевидной способность ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы по настоящему изобретению корректировать гиперурикемию и гиперурикозурию и предохранять структуру и функцию почек в животной модели, имеющей гиперурикемию и гиперурикозурию, вызывающие серьезное разрушение почек. Wu, X, et al., (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:742-746. Эти примеры дают специалистам руководство по приготовлению практически неиммуногенных конъюгатов уриказы, сохраняющих по меньшей мере 75% уриколитической активности немодифицированного фермента.

Пример 1

Очистка тетрамерной формы уриказы

Тетрамерную форму уриказы (молекулярный вес ок. 140 кДа) получали в чистом виде из раствора уриказы свиной печени препаративной эксклюзионной или ионообменной хроматографией с последующей аналитической эксклюзионной хроматографией. Уриказу свиной печени приобретали у компании Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, номер по каталогу U2350 или U3377; либо у компании Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN.

Препаративную и аналитическую эксклюзионную хроматографию проводили при рН 10-10,5, предпочтительно 10,2 в 10 ммоль-натриевом буфере, содержащем 0,1 моль NaCl, на колонках Superdex 200, предварительно откалиброванных с помощью белков известного молекулярного веса. Superdex были приобретены у Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. Можно использовать любой буфер, способный поддерживать желаемый уровень рН и совместимый с химизмом последующей стадии связывания с ПЭГ. Такие буферы хорошо известны из уровня техники. Ультрафиолетовое поглощение элюата из препаративной колонки наблюдали при 280 нм, и содержащие уриказу фракции элюата, соответствующие молекулярному весу желательной тетрамерной формы и свободные от соединений с большим молекулярным весом, собирали для использования при синтезе практически неиммуногенной ПЭГ-уриказы, как описано в Примере 2. Альтернативно тетрамерные формы уриказы можно выделить с помощью другого эксклюзионного средства, такого как Superose 12 (Amersham Pharmacia) или любого другого средства, совместимого с мягкими щелочными растворами и имеющего подходящий диапазон фракционирования. Такие средства доступны и хорошо известны из уровня техники.

Ионообменную хроматографию проводили при рН 10-10,5, предпочтительно 10,2, на колонках Mono Q (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ), которые были уравновешены 0,1 молярным натриево-карбонатным буфером. Любой буфер, совместимый с химизмом связывания с ПЭГ и способный поддерживать желательный уровень рН, может быть использован при достаточно низкой ионной силе, обеспечивающей адсорбцию уриказы на колонке. Такие буферы хорошо известны из уровня техники. Ультрафиолетовое поглощение элюата наблюдали на 280 нм при элюировании уриказы с ионообменной смолы путем увеличения ионной концентрации подаваемого буферного раствора, например, посредством линейного градиента от 0 до 0,5 моль NaCl в натриево-карбонатном буфере. Затем использовали эксклюзионную ВЭЖХ для идентификации фракций элюата, содержащих желательную тетрамерную форму уриказы без обнаруживаемых агрегатов, для синтеза практически неиммуногенной уриказы. Альтернативно тетрамерная форма уриказы может быть выделена с помощью других ионообменных средств, таких как Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) или любого другого средства, которое совместимо с мягкими щелочными растворами. Такие средства доступны и хорошо известны из уровня техники.

Активность уриказы исследовали с помощью модификации стандартных способов. См., например, Fridovich (1965); Nishimura, et al., (1979). Растворы мочевой кислоты готавили ежедневно в 50-ммольном натриево-боратном буфере, рН 9,2 для обеспечения конечных концентраций в тесте от 6 до 150 мкмоль. Препараты уриказы растворяли в этом боратном буфере, содержащем альбумин бычьей сыворотки (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, номер по каталогу А-7030), так что окончательная концентрация альбумина в данном тесте составляла 0,1 мг/мл. После смешивания различных растворов фермента с субстратом в ячейках пластинки микротитра в микропластиночном считывателе скорость исчезновения мочевой кислоты при 25°С отслеживалась при 292 нм каждые 4 секунды в течение 3 минут. Из образцов, в которых от 10 до 40% субстрата было превращено в течение 3 минут, по меньшей мере 20 точек данных использовали для расчета максимальной скорости уменьшения поглощения в минуту. Одна международная единица (ME) активности уриказы определяется как количество фермента, которое превращает один микромоль мочевой кислоты в минуту; конкретные активности выражаются в МЕ/мг белка. Некоторые данные для относительных активностей уриказы на фиг.1-10 были получены с помощью 100 мкмоль мочевой кислоты в тесте. Прочие результаты для скорости при 100 мкмоль мочевой кислоты (V₁₀₀) были рассчитаны из значений константы Михаэлиса (K_M) и максимальной скорости (V_max) для соответствующих ферментных препаратов по формуле:

V₁₀₀=100×V_max(K_M+100),

где K_M выражается в микромолях.

Пример 2

Связывание ПЭГ с тетрамерной свиной уриказой

К раствору тетрамерной уриказы в 0,1-молярном натриево-карбонатном буфере, рН 10,2, к каждому молю субъединицы уриказы (молекулярный вес 35 кДа) добавляли 10-200 моль активированного производного монометокси PEG, например, 4-нитрофенил карбонат (НФК-ПЭГ), различных размеров. Эти и прочие подходящие активированные ПЭГ поставляются компанией Shearwater Polymers.

Инструкции по связыванию этих ПЭГ с белками даны в каталоге Shearwater Polymers в Интернете на www.swpolymers.com и в JM Harris, et al., (ред.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Washington, DC: American Chemical Society. Реакцию связывания проводили при 0-8°С до тех пор, пока объем связывания ПЭГ не переставал существенно меняться со временем. Непрореагировавший ПЭГ затем удаляли из продукта реакции хроматографией и/или ультрафильтрацией.

Количество нитей ПЭГ, связанных с каждой субъединицей уриказы, определялось посредством адаптации способов, описанных в Kunitani, M, et al., (1991) J Chromatogr 588:125-137; Saifer, et al., (1997) и Sherman, et al., (1997). Аликвотные количества смесей или фракций реакции ПЭГ-илирования из препаративных ионообменных или эксклюхионных колонок определялись посредством аналитической эксклюзионной ВЭЖХ на TSK 5000PWXL при комнатной температуре в 10-ммольном натриево-карбонатном буфере, рН 10,2, содержащем 0,1 моль NaCl. В качестве колонки ВЭЖХ использовали колонку, выпускаемая фирмой TosoHaas, Montgomeryville, PA. Белки и ПЭГН отслеживались детекторами ультрафиолетового поглощения и коэффициента преломления. Количество белка в конъюгате рассчитывали по площади пика коэффициента преломления, скорректированного с учетом вклада белка в коэффициент преломления, по отношению к площади пика коэффициента преломления подходящего стандарта ПЭГ.

Фиг.3 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказы свиной печени от количества нитей ПЭГ, связанных с каждой субъединицей. Данные, полученные в соответствие с настоящим изобретением (▲, □), сравнивали с данными, полученными Chen, et al., (1981). Точка данных в большом круге обозначает конъюгат, который неиммунореактивен по данным Chen, et al., (1981). Как показано на фиг.3, конъюгаты тетрамерной свиной уриказы, содержащие до 6 нитей ПЭГ весом 30 кДа на каждую субъединицу или содержащие до 7 нитей ПЭГ весом 5 кДа на каждую субъединицу, сохраняли по меньшей мере 75% активности немодифицированного фермента. Очевидное увеличение специфической активности при увеличении количества нитей ПЭГ весом 5 или 30 кДа (до 4 нитей на каждую субъединицу) может отразиться на относительной нерастворимости или нестабильности немодифицированного фермента по сравнению с конъюгатами. Как показано на фиг.4, конъюгаты свиной уриказы со в среднем более чем 3 нитями ПЭГ весом 30 кДа на каждую субъединицу содержат большую массу ПЭГ, чем было найдено достаточным для устранения иммунореактивности у Chen, et al., (1981).

Пример 3

Свойства конъюгатов с ПЭГ тетрамерной рекомбинантной СБХ-уриказы

Рекомбинантная свино-бабуиновая химерная (СБХ) уриказа была субклонирована в вектор экспресии pET3d (Novagen, Madison, WI), и готовым плазмидным конструктом трансфицировали культуру Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (Novagen) и проводили экспрессию. Эти процедуры проводили с помощью способов, хорошо известных из уровня техники в молекулярной биологии. См. Erlich (1989); Sambrook, et al., (1989); Ausubel, F, et al., (ред.), (1997) Short Protocol in Molecular Biology. New York: John Wiley & Sons.

Фиг.11 показывает установленную аминокислотную последовательность СБХ-уриказы (аминокислоты 1-225 SEQ ID NO: 1 и аминокислоты 226-304 SEQ ID NO: 2) в сравнении с последовательностями свиньи (SEQ ID NO: 1) и бабуина (SEQ ID NO: 2). Остатки в последовательности бабуина, отличные от остатков в последовательности свиньи, выделены жирным шрифтом. Впервые последовательности свиньи и бабуина были определены Wu, et al., (1989) и подтверждены настоящими изобретателями. SEQ ID NO: 1 идентичен номеру доступа р16164 базы данных GenBank, за исключением отсутствия начального метионилового остатка в последовательности GenBank. SEQ ID NO: 2 идентичен номеру доступа р25689 GenBank, за исключением отсутствия начального метионилового остатка и замены гистидина треонином в остатке 153 в последовательности GenBank (остаток 154 на фиг.11).

Тетрамерную форму СБХ-уриказы выделяли и связывали с ПЭГ различного молекулярного веса, как описано в примерах 1 и 2. Конъюгаты с ПЭГ весом 5, 10, 19 или 30 кДа содержали до 10 нитей ПЭГ на каждую субъединицу. Те из них, которые были приготовлены с помощью ПЭГ весом по меньшей мере 10 кДа, сохраняли более 95% начальной специфической активности рекомбинантной уриказы (фиг.5-6).

Следующие свойства конъюгата тетрамерной СБХ-уриказы с приблизительно 6-тью нитями ПЭГ весом 10 кДа на каждую субъединицу проиллюстрированы на чертежах: отсутствие иммуногенности (фиг.12) и эффективность на уриказо-дефицитных мышах при (1) коррекции гиперурикемии и гиперурикозурии (фиг.13), (2) снижение тяжести дефекта концентрирования мочи (фиг.14) и (3) снижение тяжести нефрогенного несахарного диабета (фиг.15). Кроме того, данная ПЭГ-уриказа снижала тяжесть связанного с мочевой кислотой поражения почек, как видно по данным магнитно-резонансной микроскопии (фиг.16).

Фиг.12 показывает активность СБХ-уриказы в сыворотке мыши через 24 часа после каждой из четырех или пяти внутрибрюшинных инъекций ПЭГ-уриказы в сравнении с таковой через 24 часа после первой инъекции. ПЭГ-конъюгаты готовили из трех различных препаратов СБХ-уриказы с помощью двух различных технологий активации ПЭГ. Один препарат (●) тестировали на уриказо-дефицитных (uox-/-) мышах, другие два (Δ, ■) тестировали на нормальных BALB/c мышах. Наиболее иммунореактивный препарат (Α) был приготовлен из очищенной СБХ-уриказы, содержащей неизвестное количество агрегатов уриказы, связанной со в среднем 7-мью нитями ПЭГ весом 5 кДа на каждую субъединицу, с помощью сукцинимидилово-карбонатного производного ПЭГ (СК-ПЭГ). Zalipsky, патент США №5612460, включенный сюда посредством ссылки. Умеренно иммунореактивный препарат (■) был приготовлен связыванием препарата СБХ-уриказы, содержащего 11% агрегатов со в среднем 2-мя нитями ПЭГ весом 19 кДа на каждую субъединицу, с помощью 4-нитрофенилкарбонатного производного ПЭГ (НФК-ПЭГ). Sherman, et al., (1997). Наименее иммунореактивный препарат (●) был приготовлен связыванием в среднем 6-ти нитей НФК-ПЭГ весом 10 кДа на каждую субъединицу с препаратом СБХ-уриказы, содержащим <5% агрегированной уриказы.

Фиг.13 показывает обратную зависимость между концентрациями мочевой кислоты в сыворотке и моче и активностью инъецированной ПЭГ-уриказы в сыворотке уриказо-дефицитной (uox -/-) мыши. Инъекции в момент времени 0 и спустя 72 часа содержали 0,43 ME СБХ-уриказы, конъюгированной со в среднем 6-тью нитями ПЭГ весом 10 кДа на каждую субъединицу фермента.

Фиг.14 показывает, что лечение уриказо-дефицитных мышей с помощью ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы снизило тяжесть дефекта концентрирования мочи. Среднее и среднеквадратичное отклонение данных для осмоляльности мочи показано для двух мышей, содержащих одну копию нормального мышиного гена уриказы (uox+/-), шести не подвергнутых лечению гомозиготных уриказо-дефицитных мышей (uox-/-) и шести гомозиготных уриказо-дефицитных мышей, которые были десять раз инъецированы между третьим и семьдесят вторым днем жизни с помощью либо 95, либо 190 мМЕ ПЭГ-уриказы. Мыши каждой генетической группы либо получали воду ad libitum (закрашенные прямоугольники), либо были лишены воды в течение 12 часов (штрихованные прямоугольники) до сбора их мочи.

Фиг.15 показывает, что лечение уриказо-дефицитных мышей с помощью ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы снизило тяжесть нефрогенного несахарного диабета, характеризующегося ненормально высоким потреблением воды и ненормально высоким выходом мочи. Генетические основы мышей и протокол лечения были теми же, что и на фиг.14. Среднее и среднеквадратичное отклонение дневного потребления воды (сплошные прямоугольники) и выход мочи (штрихованные прямоугольники) показаны для трех групп по шесть мышей.

Фиг.16 показывает, что лечение уриказо-дефицитных мышей с помощью ПЭГ-модифицированной СБХ-уриказы снизило тяжесть вызванной мочевой кислотой нефропатии, как показано магнитнорезонансной микроскопией. Фенотип трех групп мышей и протокол лечения были такими же, что и на фиг.14 и 15.

В дополнение к результатам, приведенным на фиг.13-16, было продемонстрировано, что уровни мочевой кислоты в моче всех уриказо-дефицитных мышей сильно снижались после лечения с помощью ПЭГ-модифицированной уриказы. Наконец, фиг.17 показывает, что в отличие от ПЭГ-модифицированной тетрамерной формы СБХ-уриказы октамерная форма (молекулярный вес = 280 кДа), даже при сильном ПЭГ-илировании, является иммуногенной для мышей. Это свойство отражается в ускоренном элиминировании ПЭГ-модифицированного октамера в течение 5 дней после одной внутрибрюшинной инъекции. Тем же мышам повторно инъецировали ту же дозу тех же препаратов ПЭГ-уриказы на 8 и 15 дни. Двадцать четыре часа после второй и третьей инъекции уриколитическая активность была необнаруживаема в сыворотках мышей, инъецированных с помощью ПЭГ-илированного октамера, но обнаруживаема в сыворотках тех мышей, которые были инъецированы с помощью ПЭГ-илированного тетрамера. Эти результаты в комбинации с ускоренным очищением ПЭГ-илированного октамера, наблюдавшимся после первой инъекции (фиг.17), поддерживают полезность устранения всех форм уриказы больших, чем тетрамер, до ПЭГ-илирования фермента.

Пример 4

Получение конъюгтов уриказы из Candida utilis с ПЭГ

Уриказу из Candida utilis приобретали либо у компании Sigma-Aldrich (St. Louis, МО; номер по каталогу U 1878), либо у компании Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; номер по каталогу URYW). Действуя по описаниям примеров 1 и 2, тетрамерную форму выделяли, для синтеза ПЭГ-конъюгатов использовали ПЭГ весом 5, 10 или 30 к Да (фиг.1-2). Фиг.1 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказы из Candida utilis от количества нитей ПЭГ, связанных с каждой субъединицей. Данные, полученные в соответствии с настоящим изобретением (▲, ●, □), сравнивали сданными Nishimura, et al., (1979); Nishimura, et al., (1981); Chen, et al., (1981); Davis, et al., (1981); Tsuji, et al., (1985); Yasuda, et al., (1990), и Fujita, et al., (1991). Точки данных в больших кругах обозначают конъюгаты, которые описываются как неантигенные в Nishimura, et al., (1979 или 1981) или неиммунореактивные в Chen, et al., (1981).

Фиг.2 показывает зависимость остаточной активности ПЭГ-илированной уриказой из Candida utilis от общей массы ПЭГ, связанного с каждой субъединицей. Данные, полученные в соответствии с настоящим изобретением (▲, ●, □), сравнивали с данными тех же источников, что и на фиг.1. Точки данных в больших кружках имеют то же значение, что и на фиг.1.

Как показано на фиг.1 и 2, конъюгаты со в среднем до 6-ти нитей ПЭГ весом 5 или 30 кДа либо 9 нитей ПЭГ весом 10 к Да на каждую субъединицу сохраняют по меньшей мере 75% активности немодифицированного фермента. Очевидное увеличение специфической активности при присоединении увеличенного количества нитей ПЭГ весом 30 кДа (до 5 или 6 нитей на каждую субъединицу) может отражать относительную нерастворимость или нестабильность немодифицированного фермента по сравнению с конъюгатами.

Пример 5

Получение конъюгатов уриказы из Aspergillus flavus с ПЭГ

Уриказу из Aspergillus flavus приобретали у компании Sanofi Whinthrop (Gentilly Cedex, France). Действуя, как описано в Примере 2, синтезировали конъюгаты с помощью ПЭГ различного молекулярного веса (фиг.7-8). Конъюгаты, приготовленные связыванием фермента из A. flavus со в среднем до 12-ти нитей ПЭГ весом 5 кДа или до 7-ми нитей ПЭГ весом 30 кДа на каждую субъединицу, сохраняли 75% начальной специфической активности этой грибной уриказы.

Пример 6

Получение конъюгатов уриказы сои с ПЭГ

Рекомбинантную уриказу из узелка соевого корня (называемая также нодулин 35) готовили и очищали, как описывали Kahn и Tipton (Kahn, K, et al., (1997) Biochemistry 36:4731-4738). Этауриказа была предоставлена доктором Типтоном (University of Missouri, Columbia, МО). Действуя согласно примерам 1 и 2, выделяли тетрамерную форму и готовили конъюгаты с ПЭГ различного молекулярного веса (фиг.9-10). В отличие от уриказы из Candida utilis (фиг.1), свиной уриказы (фиг.3), свино-бабуиновой химерной уриказы (фиг.5) и уриказы из Aspergillus flavus (фиг.7), соевый фермент переносил связывание только приблизительно 2 нитей ПЭГ весом 5 или 30 кДа на каждую субъединицу с сохранением по меньшей мере 75% начальной уриколитической активности.

Пример 7

Получение конъюгатов с ПЭГ уриказы из Arthrobacter globiformis

Уриказу из Arthrobacter globiformis приобретали у компании Sigma-Aldrich (номер по каталогу U7128). См. патент Японии №9-154581. Действуя по описаниям примеров 1 и 2, выделяли тетрамерную форму и готовили конъюгаты с ПЭГ весом 5 и 30 кДа. Хотя конъюгаты со в среднем более 3-х нитей ПЭГ весом 5 кДа на каждую субъединицу сохраняли менее 60% начальной специфической активности, конъюгаты со в среднем приблизительно 2-мя нитями ПЭГ весом 30 кДа на каждую субъединицу сохраняли по меньшей мере 85% начальной специфической активности.

Пример 8

Получение конъюгатов с ПЭГ амино-укороченной свиной и СБХ-уриказ

Рекомбинантную свиную и СБХ-уриказу, в которых делегированы первые шесть аминокислот с амино-конца, экспрессировали в Е. coli и очищали от стандартными методами, как описано в примере 3. Действуя согласно примерам 1 и 2, синтезировали ПЭГ-конъюгаты амино-укороченных уриказ для получения неиммуногенных конъюгатов, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности.

Пример 9

Получение конъюгатов с ПЭГ укороченной со стороны карбоксильного и/или амино-конца свиной и СБХ-уриказы

Рекомбинантную свиную и СБХ-уриказу, в которых делегированы последние три аминокислоты со стороны карбоксильного конца, экспрессировали в Е. coli и очищали от нее стандартными методами, как описано в примере 3. Эта карбокси-концевая модификация может улучшить растворимость немодифицированных ферментов, поскольку оно удаляет сигнальную последовательность пероксисомной локализации. См. Miura, et а)., (1994). Действуя согласно описанию примеров 1 и 2, синтезировали ПЭГ-конъюгаты карбокси-укороченных уриказ для получения практически неиммуногенных конъюгатов, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности. Последовательность рекомбинантной СБХ-уриказы, укороченной на шесть остатков со стороны амино-конца и на три остатка со стороны карбокси-конца (СБХ-NT-CT), показана на фиг.11. Эти уриказы экспрессировали, очищали и ПЭГ-илировали, как описано в примерах 1, 2 и 3, для получения практически неиммуногенных конъюгатов, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности.

Пример 10

Получение конъюгатов с ПЭГ мутеинов свиной уриказы, содержащих увеличенное количество мест присоединения ПЭГ

Рекомбинантные свиные уриказы, в которых потенциальное количество мест присоединения ПЭГ увеличено путем замены одного или более аргининовых остатков лизином получены, как описано в примере 3. См. Hershfield, MS, et al., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:7185-7189. Аминокислотную последовательность одного из примеров такого мутеина (CKS-уриказа), в которой аргинин в остатке 291 заменен лизином, а треонин в остатке 301 заменен серином, показан на фиг.11. Действуя согласно описаниям примеров 1 и 2, ПЭГ конъюгировали с этой уриказой для получения практически неиммуногенных конъюгатов, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности рекомбинантной уриказы.

Пример 11

Получение конъюгатов с ПЭГ мутеина рекомбинантной уриказы бабуина

С помощью стандартных способов молекулярной биологии, как и в примере 3, конструируют уриказу бабуина, имеющую аминокислотную замещену (гистидин вместо тирозина) в положении 97 (см. последовательность бабуина на фиг.11). Действуя согласно примерам 1 и 2, синтезировали ПЭГ-конъюгаты тетрамерной формы мутеина рекомбинантной уриказы бабуина для получения конъюгатов со значительно сниженной иммуногенностью, сохраняющих по меньшей мере 75% начальной специфической активности рекомбинантной уриказы.

Пример 12

Иммуногенность конъюгатов с ПЭГ уриказ из Candida utilis, Aspergillus flavus и Arthrobacter globiformis

Уриказы из Candida utilis, Aspergillus flavus и Arthrobacter globiformis получали, как описано в примерах 4, 5 и 7, соответственно. Действуя согласно примерам 1 и 2, синтезировали конъюгаты с ПЭГ весом 5, 10, 20 или 30 кДа. Иммуногенность этих конъюгатов сильно снижена или устранена.

Claims (31)

1. Конъюгаты уратоксидазы (уриказы) для снижения повышенных уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани тела млекопитающего, включающие в себя очищенную уриказу и полиэтиленгликоль (ПЭГ), в которых, по меньшей мере, 90% упомянутой уриказы представляет собой тетрамер и каждая субъединица упомянутой уриказы ковалентно связана, в среднем, с, по большей мере, 12 нитями полиэтиленгликоля имеющего молекулярный вес приблизительно от 5 кДа до приблизительно 100 кДа.

2. Конъюгаты по п.1, в которых указанный ПЭГ имеет средний молекулярный вес примерно 10-60 кДа.

3. Конъюгаты по п.2, в которых указанный ПЭГ имеет средний молекулярный вес 10 кДа.

4. Конъюгаты по п.2, в которых указанный ПЭГ имеет средний молекулярный вес примерно 20 кДа.

5. Конъюгаты по п.2, в которых указанный ПЭГ имеет средний молекулярный вес примерно 30 кДа.

6. Конъюгаты по п.1, в которых среднее количество нитей указанного ПЭГ, ковалентно связанных с каждой субъединицей, из которых состоит указанный тетрамер, составляет от 2 до 10.

7. Конъюгаты по п.1, в которых уриказа является уриказой млекопитающего.

8. Конъюгаты по п.7, в которых уриказа выбрана из группы, включающей уриказу свиной печени, уриказу бычьей печени или уриказу овечьей печени.

9. Конъюгаты по п.1, в которых уриказа представляет собой рекомбинантную уриказу.

10. Конъюгаты по п.9, в которых рекомбинантная уриказа имеет аминокислотную последовательность уриказы свиной печени, бычьей печени, овечьей печени или печени бабуина.

11. Конъюгаты по п.9, в которых рекомбинантная уриказа представляет собой химерную уриказу.

12. Конъюгаты по п.11, в которых указанная химерная уриказа включает, по меньшей мере, одну часть уриказы свиной печени и, по меньшей мере, одну часть уриказы печени бабуина.

13. Конъюгаты по п.12, в которых указанная химерная уриказа является химерной уриказой свиньи и бабуина (СБХ-уриказой).

14. Конъюгаты по п.12, в которых химерная уриказа представляет собой уриказу с последовательностью свиной уриказы SEQ ID N0:1 с остатком лизина вместо остатка аргинина в положении 291 (R291K) и с остатком серина вместо остатка треонина в положении 301 (T301S) (CKS-уриказой).

15. Конъюгаты по п.9, в которых рекомбинантная уриказа представляет собой уриказу с аминокислотной последовательностью уриказы печени бабуина (SEQ ID NO:2) с остатком гистидина вместо тирозина в положении 97 (Y97H).

16. Конъюгаты по п.9, в которых рекомбинантная уриказа представляет собой укороченную с амино-конца и/или карбоксильного конца рекомбинантную уриказу.

17. Конъюгаты по п.6, в которых среднее количество ковалентно связанных нитей ПЭГ составляет от 3 до 8 на каждую субъединицу уриказы.

18. Конъюгаты по п.17, в которых среднее количество ковалентно связанных нитей ПЭГ составляет от 4 до 6 на каждую субъединицу уриказы.

19. Конъюгаты по п.1, в которых нити ПЭГ связаны с уриказой ковалентным линкером, выбранным из группы, включающей уретановый линкер, вторичный аминовый линкер и амидный линкер.

20. Конъюгаты по п.1, в которых ПЭГ представляет собой линейный ПЭГ.

21. Конъюгаты по п.1, в которых ПЭГ представляет собой разветвленный ПЭГ.

22. Конъюгаты по п.1, в которых, по меньшей мере, 95% указанной уриказы представляет собой тетрамер.

23. Конъюгаты по п.16, в которых укороченная с амино-конца и/или карбоксильного конца рекомбинантная уриказа представляет собой уриказу с амино-концом, укороченным, по меньшей мере, на шесть первых аминокислот.

24. Фармацевтическая композиция для снижения повышенных уровней мочевой кислоты в жидкости или ткани тела млекопитающего, включающая конъюгат по п.1 фармацевтически приемлемый носитель.

25. Композиция по п.24, в которой упомянутая композиция имеет стабилизированную лиофилизированную форму, быстро восстанавливаемую растворением с получением раствора, пригодного для парентерального введения.

26. Способ получения конъюгата по п.1, включающий нанесение раствора уриказы, включающего тетрамерную форму уриказы и агрегаты уриказы, на, по меньшей мере, одну разделительную колонку при рН примерно 9-10,5, затем с указанной разделительной колонки собирают, по меньшей мере, одну фракцию, в которой, по меньшей мере, 90% уриказы имеет тетрамерную форму и ковалентное связывание каждой субъединицы указанной тетрамерной уриказы, в среднем, с, по большей мере, 12 нитями полиэтиленгликоля, имеющего молекулярный вес приблизительно от 5 кДа до приблизительно 100 кДа.

27. Способ по п.26, в котором раствор наносят при рН 10,2.

28. Способ по п.26, в котором используют разделительные колонки с ионным обменом и/или размерной эксклюзией.

29. Способ по п.26, в котором дополнительно анализируют, по меньшей мере, одно свойство указанных фракций, выбранное из группы, включающей наличие указанной тетрамерной уриказы и отсутствие указанных агрегатов уриказы.

30. Способ по п.29, в котором анализ проводят, по меньшей мере, одним аналитическим методом, выбранным из группы, включающей хроматографию, центрифугирование, светорассеяние и электрофорез.

31. Способ по п.29, в котором указанный аналитический метод представляет собой высокоэффективную жидкостную хроматографию.

Images