PL203492B1 - Koniugat urykazy i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna - Google Patents

Koniugat urykazy i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna Download PDF

Info

Publication number
PL203492B1
PL203492B1 PL346224A PL34622499A PL203492B1 PL 203492 B1 PL203492 B1 PL 203492B1 PL 346224 A PL346224 A PL 346224A PL 34622499 A PL34622499 A PL 34622499A PL 203492 B1 PL203492 B1 PL 203492B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
uricase
peg
conjugate according
kda
conjugate
Prior art date
Application number
PL346224A
Other languages
English (en)
Other versions
PL346224A1 (en
Inventor
L. Williams David
Hershfield Michael
J. Kelly Susan
G. Mark
R. Sherman Merry
Original Assignee
Duke University
Mountain View Pharmaceuticals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Duke University, Mountain View Pharmaceuticals filed Critical Duke University
Publication of PL346224A1 publication Critical patent/PL346224A1/xx
Publication of PL203492B1 publication Critical patent/PL203492B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest koniugat urykazy i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceu- tyczna. W ogólno sci rozwi azania wed lug wynalazku dotycz a chemicznej modyfikacji bia lek w celu przed lu zenia ich czasu kr azenia i zredukowania ich immunogenno sci. Bardziej szczegó lowo, rozwi a- zana wed lug wynalazku dotycz a koniugowania poli(glikoli etylenowych) lub poli(tlenków etylenowych) z urykaz a (oksydaz a moczanow a), co zasadniczo usuwa immunogennosc urykazy, a jednocze snie nie ogranicza jej aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego. Oksydazy moczanowe (urykazy; E.C. 1.7.3.3) s a enzymami katalizuj acymi utlenianie kwasu moczowego do bardziej rozpuszczalnego produktu, allantoiny, metabolitu purynowego, który jest la- twiejszy do usuwania. Cz lowiek nie wytwarza enzymatycznie aktywnej urykazy, co jest wynikiem sze- regu mutacji w genie dla urykazy, które zasz ly w trakcie ewolucji wy zszych naczelnych. Wu, X, i wsp., (1992) J. Mol. Evol. 34: 78-84. W konsekwencji u obarczonych tym osobników, nadmierne st ezenie kwasu moczowego we krwi (hiperurykemia) i w moczu (hiperurykozuria) mo ze prowadzi c do bolesne- go zapalenia stawów (skaza moczanowa), zniekszta lcaj acych bezpostaciowych z logów moczanowych (guzki) oraz niewydolno sci nerek. U niektórych, dotkni etych tym osobników dost epne leki, takie jak allopurynol (inhibitor syntezy kwasu moczowego) wywo luj a efekty uboczne ograniczaj ace leczenie lub niedostatecznie usuwaja objawy. Hande, KR, i wsp., (1984) Am. J. Med. 76: 47-56; Fam AG, (1990) Baillière’s Clin Rheumatol 4: 177-192. Wstrzykni ecie urykazy mo ze co najmniej przej sciowo zmniej- sza c hiperurykemi e i hiperurykozuri e. Ze wzgl edu na fakt, ze urykaza jest dla ludzi bia lkiem obcym, to nawet pierwsze wstrzykni ecie niezmodyfikowanego bia lka z Aspergillus flavus wywo la lo u kilku pro- cent leczonych pacjentów reakcje anafilaktyczne (Pui, C-H, i wsp., (1997) Leukemia 11:1813-1816), a odpowiedzi immunologiczne ograniczaj a jego zastosowanie do d lugotrwa lego lub okresowego le- czenia. Donadio, D, i wsp., (1981) Nouv Presse Med 10:711-712; Leaustic, M, i wsp., (1983) Rev Rhum Osteoartic 50:553-554. Od kilku dziesi ecioleci uznaje si e dzia lanie dost epnych sposobów leczenia hiperurykemii za suboptymalne. Kissel, P, i wsp., (1968) Natur e 217:72-74. Podobnie dostrzegana by la od wielu lat mo zliwo sc, ze okre slone grupy pacjentów z ostr a skaz a moczanow a mog a czerpa c korzy sci z bez- piecznej i skutecznej postaci wstrzykiwalnej urykazy. Davis, FF, i wsp., (1978) w GB Broun, i wsp., (red.) Enzyme Engineering, tom 4 (str. 169-173), Nowy Jork, Plenum Press; Nishimura, H, i wsp., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, i wsp., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, i wsp., (1981) Lancet 2(8241):281-283; Abuchowski, A, i wsp., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352-354; Chen, RH-L, i wsp., (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298; Chua, CC, i wsp., (1988) Ann Int Med 109:114-117; Greenberg, ML, i wsp., (1989) Anal Biochem 176:290-293. Urykazy otrzymywane z na- rz adów zwierz at s a prawie nierozpuszczalne w rozpuszczalnikach, które sa bezpieczne do wstrzyk- ni ecia. Patent U.S. 3616231. Okre slone urykazy pochodzenia ro slinnego lub z mikroorganizmów s a lepiej rozpuszczalne w medycznie dopuszczalnych rozpuszczalnikach. Jednak ze wstrzykni ecie po- chodz acych z mikroorganizmów enzymów szybko wywo luje reakcje immunologiczne, które mog a prowadzi c do zagra zaj acych zyciu reakcji alergicznych lub do inaktywacji i/lub przyspieszonego usu- wania urykazy z krazenia. Donadio, i wsp., (1981); Leaustic, i wsp., (1983). Enzymy oparte na wyde- dukowanych sekwencjach aminokwasowych urykaz ssaków, takich jak swinie i pawiany, lub z owa- dów, takich jak przyk ladowo Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, i wsp., (1990) Mol Celi Biol 10:5114-5127) nie s a u zytecznymi kandydatami do zastosowa n klinicz- nych z uwagi na problemy z immunogenno scia i rozpuszczalno sci a przy fizjologicznym pH. Bia lka kowalencyjnie zmodyfikowane poli(glikolem etylenowym) lub poli(tlenkiem etylenu) (oba okre slane jako PEG) by ly stosowane w celu zwi ekszenia pó lokresu trwania bia lka i zmniejszania im- munogenno sci. Patenty U.S. 4179337, 4766106 i 4847325; Saifer, MGP, i wsp., (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387. Przy laczanie PEG o wysokiej masie cz asteczkowej prowadzi do otrzymania koniu- gatów o wyd lu zonym czasie kr azenia i/lub zmniejszonej immunogenno sci, które zachowuj a funkcjo- naln a aktywno sc, co wcze sniej wykazano dla innego enzymu, dysmutazy nadtlenkowej (Somack, R, i wsp., (1991) Free Rat Res Commun 12-13:553-562; Patenty U.S. 5283317 i 5468478) i dla innych rodzajów bia lek np. cytokin (Saifer, MGP, i wsp., (1997) Polym Preprints 38:576-577; Sherman, MR, i wsp., (1997) w JM Harris, i wsp., (red.) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (str. 155-169) Waszyngton, DC: American Chemical Society). Opisane by ly równie z koniugaty urykazy z polimerami innymi ni z PEG. Patent U.S. 4460683.PL 203 492 B1 3 W prawie wszystkich próbach modyfikowania urykazy PEG, o których donoszono (np. kowalen- cyjnego przy laczania PEG do urykazy) PEG by l przy laczany g lównie do grup aminowych, w lacznie z resztami ko nca aminowego i dost epnymi resztami lizyny. W powszechnie stosowanych urykazach, ca lkowita liczba reszt lizynowych w ka zdej z czterech identycznych podjednostek wynosi pomi edzy 25 (Aspergillus flavus (patent U.S. 5382518)), a 29 ( swinia (Wu, X, i wsp., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416)). Niektóre z lizyn w natywnej konformacji enzymu s a niedost epne dla procesu modyfi- kacji PEG. Najcz estszym sposobem ograniczenia immunogenno sci urykazy jest przylaczenie znacz- nej liczby la ncuchów niskocz asteczkowego PEG. Prowadzi to niezmiennie do znacznego ograniczenia aktywno sci enzymatycznej uzyskiwanych koniugatów. Wcze sniej naukowcy stosowali wstrzykni ecia urykazy celem skatalizowania in vivo przekszta l- cenia kwasu moczowego do allantoiny. Patrz Pui, i wsp., (1997). Stanowi to podstaw e dla stosowania we Francji i we W loszech urykazy z grzyba Aspergillus flavus (Uricozyme®) do zapobiegania lub okresowej poprawy hiperurykemii towarzysz acej cytotoksycznemu leczeniu z lo sliwych chorób krwi i do przej sciowego ograniczenia ostrej hiperurykemii u pacjentów ze skaz a moczanow a. Potaux, L, i wsp., (1975) Nouv Press Med 4:1109-1112; Legoux, R, i wsp., (1992) J Biol Chem 267:8565-8570; Patenty U.S. 5382518 i 5541098. Z uwagi na krótki czas kr azenia Uricozyme® wymaga codziennego wstrzy- kiwania. Ponadto, z uwagi na swoj a immunogenno sc nie jest preparatem dobrze nadaj acym si e do d lugotrwa lego leczenia. Pojedyncze, do zylne wstrzykni ecie preparatu urykazy z Candida utilis zwi azanej z 5 kDa PEG ograniczy lo moczany w surowicy do niewykrywalnych poziomów, u pi eciu osób, u których przed wstrzyknieciem st ezenie moczanu w surowicy wynosi lo 6,2 mg/dl, co mie sci si e w prawid lowym zakre- sie. Davis i wsp., (1981). U osób tych zastosowano dodatkowe wstrzykni ecia cztery tygodnie pó zniej, lecz ich reakcja nie zosta la opisana. Stosuj ac wzgl ednie nisko czu le oznaczenie dyfuzji w zelu, po drugim (i ostatnim) zastrzyku nie wykryto przeciwcia l przeciwko urykazie. Publikacja ta nie przedsta- wia wyników d lugotrwa lego leczenia ludzi lub zwierz at do swiadczalnych. Preparat urykazy z Arthrobacter protoformiae zwi azany z 5 kDa PEG by l stosowany do czaso- wego kontrolowania hiperurykemii u pojedynczego pacjenta z ch loniakiem, u którego przed zastrzy- kiem st ezenie moczanu w surowicy wynosi lo 15 mg/dl. Chua i wsp., (1998). Z uwagi na powa zny stan pacjenta i krótki czas leczenia (cztery zastrzyki w ci agu 14 dni) oszacowanie d lugotrwa lej skuteczno sci lub bezpiecze nstwa koniugatu nie by lo mozliwe. W niniejszym zg loszeniu okre slenie „immunogenny” odnosi si e do wywo lywania odpowiedzi od- porno sciowej przez wstrzykni ecie preparatu urykazy zmodyfikowanej PEG lub niezmodyfikowanej (antygen), podczas gdy „antygenowo sc” okre sla reakcj e antygenu z wcze sniej istniej acymi przeciwcia- lami. Lacznie antygenowo sc i immunogenno sc okre slane s a jako „immunoreaktywno sc”. We wcze- sniejszych badaniach ró znymi metodami oceniano immunoreaktywno sc urykazy zmodyfikowanej PEG, w tym przez: 1) reakcj e in vitro urykazy zmodyfikowanej PEG z wcze sniej uzyskanymi przeciw- cia lami; 2) pomiar indukcji syntezy przeciwcia la i 3) przy spieszenie poziomu usuwania po kolejnych wstrzyknieciach. Wcze sniejsze próby wykluczenia immunogenno sci urykaz pochodz acych z szeregu zróde l, przez przy laczenie szeregu la ncuchów PEG za po srednictwem ró znorodnych laczników, zako nczy ly sie umiarkowanym powodzeniem. Zmodyfikowana PEG urykaza by la po raz pierwszy ujawniona przez FF Davis i przez Y Inada i ich wspó lpracowników. Davis i wsp., (1978); Patent U.S. 4179337; Nishimu- ra i wsp., (1979); Patenty japo nskie 55-99189 i 62-55079. Koniugat ujawniony w patencie '337 by l syntetyzowany przez poddanie urykazy o nieokre slonym pochodzeniu reakcji z 2000-krotnym molar- nym nadmiarem PEG o masie 750 Daltonów, z jednoczesnym wskazaniem, ze du za liczba cz asteczek polimeru by la prawdopodobnie przy laczona do ka zdej cz asteczki urykazy. W opisie patentowym '337 ujawniono przy laczenie PEG albo poli(glikolu propylenowego) o masie cz asteczkowej 500 do 20,000 Daltonów, korzystnie oko lo 500 do 5000 Daltonów, w celu dostarczenia aktywnych, rozpuszczalnych w wodzie, nieimmunogennych koniugatów ró znych hormonów polipeptydowych i enzymów, lacznie z oksydoreduktaz a której jednym z trzech przyk ladów by la urykaza. Ponadto patent '337 k ladzie na- cisk na przylaczenie 10 do 100 lancuchów polimeru do cz asteczki enzymu i zachowania przynajmniej 40% aktywno sci enzymatycznej. Nie przedstawiono wyników eksperymentalnych dotycz acych stopnia sprz egania PEG do dost epnych grup aminowych urykazy, zachowanej specyficznej aktywno sci roz- k ladania kwasu moczowego lub immunoreaktywno sci koniugatu. Dane z 13 prac dotycz acych modyfikacji urykazy PEG s a podsumowane w tabeli 1. Niektóre z tych wyników s a równie z przedstawione graficznie na Fig. 1A-2B. Siedem z tych publikacji opisujePL 203 492 B1 4 znacz ace zmniejszenie aktywnosci rozk ladania kwasu moczowego, mierzonej in vitro, spowodowa- nej przy laczeniem ró znej liczby la ncuchów PEG do urykazy z Candida utilis. Przy laczenie du zej liczby la ncuchów PEG o masie 5 kDa do urykazy z w atroby swini daje podobne wyniki, jak to opisa- no w obu publikacjach Chen i w wyst apieniu na sympozjum tej samej grupy. Chen, i wsp., (1981); Davis i wsp., (1978). W sród bada n podsumowanych w tabeli 1 immunoreaktywno sc urykazy modyfikowanej PEG by- la zmniejszona w przypadku siedmiu i wyeliminowania w przypadku pi eciu z nich. W trzech z pi eciu pó zniejszych bada n, wyeliminowanie immunoreaktywno sci wi aza lo si e ze znacznym zmniejszeniem aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego - do najwi ecej 15%, 28% lub 45% aktywno sci pocz atko- wej. Nishimura i wsp., (1979) (15% aktywno sci); Chen i wsp., (1981) (28% aktywno sci); Nishimura i wsp., (1981) (45% aktywno sci). W czwartej publikacji donoszono o przy laczeniu PEG do 61% do- st epnych reszt lizyny, lecz nie oceniono zachowanej specyficznej aktywno sci. Abuchowski i wsp., (1981). Jednakowo z zespó l badawczy, w którego sk lad wchodzili dwaj z wy zej wymienieni naukowcy, stosuj ac te same metody, donosili niezale znie, ze ten zakres przy laczania pozostawia jedynie 23-28% aktywno sci. Chen i wsp., (1981). Publikacje z 1981 roku Abuchowski i wsp., i Chen i wsp., wykazuj a, ze aby zasadniczo ograni- czy c immunogenno sc urykazy, PEG musi by c zwi azany z oko lo 60% dost epnych lizyn (tabela 1). Pi ata publikacja, w której donoszono o usuni eciu immunoreaktywno sci urykazy nie ujawni la stopnia przy la- czenia PEG, zachowanej aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego lub charakteru przy laczenia PEG-bia lko. Veronese FM, i wsp., (1997) w JM Harris, i wsp., (red.), Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (str. 182-192) Waszyngton DC; American Chemical Society. Sprz eganie PEG do mniejszej cz esci reszt lizynowych urykazy ogranicza, lecz nie wyklucza jej immunoreaktywno sci u zwierz at do swiadczalnych. Tsuji, J, i wsp., (1985) Int J Immunopharmacol 7:725-730 (28-45% grup aminowych uleg lo sprz eganiu); Yasuda, Y, i wsp., (1990) Chem Pharm Buli 38:2053-2056 (38% grup aminowych uleg lo sprz eganiu). Zachowana aktywnosc rozk ladania kwasu moczowego odpowiadaj acych adduktów mie scila si e w zakresie od < 33% (Tsuji i wsp.,) do 60% (Yasuda i wsp.,) warto sci wyj sciowej. Tsuji i wsp., zsyntetyzowali koniugaty urykaza-PEG z PEG o masie 7,5 kDa i 10 kDa, i dodatkowo PEG o masie 5 kDa. Wszystkie uzyskane koniugaty by ly w pewnym stopniu immunogenne i antygenowe, równocze snie wykazuj ac ograniczon a aktywnosc enzymatyczn a (tabela 1; fig. 1A - 1B). PEGylowane preparaty urykazy z Candida utilis, które by ly bezpiecznie podawane dwukrotnie ka zdemu z pi eciu ludzi opisano jako te, które zachowa ly jedynie 11% swojej wyj sciowej aktywno sci. Davis i wsp., (1981). Kilka lat pó zniej, urykaza z Arthrobacter protoformiae zmodyfikowana PEG by la podawana czterokrotnie jednemu pacjentowi z zaawansowanym ch loniakiem i ostr a hiperury- kemi a. Chua i wsp., (1988). Podczas gdy zachowana aktywno sc preparatu enzymu nie by la mierzo- na, Chua i wsp. wskazali na nieobecno sc przeciwcia l przeciwko urykazie w surowicy pacjentów w 26 dni po pierwszym wstrzykni eciu urykazy-PEG, co wykryto stosuj ac enzymatyczny test immu- nosorpcyjny (ELISA). Jak podsumowano w Tabeli 1, wcze sniejsze badania nad urykaz a zmodyfikowan a PEG poka- za ly, ze aktywno sc katalityczna jest znacz aco zmniejszona przez przy laczenie dostatecznej liczby lancuchów PEG w celu zasadniczego zmniejszenia immunoreaktywno sci. Ponadto, wi ekszo sc wcze- sniejszych preparatów urykazy-PEG syntetyzowano z zastosowaniem PEG aktywowanym chlorkiem cyjanurowym, pochodn a triazyny (2,4,6-trichloro-l,3,5-triazyna), co jak pokazano wprowadzi lo nowe determinanty antygenowe i wywo lalo tworzenie przeciwcia l u królików. Tsuji i wsp., (1985).PL 203 492 B1 5 T a b e l a 1. Charakterystyka urykaz-PEG z wcze sniejszych bada n. Zród lo ury- kazy Wi azanie sprz ega- j ace Masa cza- stecz- kowa PEG (kDa) Procent lizyn zwi aza- nych z PEG Zachowana aktywno sc rozk ladania kwasu mo- czowego (%) Antygenowo sc lub immunogenno sc, komentarze Literatura 1 2 3 4 5 6 7 Nie podano Azydek 0,7 (diol) Nie poda- no Nie podano Nie podano Patent U.S. 4179337 Candida utilis Triazyna chlorek cjanurowy 5 % z „98": 20 26 43 48 31 21 15 5 Antygenowo sc z surowic a królika (% antygenowo sci niezmodyfikowanego enzymu) 70% 6% 0 0 Nishimura i wsp, 1979 Candida utilis PEG2 triazyna 2 x 5 22 25 36 46 50 87 70 45 31 27 86% 49% 0 0 0 Nishimura i wsp, 1981 Candida utilis Triazyna 5 71 11 Pi eciu m ezczyzn tolerowa lo dwa zastrzyki w ci agu 30 dni Davis, i wsp, 1981 Candida utilis Triazyna, wed lug Chen, i wsp, 1981 5 49 61 Nie podano Nie podano U ptaków immunogenno sc podobna do natywnej urykazy Immunogennosc ujemna Abuchowski i wsp, 1981 W atroba swini Triazyna 5 37 47 58 60 45 28 Przy spieszone usuwanie u myszy „ Sta le usuwanie (pó lokres ok. 8 godzin) Chen, i wsp. 1981 Candida utilis Triazyna 5 57 23 Sta le usuwanie (pó lokres ok. 8 go- dzin) Candida utilis Triazyna, wed lug Chen, i wsp, 1981 5 35 70 Nie podano Nie podano PEG zmniejsza immunogenno sc u królików „ Savoca, KV, i wsp. (1984) Int Arch Allergy Apel Immunol 75:58-67 Candida utilis Triazyna 5 Nie poda- no Nie podano PEG-urykaz e podano kurczakowi doustnie w liposomach (jednokrot- nie). Nishida, Y, i wsp, (1984) J Pharm Pharmacol 36:354-355 Candida utilis Triazyna 5 7,5 10 44 45 28 37 41 45 9.4 7,8 32 11 3 7,3 Ograniczona immunogennosc lecz pozytywne u królika (przeciwcia la nie dla urykazy, reaguj a krzy zowo z PEG dysmutaz a nadtlenkow a) Anty- genno sc badana przeciwcia lami swinki morskiej by la ograniczona. Tsuji, i wsp. 1988PL 203 492 B1 6 cd. tabeli 1 1 2 3 4 5 6 7 Arthrobacter protofor- miae Nie poda- no 5 Nie poda- no Nie podano Po 26 dniach od pierwszego z czte- rech wstrzykni ecie urykazy-PEG nie wykryto przeciwcia l w te scie ELISA Chua, i wsp. 1988 Candida utilis PEG 2 triazyna 2 x 5 10 12 15 21 38 90 89 80 70 60 Nie podano Nie podano Nie podano Nie podano Antygenowo sc badana surowic a królika by la zmniejszona o 75% Yasuda, i wsp, 1990 Candida utilis PEG 2 triazyna 2 x 5 22 68 Pojedynczy zastrzyk, PEG wyd lu za pó lokres trwania, u myszy, z ok. 1 godz. do ok. 8 godz. PEG blokuje usuwanie przez w atrob e, sledzion e i nerki (24 godz. okres badania). Fujita, i wsp, 1991 Nie podano PEG PEG 2 Nie okre- slono wi azania Nie podano Nie poda- no Wskaza- no, ze tak samo jak dla PEG Nie podano Nie podano Immunogenno sc u myszy zmniej- szona o 98% (PEG) lub 100%(PEG2). Veronese, i wsp, 1997 Japo nski patent 3-148298 dla A Sano i wsp., ujawnia zmodyfikowane bia lka, w tym urykaz e, modyfikowane PEG o masie cz asteczkowej 1-12 kDa, które wykazuj a ograniczenie antygenowo sci i „udoskonalone, wyd lu zone” dzia lanie i sposoby wytwarzania takich derywatyzowanych peptydów. Jednak ze brak jest ujawnie n w odniesieniu do liczby la ncuchów, oznacze n enzymatycznych, testów biologicznych lub znaczenia okre slenia „udoskonalone wyd lu zone” dzia lanie. Japo nskie Patenty 55- -99189 i 62-55079, oba dla Y Inada, ujawniaj a koniugaty urykazy odpowiednio wytworzone z zasto- sowaniem triazyny-PEG lub triazyny-bis-PEG (okre slonej w tabeli 1 jako PEG 2 ). Patrz Nishimura, i wsp., (1979 i 1981). Dla pierwszego rodzaju koniugatów masa cz asteczkowa PEG wynosi la 2 kDa i 5 kDa, podczas gdy w drugim zastosowano jedynie PEG o masie cz asteczkowej 5 kDa. Nishimura i wsp., (1979) donosili o odzyskaniu 15% aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego po modyfikacji 43% dost epnych lizyn liniowym PEG o masie 5 kDa, podczas gdy Nishimura i wsp., (1981) donosili o odzyskaniu 31% lub 45% aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego, po modyfikacji odpowiednio 46% lub 36% lizyn z zastosowaniem PEG 2 . Wcze sniejsze badania ujawniaj a ze gdy osi agni eta jest znacz aca redukcja immunogenno sci i/lub antygenowo sci urykazy przez modyfikacj e PEG, to jest ona niezmiennie zwi azana z zasadnicz a utrat a aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego. Bezpiecze nstwo, wygoda i koszt odczynników bio- farmaceutycznych s a wszystkie negatywnie dotkni ete przez zmniejszenie ich mocy i w efekcie potrze- b e podania zwi ekszonych dawek. Co za tym idzie, istnieje potrzeba bezpiecznej i skutecznej alterna- tywy w celu obni zania poziomu kwasu moczowego w p lynach cia la, w tym w krwi i moczu. Wynalazek dostarcza zasadniczo nieimmunogennego koniugatu urykazy z PEG, który zachowuje ca la lub prawie ca la aktywno sc rozk ladania kwasu moczowego niezmodyfikowanego enzymu. Przedmiotem wynalazku jest koniugat urykazy, który zachowuje co najmniej oko lo 75% aktyw- no sci rozk ladania kwasu moczowego nieskoniugowanej urykazy, zawieraj acy urykaz e kowalencyjnie zwi azan a srednio z 2 do 10 lancuchami PEG na podjednostk e urykazy, przy czym ka zda cz asteczka PEG ma mas e cz asteczkow a w zakresie pomi edzy 5 kDa a 100 kDa. W koniugacie wed lug wynalazku urykaza jest oczyszczon a urykaz a która w co najmniej 90% jest w postaci tetramerycznej. Zgodnie z tym aspektem wynalazku urykaza mo ze by c urykaz a zrekombinowan a. Niezale znie od tego czy jest zrekombinowana czy te z nie, urykaza mo ze korzystnie pochodzi c od ssaka. W jednym aspekcie tej postaci wykonania urykaza mo ze by c swi nsk a urykaz a z w atroby, bydl ec a urykaz a z w atroby lub owcz a urykaz a z w atroby. Urykaza mo ze te z by c bia lkiem chimerowym. Chimerowa urykaza mo ze zawiera c czes c urykazy z w atroby swini i/lub w atroby pawiana. Korzystnie chimerowa urykaza mo ze by c chimerowa urykaz a swinia-pawian (urykaza PBC) lub swi nsk a urykaz a zawieraj ac a mutacje R291K i T301S (urykaza PKS) (patrz sekwencje z Fig. 6 i wyniki bada n fizjologicznych i immunolo-PL 203 492 B1 7 gicznych z fig. 7-12). Tak ze korzystnie urykaza mo ze pochodzi c z w atroby pawiana, przy czym tyrozy- n e 97 zast apiono histydyn a. Taka modyfikacja mo ze zwi ekszy c specyficzn a aktywno sc urykazy o przynajmniej 60%. Urykaza w koniugacie wed lug wynalazku, niezale znie od pochodzenia, mo ze równie z by c korzystnie w postaci skróconej, zarówno na ko ncu aminowym jak i ko ncu karboksylowym, lub na obu ko ncach. Podobnie urykaza w koniugacie wed lug wynalazku mo ze by c urykaz a grzybow a lub pochodz ac a z mikroorganizmu i korzystnie jest wyizolowana z Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis lub Candida utilis lub jest zrekombinowanym enzymem zasadniczo o sekwencji jednej z tych urykaz. Alternatywnie urykaza w koniugacie wed lug wynalazku mo ze by c urykaz a bezkr egowca i korzystnie jest wyizolowana z Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobscura lub jest zre- kombinowanym enzymem zasadniczo o sekwencji jednej z tych urykaz. Urykaza w koniugacie wed lug wynalazku mo ze by c równie z urykaz a ro slinn a i jest korzystnie wyizolowana z brodawek korzeniowych soi (Glycine max) lub jest zrekombinowanym enzymem zasadniczo o sekwencji tej urykazy. PEG mo- ze mie c korzystnie sredni a mas e cz asteczkow a pomiedzy oko lo 10 kDa i oko lo 60 kDa; korzystniej PEG mo ze mie c sredni a mas e cz asteczkow a pomi edzy oko lo 20 kDa i oko lo 40 kDa, tak a jak, przy- k ladowo, 30 kDa. Srednia liczba kowalencyjnie przy laczonych la ncuchów PEG mo ze wynosi c korzyst- nie 3 do 8 na podjednostk e; korzystniej srednia liczba lancuchów PEG mo ze wynosi c od 4 do 6 na podjednostk e. Ponadto korzystnie urykaza w koniugacie wed lug wynalazku jest tetramerem. La ncuchy PEG mog a korzystnie by c po laczone kowalencyjnie z urykaz a za po srednictwem wi azania uretano- wego (karbaminianowego), drugorz edowego wi azania aminowego i/lub wi azania amidowego. PEG w koniugacie wed lug wynalazku mo ze by c korzystnie liniowy lub rozga leziony. Przedmiotem wynalazku jest równie z kompozycja farmaceutyczna do obni zania poziomu kwasu moczowego w p lynach cia la, zawieraj aca koniugat wed lug wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalny no snik. Korzystnie kompozycja mo ze by c stabilizowana przez liofilizacj e i szybko ulega rozpuszczaniu podczas rekonstytucji dostarczaj ac roztworów odpowiednich do podania pozajelitowego. Obecny wynalazek dostarcza równie z zastosowania koniugatu urykazy do wytwarzania leku do obni zania podwy zszonych poziomów kwasu moczowego w plynie cia la lub tkance ssaka, przy czym koniugat zawiera oczyszczon a urykaz e, która w co najmniej 90% jest w postaci tetramerycznej, obej- mujac a podjednostki, z których ka zda jest kowalencyjnie zwi azana srednio z 2 do 10 la ncuchami PEG, a ka zda cz asteczka PEG ma mas e cz asteczkow a w zakresie pomi edzy 5 kDa a 100 kDa, oraz koniugat wykazuje co najmniej oko lo 75% aktywno sc rozk ladania kwasu moczowego nieskoniugowa- nej urykazy. Lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem wed lug wynalazku mo ze by c podawany ssako- wi w celu dostarczenia skutecznej do obni zania poziomu kwasu moczowego ilo sci koniugatu PEG- urykaza. Korzystnie ssakiem mo ze by c cz lowiek. Tak ze korzystnie lek otrzymany zgodnie z zastoso- waniem wed lug wynalazku jest przeznaczony do podawania przez wstrzykni ecie do zylne, sródskórne, podskórne, domi esniowe lub dootrzewnowe albo przez inhalacj e rozpylonego preparatu. Podwy zszo- ny poziom kwasu moczowego we krwi, moczu i/lub innych p lynach cia la lub tkankach i mo ze by c zwi azany ze skaz a moczanow a guzkami dnawymi, niewydolno scia nerek, przeszczepem narz adu lub chorob a o charakterze z lo sliwym. Niniejszym opisano równie z sposób izolacji urykazy w postaci tetramerycznej z roztworu zawie- rajacego ró znorodne postaci urykazy oraz produkt otrzymany tym sposobem. Wyj sciowo roztwór mo- ze zawiera c tetrameryczn a urykaz e i agregaty urykazy. Sposób mo ze obejmowa c etapy: nanoszenia roztworu na przynajmniej jedn a kolumn e do rozdzia lu o pH pomi edzy 9 i 10,5, na przyk lad 10,2; odzy- skiwania frakcji eluatu i identyfikacji tych, które zawieraj a tetrameryczn a posta c urykazy i s a zasadni- czo wolne od agregatów urykazy; oraz po laczenia frakcji wyizolowanej tetrmerycznej urykazy. Kolum- na rozdzielaj aca mo ze by c kolumn a jonowymienn a mo ze te z rozdziela c pod wzgl edem wielko sci lub wykorzystywa c jakiekolwiek inne skuteczne zasady rozdzia lu. Sposób mo ze równie z obejmowa c ana- liz e frakcji w celu okre slenia obecno sci tetramerów urykazy i/lub nieobecno sci agregatów urykazy. Przyk ladowo taka analiza mo ze obejmowa c wysokosprawn a chromatografi e cieczow a (HPLC), inne metody chromatograficzne, rozproszenie swiat la, wirowanie i/lub elektroforez e. Oczyszczona tetrame- ryczn a urykaza mo ze zawiera c mniej ni z oko lo 10% agregatów urykazy. Krótki opis figur Fig. 1A przedstawia zachowanie aktywno sci urykazy z Candida utilis zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby lancuchów przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig. 1B przedstawia zachowanie aktywno sci urykazy z Candida utilis zmodyfikowanej PEG w funkcji ca lkowitej masy przy laczonego PEG na podjednostk e.PL 203 492 B1 8 Fig. 2A przedstawia zachowanie aktywno sci urykazy z w atroby swini zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby lancuchów przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig. 2B przedstawia zachowanie aktywno sci urykazy z w atroby swini zmodyfikowanej PEG w funkcji ca lkowitej masy przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig. 3A przedstawia zachowanie aktywno sci chimerowej urykazy swinia-pawian (PBC) zmodyfi- kowanej PEG w funkcji liczby lancuchów przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig. 3B przedstawia zachowanie aktywno sci chimerowej urykazy swinia-pawian (PBC) zmodyfi- kowanej PEG w funkcji ca lkowitej masy przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig 4A przedstawia zachowanie aktywnosci urykazy z Aspergillus flavus zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby lancuchów przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig. 4B przedstawia zachowanie aktywno sci urykazy z Aspergillus flavus zmodyfikowanej PEG w funkcji ca lkowitej masy przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig. 5A przedstawia zachowanie aktywno sci rekombinowanej urykazy z brodawek korzeniowych soi zmodyfikowanej PEG w funkcji liczby lancuchów przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig. 5B przedstawia zachowanie aktywno sci rekombinowanej urykazy z brodawek korzeniowych soi zmodyfikowanej PEG w funkcji ca lkowitej masy przy laczonego PEG na podjednostk e. Fig. 6 przedstawia wydedukowan a sekwencj e aminokwasow a chimerowej urykazy swinia- pawian (urykaza PBC), urykazy PBC, która jest skrócona zarówno na ko ncu aminowym jak i karboksy- lowym (PBC-NT-CT) i swi nskiej urykazy zawieraj acej mutacje R291K i T301S (urykaza PKS), w po- równaniu z sekwencjami swi nsk a i pawiana. Fig. 7 przedstawia aktywno sc urykazy w surowicy myszy w 24 godziny po podaniu ka zdego z czterech lub pi eciu dootrzewnowych zastrzyków urykazy PBC zmodyfikowanej PEG, w stosunku do warto sci uzyskanej w 24 godziny po pierwszym zastrzyku. Fig. 8 przedstawia odwrotn a zale zno sc pomi edzy aktywno scia wstrzykni etej urykazy PBC zmo- dyfikowanej PEG w surowicy myszy z niedoborem urykazy i stezeniami kwasu moczowego w surowi- cy i moczu. Fig. 9 przedstawia zmniejszenie ciezko sci zaburzenia zag eszczania moczu u myszy z niedobo- rem urykazy (uox-/-), które by ly leczone urykaz a PBC zmodyfikowan a PEG. Fig. 10 przedstawia zmniejszenie ostro sci przebiegu zespo lu klebuszkowej moczówki prostej u myszy z niedoborem urykazy (uox-/-), które by ly leczone urykaz a PBC zmodyfikowan a PEG. Fig. 11 przedstawia zmniejszenie ostro sci przebiegu zespo lu nefropatii indukowanej przez kwas moczowy, co uwidoczniono przez mikroskopi e rezonansu magnetycznego, u myszy z niedoborem urykazy (uox-/-), które by ly leczone urykaz a PBC zmodyfikowan a PEG. Fig. 12 przedstawia przyspieszone usuwanie z krazenia myszy BALB/c wstrzykni etego oktame- ru urykazy PBC w porównaniu z tetramerem, gdzie oba by ly zwi azane z 5-6 10 kDa la ncuchami PEG na podjednostk e. Szczegó lowy opis Obecny wynalazek dostarcza udoskonalonych koniugatów rozpuszczalnych w wodzie polime- rów, korzystnie poli(glikoli etylenowych) lub poli(tlenków etylenu) z urykazami. Koniugaty te s a zasad- niczo nieimmunogenne i zachowuj a co najmniej 75%, korzystnie 85% i najkorzystniej 95% lub wi eksz a aktywnosc rozk ladania kwasu moczowego niezmodyfikowanego enzymu. Urykazy u zyteczne do ko- niugowania z rozpuszczalnymi w wodzie polimerami obejmuj a naturalnie wyst epuj ace oksydazy mo- czanowe izolowane z bakterii, grzybów i tkanek ro slin i zwierz at, zarówno kr egowców jak i bezkr egow- ców, jak równie z rekombinowane postacie urykazy, lacznie ze zmutowanymi, hybrydowymi i/lub skró- conymi enzymatycznie aktywnymi wariantami urykazy. Rozpuszczalne w wodzie polimery obejmuj a liniowe i rozga lezione poli(glikole etylenowe) lub poli(tlenki etylenu), wszystkie powszechnie znane jako PEG. Przyk lady rozga lezionych PEG s a przedmiotem patentu U.S. 5643575. Przyk ladem linio- wego PEG jest monometoksyPEG o ogólnym wzorze CH 3 O-(CH 2 CH 2 O) n H, w którym n przyjmuje war- tosc od oko lo 100 do oko lo 2300. Jedn a z korzystnych ssaczych urykaz jest rekombinowana chimerowa urykaza swinia-pawian, zbudowana z cz esci sekwencji urykazy z w atroby swini i urykazy z w atroby pawiana, z których obie po raz pierwszy zosta ly okre slone przez Wu i wsp., (1989). Jeden przyk lad takiej chimerowej urykazy zawiera pierwsze 225 aminokwasów z sekwencji urykazy swini (SEK NR ID: 1) i ostatnie 79 amino- kwasów z sekwencji urykazy pawiana (SEK NR ID: 2) (urykaza swinia-pawian lub urykaza PBC; patrz fig. 6). Kolejny przyk lad takiej chimerowej urykazy zawiera reszty 7-225 sekwencji swini (SEK NR ID: 1) i reszty 226-301 z sekwencji pawiana (SEK NR ID: 2); jest ona równowa znikiem urykazy PBC, któraPL 203 492 B1 9 jest skrócona zarówno na aminowym, jak i karboksylowym ko ncu (PBC-NT-CT; patrz fig. 6). Kolejny przyk lad takiej chimerowej urykazy zawiera pierwsze 288 aminokwasów z sekwencji swini (SEK NR ID: 1) i ostatnie 16 aminokwasów z sekwencji pawiana (SEK NR ID: 2). Poniewa z ta ostatnia sekwen- cja ró zni si e od sekwencji swi nskiej tylko w dwóch pozycjach - z lizyn a (K) zamiast argininy w pozycji 291 oraz seryn a (S) zamiast treoniny w pozycji 301, mutant ten jest okre slony jako swinia-K-S lub urykaza PKS. Ka zda z urykaz PKS, PBC i PBC-NT-CT posiada jedn a lizyn e wi ecej, a co za tym idzie jedno wi ecej potencjalne miejsce modyfikacji przez PEG, ni z zarówno sekwencja swi nska jak i pawiana. Sekwencje cDNA dla ró znych ssaczych urykaz, w lacznie z urykaz a PBC, urykaz a PKS i rekombi- nowana urykaz a typu urykazy pawiana, zosta ly sklonowane, a optymalne warunki dla ekspresji w E. coli okre slono standardowymi metodami. Patrz Erlich, HA, (red.) (1989) PCR Technology. Principles and Applications for DNA Amplification, Nowy Jork: Stockton Press; Sambrook, J, i wsp., (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Rekombinowane urykazy ekstrahowano i oczyszczano, a ich stabilno sc i aktywno sc oznaczano przy pomocy zmodyfikowanych i standartowych testów. Patrz Fridovich, I, (1965) J Biol Chem 240:2491- -2494; Nishimura i wsp., (1979) oraz Przyk lad 1. Urykaza mo ze by c skoniugowana za po srednictwem biologicznie stabilnego, nietoksycznego, kowalencyjnego wi azania ze wzgl ednie niewielk a liczb a la ncuchów PEG. Wi azania takie mog a obejmowa c wi azania uretanowe (karbaminianowe), drugorz edowe wi aza- nia aminowe i wi azania amidowe. Ró znorodne aktywowane PEG stosowne dla tego rodzaju koniuga- cji s a dost epne na rynku z Shearwater Polymers, Hundsville, AL. Przyk ladowo, wi azania uretanowe z urykaz a mog a by c wytworzone przez inkubacj e urykazy w obecno sci pochodnych PEG modyfikowanych w eglanem sukcynoimidylowym (SC) lub w eglanem 4-nitrofenylowym (NPC). SC-PEG mo ze by c syntetyzowany z zastosowaniem procedury opisanej w Patencie U.S. 5612460, który jest w laczony tu na drodze odniesienia. NPC-PEG mo ze by c zsynte- tyzowany przez reakcj e PEG z chloromrówczanem 4-nitrofenylu zgodnie ze sposobami opisanymi w Veronese, FM, i wsp., (1985) Appl Biochem Biotechnol 11:141-152 i w Patencie U.S. 5286637, któ- re s a w laczone niniejszym na drodze odniesienia. Sposoby opisane w patencie '637 s a przystosowa- ne dla PEG o wi ekszej masie cz asteczkowej przez dopasowanie st eze n reagentów, aby zachowa c podobn a stechiometri e. Alternatywnie sposób syntezy NPC-PEG jest opisany przez Biittner, W, i wsp. we wschodnioniemieckim opisie patentowym DD 279 486 A1. Wi azania amidowe z urykaz a mog a by c uzyskane z zastosowaniem estru N-hydroksysukcyno- imidowego pochodnej karboksylowej PEG (Shearwater Polymers). Drugorz edowe wi azania amidowe mog a by c utworzone z zastosowaniem 2,2,2-trifluoroetanosulfonylu PEG (tresyl PEG; Shearwater Polymers) lub przez redukcyjn a alkilacj e z zastosowaniem aldehydu PEG (Shearwater Polymers) i cyjanoborowodorku sodu. W koniugatach zawieraj acych PEG o masie cz asteczkowej pomi edzy 5 kDa i 30 kDa, maksy- malna liczba lancuchów PEG, która zosta la przy laczona do podjednostki, przy zachowaniu co naj- mniej 75% aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego niezmodyfikowanego enzymu, zawiera la si e w zakresie od srednio dwóch la ncuchów dla urykazy z soi do ponad 10 la ncuchów dla urykazy PBC (patrz warunki testów w przyk ladzie 1 i wyniki na fig 1A - 5B), przy czym górna granica tego zakresu PEGylacji odpowiada oko lo jednej trzeciej wszystkich grup aminowych. W jednej postaci wykonania wynalazku srednia liczba la ncuchów PEG, które mog a by c przy laczone do podjednostki urykazy wy- nosi od 2 do 10. W korzystnej postaci srednia liczba zwi azanych lancuchów PEG na podjednostk e urykazy wynosi pomi edzy 3 i 8. W korzystniejszej postaci srednia liczba kowalencyjnie przy laczonych lancuchów PEG na podjednostk e urykazy zawarta jest pomi edzy 4 i 6. W kolejnej postaci wykonania masa cz asteczkowa PEG stosowanego w reakcji sprz egania wynosi pomi edzy 5 kDa i 100 kDa, korzystnie pomi edzy 10 kDa i 60 kDa, a korzystniej pomi edzy 20 kDa i 40 kDa, i wynosi przyk ladowo 30 kDa. Istnieje kilka czynników, które mog a wp lywa c na wybór optymalnej masy cz asteczkowej i liczby lancuchów PEG do przy laczenia do danej postaci urykazy. Ogólnie ograniczenie lub wyeliminowanie immunogenno sci bez zasadniczej utraty aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego mo ze wymaga c przy laczenia stosunkowo wi ekszej ilo sci lancuchów PEG o ni zszej masie cz asteczkowej, w porówna- niu do stosunkowo mniejszej liczby la ncuchów PEG o wy zszej masie cz asteczkowej. Przyk ladowo, zarówno 6 la ncuchów 20 kDa PEG na podjednostk e lub 4 la ncuchów 30 kDa PEG na podjednostk e mo ze by c optymalnie skuteczna. Podobnie, ka zda inna posta c urykazy mo ze miec inne optimum w odniesieniu do wielko sci i liczby lancuchów. Patrz fig. 1A - 5B.PL 203 492 B1 10 Koniugacja z PEG czyni wszystkie badane urykazy rozpuszczalnymi i trwa lymi w buforach o fizjo- logicznym pH, bez konieczno sci dodania analogu substratu lub inhibitora, takiego jak 8-azaksantyna, który jest stosowany jako stabilizator dla grzybowej urykazy (Uricozyme®) wprowadzanej na rynek przez Sanofi Winthrop we Francji i W loszech. Dwa ró zne koniugaty urykazy PBC, jeden zawieraj acy oko lo sze sciu 10 kDa lancuchów PEG na podjednostk e i drugi zawieraj acy oko lo dwóch 19 kDa la n- cuchów PEG na podjednostk e, zachowuj a znacz ac a aktywno sc po inkubacji w mysiej surowicy przez ponad miesi ac w 37°C. Dodatkowo szereg koniugatów wed lug wynalazku posiada pó lokres krazenia u myszy wi ekszy ni z dwa dni w przeciwie nstwie do oko lo 8 lub 24 godzinnego pó lokresu trwania, o którym wcze sniej donoszono dla modyfikowanych PEG urykaz ssaczych i z mikroorganizmów. Chen i wsp., (1981); Fuertges, F, i wsp., (1990) J Contr Release 11: 139-148; Fujita, T, i wsp., (1991) J Pharmacobiodyn 14: 623-629. D lu zszy pó lokres trwania wstrzykiwanych leków bia lkowych czyni je bardziej efektywnymi cenowo i mo ze sprzyja c stosowaniu si e pacjenta do wskazówek przyjmowania leku. Wyd lu zony pólokres trwania jest równie z charakterystyczny dla produktów, które s a lepiej tole- rowane przez organizm. Gdy koniugaty PEG z urykaz a PBC by ly przygotowane z oczyszczonej tetramerycznej postaci enzymu (4 podjednostki 35 kDa), wykazywa ly one u myszy znaczaco ograniczon a immunogenno sc (fig. 7), w przeciwie nstwie do przeci etnej immunogenno sci koniugatów PEG z wi ekszymi postaciami enzymów (np. oktamerami 35 kDa podjednostek; patrz fig. 12) i do bardzo wysokiej immunogenno sci niezmodyfikowanego enzymu. Powtarzane nastrzykiwanie myszy z niedoborem urykazy urykaz a-PEG wed lug wynalazku, wyklucza ich hiperurykemi e na wi ecej ni z dwa miesi ace i chroni struktur e i funkcj e ich nerek przed uszkodzeniami spowodowanymi kwasem moczowym (fig. 8 - 11). Wstrzykni ecie ca lkowicie aktywnych koniugatów PBC urykazy z PEG 10 kDa (fig. 3A - 3B) dra- matycznie ogranicza hiperurykemi e u homozygotycznych myszy z niedoborem urykazy (fig. 8). Rów- nie z dramatycznej redukcji uleg l poziom kwasu moczowego w moczu u wszystkich myszy z niedobo- rem urykazy, które by ly poddane dzia laniu urykazy PBC zmodyfikowanej PEG. Myszy z niedoborem urykazy otrzyma ly seri e zastrzyków z preparatu urykazy-PEG podobn a do stosowanej w celu uzyska- nia wyników z fig. 8. Takie leczenie ogranicza ci ezkosc zaburzenia zag eszczania moczu, co przed- stawiono przez pomiar osmolalno sci moczu, w normalnych warunkach i po 12 godzinnym okresie niepodawania wody (fig. 9) oraz przez okre slenie konsumpcji wody i wydalania moczu (fig. 10), w porównaniu do równoleg lego pomiaru dokonanego na nieleczonych, genetycznie podobnych my- szach. Pokazano równie z, ze 10 tygodniowy okres leczenia, poczynaj ac od pierwszych 10 dni zycia, homozygotycznych myszy z niedoborem urykazy w wyniku „nokautu” genowego (uox -/-), przy pomo- cy urykazy-PEG wed lug wynalazku, zmniejsza ostro sc indukowanych moczanem uszkodze n struktury nerki, co uwidoczniono przez mikroskopi e rezonansu magnetycznego (fig. 11). Metody mikroskopowe zostaly omówione w Hedlund, LW, i wsp., (1991) Fund Appl Toxicol 16: 787-797; Johnson, GA, i wsp., (1992) w JC Gore (red.), Reviews of Magnetic Resonance in Medicine, tom 4 (str. 187-219) Nowy Jork: Pergamon Press. Oczyszczone preparaty naturalnej i zrekombinowanej urykazy zawieraj a zazwyczaj, poza po- staci a tetrameryczn a (140 kDa), mieszanin e agregatów enzymu. Procent zawarto sci formy tetrame- rycznej w ka zdym z preparatów urykazy ogólnie waha si e od oko lo 20% do 90%. Pomimo danych, ze niezmodyfikowane PEG agregaty szeregu innych bia lek s a wysoce immunogenne (patrz np., Moore, WV, i wsp., (1980) J Clin Endocrinol Metab 51: 691-697), wcze sniejsze badania urykazy-PEG nie wykaza ly jakichkolwiek ogranicze n w zawarto sci agregatów, co sugeruje, ze nie by la rozwa zana po- tencjalna immunogenno sc agregatów zmodyfikowanych PEG. Na podstawie obserwacji twórców wy- nalazku wydaje si e prawdopodobnym, ze takie agregaty by ly obecne w preparatach enzymu u zytych we wcze sniejszych syntezach urykazy-PEG. Ich obecno sc utrudnia la wytworzenie nieimmunogennych koniugatów. Wydaje si e równie z, ze znaczna utrata aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego ob- serwowana we wcze sniejszych próbach modyfikowania urykazy PEG by ly zwi azane z du za liczb a przy laczanych lancuchów PEG o niskiej masie cz asteczkowej. Z drugiej strony opisany niniejszym sposób oczyszczania urykazy i sposób PEGylacji pozwalaj a na kowalencyjne przy laczenie a z dziesi e- ciu la ncuchów PEG do podjednostki przy jednoczesnym zachowaniu ponad 75% aktywno sci rozk la- dania kwasu moczowego, co najmniej dla okre slonych urykaz np., chimerowej urykazy swinia-pawian i enzymu z A. flavus (patrz fig. 3A i 4A). W korzystnej postaci zasadniczo wszystkie agregaty formy tetramerycznej enzymu mog a by c usuni ete przez chromatografi e jonowymienn a lub wykluczania zale znego od wielko sci cz asteczek przy pH pomi edzy oko lo 9 i 10,5, korzystnie 10,2 przed koniugacj a z PEG, co daje preparat urykazy z lo zonyPL 203 492 B1 11 zasadniczo z tetramerów. Masa molekularna urykazy w ka zdej frakcji z preparatywnej kolumny mo ze by c monitorowana przy pomocy technik analitycznych ró znicuj acych pod wzgl edem wielko sci, w tym przyk ladowo HPLC, tradycyjnej chromatografii wykluczania zale znego od wielko sci cz asteczek, wiro- wania, rozpraszania swiat la, elektroforezy kapilarnej lub elektroforezy zelowej w buforze niedenatury- zuj acym. Podczas izolacji tetramerycznej urykazy przy pomocy chromatografii wykluczania zale znego od wielko sci cz asteczek jedynie frakcje zawieraj ace posta c enzymu 140 kDa mog a by c laczone i sto- sowane do koniugacji z PEG. W przypadku tetramerycznych postaci urykazy izolowanych przez chromatografi e jonowymienn a frakcje z kolumny jonowymiennej mog a by c analizowane pod k atem wielko sci, w celu okre slenia, która z frakcji zawiera istotn a ilo sc postaci tetramerycznej bez wykrywal- nych ilo sci agregatów. W takich po laczonych frakcjach urykazy co najmniej 90% mo ze by c w postaci tetramerycznej; w ten sposób niepo zadane agregaty mog a stanowi c jedynie tak niewiele, jak 10%, 5%, 2% lub mniej ca lkowitej, wyizolowanej urykazy. Przedstawione tu wyniki wskazuj a, ze wi eksze ni z tetrameryczne postaci urykazy PBC, nawet modyfikowane PEG w du zym stopniu, s a wysoce immunogenne u myszy (fig. 12). Ponadto, u myszy, które by ly raz nastrzykni ete koniugatami PEG agregatów urykazy, aktywno sc rozk ladania kwasu mo- czowego po kolejnym nastrzykni eciu zarówno modyfikowanymi PEG tetramerami lub modyfikowanymi PEG agregatami by la gwa ltownie usuwana z uk ladu kr azenia. Przeciwnie, koniugaty przygotowane z urykazy zawieraj acej mniej ni z 5% agregatów mog ly by c wstrzykiwane wielokrotnie bez jakiegokol- wiek zwi ekszenia szybko sci ich usuwania (fig. 7) i bez wykrywalnego tworzenia przeciwcia l, co zmie- rzono przez czu ly test immunoenzymatyczny. Zastosowanie wysoko oczyszczonej tetramerycznej urykazy wyró znia dodatkowo koniugaty wed lug wynalazku spo sród wcze sniej znanych preparatów urykazy-PEG. Obecno sc znacz acej cz esci (np. wi ecej ni z 10%) agregatów w preparatach urykazy stosowanych we wcze sniejszych badaniach mo ze prowadzi c do przy laczenia do nich du zej liczby lancuchów PEG, w celu zahamowania immunogenno sci. W konsekwencji zasadniczemu zmniejszeniu ulega la aktywnosc enzymatyczna uzyskiwanych koniugatów. Niniejszym opisane zosta ly równie z ury- kazy zmodyfikowane PEG w nietetramerycznych postaciach, takich jak przyk ladowo dimery urykazy, przy czym preparaty takich koniugatów urykazy zachowuj a co najmniej oko lo 75% aktywno sci rozk la- dania kwasu moczowego i s a zasadniczo nieimmunogenne. Zmieniona przez mutacj e urykaza z w atroby pawiana wykazuje nieoczekiwanie zwi ekszon a ak- tywnosc wzgl edem niezmutowanego enzymu. Taka ulepszona urykaza z naczelnego zosta la przygo- towana tradycyjnymi technikami rekombinacji DNA. Szczególnie nieoczekiwanym by lo to, ze podsta- wienie pojedynczego aminokwasu (histydyny za tyrozyn e w pozycji 97) w urykazie pawiana daje w wyniku zasadnicze zwi ekszenie specyficznej aktywno sci enzymatycznej. Gdy to zmienione przez mutacje bia lko jest wyra zane w E. coli wykazuje o co najmniej 60% wy zsz a aktywno sc enzymatyczn a, ni z rekombinowany enzym pawiana, od którego pochodzi. Aktywno sc specyficzna jest zwi ekszana i/lub rozpuszczalno sc niemodyfikowanego PEG enzy- mu jest poprawiona przez ekspresj e skróconych wariantów swi nskiej lub chimerowej urykazy swinia- pawian, z której co najmniej 6 pierwszych aminokwasów z ko nca aminowego i/lub co najmniej 3 ami- nokwasy z ko nca karboksylowego s a usuni ete z wyra zanego bia lka (patrz fig. 6). Rekombinowana urykaza skrócona na ko ncu karboksylowym mo ze by c lepiej rozpuszczalna przed modyfikacj a PEG, poniewa z usuwana jest sekwencja nakierowywuj aca na peroksysomy. Patrz Miura, S, i wsp., (1994) Eur J Biochem223: 141-146. Koniugaty urykaza-PEG wed lug wynalazku s a u zyteczne do obni zania poziomu kwasu moczo- wego w p lynach cia la i tkankach ssaków, korzystnie ludzi, i co za tym idzie mog a by c stosowane do leczenia podwy zszonego poziomu kwasu moczowego zwi azanego ze stanami obejmuj acymi skaz e moczanow a guzki dnawe, niewydolno sc nerek, przeszczep organu i choroby o charakterze z losliwym. Koniugaty urykaza-PEG mog a by c wstrzykni ete ssakowi z podwy zszonym poziomem kwasu moczo- wego jak akolwiek z dróg podania, w tym drog a do zyln a podskórn a sródskórn a domiesniow a i do- otrzewnow a. Alternatywnie, mog a by c one rozpylone i inhalowane. Patrz Patton, JS, (1996) Adv Drug Delivery Rev 19:3-36 i Patent U.S. 5458135. Skuteczna dawka urykazy-PEG wed lug niniejszego wy- nalazku b edzie zale za la od poziomu kwasu moczowego i wielko sci osobnika. Koniugat urykaza-PEG jest podawana z farmaceutycznie dopuszczaln a zaróbk a lub rozcie nczalnikiem w ilo sci od oko lo 10 µg do okolo 1 g, korzystnie od 100 µg do 500 mg, a korzystniej w ilo sci od 1 mg do 100 mg, na przyk lad, w ilo sci 5 mg, 20 mg lub 50 mg. Podane powy zej dawki odnosz a si e do ilo sci bia lka w koniugacie. Preparaty farmaceutyczne zawieraj ace urykaz e-PEG mog a by c przygotowane tradycyjnymi technikami np. jak to opisano w Gennaro, AR (red.) (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18PL 203 492 B1 12 wydanie, Easton, PA: Mack Publishing Co. U zyteczne zarobki do przygotowania nadaj acego si e do wstrzykniecia roztworu obejmuj a przyk ladowo buforowany fosforanem roztwór soli, roztwór Ringera z dodatkiem mleczanów, wod e, poliole oraz glicerol. Farmaceutyczna kompozycja do podania do- otrzewnowego obejmuje farmaceutycznie dopuszczalne, sterylne, wodne lub niewodne ciecze, dys- persje, zawiesiny lub emulsje, jak równie z ja lowe pudry do rekonstytucji, bezpo srednio przez u zyciem, do postaci ja lowych, nadaj acych si e do wstrzykniecia roztworów lub dyspersji. Takie preparaty mog a zawiera c dodatkowe sk ladniki, takie jak przyk ladowo srodki konserwuj ace, substancje u latwiaj ace rozpuszczanie, substancje stabilizuj ace, czynniki zwil zaj ace, emulgatory, bufory, przeciwutleniacze i rozcie nczalniki. Urykaza-PEG mo ze by c równie z dostarczona jako kompozycja uwalniana w sposób kontrolo- wany do wszczepienia osobnikowi celem ci ag lego kontrolowania podwy zszonego poziomu kwasu moczowego w p lynach cia la. Polikwas mlekowy, polikwas glikolowy, regenerowany kolagen, poli-L- -lizyna, alginian sodu, guma gellan, chitozan, agaroza, wielolamelarne liposomy i inne konwencjonal- ne preparaty typu depot obejmuj ace materia ly ulegaj ace bioerozji lub biodegradacji mog a by c, przy- k ladowo, sformu lowane z biologicznie aktywnymi kompozycjami. Materia ly te, gdy wszczepione lub wstrzykniete stopniowo rozpadaj a si e i uwalniaj a do otaczaj acych je tkanek aktywny materia l. Przyk la- dowo, jeden sposób enkapsulacji urykazy-PEG obejmuje sposób ujawniony w Patencie U.S. 5653974, który jest w laczony niniejszym na drodze odniesienia. Zastosowanie preparatów ulegaj acych bioerozji i biodegradacji oraz innych typu depot jest szczególnie korzystne do podawania koniugatów. W celu dostarczenia urykazy-PEG korzystne jest zastosowanie pomp infuzyjnych i uk ladów do zatrzymywania w macierzy (ang. matrix entrapment system). PEG-urykaza mo ze równie z by c zamkni eta w micelach lub liposomach. Technologia enkapsulacji w liposomach jest dobrze znana w dziedzinie. Patrz np. Lasic, D, i wsp., (red.) (1995) Stealth Liposomes, Boca Raton, FL: CRC Press. Kompozycje farmaceutyczne urykazy-PEG wed lug wynalazku, b ed a zmniejsza ly potrzeb e he- modializy u pacjentów o wysokim ryzyku indukowanej moczanami niewydolno sci nerek np. u biorcy przeszczepu narz adu (patrz Venkataseshan, VS, i wsp., (1990) Nephron 56: 317-321) i pacjentów z pewnymi chorobami o charakterze z lo sliwym. U pacjentów ze znacznym nagromadzeniem krysta- licznego moczanu (guzki dnawe), takie kompozycje farmaceutyczne b ed a poprawia ly jakosc zycia szybciej ni z obecnie dost epne sposoby leczenia. Poni zsze przyk lady, które nie zosta ly skonstruowane, aby w jakikolwiek sposób ogranicza c wy- nalazek, ilustruj a ró zne aspekty powy zszego ujawnienia. Przyk lady te opisuj a urykazy-PEG wytworzo- ne przez aktywowane sprz eganie (np. elektrofilowe) pochodnych PEG o ró znych wielko sciach i sk la- dzie z wyst epuj acymi naturalnie urykazami - swi nsk a grzybow a lub bakteryjn a lub ze zrekombinowa- nymi urykazami - sojow a swi nsk a lub chimerowa swinia-pawian. Przedstawiono wyniki bada n nad aktywno scia rozpuszczalno sci a i stabilno sci a oraz bada n farmakokinetycznych, farmakodynamicznych i immunologicznych. Dane z fig. 8 - 11 potwierdzaj a zdolno sc urykazy PBC modyfikowanej PEG do zmniejszenia hiperurykemii i hiperurykozurii oraz do ochrony struktury i funkcji nerek w modelu zwie- rz ecym, w którym hiperurykemia i hiperurykozuria wyst epuj a powoduj ac powa zne uszkodzenie nerek. Wu, X, i wsp., (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91: 742-746. Przyk lady te dostarczaj a wskazówek oso- bie o przeci etnych umiej etno sciach, jak wytworzy c zasadniczo nieimmunogenne koniugaty urykazy, które zachowuj a, co najmniej oko lo 75% aktywno sci rozk ladania kwasu moczowego niezmodyfikowa- nego enzymu. P r z y k l a d 1 Oczyszczanie tetramerycznej postaci urykazy Tetrameryczn a posta c urykazy (masa cz asteczkowa oko lo 140 kDa) zosta la oczyszczona z roz- tworu urykazy z w atroby swini przez preparatywn a chromatografi e wykluczania zale znego od wielko- sci cz asteczek lub jonowymienn a a nast epnie analityczn a chromatografi e wykluczania zale znego od wielko sci cz asteczek. Urykaza z w atroby swini zosta la otrzymana z Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, nr katalogowy U3250 lub U3377 lub z Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN. Preparatywn a i analityczna chromatografia wykluczania zale znego od wielko sci cz asteczek by la prowadzona przy pH 10-10,5, korzystnie 10,2, w 10 mM buforze w eglanu sodu zawieraj acym 0,1 M NaCl na kolumnach Superdex 200, które wcze sniej kalibrowano bia lkiem o znanej masie cz asteczko- wej. Superdex otrzymano z Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ. U zyty mo ze by c jakikolwiek bufor, który mo ze utrzyma c po zadane pH i który jest zgodny ze srodowiskiem reakcji chemicznej, która na- st epnie b edzie stosowana do przy laczenia PEG. Bufory takie s a dobrze znane w dziedzinie. Absor- bancj e w ultrafiolecie eluatu z preparatywnej kolumny monitorowano przy 280 nm i zawieraj ace urykaz ePL 203 492 B1 13 frakcje odpowiadaj ace masie cz asteczkowej po zadanej formy tetramerycznej i wolne od indywiduów o wysokiej masie cz asteczkowej zbierano w celu zastosowania w syntezie zasadniczo nieimmuno- gennej urykazy-PEG, jak to opisano w przyk ladzie 2. Alternatywnie tetrameryczne postacie urykazy mog a by c izolowane za pomoc a innych z ló z, na których rozdzia l zachodzi z uwagi na wielko sc cz a- steczkow a takich jak przyk ladowo Superose 12, (Amersham Pharmacia) lub jakiegokolwiek innego z lo za, które jest odpowiednie dla lagodnie alkalicznego roztworu i wykazuje odpowiedni zakres frak- cjonowania wed lug wielko sci. Z loza takie s a dost epne od r eki i s a dobrze znane w dziedzinie. Chromatografia jonowymienna by la prowadzona przy pH 10 - 10,5, korzystnie 10,2 na kolum- nach Mono Q (Amersham Pharmacia, Piscataway NJ), które równowa zono 0,1 M buforem w eglanu sodu. Stosowany mo ze by c jakikolwiek bufor, który jest zgodny ze srodowiskiem reakcji sprz egania PEG, mo ze utrzyma c pozadane pH i by c stosowany przy dostatecznie niskiej sile jonowej pozwalaj a- cej na adsorpcj e urykazy na kolumnie. Bufory takie s a dobrze znane w dziedzinie. Absorbancj e eluatu w ultrafiolecie monitorowano przy 280 nm podczas elucji urykazy z zywicy jonowymiennej przez zwi ekszanie si ly jonowej nanoszonego roztworu buforu, np. stosuj ac liniowy gradient 0-0,5 M NaCl w buforze w eglanu sodu. Nast epnie stosowano HPLC wykluczania zale znego od wielko sci cz asteczek w celu identyfikacji w eluacie frakcji zawieraj acych pozadan a tetrameryczn a posta c urykazy bez wy- krywalnych agregatów, do syntezy zasadniczo nieimmunogennej urykazy-PEG. Alternatywnie tetra- meryczn a posta c urykazy mo ze by c wyizolowana przy pomocy innego no snika b ed acego wymienia- czem jonowym, takiego jak Q-Sepharose (Amersham Pharmacia) lub któregokolwiek innego no snika, który jest odpowiedni dla lekko alkalicznych roztworów. No sniki takie s a dost epne od r eki i dobrze znane w dziedzinie. Aktywno sc urykazy oznaczono stosuj ac modyfikacj e standartowej metody. Patrz, np. Fridovich (1965); Nishimura i wsp., (1979). Codziennie swie zo przygotowywano roztwory kwasu moczowego w 50 mM buforze boranu sodu, pH 9,2, tak aby uzyska c stezenia do oznacze n 6 - 150 µM. Preparaty urykazy rozpuszczano w buforze boranowym zawieraj acym albumin e surowicy bydl ecej (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, nr katalogowy A-7030), tak, ze w oznaczeniu ko ncowe st ezenie albuminy wy- nosi lo 0,1 mg/ml. Po wymieszaniu ró znych rozcie ncze n enzymu ze substratem w studzienkach p lytki do mikromiareczkowania w czytniku do p lytek, poziom zaniku kwasu moczowego w 25°C sledzono przy 292 nm co 4 sekundy przez 3 minuty. Z próbek dla których w ci agu 3 minut przekszta lconych zostalo pomi edzy 10% i 40% substratu, przynajmniej 20 punktów informatywnych u zyto w celu obli- czenia maksymalnej szybko sci zaniku absorbancji na minut e. Jedna jednostka mi edzynarodowa (IU) aktywno sci urykazy jest definiowana jako ilosc enzymu, która zu zywa jeden mikromol kwasu moczo- wego w ci agu jednej minuty; aktywnosc specyficzna jest wyra zona jako IU/mg bia lka. Pewne dane dla wzgl ednej aktywno sci urykazy podane na fig. 1A - 5B zosta ly uzyskane w oznaczeniu z 100 µM kwa- sem moczowym. Inne wyniki dla szybko sci przy 100 µM kwasie moczowym (V 100 ) zosta ly obliczone z warto sci sta lej Michaelisa (K M ) i maksymalnej szybko sci (V M ) dla reprezentatywnych preparatów enzymu, przy zastosowania wzoru: V 100 = 100 x V max /( KM + 100) w którym K M jest wyra zona w jednostkach mikromolarnych. P r z y k l a d 2 Przy laczanie PEG do tetramerycznej urykazy swini Do roztworu tetramerycznej urykazy w 0,1 M buforze w eglanu sodu pH 10,2, dodano 10 - 200 moli aktywowanej pochodnej monometoksyPEG. np. w eglanu 4-nitrofenylu (NPC-PEG) o ró znych wielko sciach (5 kDa do 30 kDa) na ka zdy mol podjednostki urykazy (masa cz asteczkowa 35 kDa). Te i inne u zytecznie aktywowane PEG s a dost epne z Shearwater Polymers. Instrukcje dotycz ace przy laczania PEG do bia lek podano w katalogu Shearwater Polymers w Internecie na stronie www.swpolymers.com i w JM Harris i wsp., (red.) (1997) Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications. ACS Symposium Series 680, Waszyngton DC: American Chemical Society. Reakcja przy laczania przebiega la w 0 - 8°C, a z do momentu, kiedy zakres sprz egania PEG nie zmienia l si e znacz aco w czasie. Nieprzereagowany PEG oddzielano od produktów reakcji przez chromatografi e i/lub ultrafiltrowanie. Liczb e lancuchów przy laczonych do podjednostki urykazy okre slano stosujac dostosowan a me- tod e opisan a przez Kunitani, M, i wsp., (1991) J Chromatogr 588:125-137; Saifer i wsp., (1997) i Sherman i wsp., (1997). Pokrótce, próbki PEGylacyjnej mieszaniny reakcyjnej lub frakcje z prepara- tywnej chromatografii jonowymiennej lub wykluczania zale znego od wielko sci cz asteczek, charaktery- zowano przez analityczny HPLC wykluczania zale znego od wielko sci cz asteczek na kolumnie TSK 5000 PW XL w temperaturze pokojowej w 10 mM buforze w eglanu sodu, pH 10,2, zawieraj acym 0,1 MPL 203 492 B1 14 NaCl. Kolumn e HPLC otrzymano z TosoHaas, Montgomeryville, PA. Bia lka i PEG monitorowano z zastosowaniem detektorów absorbancji w ultrafiolecie i wspó lczynnika za lamania swiat la. Ilo sc bia l- ka w koniugacie obliczano na podstawie absorbancji w ultrafiolecie wzgl edem absorbancji odpowied- niego standardu niezmodyfikowanej urykazy. Ilo sc PEG w koniugacie obliczano na podstawie po- wierzchni piku wspó lczynnika za lamania swiat la, skorygowanego o wk lad bia lka do wspó lczynnika za lamania swiat la, wzgl edem powierzchni piku wspó lczynnika za lamania swiat la dla standardu odpo- wiedniego PEG. Fig. 2A przedstawia zachowanie aktywno sci urykazy z w atroby swini modyfikowanej PEG w funkcji liczby lancuchów PEG przy laczonych na podjednostk e. Dane otrzymane przez twórców wy- nalazku ( ?, ?) s a porównane z danymi Chen i wsp., (1981). Dane w du zych okr egach odnosz a si e do koniugatów, dla których Chen i wsp., (1981) donosili, ze s a nieimmunogenne. Jak przedstawiono na fig. 2A, koniugaty tetramerycznej urykazy swi nskiej z maksymalnie sze scioma 30 kDa la ncuchami PEG na podjednostk e lub maksymalnie siedmioma 5 kDa la ncuchami PEG na podjednostk e zacho- wuj a przynajmniej 75% aktywno sci niezmodyfikowanego enzymu. Obserwowany wzrost aktywno sci specyficznej wraz ze zwi ekszaj ac a si e liczb a lancuchów 5 kDa lub 30 kDa PEG (a z do oko lo 4 la ncu- chów na podjednostk e) mo ze odpowiada c wzgl ednej nierozpuszczalno sci lub niestabilno sci niezmo- dyfikowanego enzymu, w porównaniu z koniugatami. Jak przedstawiono na fig. 2B, koniugaty urykazy swini srednio z wi ecej ni z trzema 30 kDa lancuchami PEG na podjednostk e wykazuj a wi eksz a mas e PEG ni z, jak to stwierdzi l Chen i wsp., (1981), jest potrzebne, aby wystarczaj aco zapobiec immunore- aktywno sci. P r z y k l a d 3 W la sciwo sci koniugatów PEG tetramerycznej zrekombinowanej urykazy PBC cDNA zrekombinowanej chimerowej urykazy swinia-pawian (PBC) subklonowano do wektora ekspresyjnego pET3d (Novagen, Madison, WI) i otrzymane konstrukty plazmidowe wprowadzano przez transformacj e do szczepu Escherichia coli PL21(DE3)pLysS (Novagen). Procedur e t a przepro- wadzono stosuj ac sposoby dobrze znane w dziedzinie biologii molekularnej. Patrz Erlich (1989); Sambrook i wsp., (1989); Ausubel, F, i wsp., (red.), (1997) Short Protocols in Molecular Biology, Nowy Jork: Wiley & Sons. Fig. 6 przedstawia wydedukowan a sekwencj e aminokwasow a urykazy PBC (aminokwasy 1-225 SEK NR ID: 1 i aminokwasy 226-304 SEK NR ID: 2) w porównaniu z sekwencj a swini (SEK NR ID: 1) i pawiana (SEK NR ID: 2). Pogrubion a czcionk a wskazano aminokwasy w sekwencji pawiana, które s a inne ni z w sekwencji swini. Sekwencje swi nska i z pawiana po raz pierwszy zosta ly okre slone przez Wu, i wsp., (1989) i zosta ly potwierdzone przez twórców wynalazku. SEK NR ID: 1 jest identyczna z sekwencj a z GenBank o numerze dost epu pl6164, z tym wyj atkiem, ze w sekwencji z GenBank brak jest pocz atkowej reszty metionylowej. SEK NR ID: 2 jest identyczna z sekwencj a dost epn a w Gen- Bank pod numerem dost epu p25689, z tym wyj atkiem, ze w sekwencji z GenBank nieobecna jest pocz atkowa reszta metionylowa, a histydyna w pozycji 153 jest zamieniona na treonin e (pozycja 154 na fig. 6). Izolowano tetrameryczn a posta c urykazy PBC i wi azano j a z PEG o ró znych masach cz asteczko- wych, jak to opisano w przyk ladach 1 i 2. Koniugaty przygotowane z PEG 5 kDa, 10 kDa, 19 kDa lub 30 kDa zawiera ly do 10 la ncuchów PEG na podjednostk e. Te przygotowane z PEG o masie 10 kDa za- chowywa ly ponad 95% wyj sciowej aktywno sci specyficznej zrekombinowanej urykazy (fig. 3A - 3B). Poni zsze w la sciwo sci koniugatów tetramerycznej urykazy PBC z oko lo 6 la ncuchami PEG na podjednostk e zilustrowano na podanych figurach.: brak immunogenno sci (fig. 7) i skutecznosc u my- szy z niedoborem urykazy w 1) poprawie hiperurykemii i hiperurykozurii (fig. 8); 2) zmniejszeniu ciez- ko sci zaburzenia zag eszczania moczu (fig. 9) i 3) zmniejszeniu ostro sci k lebuszkowej moczówki pro- stej (fig. 10). Dodatkowo urykaza-PEG zmniejsza ostro sc zale znego od kwasu moczowego uszkodze- nia nerek, co uwidoczniono przez mikroskopi e rezonansu magnetycznego (fig. 11). Fig. 7 przedstawia aktywno sc urykazy PBC w surowicy myszy w 24 godz. po ka zdym z czterech lub pi eciu dootrzewnowych zastrzyków z urykazy-PEG, wzgl edem warto sci otrzymanej w 24 godz. po pierwszym zastrzyku. Koniugaty PEG przygotowano z trzech ró znych preparatów urykazy PBC, stosu- jac dwie ró zne techniki aktywacji PEG. Jeden preparat ( ?) testowano na myszach z niedoborem ury- kazy (uox -/-); dwa inne ( ?, ¯) testowano na prawid lowych myszach BALB/c. Najbardziej immunoreak- tywny preparat ( ?) przygotowano z oczyszczonej urykazy PBC zawieraj acej nieokre slon a ilosc agre- gatów urykazy do których przy laczono srednio siedem 5 kDa lancuchów PEG na podjednostk e, stosu- jac pochodn a PEG modyfikowan a w eglanem sukcynoimidylowym (SC-PEG). Zalipsky, Patent U.S.PL 203 492 B1 15 5612460, w laczony niniejszym na drodze odniesienia. Srednio immunoreaktywne preparaty ( ¯) zosta- ly przygotowane przez przy laczenie do preparatu urykazy PBC, zawieraj acego 11% agregatów, sred- nio dwóch 19 kDa la ncuchów PEG na podjednostk e, z zastosowaniem pochodnej PEG modyfikowa- nej w eglanem 4-nitrofenylowym (NPC-PEG). Sherman i wsp., (1997). Najmniej immunoreaktywny koniugat ( ?) zosta l przygotowany przez przy laczenie srednio sze sciu 10 kDa la ncuchów NPC-PEG na podjednostk e do preparatu urykazy PBC zawieraj acego < 5% agregatów urykazy. Fig. 8 przedstawia odwrotnosc zale zno sci pomi edzy st ezeniem kwasu moczowego w surowicy i moczu i aktywno sci a wstrzykni etej urykazy-PEG, w surowicy myszy z niedoborem urykazy (uox -/-). Wstrzykiwano w czasie 0 i po 72 godz. 0,43 IU modyfikowanej PEG urykazy PBC sprz egni etej srednio z sze scioma 10 kDa lancuchami PEG na podjednostk e enzymu. Fig. 9 pokazuje, ze leczenie myszy z niedoborem urykazy z zastosowaniem urykazy PBC mo- dyfikowanej PEG zmniejsza lo ciezkosc zaburzenia zag eszczania moczu. Przedstawiono sredni a i odchylenie standardowe danych dla osmolalno sci moczu od dwóch myszy posiadaj acych po jednej kopii prawid lowego mysiego genu dla urykazy (uox +/-), sze sciu nieleczonych homozygotycznych myszy z niedoborem urykazy (uox -/-) i sze sciu homozygotycznych myszy z niedoborem urykazy, które nastrzykni eto dziesi eciokrotnie 95 albo 190 mlU urykazy-PEG pomi edzy trzecim i 72 dniem zy- cia. Myszy o ka zdym pod lo zu genetycznym albo otrzymywa ly wod e bez ogranicze n (s lupki lite) albo nie otrzymywa ly wody przez 12 godz. (s lupki kreskowane) przed zebraniem moczu. Fig. 10 pokazuje, ze leczenie myszy z niedoborem urykazy przy pomocy modyfikowanej PEG urykazy PBC zmniejsza lo ostro sc klebuszkowej moczówki prostej, charakteryzuj acej si e anormalnie wysok a konsumpcj a wody i anormalnie wysokim wydalaniem moczu. Pod lo ze genetyczne myszy i protokó l post epowania by ly takie same jak na fig. 9. Dla trzech grup z lo zonych z sze sciu myszy podano warto sci srednie i odchylenie standardowe dziennego spo zycia wody (s lupki lite) i oddawania moczu (s lupki kreskowane). Fig. 11 pokazuje, ze leczenie myszy z niedoborem urykazy przy pomocy zmodyfikowanej PEG urykazy PBC obni za ostro sc wywo lywanej kwasem moczowym nefropatii, co uwidoczniono przez mi- kroskopi e rezonansu magnetycznego. Pod lo ze genetyczne trzech grup myszy i protokó l leczenia by ly takie same jak na fig. 9 i 10. Mikroskopi e rezonansu magnetycznego przeprowadzono w Center for in vivo Microscopy, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina. Ponadto do wyników podsumowanych na fig. 8 - 11 wykazano, ze u wszystkich myszy z niedo- borem urykazy poziomy kwasu moczowego w moczu zmniejszy ly si e znacz aco po leczeniu urykaz a PBC zmodyfikowan a PEG. Fig. 12 pokazuje, ze w odró znieniu od zmodyfikowanej PEG tetramerycz- nej postaci urykazy PBC, posta c oktameryczna (masa cz asteczkowa = 280 kDa), nawet je sli silnie zmodyfikowana PEG, jest dla myszy immunogenna. W lasciwosc ta znajduje odbicie w przy spieszo- nym usuwaniu oktameru zmodyfikowanego PEG w ci agu 5 dni po pojedynczym wstrzykni eciu do- otrzewnowym. Te same myszy zosta ly ponownie nastrzykni ete tak a sam a dawk a preparatów urykazy- PEG w dniu 8 i 15-tym. W dwadzie scia cztery godziny po drugim nastrzykni eciu, w surowicy myszy nastrzykni etych zmodyfikowanym PEG oktamerem, nie wykrywalna by la aktywno sc rozk ladania kwa- su moczowego. Jednak ze aktywno sc ta by la latwa do wykrycia w surowicy tych myszy, które na- strzykni eto tetramerem modyfikowanym PEG. To ujawnienie w po laczeniu z przy spieszonym usuwa- niem zmodyfikowanego PEG oktameru, które obserwowano po pierwszym nastrzykni eciu (fig. 12), wskazuje na potrzeb e usuwania, przed modyfikacj a enzymu PEG, wszystkich postaci urykazy wi ek- szych ni z tetramer. P r z y k l a d 4 Koniugowanie urykazy z Candida utilis z PEG Urykaz e z Candida utilis otrzymano z Sigma-Aldrich (St. Louis, MO; nr katalogowy. Ul878) lub z Worthington Biochemical Corporation (Freehold, NJ; nr katalogowy URYW). Post epuj ac jak to opisano w przyk ladach 1 i 2, wyizolowano posta c tetrameryczn a i zsyntetyzowano koniugaty z PEG 5 kDa, 10 kDa lub 30 kDa (fig. 1A - 1B). Fig. 1A przedstawia zachowanie aktywno sci przez zmodyfikowan a PEG urykaz e z Candida utilis w funkcji liczby lancuchów PEG przy laczonych na podjednostk e. Dane twór- ców wynalazku ( ?, ?, ?) porównano z uzyskanymi przez Nishimura i wsp., (1979); Nishimura i wsp., (1981); Chen i wsp., (1981); Davis i wsp., (1981); Tsuji i wsp., (1985); Yasuda i wsp., (1990) i Fujita i wsp., (1991). Warto sci zaznaczone du zymi ko lami odnosz a si e do koniugatów, o których Nishimura i wsp., (1979 lub 1981) donosili, ze s a nieantygenowe lub koniugatów, o których Chen i wsp., (1981) donosili, ze s a nieimmunoreaktywne.PL 203 492 B1 16 Fig. 1B przedstawia zachowanie aktywno sci przez urykaz e z Candida utilis zmodyfikowanej PEG w funkcji ca lkowitej masy przy laczonego PEG na podjednostk e. Wyniki twórców wynalazku ( ?, ?, ?) s a porównane z tymi, o których wspomniano przy fig. 1A. Warto sci zaznaczone du zymi ko lami maja taki sam sens jak na fig. 1 A. Jak pokazano na fig. 1A i fig. 1B, koniugaty o srednio do 6 lancuchów PEG 5 kDa lub 30 kDa lub do 9 la ncuchów PEG 10 kDa na podjednostk e zachowuj a co najmniej 75% aktywno sci niezmody- fikowanego enzymu. Obserwowany wzrost aktywno sci specyficznej wraz ze zwi ekszaj ac a si e liczb a przy laczonych 30 kDa la ncuchów PEG (do 5 lub 6 la ncuchów na podjednostk e) mo ze odzwierciedla c nierozpuszczalnosc lub niestabilno sc niezmodyfikowanego enzymu w porównaniu z koniugatami. P r z y k l a d 5 Koniugowanie urykazy z Aspergillus flavus z PEG Urykaza z Aspergillus flavus zosta la uzyskana z Sanofi Winthrop (Gentilly Cedex, Francja). Po- st epuj ac jak to opisano w przyk ladzie 2, zsyntetyzowano koniugaty z PEG o ró znych masach cz a- steczkowych (fig. 4A - 4B). Koniugaty przygotowano przez sprz eganie enzymu z A. flavus, srednio z maksymalnie dwunastoma 5 kDa la ncuchami PEG lub maksymalnie siedmioma 30 kDa la ncuchami PEG na podjednostk e, zachowuj ac co najmniej 75% pocz atkowej aktywno sci urykazy grzybowej. P r z y k l a d 6 Koniugowanie urykazy sojowej z PEG Zrekombinowana urykaza z brodawek korzeniowych soi (nazywana równie z nodulin a 35) by la przygotowana i oczyszczana jak to opisali Kahn i Tipton (Kahn, K, i wsp., (1997) Biochemistry 36:4731-4738) i dostarczona przez dr Tipton (University Missouri, Columbia, MO). Post epowano jak to opisano w przyk ladach 1 i 2. Posta c tetrameryczn a by la wyizolowana i przygotowano koniugaty z PEG o ró znej masie cz asteczkowej (fig. 5A - 5B). W przeciwie nstwie do urykazy z Candida utilis (fig. 1A), urykazy swi nskiej (fig. 2A), chimerowej urykazy swinia-pawian (fig. 3A) i urykazy z Aspergillus flavus (fig. 4A) enzym z soi tolerowa l jedynie przy laczenie oko lo 2 lancuchów PEG o masie 5 kDa lub 30 kDa na podjednostk e przy zachowaniu co najmniej 75% pocz atkowej aktywno sci rozk ladania kwasu mo- czowego. P r z y k l a d 7 Koniugowanie urykazy z Arthrobacter globiformis z PEG Urykaz e z Arthrobacter globiformis otrzymano z Sigma-Aldrich (nr katalogowy U 7128). Patrz japo nski patent 9-154581. Post epuj ac tak, jak to opisano w przyk ladach 1 i 2, wyizolowano tetrame- ryczne formy i przygotowano koniugaty z PEG 5 kDa i 30 kDa. Podczas gdy koniugaty o srednio wie- cej ni z trzech la ncuchach PEG 5 kDa na podjednostk e zachowywa ly mniej ni z 60% pocz atkowej ak- tywno sci specyficznej, koniugaty o srednio oko lo dwóch lancuchach PEG 30 kDa na podjednostk e zachowywa ly co najmniej 85% pocz atkowej aktywno sci specyficznej. P r z y k l a d 8 Koniugowanie urykazy swi nskiej i PBC skróconych na ko ncu aminowym z PEG Rekombinowane urykazy swi nsk a i PBC, w których pierwsze sze sc aminokwasów na ko ncu aminowym usuni eto, wyra zano i oczyszczano z E. coli z zastosowaniem standardowych sposobów, jak opisano w przyk ladzie 3. Post epuj ac jak to opisano w przyk ladach 1 i 2 zsyntetyzowano koniugaty urykaz o skróconym ko ncu aminowym z PEG z wytworzeniem zasadniczo nieimmunogennych koniu- gatów, które zachowa ly co najmniej 75% pocz atkowej aktywno sci specyficznej. P r z y k l a d 9 Koniugowanie urykazy swi nskiej i PBC skróconych na ko ncu karboksylowym lub równocze snie na ko ncach aminowym i karboksylowym z PEG Rekombinowane urykazy swi nskie i PBC, z których usuni eto, co najmniej trzy aminokwasy z ko nca karboksylowego by ly wyra zane i oczyszczane z E. coli z zastosowaniem standardowych spo- sobów, jak opisano w przyk ladzie 3. Takie skrócenie karboksylowych ko nców mo ze zwi eksza c roz- puszczalno sc niezmodyfikowanych enzymów, bowiem zostaje usuni ety sygna l naprowadzaj acy na peroksysomy. Patrz Miura i wsp., (1994). Post epuj ac jak to opisano w przyk ladach 1 i 2, zsyntetyzo- wano koniugaty PEG urykaz skróconych na ko ncu karboksylowym w celu wytworzenia zasadniczo nieimmunogennych koniugatów, które zachowaly co najmniej 75% pocz atkowej aktywno sci specyficz- nej. Sekwencje rekombinowanej urykazy PBC skrócono o szesc aminokwasów na ko ncu aminowym i o trzy aminokwasy na ko ncu karboksylowym (PBC-NT-CT) co przedstawiono na fig. 6. Urykaza ta jest wyra zana, oczyszczana i modyfikowana PEG, jak to opisano w przyk ladach 1, 2 i 3 celem wytworzeniaPL 203 492 B1 17 zasadniczo nieimmunogennych koniugatów, które zachowa ly co najmniej 75% wyj sciowej aktywno sci specyficznej. P r z y k l a d 10 Koniugowanie z PEG mutantów swi nskiej urykazy zawieraj acych zwi ekszon a liczb e miejsc przy- laczenia PEG Rekombinowane swi nskie urykazy s a przygotowane jak to opisano w przyk ladzie 3, przy czym liczba potencjalnych miejsc przy laczenia PEG jest zwi ekszona przez zast apienie lizyn a jednej lub wi ekszej liczby reszt argininy. Patrz Hershfield, MS, i wsp., (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:7185- -7189. Sekwencja aminokwasowa jednego przyk ladowego takiego mutanta (urykaza PKS), w którym arginina w pozycji 291 jest zast apiona przez lizyn e i treonina w pozycji 301 jest zast apiona przez se- ryn e zosta la przedstawiona na fig. 6. Post epuj ac jak to opisano w przyk ladach 1 i 2, PEG jest przy la- czany do urykazy z wytworzeniem zasadniczo nieimmunogennych koniugatów, które zachowa ly co najmniej 75% pocz atkowej aktywno sci rekombinowanej urykazy. P r z y k l a d 11 Koniugowanie mutanta rekombinowanej urykazy pawiana z PEG Stosuj ac standardowe metody biologii molekularnej, jak w przyk ladzie 3, skonstruowano re- kombinowana urykaz e pawiana posiadaj ac a podstawienie aminokwasu (histydyna za tyrozyn e) w pozycji 97 (patrz fig. 6). Post epuj ac jak opisano w przyk ladzie 1 i 2, koniugaty PEG tetramerycznej postaci mutanta rekombinowanej urykazy pawiana s a syntetyzowane w celu wytworzenia koniugatów o zasadniczo ograniczonej immunogenno sci, które zachowa ly co najmniej 75% pierwotnej aktywno sci specyficznej rekombinowanej urykazy. P r z y k l a d 12 Immunogennosc koniugatów PEG z Candida utilis, Aspergillus flavus i Arthrobacter globiformis Urykaza z Candida utilis, Aspergillus flavus i Arthrobacter globiformis jest uzyskana jak opisano odpowiednio w przyk ladach 4, 5 i 7. Post epuj ac jak opisano w przyk ladach 1 i 2, koniugaty PEG syn- tetyzowano z PEG 5 kDa, 10 kDa, 20 kDa lub 30 kDa. Immunogenno sc tych koniugatów jest zasadni- czo ograniczona lub wyeliminowana. PL PL PL

Claims (33)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Koniugat urykazy zawieraj acy urykaz e kowalencyjnie zwi azan a srednio z 2 do 10 la ncu- chami PEG na podjednostk e urykazy, przy czym ka zda cz asteczka PEG ma mas e cz asteczkow a w zakresie pomi edzy 5 kDa a 100 kDa, znamienny tym, ze zawiera oczyszczon a, urykaz e, która, w co najmniej 90% jest w postaci tetramerycznej, a koniugat wykazuje, co najmniej oko lo 75% aktyw- nosc rozk ladania kwasu moczowego nieskoniugowanej urykazy.
2. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze urykaza jest ssacz a urykaz a.
3. Koniugat wed lug zastrz. 2, znamienny tym, ze urykaza jest swi nsk a urykaz a z w atroby, by- dl ec a urykaz a z w atroby lub owcz a urykaz a z w atroby.
4. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze urykaza jest zrekombinowana.
5. Koniugat wed lug zastrz. 4, znamienny tym, ze urykaza zasadniczo ma sekwencj e urykazy swi nskiej, bydl ecej, owczej lub pawiana.
6. Koniugat wed lug zastrz. 4, znamienny tym, ze urykaza jest bia lkiem chimerowym.
7. Koniugat wed lug zastrz. 6, znamienny tym, ze chimerowa urykaza zawiera czesci urykazy z w atroby swini i urykazy z w atroby pawiana.
8. Koniugat wed lug zastrz. 7, znamienny tym, ze chimerowa urykaza jest urykaz a PBC.
9. Koniugat wed lug zastrz. 7, znamienny tym, ze chimerowa urykaza jest urykaz a PKS.
10. Koniugat wed lug zastrz. 4, znamienny tym, ze urykaza zasadniczo ma sekwencj e urykazy z w atroby pawiana, w której tyrozyna w pozycji 97 jest zast apiona przez histydyn e.
11. Koniugat wed lug zastrz. 4, znamienny tym, ze urykaza zawiera koniec aminowy oraz ko- niec karboksylowy i jest skrócona na jednym lub na obu ko ncach.
12. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze urykaza jest urykaz a z grzybów lub urykaz a pochodz ac a z mikroorganizmu.
13. Koniugat wed lug zastrz. 12, znamienny tym, ze urykaza z grzybów lub urykaza pochodz a- ca z mikroorganizmu jest wyizolowana z Aspergillus flavus, Arthrobacter globiformis lub Candida utilis, lub jest zrekombinowanym enzymem zasadniczo o sekwencji jednej z tych urykaz.PL 203 492 B1 18
14. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze urykaza jest urykaz a bezkr egowca.
15. Koniugat wed lug zastrz. 14, znamienny tym, ze urykaza bezkr egowca jest wyizolowana z Drosophila melanogaster lub Drosophila pseudoobscura lub jest zrekombinowanym enzymem za- sadniczo o sekwencji jednej z tych urykaz.
16. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze urykaza jest urykaz a ro slinn a.
17. Koniugat wed lug zastrz. 16, znamienny tym, ze ro slinna urykaza jest wyizolowana z bro- dawek korzeniowych Glycine max lub jest zrekombinowanym enzymem zasadniczo o sekwencji tej urykazy.
18. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze PEG ma sredni a mas e cz asteczkow a po- mi edzy oko lo 10 kDa a 60 kDa.
19. Koniugat wed lug zastrz. 18, znamienny tym, ze PEG ma sredni a mas e cz asteczkow a po- mi edzy oko lo 20 kDa a 40 kDa.
20. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze srednia liczba kowalencyjnie przy laczonych lancuchów PEG wynosi 3 do 8 lancuchów na podjednostk e urykazy.
21. Koniugat wed lug zastrz. 20, znamienny tym, ze srednia liczba kowalencyjnie przy laczo- nych lancuchów PEG wynosi 4 do 6 la ncuchów na podjednostk e urykazy.
22. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze urykaza jest tetramerem.
23. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze lancuchy PEG s a kowalencyjnie przy laczo- ne do urykazy za po srednictwem wi aza n wybranych z grupy obejmuj acej wi azania uretanowe, drugo- rz edowe wi azania aminowe i wi azania amidowe.
24. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze PEG jest liniowy.
25. Koniugat wed lug zastrz. 1, znamienny tym, ze PEG jest rozga leziony.
26. Kompozycja farmaceutyczna do obni zania poziomu kwasu moczowego w p lynach cia la lub w tkankach, znamienna tym, ze zawiera koniugat okre slony w zastrz. 1 i farmaceutycznie dopusz- czalny no snik.
27. Kompozycja farmaceutyczna wed lug zastrz. 26, znamienna tym, ze jest stabilizowana przez liofilizacj e i szybko ulega rozpuszczaniu podczas rekonstytucji dostarczaj ac roztworów odpo- wiednich do podania pozajelitowego.
28. Zastosowanie koniugatu urykazy do wytwarzania leku do obni zania podwy zszonych pozio- mów kwasu moczowego w p lynie cia la lub tkance ssaka, przy czym koniugat zawiera oczyszczon a urykaz e, która w co najmniej 90% jest w postaci tetramerycznej, obejmuj ac a podjednostki, z których ka zda jest kowalencyjnie zwi azana srednio z 2 do 10 lancuchami PEG, a ka zda cz asteczka PEG ma mas e cz asteczkow a w zakresie pomi edzy 5 kDa a 100 kDa, oraz koniugat wykazuje co najmniej oko lo 75% aktywno sc rozk ladania kwasu moczowego nieskoniugowanej urykazy.
29. Zastosowanie wed lug zastrz. 28, znamienne tym, ze ssak jest cz lowiekiem.
30. Zastosowanie wed lug zastrz. 28, znamienne tym, ze lek jest przeznaczony do podawania ssakowi przez wstrzykni ecie do zylne, sródskórne, podskórne, domi esniowe lub dootrzewnowe albo przez inhalacj e rozpylonego preparatu.
31. Zastosowanie wed lug zastrz. 28, znamienne tym, ze podwy zszone poziomy kwasu mo- czowego s a zwi azane ze stanami wybranymi z grupy obejmuj acej skaz e moczanow a guzkowat a ska- z e moczanow a niewydolnosc nerki, przeszczep narz adu i chorob e typu z lo sliwego.
32. Zastosowanie wed lug zastrz. 28, znamienne tym, ze PEG jest liniowy.
33. Zastosowanie wed lug zastrz. 28, znamienne tym, ze PEG jest rozga leziony.PL 203 492 B1 19PL 203 492 B1 20PL 203 492 B1 21 RysunkiPL 203 492 B1 22PL 203 492 B1 23PL 203 492 B1 24PL 203 492 B1 25PL 203 492 B1 26PL 203 492 B1 27PL 203 492 B1 28PL 203 492 B1 29PL 203 492 B1 30PL 203 492 B1 31PL 203 492 B1 32PL 203 492 B1 33PL 203 492 B1 34PL 203 492 B1 35PL 203 492 B1 36PL 203 492 B1 37PL 203 492 B1 38 Departament Wydawnictw UP RP Cena 6,00 z l. PL PL PL
PL346224A 1998-08-06 1999-08-02 Koniugat urykazy i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna PL203492B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13039298A 1998-08-06 1998-08-06
US09/130,392 1998-08-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL346224A1 PL346224A1 (en) 2002-01-28
PL203492B1 true PL203492B1 (pl) 2009-10-30

Family

ID=

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2728907C (en) Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
JP5183836B2 (ja) Ｐｅｇ−尿酸酸化酵素結合体およびその使用
RU2443426C2 (ru) Конъюгаты уратоксидазы, фармацевтическая композиция для снижения уровней мочевой кислоты и способ получения вышеупомянутых конъюгатов
PL203492B1 (pl) Koniugat urykazy i jego zastosowanie oraz kompozycja farmaceutyczna
HK1155080A (en) Isolated tetrameric uricase
HK1141738B (en) Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
MXPA01001272A (en) Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
HK1037330B (en) Peg-urate oxidase conjugates and use thereof
HK1155080B (en) Isolated tetrameric uricase