DE3650650T2

DE3650650T2 - Vakzin gegen Varicella Zoster Virus

Info

Publication number: DE3650650T2
Application number: DE3650650T
Authority: DE
Inventors: Andrew J Davison; Ronald W Ellis; Paul M Keller; Robert S Lowe
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1985-08-02
Filing date: 1986-07-31
Publication date: 1998-04-16
Anticipated expiration: 2006-08-01
Also published as: DE3685617T2; JPS6270397A; US4812559A; EP0482671B1; US4686101A; DE3685617D1; EP0210931A2; EP0482671A1; EP0210931A3; JPH0775546B2; EP0210931B1; DE3650650D1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Windpocken werden durch das Varicella-Zoster-Virus (VZV), ein Mitglied der Gruppe der Herpesviren, verursacht. Die Krankheit tritt in Personen ohne vorherige VZV-Immunität auf VZV- spezifische Antikörper können kurz nach Beginnn der Krankheit nachgewiesen werden, nehmen während der Konvaleszenz ab, bleiben jedoch viele Jahre nachweisbar und korrelieren mit der Immunität gegenüber der Krankheit. Windpocken sind hochansteckend; über 90% der Bevölkerung sind VZV ausgesetzt, bevor sie 20 Jahre alt sind. In den meisten, wenn nicht allen Fällen, verbleibt VZV scheinbar latent in den Ganglionzellen der dorsalen Rückenmarkswurzel. Aus diesem latenten Zustand kann sich VZV reaktivieren und Zoster selbst in Gegenwart spezifischer Antikörper verursachen, wahrscheinlich als Folge einer geschwächten Zellimmunität. Die Krankheit ist bei Immungeschwächten und bei Personen jenseits des zweiten Jahrzehnts hochmorbid.
VZV hat fünf Haupt-Glykoproteine an seiner Oberfläche: gp115 (Glykoprotein mit 115000 Dalton), gp105, gp92, gp83 und gp55. Diese Glykoproteine sind anscheinend die Produkte von drei Genen: gA (gp105), gB(gp115, in nicht-reduziertem Zustand, zusammengesetzt aus den reduzierten Spezies gp62 und gp57) und gC (gp92, gp83, gp55). Monoklonale Antikörper gegen gA und gB zeigen eine Komplement-unabhängige Neutralisation, während monoklonale Antikörper gegen gC eine Komplement-abhängige Neutralisation zeigen.
EP 211756, im Stand der Technik nur zur Festlegung von Neuheit nach Art. 54(3) EPÜ enthalten, offenbart ein glykosyliertes Protein aus nicht vollständig gereinigten VZV-infizierten MRC-5-Zellen, das diagnostisch zur Messung von VZV-Antikörper-Titer verwendet werden kann.

ZIELE DER ERFINDUNG

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung hochgereinigter Antigene, die Krankheiten, die mit VZV-Infektionen einhergehen, verhindern. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung dieser Antigene. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung von Verfahren zur Verwendung der Antigene zur Erzeugung von Antikörpern gegen VZV sowohl in vivo als auch in vitro . Ein weiteres Ziel ist die Beschreibung der vollständigen Sequenz von Proteinantigenen, einschließlich Peptidantigenen, die auf andere Weise synthetisiert oder in Expressionsvektoren exprimiert werden können. Diese und weitere Ziele der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die DNA-Sequenz des VZV-gB-Gens wurde identifiziert. Ein Fragment dieser Sequenz wurde verwendet, um mRNA aus VZV-infizierten Zellen mittels Hybridselektion zu erhalten. Invitro-Translationsprodukte dieser mRNA wurden durch Meerschweinchenantikörper immunpräzipitiert, die gegen gB erzeugt worden waren, das durch Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern gereinigt worden war. Solche Proteine sind für die Herstellung eines Impfstoffs gegen VZV geeignet.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung eine Immunisierungszusammensetzung, umfassend ein nicht glykosyliertes Polypeptid nach den Ansprüchen 1-3.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das VZV-DNA-Segment, das die schützenden immunogenen gB-Glykoproteine codiert, wurde identifiziert, insbesondere ein 2,6-Kilobasenpaar-(kbp)-DNA-Fragment, dessen entsprechende Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenzen innerhalb der bekannten Sequenz des gesamten VZV-Genoms lokalisiert wurden.
Offenbart sind Vektoren, die dieses 2,6 kbp-DNA-Fragment vollständig oder teilweise enthalten, und Wirtszellen, die diese Vektoren enthalten, wobei die Zellen, die von dem 2,6-kbp- Fragment codierten Peptide vollständig oder teilweise exprimieren können. In Übereinstimmung mit bekannten Techniken ist es für den Fachmann naheliegend, daß Teile der vorstehenden Peptide chemisch synthetisiert oder modifiziert werden können und ihre Immunogenität behalten. Daher läßt sich die chemische Synthese von Domänen dieser Proteine durchführen, insbesondere Domänen, die hydrophile Bereiche und Threonin- oder Serin- und Asparagin-X-Serin- oder Asparagin-X-Threonin- Reste enthalten und umgeben, wobei X ein beliebiger Aminosäurerest ist, da sich diese Domänen wahrscheinlich auf der äußeren Oberfläche des Virus befinden.
Das DNA-Segment, das in gB-Polypeptide translatierbare RNA codiert, wird genau wie folgt identifiziert:
Mehrere virale Glykoproteine, gp115, gp62 und gp57 (auch als gp1 und gp3 oder "Disulfidverbundenes Dimer") bezeichnet, kreuzreagieren mit monoklonalen Antikörpern, und es wurde vorgeschlagen, daß sie die Produkte des gB-Glykoproteingens sind. Zur Lokalisierung dieses Gens im VZV-Genom wurden Plasmide aus einer genomischen VZV-DNA-Bank verwendet, um die Hybridselektion von RNA aus VZV-infizierten Zellen durchzuführen. In-vitro-Translationsprodukte werden durch Meerschweinchenantikörper immunpräzipitiert, die gegen durch Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern gereinigtes gB erzeugt wurden. Diese Antikörper können die Infektiosität des Virus neutralisieren. Durch diese Analyse wurde gefunden, daß ein Polypeptid von 100 Kilodalton (kD) aus mRNA immunpräzipitiert werden kann, die mit dem HindIII-D-Fragment selektiert wurde. Die Analyse der DNA-Sequenz dieser Region des VZV- Genoms zeigt einen offenen Leserahmen (ORF) von 2,6 kbp, der ein Protein von 100 kD mit einer glykoproteinähnlichen Struktur (hydrophober Leader, hydrophober Anker, 9 N- Glykosylierungserkennungsstellen) codiert. Diese ORF-DNA wird aus dem HindIII-D-Fragment kloniert und kann mRNA mit einem Translationsprodukt von 100 kD hybridselektieren. Weiterhin kann die Immunpräzipitierbarkeit der 100-kD-Spezies spezifisch durch immunaffinitätsgereinigtes gB blockiert werden. Zusätzlich wurde VZV-gB durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt. Bei Injektion in Meerschweinchen kann dieses Protein die Bildung von Antikörpern hervorrufen, die die VZV-Infektiosität in vitro neutralisieren. Die partielle Aminosäuresequenzanalyse des gereinigten VZV-gB zeigt Identität mit der aus der DNA-Sequenz des ORF von 2,6 kbp berechneten Aminosäuresequenz. Wir schließen, daß dieser ORF im HindIII-D-Fragment das Glykoprotein-gB- Gen ist und ein Genprodukt spezifiziert, das Neutralisationsepitope trägt.
Es ist für den Fachmann naheliegend, daß mit bekannten Techniken das oben erwähnte DNA-Fragment vollständig oder teilweise in ein Expressionsvektorsystem eingebracht werden kann, um das schützende immunogene Polypeptid vollständig oder teilweise zu erzeugen. Solch ein Expressionsvektorsystem besteht oft aus einem Plasmid, das in eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle eingebracht wird, um die Expression eines fremden Polypeptides zu steuern. Solch ein Plasmid enthält gewöhnlich neben der codierenden Sequenz per se, die das fremde Polypeptid spezifiziert, Sequenzen für die Selektion der plasmidhaltigen Wirtszellen, für die Amplifizierung der Plasmidkopienzahl innerhalb der Wirtszelle, für die Transkriptionsinitiation des fremden Polypeptides und für die Transkriptionstermination des fremden Polypeptides. Daher betrifft die Erfindung auch Wirtszellen und Vektoren, die das 2,6-kbp-DNA-Fragment vollständig oder teilweise enthalten.
Beispiele für geeignete Wirte zur Expression von VZV-Proteinen sind u.a. prokaryontische Organismen wie E. coli und B. subtilis und eukaryontische Organismen wie S. cerevisiae und kontinuierliche Säugetierzellinien, wie u.a., aber nicht beschränkt auf Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters und Verozellen.
Diese Proteine eignen sich einzeln oder in Kombination zum Schutz gegen VZV- Krankheiten, wenn sie in einen physiologisch verträglichen Träger, bspw. Kochsalzlösung oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung, gegeben werden, und wenn sie einem Mitgleid einer dafür empfänglichen Säugetierspezies in einer Menge von etwa 5 bis 150 µg pro Dosis, vorzugsweise etwa 10 bis 50 µg pro Dosis, verabreicht werden. Eine oder mehrere Dosen können zur Erzeugung eines wirksamen Schutzes gegen VZV-Erkrankung verabreicht werden. Das Protein kann durch Injektion, bspw. subkutan oder intramuskulär verabreicht werden. Diese Proteine können selbstverständlich auch direkt im Menschen mit Hilfe geeigneter viraler Expressionsvektoren, bspw. Adeno, Vaccinia oder Herpes-Simplex, exprimiert werden.
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.

BEISPIEL 1

DNA-Fragment, das die gB-Glykoproteine-Vorläuferprotein codierende RNA selektieren kann

Cytoplasma-RNAs wurden wie beschrieben aus VZV-infizierten MRC-5-Zellen präpariert (J.M. Chirgwin et al., Biochemistry Th: 5249 (1979)). Die von verschiedenen VZV-HindIII- Fragmenten codierten RNAs wurden durch Hybridisierung an klonierte VZV-HindIII-DNA- Fragmente (J.R: Ecker & R.W. Hyman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 156 (1982)) selektiert, die an Nitrocellulose gebunden waren (J.A. Cooper et al., J. Virology 37: 284 (1981)). Diese RNAs wurden in einem Kaninchen-Reticulocyten-Lysat translatiert. Die Polypeptidprodukte wurden mit polyklonalen monospezifischen Meerschweinchenantikörpern immunpräzipitiert, die gegen gB, gereinigt durch Affinitätschromatographie mit monoklonalen Antikörpern, gezüchtet wurden.(Diese Reinigung ist nachstehend in Beispiel V beschrieben). Mit dieser Analyse wurde gefünden, daß durch die virusinfektiositätsneutralisierenden Anti-gB-Antikörper ein in-vitro-Translationsprodukt von 100 kD aus der mit dem VZV-HindIII-D-Fragment selektierten mRNA immunpräzipitiert werden konnte. (Die Neutralisationsdaten sind nachstehend in Beispiel IV beschrieben.)

BEISPIEL II

DNA-Fragment von HindIII-D-DNA mit einem großen ORF

Die Sequenzanalyse des HindIII-D-Fragmentes aus dem VZV-Genom zeigte einen ORF, der ein 100-kD-Protein mit einer glykoproteinähnlichen Struktur (hydrophober Leader, hydrophober Anker, 9 N-Glykosylierungs-Erkennungsstellen) codieren könnte. Ein Segment dieser ORF-DNA wurde aus dem HindIII-D-Fragment kloniert, und es wurde gezeigt, daß es mRNA mit einem Translationsprodukt von 100 kD hybridselektieren kann, das sowohl mit monospezifischem Meerschweinchenserum als auch mit konvaleszentem Zosterserum immunpräzipitierbar war. Außerdem konnte die Immunpräzipitierbarkeit der 100-kD-Spezies durch beide Seren spezifisch durch immunaffinitätsgereinigtes gB blockiert werden, jedoch nicht durch ein anderes Haupt-VZV- Glykoprotein. Dieses Segment der HindIII-D-DNA wurde daher als das gB-Gen identifiziert.

BEISPIEL III

Bestimmung der Nukleotidsequenzen des 2,6kbp-Segmentes von VZV-DNA

Die vollständige Nukleotidsequenz VZV-HindIII-D-DNA-Segmentes enthält mehrere große offene Leserahmen. Einer dieser offenen Leserahmen ist 2,6 kbp lang, codiert ein 100-kD-Protein und enthält das in Beispiel II beschriebene VZV-gB-Antigene-codierende Segment. Die Nukleotidsequenz des vollständigen 2,6 kbp-Segmentes, das das gB-Glykoprotein codiert ist nachstehend angegeben:
Die voranstehenden Nukleotidsequenzen codieren das folgende Peptid:

BEISPIEL IV

Reinigung des VZV-gB-Glykoproteins

Aszitesflüssigkeiten mit monoklonalem Antikörper B1 (beschrieben in Keller et al., J. Virology 52: 293, (1984)) wurden von Mäusen gesammelt. Hierzu wurde 0,15 M NaCl in gleichem Volumen zugegeben. Anschließend wurde eine gesättigte (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung in einem gleichen Gesamtvolumen zugegeben und über Nacht bei 4ºC gehalten. Dieses Gemisch wurde bei 10" C und 2000 U/min zentrifugiert. Das Pellet wurde in destilliertem H&sub2;O (2 mg/ml) resuspendiert und über Nacht gegen Kupplungspuffer (0,1 M NaHCO&sub3;, 0,5M NaCl, pH-Wert 8,4) dialysiert. Ein Gramm cyanogenbromid-aktivierte Sepharose 48 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) wurde in 0,001 N HCl gequollen und dann in ein grobe 60-ml-Sinterglasfritte dekantiert. Diese wurde mit 200 ml 0,001 N HCL und dann mit 50 ml Kupplungspuffer gewaschen. Die Sepharose wurde dann mit 10 ml einer Lösung aus monoklonalen Antikörpern gemischt und 2 Stunden bei 23ºC rotiert. Anschließend wurden 80 µl Ethanolamin zugegeben, und die Lösung wurde 1 Stunde bei 23ºC rotiert. Das Harz wurde in eine Einmal-Chromatograhiesäule (Biorad) gegossen, abtropfen gelassen, und nacheinander mit 10-ml-Volumina der folgenden Lösungen gewaschen: 1) Kupplungspuffer; 2) 0,1 M Na&sub2;HPO&sub4;; 0,5 M NaCl, pH-Wert 8,2; 3) 0,1 M NaOAc, 0,5 M NaCl, pH-Wert 4,0; 4) 0,1 M NaHBO&sub4;, pH-Wert 8,2; 5) 3 M KSCN; 6) 0,1 M NaHBO&sub4;, pH-Wert 8,2; danach vor Gebrauch in 0,1 M NaHBO&sub4;, pH-Wert 8,2, bei 4ºC aufbewahrt.
VZV-Glykoproteine wurden aus menschlichen diploiden MRC-5-Fibroblasten gereinigt, die mit VZV bis zu einer 80%igen Cytopathiewirkung infiziert worden waren. Die Zellen in 750-cm²- Rollflaschen wurden zweimal mit 0,15 M NaCl, 0,01 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH-Wert 7,2, gewaschen und gut ablaufen gelassen. Es wurden zehn ml 50 mM Tris, pH-Wert 7,5, 2% Triton X-100, 4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) 15 min in der Flasche unter Rollbewegung inkubiert. Mit den gleichen 10 ml wurdendann nacheinander 9 weitere Rollflaschen extrahiert. Die 10 Rollflaschen wurden nacheinander mit einem frischen 10-ml-Pufferaliquot gespült, das mit dem ersten Aliquot vereinigt wurde, so daß 20 ml Extrakt das Material aus 10 Rollflaschen darstellen. Die Extrakte wurden bis zur Verwendung bei -70ºC aufbewahrt.
Die Extrakte wurden aufgetaut und über Nacht bei 4ºC gegen 0,15 M NaCl, 0,01 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,05% Triton X-100, pH-Wert 7,2, dialysiert, danach durch 15minütiges Zentrifugieren bei 1500 U/min und 4ºC geklärt. 20 ml Extrakt wurden zu 1 g mit monoklonalem Antikörper gekoppeltem Harz gegeben und über Nacht bei 4ºC unter Schütteln inkubiert. Die Aufschlämmung wurde 15 Minuten bei 1500 U/min und 4ºC zentrifugiert und dreimal mit 0,1 M NaHBO&sub4;, pH-Wert 8,2, gewaschen. Das Glykoprotein wurde durch Inkubation bei 23ºC mit 10 ml 3M KSCN eluiert. Das Eluat wurde sofort gegen 0,15 M NaCl, 0,01 M Na&sub2;HPO&sub4;, 0,05% Triton X-100, pH-Wert 7,2, über Nacht bei 4ºC dialysiert und auf etwa 1 mg/ml eingeengt.
Ungefähr 500 µg des durch Immunaffinität gereinigten gB wurden in die Probenschleife eines LCC (Flüssigkeits-Chromatographie-Controller) 500 FPLC (Schnelle-Protein- Flüssigkeitschromatographie) (Pharmacia) geladen. Die Probe wurde dann auf eine Mono-Q- Anionenaustauschersäule (Pharmacia) injiziert, und anschließend mit 5 ml 20 mM Tris, pH-Wert 7,7, 20 mM CHAPS (Sigma) gewaschen. Über die Säule wurde ein Gradient von 0 - 1 M NaCl in 20 mM Tris, pH-Wert 7,5, 20 mM CHAPS geschickt, und einzelne Fraktionen wurden gesammelt. Bei etwa 0,3 M NaCl wurde ein einzelner homogener Hauptpeak eluiert, der in einem Centricon- Konzentrator (Amicon) in 10 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 auf ein Volumen von 50 µl eingeengt wurde. Dieser Peak wurde durch die nachstehenden Merkmale als VZV-gB-Gen bestätigt. Bei Silberfärbungen einer unter reduzierenden Bedingungen durchgeführten Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde die Probe in zwei Proteine mit Molekulargewichten von 62000 und 57000 Dalton aufgelöst, wie in Keller et al., ibid., als gp62, gp57; Okuno et al., Virology 129: 357 (1983), als gp 5; Grose et al., Virology 132: 138 (1984), als gp66, "Disulfid-verbundenes Dimer"; Ferghani et al., J. Virology, 52: 55 (1984), als 64K- 65K beschrieben. Bei Silberfärbungen einer unter nicht-reduzierenden Bedingungen durchgeführten SDS-PAGE wurde die Probe als einzelnes Protein mit einem Molekulargewicht 115000 aufgelöst, wie in Grose et al., ibid, als gp140; Vafai et al., J. Virology 52: 953 (1984), als gp130 beschrieben.

BEISPIEL V

Gereinigtes VZV-gB-Polypeptid induziert Antikörper die die VZV-Infektiosität in vitro neutralisieren

Meerschweinchen wurden intramuskulär mit 20 µg VZV-gB (gereinigt durch Immunaffinitätschromatographie wie vorstehend in Beispiel IV beschrieben) in vollständigem Freund'schem Adjuvans beimpft. Einen Monat darauf wurden im Abstand von zwei Wochen zwei Impfüngen von jeweils 10 µg VZV-gB in unvollständigem Freund'schem Adjuvans durchgeführt. Nach diesen drei Impfungen wurden den Meerschweinchen Seren entnommen. Jedes der Meerschweinchenseren wurde wie beschrieben (Keller et al., ibid) in einem in-vitro-VZV- Neutralisationstest verwendet. In diesem Test brachten die Seren nach der Immunisierung VZVneutralisierende Antikörper hervor, nicht jedoch die vor der Immunisierung.

BEISPIEL VI

Aminosäureanalyse von gereinigtem VZV-gB-Polypeptid

300 µg VZV-gB (gereinigt wie in Beispiel IV beschrieben) wurden einer aminoterminalen Sequenzanalyse mit einem Gasphasen-Sequenator von Applied Biosystems [Hewick et al., J. Biol. Chem. 256: 7790 (1981)] unterworfen. Die in jedem Schritt erzeugten PTH-(Phenylthiohydantoin-)- Aminosäuren wurden getrennt und durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie [Speiss et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 70: 2974 (1979)] quantifiziert.
Die Sequenzanalyse zeigte, daß gB zwei verschiedene Aminotermini enthält, was mit der in Beispiel IV vorstehend beschriebenen Analyse übereinstimmt. Jeder Sequenatorzyklus ergab 0, 1 oder 2 identifizierbare Aminosäuren. Insgesamt wurden 11 Aminosäuren in gB identifiziert. Von diesen konnten sechs in die Sequenz der Aminosäuren 9-20 eingeordnet werden, die aus der DNA- Sequenz in Beispiel III vorstehend abgeleitet wurde, und fünf von diesen konnten in die Sequenz der Aminosäuren 432-443 eingeordnet werden, die aus der DNA-Sequenz in Beispiel III vorstehend abgeleitet wurde. Da die abgeleitete Aminosäuresequenz 868 Aminosäuren enthält, stimmen diese Sequenzdaten des gereinigten VZV-gB mit einem Spaltungsereignis überein, das das Protein in zwei Polypeptide teilt, die jeweils etwa 430 Aminosäuren enthalten. Dies stimmt mit den sehr ähnlichen Molekulargewichten der beiden reduzierten VZV-gB-Spezies, d.h. gp62 und gp57, überein. Figur 1 Aminosäuresequenzanalyse von gereinigtem VZV-gB
1 = abgeleitete Aminosäuren 9-20 aus Beispiel III
2 = Aminosäuresequenz des gereinigten VZV-gB, in der ein Bindestrich (-) bedeutet, daß an dieser Stelle keine Aminosäure aufgelöst wurde
3 = abgeleitete Aminosäuresequenzen 432-443 aus Beispiel III

Claims

1. Immunogene Zusammensetzung, bestehend aus einem nichtglykosylierten Polypeptid mit der folgenden Sequenz:

oder einer immunogenen Untereinheit davon und einem physiologisch verträglichen Träger, die sich zur Verabreichung an ein Säugetier eignet.

2. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend 5 µg bis 150 µg des Polypeptides oder der immunogenen Untereinheit davon.

3. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der physiologisch verträgliche Träger Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung ist.