CH685299A5 - Menschliches Fibroblasteninterferon beta 2, Verfahren zur Herstellung von menschlichem Fibroblasteninterferon beta 1 und beta 2 und deren Verwendung. - Google Patents

Description

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Beschreibung

Interferon ist ein wichtiges, vom Körper hergestelltes antivirales Protein, das auch eine Wachstumshemmung von Tumorzellen bewirkt. Aufgrund seiner Artspezifität wird zur Anwendung in der Humanmedizin menschliches Interferon benötigt. Die begrenzten Mengen an Interferon, die in Gewebekulturzellen und frischen Leukozyten gebildet werden, genügen nicht für die klinische Verwendung in grossem Massstab. Das Einschleusen der genetischen Information für menschliches Interferon in Bakterien könnte die Produktion eines Polypeptides mit Interferon-Aktivität ermöglichen. Es ist bekannt, dass derartige Methoden für das menschliche Wachstumshormon und für Insulin entwickelt wurden.

Die beiden Typen von Interferon, nämlich Leukozyten-Interferon (IFN-a) und Fibroblasteninterferon (IFN-ß) werden anscheinend von verschiedenen mRNAs kodiert; vgl. Cavallieri et al., Proc. Nati. Acad. Sei., USA, Band 74 (1977), Seiten 4415 bis 4419. Die Isolierung dieser mRNA's in reiner Form ist bis jetzt noch nicht gelungen. Dies erscheint auch umso schwieriger, als die Wirtszelle nur dann in der Lage ist, die Interferon-mRNA zu synthetisieren, wenn die Zelle geeigneten exogenen Faktoren ausgesetzt wird, beispielsweise einer viralen Infektion oder speziellen synthetischen Polynucleotiden, wie Poly-(rl:rC). Selbst dann produziert die Zelle nur in geringsten Mengen. Dementsprechend wurde vorgeschlagen, einen mRNA-Extrakt von Wirtszellen zu verwenden, welche vorher zur Bildung von Interferon induziert worden waren, und diese mRNA in vitro in einem zellfreien System mit allen Bestandteilen, insbesondere den natürlichen Aminosäuren, translatieren zu lassen, um auf diese Weise ein Proteinpräparat mit Interferon-Aktivität zu erhalten. Die Interferon-mRNA stellt jedoch einen sehr untergeordneten Anteil der zu translatierenden mRNA's dar, und dementsprechend war das schliesslich erhaltene Proteinpräparat mit Interferon-Aktivität sehr stark durch andere Proteine verunreinigt.

Daher würde die Verwendung solcher mRNA-Präparate als Ausgangsmaterial zur direkten Umwandlung in Doppelstrang-DNA, welche nach Insertion in einen geeigneten Vektor kloniert werden soll, Screening-Schwierigkeiten mit sich bringen, die praktisch unüberwindlich wären.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die erwähnten Schwierigkeiten der Interferon-Herstellung weitestgehend zu überwinden.

Während es bisher nur gelang, mit bekannten Methoden menschliches Fibroblasteninterferon ß1 zu isolieren, welches ein Molekulargewicht von etwa 20 000 aufweist, gelang es im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, eine neue, hochaktive Substanz mit einem Molekulargewicht von etwa 23 000 zu isolieren, welche als Interferon ß2 bezeichnet wurde.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit menschliches Fibroblasteninterferon ß2, wie es in Patentanspruch 1 definiert ist.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von menschlichen Fibroblasteninterferon ß1 und ß2, wie in Patentanspruch 2 definiert. Besondere Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den Patentansprüchen 3 und 4 definiert. Die Erfindung betrifft ferner die derart erhaltenen Interferone und eine Verwendung von Interferonen zur Herstelung von pharmazeutischen Präparaten, wie sie in den Patentansprüchen 7 und 8 definiert sind.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird vorzugsweise zur Herstellung von hochgereinigten menschlichen Fibroblasteninterferonen ß1 und ß2 eingesetzt.

Es ist als Vorteil einzuschätzen, dass einige der aufgeführten Stufen nicht in genau der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden müssen. Dies trifft insbesondere zu für die Stufe f), welche die Herstellung der cDNA-Proben betrifft.

Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die Stufen c) und f) lediglich an Fraktionen der mRNA's durchgeführt, die aus den Zellen extrahiert werden und zwar aus den induzierten oder nicht induzierten Zellen. In dieser Hinsicht kann die Tatsache ausgenutzt werden, dass mRNA's einen Poly-A-Teil enthalten, der die Abtrennung der mRNA von der Ge-samt-RNA durch Bindung an Oligo-dT-Cellulose ermöglicht. Die anschliessend eluierte mRNA-Fraktion wird vorteilhafterweise danach noch durch eine Sacharose Gradienten-Zentrifugation fraktioniert. Die verschiedenen Banden werden sodann gesondert in einem geeigneten zellfreien System, beispielsweise einem Reticulocyten-Lysat, translatiert. Jedes der Translationsprodukte wird dann darauf untersucht, ob es durch ein Anti-lnterferonserum ausgefällt wird. Die Banden der mRNA, deren Translationsprodukte eine positive Reaktion bei diesem Immunpräzipitationstest ergeben, werden zur Durchführung der beiden vorstehend beschriebenen Stufen c) und f) zurückbehalten. Ein weiterer Aspekt dieses Verfahrens ist darin zu erblicken, dass zwei verschiedene mRNA's, die für Interferon kodieren, aus menschlichen Fibroblastenzellen isoliert werden können, wenn diese Zellen gemäss Stufe a) induziert werden. Die kleinere mRNA sedimentiert bei 11 S und liefert durch Translation in einem zellfreien System ein Protein mit einem Molekulargewicht von 20 000. Dieses wird durch Antikörper, die gegen eines der Interferone erzeugt werden, welche aus diesen Zellen gewonnen und gereinigt werden können, selektiv ausgefällt. Dieses Protein ist menschliches Interferon (IFN)-ßl. Die grössere mRNA sedimentiert bei 14 S und liefert ein Protein mit einem Molekulargewicht von 23 000. Dieses Protein wird durch Antikörper gegen ein weniger gereinigtes Fibroblasten-Interferonpräparat ausgefällt. Dieses Protein wird als menschliches lnterferon-ß2 bezeichnet. Fraktionen von mRNA für beide Proteine werden in der Stufe c) eingesetzt. Dies ermöglicht die beliebige Herstellung von IFN ß1 oder IFN ß2 in praktisch reiner Form. Die

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Hybridisierung (Stufen g, h, i) gestattet eine genaue Identifizierung von einzelnen E. coli-Kolonien, die eine der beiden Interferon-cDNA's für IFN ß1 oder ß2 enthalten.

Es liegt auf der Hand, dass diejenigen Kolonien, die nur mit «induzierten» cDNA-Proben und nicht mit den «nicht-induzierten» cDNA-Proben hybridisieren, nur solche Kolonien darstellen, die einen modifizierten Vektor mit der cDNA enthalten, die der Interferon-mRNA entspricht, weil a) die DNA, die mit der «nicht-induzierten» cDNA-Probe nicht hybridisierbar ist, dementsprechend keiner der mRNA's entspricht, die normalerweise von einer nicht-induzierten Zelle gebildet werden und b) der einzige Unterschied zwischen den beiden Proben darin besteht, dass die «induzierte» cDNA-Probe eine cDNA aus einer der Interferon-mRNA's enthält, die andere Probe dagegen nicht.

Die Herstellung dieser cDNA-Proben kann nach üblichen Methoden erfolgen, insbesondere durch Transkription mit einer reversen Transkriptase. Vorzugsweise wird ein bakterieller Vektor mit hoher Kopienzahl, wie das pBR322-Plasmid verwendet. Um die spätere Expression der durch die Interferon-cDNA modifizierten Vektoren in einem Mikroorganismus zu erhalten, kann man einen Satz von Vektoren verwenden, wie sie von Patrick Charney, et al., in dem Aufsatz «Bacteriophage Lambda and Plasmid Vectors Allowing Fusion of Cloned Genes in each of the three translational phases», Nucleic Acids Res., Bd. 5 (12), 1978, S. 4479 bis 4494, beschrieben wurden.

Gemäss einem weiteren wichtigen Schritt des erfindungsgemässen Verfahrens kann der vorstehend modifizierte Vektor, wie immer sein (Translations-)Leseraster auch vorliegen mag, zur Extraktion von In-terferon-mRNA aus dem RNA-Gemisch verwendet werden, das durch die induzierten Zellen gebildet wird. Bei dieser Stufe werden diese RNA's mit einem derartigen durch die Interferon-cDNA modifizierten Vektor zusammengebracht, welcher vorher auf einem Träger fixiert worden ist. Die Vereinigung (von m-RNA's und modifiziertem Vektor) erfolgt unter solchen Bedingungen, die die Hybridisierung erlauben. Danach wird die hängengebliebene (gebundene) mRNA von dem fixierten DNA-Vektor eluiert. Auf diese Weise wird nRNA von menschlichem Interferon (entweder IFN-ß1 oder IFN-ß2) in hochgereinigter Form erhalten.

Der hohe Reinigungsgrad ergibt sich aus der Tatsache, dass das Translationsprodukt in einem geeigneten in vitro-System in jedem Fall im wesentlichen aus einem einzigen Polypeptid mit Interferonaktivität besteht, das durch die Antikörper gegen menschliches Interferon ausgefällt wird.

Die Erfindung ermöglicht somit auch die Gewinnung der gereinigten mRNA's, die normalerweise etwa 900 Nucleotide für IFN-ß1 und etwa 1300 Nucleotide für IFN-ß2 enthalten. Die entsprechenden cDNA's werden durch Transkription der mRNA's erhalten.

Es liegt auf der Hand, dass jedem der Hybridisierungsschritte des erfindungsgemässen Verfahrens, sofern erforderlich, eine Denaturierung der möglichen doppelsträngigen Nucleinsäuren vorangeht, um sicherzustellen, dass keine doppelsträngigen Nucleinsäuren (die eine Interferon-Aktivität in Zellen induzieren könnten) in den gereinigten mRNA's verbleibt, wenn diese zur in vitro Produktion durch Translation von praktisch reinem Protein mit Interferon-Aktivität verwendet werden.

Aus den erhaltenen reinen mRNAs und cDNAs ist es für den Fachmann ohne weiteres möglich, nach bekannten Verfahren menschliches Fibroblasteninterferon ß1 und ß2 herzustellen. Diese Interferone lassen sich auf übliche Weise zu pharmazeutischen Präparaten formulieren.

Die Erfindung wird anhand der Figuren und der Tabelle weiter erläutert.

Flg. 1 zeigt die Fraktionierung von mRNA an einem Sacharosegradienten sowie die Translation dieser aus induzierten Zellen stammenden mRNA-Fraktionen in Xenopus laevis-Oocyten zur Herstellung von menschlichem Interferon und ihre Translation in Reticulocyten-Lysaten zur Produktion spezifisch im-munpräzipitierbarer Proteine. Dieses Verfahren gestattet die Trennung der mRNA's für IFN-ß1 und IFN-ß2.

Fig. 2 veranschaulicht das Ergebnis einer differentiellen Hybridisierung der DNA's der gleichen bakteriellen Kolonien mit den beiden vorstehend erwähnten cDNA-Proben aus induzierten und nicht-induzier-ten Zellen.

Fig. 3 erläutert eine Reinigung von Interferon IFN ß2-mRNA durch Hybridisierung mit immobilisierter DNA aus dem bakteriellen Klon A341, nachgewiesen durch Translation in einem Reticulocytenlysat.

Fig. 4 zeigt, dass DNA aus dem bakteriellen Klon A341 komplementär ist zu einer mRNA mit etwa 1300 Nucleotiden, die in menschlichen Zellen nur nach Induktion der Interferonsynthese auftritt.

Tabelle I zeigt, dass diese mRNA nach Translation in den Oocyten von Xenopus laevis biologisch aktives Interferon liefert, welches das Wachstum eines Virus in menschlichen Zellen hemmt.

Fig. 1a zeigt die Trennung zweier, für humane Interferonaktivitität codierend mRNAs (gepunktete Linie und Sterne). Die Trennung wurde durch Zentrifugation in einem Röhrchen, das einen Saccharose-Gradienten enthielt, der mRNAs gemäss ihrer Grösse trennt, bewirkt. Der mRNA-Peak um Fraktion 6 auf der Abszisse ist grösser (14S) als der mRNA-Peak um die Fraktionsnummern 10-12 (11S). Die Interferonaktivität wurde durch Injizieren jeder der RNA-Fraktionen in Frosch (Xenopus)-Oocyten gemessen und durch Messen der Aktivität des menschlichen Interferons, das von diesen Oocyten ausgeschieden wurde, gemessen.

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Um darzustellen, welche Proteine von diesen beiden Humaninterferon-mRNA-Peaks codiert werden, wurde jede Fraktion zu Lysaten aus Hasenreticulocyten mit radioaktivem Methionin gegeben, so dass die Proteine, die von jeder RNA-Fraktion synthetisiert werden, radioaktiv sind. Ein in Hasen unter Verwendung von teilweise gereinigtem Interferon aus menschlichen Fibroblasten (Interferon-beta) hergestelltes Antiserum, wurde verwendet, um die radioaktiven Proteine, die als Reaktion auf jede mRNA-Fraktion gemacht wurden, immunzufällen. Die Proteine, die auf diese Weise immungefällt wurden, wurden durch Gelelektrophorese auf einem Polyacrylamidgel mit SDS getrennt, das nach Grösse (von oben nach unten in Fig. 1 b) trennt. Die Autoradiographie zeigt die von dem Antiserum (Antikörper) erkannten Proteine.

Zum Vergleich mit den Proteinen, die mit RNA von Fibroblasten, die nicht induziert wurden, um Interferon (n) zu produzieren, ist in Figur 1b dargestellt, dass die mRNA-Fraktionen aus zur Interferonproduktion induzierten (i) Fibroblasten zwei Proteine unterschiedlicher Grösse synthetisieren, die mit 23 (Molekulargewicht 23 000 Dalton) und 20 (20 000 Dalton) gekennzeichnet sind, die nicht vorhanden sind, wenn die Fibroblasten kein Interferon-beta produzieren. Die Grösse dieser Proteine wurde durch Vergleich mit Molekulargewichtsmarkerproteinen, die auf der rechten Seite in Fig. 1b gezeigt sind, bestimmt. Die Menge von jedem dieser zwei Proteine in Fig. 1b, die von jeder der mRNA-Fraktionen in Fig. 1a hergestellt wurde, wurde durch Scanning des Röntgenfilms der Autoradiographie quantifiziert. Die Menge von jedem Protein wird als das Proteingebiet ausgedrückt, das in Fig. 1a durch durchgezogene Linien dargestellt ist. Es ist dargestellt, dass die Proteinmenge von 23 000 Dalton (geschlossene Kreise) proportional der Menge des grösseren mRNA ist, die humane Interferonaktivität codiert und die um Fraktion 6 in Fig. 1a gefunden wird. Im Gegensatz dazu, ist die Menge an 20 000 Dalton Protein (offene Kreise) proportional zu der Menge der kleineren mRNA, die humane Interferonaktivität codiert und die um die Fraktionen 10-12 gefunden wird.

Dieser Versuch 1) zeigt, dass es zwei mRNAs in menschlichen Fibroblasten gibt, die induziert wurden, um Interferon zu produzieren, die menschliche Interferonaktivität codieren, 2) dass die grössere dieser mRNAs für ein Protein von 23 KDa und die kleinere dieser mRNAs für ein anderes Protein von 20 KDa codiert, 3) dass beide Proteine, das 23 KDa- und das 20 KDa-Protein immunologisch verwandt mit Proteinen sind, die in teilweise gereinigtem menschlichem Interferon-beta gefunden werden. Die kleinere mRNA und das 20 KDa-Protein wurden lnterferon-beta-1 genannt, während die grössere mRNA und das 23 KDa-Protein lnterferon-beta-2 genannt wurden.

Fig. 2 veranschaulicht, wie cDNA-Klone, die mRNAs entsprechen, die nur in menschlichen Fibroblasten gefunden werden, die zur Interferonaktivität induziert wurden, identifiziert werden. Die Figur zeigt eine Autoradiographie von zwei Nitrozellulosefilterscheiben mit einem Durchmesser von 5 cm, auf die DNA von 15 verschiedenen Kolonien des Bakteriums E. coli adsorbiert wurden. Diese Kolonien von E. coli enthalten jeweils einen anderen cDNA-Klon, der aus menschlichen Fibroblasten, die zur Interferonproduktion induziert wurden, stammen. (In diesem Versuch stammte die mRNA aus den Fraktionen in Fig. 1a, die die Grösse zur Codierung des 23 KDa-Protein besitzen). Insgesamt 2000 Kolonien, die jeweils eine andere cDNA aufgrund des Klonierungsverfahrens haben, wurden untersucht, die Figur zeigt jedoch Ergebnisse von nur 15 ausgewählten Kolonien. Um zu identifizieren welche E. coli-Koionien einen cDNA-Klon enthalten, der einer mRNA entspricht, die nur in induzierten humanen Fibroblasten vorkommt, wurde ein Verfahren angewendet, das als différentielle Hybridisierung bezeichnet wird. Jede der beiden Filterscheiben, die identisch sind, wurde mit einer anderen radioaktiven cDNA hybridisiert: die linke Filterscheibe (Ni) wurde mit cDNA aus RNA (von Fraktion 6 eines Gradienten wie in Fig. 1a) hybridisiert, die von nicht-induzierten humanen Fibroblasten (N.i. cDNA) stammte. Im Gegensatz dazu, wurde die rechte Filterscheibe mit cDNA aus RNA hybridisiert, die von induzierten Fibroblasten (i-cDNA) stammt.

Da jeder numerierte Fleck auf einem der zwei Filterscheiben nur einen und einzigartigen cDNA-Klon enthält, kann dieser entweder eine cDNA von einer mRNA enthalten, die nur in induzierten Fibroblasten vorhanden ist oder eine cDNA von einer mRNA, die auch in nicht-induzierten Fibroblasten enthalten ist. Im zweiten Fall wird die cDNA der Bakterienkolonie sowohl mit i- als auch mit N.i.-radioaktiv markierten cDNAs, die als Sonden verwendet werden, hybridisieren. Im ersten Fall wird DNA der Bakterienkolonie nur mit der radioaktiven cDNA von i hybridisieren.

Es ist dargestellt, dass die zwei DNAs der Bakterienkolonien nur mit der i-cDNA hybridisieren: diese sind durch Pfeile (Nummern 5 und 13) gekennzeichnet. Die anderen Bakterienkolonien in der Nähe der Nummern 1, 3, 6, 9, 11, 12 und 15 hybridisieren sowohl mit i- als auch mit N.i.-cDNA-Sonden. Wir schliessen, dass E. coli-Kolonien 5 und 13 jeweils einen cDNA-Klon enthalten, der einer mRNA entspricht, die nur in induzierten Fibroblasten vorhanden ist. Wir haben den Klon in Kolonie Nummer 13 als Klon A341 bezeichnet.

Fig. 3 zeigt, dass der A341 genannte cDNA-Klon (in Fig. 2) cDNA enthält, die komplementär zu der mRNA ist, die für das 23 KDa-Protein codiert, das durch das Antiserum (Antikörper) gegen humanes Interferon (dieses Protein ist IFN-ß-2, siehe Fig. 1) erkannt wird.

Die Figur zeigt eine Autoradiographie einer Polyacrylamidgelelektrophorese in SDS, die die radioaktiven Proteine, die in Hasenretikulocytenlysaten von verschiedenen mRNAs synthetisiert wurden, durch abnehmende Grösse (von oben nach unten) trennt. Die mit «tot» gekennzeichnete Bande zeigt die Proteine, die von der gesamten RNA aus induzierten humanen Fibroblasten hergestellt wurden. Viele Pro-

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teine mit vielen unterschiedlichen Grössen werden hergestellt. Die durch «341 » gekennzeichnete Bande zeigt das Protein, das von der mRNA hergestellt wurde, die durch Hybridisierung mit dem cDNA-Klon A341 (aus der DNA des in Fig. 2 gezeigten bakteriellen Klons A341 isoliert) gereinigt wurde. Das Verfahren der Hybridisierungsselektion, das angewendet wird, um diese mRNA zu erhalten, stellt sicher, dass nur mRNA, die hybridisieren kann und zu einem der zwei DNA-Stränge der cDNA des A341-Klons komplementär (und daher in der Sequenz identisch mit dem anderen Strang der A341 cDNA) ist, aus der grossen mRNA-Mischung, die in der «Gesamt»-RNA enthalten ist, ausgewählt und gereinigt wird. Es ist dargestellt, dass diese mit der A341 cDNA korrespondierende mRNA nur ein Protein herstellt, dessen Grösse im Vergleich zu den Markerproteinen (linke Bande m) 23 KDa beträgt. Dieses Protein hat genau die gleiche Grösse wie das 23 KDa-Protein (als IF gekennzeichnet), das durch die Antikörper gegen das menschliche Interferon immungefällt wird. Als Kontrolle haben wir RNA verwendet, die durch Hybridisierung mit einer nichtverwandten DNA, nämlich dem pBR-Plasmid von E. coli, ausgewählt wurde. Die mit Pbr gekennzeichnete Bande zeigt, dass das 23 KDa-Protein von dieser Kontroll-mRNA nicht hergestellt wird.

Es kann geschlossen werden, dass die A341-cDNA eine Sequenz enthält, die identisch mit derjenigen mRNA ist, die das IFN-ß-2-Proteins ist. Der Versuch zeigt auch, dass das angewendete Hybridisie-rungsselektionsverfahren (Hybridisierung der Gesamt-RNA mit A341-cDNA, die auf einen Nitrocellulose-filterquadrat immobilisiert wurde, gefolgt von Waschen und Eluierung der hybridisierten RNA) reine IFN-ß-2-mRNA liefert. Dies wird durch die Tatsache gezeigt, dass diese durch Hybridisierung ausgewählte mRNA nur für ein Protein aus der grossen Mischung codiert, die mit der Gesamt-RNA synthetisiert wurde. (Beachte, dass in den Banden «total», «341 » und Pbr die gesamte, als Antwort auf die zu Hasen-reticulocytenlysaten gegebene RNA, vorhanden ist und Immunpräzipitation nicht angewendet wurde).

Fig. 4a zeigt, dass die cDNA A341 tatsächlich einer mRNA entspricht, die nur in menschlichen Fibroblasten gefunden wird, die induziert wurden, um Interferon zu bilden. Die Figur zeigt eine Autoradiogra-phie von 3 Nitrocellulosefilterstreifen (1, 2, 3), auf die jeweils ein Agarosegel nach der Elektrophorese der aus zur Interferonbildung induzierten (i) und nicht induzierten (ni) menschlichen Fibroblasten extrahierten RNA, geblottet wurde. Die Gelelektrophorese trennt RNA nach abnehmender Grösse (von oben nach unten). Die Positionen der 28S-, 18S-, und 5S-RNA-Marker sind dargestellt. Der Nitrocellulose-streifen Nummer 1 wurde mit radioaktiver cDNA des cDNA-Klons A341 hybridisiert. Es ist dargestellt, dass diese cDNA mit einer RNA hybridisiert, deren Grösse durch Vergleich mit den RNA-Markern als 14S bestimmt wurde, welche nur in i RNA aber nicht in ni RNA gefunden wird. Der Streifen Marker 2 wurde als Kontrolle mit pbR-DNA hybridisiert: es konnte keine RNA nachgewiesen werden. Streifen Nummer 3 war eine andere Kontrolle, die mit cDNA hybridisiert wurde, die aus der Gesamt-RNA von Fibroblasten hergestellt wurde. Es kann erkannt werden, dass die Bande n mit vielen RNAs hybrisiert, sogar mit mehr RNAs als in Bande i, was beweist, dass RNA in Bande n vorhanden ist, obwohl die A341-cDNA nicht mit dieser RNA hybridisiert. Dies zeigt, dass die Hybridisierung der A341-cDNA mit der induzierten 14S-RNA sehr spezifisch ist.

Fig. 4b zeigt zwei Streifen (ß1 und ß2), auf die die gesamte RNA aus den induzierten Fibroblasten geblottet wurde. Der als ß2 bezeichnete Streifen wurde mit der A341-cDNA hybridisiert. Die Grösse der durch die A341-cDNA nachgewiesene RNA wurde durch Vergleich mit RNAs bekannter Grössen (nicht gezeigt) als 1,3 Kilobasen (kb) bestimmt. Der als ß1 bezeichnete Streifen wurde mit einem cDNA-Klon hybridisiert, der als dem IFN-ß1 -Protein entsprechenden 20 KDa Protein (wie in Fig. 1b) mittels Verfahren, die in Fig. 2 und 3 für IFN-ß2 veranschaulicht sind, identifiziert wurde. Es ist dargestellt, dass die IFN-ß1-mRNA 0,9 kb gross ist.

Tabelle 1 zeigt, dass mRNA, die durch Hybridisierungsselektion mittels der A341-cDNA (wie in Fig. 3) gereinigt wurde, Interferonaktivität codiert. Die gereinigte RNA wurde in Xenopus-Oocyten injiziert und die in das Medium, in dem die Oocyten (Oocyten-Überstand) inkubiert wurden, abgesonderten Proteine wurden auf IFN-Aktivität mittels zwei experimentellen Verfahren untersucht. In dem Versuch 1 wurden die hergestellten Proteine menschlichen Fibroblasten zugegeben, die mit vesikularem Stomati-tis-Virus (VSV) infiziert wurden. Ein Antikörper gegen das G-Protein des VSV wurde in einem Radioim-munassay verwendet, um die Menge der von den Zellen hergestellten Viren zu messen. Es ist dargestellt, dass mit dem Oocyten-Überstand der nicht injizierten Oocyten die willkürliche Menge der durch die menschlichen Fibroblasten hergestellten Viren in dem Radioimmunoassay 7445 cpm entsprachen. Mit einem Interferon-Standard von 100 Einheiten pro ml nimmt diese Menge wie erwartet bis 700 cpm ab. Mit dem durch die gereinigte RNA hergestellten Protein, der mit einem cDNA-Klon von IFN-ß2 identisch ist (in diesem Fall entspricht E474 der 5'-Position der IFN-ß2-mRNA), wurde die Virusmenge auf 1920 cpm reduziert, beinahe so tief wie mit dem IFN-Standard. Als Kontrolle verwendeten wir RNA, die mit einer nichtverwandten Plasmid-cDNA gereinigt wurde, und mit dieser Kontrolle ergab sich nur eine, im Vergleich mit der nichtinjizierten Oocyten-Kontrolle, nichtsignifikante Virusreduktion.

In Versuch 2 wurden auch die Proteine des Oocytenüberstandes zu den menschlichen Fibroblasten gegeben, aber wir haben die Induktion der 2'-5'-Oligoadenylatsynthetase gemessen, welche eine durch IFN in Zellen induzierte Enzymaktivität ist. In diesem Fall wird das radioaktive [32P]-A2'p5'A-Produkt höher sein, je mehr IFN in dem Assay ist.

Es ist dargestellt, dass menschliche Fibroblasten, die 100 Einheiten pro ml IFN-Standard ausgesetzt wurden, 10.800 cpm gegenüber nur 1.700 in Fibroblasten ergeben, die Extrakten aus (im Inkubations5

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medium lysierte Oocyten) nicht injizierten Oocyten ausgesetzt waren. Die mit einem Pool aus IFN-ß2-cDNA-Plasmiden hybridisierte RNA ergibt 4700 cpm, was erlaubt zu berechnen, dass die Extrakte der mit dieser IFN-ß2-RNA injizierten Oocyten ein Äquivalent von 30 E/ml lFN-Aktivität ergeben. Die RNA der Plasmid-DNA der Kontrolle ergab keine Aktivität, die über derjenigen des nicht injizierten Oocyten-extrakts lag. Es ist anzumerken, dass der Oocytenextrakt 15mal verdünnt wurde, so dass das IFN, das von IFN-ß2-spezifische mRNA hergestellt wurde, höher ist und 450 E/ml entspricht. Diese Tabelle zeigt, dass die reine IFN-ß2-mRNA, die durch Hybridisierung mit Klonen der IFN-ß2-cDNAs erhalten wurde, ein Protein mit der biologischen Aktivität von Interferon hergestellt. Dies beweist, dass das IFN-ß2-Pro-tein (wie in Fig. 3 durch gleiche Hybridisierungsselektion definiert) diese biologische Aktivität besitzt.

Tabelle

Hybridisierung und Translation von ß2-lnterferon mRNA

Versuch 1

Versuch 2

V.S.V.-Virus Ausbeute

Radioimmuntest,

cpm

Oligo-Isoadenylat-Synthetaseinduktion [32P]-A2'p5'A, cpm berechneter IF-Titer

Oocyten-Überstand (verdünnt 1:10)

Oocytenextrakt (verdünnt 1:15)

nicht injiziert

7445

1700

mit RNA, welche an IF-ß2-Plasmid hybridisierte (=A341)

1920

4700

30 U/ml mit RNA, welche an ein nicht modifiziertes Plasmid hybridisiert (= pBR322)

6015

1500

0

Interferon-Standard 100 U/ml

700

10800

Anmerkung: In Versuch 1 wurde DNA des Klons E 474 verwendet, während für Versuch 2 ein Pool (Gemisch) von IF-ß2 DNA-Plasmiden verwendet wurde.

Beispiel a) Reinigung der beiden Interferon-mRNA's aus menschlichen diploiden Fibroblasten

RNA wird aus Monolayerkulturen der menschlichen Fibroblastenlinie FS11 (isoliert am Weizmann Institute of Science) extrahiert. Diese diploiden Zellen aus der Vorhaut eines normalen, 8 Tage alten Knaben werden von 15 gesonderten Isolaten ausgewählt im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Bildung hoher Interferon-Titer. Alternativ werden Kulturen eines Klones von menschlichen SV 80 Zellen verwendet. Die Kulturen in Eagle's Minimalmedium mit 10% fötalem Kälberserum werden in 2,2 Liter fassenden Rollerflaschen aus Glas oder 22 x 22 cm Tabletts aus Kunststoff in einer Atmosphäre aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft bei 37°C inkubiert. 3 Tage nach dem Zusammenfliessen der Zellen werden die Kulturen zur Produktion von Interferon induziert, indem sie 3Vz Stunden lang mit 100 (ig/ml Poly(rl:rC) und 50 ng/ ml Cycloheximid (dies blockiert die Synthese von Proteinen durch den Wirt), behandelt werden. Actinomycin D (das die Synthese von zellulärer RNA blockiert) wird in einer Menge von 1 ng/ml zugesetzt. 1 Stunde später werden die Zellen mit gepuffertem Nonidet-P40 Detergens (Netzmittel) lysiert und die cytoplasmatische RNA wird mit einem Phenol-Kresol-Gemisch nach Kirby (1965) extrahiert. Die mRNA's werden aus der Gesamt-RNA dadurch isoliert, dass man sie an Oligo-dT-Cellulose bindet, da sie selbst Poly-A enthalten. Der mRNS-Anteil wird anschliessend durch Sucrosegradientenzentrifugation fraktioniert. Die Fraktionen, die Interferon-mRNA enthalten, werden durch Mikroinjektion in Oocyten von Xenopus laevis gemäss N. K. B. Raj und P. M. Pitha, (Proc. Nati. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 1483 bis 1487) identifiziert. 24 bis 40 Stunden später wird die antivirale Aktivität des in das Oocyten-Inkubationsmedium freigesetzten Interferons bestimmt. Die antivirale Aktivität wird dadurch bestimmt, dass man FS11-Zellen mit Verdünnungen des Oocytenmediums behandelt. Die Zellen werden mit dem Virus der vesiculären-Stomatitis (VSV) infiziert. Es wird die Hemmung des cytopathischen Effekts des Virus beobachtet. Die Interferontiter werden durch Vergleich mit einer bekannten Lösung entsprechend der letzten wirksamen Verdünnung berechnet. Die Interferon-mRNA enthaltenden Fraktionen werden ausserdem durch Translation in einem Reticulocyten-Lysat und anschliessende Immunpräzipitation des Produkts nach der Methode von Weissenbach et al., (Eur. J. Biochemistry, Bd. 98, (1979), S. 1 bis 8) identifiziert.

Fig. 1a zeigt die beiden Peaks der Interferon-mRNA-Aktivität, ermittelt durch Injektion in Oocyten. Fig. 1b zeigt die Linien, die durch Immunpräzipitation der Translationsprodukte mit dem Anti-Interferon-Serum erhalten wurden. Die beiden Pfeile zeigen die beiden Polypeptide vom Molekulargewicht

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23 000 (23 K) und 20 000 (20 K). Die Saccharose-Gradientenfraktionen, die für die 23 K und 20 K im-munpräzipitierten Polypeptide kodieren, sind in Fig. 1a gezeigt. Es ist ersichtlich, dass sie den beiden Peaks der Interferon-mRNS-Aktivität entsprechen.

Interferonaktivität wird auch in den Translationsprodukten der Reticulocyten-Lysate durch Bestimmung der Induktion der (2'-5')-OIigo-isoadenylat-Synthetase in menschlichen Zellen festgestellt. Aufgrund der beiden Methoden kann festgestellt werden, dass der grössere Interferon-mRNA-Peak für das 23K-Poly-peptid kodiert, während der kleinere Interferon-mRNA-Peak für das 20K-Polypeptid kodiert. Beide Inter-feron-mRNA's werden auf diese Weise isoliert und zur Klonierung in E. coli verwendet.

b) Klonierung von lnterferon-B2-cDNA in E. coli

Die gereinigte mRNA aus induzierten Zellen enthält etwa 1 bis 3% der mRNA für das Polypeptid vom Molekulargewicht 23 000. Sie dient als Matrize zur Synthese von cDNA durch reverse Transkriptase von Vogelmyeloblastosis-Virus (AMV). Als Starter wird Oligo-dT verwendet. Nach Eliminierung der RNA durch Alkalibehandlung kann der zweite Strang der DNA mit reverser Transkriptase oder DNA-Polyme-rase I synthetisiert werden. Einsträngige DNA wird mit Nuclease S1 weghydrolysiert, und die 3'-Enden der DNA werden mit Nucleotid-terminaler Transferase unter Verwendung von dGTP als Substrat verlängert. Die Plasmid-DNA, welche in entsprechender Weise mit terminaler Transferase und dCTP verlängert wurde, wird mit dieser dG-verlängerten menschlichen cDNA hybridisiert und in E. coli DP 50 eingeschleust. Transformierte Bakterienkolonien werden durch Auftragen auf Agarplatten identifiziert (selektio-niert), die Luria Nährbrühe, Diaminopimelinsäure, Thymidin und Tetracyclin enthalten. Die Kolonien werden weiterhin auf ähnlichen Agarplatten geprüft, die Ampicillin als einziges Antibiotikum enthalten. Auf einem Nitrocellulosefilter auf einer Agarplatte der vorstehend beschriebenen Art mit 10 ng/ml Tetracyclin lässt man die ampicillinempfindlichen, tetracyclinresistenten Bakterienkolonien heranwachsen. Über 2000 der erhaltenen transformierten Kolonien werden auf andere Nitrocellulosefilter übertragen, die ebenfalls auf Agarplatten der vorstehend beschriebenen Art aufgelegt sind. Jede der Duplikatkolonien wird ihrer jeweiligen Ursprungs- oder Ausgangskolonie zugeordnet, gewöhnlich durch gemeinsame Numerierung. Sobald die Kolonien einen Durchmesser von 3 bis 5 mm erreicht haben, werden die Filter (Ausgangskolonien und Duplikate) auf einen Stapel aus Filterpapieren übertragen, die zunächst mit 0,5 n Natronlauge, sodann mit 0,15 molarer Kochsalzlösung und 0,1 n Natronlauge imprägniert worden sind, um in situ die entsprechenden DNA's freizusetzen. Die Filterpapiere werden neutralisiert und getrocknet. Zum Nachweis der Bakterienkolonien, die die Interferon-DNA-Sequenzen enthalten, werden die Filterpapiere mit zwei verschiedenen [32P]cDNA-Proben hybridisiert. Eine cDNA-Probe wird durch reverse Transkriptase der mRNA aus der Sucrose-Gradientenfraktion von induzierten Zellen (Pfeil 23K der Fig. 1) hergestellt. Die zweite Probe wird in gleicher Weise aus der entsprechenden Fraktion des nicht-induzierten Zellenpräparats hergestellt. Beide cDNA-Proben werden mit den vier stark radioaktiven [32p]-Desoxynucleosidtriphosphaten als Substrate und fragmentierter Kälberthymus-DNA als Starter synthetisiert. Auf diese Weise wird eine statistische Wiedergabe der mRNA-Sequenzen in den cDNA-Pro-ben erreicht. Die Hybridisierung wird während 18 Stunden bei 62 bis 64°C in einem 0,9 molaren NaCI-0,09 molarem Natriumcitrat-Puffer vom pH-Wert 7,0 durchgeführt. Die Ausgangskolonien werden mit den cDNA Proben der induzierten Zellen und die Duplikatkolonien mit den cDNA-Proben der nicht-indu-zierten Zellen (oder umgekehrt) hybridisiert. Nach gründlichem Waschen werden die Filter auf Röntgenfilm gelegt, und es werden die Bakterienkolonien festgestellt, die nur mit der «induzierten» cDNA, nicht jedoch mit der «nicht induzierten» cDNA hybridisieren. Auf diese Weise wurden 20 verschiedene Bakterienkolonien aus insgesamt mehr als 2000 untersuchten transformierten Kolonien isoliert. Diese 20 Bakterienkolonien enthalten Mehrfachkopien eines Plasmids, in welches DNA-Sequenzen inseriert sind, welche sich vom menschlichen mRNA ableiten, die nur dann exprimiert wird, nachdem die Zellen durch Poly-(rhrC) zur Interferonproduktion induziert worden sind.

Ein Beispiel zur Erläuterung dieser Methode ist in Fig. 2 anhand von 15 Paaren von alkalibehandelten Kolonien (Ausgangs-Kolonien und Duplikatkolonien) auf ihren Nitrocellulosefiltern wiedergegeben, deren DNA's mit [32P]-cDNA's hybridisiert worden sind, die von den mRNA-Fraktionen 23K von Fig. 1 hergestellt wurden, welche entweder aus mit Poly(rl):(rC) zur Interferonproduktion induzieren (i) Zellen oder aus nicht induzierten (n.i.) Zellen stammten. Die Pfeile zeigen (zwei) Kolonien, insbesondere die Kolonien 5 und 13, welche die induzierten Sequenzen enthalten.

Die Kolonie Nr. 13 wird als E. coli DP50/A341 bezeichnet.

c) Isolierung von Interferon-mRNA aus menschlichen Fibroblasten

Interferon mRNA (und der Nachweis der Gegenwart von Interferon-cDNA-Sequenzen in der Plasmid-DNA des Klones A341) wird folgendermassen erhalten:

Eine 500 ml Kultur dieses Bakterienklones wird zur Herstellung von 50 (ig Plasmid-DNA verwendet. Diese DNA wird nach vorheriger Denaturierung kovalent an Diazobenzyloxymethyl-Cellulosepulver nach der Methode von Aldwine et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977) S. 5350, gebunden. In ähnlicher Weise wird Plasmid pBR322-DNA (die keine humanen DNA-Sequenzen enthält), an Cellulose gebunden. Poly-A enthaltende mRNA aus menschlichen Fibroblasten, die zur Interferonbildung induziert

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worden sind, wird mit den beiden DNA-Celiulosepräparaten in 50prozentigem Formamid bei 52°C hybridisiert. Sodann wird mit reinem Formamid bei 70°C eluiert. Die nach dem Eluieren wiedergewonnene RNA wird in dem zellfreien Reticulocyten-System (Fig. 3) translatiert. Das entstandene Translationsprodukt der an der A341-DNA-Cel!u!ose selektierten mRNA ist im wesentlichen das Polypeptid vom Molekulargewicht 23 000. Von der pBR 322 DNA-Cellulose hingegen wird keine menschliche Interferon-mRNA isoliert. Im Vergleich zu den Translationsprodukten der menschlichen mRNA vor der Hybridisierung an A341 DNA-Cellulose konnte festgestellt werden, dass die klonierte A341 DNA nur zu einem geringen Teil komplementär ist zu der mRNA des Gemisches. Das Produkt der an A341 DNA-Cellulose gebundenen mRNA wird durch das menschliche Fibroblasten-Interferon-Antiserum immunpräzipitiert.

Die Interferon-mRNA kann auch nach einem ähnlichen Verfahren isoliert werden, wie dies vorstehend beschrieben ist, bei dem die Piasmid-A341-DNA jedoch an Nitrocellulosefilter gebunden ist, dann m-RNA daran hybridisiert wird und schliesslich durch 1 minütiges Kochen in Wasser eluiert wird.

Die Aktivität dieser gereinigten mRNA zur Kodierung für biologisch aktives menschliches Interferon konnte durch Injektion in Oocyten von Xenopus laevis und anschliessende Bestimmung der Hemmung der Virusvermehrung in menschlichen Zellen festgestellt werden, die dem Oocyten-Inkubationsmedium ausgesetzt wurden; vgl. Tabelle I. Die Interferon-Aktivität der gereinigten ß2-mRNA kann auch durch Induktion der (2'-5')-Oligoisoadenylat-Synthetase in menschlichen Zellen durch die Oocyten-Translations-produkte gezeigt werden; vgl. Tabelle I.

Die Restriktionskartierung der A341-Plasmid-DNA (die Analyse der A321-Plasmid-DNA durch Restriktionsenzyme) zeigt, dass sie ein Insert aus menschlicher DNA von etwa 900 Nucleotiden in der Pst-Schnittsteile enthält. Die A341-DNA hybridisiert auch mit drei Fragmenten des menschlichen Genoms, das durch Eco R1-Nuclease geschnitten wurde. Diese Fragmente werden durch Agarose-Gelelektrophorese voneinander getrennt. Die Hybridisierung an Agarose-Gelelektropherogramme von mRNA aus menschlichen Fibroblasten zeigt ferner, dass A341-DNA komplementär ist zu RNA-Sequenzen, die nur in Zellen exprimiert werden, die dem Interferon-Induktor Poly (rl : rC) ausgesetzt wurden; vgl. Fig. 4a. Selbst eine einstündige Behandlung der Zellen mit Poly (rl:rC) führt zur Anhäufung einer etwa 1300 Nucleotide langen RNA, die mit A341-DNA hybridisiert. Diese stellt die IFN ß2-mRNA dar.

Die vorstehenden Werte zeigen, dass der bakterielle Klon E. coli DP50/A341 in der Pst-Schnittstelle seines pBR322-Plasmids ein Insert von etwa 900 Nucleotiden aus menschlichen cDNA-Sequenzen enthält, die komplementär zu einer menschlichen Interferon-mRNA sind. Es wurden mehrere, auf ähnliche Weise hergestellte Klone erhalten. Fig. 4b zeigt, dass Klone für IFN-ß2 mit der grösseren, etwa 1300 Nucleotideinheiten langen mRNA hybridisieren, während Klone für IFN-ß1 mit der kleineren, etwa 900 Nucleotideinheiten langen mRNA hybridisieren.

Das Verfahren kann zur Herstellung von Klonen von Interferon-DNA unterschiedlicher Typen (a, ß, 7) aus menschlichen Zellen verwendet werden.

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Menschliches Fibroblasteninterferon ß2, dadurch gekennzeichnet, dass es ein einzelnes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 23 000 ist.

   2. Verfahren zum Herstellen von menschlichem Fibroblasteninterferon ß1 und ß2, dadurch gekennzeichnet, dass

   (a), eine Kultur von Fibroblastenzeilen einem exogenen Faktor- ausgesetzt wird, wodurch in den genannten Zellen die Synthese von Interferon mRNA induziert wird,

   (b) die in den induzierten Zellkulturen gebildeten mRNAs sowie weiterhin mRNAs von nicht-induzier-ten Kontrollkulturen der gleichen Wirtszellen extrahiert werden,

   (c) doppelsträngige cDNAs, abgeleitet von der mRNA, die aus der induzierten Kultur extrahiert wurde, synthetisiert werden, die genannten cDNAs in Vektoren inseriert werden, Mikroorganismen mit den erhaltenen, modifizierten Vektoren transformiert werden, und dass die genannten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, um eine selektive Entwicklung von Mikroorganismenkolonien, enthaltend den genannten Vektor, sogenannte Ausgangskolonien, zu veranlassen,

   (d) Duplikatkolonien der genannten Ausgangskolonien gebildet werden,

   (e) die DNAs sowohl der Ausgangs- als auch der Duplikatkolonien in situ freigesetzt werden,

   (f) cDNA-Proben der mRNAs sowohl der induzierten Kultur als auch der nicht-induzierten Kontrollkultur synthetisiert werden, wobei die entsprechenden mRNAs als Template verwendet werden, wodurch induzierte cDNA und nicht-induzierte cDNA hergestellt wird,

   (g) die DNAs der Ausgangskolonien einerseits und der Duplikatkolonien andererseits, jeweils mit den oben genannten induzierten und nicht-induzierten cDNA-Proben hybridisiert werden,

   (h) die DNAs, die mit den induzierten cDNA-Proben, nicht jedoch mit den nicht-induzierten cDNA-Proben hybridisieren, wiedergewonnen, und

   (i) die vorher in Verfahrensschritt (b) extrahierten mRNAs mit einzelnen DNAs aus Verfahrensschritt (h), die nach Inserieren in einem Vektor an einem Träger immobilisiert wurden, unter Bedingungen kontaktiert werden, die geeignet sind, um Hybridisierung zu erlauben und darauffolgend die fixierten mRNAs von dem immobilisierten DNA-Vektor in im wesentlichen reiner Form eluiert werden, die so eiuierten mRNAs translatiert werden, um festzustellen, welche in menschliches Fibroblasteninterferon

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   ß1 oder ß2 translatierbar sind und somit die entsprechenden DNAs aus Stufe (h), die für menschliches Fibroblasteninterferon ß1 oder ß2 kodieren, identifiziert werden,

   (j) die so identifizierten Interferon-DNAs aus Verfahrensschritt (h) in Mikroorganismen eingeführt werden, so dass kultivierbare Zellen gebildet werden,

   (k) die Zellen kultiviert werden und das menschliche Fibroblasteninterferon ß1 oder ß2 aus diesen extrahiert und gereinigt wird.

   3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der exogene Faktor aus Verfahrensschritt (a) doppelsträngige RNA ist.

   4. Verfahren nach Patentanspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die in Stufe (b) erhaltenen mRNAs durch Saccharosegradienten-Zentrifugation fraktioniert werden.

   5. Menschliches Fibroblasteninterferon ß1, erhalten nach dem Verfahren gemäss einem der Patentansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 20 000 ist.

   6. Menschliches Fibroblasteninterferon ß2, erhalten nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es ein einzelnes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 23 000 ist.

   7. Verwendung von menschlichem Fibroblasteninterferon ß1 nach Anspruch 5 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates mit antiviraler und Antitumoraktivität.

   8. Verwendung von menschlichem Fibroblasteninterferon ß2 nach Anspruch 1 zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates mit antiviraler und Antitumoraktivität.

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