CH664967A5 - Im wesentlichen reine mrna's des menschlichen fibroblasten-interferons. - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG

Interferon ist ein wichtiges, vom Körper hergestelltes antivirales Protein, das auch eine Wachstumshemmung von Tumorzellen bewirkt. Aufgrund seiner Artspezifität wird zur Anwendung in der Humanmedizin menschliches Interferon benötigt. Die begrenzten Mengen an Interferon, die in Gewebekulturzellen oder frischen Leukozyten gebildet werden, genügen nicht für die klinische Verwendung in grossem Massstab. Das Einschleusen der genetischen Information für menschliches Interferon in Bakterien könnte die Produktion eines Polypeptids mit Interferon-Aktivität ermöglichen. Es ist bekannt, dass derartige Methoden für das menschliche Wachstumshormon und für Insulin entwickelt wurden.

Die beiden Typen von Interferon, nämlich Leukozyten-Interferon (IFN-a) und Fibroblasten-Interferon (IFN-ß) werden anscheinend von verschiedenen mRNA's kodiert; vgl. Cavallieri et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 4415 bis 4419. Die Isolierung dieser mRNA's in reiner Form ist bis jetzt noch nicht gelungen. Dies erscheint auch um so schwieriger, als die Wirtszelle nur dann in der Lage ist, die Interferon-mRNA zu synthetisieren, wenn die Zelle geeigneten exogenen Faktoren ausgesetzt wird, beispielsweise einer viralen Infektion oder speziellen synthetischen Polynucleotiden, wie Poly(rI:rC). Selbst dann produziert die Zelle nur in geringsten Mengen. Dementsprechend wurde vorgeschlagen, einen mRNA-Extralct von Wirtszellen zu verwenden, welche vorher zur Bildung von Interferon induziert worden waren, und diese mRNA in vitro in einem zellfreien System mit allen Bestandteilen, insbesondere den natürlichen Aminosäuren, translatieren zu lassen, um auf diese Weise ein Proteinpräparat mit Interferon-Aktivität zu erhalten. Die Interferon-mRNA stellt jedoch nur einen sehr untergeordneten Anteil der zu translatierenden mRNA's dar, und dementsprechend war das schliesslich erhaltene Proteinpräparat mit Interferon-Aktivität sehr stark durch andere Proteine verunreinigt.

Daher würde die Verwendung solcher mRNA-Präparate als Ausgangsmaterial zur direkten Umwandlung in Doppelstrang-DNA, welche nach Insertion in einen geeigneten Vektor kloniert werden soll, Screening-Schwierigkeiten mit sich bringen, die praktisch unüberwindlich wären.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die erwähnten Schwierigkeiten der Interferon-Herstellung mit Hilfe von zwei im wesentlichen reinen mRNA's weitestgehend zu überwinden.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindungen sind die beiden mRNA's, wie sie in den Patentansprüchen 1 und 2 definiert sind. Eine für IFN-ß-1 codierende mRNA in praktisch reiner Form ist neu. Eine für IFN-ß-2 codierende mRNA war bisher völlig unbekannt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung solcher mRNA's, wie in Patentanspruch 3 definiert.

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Die Erfindung bezieht sich ferner auf die Verwendung dieser mRNA's zur Herstellung von menschlichem Interfe-ron-ß-1 und Interferon-ß-2 gemäss den Patentansprüchen 6 und 7.

Es ist als Vorteil einzuschätzen, dass einige der vorstehend aufgeführten Stufen nicht in genau der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden müssen. Dies trifft insbesondere zu für die Stufe (f), welche die Herstellung der cDNA-Proben betrifft.

Die Stufen (f) und (c) werden lediglich an Fraktionen der mRNA's durchgeführt, die aus den Zellen extrahiert werden, und zwar aus den induzierten oder nicht induzierten Zellen. In dieser Hinsicht kann die Tatsache ausgenutzt werden,

dass mRNA's einen Poly-A-Teil enthalten, der die Abtrennung der mRNA von der Gesamt-RNA durch Bindung an Oligo-T-Cellulose ermöglicht. Die anschliessend eluierte mRNA-Fraktion wird vorteilhafterweise danach noch durch eine Sucrose-Gradienten-Zentrifugation fraktioniert. Die verschiedenen Banden werden sodann gesondert in einem geeigneten zellfreien System, beispielsweise einem Reticulo-cyten-Lysat, translatiert. Jedes der Translationsprodukte wird dann darauf untersucht, ob es durch ein Anti-Interfe-ronserum ausgefällt wird. Die Banden der mRNA, deren Translationsprodukte eine positive Reaktion bei diesem Im-munpräzipitationstest ergeben, werden zur Durchführung der beiden vorstehend beschriebenen Stufen (f) und (c) zurückbehalten. Ein weiterer Aspekt dieses Verfahrens ist darin zu erblicken, dass zwei verschiedene mRNA's, die für Interferon kodieren, aus menschlichen Fibroblastenzellen isoliert werden können, wenn diese Zellen gemäss Stufe (a) induziert werden. Die kleinere mRNA sedimentiert bei IIS und liefert durch Translation in einem zellfreien System ein Protein mit einem Molekulargewicht von 20 000. Dieses wird durch Antikörper, die gegen eines der Interferone erzeugt werden, welche aus diesen Zellen gewonnen und gereinigt werden können, selektiv ausgefällt. Dieses Protein ist menschliches Interferon (IFN)-ßl. Die grössere mRNA sedimentiert bei 14 S und liefert ein Protein mit einem Molekulargewicht von 23 000. Dieses Protein wird durch Antikörper gegen ein weniger gereinigtes Fibroblasten-Interferonpräpa-rat ausgefällt. Dieses Protein wird als menschliches Interfe-ron-ß2 bezeichnet. Fraktionen von mRNA für beide Proteine werden in der Stufe (c) eingesetzt. Dies ermöglicht die beliebige Herstellung von IFN ßl oder IFN ß2 in praktisch reiner Form. Die Hybridisierung (Stufen (f), (a), (d), (e), (g) und (h) gestattet eine genaue Identifizierung von einzelnen E. coli-Kolonien, die eine der beiden Interferon-cDNA's für IFN ßl oder ß2 enthalten.

Es liegt auf der Hand, dass diejenigen Kolonien, die nur mit «induzierten» cDNA-Proben und nicht mit den «nicht-induzierten» cDNA-Proben hybridisieren, nur solche Kolonien darstellen, die einen modifizierten Vektor mit der cDNA enthalten, die der Interferon-mRNA entspricht, weil a) die DNA, die mit der «nicht-induzierten» cDNA-Probe nicht hybridisierbar ist, dementsprechend keiner der mRNA's entspricht, die normalerweise von einer nicht-induzierten Zelle gebildet werden und b) der einzige Unterschied zwischen den beiden Proben darin besteht, dass die «induzierte» cDNA-Probe eine cDNA aus einer der Interferon-mRNA's enthält, die andere Probe dagegen nicht.

Die Herstellung dieser cDNA-Proben kann nach üblichen Methoden erfolgen, insbesondere durch Transkription mit einer reversen Transkriptase. Vorzugsweise wird ein bakterieller Vektor mit hoher Kopienzahl, wie das pBR322-Plasmid verwendet. Um die spätere Expression der durch die Interferon-cDNA modifizierten Vektoren in einem Mikroorganismus zu erhalten, kann man einen Satz von Vektoren verwenden, wie sie von Patrick Charney et al., in dem Aufsatz «Bacteriophage Lambda and Plasmid Vectors Allowing Fusion of Cloned Genes in each of the three translational phases», Nucleic Acids Res., Bd. 5 (12), 1978, S. 4479 bis 4494, beschrieben wurden.

Gemäss einem weiteren wichtigen Schritt des erfindungs-gemässen Verfahrens wird der vorstehend modifizierte Vektor, wie immer sein (Translations-)Leseraster auch vorliegen mag, zur Extraktion von Interferon-mRNA aus dem RNA-Gemisch verwendet das durch die induzierten Zellen gebildet wird. Bei diesem Verfahren werden diese RNA's mit einem derartigen durch die Interferon-cDNA modifizierten Vektor zusammengebracht, welcher vorher auf einem Träger fixiert worden ist. Die Vereinigung (von mRNA's und modifiziertem Vektor) erfolgt unter solchen Bedingungen, die die Hybridisierung erlauben. Danach wird die hängengebliebene (gebundene) mRNA von dem fixierten DNA-Vektor eluiert. Auf diese Weise wird mRNA von menschlichem Interferon (entweder IFN ßl oder IFN ß2) in hochgereinigter Form erhalten.

Der hohe Reinigungsgrad ergibt sich aus der Tatsache, dass das Translationsprodukt in einem geeigneten in vitro-System in jedem Fall im wesentlichen aus einem einzigen Polypeptid mit Interferonaktivität besteht, das durch die Antikörper gegen menschliches Interferon ausgefällt wird.

Die Erfindung betrifft somit auch die gereinigten mRNA's, die normalerweise etwa 900 Nucleotide für IFN-ßl und etwa 1300 Nucleotide für IFN-ß2 enthalten. Die Erfindung betrifft ferner die beiden unterschiedlichen Interferon-mRNA's und somit die Proteinkomponenten, die auch unterschiedliche biologische Bedeutung haben können. Es liegt auf der Hand, dass jedem der Hybridisierungsschritte des erfmdungsgemässen Verfahrens, sofern erforderlich, eine Denaturierung der möglichen doppelsträngigen Nucleinsäu-ren vorangeht, um sicherzustellen, dass keine doppelsträngigen Nucleinsäuren (die eine Interferon-Aktivität in Zellen induzieren könnten) in den gereinigten mRNA's verbleibt, wenn diese zur in vitro-Produktion durch Translation von praktisch reinem Protein mit Interferon-Aktivität verwendet werden.

Die Erfindung wird anhand der Figuren und Tabellen weiter erläutert.

Fig. 1 zeigt die Fraktionierung von mRNA an einem Su-crosegradienten sowie die Translation dieser aus induzierten Zellen stammenden mRNA-Fraktionen in Xenopus laevis-Oocyten zur Herstellung von menschlichem Interferon und ihre Translation in Reticulocyten-Lysaten zur Produktion spezifisch immunpräzipitierbarer Proteine. Dieses Verfahren gestattet die Trennung der mRNA's für IFN-ßl und IFN-ß2.

Fig. 2 veranschaulicht das Ergebnis einer differentiellen Hybridisierung der DNA's der gleichen bakteriellen Kolonien mit den beiden vorstehend erwähnten cDNA-Proben aus induzierten und nicht induzierten Zellen.

Fig. 3 erläutert eine Reinigung von Interferon IFN ß2-mRNA durch Hybridisierung mit immobilisierter DNA aus dem bakteriellen Klon A341, nachgewiesen durch Translation in einem Reticulocytenlysat.

Fig. 4 zeigt, dass DNA aus dem bakteriellen Klon A341 komplementär ist zu einer mRNA mit etwa 1300 Nucleoti-den, die in menschlichen Zellen nur nach Induktion der Interferonsynthese auftritt.

Tabelle I zeigt, dass diese mRNA nach Translation in den Oocyten von Xenopus laevis biologisch aktives Interferon liefert, welches das Wachstum eines Virus in menschlichen Zellen hemmt.

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Beispiel a) Reinigung der beiden Interferon-mRNA's aus menschlichen diploiden Fibroblasten

RNA wird aus Monolayerkulturen der menschlichen Fi-broblastenlinie FS 11 (isoliert am Weizmann Institut of Science) extrahiert. Diese diploiden Zellen aus der Vorhaut eines normalen, 8 Tage alten Knaben werden von 15 gesonderten Isolaten ausgewählt im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Bildung hoher Interferon-Titer. Alternativ werden Kulturen eines Klones von menschlichen SV 80 Zellen verwendet. Die Kulturen in Eagle's Minimalmedium mit 10% fötalem Kälberserum werden in 2,2 Liter fassenden Rollerflaschen aus Glas oder 22 x 22 cm Tabletts aus Kunststoff in einer Atmosphäre aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft bei 37 C inkubiert. 3 Tage nach dem Zusammenfassen der Zellen werden die Kulturen zur Produktion von Interferon induziert, indem sie 3'/2 Stunden lang mit 100 (ig/ml Poly-(rI:rC) und 50 jig/ml Cycloheximid (dies blockiert die Synthese von Proteinen durch den Wirt), behandelt werden. Ac-tinomycin D (das die Synthese von zellulärer RNA blok-kiert) wird in einer Menge von 1 ng/ml zugesetzt. 1 Stunde später werden die Zellen mit gepuffertem Nonidet-P40 De-tergens (Netzmittel) lysiert und die cytoplasmatische RNA wird mit einem Phenol-Kresol-Gemisch nach Kirby (1965) extrahiert. Die mRNA's werden aus der Gesamt-RNA dadurch isoliert, dass man sie an Oligo-dT-Cellulose bindet, da sie selbst Poly-A enthalten. Der mRNS-Anteil wird anschliessend durch Sucrosegradientenzentrifugation fraktioniert. Die Fraktionen, die Interferon-mRNA enthalten, werden durch Mikroinjektion in Oocyten von Xenopus laevis gemäss N.K.B. Raj und P.M. Pitha, (Proc. Nati. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 1483 bis 1487) identifiziert. 24 bis 40 Stunden später wird die antivirale Aktivität des in das Oocy-ten-Inkubationsmedium" freigesetzten Interferons bestimmt. Die antivirale Aktivität wird dadurch bestimmt, dass man FS 11-Zellen mit Verdünnungen des Oocytenmediums behandelt. Die Zellen werden mit dem Virus der vesiculären Stomatitis (VSV) infiziert. Es wird die Hemmung des cyto-pathischen Effekts des Virus beobachtet. Die Interferontiter werden durch Vergleich mit einer bekannten Lösung entsprechend der letzten wirksamen Verdünnung berechnet. Die Interferon-mRNA enthaltenden Fraktionen werden ausserdem durch Translation in einem Reticulocyten-Lysat und anschliessende Immunpräzipitation des Produkts nach der Methode von Weissenbach et al., (Eur. J. Biochemistry, Bd. 98, (1979), S. 1 bis 8) identifiziert.

Fig. la zeigt die beiden Peaks der Interferon-mRNA-Aktivität, ermittelt durch Injektion in Oocyten. Fig. lb zeigt die Linien, die durch Immunpräzipitation der Translationsprodukte mit dem Anti-Interferon-Serum erhalten wurden. Die beiden Pfeile zeigen die beiden Polypeptide vom Molekulargewicht 23 000 (23 K) und 20 000 (20 K). Die Sucrose-Gradientenfraktionen, die für die 23 K und 20 K immunprä-zipitierten Polypeptide kodieren, sind in Fig. la gezeigt. Es ist ersichtlich, dass sie den beiden Peaks der Interferon-mRNS-Aktivität entsprechen.

Interferonaktivität wird auch in den Translationsprodukten der Reticulocyten-Lysate durch Bestimmung der Induktion der (2' — 5')-01igo-isoadenylat-Synthetase in menschlichen Zellen festgestellt. Aufgrund der beiden Methoden kann festgestellt werden, dass der grössere Interfe-ron-mRNA-Peak für das 23K-Polypeptid kodiert, während der kleinere Interferon-mRNA-Peak für das 20K-Polypeptid kodiert. Beide Interferon-mRNA's werden auf diese Weise isoliert und zur Klonierung in E. coli verwendet.

b) Klonierung von Interferon-ß2-cDNA in E. coli

Die gereinigte mRNA aus induzierten Zellen enthält etwa 1 bis 3° o der mRNA für das Polypeptid vom Molekulargewicht 23 000. Sie dient als Matrize zur Synthese von cDNA durch reverse Transkriptase von Vogelmyeloblasto-sis-Virus (AMV). Als Starter wird Oligo-dT verwendet.

Nach Eliminierung der RNA durch Alkalibehandlung kann der zweite Strang der DNA mit reverser Transkriptase oder DNA-Polymerase I synthetisiert werden. Einsträngige DNA wird mit Nuclease S1 weghydrolysiert, und die 3'-Enden der DNA werden mit Nucleotid-terminaler Transferase unter Verwendung von dGTP als Substrat verlängert. Die Plas-mid-DNA, welche in entsprechender Weise mit terminaler Transferase und dCTP verlängert wurde, wird mit dieser dG-verlängerten menschlichen cDNA hybridisiert und in E. coli DP 50 eingeschleust. Transformierte Bakterienkolonien werden durch Auftragen auf Agarplatten identifiziert (selek-tioniert), die Luria Nährbrühe, Diaminopimelinsäure, Thy-midin und Tetracyclin enthalten. Die Kolonien werden weiterhin auf ähnlichen Agarplatten geprüft, die Ampicillin als einziges Antibiotikum enthalten. Auf einem Nitrocellulose-filter auf einer Agarplatte der vorstehend beschriebenen Art mit 10 (ig/ml Tetracyclin lässt man die ampicillinempfindli-chen, tetracyclinresistenten Bakterienkolonien heranwachsen. Über 2000 der erhaltenen transformierten Kolonien werden auf andere Nitrocellulosefilter übertragen, die ebenfalls auf Agarplatten der vorstehend beschriebenen Art aufgelegt sind. Jede der Duplikatkolonien wird ihrer jeweiligen Ursprungs- oder Ausgangskolonie zugeordnet, gewöhnlich durch gemeinsame Numerierung. Sobald die Kolonien einen Durchmesser von 3 bis 5 mm erreicht haben, werden die Filter (Ausgangskolonien und Duplikate) auf einen Stapel aus Filterpapieren übertragen, die zunächst mit 0,5 n Natronlauge, sodann mit 0,15 molarer Kochsalzlösung und 0,1 n Natronlauge imprägniert worden sind, um in situ die entsprechenden DNA's freizusetzen. Die Filterpapiere werden neutralisiert und getrocknet. Zum Nachweis der Bakterienkolonien, die die Interferon-DNA-Sequenzen enthalten, werden die Filterpapiere mit zwei verschiedenen [32P]cDNA-Proben hybridisiert. Eine cDNA-Probe wird durch reverse Transkriptase der mRNA aus der Sucrose-Gradientenfraktion von induzierten Zellen (Pfeil 23K der Fig. 1) hergestellt. Die zweite Probe wird in gleicher Weise aus der entsprechenden Fraktion des nicht-induzierten Zellenpräparats hergestellt. Beide cDNA-Proben werden mit den vier stark radioaktiven [32P]-Desoxynucleosidtriphosphaten als Substraten und fragmentierter Kälberthymus-DNA als Starter synthetisiert. Auf diese Weise wird eine statistische Wiedergabe der mRNA-Sequenzen in den cDNA-Proben erreicht. Die Hybridisierung wird während 18 Stunden bei 62 bis 64 °C in einem 0,9 molaren NaCl-0,09 molarem Natriumcitrat-Puffer vom pH-Wert 7,0 durchgeführt. Die Ausgangskolonien werden mit den cDNA-Proben der induzierten Zellen und die Duplikatkolonien mit den cDNA-Proben der nicht-induzierten Zellen (oder umgekehrt) hybridisiert. Nach gründlichem Waschen werden die Filter auf Röntgenfilm gelegt, und es werden die Bakterienkolonien festgestellt, die nur mit der «induzierten» cDNA, nicht jedoch mit der «nicht induzierten» cDNA hybridisieren. Auf diese Weise wurden 20 verschiedene Bakterienkolonien aus insgesamt mehr als 2000 untersuchten transformierten Kolonien isoliert. Diese 20 Bakterienkolonien enthalten Mehrfachkopien eines Plasmids, in welches DNA-Sequenzen inseriert sind, welche sich vom menschlichen mRNA ableiten, die nur dann exprimiert wird, nachdem die Zellen durch Poly(rI:rC) zur Interferonproduktion induziert worden sind.

Ein Beispiel zur Erläuterung dieser Methode ist in Fig. 2 anhand von 15 Paaren von alkalibehandelten Kolonien (Ausgangs-Kolonien und Duplikatkolonien) auf ihren Ni-trocellulosefiltern wiedergegeben, deren DNA's mit [32P]-cDNA's hybridisiert worden sind, die von den mRNA-Frak-

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tionen 23K von Fig. 1 hergestellt wurden, welche entweder aus mit Poly(rI):(rC) zur Interferonproduktion induzieren (i) Zellen oder aus nicht induzierten (n.i.) Zellen stammten. Die Pfeile zeigen (zwei) Kolonien, insbesondere die Kolonien 5 und 13, welche die induzierten Sequenzen enthalten.

Die Kolonie Nr. 13 wird als E. coli DP50/A341 bezeichnet.

c) Isolierung von Interferon-mRNA aus menschlichen Fibroblasten

Interferon mRNA (und der Nachweis der Gegenwart von Interferon-cDNA-Sequenzen in der Plasmid-DNA des Klones A341) wird folgendermassen erhalten:

Eine 500 ml Kultur dieses Bakterienklones wird zur Herstellung von 50 |ig Plasmid-DNA verwendet. Diese DNA wird nach vorheriger Denaturierung kovalent an Diazo-benzyloxymethyl-Cellulosepulver nach der Methode von Aldwine et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977) S. 5350, gebunden. In ähnlicher Weise wird Plasmid pBR322-DNA (die keine humanen DNA-Sequenzen enthält), an Cellulose gebunden. Poly-A enthaltende mRNA aus menschlichen Fibroblasten, die zur Interferonbildung induziert worden sind, wird mit den beiden DNA-Cellulose-präparaten in 50prozentigem Formamid bei 52 °C hybridisiert. Sodann wird mit reinem Formamid bei 70 °C eluiert. Die nach dem Eluieren wiedergewonnene RNA wird in dem zellfreien Reticulocyten-System (Fig. 3) translatiert. Das entstandene Translationsprodukt der an der A341-DNA-Cellu-lose selektierten mRNA ist im wesentlichen das Polypeptid vom Molekulargewicht 23 000. Von der pBR322-DNA-Cellulose hingegen wird keine menschliche Interferon-mRNA isoliert. Im Vergleich zu den Translationsprodukten der menschlichen mRNA vor der Hybridisierung an A341-DNA-Cellulose konnte festgestellt werden, dass die klonierte A341-DNA nur zu einem geringen Teil komplementär ist zu der mRNA des Gemisches. Das Produkt der an A341-DNA-Cellulose gebundenen mRNA wird durch das menschliche Fibroblasten-Interferon-Antiserumimmunpräzipitiert.

Die Interferon-mRNA kann auch nach einem ähnlichen Verfahren isoliert werden, wie dies vorstehend beschrieben ist, bei dem die Plasmid-A341-DNA jedoch an Nitrocellulo-sefilter gebunden ist, dann mRNA daran hybridisiert wird und schliesslich durch lminütiges Kochen in Wasser eluiert wird.

Die Aktivität dieser gereinigten mRNA zur Kodierung für biologisch aktives menschliches Interferon konnte durch Injektion in Oocyten von Xenopus laevis und anschliessende Bestimmung der Hemmung der Virusvermehrung in menschlichen Zellen festgestellt werden, die dem Oocyten-Inkubationsmedium ausgesetzt wurden; vgl. Tabelle I. Die Interferon-Aktivität der gereinigten ß2-mRNA kann auch durch Induktion der (2' — 5')-01igoisoadenylat-Synthetase in menschlichen Zellen durch die Oocyten-Translationspro-dukte gezeigt werden; vgl. Tabelle I.

Die Restriktionskartierung der A341-PIasmid-DNA (die Analyse der A321 -Plasmid-DNA durch Restriktionsenzyme) zeigt, dass sie ein Insert aus menschlicher DNA von etwa 900 Nucleotiden in der Pst-Schnittstelle enthält. Die A341-DNA hybridisiert auch mit drei Fragmenten des menschlichen Genoms, das durch Eco Rl-Nuclease geschnitten wurde. Diese Fragmente werden durch Agarose-Gelelektropho-rese voneinander getrennt. Die Hybridisierung an Agarose-Gelelektropherogramme von mRNA aus menschlichen Fibroblasten zeigt ferner, dass A341-DNA komplementär ist zu RNA-Sequenzen, die nur in Zellen exprimiert werden, die dem Interferon-Induktor Poly(rI:rC) ausgesetzt wurden; vgl. Fig. 4a. Selbst eine einstündige Behandlung der Zellen mit Poly(rI:rC) führt zur Anhäufung einer etwa 1300 Nucleotide

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langen RNA, die mit A341-DNA hybridisiert. Diese stellt die IFN-ß2-mRNA dar.

Die vorstehenden Werte zeigen, dass der bakterielle Klon E. coli DP50/A341 in der Pst-Schnittstelle seines pBR322-Plasmids ein Insert von etwa 900 Nucleotiden aus menschlichen cDNA-Sequenzen enthält, die komplementär zu einer menschlichen Interferon-mRNA sind. Es wurden mehrere, auf ähnliche Weise hergestellte Klone erhalten. Fig. 4b zeigt, dass Klone für IFN-ß2 mit der grösseren, etwa 1300 Nucleo-tideinheiten langen mRNA hybridisieren, während Klone für IFN-ßl mit der kleineren, etwa 900 Nucleotideinheiten langen mRNA hybridisieren.

Das Verfahren kann zur Herstellung von Klonen von Interferon-DNA unterschiedlicher Typen (a, ß, y) aus menschlichen Zellen verwendet werden.

Beschreibung der Figuren:

Figur 1:

Sucrose-Gradient von Poly-A-RNA aus menschlichen Zellen, die zur Herstellung von Interferon induziert worden waren (a). Sedimentation erfolgte von rechts nach links. In 10 Xenopus Oocyten werden 0,4 ng RNA aus jeder Fraktion injiziert. Nach 40 Stunden wird das Medium um die Oocyten mit FSll-Zellen auf Interferon untersucht (linke Skala).

Jede RNA-Fraktion (0,24 jag) wird auch in Reticulocyten-Lysaten translatiert, und die 35S-Methionin-markierten Produkte werden mit Anti-Interferon-Serum ausgefällt. Die durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysierten Produkte sind in der Reihe i von (b) gezeigt. Die Reihe n in (b) stellt die immunpräzipitierten Produkte von nicht-fraktio-nierter mRNA aus nicht induzierten Zellen dar. Am rechten Ende von (b) sind die Molekulargewichtsmarker angegeben (von oben nach unten 68,46, 30, 18 und 14 Dalton x 10~3). Die Position und die Intensität des 23K- und 20K-Proteins (Pfeile) wird aufgezeichnet und ist graphisch in a (rechte Skala) wiedergegeben. Die schwerere der beiden Interferon-mRNA's wird in das 23K-Protein translatiert, während die kleinere Interferon-mRNA in das 20K-Protein translatiert wird.

Figur 2:

Erkennung von transformierten bakteriellen Klonen, die Interferon-DNA enthalten.

Die Nukleinsäuren von 15 alkalibehandelten, auf Nitro-cellulosefiltern gewachsenen Kolonien werden in situ mit [32P]cDNA hybridisiert. Diese wurde an der 23K mRNA synthetisiert, welche entweder aus Zellen stammt, die durch Poly(rI) : (rC) zur Interferonproduktion induziert waren (i), oder aus nicht-induzierten Zellen (Ni). Die Pfeile zeigen zwei Kolonien, die induzierte Sequenzen enthalten. Die Kolonie Nr. 13 ist E. coli DP50/A341.

Figur 3:

Nachweis von Interferon-DNA im Klon E. coli DP50/ A341.

Poly-A-mRNA aus menschlichen Fibroblasten, die zur Interferon-Produktion induziert worden sind, wird mit DNA aus dem A341-Plasmid hybridisiert, die an Cellulose kovalent gebunden ist. Nach Translation der mRNA erfolgt die Gelelektrophorese der Translationsprodukte, welche zeigt, dass nur mRNA, die für das Interferon-(IF)-Polypep-tid kodiert, aus dem Gemisch der gesamten mRNA's selek-tioniert wurde. pBR322-DNA ist nicht in der Lage, diese mRNA zu binden. Die Position des IF-Polypeptids zeigt sich nach Immunpräzipitation mit Anti-Interferon-Serum (ipt).

Figur 4:

a) Plasmid-DNA aus dem bakteriellen Klon A341 (1) hybridisiert mit einer 14S (1300 Nucleotide langen) mRNA, die in Zellen gefunden wird, welche zur Interferonproduktion induziert wurden (i). Diese RNA wird jedoch nicht in nicht-

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induzierten Zellen (n) gefunden. Die Plasmid pBR322-DNA (2) hybridisiert nicht, während nichtklonierte Gesamt-cDNA (tot) (3) mit zahlreichen mRNA's hybridisiert, die auch in nicht-induzierten Zellen gefunden werden. Es wird eine Agarose-Gelelektrophorese der RNA's und anschliessende Hybridisierung mit den drei 32P-DNA's gezeigt.

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b) Plasmid-DNA aus verschiedenen Klonen von Interferon-DNA wird für ein ähnliches Hybridisierungsexperiment an mRNA-Elektropherogrammen verwendet. Klone mit IFN-ß2 DNA hybridisieren mit der 1300 Nucleotid langen 5 mRNA, während Klone mit IFN-ßl DNA an der kleineren, 900 Nucleotide langen Interferon-mRNA hybridisieren.

Tabelle

Hybridisierung und Translation von ß2-Interferon mRNA

Versuch 1

Versuch 2

V.S.V.-Virus Ausbeute

Oligo-Isoadenylat-

berech

Radioimmuntest,

Synthetaseinduktion neter

cpm

[32P]-A2'p5'A, cpm

IF-Titer

Oocyten-Überstand

Oocytenextrakt

(verdünnt 1:10)

(verdünnt 1:15)

nicht injiziert 7 445 1 700

mit RNA, welche an IF-ß2-Plasmid 1 920 4 700

hybridisierte (= A341)

mit RNA, welche an ein nicht 6015 1 500

modifiziertes Plasmid hybridisiert (= pBR322) .

Interferon-Standard 100 U/ml 700 10 800

Anmerkung: In Versuch 1 wurde DNA des Klons E 474 verwendet, während für Versuch 2 ein Pool (Gemisch) von IF-ß2 DNA-Plasmiden verwendet wurde.

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1. Eine mRNA des menschlichen Fibroblasteninterfe-rons, dadurch gekennzeichnet, dass sie für das Fibroblasten-interferon-ß-1 codiert und in hochgereinigter Form vorliegt, und etwa 900 Nukleotide aufweist und im wesentlichen in ein einzelnes Polypeptid translatierbar ist, das ein Molekulargewicht von etwa 20 000 und Interferon-Aktivität hat.

2. Eine mRNA des menschlichen Fibroblasteninterfe-rons, dadurch gekennzeichnet, dass sie für das Fibroblasten-interferon-ß-2 codiert und in hochgereinigter Form vorliegt und etwa 1300 Nukleotide aufweist und im wesentlichen in ein einzelnes Polypeptid translatierbar ist, das ein Molekulargewicht von etwa 23 000 und Interferon-Aktivität hat.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren zum Herstellen von im wesentlichen reiner mRNA des menschlichen Fibroblasteninterferons nach Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass

(a) eine Kultur von Fibroblastenzellen einem exogenen Faktor ausgesetzt wird, wodurch in den genannten Zellen die Synthese von Interferon mRNA induziert wird,

(b) die in den induzierten Zellkulturen gebildeten mRNA's sowie weiterhin mRNA's von nicht-induzierten Kontrollkulturen der gleichen Wirtszellen extrahiert werden,

(c) doppelsträngige cDNA's, abgeleitet von der mRNA, die aus der induzierten Kultur extrahiert wurde, synthetisiert werden, die genannten cDNA's in Vektoren inseriert werden, Mikroorganismen mit den erhaltenen, modifizierten Vektoren transformiert werden, und dass die genannten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden, um eine selektive Entwicklung von Mikroorganismus-Kolonien, enthaltend den genannten Vektor, sogenannte Initial-Kolonien, zu veranlassen,

(d) Duplikat-Kolonien der genannten Initial-Kolonien gebildet werden,

(e) die DNA's sowohl der Initial- als auch der Duplikat-Kolonien in situ freigesetzt werden,

(f) cDNA-Proben der mRNA's sowohl der induzierten Kultur als auch der nicht-induzierten Kontrollkultur synthetisiert werden, wobei die korrespondierenden mRNA's als Templates verwendet werden, wodurch induzierte cDNA und nicht-induzierte cDNA hergestellt wird,

(g) die DNA's der Initial-Kolonien einerseits und der Duplikat-Kolonien andererseits, jeweils mit den oben genannten induzierten und nicht-induzierten cDNA-Proben hybridisiert werden,

(h) die DNA's, die mit den induzierten cDNA-Proben, nicht jedoch mit den nicht-induzierten cDNA-Proben hybridisieren, wiedergewonnen werden,

(i) die vorher in Verfahrensschritt (b) extrahierten mRNA's mit einzelnen DNA's aus Verfahrensschritt (h), die nach Insertion in einen Vektor auf einem Träger immobilisiert wurden, unter Bedingungen kontaktiert werden, die geeignet sind, um Hybridisierung zu erlauben, und darauffolgend die fixierten mRNA von dem immobilisierten DNA-Vektor in im wesentlichen reiner Form eluiert wird, worauf die mRNA mittels Sucrosegradienten-Zentrifugation fraktioniert wird, wobei zwei voneinander verschiedene Fraktionen der mRNA's erhalten werden, die entweder etwa 900 oder etwa 1300 Nukleotide aufweisen und in zwei voneinander verschiedene Fibroblasteninterferone translatierbar sind, nämlich Interferon-ß-1 und Interferon-ß-2.

4. mRNA, die etwa 900 Nukleotide aufweist und in Fi-broblasteninterferon-ß-1 translatierbar ist, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 3.

5. mRNA, die etwa 1300 Nukleotide aufweist und in Interferon-ß-2 translatierbar ist, hergestellt nach dem Verfahren gemäss Patentanspruch 3.

6. Verwendung der mRNA nach Patentanspruch 1 zur Herstellung von menschlichem Fibroblasten-Interferon-ß-1 durch Translation.

7. Verwendung der mRNA nach Patentanspruch 2 zur Herstellung von menschlichem Fibroblasten-Interferon-ß-2 durch Translation.

8. Menschliches Fibroblasten-Interferon-ß-1 erhalten nach der Verwendung gemäss Patentanspruch 6.

9. Menschliches Fibroblasten-Interferon-ß-2 erhalten nach der Verwendung gemäss Patentanspruch 7.