DE3043981A1

DE3043981A1 - Verfahren zur gewinnung von fuer interferon in menschlichen zellen kodierender dna, verfahren zur anreicherung von interferon boten-rna (mrna) oder einer induzierbaren mrna eines anderen proteins oder polypeptids, vektoren, verfahren zur abtrennung von mrna eines induzierbaren proteins von anderen mrna's, mrna von menschlichem interferon, in einen vektor einbaubare und fuer ein polypeptid mit interferon-aktivitaet kodierende dna, sowie menschliches interferon (beta)-1 und(beta)-2 in hochgereinigter form

Info

Publication number: DE3043981A1
Application number: DE19803043981
Authority: DE
Inventors: Michel Rehovot Revel; Pierre 75013 Paris Tiollais
Original assignee: Institut Pasteur 75724 Paris; Institut Pasteur de Lille; Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1979-11-21
Filing date: 1980-11-21
Publication date: 1981-10-01
Also published as: US5541312A; SE461223B; US5468608A; DE3043981C2; IL58765A0; GB2063882B; US5468607A; GB2063882A; SE8007998L; CH684892A5; SE8603145D0; JPH02211879A; JPS63164896A; DE3051086C2; IT1194820B; US5468609A; SE469660B; JP2555279B2; CH664967A5; SE8603145L

Description

Interferon ist ein wichtiges, vom Körper hergestelltes antivirales Protein, das auch eine Wachstumshemmung von Tumorzellen bewirkt. Aufgrund seiner Artspezifität wird zur Anwendung in der Humanmedizin menschliches Interferon benötigt. Die begrenzten Mengen an Interferon, die in Gewebekulturzellen oder frischen Leukozyten gebildet werden, genügen nicht für die klinische Verwendung in großem Maßstab.. Das Einschleusen der genetischen Information für menschliches Interferon in Bakterien könnte die Produktion eines Polypeptids mit Interferon-Aktivität ermöglichen. Es ist bekannt, daß derartige Methoden für das menschliche Wachstumshormon und für Insulin entwickelt wurden.

Die beiden Typen von Interferon, nämlich Leukozyten-Interferon (IFN-a) und Fibroblasten-Interferon (IPN-ß) werden anscheinend von verschiedenen m-RNA's kodiert; vgl. Cavallieri et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 4415 bis 4419. Die Isolierung dieser mRNA's in reiner Form ist bis jetzt noch nicht gelungen. Dies erscheint auch um so schwieriger, als die Wirtszelle nur dann in der Lage ist, die Interferon-mRNÄ zu synthetisieren, wenn die Zelle geeigneten exogenen Faktoren ausgesetzt wird, beispielsweise einer viralen Infektion oder speziellen synthetischen Polynucleotide^ wie Poly (rI:rC).Selbst dann produziert die Zelle nur. in geringsten Mengen. Dementsprechend wurde vorgeschlagen, einen

mRNA-Extrakt von Wirtszellen zu verwenden, welche vorher zur Bildung von Interferon induziert worden waren, und diese mRNA in vitro in einem zellfreien System mit allen Bestandteilen, insbesondere den natürlichen Aminosäuren, translatieren zu lassen, um auf diese Weise ein Proteinpräparat mit Interferon-

Aktivität zu erhalten. Die Interferon-mRNA jedoch nur einen sehr untergeordneten Anteil der zu translatierenden mRNA's

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dar, und dementsprechend war das schließlich erhaltene Proteinpräparat mit Interferon-Aktivität sehr stark durch andere Proteine verunreinigt.

Daher würde die Verwendung solcher mRNA-Präparate als Ausgangsmaterial zur direkten Umwandlung in Doppelstrang-DNA, welche nach Insertion in einen geeigneten Vektor kloniert werden soll, Screening-Schwierigkeiten mit sich bringen, die praktisch unüberwindlich wären.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, die erwähnten Schwierigkeiten der Interferon-Herstellung weitestgehend zu überwinden, und insbesondere ein Verfahren zum Isolieren der mRNA, insbesondere mensch-

liehen Ursprungs, die nach Translation Interferon bildet, sowie der entsprechenden DNA¹s zu schaffen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Isolierung des genetischen Materials (DNA) zu schaffen, das die für Interferon in menschlichen Zellen kodierenden Nucleotidsequenzen enthält.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren dieser Art zu schaffen, bei dem die Boten-RNA in DNA transkribiert wird, und bei dem die DNA in einem geeigneten . Vektor kloniert wird. Plasmide werden als Vektoren bevorzugt. Das bevorzugte Plasmid ist ein Plasmid des pBR322-Typs.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu entwickeln, um die jeweilige unterschiedliche genetische Sequenz festzustellen, die in menschlichen Zellen exprimiert wird, wenn diese zur Bildung von Interferon induziert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht aus einer differentiellen Hybridisierung der bakteriellen Klone zunächst mit DNA von RNA aus induzierten Zellen und sodann mit ebensolcher DNA von RNA aus nicht induzierten Zellen.

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Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur genetischen Modifizierung von Bakterien zu entwickeln, damit diese ein Interferon-Polypeptid herstellen. Zu diesem Zweck soll eine klonierte Interferon-DNA in einen geeigneten Vektor-Träger (Wirtsstamm) eingeschleust werden. Die klonierte Interferon-DNA wird vorzugsweise auf die vorstehend angedeutete Weise hergestellt. Ein bevorzugter Vektor-Träger bzw. eine bevorzugte Wirtszelle ist E.coli oder ein anderer geeigneter Mikroorganismus. Andere Typen von bevorzugten Wirtszellen für Vektoren sind eukaryotische Zellen.

Weitere Aufgaben der Erfindung sind aus der nachstehenden Beschreibung ersichtlich.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Isolierung von genetischem Material (DNA), das die für Interferon in menschlichen Zellen, vorzugsweise Fibroblastenzellen, kodierende Nucleotidsequenz enthält. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen, welche durch einen entsprechenden Induktor zur Interferonproduktion angeregt werden können, kultiviert, sie mit einem solchen Induktor behandelt, die mRNA aus solchen Zellen extrahiert, die erhaltene Interferon-Boten-RNA reinigt, die gereinigte Boten-RNA zu DNA transkribiert und die erhaltene DNA in einem geeigneten Vektor kloniert. Vorzugsweise werden als Zellen menschliche diploide Vorhautzellen und als Induktor vorzugsweise doppelsträngige ENA verwendet.

Das Verfahren zur Anreicherung von Interferon-Boten-RNA oder einer induzierbaren mRNA eines anderen Proteins oder Polypeptids, dessen Produktion in der Wirtszelle durch exogene Faktoren induziert werden kann_f ist durch folgende

Verfahrensmaßnahmen gekennzeichnet:
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ORIGINAL INSPECTED

a) eine Kultur der Wirtszellen wird dem exogenen Faktor ausgesetzt, um in den Wirtszellen die Synthese der induzierbaren mRNA zu induzieren;

b) die mRNA¹s, einschließlich der induzierbaren mRNA, die in der induzierten Zellkultur gebildet worden sind, sowie die mRNA's einer nicht induzierten Vergleichskultur der gleichen Wirtszellen werden extrahiert;

c) von den mRNA's sowohl der induzierten Kultur als auch der nicht induzierten Verglexchskultur werden cDNA-Proben ("induzierte cDNA's" und "nicht induzierte cDNA's") hergestellt, wobei die entsprechenden mRNA's als Matrizen dienen;

d) doppelsträngige cDNA's, die sich von der aus der induzierten Kultur extrahierten mRNA ableiten, werden hergestellt, und in geeignete Vektoren inseriert. Diese modifizierten Vektoren werden in geeignete Mikroorganismen eingeschleust und die Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen gezüchtet, so daß sich selektiv solche Kolonien entwickeln können, deren Zellen die modifizierten Vektoren enthalten (Ausgangskolonien);

e) Duplikatkolonien dieser Ausgangskolonxen werden hergestellt;

f) die DNA's sowohl der Ausgangskolonien als auch der Duplikatkolonien werden in situ freigesetzt;

g) die DNA's der Ausgangskolonien einerseits und der Duplikatkolonien andererseits werden mit Proben der vorstehend be schriebenen "induzierten cDNA" bzw. der "nicht induzierten cDNA" (oder umgekehrt) hybridisiert; h) die DNA's von Klonen, die mit den ProBen der. "induzierten cDNA" hybridisieren nicht aber mit den Proben der "nicht-induzierten cDNA" gewonnen werden. Auf diese Weise werden DNA's erhalten, die mit der mRNA hybridisierbar sind, die in das induzierbare Protein oder PoIypeptid, insbesondere Interferon, translatiert werden kann.

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Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise zur Herstellung von hochgereinigter interferon-mRNA menschlichen Ursprungs eingesetzt.

Es ist als Vorteil einzuschätzen, daß einige der vorstehend aufgeführten Stufen nicht in genau der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden müssen. Dies trifft insbesondere zu für die Stufe c), welche die Herstellung der cDNA-Proben betrifft. Tatsächlich ist die Stufe c) nicht unbedingt eine Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens. Statt dessen können analoge Proben aus anderen Zellquellen verwendet werden.

Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Stufen c) und d) lediglich an Fraktionen der mRNA's durchgeführt, die aus den Zellen extrahiert werden .und zwar aus den induzierten oder nicht induzierten Zellen. In dieser Hinsicht kann die Tatsache ausgenutzt werden, daß mRNA's einen Poly-A-Teil enthalten, der die Abtrennung der mRNA von der Gesamt-RNA durch Bindung an Oligo-T-Cellulose ermöglicht. Die anschließend eluierte mRNA-Fraktion wird vorteilhafterweise danach noch durch eine Sucrose-Gradienten-Zentrifugation fraktioniert. Die verschiedenen Banden werden sodann gesondert in einem geeigneten zellfreien System, beispielsweise einem Reticulocyten-Lysat, translatiert. Jedes der Translationsprodukte wird dann darauf untersucht, ob es durch ein Anti-Interferonserum ausgefällt wird. Die Banden der mRNA, deren Translationsprodukte eine positive Reaktion bei diesem Iitmiunpräzipitationstest ergeben, werden . .zur Durchführung der beiden vorstehend beschriebenen Stufen c) und d) zurückbehalten. Ein weiterer Aspekt dieses Verfahrens ist darin zu erblicken, daß zwei verschiedene mRNA's, die für Interferon kodieren, aus menschlichen Fibroblastenzellen isoliert v/erden können, wenn diese Zellen gemäß Stufe a) induziert werden. Die kleinere mRNA sedimentiert bei 11 S und liefert durch Translation in einem zellfreien System ein Protein mit einem Molekulargewicht

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von 20 000. Dieses wird durch Antikörper, die gegen eines der Interferone erzeugt werden, welche aus diesen Zellen gewonnen und gereinigt werden können, selektiv ausgefällt. Dieses Protein ist menschliches Interferon (IFN)-ß1. Die größere mRNA sedimentiert bei 14 S und liefert ein Protein mit einem Molekulargewicht von 23 000. Dieses Protein wird durch Antikörper gegen ein weniger gereinigtes Fibroblasten-Interferonpräparat ausgefällt. Dieses Protein wird als menschliches Interferon-ß2 bezeichnet. Fraktionen von mRNA für beide Proteine werden in der Stufe d) eingesetzt. Dies ermöglicht die beliebige Herstellung von IFN ß1 oder IFN ß2 in praktisch reiner Form. Die Hybridisierung (Stufen c, d, e, f, g und h) gestattet eine genaue Indentlfizierung von einzelnen E.coli~ Kolonien, die eine der beiden Interferon-cDNA's für IFN ß1 oder ß2 enthalten.

Es liegt auf der Hand, daß diejenigen Kolonien, die nur mit "induzierten" cDNA-Proben und nicht mit den "nicht-induzierten" cDNA-Proben hybridisieren, nur solche Kolonien darstellen, die einen modifizierten Vektor mit der cDNA enthalten, die der Interferon-mRNA entspricht, weil

a) die DNA, die mit der "nicht-induzierten" cDNA-Probe nicht hybridisierbar ist, dementsprechend keiner der mRNA's entspricht, die normalerweise von einer nicht-induzierten Zelle gebildet werden und

b) der einzige Unterschied zwischen den beiden Proben darin besteht, daß die "induzierte "cDNA -Probe eine cDNA aus einer der Interferon-mRNA¹s enthält, die andere Probe dagegen nicht.

Die Herstellung dieser cDNA-Proben kann nach üblichen Methoden erfolgen, insbesondere durch Transkription mit

einer reversen Transkriptase. Vorzugsweise wird ein bakterieller Vektor mit hoher Kopienzahl, wie das pBR322-Plasmid verwendet. Um die spätere Expression der durch die Interferon-cDNA modifizierten Vektoren in einem Mikro-

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Organismus zu erhalten, kann man einen Satz von Vektoren verwenden, wie sie von Patrick Charney, et al., in dem Aufsatz "Bacteriophage Lambda and Plasmid Vectors Allowing Fusion of Cloned Genes in each of the three translational phases", Nucleic Acids Res., Bd. 5 (12), 1978, S. 4479 bis 4494, beschrieben wurden.

Gemäß einem weiteren wichtigen Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der vorstehend modifizierte Vektor, wie immer sein (Translations-)Leseraster auch vorliegen mag, zur Extraktion von Interferön-mRNA aus dem RNA-Gemisch verwendet werden, das durch die induzierten Zellen gebildet wird. Bei diesem Verfahren werden diese RNA*s mit einem derartigen durch die Interferon-cDNA modifizierten Vektor zusammengebracht, welcher vorher auf einem Träger"fixiert worden ist. Die Vereinigung (von m-RNA's und modifiziertem Vektor) erfolgt unter solchen Bedingungen, die die Hybridisierung erlauben. Danach wird die hängengebliebene (gebundene) mRNA von dem fixierten DNA-Vektor eluiert. Auf diese Weise kann mRNA von menschlichem Interferon (entweder IFN ß1 oder IFN ß2) in hochgereinigter Form erhalten werden.

Der rohe Reinigungsgrad ergibt sich aus der Tatsache, daß das Translationsprodukt in einem geeigneten in vitro-System in jedem Fall im wesentlichen aus einem einzigen Polypeptid mit Interferonaktivität besteht, das durch die Antikörper gegen menschliches Interferon ausgefällt wird.

Die Erfindung betrifft somit auch die gereinigten mRNA's, die normalerweise bis zu 900 bis 1000 Nucleotide für IFN-ß1 und 1250 bis 1350 Nucleotide für IFN-B2 enthalten. In gleicher Weise betrifft die Erfindung die entsprechenden cDNA's, die durch Transkription der mRNA's erhalten werden. Die Erfindung betrifft ferner die beiden unterschiedlichen Interferon-mRNA's und somit die Proteinkomponenten, die auch unterschiedliche biologische Bedeutung haben können. Es

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liegt auf der Hand, daß jedem der Hybridisierungsschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens, sofern erforderlich, eine Denaturierung der möglichen doppelsträngigen Nucleinsäuren vorangeht, um sicherzustellen, daß keine doppelsträngigen Nucleinsäuren (die eine Interferon-Aktivität in Zellen induzieren könnten) in den gereingten mRNA's verbleibt, wenn diese zur in vitro-Produktion durch Translation von praktisch reinem Protein mit Interferon-Aktivität verwendet werden.

Die Erfindung wird anhand der Figuren und Tabellen weiter erläutert.

Fig. 1 zeigt die Fraktionierung von mRNA an einem Sucrosegradienten sowie die Translation dieser aus induzierten Zellen stammenden mRNA-Fraktionen in Xenopus laevis-Oocyten zur Herstellung von menschlichem Interferon und ihre Translation in Reticulocyten-Lysaten zur Produktion spezifisch immunpräzipitierbarer Proteine. Dieses Verfahren gestattet die Trennung der mRNA's für IFN-ß1 und IPN-B2.

Fig. 2 veranschaulicht das Ergebnis einer differentiellen Hybridisierung der DNA's der gleichen bakteriellen Kolonien mit den beiden vorstehend erwähnten cDNA-Proben aus induzierten und nicht induzierten Zellen.

Fig. 3 erläutert eine Reinigung von Interferon IFN B2-mRNA durch Hybridisierung mit immobilisierter DNA aus dem bakteriellen Klon A341, nachgewiesen durch Translation in einem Reticulocytenlysat.

Fig. 4 zeigt, daß DNA aus dem bakteriellen Klon A341 komplementär ist zu einer mRNA mit 1250 bis 1350 Nucleotiden, die in menschlichen Zellen nur nach Induktion der Interferonsynthese auftritt.

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Tabelle I zeigt, daß diese mRNA nach Translation in den Oocyten von Xenöpus laevis biologisch aktives Interferon liefert, welches das Wachstum eines Virus in menschlichen Zellen hemmt.

Beispiel

a) Reinigung der beiden Interferon-mRNA's aus menschlichen diplQiden Fibroblasten

RNA wird aus Monolayerkulturen der menschlichen Fibroblastenlinie FS11 (isoliert am Weizmann Institute of Science) extrahiert. Diese diploiden Zellen aus der Vorhaut eines normalen, 8 Tage alten Knaben, werden von 15 gesonderten Isolaten ausgewählt im Hinblick auf ihre Fähigkeit zur Bildung hoher Interferon-Titer. Alternativ werden Kulturen eines Klones von menschlichen SV 80 Zellen verwendet. Die Kulturen in Eagle's Minimalmedium mit 10 % fötalem Kälberserum werden in 2,2 Liter fassenden Rollerflaschen aus Glas oder 22 χ 22 cm Tabletts aus Kunststoff in einer Atmosphäre aus 5 % Kohlendioxid und 95 % Luft bei 37°C inkubiert. 3 Tage nach dem Zusammenfließen der Zellen werden die Kulturen zur Produktion von Interferon induziert, indem sie 3 1/2 Stunden lang mit 100 μg/ml Poly(xIrrC) und 50 pg/ml Cycloheximid (dies blockiert die Synthese von Proteinen durch den Wirt), behandelt werden. Actinomycin D (das die Synthese von zellulärer RNA blockiert) wird in einer Menge von 1 μg/ml zugesetzt. 1 Stunde später werden die Zellen mit gepuffertem Nonidet-P40 Detergens (Netzmittel) lysiert und die cytoplasmatische RNA wird mit einem Phenol-Kresol-Gemisch nach Kirby (1965) extrahiert. Die mRNA's werden aus der Gesamt-RNA dadurch isoliert, daß man sie an Oligo-dT-Cellulose bindet, da sie selbst PoIy-A enthalten. Der mRNS-Anteil wird anschließend durch Sucrosegradientenzentrifugation fraktioniert. Die Fraktionen, die Interferon-mRNA enthalten, werden durch Mikroinjektion in Oocyten von Xenopus laevis gemäß

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N.K.B. Raj und P.M. Pitha, (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 1483 bis 1487) identifiziert. 24 bis 40 Stunden später wird die antivirale Aktivität des in das Oocyten-Inkubationsmedium freigesetzten Interferons bestimmt. Die antivirale Aktivität wird dadurch bestimmt, daß man FS11-Zellen mit Verdünnungen des Oocytenmediums behandelt. Die Zellen werden mit dem Virus der vesiculären Stomatitis (VSV) infiziert. Es wird die Hemmung des cytopathischen Effekts des Virus beobachtet. Die Interferontiter werden

ϊ° durch Vergleich mit einer bekannten Lösung entsprechend der letzten wirksamen Verdünnung berechnet. Die Interferon-mRNA enthaltenden Fraktionen werden außerdem durch Translation in einem Reticulocyten-Lysat und anschließende Immunpräzipitation des Produkts nach der Methode von Weissenbach et al., (Eur. J. Biochemistry, Bd. 98, (1979), S. 1 bis 8) identifiziert.

Fig. 1a zeigt die beiden Peaks der Interferon-mRNA-Aktivität, ermittelt durch Injektion in Oocyten. Fig. 1b zeigt die Linien, die durch Immunpräzipitation der Translationsprodukte mit dem Anti-Interferon-Serum erhalten wurden. Die beiden Pfeile zeigen die beiden Polypeptide vom Molekulargewicht 23 000 (23 K) und 20 000 (20 K). Die Sucrose-Gradientenfraktionen, die für die 23 K und 20 K immunpräzipitierten Polypeptide kodieren, sind in Fig. 1a gezeigt. Es ist ersichtlich, daß sie den beiden Peaks der Interferon-mRNS-Aktivität entsprechen.

Interferonaktivität wird auch in den Translationsprodukten

^ow der Reticulocyten-Lysate durch Bestimmung der Induktion der (2'-5·)-01igo-isoadenylat-Synthetase in menschlichen Zellen festgestellt. Aufgrund der beiden Methoden kann festgestellt werden, daß der größere Interferon-mRNA-Peak für das 23K-Polypeptid kodiert, während der kleinere Interferon-mRNA-Peak

für das 20K-Polypeptid kodiert. Beide Interferon-mRNA¹s werden auf diese Weise isoliert und zur Klonierung in E. coli verwendet.

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k) Klonierung von Interferon-ß2-cDNA in E. coli

Die gereinigte mRNA aus induzierten Zellen enthält etwa T bis 3 % der mRNA für das Polypeptid vom Molekulargewicht 23 000. Sie dient als Matrize zur Synthese von cDNA durch reverse Transkriptase von Vogelmyeloblastosis-Virus (AMV) . Als Starter wird Oligo-dT verwendet. Nach Eliminie rung der RNA durch Alkalibehandlung kann der zweite Strang der DNA mit reverser Transkriptase oder DNA-Polymerase I synthetisiert werden. Einsträngige DNA wird mit Nuclease S1 weghydrolysiert, und die 3'-Enden der DNA werden mit Nucleotid-terminaler Transferase unter Verwendung von dGTP als Substrat verlängert. Die Plasmid-DNA, welche in entsprechender Weise mit terminaler Transferase und dCTP verlängert wurde, wird mit dieser dG-v6rlangerten menschlichen .cDNA hybridisiert und in E.coli DP 50 eingeschleust. Transformierte Bakterienkolonien werden durch Auftragen auf Agarplatten identifiziert (selektioniert), die Luria Nährbrühe, Diaminopimelinsäure, Thymidin und Tetracyclin enthalten. Die

Kolonien werden weiterhin auf ähnlichen Agarplatten geprüft, die Ampicillin als einziges Antibiotikum enthalten. Auf einem Nitrocellulosefilter auf einer Agarplatte der vorstehend beschriebenen Art mit 10 μg/ml Tetracyclin läßt man die ampicillinempfindlichen, tetracyclinresistenten Bakterien-

kolonien heranwachsen, über 2000 der erhaltenen transformierten Kolonien werden auf andere Nitrocellulosefilter übertragen, die ebenfalls auf Agarplatten der vorstehend beschriebenen Art aufgelegt sind. Jede der Duplikatkolonien wird ihrer jeweiligen Ursprungs- oder Ausgangskolonie zuge-

ordnet, gewöhnlich durch gemeinsame Nummerierung. Sobald die Kolonien einen Durchmesser von 3 bis 5 mm erreicht haben, werden die Filter (Ausgangskolonien und Duplikate) auf einen Stapel aus Filterpapieren übertragen, die zunächst mit 0,5 η Natronlauge, sodann mit 0,15 molarer Kochsalzlösung und

0,1 η Natronlauge imprägniert worden sind, um in situ die ent sprechenden DNA's freizusetzen. Die Filterpapiere werden

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neutralisiert und getrocknet. Zum Nachweis der Bakterienkolonien, die die Interferon-DNA-Sequenzen enthalten, werden

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die Filterpapiere mit zwei verschiedenen [ P]cDNA-Proben hybridisiert. Eine cDNA-Probe wird durch reverse Transkriptase der mRNÄ aus der Sucrose-Gradientenfraktion von induzierten Zellen (Pfeil 23K der Fig. 1) hergestellt. Die zweite Probe wird in gleicher Weise aus der entsprechenden Fraktion des nicht-induzierten Zellenpräparats hergestellt. Bei-

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de cDNA-Proben werden mit den vier stark radioaktiven [ P] Desoxynucleosidtriphosphaten als Substraten und fragmentierter Kälberthymus-DNA als Starter synthetisiert. Auf diese Weise wird eine statistische Wiedergabe der mRNA-Sequenzen in den cDNA-Proben erreicht. Die Hybridisierung wird während 18 Stunden bei 62 bis 64°C in einem 0,9 molaren NaGl-O,09 molarem Natriumcitrat-Puffer vom pH-Wert 7,0 durchgeführt. Die Ausgangskolonien werden mit den cDNA-Proben der induzierten Zellen und die Duplikatkolonien mit den cDNA-Proben der nicht-induzierten Zellen (oder umgekehrt) hybridisiert. Nach gründlichem Waschen werden die Filter auf Röntgenfilm gelegt, und es werden die Bakterienkolonien festgestellt, die nur mit der "induzierten" cDNA, nicht jedoch mit der "nicht induzierten" cDNA hybridisieren. Auf diese Weise wurden 20 verschiedene Bakterienkolonien aus insgesamt mehr als 2000 untersuchten transformierten Kolonien isoliert. Diese 20 Bakterienkolonien enthalten Mehrfachkopien eines Plasmlds, ■" in welches DNA-Sequenzen inseriert sind, welche sich vom menschlichen mRND ableiten, die nur dann exprimiert wird, nachdem die Zellen durch Poly-(rlrrC) zur Interferonproduktion induziert worden sind.

Ein Beispiel zur Erläuterung dieser Methode ist in Fig. 2 anhand von 15 Paaren von alkalibehandelten Kolonien (Ausgangs-Kolonien und Duplikatkolonien) auf ihren Nitrocellulo-

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sefiltern wiedergegeben, deren DNA's mit [ P]-cDNA's hybri-

^⁵ disiert worden sind, die von den mRNA-Fraktionen 23K von Fig. 1 hergestellt wurden, welche entweder aus mit Poly

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(rl):(rC) zur Interferonproduktion induzieren (i) Zellen oder aus nicht induzierten (n.i.)Zellen stammten. Die Pfeile zweigen (zwei) Kolonien, insbesondere die Kolonien 5 und 13, welche die induzierten Sequenzen enthalten.

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Die Kolonie Nr^ 13 wird als S-. coli DP5O/A341 bezeichnet.

c) Isolierung von Interferon-mRNA aus menschlichen Fibroblasten

Interferon mRNA (und der Nachweis der Gegenwart von Interferon-cDNA-Sequenzen in der Plasmid-DNA des Klones A341) wird folgendermaßen erhalten:
Eine 500 ml Kultur dieses Bakterienklones wird zur Herstellung von 50 ug Plasmid-DNA verwendet. Diese DNA wird nach vorheriger Denaturierung kovalent an Diazobenzyloxymethyl-Cellulosepulver nach der Methode von Aldwine et al., Proc. Natl. Acad. Sei, USA, Bd. 74 (1977) S." 5350, gebunden. In ähnlicher Weise wird Plasmid pBR322-DNA (die keine humanen DNA-Sequenzen enthält), an Cellulose gebunden. PoIy-A enthaltende mRNA aus menschlichen Pibroblasten, die zur Interferonbildung induziert worden sind, wird mit den beiden DNA-Cellulosepräparaten in 50prozentigem Formamid bei 52°C hybridisiert. Sodann wird mit reinem Formamid bei 70°C eluiert. Die nach dem Eluieren wiedergewonnene RNA wird in dem zellfreien Reticulocyten-System (Fig. 3) translatiert. Das entstandene Translationsprodukt der an der A341-DNA-Cellulose selektierten mRNA ist im wesentlichen das Polypeptid vom Molekulargewicht 23 000. Von der pBR 322 DNA-Cellulose hingegen wird keine iienschliche Interferon-mKNA isoliert. Im Vergleich zu den Translationsprodukten ^der menschlichen mRNAy_{or der} Hybridisierung an A341 DNA-Cellulose konnte festgestellt werden, daß die klonierte A341 DNA nur zu einem geringen Teil komplementär ist zu der mRNA des Gemisches. Das Produkt der an A341 DNA-Cellulose gebundenen mRNA wird durch das menschliche Fibroblasten-Interferon-Antiserum immunpräzipitiert.

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Die Interferon-mRNA kann auch nach einem ähnlichen Verfahren isoliert werden, wie dies vorstehend beschrieben ist, bei dem die Plasmid-A341-DNA jedoch an Nitrocellulosefilter gebunden ist, dann m-RNA daran hybridisert wird und schließlich durch Iminütiges Kochen in Wasser eluiert wird.

Die Aktivität dieser gereinigten mRNA zur Kodierung für biologisch aktives menschliches Interferon konnte durch Injektion in Oocyten von Xenopus laevis und anschließende Bestimmung der Hemmung der Virusvermehrung in menschlichen Zellen festgestellt werden, die dem Oocyten-Inkubationsmedium ausgesetzt wurden; vgl. Tabelle I. Die Interferon-Aktivität der gereinigten ß2-mRNA kann auch durch Induktion der (2'-5')-Oligoisoadenylat-Synthetase in menschlichen Zellen durch die Oocyten-Translationsprodukte gezeigt werden; vgl. Tabelle I.

Die Restriktionskartierung der A341-Plasmid-DNA(die Analyse der A321-Plasmid-DNA durch Restriktionsenzyme) zeigt, daß sie ein Insert aus menschlicher DNA von etwa 900 Nucleotiden in der Pst-Schnittsteile enthält. Die A341-DNA hybridisiert auch mit drei Fragmenten des menschlichen Genoms, das durch Eco R1-Nuclease geschnitten wurde .Diese Fragmente werden durch Agarose-Gelelektrophorese voneinander getrennt. Die Hybridi-

sierung an Agarose-Gelelektropherogramme von mRNA aus menschlichen Fibroblasten zeigt ferner, daß A341-DNA komplementär ist zu RNA-Seguenzen, die nur in Zellen exprimiert werden, die dem Interferon-Induktor Poly (rl : rC) ausgesetzt wurden; vgl. Fig. 4a. Selbst eine einstündige Behandlung der Zellen mit Poly (rlrrC) führt zur Anhäufung einer 1250 bis 1350 Nucleotide langen RNA, die mit A341-DNA hybridisiert. Diese stellt die IFN ß2-mRNA dar.

Die vorstehenden Werte zeigen, daß der bakterielle Klon E.coli

DP5O/A341 in der Pst-Schnittstelle seines pBR322-Plasmids ein Insert von etwa 900 Nucleotiden aus menschlichen cDNA-Sequen-

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. , menschlichen

zen enthält, die komplementär zu exner InterferonmRNA sind. Es wurden mehrere, auf ähnliche. Weise hergestellte Klone erhalten. Fig. 4b zeigt, daß Klone für IFN-ß2 mit der größeren, 1250 bis 1350 Nucleotideinheiten langen mRNA hybridisieren, während Klone für IFN-ß1 mit der kleineren, 900 bis 1000 Nucleotideinheiten langen mRNA hybridisieren. .

Das Verfahren kann zur Herstellung von Klonen von Interferon-DNA unterschiedlicher Typen (α, ß, v) aus menschlichen Zellen verwendet werden.

Beschreibung der Figuren;

Figur 1:

Sucrose-Gradient von Poly A-RNA aus menschlichen Zellen, die zur Herstellung von Interferon induziert worden waren (a). Sedimentation erfolgte von rechts nach links. In 10 Xenopus Oocyten werden 0,4 μg RNA aus jeder Fraktion injiziert. Nach 40 Stunden wird das Medium um die Oocyten mit FS11-Zellen auf Interferon untersucht (linke Skala). Jede RNA-Fraktion (0,24 μg) wird auch in Reticulocyten-Lysaten

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translatiert, und die S-Methionin-markierten Produkte werden mit Anti-Interferon-Serum ausgefällt. Die durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysierten Produkte sind in der Reihe i von (b) gezeigt. Die Reihe η in (b) stellt die immunpräzipitierten Produkte von nicht-fraktionierter mRNA aus nicht induzierten Zellen dar. Am rechten Ende von (b) sind die Molekulargewxchtsmarker angegeben (von oben nach ^ου unten 68, 46, 30, 18 und 14 Dalton χ 10 ). Die Position und die Intensität des 23K und 2OK Proteins (Pfeile) wird aufgezeichnet und ist graphisch in a (rechte Skala) wiedergegeben. Die schwerere der beiden Interferon-mRNA's wird in das 23-K-Protein translatiert, während die kleinere Inter-

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feron-mRNA in das 20K-Protein translatiert wird.

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Figur 2:

Erkennung von transformierten bakteriellen Klonen, die Interferon-DNA enthalten.

Die Nukleinsäuren von 15 alkalibehandelten, auf Nitrocellu-

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losefiltern gewachsenen Kolonien werden in situ mit [ P]cDNA hybridisiert. Diese wurde an der 23K mRNA synthetisiert, welche entweder aus Zellen stammt, die durch Poly(rl):(rC) zur Interferonproduktion induziert waren (i), oder aus nichtinduzierten Zellen (Ni). Die Pfeile zeigen zwei Kolonien, die induzierte Seuqenzen enthalten. Die Kolonie Nr. 13 ist E. coli DP 5O/A341.

Figur 3:
Nachweis von Interferon-DNA im Klon E coli DP5O/A341

Poly A-mRNA.aus menschlichen Fibroblasten, die zur Interferon-Produktion induziert worden sind, wird mit DNA aus dem A341-Plasmid hybridisiert, die an Cellulose kovalent gebunden ist. Nach Translation der mRNA erfolgt die Gelekektrophorese der Translationsprodukte, welche zeigt, daß nur mRNA, die für das Interferon-(IF) Polypeptid kodiert, aus dem Ge-

»322 misch der gesamten mRNA's selektioniert wurde. pBIy DNA ist nicht in der Lage, diese mRNA zu binden. Die Position des IF-Polypeptids zeigt sich nach Immunpräzipitation mit AntiInterferon-Serum (ipt).

Figur 4:

a) Plasmid-DNA aus dem bakteriellen Klon A34.1 (1) hybridisiert mit einer 14S (1 300 Nucleotide langen) mRNA, die in Zellen gefunden wird, welche zur Interferonproduktion induziert wurden (i). Diese .RNA wird jedoch nicht in nicht-induzierten Zellen (n) gefunden . Die Plasmid pBR} DNA (2) hybridisiert nicht, während nichtklonierte Gesamt-cDNA (tot) (3) mit zahlreichen mRNA's hybridisiert, die auch in nicht-induzierten Zellen gefunden werden. Es wird eine Agarose-Gelelektrophore-

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se der RNA's und anschließende Hybridisierung rait den drei ³²P-DNA¹S gezeigt.

b) Plasmid-DNA aus verschiedenen Klonen von Interferon-DNA wird für ein ähnliches Hybridisierungsexperiment an m-RNA-Elektropherogrammen verwendet. Klone mit IFN-ß2 DNA hybridisieren mit der 1 300 Nucleotid langen inRNA, während Klone mit IFN-B1 DNA an der kleineren, 900 Nucleotide langen Interferon-mRNA hybridisieren.

' .

Tabelle I

Hybridisierung··und Translation von*. ß2-Interferon mRNA

15

Versuch 1 Versuch 2

V.S.V.-Virus Ausbeu- Oligo-Isoadenylat- berechte Radioimmuntest, Synthetaseinduktion neter

cpm ./32 , _, _i, IF-Titer * L P/-Ä2'p5^lÄ,CDm

2Q Oocyten-Überstand Oocytenextrakt

(verdünnt 1 : 1O) (verdünnt 1:15)

nicht injiziert 7445 1700

mit RNA, welche an
IF-ß2-Plasmid hybri- '
disierte (=A341) 1920 4700 30 ü/ml

mit RNA, welche an

ein nicht modifiziertes 6015 1500 0

Plasmid hybridisiert

(= pBR322)

³⁰

Anmerkung: In Versuch 1 wurde DNA des Klons E 474 verwendet, während für Versuch 2 ein Pool (Gemisch) ΛΟ.η IP-B2 DNA-Plasmiden verwendet wuifde.

L " . J

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-ÄS-

Leerseite

Claims

VOSSIUS -VOSSIUS-TAUCHNER -.B.EgiNje.MAN-N- RAUH

PATENTANWÄLTE

SIEBERTSTRASSE 4 - 8DOO MÜNCHEN 86 · PHONE: (O89) 47 4O7B CABLE; BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29453 VOPAT D

u.Z.: P 892 (Vo/kä) 21. November 1980

Case: T/431

YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY, LTD., Rehovot, Israel

und

INSTITUT PASTEUR
Paris, Frankreich

"Verfahren zur Gewinnung von für Interferon in menschliehen Zellen kodierender DNA, Verfahren zur Anreicherung von Interferon Boten-RNA (mRNA) oder einer induzierbaren mRNA eines anderen Proteins oder Polypeptide, Vektoren, Verfahren zur Abtrennung von TDBSVi ' eines induzierbaren Proteins von anderen niRNA's, mRNA von menschlichem Interferon, in einen Vektor einbaubare und für ein PoIypeptid mit Interferon-Aktivität kodierende DNA, sowie menschliches Interferon ß-1 und ß-2 in hochgereinigter Form"

Priorität: 21. November 1979, Israel, Nr. 58 765

Patentansprüche

1. Verfahren zur Isolierung genetischen Materials (DNA), das die Nukleotidsequenz enthält, welche für Interferon in menschlichen Zellen kodiert, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) bei Behandlung mit einem Interferon-Induktor Interferon produzierende menschliche Zellen anzüchtet,

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b) diese Zellen mit einem derartigen Induktor behandelt,

c) die mRNA aus derart induzierten Zellen isoliert,

d) die erhaltene Interferon-mRNA reinigt/

e) die mRNA in DNA transkribiert, sowie

f) die erhaltene DNA in einem geeigneten Vektor kloniert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man diploide Zellen der menschlichen Vorhaut, d.h. Fibroblasten-Zellen als menschliche Zellen einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Induktor doppelsträngige RNA verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die RNA durch Sucrosegradientenzentrifugation reinigt und danach . die mRNA in vitro in aktives Interferon translatiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß

man die aus den induzierten Zellen isolierte RNA in RNA-Frak-

tionen auftrennt, welche letztlich die Herstellung von mensch lichem Interferon IFN-ß1 und IFN-ß2 ermöglichen.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Vektor ein Plasmid verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Vektor das

man als^Plasmid pBR 322 verwendet.

8. Verfahren zur Erkennung der verschiedenen genetischen Sequenzen, welche in einer menschlichen Zelle ausgeprägt werden, wenn diese zur Interferon-Herstellung induziert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man eine differentielle Hybridisierung der bakteriellen Klone zunächst mit DNA (cDNA), welche von RNA aus gemäß Anspruch 3 oder 4 induzierten Zellen

oc danach

gewonnen wurde, sowie ymit identischer . DNA (cDNA), welche von RNA nicht induzierter Zellen hergestellt wurde, durchführt.

L - -J

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Γ ■ ~

9. Verfahren zur Manipulation eines Bakterienstarames zur Herstellung von Interferon-Polypeptid, dadurch gekennzeichnet, daß man eine nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 6 erhaltene klonierte Interferon-DNA in den Bakterienstamm (Wirtsstamm,) einschleust.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtsstamm E. coli verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirtsstamm eukaryotische Zellen verwendet.

12. . Verfahren zur Anreicherung von Interferon-mRNA oder einer mRNA (induzierbare mRNA) für ein anderes Protein oder Polypeptid, deren Herstellung die Induktion in der Wirtszelle durch exogene Faktoren erfordert, dadurch gekennzeichnet, daß man,

a) eine Wirtszellkultur mit einem solchen exogenen Faktor behandelt, um in diesen Wirtszellen die Synthese der indu-

zierbaren mRNA auszulösen,

b) die mRNÄ's einschließlich der induzierbaren mRNA, welche in der induzierten Zellkultur gebildet wurde, sowie die mRNA¹s aus einer nicht induzierten Kontrollkultur der gleichen Wirtszellen extrahiert,

c) cDNA-Proben sowohl von den mRNA's aus der induzierten Kultur als auch von den mRNA¹ s auster nicht-induzierten Kontrollkultur erzeugt, wobei die entsprechenden mRNA's als Matrizen dienen ("induzierte cDNA" und "nicht-induzierte cDNA"),

d) doppelsträngige cDNA's erzeugt, die von der mRNA aus der

induzierten Kultur stammen, diese cDNA's in einen Vektor einführt, einen Mikroorganismus mit diesen modifizierten Vektoren transformiert, sowie diesen Mikroorganismus unter Bedingungen züchtet, die das selektive Wachstum sol-

eher Mikroorganismenkolonien erlauben, welche die modifizierten Vektoren enthalten (Ausgangskolonien),

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e) von diesen Ausgangskolonien Duplikatkolonien herstellt,

f) die DNA's sowohl von den Ausgangs- wie von den Duplikatkolonien in situ freisetzt,

g) die DNA's von^Susgangskolonien einerseits sowie von den

' Proben

Duplikatkolonien andererseits mit/der "induzierten cDNA" bzw. der. "nicht induzierten cDNA" /oder. . umgekehrt) hybridisiert, „ ,

den Proben

h) . die DNA's von Klonen, welche mit /de*¹" induz ierten cDNA" ' nicht dagegen mit den Proben der "nicht induzierten CDNA ... · hybridisieren »gewinnt, wobei DNA's

erhalten werden, welche mit solcher mRNA hybridisieren, die in das induzierbare Protein oder Polypeptid, insbesondere Interferon, translatiert werden kann.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) eine Ausgangs-mRNA menschlichen Ursprungs verwendet.

14. Verfahren zur Herstellung von Mikroorganismenzellen, die mehrere Kopien der gemäß Anspruch 12 oder 13, Stufe h) erhaltenen DNA's enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß man die in Anspruch 12 oder 13, Stufe h) erhaltenen DNA's in einen Mikroorganismus einschleust.

Vektor., enthaltend
15./ eine DNA, die mit der RNA eines induzierbaren Proteins,

wie Interferon, hybridisieren kann. ....

16. Vektor nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß er sich von pBR322 ableitet und ein DNA-Insert enthält, das mit menschlicher mRNA hybridisieren kann und bis zu 900-1000 Nukleotide umfaßt.

17. Vektor nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Insert etwa 720 Nukleotide umfaßt.

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18. Verfahren zur Abtrennung von mRNA für ein induzierbares Protein, wie Interferon, von den mRNA's, die von einer Zelle, vorzugsweise menschlichen Ursprungs, produziert werden, wenn diese Zelle mit einem geeigneten exogenen Faktor behandelt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die vorher extrahierten, in den Zellen synthetisierten mRNA¹s mit einem auf einem Träger fixierten DNA-Vektor nach Anspruch 15 bis 17 unter Bedingungen zusammenbringt, welche Hybridisierung erlauben und danach die gebundene mRNA von dem fixierten DNA-Vektor eluiert.

19. mRNA von menschlichem Interferon in hochgereinigter . Form.

20. mRNA von menschlichem Interferon ß1 in hochgereinigter Form.

21. mRNA von menschlichem Interferon ß2 in hochgereinigter

Form.
20

22. mRNA für menschliches Interferon, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa 900 bis etwa 1000 Nukleotide lang ist, wenn sie für IFN-ß.1 kodiert, und 1250-1350 Nukleotide, wenn sie für IFN-ß.2 kodiert, und daß sie in ein einziges PoIypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 20 000 bzw. 23 000 mit Interferon-Aktivität translatiert werden kann.

23. DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie für ein PoIypeptid mit Interferon-Aktivität kodiert und in einen Vektor, wie das Plasmid pBR322, eingebaut werden kann.

24. Menschliches Interferon ß1 in hochgereinigter Form.

25. Menschliches Interferon 62 in hochgereinigter Form 35

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