SE461223B - Mrna och cdna foer humant fibroblastinterferon, foerfarande foer deras framstaellning samt anvaendning daerav - Google Patents

Description

l0 15 20 25 30 35 40 461 223 2 aminosyrorna, varvid en proteinframställning med interferonaktivitet erhållits, skulle interferon-mRNA inte vara mer än en mycket liten del av det mRNA som översatts och således skulle den slutligen framställda produkten med interferon- aktivitet vara mer än kraftigt förorenad med andra protein.

Således skulle användandet av mRNA-beredningar enligt tidigare känd teknik såsom utgângsmaterial för en direkt transformering till dubbelflätad DNA, som är benägen att reproduceras ("cloned“) efter det att den införts i en lämplig vektor, innebära filtreringssvârigheter som i praktiken skulle vara oövervinnerliga.

Ett huvudändamål med föreliggande uppfinning är att övervinna, i största möjliga mån, ovan nämnda svårigheter speciellt vid tillhandahållandet av en metod för isolering av det mRNA som är översättningsbart till interferon, mera speciellt av humant ursprungjliksom motsvarande DNA.

Ytterligare ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för isolering av genetiskt material (DNA), innehållande den nukleotid- sekvens som kodar för interferon i humanceller. Ännu ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett för- farande av denna typ, vari budbärar~RNA transkriberas till DNA och vilket omfattar reproducering ("cloning“) av DNA i en lämplig vektor. En föredragen vektor är en plasmid och en föredragen plasmid är en plasmid av pBR322-typ. Ännu ytterligare ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för att detektera den särskilda genetiska sekvensen som kommer till uttryck i humanceller då den induceras att producera interferon. Ett föredraget I I utförande innebär en differentierad hybridisering av bakteriekloner, först med DNA från RNA från inducerade celler och för det andra med identiskt DNA erhållet från RNA från icke-inducerade celler.

Ytterligare ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarandet för framställningpv en bakteriestam att producera interferonpolypeptider, vilket omfattar introducering av ett klon-interferon-DNA i en lämplig vektorbärare.

Klon-interferon-DNA framställes med fördel såsom angetts ovan. En föredragen vektor är E. coli eller någon annan lämplig mikroorganism. En annan typ av föredragen vektorbärare är en eukaryotisk cell.

Andra och ytterligare ändamål med föreliggande uppfinning komer nedan att framgå. ' En föredragen bild av föreliggande uppfinning omfattar ett förfarande för att isolera genetiskt material (DNA), vilket innehåller nukleotidsekvensen som kodar för interferon i humanceller, företrädesvis fibroblastceller, vilket förfarande omfattar kultivering av celler som producerar interferon då de utsättes för en inducerare av interferon och att dessa utsättes för en sådan inducerare, extrahe- ring av budbärar-RNA från nämnda inducerade celler, rening av budbärar-RNA från interferon, transkribering av budbärar-RNA till DNA och reproducering (“cloning") l0 l5 20 25 30 35 40 s 461 225 av DNA i diploida förhudsceller. Enligt ett föredraget utförande är induceraren en dubbel- flätad RNA.

Förfarandet enligt uppfinningen för berikning med interferön-mRNA eller med en lämplig vektor. Enligt ett föredraget utförande är cellerna humana, ett mRNA (inducerbart mRNA) eller annat protein eller polypeptid, vars produktion kan framkallas i värdcellen med hjälp av exogena faktorer omfattar: a) exponering av en kultur av värdceller för sådana exogena faktorer så att syntesen av inducerande mRNA framkallas i värdcellerna; b) extrahering av mRNA innefattande det inducerande mRNA som formas i de in- ducerade cellkulturerna sàväl som mRNA från icke-inducerade kontrollkulturer av samma värdceller; c) syntetisering av försöksmaterial av CDNA från mRNA av såväl inducerade kulturer som icke-inducerade kontrollkulturer med användande av motsvarande mRNA som mallar (inducerat cDNA och icke-inducerat cDNA); d) syntetisering av dubbelflätat cDNA, vilket erhållits från det mRNA som extraherats frân de inducerade kulturerna, införning av cDNA i lämpliga vektorer, transfektering av lämpliga mikroorganismer med de erhållna, modifierade vektorerna och kultivering av mikroorganismerna under betingelser som är lämpliga för att orsaka selektiv utveckling av mikroorganismkolonier av de modifierade vektorerna (intialkolonier); , e) formning av duplikatkolonier från initialkolonierna; f) frigörning på plats av_DNA i såväl initial- som duplikatkolonierna; g) hybridisering av DNA i intitialkolonierna respektive duplikatkolonierna med ovan nämnda, inducerade försöksmaterial av cDNA respjcke-inducerat försöks- materíäl av cDNA (eller omvänt); h) utvinning av DNA från kloner som hybridiserar med inducerat cDNA-material men inte hybridiserar med icke~inducerat CDNA-material, varvid erhålles DNA som är hybridiserbart med mRNA kapabelt att översättas till inducerande protein eller polypeptid, speciellt interferon.

Förfarandet enligt uppfinningen hänför sig företrädesvis till framställningen av hög-renat mRNA av interferon av humant ursprung.

Det bör påpekas att vissa av stegen som definierats ovan inte behöver utföras i den exakta ordning som där anges. Detta gäller speciellt för steg c), vilket hänför sig till syntesen av försöksmaterial av CDNA. Egentligen behöver detta sista steg c) inte vara ett steg i förfarandet av uppfinningen i sig. Analoga försöks- material, från andra cellulära källor, kan användas i stället.

I ett ytterligare föredraget utförande av uppfinningen tillämpas stegen c) och d), såsom de definieras ovan, enbart på fraktioner av mRNA som kan extraheras från celler, antingen de “inducerats" eller "icke-inducerats". I det avseendet kan för- del dras av det faktum att mRNA omfattar en poly-A~del, vilken medger separation l0 l5 20 25 30 35 40 461 223) 4 av mRNA från totala RNA genom bindning till oligo-T-cellulosa. Den påföljande utspädda mRNA-fraktionen fraktioneras därefter företrädesvis genom sukros- gradientcentrifugering, varvid de olika banden sedan separat överföres till ett lämpligt cellfritt system, såsom ett retikulocytlysat, där varje överförings- produkt sedan testas på sin förmåga att immunoutfällas av anti-interferonserum.

De band av mRNA, vars överföringsprodukter gav en positiv reaktion i sådana immunoutfällningsförsök kvarhölls för att på dessa utföra de två ovan definierade stegen c) och d). En ytterligare sida med detta förfarandet är att två olika mRNA som kodar för interferon kan isoleras från humana fibroblastceller om dessa celler induceras såsom i a) ovan. De minsta mRNA sedimenterar vid llS och ger genom överföring till ett cellfritt system ett protein med en molekylvikt av 20.000, vilket selektivt utfälles med hjälp av antikroppar som framställts mot ett av de interferon som kan renas från dessa celler. Detta protein är humant interferon (IFN)-pl. Den största mRNA-fraktionen sedimenterar vid l4S och ger ett protein med en molekylvikt av 23.000, vilket utfälles med hjälp av antikroppar mot en mindre renad framställning av fibroblastinterferon. Detta protein betecknas som humant interferon-,b2. Fraktioner av mRNA för båda proteinerna användes i steg d) ovan. Detta gör det möjligt att om så önskas producera IFN-Al eller IFN-,¿2 i huvudsakligen ren form. Hybridiseringen (steg c, d, e, f, g och h såsom de definierats ovan) gör det således möjligt att exakt definiera enstaka kolonier av E. coli innehållande en eller tvâ interferon-ÖDNA IFN ßl eller )à2. Speciellt) - bör noteras att de kolonier som hybridiseras med enbart_"induceratÜ cDNA-material och inte med “icke-inducerat" cDNA-material endast kan utgöras av de som har inför- livat en modiferad vektor med det cDNA som motsvarar interferon-mRNA, eftersom: a) nämnda DNA, som inte kan hybridiseras med det "icke-inducerade"-cDNA-mate- rialet, således inte motsvarar något av de mRNA som normalt produceras av en "icke-inducerad“ cell och b) den enda skillnaden mellan de två försöksmaterialen som användes är att det "inducerade“ cDNA-materialet enbart skiljer sig från det andra genom det faktum att det innehåller ett cDNA som erhållits från ett interferon-mRNA. Det framstår klart för en fackman inom omradet att bildningen av dessa cDNA-försöksmaterial kan erhållas med hjälp av varje metod som är känd i sig, speciellt genom transkription i närvaro av ett revers-transkriptas. Det är en fördel att använda en högproducerande bakterievektor såsom plasmiden pBR322. I syfte att erhålla att vektorer modifierade med interferon-cDNA kommer till uttryck senare i en mikro- organism, kan man använda ett antal vektorer som definieras av Patrick Charney~et al. i “Bacteriophage Lambda and Plasmid Vectors Allowing Fusion of Cloned Genes in each of the three translational phases", Nucleic Acids Res., l978 - 5(l2), 4 479-94.

Enligt ett ytterligare viktigt steg i uppfinningen, kan ovan nämnda modifierade vektor, vilken dess överföringsfas än må vara, användas för extrahering av inter- lO l5 20 25 30 35 s 461 223 feron~mRNA från RNA~blandningen som erhållits med hjälp.av “inducerade" celler, vilket förfarande omfattar att dessa RNA låtes komma i kontakt med en sådan vektor som modifierats av interferon-cDNA, vilket tidigare immobiliserats pâf en bärare, under betingelser som är lämpliga för att orsaka hybridisering och varefter den fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn. På ett sådant sätt kan mRNA av humant interferon (antingen IFN l eller IFN 2)erhållas i Stañkt renad form. - Det höga tillstånd av renhet kan erhållas genom det faktum att överförings- produkten, i ett lämpligt in vitro-system, i varje fall huvudsakligen består av en enkel polypeptidförening med interferonaktivitet och vilken kan utfällas av nämnda antikroppar till hunmnt interferon.

Uppfinningen hänför sig således också till det renade mRNA, vilket normalt omfattar upp till 900-l000 nukleotider för IFN- Al och l250-l350 för IFN-Åß2.

På samma sätt hänför sig uppfinningen även till motsvarande cDNA, vilken kan erhållas genom transkription av nämnda RNA. Uppfinningen hänför sig dessutom till existensen av två olika interferon-mRNA och således till proteindelar som också kan ha olika biologisk betydelse. Där så är lämpligt föregås varje hybridi- seringssteg innefattat i föreliggande uppfinning av en denaturering av möjliga dubbelflätade nukleinsyror för att garantera att inga dubbelflätade nukleinsyror (vilka skulle kunna inducera interferonaktivitet i celler) finns kvar i det renade mRNA-materialet, då detta användes för framställning, genom translation ' av huvudsakligen rent protein med interferonaktivitet in vitrof Uppfinningen kommer vidare att beskrivas på ett icke begränsande sätt genom en mera detaljerad beskrivning med hänvisning speciellt till figurerna och tabellen.

Fig. l illustrerar fraktioneringen av mRNA pà en sukrosgradient och över- sättningen av dessa mRNA delar, vilka härstammar från inducerade celler, till att ge human interferonaktivitet i Xenopus laevis.oocyter och till att speciellt ge immuno-utfällt protein i retikulocytlysat, ett förfarande som separerar mRNA för IFN-Ål och.för IFN-A2.

Fig. 2 illustrerar resultatet från en differentiell hybridiseringsprocedur av DNA från samma bakteriekolonier med de två ovan nämnda försöksmaterialen från "inducerade" respektive “icke-inducerade" celler.

Fig. 3 visar en rening av interferon~IFN762-mRNA genom hybridisering med immobiliserat DNA från bakterieklon A34l såsom visats genom översättning i ett retikulocytlysat.

Fig. 4 visar att DNA från bakterieklon A34l motsvarar en 1250-l350 lang mRNA som uppträder i humanceller endast efter induktion av interferonsyntes.

Tabell l visar att detta mRNA, vid översättning i Xenopus laevis 'oocyter ger biologiskt aktivt interferon som hindrar växten av ett virus i humanceller. lO 15 20 25 30 35 40 461 225 s EXEMPEL a) Rening av tvâ interferon¿mRNA från humana, diploida fibroblaster RNA extraherades ur kulturer i monolager från den humana fibroblastlinjen FSll (isolerad vid Heizmann Institute of Science). Dessa diploida celler som erhållits från förhudsexplantat, vilka tagits från en normal individ 8 dagar efter födseln,_valdes ut bland l5 separata isolat för sin kapacitet att producera kraftiga titrar av interferon. Alternativa kulturer av en klon av human~SV80-celler användes. Kulturerna i Eagles minimala nedium med 10 %:s fosterkalvserum placerades i 2,2 liters glasrundkolvar eller 22 x 22 cmzs plastskàlar i en atmosfär av 5 % C02 och 95 % luft vid 3700. Tre dagar efter samanflödningen inducerades kulturerna för att framställa interferon genom utsättning för poly(rI):(rC) l00,ug/ml, och cykloheximid (vilket blockerar syntesen av protein av värden) 50,ag/ml under 3,5 tinmar. Aktinomycin D (vilket blockerar syntesen av cellulärt RNA) l ßg/ml till- sattes och l timme senare fick cellerna genomgå lys med buffrat Nonidet-P40-deter- gent och cytoplasmiskt RNA extraherades med en fenolkresolblandning enligt Kirby (l965). mRNA išolerades från den totala RNA med utnyttjande av det faktum att de innehåller Poly A, genom bindning till oligo~dT-cellulosa. mRNA-fraktionen fraktio- nerades därefter genom sukrosgradientcentrifugering. Fraktionerna innehållande interferon-mRNA identifierades genom mikroinjicering i šengpus laevjs oocyter enligt Raj N.K.B och Pitha f.M. (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 15, l483-l487, l977), samt genom att 24-40 timmar senare mäta den antivirala aktiviteten av det fri- gjorda'interferonet i oocyt-inkubationsnediet. Den antivirala aktiviteten mättes genom att FSll-celler utsattes för utspädning av oocyt-medium, varvid dessa celler infekterades med vesikulärt stomatitvirus och inhiberingen av den cytopatiska effekten orsakad av virusen observerades. Interferontitrar beräknades genom jäm- förelse med en känd lösning enligt den senast verksamma utspädningen. Éraktionerna innehållande interferon-mRNA identifierades också genom översättning i ett retiku- locytlysat följt av immuno-utfällning av produkten enligt förfarandet av Weissenbach et al., (Eur.J.Biochemistry §§, l-8, l979).

Fig. lb visar de tvâ topparna av interferon-mRNA-aktivitet, vilka detekteras genom injektion i oocyter. Fig. lb representerar immuno-utfällningslinjerna som er- hållits mellan översättningsprodukterna och anti-inferferonserum, där de tvâ pilarna visar på de tvâ polypeptiderna med molekylvikter av 23,000 (23K) och 20.000 (20K).

De sukrosgradientfraktioner som kodar för 23K- och 20K-immunoutfällda polypeptider visas i fig. la och kan ses motsvara de två topparna av interferon-mRNA-aktivitet.

Interferonaktivitet detekterades också i översättningsprodukterna i retikulocyt- lysat genom mätning av induktion av (2'-5')-oligo-isoadenylatsyntetas i human- celler. Hed hjälp av bägge metoderna erhölls att den största interferon~mRNA-toppen kodar för 23K-polypeptiden, medan den minsta interferon-mRNA-toppen kodar för 20K- polypeptiden. Bägge interferon-mRNA isolerades på detta sätt och användes för 10 15 20 25 30 35 40 7 461 225 kloning i E. coli. b) Kloning av interferon-32-cDNA i E. coli Det renade mRNA från inducerade celler beräknades innehålla ca l-3 % av mRNA för polypeptiden med en molekylvikt av 23.000 och användes som mall för att syntetisera cDNA med fågel-myeloblastosis virus, reversetransbüptasoch oligo-dT som startmaterial. Efter eliminering av RNA genom alkalisk behandling, kunde den andra flätan av DNA syntetiseras med reverstranskriptas eller DNA-polymeras I.

Enkelflätad DNA hydrolyserades av med nukleas Sl och 3'-ändarna av DNA förlängdes ("svanSades“) med terminal nukleotidtransferas med användande av dGTP som substrat.

Plasmid-DNA hybridiserades därefter med det humana,dC-svansade cDNA, som beskrivits ovan, och användes för att transfektera E. coli DP50. Transfekterade bakterie- kolonier identifierades genom spridning på agarplattor innehållande Luriabuljong, diaminopimelinsyra, timidin och tetracyklin. Kolonierna testades vidare på liknande agarplattor men vilka innehöll ampicillin som enda antibiotika. De ampicillin- känsliga men tetracyklinresistenta öakteriekolonierna läts växa pâ mikrocellulosa- filter placerat på en agarplatta såsom ovan med tetracyklin, l0¿vg/ml. över två tusen av de erhållna transformerade kolonierna överfördes respektive delvis på andra mikrocellulosafilter, vilka var placerade på agarplattor som ovan, varvid varje duplikatkoloni relaterades (speciellt genom vanlig numrering) till en av initialkolonierna. Efter det att kolonierna nått 3-5 mm i diameter, överfördes filtret (initialkulturer och duplikat) till toppen av en stapel filterpapper som impregnerats först med 0,5 N Na0H, därefter med O,l5 M NaCl och 0,l N Na0H för att orsaka att respektive DNA frigöres på plats. Filtren neutraliserades och torkades. För att detektera de öakteriekolonier som innehöll interferon~DNA-sekven- serna hybridiserades filtren med tvâ olika I32P)LcDNA-prover. Ett cDNa-prov preparerades med reverstranskriptas av mRNA från sukrosgradientfraktionen från inducerade celler (pil 23K i fig. l). Det andra provet preparerades på ett iden- tiskt vis med den liknande fraktionen från icke-inducerade cellpreparationen.

Bägge cDNA-proverna syntetiserades med användande av de fyra starkt radioaktiva [32R]-deoxinukleosidtrifosfataser som substrat och fragmenterad kalvtymus DNA som startmaterial. Slumpvis representation av mRNA-sekvenser i cDNA-proverna upp- náddes därvid. Hybridiseringen utfördes vid 62-6400 under l8 timmar i 0,9 M NaCl - 0,09 M Na citratbuffert, pH 7,0, varvid initialkolonierna hybridiserades med cDNA- proverna av de inducerade cellerna och duplikatkolonierna med cDNA-proverna från de icke-inducerade cellerna (eller omvänt). Efter noggrann tvättning utsattes filtren för röntgenstrålning och de bakteriekolonier som hade förmåga att hybridi- seras till det inducerade cDNA men icke till det icke-inducerade cDNA identifierades.

På detta sätt isolerades 20 olika bakteriekolonier av ett totalt av över.2OD0 utsorterade transformerade kolonier. Samtliga av dessa 20 bakteriekolonier inne- höll multipla kopier av en plasmid i vilken infördes sekvenser av human-mRNA lD l5 20 25 30 35 40 461 225 8 avgivna endast efter det att cellerna inducerats till att producera interferon av poly (rI:rC).

Ett exempel som illustrerar denna teknik visas i fig. 2 som visar femton par alkalibehandlade par av kolonier (initiella och duplikat) på deras respektive nitrocellulosafilter, vars DNA har hybridiserats med [32P] -cDNA berett mot mRNA- fraktion 23K i fig. l, från celler som inducerats (i) eller icke-inducerats (i.i) av poly(rI):(rC) för interferonproduktion.Pilarna visar två kolonier, speciellt kolonierna 5 och l3, vilka innehåller inducerade sekvenser. Kolonierna lß beteckna- des som E. coh nPso/Asm. ' c) Isolering av interferon mRNA från humana fibroblaster Isolering av interferon=mRNA (och demonstration av närvaron av interferon- cDNA-sekvenser i plasmid-DNA av klon A341) utfördes på följande sätt: En 500 ml kultur av denna bakterieklon användes för att bereda 50 ßg plasmid-DNA. Detta DNA (efter tidigare denaturering) var kovalent bundet till diazobensyloximetyl- cellulosapulver enligt metoderna som angetts av Aldwine et al. (Proc.Natl.Acad.

Sci. USA l977,_Zí, 5350). Parallellt bands på liknande sätt plasmid-p8R322 DNA (inte innehållande humana DNA-sekvenser) till cellulosa. Poly A-innehållande mRNA, från humana fibroblaster som inducerats för att producera interferon, hybridisera- des till de tvâ DNA cellulosaberedningarna i 50 % formamid vid 52°C och eluderades genom höjning av formamidkoncentrationen till l00 Z vid 70°C. Den efter eluderingen utvunna RNA översattes i det cellfria, retikulocytsystemet (fig. 3), varvid den huvudsakliga översättningsprodukten av mRNA som valdes från A341 DNA-cellulosan befanns huvudsakligen vara polypeptiden med en molekylvikt av 23.000. Däremot er- hölls inget humant interferon mRNA från p8R322 DNA-cellulosan. I jämförelse till översättningsprodukterna av humant mRNA, före dess hybridisering till A34l DNA- cellulosa, kunde det fastställas att det klonade A34l DNA är komplementärt enbart till en liten del av mRNA-blandningen. Produkten av mRNA utvald från A341 DNA- cellulosan immunoutfälldes med hjälp av antihumant fibroblastinterferonserum.

Interferon mRNA kan också isoleras med hjälp av ett liknande förfarande till det som nämnts ovan, men där plasmid A34l DNA binds till nitrocellulosafilter, RNA hybridiseras till denna och eluderas med hjälp av kokning under l min. i H Aktiviteten hos detta renade mRNA att koda för biologiskt, potent, humant interferon har visat sig genom injektion till Xenogus laevis oocyt följt av mätning av inhiberingen av virusmângfaldigande i humanceller, vilka utsatts för oocyt- inkubatiflnsmediet (Tabell l). Interferonaktiviteten för det renade ,62-mRNA visades också genom induktion av (2'-5')-oligo-isoadenylatsyntetas i humanceller med hjälp avcoocyttranslationsprodukterna (Tabell l).

Restriktionsenzym som kartlägger A341-plasmid-DNA visar att detta innehåller ett human-DNA-inlägg av ca 900 nukleotider i Pst-läge. A34l-DNA hybridiserades 20. l0 l5 20 25 30 35 9 461' 225 också till 3 fragment av det humangenom som uppslukats genom Egg Rl-nukleas.

Dessa fragment separerades genom agarosgelelektrofores. Hybridisering till agarosgel-elektroforogram av mRNA från humanfibroblasten visade ytterligaee att A34l-DNA är komplementärt till RNA-sekvenser som endast kommer till uttryck i celler som utsatts för interferoninducerande poly (rI:rC) (Fig. 4a). Även en en timmes lång utsättning av cellerna för poly(rI:rC) leder till ansamlingen av en l250-l350 nukleotid RNA som hybridiserar till A34l-DNA, och vilken representerar IFN- ß2-mRNA.

De data som anges ovan visar att bakterieklonen E. coli DP50/A341 innehöll i Pst-läge av dess pBB322-plasmid ett inlägg av ca 900 nukleotider av human-cDNA- sekvenser, vilka är komplementära till ett humant interferon-mRNA. Ett antal liknande framställda kloner erhölls. Fig. 4b visar attkioney-för IFN-,é2 hybridi- serar till den största l250-l350 nukleotider långa mRNA, medan kloner för IFN~ßl hybridiserar till de minsta 900-l000 nukleotider långa mRNA.

Förfarandet kan utnyttjas för att erhålla kloner av interferon-DNA av olika ' typer (1, 5, Y) från humanceller.

Förklaring till figurerna: Fig. l: Sukrosgradient av poly A+-RNA från humanceller som inducerats för att producera interferon (a). Sedimentering erhölls från höger till vänster.

Tio Xenopus oocyter injicerades med 0,4 pg RNA av varje fraktion och efter 40 timmar analyserades mediet kring oocyterna på FSll-celler efter inter- feron (vänstra skalan). Varje RNA-fraktion (0,24Åflg) översattes också i retikulocytlysat och den 355-metioninmärkta produkten utfälldes med anti- _ -interferonserum. De produkter som analyserades med hjälp av polyakrylamid- gel-elektrofores visas av i.i (b). Beteckningeni_i-i(b) representerar de immuno-utfällda produkterna av ofraktionerat mRNA från icke-inducerade celler Till höger i (b) finns markeringar för molekylvikterna (fran topp till botten 68, 46, 30, l8 respektive l4 daltonenheter x l0'3). Läget och intensiteterna för 23K- och ZDK-proteinerna (pilarna) noterades och visas grafiskt i(a) (högra skalan). Den tyngsta av de tvâ interferon mRNA översattes i 23K- proteinet medan den minsta interferon mRNA översattes i 20K-proteinet.

Fig. 2: Detektion av transformerade bakteriekloner innehållande interferon DNA.

Femton alkalibehandlade kolonier på nitrocellulosafilter hybridiserades med [32E]-cDNA, vilka beretts mot 23K-mRNA-fraktionen (se fig. l) från celler som inducerats (i) eller icke-inducerats (i.i) av poly(rI):(rC) för inter- - feronproduktion. Pilarna visar två kolonier som innehåller inducerade sek- venser. Koloni nummer l3 är E. coli DP50lA34l. 461 Fig. 3: Fig. 4: 225 w Demonstration att klonen E. coli DP50/A341 innehåller interferon DNA.

Poly A+-mRNA från humanfibroblaster, som inducerats för interferon- produktion, hybridiserades till DNA från A341-plasmider kovalent bundet till cellulosa och översattes. Gelelektrofores av översättningsprodukterna visar att mRNA som kodar för interferon-(IF)-polypeptiden väljes unikt ut fràn blandningen av totala mRNA. pBR-DNA kan inte välja ut detta mRNA.

Läget för IF-polypeptiden visas efter imuno-utfällning med anti-inter- feron (ipt). a) Plasmíd-DNA av bakterieklonen A34l hybridiserar till en l4S (l300 nukleotider lång) mRNA funnen i celler som inducerats för interferon-. framställning (i) men inte i icke-inducerade celler (ii). Plasmid-pBR- DNA hybridiserar inte medan o-klonad total CDNA (tot) hybridiserar till många mRNA funna också i icke-inducerade celler. En agaros-gel-elektro- fores pa RNA fam av hybrsgiserang :in ae tre ”P-oNA visas. b) Plasmid-DNA från olika kloner av interferon-DNA användes för ett liknande experiment av hybridisering till mRNA-elektroforogram. Kloner innehållande IFN-;š2-DNA hybridiserar till den l300 nukleotider långa mRNA, medan kloner med IFN- fd-DNA hybridiserar till den mindre 900 nukleotider långa interferon-mRNA.

TABELL l HYBRIDISERING-ÖVERSÃTTNING AV/å2-INTERFERON-mRNA Experiment l Experiment 2 Beräknad V-5¿V¿ -vírusutbyte 0lig0-isoadenylat- Beräknad Radloinnwnoanalys, cpm syntetas-induktion IF-titer fiZPJ-Az-psvx, cpm Docyt-supernatant Oocyt-extrakt (utspädd l:l0) (utspädd l:l5) - oinjicerad 7445 l700 - med RNA hybridiserad till IF-#2-plasmid l920 4700 30 U/ml - med RNA hybridiserad till obesläktad plasmid 60l5 lS00 0 - Interferon-standard 100 U/ml 700 l0800

Claims (16)

10 15 20 25 30 35 40 461 225 11 x Klon E474-DNA användes i Experiment 1 och en pool av IF-/2-DNA-plasmider i Experiment 2. PATENTKRAV

1. Förfarande för framställning av huvudsakligen rent mRNA för humant fibroblastinterferon, k ä n n e t e c k n a t av: (a) att en kultur av fibroblastceller utsättas för en exogen faktor för att i cellerna inducera syntesen av interferon mRNA; (b) att mRNA som bildats i den inducerade cellkulturen liksom mRNA från en icke-inducerad kontrollkultur av samma vârdceller extraheras; (c) att man syntetiserar dubbelstrëngat cDNA erhållet från det mRNA som extraherats från den inducerade kulturen, att detta cDNA införes i vektorer, att bakterier transfekteras med de modifierade vektorerna som erhållits och att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonierna med nämnda modifierade vektorer (initiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella kolonier bildas; (e) att DNA för såväl initial- som duplikatkolonierna frigöras på plats; (f) att cDNA-försöksmaterial syntetiseras av mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kontrollkulturen med hjälp av motsvarande mRNA som mall (inducerat cDNA och icke-inducerat cDNA); (g) att DNA för de inítiella kolonierna å ena sidan och duplikat- kolonierna å andra sidan hybridiseras med ovan nämnda försöksmaterial av inducerat cDNA och icke-inducerat cDNA; (h) att DNA som hybridiserar med försöksmaterialet av inducerat cDNA men inte hybridiserar med försöksmaterialet av icke-inducerat cDNA utvinnes; (i) att tidigare, i steg (b), extraherat mRNA låtes komma i kontakt med DNA från steg (h), immobiliserat på en matris under betingelser som ger upphov till hybridisering, att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn i huvudsakligen ren form för att utvinna det mRNA som har förmåga att translateras till humant fibroblastinterferon-beta.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att mRNA i steg (b) fraktioneras med hjälp av sukrosgradientcentrifugering följt av in vitro-translation av mRNA till humant fibroblastinterferon beta-1 och beta-2.

3. Huvudsakligen rent mRNA av humant fibroblastinterferon-beta-1 er- hållet genom (a) att en kultur av fibroblastceller utsättas för en exogen faktor för att i cellerna inducera syntesen av interferon mRNA; (b) att mRNA som bildats i den inducerade cellkulturen liksom mRNA från en icke-inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (b') att mRNA som har extraherats från den inducerade kulturen separeras 10 15 20 25 30 35 40 461 223 12 genom sukrosgradientcentrifugering och att mRNA-sedimentet isoleras vid 115; (c) att man syntetiserar dubbelstrëngat cDNA erhållet från det mRNA som_ extraherats från den inducerade kulturen, att detta cDNA införes i vektorer,' att bakterier transfekteras med de modifierade vektorerna som erhållits och I? att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonierna med nämnda modifierade vektorer (initiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella kolonier bildas; (e) att DNA för såväl initial- som duplikatkolonierna frigöras på plats; (f) att cDNA~försöksmaterial syntetiseras av mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kontrollkulturen med hjälp av motsvarande mRNA som mall (índucerat cDNA och icke-inducerat cDNA); (g) att DNA för de initiella kolonierna å ena sidan och duplikat- kolonierna å andra sidan hybridiseras med ovan nämnda försöksmaterial av inducerat cDNA och icke-inducerat cDNA; (h) att DNA som hybridiserar med försöksmaterialet av inducerat cDNA men inte hybridiserar med försöksmaterialet av icke-inducerat cDNA utvinnes; (i) att tidigare, i steg (b'), isolerat mRNA lâtes komma i kontakt med DNA från steg (h), immobilíserat på en matris under betingelser som ger upphov till hybridisering, att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn i huvudsakligen ren form för att utvinna det mRNA som har förmåga att translateras till humant fibroblastinterferon-beta-1, k ä n n e t e c k n a t av att det har ca 900 nukleotider och att det är translaterbart till huvudsakligen en enkel polypeptid med en molekylvikt av ca 20.000 och med interferonaktivitet.

4. Huvudsakligen rent mRNA för humant fibroblaatinterferon beta-2 er- hållet genom (a) att en kultur av fibroblastceller utsättas för en exogen faktor för att i cellerna inducera syntesen av interferon mRNA; (b) att mRNA som bildats i den inducerade cellkulturen liksom mRNA från en icke-inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (b") att mRNA som har extraherats från den inducerade kulturen separe- ras genom sukrosgradientcentrifugering och att mRNA-sedimentet isoleras vid 145; (c) att man syntetíserar dubbelsträngat cDNA erhållet från det mRNA som extraherats från den inducerade kulturen, att detta cDNA införas i vektorer, att bakterier transfekteras med de modifierade vektorerna som erhållits och att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonierna med nämnda modifierade vektorer (initiella ko1onier); (d) att duplikatkolonier av nämnda ínitiella kolonier bildas; (e) att DNA för såväl initial- som duplikatkolonierna frigöras på plats; 10 15 20 25 30 35 40 461 225 13 (f) att cDNA-försöksmaterial syntetiseras av mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kontrollkulturen med hjälp av motsvarande mRNA som mall (inducerat cDNA och icke-inducerat cDNA); (g) att DNA för de initiella kolonierna å ena sidan och duplikat- koloníerna å andra sidan hybridiseras med ovan nämnda försöksmaterial av inducerat cDNA och icke-inducerat cDNA; I (h) att DNA som hybridiserar med fürsöksmaterialet av inducerat cDNA men inte hybridiserar med Försöksmaterialet av icke-inducerat cDNA utvinnes; (i) att tidigare, i steg (b"), isolerat mRNA lâtes komma i kontakt med DNA från steg (h), immobiliserat på en matris under betingelser som ger upphov till hybridisering, att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobilíserade DNA-vektorn i huvudsakligen ren form för att utvinna det mRNA som har Förmåga att translateras till humant FibroblastinterFeron-beta~2, k ä n n e t e c k n a t av att det har ca 1300 nukleotider och att det är translaterbart till huvudsakligen en enkel polypeptid med en molekylvikt av ca 23.000 och med interferonaktivitet.

5. Användning av huvudsakligen rent mRNA För humant fibroblastinterferon framställt genom (a) att en kultur av fibroblastceller utsättes för en exogen Faktor För att i cellerna inducera syntesen av interferon mRNA; (b) att mRNA som bildats i den inducerade cellkulturen liksom mRNA från en icke-inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (c) att man syntetiserar dubbelsträngat cDNA erhållet från det mRNA som extraherats från den índucerade kulturen, att detta cDNA införes i vektorer, att bakterier transfekteras med de modifierade vektorerna som erhållits och att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteríekolonierna med nämnda modifierade vektorer (initiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella kolonier bildas; (e) att DNA för såväl initial- som duplíkatkolonierna frigöras på plats; (f) att cDNA~försöksmaterial syntetiseras av mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-índucerade kontrollkulturen med hjälp av motsvarande mRNA som mall (índucerat cDNA och icke-inducerat cDNA); (g) att DNA för de initíella kolonierna å ena sidan och duplikat- kolonierna å andra sidan hybridiseras med ovan nämnda försöksmaterial av inducerat cDNA och icke-inducerat cDNA; (h) att DNA som hybridiserar med Försöksmateríalet av inducerat cDNA men inte hybridiserar med Försöksmaterialet av icke-inducerat cDNA utvinnes; (i) att tidigare, i steg (b), extraherat mRNA låtes koma i kontakt med DNA från steg (h), immobiliserat på en matris under betingelser som ger upp- hov till hybridiseríng, att därefter det fixerade mRNA eluderas från den 10 15 20 25 30 35 40 461 223 14 immobiliserade DNA-vektorn i huvudsakligen ren form för att utvinna det mRNA som har förmåga att translateras till humant fibroblastinterferon-beta, för framställning av interferon beta omfattande transkribering av mRNA till DNA och kloning av DNA i en vektor, varefter det klonade interferon-DNA införas i en eukariotisk eller prokariotisk cell, att cellen odlas och att ínterferonet utvinnes.

6. Användning enligt krav 5 för framställning av interferon-beta-1, varvid mRNA uppvisar ca 900 nukleotider och är tranalaterbart till huvudsak- ligen en enkel polypeptid med en molekylvikt av ca 20.000 och med inter- feronaktívitet. _

7. Användning enligt krav 5 för framställning av interferon-beta-2, varvid mRNA uppvisar ca 1300 nukleotider och är translaterbart till huvud- sakligen en enkel polypeptid med en molekylvikt av ca 23.000 och med inter- Feronaktivitet. B.

8. Dubbelsträngat cDNA, k ä n n e t e c k n a t av att det kodar För en polypeptid med interferon-beta-2-aktivitet och är komplementärt till ett mRNA för humant interferon-beta-2 som translateras till biologiskt aktivt humant interferon-beta-2 i oocyter från Xenopus laevis.

9. DNA enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t av att det har ca 1250 - 1350 nukleotider och kan translateras till väsentligen en enda polypeptid med en molekylvikt av ca 23000.

10. DNA enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t av att det utvinnes från humana fibroblastceller.

11. DNA enligt krav B, k ä n n e t e c k n a t av att det Föreligger i klonad Form.

12. Förfarande För framställning av DNA enligt krav 8, innefattande att celler, som producerar interferon vid exponering För en interferoninducerare, odlas, att dessa exponeras för en sådan inducerare, att budbärar~RNA För humant interferon-beta-2 extraheras från dessa inducerade celler, att nämnda interferon-budbärar-RNA renas och att detta budbärar-RNA enligt krav 4 transkriberas till DNA enligt krav 8.

13. Förfarande enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t av att det DNA som erhålles klonas i en vektor.

14. Förfarande enligt krav 12 eller 13, k ä n n e t e c k n a t av stegen: (a) att en kultur av fibroblastceller utsättas för en exogen faktor som i cellerna inducerar syntes av interferon-beta-2-mRNA; (b) att mRNA som har bildats i den inducerade cellkulturen samt mRNA från en ej inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (c) att dubbelsträngat cDNA erhållet från det mRNA som har extraherats l) UN 10 15 20 25 30 35 40 461 223 15 från den inducerade kulturen syntetiseras, att detta cDNA införes i vektorer, att bakterier transfekteras med de modifierade vektorerna som har erhållits, att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonier med nämnda vektorer (initiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella koloníer bildas; (e) att DNA för såväl de initiella kolonierna som duplikatkolonierna frigöras på plats; (f) att cDNA-försöksmaterial syntetiseras av mRNA från både den indu- cerade kulturen och den ej inducerade kontrollkulturen med användning av mot- svarande mRNA som mall (inducerat cDNA och ej inducerat cDNA); (g) att DNA från de initiella kolonierna å ena sidan, och från duplikat- kolonierna å andra sidan hybridiseras med ovannämnda försöksmaterial av in- ducerat cDNA respektive ej inducerat cDNA; (h) att DNA som hybridiseras med försöksmaterialet av inducerat cDNA och som inte hybridiseras med försöksmaterialet av ej inducerat cDNA utvinnes; (i) att det mRNA som tidigare, i steg (b), har extraherats, bringas i kontakt med individuellt cDNA från steg (h), immobiliserat på en matris under betingelser som orsakar hybridisering, och att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn i väsentligen ren form och att klonat DNA som har hybridiserats med det mRNA som kan translateras till humant fibroblastinterferon-beta-2 identifieras.

15. förfarande enligt krav 14, k ä n n e t e c k n a t av att mRNA fraktioneras genom sukrosgradientcentrifugering följt av in vitro-translation av mRNA till humant fibroblastínterferon-beta-2.

16. Användning av DNA enligt krav 8 eller 9 för framställning av inter- feron-beta-2, innefattande att nämnda DNA klonas i en vektor, att det klonade interferon-beta-2-DNA införas i en eukaryotisk eller prokaryotisk cell, att cellen odlas och att interferon-beta-2_utvinnes.