JP2555279B2 - インタ−フエロンに転換可能なｍＲＮＡ及びその製造方法 - Google Patents

インタ−フエロンに転換可能なｍＲＮＡ及びその製造方法

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JP2555279B2 JP55164482A JP16448280A JP2555279B2 JP 2555279 B2 JP2555279 B2 JP 2555279B2 JP 55164482 A JP55164482 A JP 55164482A JP 16448280 A JP16448280 A JP 16448280A JP 2555279 B2 JP2555279 B2 JP 2555279B2
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Description

【発明の詳細な説明】 インターフエロンは生体により生成された重要な抗ウ
イルス性及び制癌性蛋白質である。この種特異性のため
に、インターフエロンの臨床的使用はヒトインターフエ
ロンを必要とする。組織培養細胞からまたは新鮮な白血
細胞から生成されうるインターフエロンは量が限られて
いるため大規模な臨床的使用には充分ではない。ヒトイ
ンターフエロンのための遺伝子情報を細菌性微生物へ導
入することは、もしこれが入手可能ならば、恐らく、イ
ンターフエロン活性を有するポリペプチドの大量生産を
可能にするであろう。このような技術がヒト成長ホルモ
ン及びインシユリンの場合に開発されていることが知ら
れている。
インターフエロンの２種のタイプ、すなわち、白血球
（IFN−α）及び繊維芽細胞タイプ（IFN−β）が異なる
メツセンジヤーRNAにより遺伝暗号化されるようである
（Cavallier,et al,1977,Proc Natl Acad Sci USA 74,4
415−19）。純粋な形態をしたこれらmRNAの単離は未だ
達成されていない。これは恐らく宿主細胞が適当な外因
性因子、例えばウイルス性感染またはポリ（rI:rC）の
ような特定の実験用ポリヌクレオチドにインターフェロ
ンmRNAを曝露した結果としてのみ、そしてわずか微少量
でしかインターフェロンmRNAを合成できないようである
ので、なお一層困難に思われる。従って、もし、インタ
ーフェロンを生成するため予め誘導された宿主細胞のmR
NA抽出物を用い、全成分、特に天然のアミノ酸を含む細
胞不含系においてこれを試験管内で転換されるようにす
ることが既に提案されたならばインターフェロン活性を
有する蛋白質製剤が得られたであろうが、インターフェ
ロンmRNAは実際、転換されるmRNAの非常にわずかな割合
でしかなく、従ってインターフェロン活性を有する最終
蛋白質製剤は他の蛋白質によってより不純にされてい
た。
従って、適当な媒介物質中へのそれの挿入後クロン化
されやすい二本鎖DNAへの直接形質転換のための出発物
質として従来技術によるmRNA製剤を用いることは実際克
服しえない検索上の困難さを伴うであろう。
本発明の主要な目的は上記の困難さ、特にインターフ
ェロンに転換可能なmRNA、特にヒトに由来するもの及び
対応するDNAを単離する方を提供することの困難さを大
幅に克服することである。
本発明の更に一つの目的はヒト細胞におけるインター
フェロンのためのヌクレオチド配列遺伝暗号を含有する
遺伝性物質（DNA）の単離方法を提供することである。
本発明の更にもう一つの目的はメッセンジャーRNAがD
NAに転換され、かつ適当な媒介物質中でこのDNAをクロ
ン化することからなるこのタイプの方法を提供すること
である。好ましい媒介物質はプラスミドであり、そして
好ましいプラスミドはpBR322タイプのプラスミドであ
る。
更に、本発明の一つの目的はインターフェロンを生成
するため誘導されたときのヒト細胞において発現された
異なる遺伝子配列を検出する方法を提供することであ
る。好ましい実施態様は先ず誘導された細胞RNAからのD
NAで、次いで誘導されなかった細胞RNAから誘導された
同一のDNAで細菌性クロンの分画交雑を達成することか
らなる。
なお更に本発明の一つの目的はクロン化されたインタ
ーフェロンDNAを適当な媒介物質キャリヤーに導入する
ことからなるインターフェロンポリペプチドを生成する
細菌性菌株を処理する方法を提供することである。クロ
ン化されたインターフェロンDNAは上述したように有利
に生成される。好ましい媒介物質は大腸菌（E.coli）ま
たは他の適当な微生物である。他のタイプの好ましい媒
介物質キャリヤーは成熟核細胞である。
他のそして更に別の本発明の目的は後で明らかになる
であろう。
本発明の好ましい観点はインターフェロンの誘導物質
に曝露したときインターフェロンを生成する細胞を培養
し、これをこのような誘導物質に曝露し、メッセンジャ
ーRNAを該誘導された細胞から抽出し、インターフェロ
ンメッセンジャーRNAを精製し、メッセンジャーRNAをDN
Aに転換し、次いで適当な媒介物質中でこのDNAをクロン
化することからなる、ヒト細胞、好ましくは繊維芽細胞
中のインターフェロンのためのヌクレオチド配列遺伝暗
号を含有する遺伝性物質（DNA）を単離する方法からな
る。好ましい実施態様によれば、細胞はヒト二倍体包皮
細胞である。好ましい実施態様によれば、誘導物質は二
本鎖RNAである。
その生成が宿主細胞において外因性因子により誘導さ
れやすいインターフェロンmRNAのまたは他の蛋白質もし
くはポリペプチドのmRNA（誘導可能なmRNA）の増殖法で
ある本発明方法は、 ａ）宿主細胞培養をこのような外因性因子に曝露するこ
とにより、該誘導可能なmRNAの合成を該宿主細胞におい
て誘導し、 ｂ）該誘導された細胞培養中に形成された誘導可能なmR
NAを含有するmRNAをそこから同一宿主細胞の誘導されな
かった対照培養のmRNAと共に抽出し、 ｃ）対応するmRNAを型として、誘導された培養及び誘導
されなかった対照培養両者のmRNAのcDNAプローブ（誘導
されたcDNA及び誘導されなかったcDNA）を合成し、 ｄ）誘導された培養から抽出されたmRNAから誘導された
二本鎖cDNAを合成し、該cDNAを適当な媒介物質に挿入
し、適当な微生物を、得られた修飾された媒介物質で感
染（トランスフェクト）させ、該微生物を、該修飾され
た媒介物質の微生物コロニー（初期コロニー）の選択的
発育を持たらすために適した条件下で培養し、 ｅ）該初期コロニーの重複コロニーを形成し、 ｆ）該初期及び重複コロニー両者のDNAの現場遊離を起
こし、 ｇ）一方では初期コロニーの、そして他方では重複コロ
ニーのDNAを、各々上述した誘導されたcDNAプローブ及
び誘導されなかったcDNAプローブと（または逆に）交雑
させ、 ｈ）誘導されたcDNAプローブと交雑するが誘導されなか
ったcDNAプローブとは交雑しないクロンのDNAを回収
し、これにより、該誘導可能な蛋白質またはポリペプチ
ド、特にインターフエロンに翻訳されることが可能なmR
NAと交雑可能なDNAを得ること からなる。
本発明方法は好ましくはヒトに由来するインターフェ
ロンの高度に精製されたmRNAの製造に利用される。
上で定義した工程のあるものは上記したと全く同じ順
番で行なう必要はない。このことは特にcDNAプローブの
合成に関する工程ｃ）に適用される。実際、後者の工程
ｃ）は本発明方法自体の工程である必要さえない。他の
細胞源からの類似のプローブを代りに用いてもよい。
本発明の更に別の有利な実施態様において、上で定義
した工程ｃ）及びｄ）は細胞から抽出されうるmRNAのみ
の画分について、それらが「誘導された」のか「誘導さ
れなかった」に関係なく行なわれる。この点に関し、mR
NAは、オリゴ−Ｔ−セルロースへの結合により全RNAか
らのmRNAの分離を可能にするポリ−Ａ部分を含むという
事実を利用できる。その後溶離されたmRNAフラクシヨン
は有利にはその後庶糖勾配遠心分離により分画でき、次
いで異なるバンドは別個に適当な細胞不含系、例えば網
状赤血球細胞溶解質へ翻訳され、次いで転換生成物各々
は抗インターフェロン血清により免疫沈澱される能力に
ついて試験される。このような免疫沈澱試験でその翻訳
生成物が陽性反応を与えたmRNAのバンドは次いで２種の
上で定義した工程ｃ）及びｄ）を行なうため保持され
る。この方法の更に別の観点はインターフェロンのため
の２種の異なるmRNA遺伝暗号が、ヒト細胞芽細胞が上記
ａ）におけるように誘導される場合これらの細胞から単
離されうることである。細胞のmRNAは11sで沈降し、か
つ細胞不含系中で転換により分子量20,000の蛋白質を生
じ、この蛋白質はこれらの細胞から精製されうるインタ
ーフェロンの１種に対して製造された抗体により選択的
に沈澱される。この蛋白質はヒトインターフェロン（IF
N）−β１である。最大のmRNAは14sで沈降し、かつ分子
量23,000の蛋白質を生じ、この蛋白質は繊維芽細胞イン
ターフェロンの精製度のより低い製剤に対する抗体によ
り沈澱される。この蛋白質はヒトインターフェロン−β
２と命名される。両蛋白質のためのmRNAの画分は上記の
工程ｄ）に使用された。これは実質的に純粋な形態で自
由にIFN−β１またはIFN−β２を製造することを可能に
する。交雑（上で定義した工程c,d,e,f,g及びｈ）は従
って２種のインターフェロンcDNA IFNβ１またはβ２の
一方を含有する大腸菌の単一コロニーを正しく同定でき
るようにする。特に、「誘導された」cDNAプローブとの
み交雑するが、「誘導されなかった」cDNAプローブとは
交雑しないこれらコロニーは、ａ）「誘導されなかっ
た」cDNAプローブと交雑可能ではない該DNAは「誘導さ
れなかった」細胞により通常生成されたmRNAのいずれに
も適宜対応せず、かつｂ）使用される２種のプローブ間
の唯一の差異は「誘導された」cDNAプローブは他方とは
これがインターフェロンmRNAの１種から誘導されたcDNA
を含有するという事実によってのみ異なっている限り、
インターフェロンmRNAに対応するcDNAを有する修飾され
た媒介物質を組込んだものからなることしかできないこ
とが認められよう。これらcDNAの形成はそれ自体公知の
任意の方法で、特に逆転換酵素の存在下における転換に
よって達成できることはこの分野の当業者にとって明ら
かであろう。pBR322プラスミドのような高生産性細胞性
媒介物質を用いるのが有利である。インターフェロンcD
NAにより修飾された媒介物質の微生物における後の発現
を達成するために、「３種の転換期の各々におけるクロ
ン化された遺伝子の融合を可能にするバクテリオファー
ジランダ及びプラスミド媒介物質（Bacteriophage Lamb
da and Plasmid Vectors Allowing Fusion of Cloned G
enes in each of the three translational phase
s）」,Nucleic Acid Res.,1978−５（12）,4479−94に
おいてPatrick Charney et alにより定義されたような
一組の媒介物質を使用することができる。
本発明の更に別の重要な工程によれば、上記の修飾さ
れた媒介物質は、その転換期がいずれであるかにかかわ
らず、「誘導された」細胞により製造されたRNA混合物
からインターフェロンmRNAを抽出するために使用でき、
この方法はこれらのRNAを、支持体上に既に不動化され
たインターフェロンcDNAにより修飾されたこのような媒
介物質に、交雑を起こすのに適した条件下で接触させ、
次いで固定されたmRNAを不動化されたDNA媒介物質から
溶離させることを含む。このような方法により、ヒトイ
ンターフェロン（IFNβ１またはIFNβ２）のmRNAは高度
に精製された形態で得られる。
翻訳生成物が、適当な試験管内系においていずれの場
合も、インターフェロン活性を有しかつヒトインターフ
ェロンへの該抗体により沈澱されうる単一ポリペプチド
化合物から本質的になるという事実により高水準の精製
が認められうる。
従って、本発明はまた通常IFN−β１の場合は900〜1,
000以下のヌクレオチド及びIFN−β２の場合は1,250〜
1,350のヌクレオチドを含む該精製されたmRNAにも関す
る。同一の方法によりこれはまた該RNAの転換により得
ることができる対応するcDNAにも関する。本発明はまた
２種の異なるインターフェロンmRNA及び従ってやはり異
なる生物学的重要性を有するであろう蛋白質部分の存在
にも関する。本願に包含される交雑工程の各々の前に、
可能な二本鎖核酸の変性を、それが適切な場合には行な
ってもよく、これにより、（細胞中のインターフェロン
を誘導しうる）二本鎖核酸は、精製mRNAをその転写によ
り試験管内でインターフェロン活性を有する実質的に純
粋な蛋白質の製造に用いるとき、この精製mRNA中に何ら
残存しないことが確実にされる。
以下、本発明を適切な図面及び表に照らしてこの好ま
しい実施態様のより詳細な記載により説明するが、これ
は本発明を限定するものではない。
ａ） ヒト二倍体繊維芽細胞からの２種のインターフェ
ロンmRNAの精製 （the Weizmann Institute of Scienceにて単離され
た） ヒト繊維芽細胞系統FS11の単層培養からRNAを抽出し
た。生後８日目の正常な個体から取った包皮体外移植組
織から育てたこれら二倍体細胞は、15の個々の単離物の
うちこれらが高力価のインターフェロンを生成する能力
があるため選択した。あるいは、ヒトSV80細胞のクロン
の培養を用いた。10％の胎児牛血清を含有するEagleの
最小培地中の培養を、2.2のガラスローラービンまた
は22×22cmのプラスチックトレイ中で５％CO2及び95％
空気中37℃で保持した。合流させて３日後、培養をポリ
（rI）：（rC）100μg/ml及び（宿主による蛋白質の合
成を遮断する）シクロヘキシミド50μg/mlに3.5時間曝
露することによりインターフェロンを生成するよう誘導
した。（細胞性RNAの合成を遮断する）アクチノマイシ
ンD1μg/mlを添加し、１時間後細胞を、緩衝化したNoni
det P−40洗剤で溶解し、細胞形質のRNAをkirby（196
5）のようにフェノール／クレゾール混合物で抽出し
た。mRNAを、これらがオリゴ−dT−セルロースへの結合
によりPoly Aを含有しているという事実を活用すること
により全RNAから単離した。mRNA画分は次いで庶糖勾配
遠心分離により分画した。インターフェロンmRNAを含有
する画分はRaj N.K.B及びPitha P.M.（Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 74,1483−1487、1977）に従って、Xenopus lae
vis卵母細胞に顕微注射し次いで24〜40時間後卵母細胞
培養培地中に放出されたインターフェロンの抗ウィルス
活性を測定することにより同定した。抗ウィルス活性
は、FS11細胞を卵母細胞培地の希釈液に曝露し、該細胞
を小水疱性口内炎ウィルスに感染させ、次いでこのウィ
ルスにより持たらされた細胞発病効果の抑制を観察する
ことにより測定した。インターフェロンの力価は最終有
効希釈に従がい既知溶液と比較することにより計算し
た。インターフェロンmRNAを含有する画分もまた、網状
赤血球細胞溶解質中で転換し、次いでWeissenbach et a
lの方法（Eur.J.Biochemistry 98,1−8,1979）により生
成物の免疫沈澱を行なうことにより同定した。
第1b図は卵母細胞に注射することにより検出されたイ
ンターフェロンmRNA活性の２本のピークを示している。
第1b図は転換生成物及び抗インターフェロン血清間で得
られた免疫沈澱線を表わしたものであり、２本の矢印は
分子量23,000（23k）及び20,000（20k）の２種のポリペ
プチドを示す。この23k及び20kの免疫沈澱ポリペプチド
のための庶糖勾配画分遺伝暗号を第1a図に示したが、こ
れらがインターフェロンmRNA活性の２本のピークに対応
することがはっきり分る。インターフェロン活性はまた
ヒト細胞における（２′−５′）オリゴ−イソアデニレ
ート合成酵素の誘導を測定することにより網状赤血球細
胞溶解質の翻訳生成物においても検出した。両方法によ
り最大のインターフェロンmRNAピークは23kポリペプチ
ドのために遺伝暗号をつくり、一方最小インターフェロ
ンmRNAピークは23kポリペプチドのために遺伝暗号をつ
くることが分った。両インターフェロンmRNA共にこのよ
うな方法で単離し、大腸菌（E.coli）におけるクロン化
に用いた。
ｂ） インターフェロンβ2cDNAの大腸菌におけるクロ
ン化 誘導された細胞からの精製されたmRNAは分子量23,000
のポリペプチドについてmRNAの約１〜３％を含有すると
計算され、これを鳥類の骨髄芽球症ウィルス、逆転換酵
素及びオリゴ−dTをプライマーとしてcDNAを合成するた
めの型として用いた。RNAをアルカリ処理により除去し
た後、DNAの第二鎖は逆転換酵素またはDNAポリメラーゼ
Ｉを用いて合成できる。一本鎖DNAは核酸分解酵素S1を
用いて加水分解することにより除き、DNAの３′末端
を、dGTPを基質として用いてヌクレオチド末端転移酵素
により延伸した（「尾をつけた（tailed）」）。次い
で、プラスミドDNAを上記したdcで尾をつけたヒトcDNA
と交雑させ、大腸菌（E.coli）DP50に感染（トランスフ
ェクト）させるために用いた。感染させた細菌性コロニ
ーはLuria肉汁、ジアミノピメル酸、チミジン及びテト
ラサイクリンを含有する寒天板上で平板培養することに
より同定した。更に、コロニーを同様な、但し唯一の抗
生物質としてアンピシリンを含有する寒天板上で試験し
た。アンピシリン感性とテトラサイクリン耐性のあるこ
の細菌性コロニーは上記のようなテトラサイクリン10μ
g/mlを含有する寒天板上に置いたニトロセルロースフェ
ルター上で生育させた。得られた形質転換された2000を
越すコロニーは、上で示したように寒天板上にある別の
ニトロセルロースフィルター上で各々転移させたが、重
複コロニーの各々は最初のコロニーの一つに（特に共通
の番号付けにより）関係していた。コロニーが著形３〜
5mmに達した後、フィルター（最初の培養及び重複物）
を、重ねた濾紙の頂上に移し、先ず0.5N NaOH、次いで
0.15M NaCl及び0.1NNaOHで含浸させることによりそれら
の各々のDNAの現場遊離を起こした。濾紙を中和し、そ
して乾燥させた。インターフェロンDNA配列を含有する
細菌性コロニーを検出するために、濾紙を２種の異なる
〔32P〕cDNAプローブと交雑させた。一方のcDNAプロー
ブは誘導された細胞（第１図の矢印23k）からの庶糖勾
配画分からのmRNAの逆転換酵素により製造した。第二の
プローブは誘導されなかった細胞製剤の同様な画分から
同一の方法で製造した。両cDNA製剤は４種の高放射能性
〔32P〕−デオキシヌクレオシドトリホスフェートを基
質として、そして断片化された小牛の胸腺DNAをプライ
マーとして用いて合成した。cDNAプローブにおけるmRNA
配列のランダム表現がかくして達成された。交雑は0.9M
NaCl−0.09Mクエン酸Na緩衝液pH7.0中で62〜64℃で18
時間行ない、最初のコロニーは誘導された細胞のcDNAプ
ローブと、そして重複コロニーは誘導されなかった細胞
のcDNAプローブと各々（または逆に）交雑させた。大量
洗浄後、フィルターをＸ線フィルムに曝露し、誘導され
たcDNAには交雑可能であるが、誘導されなかったcDNAに
は交雑可能ではない細菌性コロニーを同定した。この方
法により、検索した全部で2,000を越す形質転換された
コロニーから20種の異なる細菌性コロニーを単離した。
これら20種の細菌性コロニーは全て、細胞がポリ（rI:r
C）によりインターフェロンを生成するため誘導されて
しまった後でのみ発現されるヒトmRNA配列が挿入された
プラスミドの多重コピーを含有している。
この技術を例示した実施例を第２図に示したが、この
ものはインターフェロン生成のためポリ（rI）：（rC）
により誘導された（ｉ）または誘導されなかった（n.
i）細胞からの、第１図のmRNA画分23kに対して製造され
た〔32P〕−cDNAでそのDNAが交雑された、それらのニト
ロセルロースフィルター上の15対のアルカリ処理したコ
ロニー対（最初のもの及び重複のもの）に関するもので
ある。矢印は２種のコロニー、特に誘導された配列を含
有する５と13の番号をつけたコロニーを示している。コ
ロニー番号13はE.coli DP50/A341と命名された。
ｃ） ヒト繊維芽細胞からのインターフェロンmRNAの単
離 インターフェロンmRNAの単離（及びクロンA341のプラ
スミドDNA中のインターフェロンcDNA配列の存在の立
証）は下記のように達成された。この細菌性クロンの50
0mlの培養を用いて50μｇのプラスミドDNAを製造した。
このDNAを（その前に変性させた後）、Aldwine et alの
方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1977,74,5350）に従っ
てジアゾベンジルオキシメチルセルロース粉末に共有結
合させた。並行して、（ヒトDNA配列を含有しない）プ
ラスミドpBR322DNAを同様にセルロースに結合させた。
インターフェロンを生成するため誘導されたヒト繊維芽
細胞からのPoly−Ａ含有mRNAを50％ホルムアミド中52℃
でこの２種のDNAセルロース製剤に交雑させ、次いで70
℃でホルムアミド濃度を100％まで上げることにより溶
離した。溶離後回収されたRNAを網状赤血球細胞不含系
中で翻訳し（第３図）、これによりA341DNA−セルロー
ス上に選択されたmRNAの本質的な翻訳生成物は実質的に
分子量23,000のポリペプチドであることが分った。対照
的に、pBR322DNA−セルロースから何らヒトインターフ
ェロンmRNAは回収されなかった。A341DNA−セルロース
への交雑の前のヒトmRNAの転換生成物と比較して、クロ
ン化されたA341DNAは混合物中のmRNAのごくわずかにし
か対応しないことが確認できた。A341DNA−セルロース
上に選択されたmRNAの生成物を抗ヒト繊維芽細胞インタ
ーフェロン血清により免疫沈澱させた。
同記と同様な方法により、但し、プラスミドA341DNA
をニトロセルロースフィルタ‐に結合させ、RNAをそれ
に交雑させ、H2O中で１分間沸騰させることにより溶離
させて、インターフェロンmRNAもまた単離できた。
生物学的に強力なヒトインターフェロンのために遺伝
暗号をつくるこの精製mRNAの活性を、Xenopus laevis卵
母細胞に注射し、次いで卵母細胞培養培地に曝露された
ヒト細胞におけるウィルス増殖の抑制を測定することに
より示した（第１表）。また、精製されたβ2mRNAのイ
ンターフェロン活性も卵母細胞翻訳生成物によりヒト細
胞における（２′−５′）オリゴ−イソアデニレート合
成酵素の誘導により示した（第１表）。
下記の第１表はこのmRNAがXenopus laevis卵母細胞に
おける翻訳後、ヒト細胞におけるウィルスの生育を抑制
する生物学的に活性なインターフェロンを生じることを
立証したものである。
A341プラスミドDNAの制限酵素地図はこれがPst部位中
に約900のヌクレオチドのヒトDNA挿入物を含有している
ことを示した。A341DNAはまたEco R1拡酸分解酵素によ
り消化されたヒトゲノムの３断片に交雑した。これらの
断片はアガロースゲルの電気泳動により分離される。ヒ
ト繊維芽細胞からのmRNAのアガロースゲル電気泳動描写
図への交雑は更にA341DNAがインターフェロン誘導物質
ポリ（rI:rC）へ曝露された細胞においてのみ発現され
たRNA配列に対応していることを示した（第４図）。ポ
リ（rI:rC）へ細胞を１時間曝露しただけでA341DNAに交
雑する1,250〜1,350のヌクレオチド長のRNAの蓄積が起
こり、このものはIFN−β2mRNAを表わす。
上のデータは細菌性クロンE.coli DP50/A341はそのpB
R322プラスミドのPst部位中にヒトインターフェロンmRN
Aに対応するヒトcDNA配列の約900のヌクレオチドの挿入
物を含有することを立証した。いくつかの同様に製造し
たクロンが得られた。第4b図はIFN−β２のためのクロ
ンは最大の1,250〜1,350のヌクレオチド長のmRNAに交雑
し、一方IFN−β１のためのクロンは最小の900〜1,000
のヌクレオチド長のmRNAに交雑したことを示している。
この方法はヒト細胞からの異なるタイプ（α，β，
γ）のインターフェロンDNAのクロンを得るために使用
できる。
図面の説明 第１図：インターフェロンを生成するため誘導されたヒ
ト細胞からのPoly A+の庶糖勾配（ａ）。沈降は右から
左である。０個のXenopus laevis卵母細胞に各画分当り
0.4μｇのRNAを注射し、40時間後、これら卵母細胞周囲
の培地をFS11細胞上でインターフェロンについて分析し
た（左の目盛）。各RNA画分（0.24μｇ）もまた網状赤
血球細胞溶解質中で転換し、35−Ｓメチオニンで標識し
た生成物を抗インターフェロン血清で沈澱させた。ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動で分析した生成物を（ｂ）
のレーンｉに示す。（ｂ）中のレーンｎは誘導されなか
った細胞からの分画されなかったmRNAの免疫沈澱された
生成物を表わす。（ｂ）の右端は分子量の印である（上
から下まで、68,46,30,18及び14ダルトン×10-3）。23k
及び20k蛋白質（矢印）の位置及び強度を記録し、これ
を（右の目盛により）グラフとして示した。２種のイン
ターフェロンmRNAの重い方が23k蛋白質において転換さ
れ、一方小さな方のインターフェロンmRNAは20k蛋白質
において転換される。
第２図：インターフェロンDNAを含有する形質転換され
た細菌性クロンの検出。ニトロセルロースフィルター上
の15のアルカリ処理したコロニーを、インターフェロン
生成のためポリ（rI）：（rC）により誘導された（ｉ）
または誘導されなかった（n.i）細胞からの23kmRNA画分
（第１図参照）に対して製造した〔32P〕cDNAと交雑さ
せた。矢印は誘導された配列を含有する２種のコロニー
を示す。コロニー番号13はE.coli DP50/A341である。
第３図：クロンE.coli DP50/A341がインターフェロンDN
Aを含有することの立証。インターフェロン生成のため
に誘導されたヒト繊維芽細胞からのPoly A+mRNAを、セ
ルロースに共有結合されたA341プラスミドからのDNAに
交雑させ、転換した。転換生成物のゲル電気泳動はイン
ターフェロン（IF）ポリペプチドのために遺伝暗号をつ
くるmRNAが全mRNAの混合物から独自に選択されることを
示す。pBRDNAはこのmRNAを選択することができない。IF
ポリペプチドの位置は抗インターフェロンによる免疫沈
澱（ipt）の後で示される。
第４図： ａ） 細菌性クロンA341のプラスミドDNAはインターフ
ェロン生成のために誘導された（ｉ）細胞中に見出され
るが誘導されなかった（ｎ）細胞中には見出されない14
S（1,300のヌクレオチド長の）mRNAに交雑する。プラス
ミドpBR DNAは交雑しないが、クロン化されなかった全c
DNA（tot）は誘導されなかった細胞中においても見出さ
れる多くのmRNAと交雑する。RNAのアガロースゲル電気
泳動及びそれに続く３種の32P−DNAへの交雑を示した。
ｂ） インターフェロンDNAの異あるクロンからのプラ
スミドDNAをmRNA電気泳動描写図への同様な交雑実験に
て用いた。IFN−β2DNAを含有するクロンは1,300のヌク
レオチド長のmRNAに交雑し、一方IFN−β１を有するク
ロンはより小さな900のヌクレオチド長のインターフェ
ロンmRNAに交雑する。
【図面の簡単な説明】
第１図は庶糖勾配上のmRNAの分画、及びXenopus laevis
卵母細胞中にヒトインターフェロン活性を生成しかつ網
状赤血球細胞溶解質中に特異的に免疫沈澱させた蛋白質
を生成するために誘導された細胞に由来するこれらmRNA
画分の転換、すなわちIFN−β１及びIFN−β２のために
mRNAを分離する方法を示しており、 第２図は「誘導された」及び「誘導されなかった」細胞
からの２種の上記のプローブ各々による同一の細菌性コ
ロニーのDNAの分画交雑方法の結果を示しており、 第３図は網状赤血球溶解質における転換により立証され
たように細菌性クロンA341からの不動化されたDNAへの
交雑によるインターフェロンIFN−β２の精製を示して
おり、 第４図は細菌性クロンA341からのDNAがインターフェロ
ン合成の誘導後にのみヒト細菌中に現われる1,250〜1,3
50長のmRNAに対応することを立証するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−63996（ＪＰ，Ａ) Ｋｎｉｇｈｔ．Ｊｒ．Ｅ Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ. 73．520（1976) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｖｏ ｌ．98，Ｐ．１〜８（Ｊｕｌｙ．16. 1979)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】庶糖勾配遠心により14Sで沈降し、約1,300
    のヌクレオチドを有し、かつ約23,000の分子量を有しイ
    ンターフェロン活性を有するポリペプチドへ翻訳可能で
    あり、ヒト繊維芽細胞インターフェロンβ１のmRNAを実
    質的に含有しない高純度に精製された形態のヒト繊維芽
    細胞インターフェロンβ２のmRNAを得る方法であって、 ａ） 繊維芽培養細胞を外因性因子に曝露することによ
    り、mRNAの合成を該細胞に置いて誘導し； ｂ） 該誘導された培養細胞中に形成されたmRNAを、同
    一宿主細胞の誘導されなかった対照培養細胞のmRNAと共
    に抽出し； ｂ′） 誘導された培養細胞から抽出されたmRNAを、庶
    糖勾配遠心により11Sで沈降するmRNAと14Sで沈降するmR
    NAとに分離し、 ｃ） 誘導された培養細胞から抽出された14S mRNAから
    誘導される二本鎖cDNAを合成し、該cDNAを適当なベクタ
    ーに挿入し、適当な微生物を、得られた修飾されたベク
    ターで感染（トランスフェクト）させ、該微生物を、該
    修飾されたベクターの微生物コロニー（初期コロニー）
    に選択的発育をもたらすために適した条件下で培養し； ｄ） 該初期コロニーに重複コロニーを形成し； ｅ） 該初期及び重複コロニー両者のDNAの現場（in si
    tu）遊離を起こし； ｆ） 対応するmRNAを鋳型として、誘導された培養細胞
    の14Sで沈降するmRNA及び誘導されなかった対照培養細
    胞のmRNAのcDNAプローブ（誘導されたcDNA及び誘導され
    なかったcDNA）を合成し； ｇ） 一方では初期コロニーの、そして他方では重複コ
    ロニーのDNAを、各々上述した誘導されたcDNAプローブ
    及び誘導されなかったcDNAプローブと交雑させ； ｈ） 誘導されたcDNAプローブと交雑するが「誘導され
    なかった」cDNAプローブとは交雑しないDNAを回収し；
    そして ｉ） 工程ｂ）又はｂ′）において既に抽出されたmRNA
    を、支持体上に不動化された工程ｈ）で得られる個々の
    DNAと、交雑を起こすのに適当な条件下で接触させ、次
    いで固定されたmRNAを不動化されたDNAベクターから溶
    離し、次いでヒト繊維芽細胞インターフェロンβ２に翻
    訳可能なヒト繊維芽細胞インターフェロンβ２のmRNAを
    実質的に純粋な形態で回収する； ことを含む上記方法。
  2. 【請求項２】庶糖勾配遠心により14Sで沈降し、約1,300
    のヌクレオチドを有し、かつ約23,000の分子量を有しイ
    ンターフェロン活性を有するポリペプチドへ翻訳可能で
    あり、ヒト繊維芽細胞インターフェロンβ１のmRNAを実
    質的に含有しない高純度に精製された形態のヒト繊維芽
    細胞インターフェロンβ２のmRNA。
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