SE461223C - mRNA och cDNA för humant fibroblastinterferon, förfarande för deras framställning samt användning därav - Google Patents
mRNA och cDNA för humant fibroblastinterferon, förfarande för deras framställning samt användning däravInfo
- Publication number
- SE461223C SE461223C SE8007998A SE8007998A SE461223C SE 461223 C SE461223 C SE 461223C SE 8007998 A SE8007998 A SE 8007998A SE 8007998 A SE8007998 A SE 8007998A SE 461223 C SE461223 C SE 461223C
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- mrna
- induced
- cdna
- dna
- interferon
- Prior art date
Links
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 title claims description 156
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title claims description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 title claims description 13
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 title claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 8
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 81
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 81
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 79
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 50
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 40
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 32
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 19
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 19
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 16
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 15
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 15
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 6
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 4
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims 12
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims 10
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims 5
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 2
- 239000002799 interferon inducing agent Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 54
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 10
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 9
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 230000001064 anti-interferon Effects 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 108010067304 (2'-5')oligo-isoadenylate synthetase Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 2
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N (2R,6R)-form-2.6-Diaminoheptanedioic acid Natural products OC(=O)C(N)CCCC(N)C(O)=O GMKMEZVLHJARHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 2-(4-octylphenoxy)ethanol Chemical compound CCCCCCCCC1=CC=C(OCCO)C=C1 BHNQPLPANNDEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LMWMTSCFTPQVCJ-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1.CC1=CC=CC=C1O LMWMTSCFTPQVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 101100396576 Gallus gallus IFNB gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 108030003004 Triphosphatases Proteins 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N meso-2,6-diaminopimelic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O GMKMEZVLHJARHF-SYDPRGILSA-N 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5412—IL-6
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/565—IFN-beta
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
l0 15 20 25 30 35 40 461 223 2 aminosyrorna, varvid en proteinframställning med interferonaktivitet erhållits, skulle interferon-mRNA inte vara mer än en mycket liten del av det mRNA som översatts och således skulle den slutligen framställda produkten med interferon- aktivitet vara mer än kraftigt förorenad med andra protein.
Således skulle användandet av mRNA-beredningar enligt tidigare känd teknik såsom utgângsmaterial för en direkt transformering till dubbelflätad DNA, som är benägen att reproduceras ("cloned“) efter det att den införts i en lämplig vektor, innebära filtreringssvârigheter som i praktiken skulle vara oövervinnerliga.
Ett huvudändamål med föreliggande uppfinning är att övervinna, i största möjliga mån, ovan nämnda svårigheter speciellt vid tillhandahållandet av en metod för isolering av det mRNA som är översättningsbart till interferon, mera speciellt av humant ursprungjliksom motsvarande DNA.
Ytterligare ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för isolering av genetiskt material (DNA), innehållande den nukleotid- sekvens som kodar för interferon i humanceller. Ännu ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett för- farande av denna typ, vari budbärar~RNA transkriberas till DNA och vilket omfattar reproducering ("cloning“) av DNA i en lämplig vektor. En föredragen vektor är en plasmid och en föredragen plasmid är en plasmid av pBR322-typ. Ännu ytterligare ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarande för att detektera den särskilda genetiska sekvensen som kommer till uttryck i humanceller då den induceras att producera interferon. Ett föredraget I I utförande innebär en differentierad hybridisering av bakteriekloner, först med DNA från RNA från inducerade celler och för det andra med identiskt DNA erhållet från RNA från icke-inducerade celler.
Ytterligare ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett förfarandet för framställningpv en bakteriestam att producera interferonpolypeptider, vilket omfattar introducering av ett klon-interferon-DNA i en lämplig vektorbärare.
Klon-interferon-DNA framställes med fördel såsom angetts ovan. En föredragen vektor är E. coli eller någon annan lämplig mikroorganism. En annan typ av föredragen vektorbärare är en eukaryotisk cell.
Andra och ytterligare ändamål med föreliggande uppfinning komer nedan att framgå. ' En föredragen bild av föreliggande uppfinning omfattar ett förfarande för att isolera genetiskt material (DNA), vilket innehåller nukleotidsekvensen som kodar för interferon i humanceller, företrädesvis fibroblastceller, vilket förfarande omfattar kultivering av celler som producerar interferon då de utsättes för en inducerare av interferon och att dessa utsättes för en sådan inducerare, extrahe- ring av budbärar-RNA från nämnda inducerade celler, rening av budbärar-RNA från interferon, transkribering av budbärar-RNA till DNA och reproducering (“cloning") l0 l5 20 25 30 35 40 s 461 225 av DNA i diploida förhudsceller. Enligt ett föredraget utförande är induceraren en dubbel- flätad RNA.
Förfarandet enligt uppfinningen för berikning med interferön-mRNA eller med en lämplig vektor. Enligt ett föredraget utförande är cellerna humana, ett mRNA (inducerbart mRNA) eller annat protein eller polypeptid, vars produktion kan framkallas i värdcellen med hjälp av exogena faktorer omfattar: a) exponering av en kultur av värdceller för sådana exogena faktorer så att syntesen av inducerande mRNA framkallas i värdcellerna; b) extrahering av mRNA innefattande det inducerande mRNA som formas i de in- ducerade cellkulturerna sàväl som mRNA från icke-inducerade kontrollkulturer av samma värdceller; c) syntetisering av försöksmaterial av CDNA från mRNA av såväl inducerade kulturer som icke-inducerade kontrollkulturer med användande av motsvarande mRNA som mallar (inducerat cDNA och icke-inducerat cDNA); d) syntetisering av dubbelflätat cDNA, vilket erhållits från det mRNA som extraherats frân de inducerade kulturerna, införning av cDNA i lämpliga vektorer, transfektering av lämpliga mikroorganismer med de erhållna, modifierade vektorerna och kultivering av mikroorganismerna under betingelser som är lämpliga för att orsaka selektiv utveckling av mikroorganismkolonier av de modifierade vektorerna (intialkolonier); , e) formning av duplikatkolonier från initialkolonierna; f) frigörning på plats av_DNA i såväl initial- som duplikatkolonierna; g) hybridisering av DNA i intitialkolonierna respektive duplikatkolonierna med ovan nämnda, inducerade försöksmaterial av cDNA respjcke-inducerat försöks- materíäl av cDNA (eller omvänt); h) utvinning av DNA från kloner som hybridiserar med inducerat cDNA-material men inte hybridiserar med icke~inducerat CDNA-material, varvid erhålles DNA som är hybridiserbart med mRNA kapabelt att översättas till inducerande protein eller polypeptid, speciellt interferon.
Förfarandet enligt uppfinningen hänför sig företrädesvis till framställningen av hög-renat mRNA av interferon av humant ursprung.
Det bör påpekas att vissa av stegen som definierats ovan inte behöver utföras i den exakta ordning som där anges. Detta gäller speciellt för steg c), vilket hänför sig till syntesen av försöksmaterial av CDNA. Egentligen behöver detta sista steg c) inte vara ett steg i förfarandet av uppfinningen i sig. Analoga försöks- material, från andra cellulära källor, kan användas i stället.
I ett ytterligare föredraget utförande av uppfinningen tillämpas stegen c) och d), såsom de definieras ovan, enbart på fraktioner av mRNA som kan extraheras från celler, antingen de “inducerats" eller "icke-inducerats". I det avseendet kan för- del dras av det faktum att mRNA omfattar en poly-A~del, vilken medger separation l0 l5 20 25 30 35 40 461 223) 4 av mRNA från totala RNA genom bindning till oligo-T-cellulosa. Den påföljande utspädda mRNA-fraktionen fraktioneras därefter företrädesvis genom sukros- gradientcentrifugering, varvid de olika banden sedan separat överföres till ett lämpligt cellfritt system, såsom ett retikulocytlysat, där varje överförings- produkt sedan testas på sin förmåga att immunoutfällas av anti-interferonserum.
De band av mRNA, vars överföringsprodukter gav en positiv reaktion i sådana immunoutfällningsförsök kvarhölls för att på dessa utföra de två ovan definierade stegen c) och d). En ytterligare sida med detta förfarandet är att två olika mRNA som kodar för interferon kan isoleras från humana fibroblastceller om dessa celler induceras såsom i a) ovan. De minsta mRNA sedimenterar vid llS och ger genom överföring till ett cellfritt system ett protein med en molekylvikt av 20.000, vilket selektivt utfälles med hjälp av antikroppar som framställts mot ett av de interferon som kan renas från dessa celler. Detta protein är humant interferon (IFN)-pl. Den största mRNA-fraktionen sedimenterar vid l4S och ger ett protein med en molekylvikt av 23.000, vilket utfälles med hjälp av antikroppar mot en mindre renad framställning av fibroblastinterferon. Detta protein betecknas som humant interferon-,b2. Fraktioner av mRNA för båda proteinerna användes i steg d) ovan. Detta gör det möjligt att om så önskas producera IFN-Al eller IFN-,¿2 i huvudsakligen ren form. Hybridiseringen (steg c, d, e, f, g och h såsom de definierats ovan) gör det således möjligt att exakt definiera enstaka kolonier av E. coli innehållande en eller tvâ interferon-ÖDNA IFN ßl eller )à2. Speciellt) - bör noteras att de kolonier som hybridiseras med enbart_"induceratÜ cDNA-material och inte med “icke-inducerat" cDNA-material endast kan utgöras av de som har inför- livat en modiferad vektor med det cDNA som motsvarar interferon-mRNA, eftersom: a) nämnda DNA, som inte kan hybridiseras med det "icke-inducerade"-cDNA-mate- rialet, således inte motsvarar något av de mRNA som normalt produceras av en "icke-inducerad“ cell och b) den enda skillnaden mellan de två försöksmaterialen som användes är att det "inducerade“ cDNA-materialet enbart skiljer sig från det andra genom det faktum att det innehåller ett cDNA som erhållits från ett interferon-mRNA. Det framstår klart för en fackman inom omradet att bildningen av dessa cDNA-försöksmaterial kan erhållas med hjälp av varje metod som är känd i sig, speciellt genom transkription i närvaro av ett revers-transkriptas. Det är en fördel att använda en högproducerande bakterievektor såsom plasmiden pBR322. I syfte att erhålla att vektorer modifierade med interferon-cDNA kommer till uttryck senare i en mikro- organism, kan man använda ett antal vektorer som definieras av Patrick Charney~et al. i “Bacteriophage Lambda and Plasmid Vectors Allowing Fusion of Cloned Genes in each of the three translational phases", Nucleic Acids Res., l978 - 5(l2), 4 479-94.
Enligt ett ytterligare viktigt steg i uppfinningen, kan ovan nämnda modifierade vektor, vilken dess överföringsfas än må vara, användas för extrahering av inter- lO l5 20 25 30 35 s 461 223 feron~mRNA från RNA~blandningen som erhållits med hjälp.av “inducerade" celler, vilket förfarande omfattar att dessa RNA låtes komma i kontakt med en sådan vektor som modifierats av interferon-cDNA, vilket tidigare immobiliserats pâf en bärare, under betingelser som är lämpliga för att orsaka hybridisering och varefter den fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn. På ett sådant sätt kan mRNA av humant interferon (antingen IFN l eller IFN 2)erhållas i Stañkt renad form. - Det höga tillstånd av renhet kan erhållas genom det faktum att överförings- produkten, i ett lämpligt in vitro-system, i varje fall huvudsakligen består av en enkel polypeptidförening med interferonaktivitet och vilken kan utfällas av nämnda antikroppar till hunmnt interferon.
Uppfinningen hänför sig således också till det renade mRNA, vilket normalt omfattar upp till 900-l000 nukleotider för IFN- Al och l250-l350 för IFN-Åß2.
På samma sätt hänför sig uppfinningen även till motsvarande cDNA, vilken kan erhållas genom transkription av nämnda RNA. Uppfinningen hänför sig dessutom till existensen av två olika interferon-mRNA och således till proteindelar som också kan ha olika biologisk betydelse. Där så är lämpligt föregås varje hybridi- seringssteg innefattat i föreliggande uppfinning av en denaturering av möjliga dubbelflätade nukleinsyror för att garantera att inga dubbelflätade nukleinsyror (vilka skulle kunna inducera interferonaktivitet i celler) finns kvar i det renade mRNA-materialet, då detta användes för framställning, genom translation ' av huvudsakligen rent protein med interferonaktivitet in vitrof Uppfinningen kommer vidare att beskrivas på ett icke begränsande sätt genom en mera detaljerad beskrivning med hänvisning speciellt till figurerna och tabellen.
Fig. l illustrerar fraktioneringen av mRNA pà en sukrosgradient och över- sättningen av dessa mRNA delar, vilka härstammar från inducerade celler, till att ge human interferonaktivitet i Xenopus laevis.oocyter och till att speciellt ge immuno-utfällt protein i retikulocytlysat, ett förfarande som separerar mRNA för IFN-Ål och.för IFN-A2.
Fig. 2 illustrerar resultatet från en differentiell hybridiseringsprocedur av DNA från samma bakteriekolonier med de två ovan nämnda försöksmaterialen från "inducerade" respektive “icke-inducerade" celler.
Fig. 3 visar en rening av interferon~IFN762-mRNA genom hybridisering med immobiliserat DNA från bakterieklon A34l såsom visats genom översättning i ett retikulocytlysat.
Fig. 4 visar att DNA från bakterieklon A34l motsvarar en 1250-l350 lang mRNA som uppträder i humanceller endast efter induktion av interferonsyntes.
Tabell l visar att detta mRNA, vid översättning i Xenopus laevis 'oocyter ger biologiskt aktivt interferon som hindrar växten av ett virus i humanceller. lO 15 20 25 30 35 40 461 225 s EXEMPEL a) Rening av tvâ interferon¿mRNA från humana, diploida fibroblaster RNA extraherades ur kulturer i monolager från den humana fibroblastlinjen FSll (isolerad vid Heizmann Institute of Science). Dessa diploida celler som erhållits från förhudsexplantat, vilka tagits från en normal individ 8 dagar efter födseln,_valdes ut bland l5 separata isolat för sin kapacitet att producera kraftiga titrar av interferon. Alternativa kulturer av en klon av human~SV80-celler användes. Kulturerna i Eagles minimala nedium med 10 %:s fosterkalvserum placerades i 2,2 liters glasrundkolvar eller 22 x 22 cmzs plastskàlar i en atmosfär av 5 % C02 och 95 % luft vid 3700. Tre dagar efter samanflödningen inducerades kulturerna för att framställa interferon genom utsättning för poly(rI):(rC) l00,ug/ml, och cykloheximid (vilket blockerar syntesen av protein av värden) 50,ag/ml under 3,5 tinmar. Aktinomycin D (vilket blockerar syntesen av cellulärt RNA) l ßg/ml till- sattes och l timme senare fick cellerna genomgå lys med buffrat Nonidet-P40-deter- gent och cytoplasmiskt RNA extraherades med en fenolkresolblandning enligt Kirby (l965). mRNA išolerades från den totala RNA med utnyttjande av det faktum att de innehåller Poly A, genom bindning till oligo~dT-cellulosa. mRNA-fraktionen fraktio- nerades därefter genom sukrosgradientcentrifugering. Fraktionerna innehållande interferon-mRNA identifierades genom mikroinjicering i šengpus laevjs oocyter enligt Raj N.K.B och Pitha f.M. (Proc.Natl.Acad.Sci. USA 15, l483-l487, l977), samt genom att 24-40 timmar senare mäta den antivirala aktiviteten av det fri- gjorda'interferonet i oocyt-inkubationsnediet. Den antivirala aktiviteten mättes genom att FSll-celler utsattes för utspädning av oocyt-medium, varvid dessa celler infekterades med vesikulärt stomatitvirus och inhiberingen av den cytopatiska effekten orsakad av virusen observerades. Interferontitrar beräknades genom jäm- förelse med en känd lösning enligt den senast verksamma utspädningen. Éraktionerna innehållande interferon-mRNA identifierades också genom översättning i ett retiku- locytlysat följt av immuno-utfällning av produkten enligt förfarandet av Weissenbach et al., (Eur.J.Biochemistry §§, l-8, l979).
Fig. lb visar de tvâ topparna av interferon-mRNA-aktivitet, vilka detekteras genom injektion i oocyter. Fig. lb representerar immuno-utfällningslinjerna som er- hållits mellan översättningsprodukterna och anti-inferferonserum, där de tvâ pilarna visar på de tvâ polypeptiderna med molekylvikter av 23,000 (23K) och 20.000 (20K).
De sukrosgradientfraktioner som kodar för 23K- och 20K-immunoutfällda polypeptider visas i fig. la och kan ses motsvara de två topparna av interferon-mRNA-aktivitet.
Interferonaktivitet detekterades också i översättningsprodukterna i retikulocyt- lysat genom mätning av induktion av (2'-5')-oligo-isoadenylatsyntetas i human- celler. Hed hjälp av bägge metoderna erhölls att den största interferon~mRNA-toppen kodar för 23K-polypeptiden, medan den minsta interferon-mRNA-toppen kodar för 20K- polypeptiden. Bägge interferon-mRNA isolerades på detta sätt och användes för 10 15 20 25 30 35 40 7 461 225 kloning i E. coli. b) Kloning av interferon-32-cDNA i E. coli Det renade mRNA från inducerade celler beräknades innehålla ca l-3 % av mRNA för polypeptiden med en molekylvikt av 23.000 och användes som mall för att syntetisera cDNA med fågel-myeloblastosis virus, reversetransbüptasoch oligo-dT som startmaterial. Efter eliminering av RNA genom alkalisk behandling, kunde den andra flätan av DNA syntetiseras med reverstranskriptas eller DNA-polymeras I.
Enkelflätad DNA hydrolyserades av med nukleas Sl och 3'-ändarna av DNA förlängdes ("svanSades“) med terminal nukleotidtransferas med användande av dGTP som substrat.
Plasmid-DNA hybridiserades därefter med det humana,dC-svansade cDNA, som beskrivits ovan, och användes för att transfektera E. coli DP50. Transfekterade bakterie- kolonier identifierades genom spridning på agarplattor innehållande Luriabuljong, diaminopimelinsyra, timidin och tetracyklin. Kolonierna testades vidare på liknande agarplattor men vilka innehöll ampicillin som enda antibiotika. De ampicillin- känsliga men tetracyklinresistenta öakteriekolonierna läts växa pâ mikrocellulosa- filter placerat på en agarplatta såsom ovan med tetracyklin, l0¿vg/ml. över två tusen av de erhållna transformerade kolonierna överfördes respektive delvis på andra mikrocellulosafilter, vilka var placerade på agarplattor som ovan, varvid varje duplikatkoloni relaterades (speciellt genom vanlig numrering) till en av initialkolonierna. Efter det att kolonierna nått 3-5 mm i diameter, överfördes filtret (initialkulturer och duplikat) till toppen av en stapel filterpapper som impregnerats först med 0,5 N Na0H, därefter med O,l5 M NaCl och 0,l N Na0H för att orsaka att respektive DNA frigöres på plats. Filtren neutraliserades och torkades. För att detektera de öakteriekolonier som innehöll interferon~DNA-sekven- serna hybridiserades filtren med tvâ olika I32P)LcDNA-prover. Ett cDNa-prov preparerades med reverstranskriptas av mRNA från sukrosgradientfraktionen från inducerade celler (pil 23K i fig. l). Det andra provet preparerades på ett iden- tiskt vis med den liknande fraktionen från icke-inducerade cellpreparationen.
Bägge cDNA-proverna syntetiserades med användande av de fyra starkt radioaktiva [32R]-deoxinukleosidtrifosfataser som substrat och fragmenterad kalvtymus DNA som startmaterial. Slumpvis representation av mRNA-sekvenser i cDNA-proverna upp- náddes därvid. Hybridiseringen utfördes vid 62-6400 under l8 timmar i 0,9 M NaCl - 0,09 M Na citratbuffert, pH 7,0, varvid initialkolonierna hybridiserades med cDNA- proverna av de inducerade cellerna och duplikatkolonierna med cDNA-proverna från de icke-inducerade cellerna (eller omvänt). Efter noggrann tvättning utsattes filtren för röntgenstrålning och de bakteriekolonier som hade förmåga att hybridi- seras till det inducerade cDNA men icke till det icke-inducerade cDNA identifierades.
På detta sätt isolerades 20 olika bakteriekolonier av ett totalt av över.2OD0 utsorterade transformerade kolonier. Samtliga av dessa 20 bakteriekolonier inne- höll multipla kopier av en plasmid i vilken infördes sekvenser av human-mRNA lD l5 20 25 30 35 40 461 225 8 avgivna endast efter det att cellerna inducerats till att producera interferon av poly (rI:rC).
Ett exempel som illustrerar denna teknik visas i fig. 2 som visar femton par alkalibehandlade par av kolonier (initiella och duplikat) på deras respektive nitrocellulosafilter, vars DNA har hybridiserats med [32P] -cDNA berett mot mRNA- fraktion 23K i fig. l, från celler som inducerats (i) eller icke-inducerats (i.i) av poly(rI):(rC) för interferonproduktion.Pilarna visar två kolonier, speciellt kolonierna 5 och l3, vilka innehåller inducerade sekvenser. Kolonierna lß beteckna- des som E. coh nPso/Asm. ' c) Isolering av interferon mRNA från humana fibroblaster Isolering av interferon=mRNA (och demonstration av närvaron av interferon- cDNA-sekvenser i plasmid-DNA av klon A341) utfördes på följande sätt: En 500 ml kultur av denna bakterieklon användes för att bereda 50 ßg plasmid-DNA. Detta DNA (efter tidigare denaturering) var kovalent bundet till diazobensyloximetyl- cellulosapulver enligt metoderna som angetts av Aldwine et al. (Proc.Natl.Acad.
Sci. USA l977,_Zí, 5350). Parallellt bands på liknande sätt plasmid-p8R322 DNA (inte innehållande humana DNA-sekvenser) till cellulosa. Poly A-innehållande mRNA, från humana fibroblaster som inducerats för att producera interferon, hybridisera- des till de tvâ DNA cellulosaberedningarna i 50 % formamid vid 52°C och eluderades genom höjning av formamidkoncentrationen till l00 Z vid 70°C. Den efter eluderingen utvunna RNA översattes i det cellfria, retikulocytsystemet (fig. 3), varvid den huvudsakliga översättningsprodukten av mRNA som valdes från A341 DNA-cellulosan befanns huvudsakligen vara polypeptiden med en molekylvikt av 23.000. Däremot er- hölls inget humant interferon mRNA från p8R322 DNA-cellulosan. I jämförelse till översättningsprodukterna av humant mRNA, före dess hybridisering till A34l DNA- cellulosa, kunde det fastställas att det klonade A34l DNA är komplementärt enbart till en liten del av mRNA-blandningen. Produkten av mRNA utvald från A341 DNA- cellulosan immunoutfälldes med hjälp av antihumant fibroblastinterferonserum.
Interferon mRNA kan också isoleras med hjälp av ett liknande förfarande till det som nämnts ovan, men där plasmid A34l DNA binds till nitrocellulosafilter, RNA hybridiseras till denna och eluderas med hjälp av kokning under l min. i H Aktiviteten hos detta renade mRNA att koda för biologiskt, potent, humant interferon har visat sig genom injektion till Xenogus laevis oocyt följt av mätning av inhiberingen av virusmângfaldigande i humanceller, vilka utsatts för oocyt- inkubatiflnsmediet (Tabell l). Interferonaktiviteten för det renade ,62-mRNA visades också genom induktion av (2'-5')-oligo-isoadenylatsyntetas i humanceller med hjälp avcoocyttranslationsprodukterna (Tabell l).
Restriktionsenzym som kartlägger A341-plasmid-DNA visar att detta innehåller ett human-DNA-inlägg av ca 900 nukleotider i Pst-läge. A34l-DNA hybridiserades 20. l0 l5 20 25 30 35 9 461' 225 också till 3 fragment av det humangenom som uppslukats genom Egg Rl-nukleas.
Dessa fragment separerades genom agarosgelelektrofores. Hybridisering till agarosgel-elektroforogram av mRNA från humanfibroblasten visade ytterligaee att A34l-DNA är komplementärt till RNA-sekvenser som endast kommer till uttryck i celler som utsatts för interferoninducerande poly (rI:rC) (Fig. 4a). Även en en timmes lång utsättning av cellerna för poly(rI:rC) leder till ansamlingen av en l250-l350 nukleotid RNA som hybridiserar till A34l-DNA, och vilken representerar IFN- ß2-mRNA.
De data som anges ovan visar att bakterieklonen E. coli DP50/A341 innehöll i Pst-läge av dess pBB322-plasmid ett inlägg av ca 900 nukleotider av human-cDNA- sekvenser, vilka är komplementära till ett humant interferon-mRNA. Ett antal liknande framställda kloner erhölls. Fig. 4b visar attkioney-för IFN-,é2 hybridi- serar till den största l250-l350 nukleotider långa mRNA, medan kloner för IFN~ßl hybridiserar till de minsta 900-l000 nukleotider långa mRNA.
Förfarandet kan utnyttjas för att erhålla kloner av interferon-DNA av olika ' typer (1, 5, Y) från humanceller.
Förklaring till figurerna: Fig. l: Sukrosgradient av poly A+-RNA från humanceller som inducerats för att producera interferon (a). Sedimentering erhölls från höger till vänster.
Tio Xenopus oocyter injicerades med 0,4 pg RNA av varje fraktion och efter 40 timmar analyserades mediet kring oocyterna på FSll-celler efter inter- feron (vänstra skalan). Varje RNA-fraktion (0,24Åflg) översattes också i retikulocytlysat och den 355-metioninmärkta produkten utfälldes med anti- _ -interferonserum. De produkter som analyserades med hjälp av polyakrylamid- gel-elektrofores visas av i.i (b). Beteckningeni_i-i(b) representerar de immuno-utfällda produkterna av ofraktionerat mRNA från icke-inducerade celler Till höger i (b) finns markeringar för molekylvikterna (fran topp till botten 68, 46, 30, l8 respektive l4 daltonenheter x l0'3). Läget och intensiteterna för 23K- och ZDK-proteinerna (pilarna) noterades och visas grafiskt i(a) (högra skalan). Den tyngsta av de tvâ interferon mRNA översattes i 23K- proteinet medan den minsta interferon mRNA översattes i 20K-proteinet.
Fig. 2: Detektion av transformerade bakteriekloner innehållande interferon DNA.
Femton alkalibehandlade kolonier på nitrocellulosafilter hybridiserades med [32E]-cDNA, vilka beretts mot 23K-mRNA-fraktionen (se fig. l) från celler som inducerats (i) eller icke-inducerats (i.i) av poly(rI):(rC) för inter- - feronproduktion. Pilarna visar två kolonier som innehåller inducerade sek- venser. Koloni nummer l3 är E. coli DP50lA34l. 461 Fig. 3: Fig. 4: 225 w Demonstration att klonen E. coli DP50/A341 innehåller interferon DNA.
Poly A+-mRNA från humanfibroblaster, som inducerats för interferon- produktion, hybridiserades till DNA från A341-plasmider kovalent bundet till cellulosa och översattes. Gelelektrofores av översättningsprodukterna visar att mRNA som kodar för interferon-(IF)-polypeptiden väljes unikt ut fràn blandningen av totala mRNA. pBR-DNA kan inte välja ut detta mRNA.
Läget för IF-polypeptiden visas efter imuno-utfällning med anti-inter- feron (ipt). a) Plasmíd-DNA av bakterieklonen A34l hybridiserar till en l4S (l300 nukleotider lång) mRNA funnen i celler som inducerats för interferon-. framställning (i) men inte i icke-inducerade celler (ii). Plasmid-pBR- DNA hybridiserar inte medan o-klonad total CDNA (tot) hybridiserar till många mRNA funna också i icke-inducerade celler. En agaros-gel-elektro- fores pa RNA fam av hybrsgiserang :in ae tre ”P-oNA visas. b) Plasmid-DNA från olika kloner av interferon-DNA användes för ett liknande experiment av hybridisering till mRNA-elektroforogram. Kloner innehållande IFN-;š2-DNA hybridiserar till den l300 nukleotider långa mRNA, medan kloner med IFN- fd-DNA hybridiserar till den mindre 900 nukleotider långa interferon-mRNA.
TABELL l HYBRIDISERING-ÖVERSÃTTNING AV/å2-INTERFERON-mRNA Experiment l Experiment 2 Beräknad V-5¿V¿ -vírusutbyte 0lig0-isoadenylat- Beräknad Radloinnwnoanalys, cpm syntetas-induktion IF-titer fiZPJ-Az-psvx, cpm Docyt-supernatant Oocyt-extrakt (utspädd l:l0) (utspädd l:l5) - oinjicerad 7445 l700 - med RNA hybridiserad till IF-#2-plasmid l920 4700 30 U/ml - med RNA hybridiserad till obesläktad plasmid 60l5 lS00 0 - Interferon-standard 100 U/ml 700 l0800
Claims (16)
1. Förfarande för framställning av huvudsakligen rent mRNA för humant fibroblastinterferon kännetecknat av: (a) att en kultur av fibroblastceller utsättes för en exogen faktor för att i cellerna inducera syntesen av inter- feron mRNA; (b) att mRNA som bildats i den inducerade cellkulturen liksom mRNA från en icke-inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (C) att man syntetiserar dubbelsträngat CDNA erhållet från det mRNA som extraherats från den inducerade kul- turen, att detta cDNA införes i vektorer, att bakterier transfekteras med de modifierade vektorerna som erhållits och att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonierna med nämnda modi- fierade vektorer (initiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella kolonier bildas; (e) att DNA för såväl initial- som duplikatkolonierna frigöres på plats; V (f) att CDNA-försöksmaterial syntetiseras av mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kon- trollkulturen med hjälp av motsvarande mRNA som mall (indu- cerat cDNA och icke-inducerat cDNA); (g) att DNA"för de initiella kolonierna å ena sidan och duplikatkolonierna à andra sidan hybridiseras med ovan nämnda försöksmaterial av inducerat CDNA och icke-inducerat CDNA; 10 15 20 25 30 35 40 45 /3 461 223 (h) att DNA som hybridiserar med försöksmaterialet av inducerat cDNA men inte hybridiserar med försöksmaterialet av icke-inducerat cDNA utvinnes; (i) isolering och identifiering av mRNA genom att tidigare, i steg (b), extraherat mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kontrollkulturen låtes komma i kontakt med DNA från steg (h), immobiliserat på en matris under betingelser som ger upphov till hybridisering, att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn i huvudsakligen ren form för att utvinna det mRNA som har förmåga att translateras till humant fibroblastinterferon-beta.
2. Förfarande enligt krav 1, kännetecknat av att mRNA i steg (b) fraktioneras med hjälp av sukrosgradientcentri- fugering följt av in vitro-translation av mRNA till humant fibroblastinterferon beta-1 och beta-2.
3. Huvudsakligen rent mRNA av humant fibroblastinter- feron-beta-l erhållet genom (a) att en kultur av fibroblastceller utsättes för en exogen faktor för att i cellerna inducera syntesen av inter- feron mRNA; (b) att mRNA som bildats i den inducerade cellkulturen -liksom mRNA fràn en icke-inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (b') att mRNA som har extraherats fràn den inducerade kulturen separeras genom sukrosgradientcentrifugering och att mRNA-sedimentet isoleras vid llS; (c) att man syntetiserar dubbelsträngat CDNA erhållet fràn det mRNA som extraherats från den inducerade kulturen, att detta cDNA införes i vektorer, att bakterier transfek- teras med de modifierade vektorerna som erhållits och att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonierna med nämnda modifierade vektorer (initiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella kolonier bildas; (e) att DNA för såväl initial- som duplikatkolonierna frigöres på plats; (f) att CDNA-försöksmaterial syntetiseras av mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kon- trollkulturen med hjälp av motsvarande mRNA som mall (indu- cerat CDNA och icke-inducerat cDNA); (g) att DNA för de initiella kolonierna å ena sidan och duplikatkolonierna å andra sidan hybridiseras med ovan nämnda försöksmaterial av inducerat cDNA och icke-inducerat CDNA; (h) att DNA som hybridiserar med försöksmaterialet av inducerat CDNA men inte hybridiserar med försöksmaterialet av icke-inducerat CDNA utvinnes; 461 2,25 w 10 15 20 25 30 35 40 45 50 (i) isolering och identifiering av mRNA genom att tidigare, i steg (b'), isolerat mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kontrollkulturen látes komma i kontakt med DNA fràn steg (h), immobiliserat på en matris under betingelser som ger upphov till hybridisering, att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn i huvudsakligen ren form för att utvinna det mRNA som har förmåga att translateras till humant fibroblastinterferon-beta-l, kännetecknat av att det har ca 900 nukleotider och att det är translaterbart till huvudsakligen en enkel polypeptid med en molekylvikt av ca 20.000 och med interferonaktivitet.
4. Huvudsakligen rent mRNA för humant fibroblastinter- feron-beta-2 erhållet genom , (a) att en kultur av fibroblastceller utsättes för en exogen faktor för att i cellerna inducera syntesen av inter- feron mRNA; (b) att mRNA som bildats i den inducerade cellkulturen liksom mRNA från en icke-inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (b") att mRNA som har extraherats från den inducerade kulturen separeras genom sukrosgradientcentrifugering och att mRNA-sedimentet isoleras vid 145; (c) att man syntetiserar dubbelsträngat cDNA erhållet från det mRNA som extraherats från den inducerade kulturen, att detta cDNA införes i vektorer, att bakterier transfek- teras med de modifierade vektorerna som erhållits och att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonierna med nämnda modifierade vektorer (initiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella kolonier bildas; (e) att DNA för såväl initial- som duplikatkolonierna frigöres på plats; (f) att cDNA-försöksmaterial syntetiseras av mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kon- trollkulturen med hjälp av motsvarande mRNA som mall (in- ducerat cDNA och icke-inducerat cDNA); (9) att DNA för de initiella kolonierna å ena sidan och duplikatkolonierna å andra sidan hybridiseras med ovan nämnda försöksmaterial av inducerat cDNA och icke-inducerat CDNA; (h) att DNA som hybridiserar med försöksmaterialet av inducerat cDNA men inte hybridiserar med försöksmaterialet av icke-inducerat cDNA utvinnes; (i) isolering och identifiering av mRNA genom att tidigare, i steg (b"), isolerat mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kontrollkulturen látes komma i kontakt med DNA från steg (h), immobiliserat på.en matris under betingelser som ger upphov till 10 15 20 25 30 35 40 45- /s 461 223 hybridisering, att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn i huvudsakligen ren form för att utvinna det mRNA som har förmåga att translateras till humant fibroblastinterferon-beta-2, kännetecknat av att det har ca 1300 nukleotider och att det är translaterbart till huvudsakligen en enkel polypeptid med en molekylvikt av ca 23.000 och med interferonaktivitet.
5. Användning av huvudsakligen rent mRNA för humant fibroblastinterferon framställt genom (a) att en kultur av fibroblastceller utsättes för en exogen faktor för att i cellerna inducera syntesen av inter- feron mRNA; (b) att mRNA som bildats i den inducerade cellkulturen liksom mRNA från en icke-inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (c) att man syntetiserar dubbelsträngat cDNA erhållet från det mRNA som extraherats från den inducerade kulturen, att detta cDNA införes i vektorer, att bakterier transfek- teras med de modifierade vektorerna som erhållits och att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonierna med nämnda modifierade vektorer (initiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella kolonier bildas; (e) att DNA för såväl initial- som duplikatkolonierna frigöres på plats; (f) att CDNA-försöksmaterial syntetiseras av mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kon- trollkulturen med hjälp av motsvarande mRNA som mall (indu- cerat cDNA och icke-inducerat cDNA); (g) att DNA för de initiella kolonierna à ena sidan och duplikatkolonierna å andra sidan hybridiseras med ovan nämnda försöksmaterial av inducerat cDNA och icke-inducerat CDNA; (h) att DNA som hybridiserar med försöksmaterialet av inducerat cDNA men inte hybridiserar med försöksmaterialet av icke-inducerat cDNA utvinnes; (i) isolering och identifiering av mRNA genom att tidigare, i steg (b), extraherat mRNA från såväl den inducerade kulturen som den icke-inducerade kontrollkulturen låtes komma i kontakt med DNA från steg (h), immobiliserat på en matris under betingelser som ger upphov till hybridisering, att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn i huvudsakligen ren form för att utvinna det mRNA som har förmåga att translateras till humant fibroblastinterferon-beta, för framställning av in- terferon beta omfattande transkribering av mRNA till DNA och kloning av DNA i en vektor, varefter det klonade interferon- DNA införes i en eukariotisk eller prokariotisk cell, att 461 225 10 15 20 25 30 35 40 45 /6 cellen odlas och att interferonec utvinnes, pà i och för sig känt sätt.
6. Användning enligt krav 5 för framställning av inter- feron-beta-l, varvid mRNA uppvisar ca 900 nukleotider och är translaterbart till huvudsakligen en enkel polypeptid med en molekylvikt av ca 20.000 och med interferonaktivitet.
7. Användning enligt krav 5 för framställning av inter- feron-beta-2, varvid mRNA uppvisar ca 1300 nukleotider och är translaterbart till huvudsakligen en enkel polypeptid med en molekylvikt av ca 23.000 och med interferonaktivitet.
8. Dubbelsträngat CDNA, kännetecknat av att det kodar för en polypeptid med interferon-beta-2-aktivitet och är komplementärt till ett mRNA enligt krav 4, som translateras till biologiskt aktivt humant interferon-beta-2 i oocyter från Xennnusiamcis.
9. DNA enligt krav 8, kännetecknat av att det har ca 1250-1350 nukleotider och kan translateras till väsentligen en enda polypeptid med en molekylvikt av ca 23000. _
10. DNA enligt krav 8, kännetecknat av att det utvinnes från humana fibroblastceller.
11. DNA enligt krav 8, kännetecknat av att det före- ligger i klonad form.
12. Förfarande för framställning av DNA enligt krav 8, innefattande att celler, som producerar interferon vid exponering för en interferoninducerare, odlas, att dessa exponeras för en sådan inducerare, att budbärar-RNA för humant interferon-beta-2 extraheras från dessa inducerade celler, att nämnda interferon-budbärar-RNA renas och att detta budbärar-RNA enligt krav 4 transkriberas till DNA enligt krav 8.
13. Förfarande enligt krav 12, kännetecknat av att det DNA som erhålles klonas i en vektor.
14. Förfarande enligt krav 12 eller 13, kännetecknat av stegen: (a) att en kultur av fibroblastceller utsättes för en exogen faktor som i cellerna inducerar syntes av interferon- beta-2-mRNA; (b) att mRNA som har bildats i den inducerade cell- kulturen samt mRNA från en ej inducerad kontrollkultur av samma värdceller extraheras; (c) att dubbelsträngat cDNA erhållet från det mRNA som har extraherats från den inducerade kulturen syntetiseras, att detta cDNA införes i vektorer, att bakterier transfek- teras med de modifierade vektorerna som har erhållits, att bakterierna odlas under betingelser som orsakar selektiv utveckling av bakteriekolonier med nämnda vektorer (ini- tiella kolonier); (d) att duplikatkolonier av nämnda initiella kolonier bildas; 10 15 20 25 30 f; 461 223 (e) att DNA för såväl de initiella kolonierna som du- plikatkolonierna frigöres på plats; (f) att cDNA-försöksmaterial syntetiseras av mRNA från både den inducerade kulturen och den ej inducerade kontroll- kulturen med användning av motsvarande mRNA som mall (indu- cerat cDNA och ej inducerat cDNA); (g) att DNA från de initiella kolonierna å ena sidan, och frán duplikatkolonierna à andra sidan hybridiseras med ovannämnda försöksmaterial av inducerat cDNA respektive ej inducerat cDNA; (h) att DNA som hybridiseras med försöksmaterialet av inducerat cDNA och som inte hybridiseras med försöksmate- rialet av ej inducerat CDNA utvinnes; (i) att det mRNA som tidigare, i steg (b), har extra- herats, bringas i kontakt med individuellt DNA från steg (h), immobiliserat på en matris under betingelser som or- sakar hybridisering, och att därefter det fixerade mRNA eluderas från den immobiliserade DNA-vektorn i väsentligen ren form och att klonat DNA som har hybridiserats med det mRNA som kan translateras till humant fibroblastinterferon- beta-2 identifieras.
15. Förfarande enligt krav 14, kånnetecknat av att mRNA fraktioneras genom sukrosgradientcentrifugering följt av in vitro-translation av mRNA till humant fibroblastinterferon- beta-2.
16. Användning av DNA enligt krav 8 eller 9 för fram- ställning av interferon-beta-2, innefattande att nämnda DNA klonas i en vektor, att det klonade interferon-beta-2-DNA införes i en eukaryotisk eller prokaryotisk cell, att cellen odlas och att interferon-beta-2 utvinnes, på i och för sig känt sätt.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL58765A IL58765A (en) | 1979-11-21 | 1979-11-21 | Process for the production of essentially pure messenger rna of human fibroblast interferon and process for the production of interferon beta |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE8007998L SE8007998L (sv) | 1981-05-22 |
| SE461223B SE461223B (sv) | 1990-01-22 |
| SE461223C true SE461223C (sv) | 1997-02-02 |
Family
ID=11051449
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8007998A SE461223C (sv) | 1979-11-21 | 1980-11-14 | mRNA och cDNA för humant fibroblastinterferon, förfarande för deras framställning samt användning därav |
| SE8603145A SE469660B (sv) | 1979-11-21 | 1986-07-17 | Humant fibroblastinterferon-beta, framstaellning och anvaendning daerav |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE8603145A SE469660B (sv) | 1979-11-21 | 1986-07-17 | Humant fibroblastinterferon-beta, framstaellning och anvaendning daerav |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5468607A (sv) |
| JP (3) | JP2555279B2 (sv) |
| CH (2) | CH684892A5 (sv) |
| DE (2) | DE3051086C2 (sv) |
| FR (1) | FR2475901A1 (sv) |
| GB (1) | GB2063882B (sv) |
| IL (1) | IL58765A (sv) |
| IT (1) | IT1194820B (sv) |
| SE (2) | SE461223C (sv) |
Families Citing this family (63)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56131598A (en) * | 1980-03-19 | 1981-10-15 | Japan Found Cancer | Novel recombinant plasmid having gene of human fibroblastic interferon messenger rna |
| US5510472A (en) * | 1979-11-21 | 1996-04-23 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Production of recombinant human interferon-beta2 |
| US5554513A (en) * | 1979-11-21 | 1996-09-10 | Yeda Research & Development Co. Ltd. | Production of recombinant human interferon-beta2 |
| DK33181A (da) * | 1980-02-06 | 1981-08-07 | Searle & Co | Fremgangsmaade til fremstilling af et interferonlignende protein |
| DE3005843A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-10 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enthaltenden mikroorganismus |
| DE3005897A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Hoechst Ag, 6000 Frankfurt | Genprodukt eines hoeheren organismus aus einem dieses gen enhtaltenden mikroorganismus |
| PT72786B (en) | 1980-04-03 | 1983-01-10 | Biogen Nv | Process for producing dna sequences recombinant dna molecules and human fibroplast interferon-like polypeptides |
| DE3176011D1 (en) * | 1980-06-12 | 1987-04-23 | Japan Found Cancer | Plasmid |
| GR81946B (sv) * | 1980-09-25 | 1984-12-12 | Genentech Inc | |
| US5582824A (en) * | 1981-10-19 | 1996-12-10 | Genentech, Inc. | Recombinant DES-CYS-TYR-CYS human immune interferon |
| AU561343B2 (en) * | 1981-10-19 | 1987-05-07 | Genentech Inc. | Human immune interferon by recombinant dna |
| JPS58110548A (ja) * | 1981-12-24 | 1983-07-01 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 新規な生理活性ペプチド |
| US6432677B1 (en) | 1982-03-08 | 2002-08-13 | Genentech, Inc. | Non-human animal interferons |
| IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
| US5827694A (en) * | 1982-03-08 | 1998-10-27 | Genentech, Inc. | DNA encoding non-human animal interferons, vectors and hosts therefor, and recombinant production of IFN polypeptides |
| US6936694B1 (en) | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| DE3220116A1 (de) * | 1982-05-28 | 1983-12-01 | Dr. Karl Thomae Gmbh, 7950 Biberach | Mikrobiologisch hergestellte (alpha)- und ss-interferone, dna-sequenzen, die fuer diese interferone codieren, mikroorganismen, die diese genetische information enthalten, und verfahren zu ihrer herstellung |
| US4737462A (en) * | 1982-10-19 | 1988-04-12 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β |
| US4966843A (en) * | 1982-11-01 | 1990-10-30 | Cetus Corporation | Expression of interferon genes in Chinese hamster ovary cells |
| US5831023A (en) * | 1982-11-01 | 1998-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant animal interferon polypeptides |
| US4855238A (en) * | 1983-12-16 | 1989-08-08 | Genentech, Inc. | Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor |
| EP0569687B1 (en) * | 1984-05-18 | 2002-08-21 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Human IL-1 cDNA sequences encoding biologically-active human IL-1 proteins |
| US5998578A (en) * | 1984-05-18 | 1999-12-07 | New England Medical Center Hospitals, Inc. | Biologically active fragments of IL-1β |
| US5122459A (en) * | 1984-12-31 | 1992-06-16 | Immunex Corporation | Gene encoding biologically active human interleukin 1 |
| WO1986006407A1 (en) * | 1985-04-23 | 1986-11-06 | Medical Biology Institute | IDENTIFICATION OF AN IgE-BINDING PROTEIN BY MOLECULAR CLONING |
| EP0200986B2 (en) * | 1985-04-25 | 1998-03-11 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Recombinant human interleukin-1 |
| DE3650790T2 (de) * | 1985-10-14 | 2008-01-24 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Menschlisches Interferon-Beta 2A zur Verwendung als Arzneimittel |
| US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
| US6284237B1 (en) | 1986-07-08 | 2001-09-04 | Steven C. Clark | Methods of treatment using IL-6 |
| IE67035B1 (en) * | 1986-07-08 | 1996-02-21 | Genetics Inst | Production and use of non-glycosylated IL-6 |
| DE3750106T3 (de) * | 1986-08-06 | 1999-04-22 | Ajinomoto Co., Inc., Tokio/Tokyo | Rekombinanter B-Zell-Differenzierungsfaktor. |
| US4939093A (en) * | 1987-02-02 | 1990-07-03 | Cetus Corporation | Human IL-2 like polypeptides, DNA sequences and recombinant DNA molecules therefore and methods for the production and use thereof |
| US4961969A (en) * | 1987-05-11 | 1990-10-09 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interferon-β |
| IL88375A (en) * | 1988-11-14 | 1995-07-31 | Yeda Res & Dev | Monoclonal antibodies that specifically bind interferon-bia 2 natural and recombinant and a natural and recombinant interferon-beta 2 purification method and method |
| US5338834A (en) * | 1993-01-26 | 1994-08-16 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Ultrapure human interleukin-6 |
| US5723125A (en) * | 1995-12-28 | 1998-03-03 | Tanox Biosystems, Inc. | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc linked through a non-immunogenic peptide |
| US20050002902A1 (en) * | 1995-12-28 | 2005-01-06 | Liming Yu | Hybrid with interferon-alpha and an immunoglobulin Fc for treatment of tumors and viral infections |
| US20030026779A1 (en) * | 1999-10-15 | 2003-02-06 | Liming Yu | Treatment of tumors and viral infections with a hybrid conjugate of interferon and an immunoglobulin Fc |
| MXPA04004671A (es) * | 2001-11-14 | 2005-08-25 | Johnson & Johnson | Anticuerpos anti-interleucina-6, composiciones, metodos y usos. |
| US20050100550A1 (en) * | 2003-11-10 | 2005-05-12 | Mohit Trikha | Anti-angiogenic uses of IL-6 antagonists |
| WO2005074546A2 (en) | 2004-02-02 | 2005-08-18 | Ambrx, Inc. | Modified human growth hormone polypeptides and their uses |
| PA8672101A1 (es) | 2005-04-29 | 2006-12-07 | Centocor Inc | Anticuerpos anti-il-6, composiciones, métodos y usos |
| US8252286B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-08-28 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| US7906117B2 (en) * | 2007-05-21 | 2011-03-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever |
| US9701747B2 (en) | 2007-05-21 | 2017-07-11 | Alderbio Holdings Llc | Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration |
| MX2009012493A (es) * | 2007-05-21 | 2010-01-20 | Alder Biopharmaceuticals Inc | Metodos de humanizacion de anticuerpo de conejo novedosos y anticuerpos de conejo humanizados. |
| US8178101B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-05-15 | Alderbio Holdings Inc. | Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia |
| US20090238825A1 (en) * | 2007-05-21 | 2009-09-24 | Kovacevich Brian R | Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies |
| ES2610607T3 (es) | 2007-05-21 | 2017-04-28 | Alderbio Holdings Llc | Anticuerpos contra IL-6 y usos de los mismos |
| US8062864B2 (en) | 2007-05-21 | 2011-11-22 | Alderbio Holdings Llc | Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies |
| US8404235B2 (en) | 2007-05-21 | 2013-03-26 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| EP3103880A1 (en) | 2008-02-08 | 2016-12-14 | Ambrx, Inc. | Modified leptin polypeptides and their uses |
| US8777182B2 (en) | 2008-05-20 | 2014-07-15 | Grinon Industries | Fluid transfer assembly and methods of fluid transfer |
| US8188235B2 (en) * | 2008-06-18 | 2012-05-29 | Pfizer Inc. | Antibodies to IL-6 and their uses |
| US9212223B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-12-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| US8323649B2 (en) * | 2008-11-25 | 2012-12-04 | Alderbio Holdings Llc | Antibodies to IL-6 and use thereof |
| US9452227B2 (en) * | 2008-11-25 | 2016-09-27 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments |
| US8337847B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-25 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies |
| US8420089B2 (en) | 2008-11-25 | 2013-04-16 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| US8992920B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-03-31 | Alderbio Holdings Llc | Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis |
| US9775921B2 (en) | 2009-11-24 | 2017-10-03 | Alderbio Holdings Llc | Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody |
| US9724410B2 (en) | 2009-11-24 | 2017-08-08 | Alderbio Holdings Llc | Anti-IL-6 antibodies or fragments thereof to treat or inhibit cachexia, associated with chemotherapy toxicity |
| AU2011332817A1 (en) | 2010-11-23 | 2013-06-13 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Anti-IL-6 antibodies for the treatment of anemia |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4237224A (en) * | 1974-11-04 | 1980-12-02 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Process for producing biologically functional molecular chimeras |
| FR2321298A1 (fr) * | 1975-08-01 | 1977-03-18 | Anvar | Procede de preparation de produits a activite interferon |
| NZ187300A (en) * | 1977-05-27 | 1982-08-17 | Univ California | Dna transfer vector and micro-organism modified to contain a nucleotide sequence equivalent to the gene of a higher organism |
| US5326859A (en) * | 1979-10-30 | 1994-07-05 | Juridical Foundation, Japanese Foundation For Cancer Research | DNA and recombinant plasmid |
| JPS5663996A (en) * | 1979-10-30 | 1981-05-30 | Japan Found Cancer | Novel recombinant having gene complementary to human interferon messenger rna |
| FI77877C (sv) * | 1979-04-20 | 1989-05-10 | Technobiotic Ltd | Förfarande för framställning och rening av human Le-formig interferonp rotein. |
| US4262090A (en) * | 1979-06-04 | 1981-04-14 | Cetus Corporation | Interferon production |
| US4289689A (en) * | 1980-03-14 | 1981-09-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Preparation of homogeneous human fibroblast interferon |
| JPS5655731A (en) * | 1979-10-11 | 1981-05-16 | Ogura Clutch Co Ltd | Clutch/brake device |
| NL7907791A (nl) * | 1979-10-23 | 1981-04-27 | Stichting Rega V Z W | Werkwijze voor het zuiveren van interferon. |
| PT72786B (en) * | 1980-04-03 | 1983-01-10 | Biogen Nv | Process for producing dna sequences recombinant dna molecules and human fibroplast interferon-like polypeptides |
| DE3177298T2 (de) * | 1980-06-06 | 1993-07-01 | Biogen Inc | Verbesserte vektoren, verfahren zur herstellung solcher vektoren und zur expression von klonierten genen. |
-
1979
- 1979-11-21 IL IL58765A patent/IL58765A/xx unknown
-
1980
- 1980-11-14 SE SE8007998A patent/SE461223C/sv not_active IP Right Cessation
- 1980-11-19 GB GB8037067A patent/GB2063882B/en not_active Expired
- 1980-11-20 US US06/208,925 patent/US5468607A/en not_active Expired - Lifetime
- 1980-11-21 CH CH3224/93A patent/CH684892A5/de not_active IP Right Cessation
- 1980-11-21 DE DE3051086A patent/DE3051086C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1980-11-21 DE DE19803043981 patent/DE3043981A1/de active Granted
- 1980-11-21 CH CH8627/80A patent/CH664967A5/de not_active IP Right Cessation
- 1980-11-21 FR FR8024833A patent/FR2475901A1/fr active Granted
- 1980-11-21 JP JP55164482A patent/JP2555279B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1980-11-21 IT IT26172/80A patent/IT1194820B/it active
-
1982
- 1982-09-28 US US06/425,933 patent/US5468609A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-09-28 US US06/425,935 patent/US5468608A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-09-28 US US06/425,934 patent/US5541312A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-17 SE SE8603145A patent/SE469660B/sv not_active IP Right Cessation
-
1987
- 1987-06-24 JP JP62157455A patent/JP2548201B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-04-13 JP JP1094314A patent/JPH02211879A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63164896A (ja) | 1988-07-08 |
| JPS5685296A (en) | 1981-07-11 |
| SE8007998L (sv) | 1981-05-22 |
| FR2475901A1 (fr) | 1981-08-21 |
| GB2063882B (en) | 1984-05-31 |
| IT1194820B (it) | 1988-09-28 |
| SE8603145D0 (sv) | 1986-07-17 |
| DE3043981C2 (sv) | 1989-11-30 |
| CH664967A5 (de) | 1988-04-15 |
| US5468609A (en) | 1995-11-21 |
| SE469660B (sv) | 1993-08-16 |
| US5468608A (en) | 1995-11-21 |
| SE8603145L (sv) | 1986-07-17 |
| SE461223B (sv) | 1990-01-22 |
| CH684892A5 (de) | 1995-01-31 |
| IT8026172A0 (it) | 1980-11-21 |
| DE3051086C2 (sv) | 1992-11-05 |
| JP2548201B2 (ja) | 1996-10-30 |
| FR2475901B1 (sv) | 1985-02-15 |
| IL58765A (en) | 1986-09-30 |
| US5468607A (en) | 1995-11-21 |
| IL58765A0 (en) | 1980-02-29 |
| DE3043981A1 (de) | 1981-10-01 |
| GB2063882A (en) | 1981-06-10 |
| JPH02211879A (ja) | 1990-08-23 |
| US5541312A (en) | 1996-07-30 |
| JP2555279B2 (ja) | 1996-11-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SE461223C (sv) | mRNA och cDNA för humant fibroblastinterferon, förfarande för deras framställning samt användning därav | |
| Nagata et al. | Synthesis in E. coli of a polypeptide with human leukocyte interferon activity | |
| Chebath et al. | Interferon-induced 56,000 Mr protein and its mRNA in human cells: molecular cloning and partial sequence of the cDNA | |
| KR860001558B1 (ko) | 인터페론의 제조방법 | |
| RU2092561C1 (ru) | Способ получения полипептида со свойствами гамма-интерферона человека | |
| KR940010865B1 (ko) | 종양 괴사 인자의 생산 방법 및 종양 괴사 인자의 수율을 증가시키는 방법 | |
| EP0041313B1 (en) | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing human fibroblast interferon | |
| KR920006349B1 (ko) | 미생물을 이용한 α- 및 β-인터페론의 제조방법 | |
| EP0083777B1 (en) | Physiologically active peptide with between 147 and 162 amino acid residues | |
| SE465223B (sv) | Moget rekombinant-humanleukocytinterferon och foerfarande foer dess framstaellning | |
| JP2000157291A (ja) | 大きな構造遺伝子の製造および発現 | |
| JP2721139B2 (ja) | 動物のインターフェロン | |
| DK173054B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af nyttige polypeptider ved genteknik, rekombinant BmNPV-DNA og vektor, der er anvendelig ve | |
| JPS6361920B2 (sv) | ||
| Langer et al. | Purification, bacterial expression, and biological activities of the human interferons | |
| CN108912222B (zh) | 一种重组犬干扰素CaIFN-λ及其应用 | |
| EP0163603B1 (en) | A human t-cell growth factor | |
| Wang et al. | Comparative analysis of cellular and viral sequences related to sarcomagenic cell transformation | |
| Gren et al. | Novel human leukocyte interferon subtype and structural comparison of alpha interferon genes | |
| WO1986006744A1 (en) | A cDNA MOLECULE CODING FOR THE EXPRESSION OF AN INTERFERON alpha TYPE POLYPEPTIDE, A BACTERIAL OR CELLULAR HOST TRANSFORMED WITH SUCH MOLECULE AND A POLYPEPTIDE SHOWING INTERFERON ACTIVITY PREPARED BY SUCH HOST | |
| Shiroki et al. | Activation of the human beta interferon gene by the adenovirus type 12 E1B gene | |
| NO894598L (no) | Bovinmetallotionein regulatorisk omraade. | |
| KR890001828B1 (ko) | 인터페론-α형의 폴리펩티드의 제조방법 | |
| Lammers et al. | Alternative mechanisms for gene activation induced by poly (rI)· poly (rC) and Newcastle disease virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| NUG | Patent has lapsed |
Ref document number: 8007998-1 Format of ref document f/p: F |