CH666050A5

CH666050A5 - Verfahren zur herstellung von interferon epsilon.

Info

Publication number: CH666050A5
Application number: CH2899/85A
Authority: CH
Inventors: Allan P Jun Jarvis; David I Kosowsky
Original assignee: Damon Biotech Inc
Priority date: 1984-07-06
Filing date: 1985-07-05
Publication date: 1988-06-30
Also published as: DK256385A; FR2567132A1; IT8567622A0; NO852717L; JPS6124600A; SE8501534L; IT1199893B; AU4193685A; DK256385D0; GB2161487B; GB2161487A; BE902688A; US4614651A; FR2567132B1; GB8517165D0; CA1228037A; SE8501534D0

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Substanz (die im folgenden als Interferon Epsilon oder IFN-e bezeichnet wird), die z.B. in menschlichen Epithelzellenkulturen als antivirales Mittel brauchbar ist, sowie auf das so hergestellte Interferon Epsilon.

Interferone sind Substanzen mit antiviralen Eigenschaften. Sie werden von Zellen bestimmter Typen erzeugt, die durch Einwirkung eines Virus, bestimmter Nucleinsäuren oder Antigen/Mitogen-Komplexe stimuliert worden sind. Interferone sind ausserordentlich wirksame Arzneimittel, die als klinische antivirale und Antitumormittel sehr vielversprechend sind.

Zurzeit sind drei Typen von menschlichem Interferon bekannt: Interferon Alpha, das von menschlichen Leukozyten oder lymphoblastoiden Zellen erzeugt wird, Interferon Beta, das von Fibroblasten erzeugt wird, und Interferon Gamma, das von menschlichen T-Lymphozyten erzeugt wird. Alle drei

Interferone werden von den betreffenden Zellen sekretiert, nachdem die Zellen durch Viren oder analoge Expositionen stimuliert worden sind. Menschliche Interferone können voneinander durch typspezifische Antikörperreaktionen oder durch Proteinsequenzierung unterschieden werden. ■

Früher wurde die antivirale Aktivität jedes einzelnen Interferontyps durch seine Fähigkeit, menschliche Fibrobla-stenzellen in Kulturen zu schützen, bestimmt. Eine herkömmliche antivirale Einheit Interferon ist diejenige Konzentration, die die Hälfte der Zellen in einer menschlichen Fibroblasten-kultur gegen Exposition mit Vesicular Stomatitis Virus bei einer Standardkonzentration schützt.

Antivirale Aktivität wurde in anderen Zellen von menschlichem und tierischem Ursprung enthaltenden Präparaten nachgewiesen. Die Interferenz bei der Vermehrung von Grippevirus wurde von Issacs und Lindenmann (1957) zuerst in Kulturen der chorioallantoischen Membran von Hühnern nachgewiesen. Ein anderes Beispiel ist die Hela-Zellinie, die eine transformierte Krebszelle von epithelialem (cervicalem) Ursprung ist, wie G. Gey et al. in Cancer Research, Band 12, Seiten 264 bis 265 (1952) berichten. Verschiedene transformierte oder neoplastische Zellinien, die ursprünglich aus menschlichem Epithelgewebe stammten, können zur Produktion von Interferon stimuliert werden [«Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines», Jameson et al., Archives of Virology 62,209-219 (1979)].

In der jetzt fallengelassenen US-Patentanmeldung Nr. 397 610 der Patentinhaberin wurde die Existenz eines neuen Materials offenbart, das Interferon Epsilon genannt wird, und ein Verfahren zur Herstellung desselben beschrieben. Wie in dieser Patentanmeldung beschrieben, wurde eine Epithelzellenkultur, die aus menschlicher Epidermis stammte (Keratinozyten), gezüchtet und exponiert, um Interferon herzustellen. Das Interferon wurde von den Zellen in das Kulturmedium sekretiert und anschliessend durch Affinitätschromatographie teilweise gereinigt. Es wurde gezeigt, dass das so gereinigte Interferon Eigenschaften aufwies, die von denen der bekannten Alpha-, Beta- und Gamma-Interferone verschieden sind.

Es wurde gefunden, dass ein neues und einzigartiges antivirales Material, nämlich Interferon Epsilon, von menschlichen Epithelzellen, insbesondere Keratinozyten, erzeugt wird, dass das neue Material von Interferon Alpha, Beta und Gamma antigen verschieden ist und dass das neue Material ausgeprägte antivirale Eigenschaften in menschlichen Epithelzellen hat, aber keine nachweisbare Aktivität in anderen Typen von menschlichen Zellen hat. Das neue Material scheint ein Molekulargewicht von etwa 20 000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, zu haben und scheint speziesspezifisch zu sein. SDS bedeutet Natriumdode-cylsulfat. Interferon Epsilon zeigte keine antivirale Aktivität auf die getesteten Rinder- und Mäusezellen.

Interferon Epsilon kann erzeugt werden, indem man primäre, diploide Epithelzellen von menschlichem Ursprung mit einem Virus stimuliert. Solche Zellen können z.B. gemäss dem Verfahren gezüchtet werden, das in der US-PS Nr. 4 016 036 von Green et al. offenbart ist. Wenn das neue Interferon auf diese Weise erzeugt wird, werden gleichzeitig andere bekannte Interferone erzeugt. Diese Tatsache erklärt in Kombination mit der Tatsache, dass IFN Epsilon keine nachweisbare antivirale Aktivität auf den normalerweise bei Interferonbestimmungen verwendeten Zelltyp, das heisst Fibroblasten, hat, warum die Existenz und die Identität dieser neuen Substanz bisher der Aufmerksamkeit der Fachleute entgangen ist.

Das neue Interferon kann auch in natürlich oder künstlich transformierten eukaryotischen Zellen erzeugt werden, die das Gen enthalten, das für Epsilon Interferon codiert und das

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in normalen Epithelzellen aktiv ist. Es kann auch in Zellen erzeugt werden, die mit Hilfe von rekombinante DNA-Methoden modifiziert worden sind, das heisst Zellen, die eine transkriptionell kompetente fremde DNA enthalten, die das für Interferon Epsilon codierende Gen enthält, das in menschlichen Epithelzellen aktiv ist.

Interferon Epsilon kann leicht von anderen Interferonen unterschieden werden, indem man eine Keratinozytenanaly-senmethode anwendet, die in dem von derselben Anmelderin am gleichen Tag eingereichten schweizerischen Patent mit dem Titel «Verfahren zum Prüfen einer Probe auf das Vorhandensein von Interferon Epsilon» beschrieben ist. Die Keratinozytenanalyse beruht auf der Beobachtung, dass von allen bekannten Interferonen zur Interferon Epsilon aktiv ist, wenn es zur Behandlung von Epithelzellen verwendet wird, aber keine nachweisbare Aktivität hat, wenn es zur Behandlung von anderen Zelltypen verwendet wird.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine antivirale Substanz eines neuen Typs zur Verfügung zu stellen, die beispielsweise dazu brauchbar ist, menschliche Epithelzellen vor Virusbefall zu schützen. Eine weitere Aufgabe besteht darin, eine Methode zur Herstellung eines Interferons des Typs, der normalem, gesundem, menschlichem Epithelgewebe angeboren ist, zur Verfügung zu stellen. Eine andere Aufgabe ist es, die Behandlung von viralen Infektionen oder Tumorwachstum in Epithelzellen zu ermöglichen. Eine weitere Aufgabe besteht darin, einen Interferontyp zur Verfügung zu stellen, der in bezug auf menschliche Epithelzellen spezifisch ist. Diese und andere Aufgaben und Merkmale der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen hervor.

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, die die Elektrophorese des erfindungsgemässen Epithelinterferons zeigt.

Ganz generell können normale menschliche Epithelzellen zur Erzeugung von Interferon Epsilon in vitro gezüchtet werden, beispielsweise nach der Methode von Green et al. Die Zellen werden dann einer IFN-Induktionsmethode durch Exponieren in bezug auf bestimmte Viren unterworfen. Nach einer kurzen Inkubation, im typischen Falle in der Grössen-ordnung von einer Stunde, kann der Inducer entfernt werden und können die Zellen in normales, frisches Wachstums- oder Erhaltungsmedium gebracht und inkubiert werden, beispielsweise 24 Stunden lang. Die Exposition der Zellen in bezug auf den Inducer löst die Expression des Gens oder der Gene der Zelle, das bzw. die für die Produktion von Epsilon Interferon codiert bzw. codieren, aus. Während der anschliessenden Inkubation synthetisiert und sekretiert die Zelle Interferon Epsilon. In diesem Zeitpunkt wird das Medium geerntet; wenn man es beispielsweise mit der Methode analysiert, die in dem oben erwähnten, am gleichen Tag eingereichten schweizerischen Patentgesuch beschrieben wird, findet man, dass es antivirale Interferon-Epsilon-Aktivität enthält.

In dieser Weise stimulierte Epithelzellen erzeugen andere Interferone, die ebenfalls antivirale Aktivität in Epithelzellen haben. Demgemäss müssen diese verunreinigenden Materialien entfernt werden, um die Eigenschaften von Epsilon Interferon zu untersuchen. Dies kann erfolgen, indem man die Aktivität des verunreinigenden Interferons mit Antikörper neutralisiert, das heisst, indem man Anti-Alpha-, Anti-Beta-und/oder Anti-Gamma-Antikörper mit dem geernteten Medium mischt. Natürlich können andere Reinigungsstufen ein konzentrierteres Präparat mit höherer Aktivität erzeugen.

Das Produkt, das aus dieser Verfahrensweise resultiert, zeigt in Neutralisationsexperimenten keine Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen Alpha-Interferon, Beta-Interferon oder Gamma-Interferon. Es ist bei pH = 2 stabil, und seine Aktivität wird durch proteolytische Enzyme zerstört. Es wird angenommen, dass es ein glycosyliertes Protein ist. Es hat ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 20 000, wenn es gly-cosyliert ist (bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektro-phorese). Das neue Interferon zeigt eine ausgeprägte Aktivität in menschlichen Epithelzellen, aber keine nachweisbare Akti-5 vität in Fibroblasten oder anderen Zelltypen. Diese Eigenschaften kennzeichnen Interferon Epsilon als eine einzigartige Substanz.

Interferon Epsilon kann aus normalen Epithelzellen, die z.B. aus der Epidermis, Conjunctiva, Vagina und dem Oeso-io phagus von Menschen stammen, unter Anwendung der «normalen Induktion» (Field et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, Band 58, Seiten 1004-1009,1967) mit Newcastle Disease Virus (Baron und Issacs, British Medicai J., Band 56, Seiten 18-20,1962) und mit Sendai Virus (Parain-15 fluenza-1, Gresser, Proceedings of the Society of Expérimental and Biological Medicine, Band 108, Seiten 303-307, 1961) erzeugt werden. Die erzeugten Mengen variieren je nach dem Typ des verwendeten Inducers und entsprechend den verschiedenen Modifizierungen der Induktionsmethoden. Es 2o scheint, dass jüngere Keratinozytenzellen mehr Interferon Epsilon erzeugen als gealterte Zellen. Newcastle Disease Virus wirkt gut. Andere Viren, die brauchbar sein können, werden in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

Virus

Tabelle Literaturstelle

30 Influenza-A

Parainfluenza-3 Masern

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40

Mumps Röteln

Atmungszellverb'and

Tollwutvirus Vesikuläre Stomatitis

Chikungunyafieber 45 Sindbisfieber Westliche Pferdeenzephalitis Gelbfieber

50

Poliovirus-Type 1 Poliovirus-Type 2

Encephalomyocarditis

55

Rhinovirus-2 Rhinovirus-12 Reovirus-2

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«Blue tongue»

Adenoviren

Varicella-Zoster

Menschliches

Cytomegalovirus

Herpes simplex

Vaccinia

Gresser und Dull (1964); Andrews (1961)

Chany (I960)

Petralli, Merigan und Wilbur (1965a); DeMaeyer und Enders (1961)

Cantell (1961); Waddell, Wilbur und

Merigan (1968)

Neva und Weller (1964)

Ray, Gravelle und Chin (1967) ;

Moehring und Forsyth (1971)

Wiktor et al. (1972)

Marcus und Sekellick (1977); Vilcek,

Ymazaki und Havell (1977)

Zimmermann et al. (1972)

Gresser und Enders (1962)

Luby, Sanders und Sulikin (1971) Wheelock und Sibley (1965); Wheelock und Edelman (1969) Gresser, Chany und Enders (1965) Smorodintsev et al. (1970); Ho und Enders (1959a, b)

Stewart II, Gosser und Lockart (1971a)

Smorodintsev et al. (1971a); Fiala

(1972)

Gatmaitan, Stanley und Jackson

(1973)

Oie, Loh und Ratnayake (1973) Jameson und Grossberg (1977)

Lysov et al. (1971)

Vaczi, Horvath und Hadhazy (1965) Vaczi, Horvath und Hadhazy (1965) ; Glasgow (1974)

Rasmussen et al. (1974)

Wheelock (1964); Epstein, Stevens und Merigan (1972)

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Interferon Epsilon ist aktiv als antivirale Substanz, wenn es zur Behandlung von Epithelzellen verwendet wird, hat aber keine nachweisbare Aktivität, wenn es zur Behandlung anderer menschlicher Zelltypen verwendet wird. Im Gegensatz dazu ist Beta-Interferon (das aus menschlichen Fibrobla-stenzellen stammt) am wirksamsten bei der Behandlung von menschlichen Fibroblastenzellen oder menschlichem Fibro-blastengewebe und hat in bezug auf menschliche Epithelzellen geringere antivirale Eigenschaften. Demgemäss kann die folgende Verfahrensweise angewandt werden, um menschliche Epithelzelltypen oder -gewebe vor viraler Infektion zu schützen und die Vermehrung eines Virus, das einen gegebenen Zelltyp oder ein gegebenes Gewebe infiziert hat, zu unterbinden.

Zunächst wird eine Kultur von Epithelzellen, z.B. Keratinozyten, neh herkömmlichen Methoden, wie der oben erwähnten Green-Methode, gezüchtet. Die Zellen der Kultur werden dann behandelt, um die Expression der Gencodierung, die für die Erzeugung von Interferon Epsilon verantwortlich ist, zu induzieren. Dies kann z.B. mittels herkömmlicher IFN-Induktionsmethoden geschehen. Das Produkt wird dann geerntet, im typischen Falle aus dem Medium nach der Inkubation, und gereinigt. Das Produkt kann als wirksame antivirale Substanz für die Behandlung der Zellen oder des Gewebes des fraglichen Typs verwendet werden.

Eine Einheit Interferon Epsilon kann definiert werden als die Konzentration, die die Hälfte der Zellen in einer menschlichen Keratinozytenzellenkultur vor Exposition mit einem Virus schützt, das in die Kultur in einer Konzentration von 1 PFU pro Zelle eingeführt worden ist. Die Anzahl Einheiten von Interferon, die in einem gegebenen Präparat vorhanden sind, kann bestimmt werden, indem man zunächst durch Neutralisation mit Antikörpern alle vorhandene verunreinigende Interferonaktivität entfernt, das Präparat der Reihenverdünnung unterwirft, Kulturen von Keratinozyten mit den betreffenden verdünnten Proben inkubiert und die Proben dann mit einem Virus exponiert. Die Anzahl der Einheiten, die in der unverdünnten Probe vorhanden sind, wird bestimmt, indem man feststellt, welche Kultur 50% lebende Zellen enthält, und dann mit dem Verdünnungsfaktor des Präparates, das mit der Kultur inkubiert wurde, multipliziert.

Signifikante Mengen dieser neuen antiviralen Substanz können auch mit Hilfe von zwei weiteren bekannten zellulären Methoden erzeugt werden. Die erste davon umfasst die Verwendung von chemisch, viral oder spontan tranformierten eukaryotischen Zellen, wie Epithelzellen. Das zweite Verfahren verwendet zurzeit etablierte rekombinante DNA-Methoden, die denjenigen ähnlich sind, die zurzeit bei der Herstellung von a- und ß-Interferon angewandt werden.

Bei dem ersten Verfahren können transformierte Zellen, die Interferon Epsilon zu erzeugen vermögen, unter Anwendung der in vivo-Methode oder der in vitro-Methode erhalten werden. Die erste Methode (in vivo) umfasst die direkte Isolierung von transformierten Epithelzelltypen aus frischem Gewebe; die zweite Methode (in vitro) umfasst ein Selektionsverfahren, bei dem ein Stamm von normalen menschlichen diploiden Epithelzellen entweder lange Zeit gezüchtet wird, bis eine kleine, aber nachweisbare Anzahl Zellen in der Population spontane Transformation erfährt, oder der ursprüngliche Stamm wird kurze Zeit mit einem Virus oder einem bekannten Mutagen, wie EMS, MSS oder MNNG, behandelt, um die Häufigkeit der Transformation zu erhöhen. Gewisse Zellen, die mittels einer der beiden beschriebenen in vitro-Methoden transformiert worden sind, enthalten eine transkriptioneil kompetente Gencodierung, die für die Erzeugung von Interferon Epsilon verantwortlich ist.

So erhaltene transformierte Kulturen können unter Anwendung von normalen Induktionsmethoden, wie sie vorstehend für normale menschliche diploide Epithelzellen beschrieben wurden, induziert werden, Interferon Epsilon zu erzeugen.

Bei der zweiten Methode wird die mRNA, die in Reaktion auf die Interferoninduktion in Epithelzellen synthetisiert worden ist, aus den Zellen extrahiert, gegebenenfalls durch Ultra-zentrifugieren oder dergleichen gereinigt, um eine mRNA-Fraktion von erhöhter Spezifizität zu erhalten, und er Extrakt wird als Matrize für die Synthese von komplementärer DNA (cDNA) verwendet. Die cDNA kann unter Verwendung des reversen Transkriptaseenzyms von «Avian Myoblastosis» erzeugt werden. Das resultierende Endprodukt dieses Verfahrens, doppelsträngige komplementäre DNA (dscDNA), die die Sequenz enthält, die für die Synthese von Interferon Epsilon codiert, und ein bakterieller oder eukaryotischer Vektor werden dann mit einem Restriktionsenzym behandelt, das die DNA spaltet und Bindestellen erzeugt, durch die die dscDNA und der Vektor gebunden werden können. Der Vektor und die DNA werden dann miteinander gemischt, «annealed» und unter Verwendung eines Ligaseenzyms kova-lent gebunden. In diesem Zeitpunkt wird das rekombinante Vektorpräparat verwendet, um entweder eine bakterielle oder eine eukaryotische Zelle zu transformieren. Die transformierten Zellen enthalten somit während ihres Interferon-Epsilon-Produktionsstadiums die DNA, die zu der gesamten ursprünglich in den Epithelzellen enthaltenen RNA oder einem Teil derselben komplementär ist.

Diese rekombinanten Vektoren werden dann mit einem geeigneten Zelltyp inkubiert, der dem Vektor erlaubt zu wirken. Dies führt zu einer Zellpopulation, die eine oder mehrere einzelne Zellen enthält, die Interferon Epsilon zu synthetisieren und zu sekretieren vermögen. Die Zellpopulation wird dann dem Screening in bezug auf eine Subpopulation von Zellen mit einem exogenen, transkriptionell kompetenten Gen, das Interferon Epsilon erzeugt, unterworfen, und diese Subpopulation wird gezüchtet, um eine Zellinie zu etablieren, die verhältnismässig grosse Mengen IFN-e zu erzeugen vermag.

Weitere Einzelheiten dieser rekombinanten DNA-Methode finden sich z.B. in den folgenden Literaturstellen:

1. US-PS Nr. 4 237 224 von Cohen et al. mit dem Titel «Process for Producing Biologically Functional Molecular Chimeras».

2. Scheller, R. et al., 1977, «Clones of Individuai Repeti-tive Sequences from Sea Urchins DNA Constructed with Syn-thetic Eco Ri Sites», Science, Band 196, Seiten 197-200;

3. Blattner, F. et al., 1977, «Charon Phages: Safer Deriva-'tives of Bacteriophage Lambda for DNA Cloning», Science, Band 196, Seiten 161-169;

4. Broach, J.R., und Hicks, J.B., 1980, «Replication and Recombination Functions Associated with Yeast Plasmid, 2 Micron Circle», Cell, Band 21, Seiten 501-508; und

5. Hamer, D., 1981, «Synthesis Processing and Sécrétion of Eukaryotic Proteins in the SV40 - Monkey Cell System», Recombinant DNA Abstracts, Band 1, Seite 4.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Epithelzellenkultur von epidermalem Ursprung (Keratinozyten), die von dem Laboratorium von Dr. Howard Green am Massachusetts Institute of Technology erhalten wurde, wurde bis zu einer Dichte von 1 bis 2 x 105 Zellen pro cm2 gezüchtet und verwendet, um Interferon Epsilon unter Anwendung der Newcastle-Disease-Virus-(NDV)-Induktions-methode (Baron und Issacs, I.e.) zu erzeugen. Das verwendete Virus war der Bankowski-Stamm von NDV, der von den Poultry Health Laboratories, Davis, California, erhältlich ist. Vier Proben von je 1 ml eines «minimum essential medium»

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(MEM, Gibco), das 2% durch Wärme inaktiviertes fötales Kälberserum («HIFCS») und NDV enthielt, mit Viruskonzentrationen von 0 bis 250 Virus-PFU pro Zelle in den Testproben wurden hergestellt und inkubiert. Die Zellkulturen wurden 24 Stunden lang inkubiert. Das Medium wurde dann geerntet, mit 0,1-normaler HCl bis pH = 2 angesäuert und 5 bis 6 Tage lang bei 4 °C aufbewahrt, um das NDV zu inaktivieren.

Beispiel 2

Das gemäss Beispiel 1 hergestellte rohe Interferon wurde nach Neutralisation von Interferon Alpha, Interferon Beta und Interferon Gamma mit in bezug auf jeden der drei bekannten Interferontypen spezifischen Antikörpern auf seine antivirale Aktivität geprüft. Die Neutralisationstitrationen der einzelnen Interferone wurden unter Verwendung von Anti-IFN-alpha (NIH), Anti-IFN-beta (NIH und Y.H. Tan, Calgary University, Calgary, Alberta, Canada), Anti-IFN-gamma (S. Baron) und Gemischen dieser Antiseren ausgeführt. Die zurückbleibenden neutralisierten Präparate wurden dann auf Fibroblastenkulturen (Human-FS-4) und Epithelkulturen (Human-AR) getestet. Die Resultate zeigten, dass Interferon Epsilon keine nachweisbare antivirale Aktivität in bezug auf Fibroblasten hatte, aber Aktivität gegen Viren in Epithelzellen zeigte.

Die folgende Tabelle gibt eine komplette Batterie von Tests der Neutralisation und der antiviralen Aktivität wieder.

Tabelle I

Antivirale Wirkung von Interferonpräparaten auf Human-FS-4- und -AR-Zellen

Probe Behandlung1 Interferontiter2 (Einheiten/ml)

Anti-a Anti-ß Anti-y Human-FS-4 Human-AR

IFN-e

128

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IFN-e

+

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IFN-e

—

+

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IFN-e

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+

192

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IFN-e

+

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IFN-e

+

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IFN-a

—

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IFN-ß

—

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IFN-a/b

—

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IFN-y

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IFN-a/ß/y

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384

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IFN-a/ß/y

+

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—

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+

-

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IFN-a/ß/y

—

+

N.D.

16

IFN-a/ß/y

+

-

.<4

<4

IFN-a/ß/y

+

<4

1 Die Proben wurden mit überschüssigem Antiserum, wie angegeben, 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, bevor sie auf Interferonwirkung geprüft wurden.

2 Der Interferontiter wurde durch einen viralen cytopathi-schen Test bestimmt.

3 N.D. = Keine Daten

Es ist aus den Daten ersichtlich, dass Interferon Alpha und Interferon Beta gleichzeitig mit Interferon Epsilon erzeugt wurden. Es ist festzuhalten, dass die Neutralisation mit a-Antikörper allein oder ß-Antikörper allein die Interferonaktivität sowohl in den Fibroblasten- als auch in den Keratinozytenkulturen reduzierte. Die Neutralisation mit beiden Antikörpern und mit einem Gemisch aus a-, ß- und y-An-tikörpern zerstörte alle antivirale Aktivität des Interferon-

Epsilon-Präparates in bezug auf Fibroblasten, während eine Aktivität von 32 Einheiten pro ml in den Keratinozytenzellen zurückblieb. Dies beweist das Vorhandensein von Interferon Epsilon und bestätigt, dass dieses eine selektive Aktivität auf Epithelzellkulturen hat.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Beständigkeit von Interferon Epsilon gegen saure pH-Werte. Interferon Epsilon wurde durch Induktion von menschlichen Epidermiszellen mit NDV gemäss Beispiel 1 erzeugt. Als das Medium geerntet wurde, wurde es in drei Portionen aufgeteilt. In der ersten Portion wurde das Virus wie in Beispiel 1 beschrieben durch Ansäuern mit HCl bis pH = 2 inaktiviert. Die zweite Portion wurde 5 Tage lang durch ein Millipore 01310-Filter (Molekulargewichtsgrenze 100 000, Millipore Corp., Bedford, MA) filtriert, um das Virus zu entfernen. Der dritte Teil wurde durch ein Millipore PTMK01310-Filter (Molekulargewichtsgrenze 100 000), das vorher 4 Stunden lang in einer l%igen Lösung von BS A eingeweicht worden war, filtriert. In jedem Falle wurde das resultierende Medium sowohl in bezug auf Interferon Epsilon als auch in bezug auf das Vorhandensein von restlichem Virus geprüft. Keine der Proben zeigte irgendeine virale Aktivität, und jede Probe enthielt die gleiche Menge Interferon-Epsilon-Aktivität.

Beispiel 4

Die Wirkung des Kulturalters von Keratinozyten und der Viruskonzentration des induzierenden Virus auf die Erzeugung von Epsilon-Interferon wurde untersucht. Die Resultate sind unten in Tabelle II zusammengefasst.

Tabelle II

Wirkung von Kulturalter und Viruskonzentration auf die Erzeugung von IFN-e

M.O.I.1

Interferontiter2

(Einheiten/106 Zellen)

(Virus-PFU/Zelle)

14 Tage

21 Tage

27 Tage

0

<6

<3

<4

0,1

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<3

<4

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2

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6

16

5 '

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6

16

10

157

6

16

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210 ~

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210

9

32

70

ND3

12

32

90

ND

9

32

100

79

ND

250

79

ND

1 Viruskonzentration

2 Die Interferonproben wurden mit überschüssigen Interfe-ron-a- und -ß-Antiseren inkubiert, bevor sie auf ihre Wirkung auf Keratinozyten geprüft wurden.

3 ND = Keine Daten

Tabelle II zeigt, dass mindestens bei Epithelzellen vom Keratinozytentyp jüngere Zellen, das heisst 14 Tage alte Zellen, mehr Interferon Epsilon erzeugen als ältere Zellen. Dieses Resultat steht im Widerspruch zu den Experimenten mit anderen Interferonformen, bei denen im typischen Falle gefunden wird, dass ältere Zellen höhere Titer erzeugen.

Diese Erscheinung kann zum Teil durch die charakteristische Ansammlung von Keratin in Keratinozytenzellen während

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ihrer Alterung erklärt werden. Die Tabelle zeigt auch, dass die IFN-Epsilon-Erzeugung am höchsten ist, wenn man Viruskonzentrationen im Bereich von 5 bis 20 Virus-PFU/ Zelle anwendet.

Beispiel 5

Unfraktioniertes Interferon Epsilon wurde zuerst 20 Minuten lang bei 300xg zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde auf einem Fisher Rotarack bei 4 °C mit Glas mit definierten Poren («controlied pore glass» C.P.G.) (Elec-tronucleonics, Inc.) gemischt. 0,28 g Glas mit definierten Poren wurden pro 30 ml überstehender Kulturflüssigkeit verwendet. Nach 3 Stunden wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt, und die Glasperlen mit definierten Poren wurden in eine Säule (2,5 x 3,1 cm) gefüllt. Die Säule wurde zuerst mit 4 Säulenvolumen PBS und dann mit 4 Säulenvolumen 1,0-moIarem NaCl-20-millimolarem Phosphatpuffer vom pH = 7,4 gewaschen. Das Interferon Epsilon wurde mit 4 Säulenvolumen von 50vol-%igem Ethylenglycol-l,0-molarem NaCl-20-millimolarem Phosphatpuffer vom pH = 7,4 eluiert und in einem gleichen Volumen 1,0-molarem NaCl-20-milli-molarem Phosphatpuffer gesammelt, so dass sich eine Endkonzentration an Ethylenglycol von 25% ergab. Die Interferon Epsilon enthaltende Fraktion wurde durch Ultrafiltration auf 1,0 bis 1,6 ml eingeengt und auf eine Polyacrylamid-Agarose-Säule (Ultragel AcA54) (1,6 x 85 cm) aufgebracht, die mit 25vol.-%igem Ethylenglycol-1,0-molarem NaCl-20-milli-molarem Phosphatpuffer vom pH = 7,4 äquilibriert worden war. Das Interferon Epsilon wurde dann bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 6,0 ml pro Stunde mit dem Äquilibrie-rungspuffer eluiert.

Das Interferon Epsilon kann durch Affinitätschromatographie auf einer Anzahl von immobilisierten Liganden gereinigt und eingeengt werden. Dazu gehören unter anderem reaktive rote Agarose, Phenylsepharose (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), «Procion red agarose», Phenylagarose (BRL, Gaithersburg, Md.), Glycogel B, N-(3-Carboxypropionyl)-aminodecan-(CPAD)-agarose und N-Pyromellitylaminode-can-(PMAD)-agarose (Pierce Chemical Co., Rockford, III.).

Das Interferon Epsilon kann auch auf einer Säule gereinigt werden, die immobilisiertes Anti-Interferon Epsilon enthält.

Beispiel 6

5 Epithel-Interferonmaterialien, die gemäss Beispiel 1 hergestellt und gemäss Beispiel 5 teilweise gereinigt worden waren, wurden der Molekulargewichtsanalyse unter Anwendung der SDS-Gelelektrophorese nach der Methode von Lamelli unterworfen. Die Proben wurden bei Raumtempera-io tur in Gegenwart von 1,0% SDS, 0,05-molarem Tris-HCl-Puf-fer (pH = 6,8), 10 Vol.-% Glycerin und 0,001% Bromphenolblau eine Stunde lang inkubiert, auf 12,5% Polyacrylamidgele aufgebracht und annäherungsweise 16 Stunden lang laufen gelassen. Nach der Elektrophorese wurden die Zonen, die die 15 Molekulargewichtsstandards enthielten, angefärbt. Die Interferon enthaltenden Zonen wurden in 3-mm-Scheiben zerteilt und durch Schütteln mit 0,5 ml PBS, die 0,5% SDS enthielten, 20 Stunden lang bei Raumtemperatur extrahiert. «PBS» bedeutet «phosphatgepufferte Kochsalzlösung». Analysen 20 dieser Fraktionen wurden ausgeführt, und das Molekulargewicht des Hauptaktivitätspeaks, der mit Interferon Epsilon verbunden war, wurde durch Vergleich seiner Stellung auf dem Gel mit den Molekulargewichtsstandards zu annäherungsweise 20 000 bestimmt.

25 In Fig. 1 ist die antivirale Interferon-Epsilon-Aktivität in AR-Epithelzellen (Keratinozyten) gezeigt. Ein rohes Interferon-Epsilon-Präparat (hergestellt wie in der Beschreibung und den Beispielen erläutert) wurde, wie in Beispiel 5 beschrieben, durch Säulenchromatographie gereinigt. Die 3o antivirale Aktivität der aus der Säule eluierten aktiven Fraktion ist in Fig. 1 durch die leeren Kreise dargestellt. Der durch Interferon Epsilon verursachte Aktivitätspeak wurde durch ein Protein erzeugt, das gemäss Elektrophorese im Vergleich mit Molekulargewichtsstandards ein scheinbares Mole-35 kulargewicht von etwa 20 000 hat und dessen Aktivität durch Behandlung mit ß-Mercaptoethanol auch dramatisch reduziert wird. In der Zeichnung bedeuten «-ß-me» und « + -ß-me» «ohne ß-Mercaptoethanol» bzw. «mit ß-Mercaptoethanol». Die schwarzen Punkte zeigen die antivirale Aktivität für 4o verschiedene eluierte Fraktionen, die mit ß-Mercaptoethanol behandelt worden waren.

G

1 Blatt Zeichnungen

Claims

666 OSO

1. Verfahren zur Herstellung von e-Interferon, dadurch gekennzeichnet, dass man

A. eine Kultur von lebenden Zellen erzeugt, die ein Gen enthalten, das in menschlichen Epithelzellen aktiv ist;

B. diese Zellen in einem Medium unter Bedingungen inkubiert, die die Synthese von Interferon fördern;

C. das Medium erntet; und

D. ein Interferon aus diesem Medium reinigt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass i) es durch eine lebende Zelle hergestellt wird, die ein Gen enthält, das in menschlichen Epithelzellen aktiv ist;

ii) seine antivirale Aktivität in bezug auf menschliche Epithelzellen spezifisch ist;

iii) es antigen verschieden von Interferon Alpha, Interferon Beta und Interferon Gamma ist; und iv) seine antivirale Aktivität bei pH = 2 stabil ist und durch proteolytische Enzyme zerstört wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur von lebenden Zellen eine menschliche Epithelzellenkultur ist und dass vor Stufe B ein Virus verwendet wird, um die Zellen zur Erzeugung des e-Interferons zu induzieren.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellkultur aus menschlichen Keratinozyten züchtet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultur Zellen aufweist oder daraus besteht, die ein exogenes Gen enthalten, das in menschlichen Epithelzellen aktiv ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in dem geernteten Medium eine Verunreinigung enthalten ist, die aus Interferon Alpha, Interferon Beta, Interferon Gamma und Gemischen davon gewählt ist, und dass die Reinigungsstufe die Stufe der Entfernung der Aktivität des verunreinigenden Interferons umfasst.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen verwendet, in denen das in menschlichen Epithelzellen aktive Gen ein exogenes Gen ist, das durch rekombinante DNA-Methoden inseriert worden ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass das e-Interferon gemäss SDS-Polyacryl-amid-Gelelektrophorese ein Molekulargewicht von etwa

20 000 hat.

8. E-Interferon, hergestellt nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7.