FR2567132A1

FR2567132A1 - Preparation a base d'interferon et son procede de fabrication

Info

Publication number: FR2567132A1
Application number: FR8509569A
Authority: FR
Inventors: Allan Perley Jarvis Jr; David Israel Kosowsky
Original assignee: Damon Biotech Inc
Current assignee: Abbott Biotech Inc
Priority date: 1984-07-06
Filing date: 1985-06-24
Publication date: 1986-01-10
Also published as: JPS6124600A; IT8567622A0; IT1199893B; CH666050A5; DK256385A; BE902688A; GB2161487B; FR2567132B1; SE8501534D0; GB2161487A; DK256385D0; AU4193685A; US4614651A; GB8517165D0; SE8501534L; NO852717L; CA1228037A

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE PREPARATION PRESENTANT UNE ACTIVITE ANTIVIRALE. CETTE PREPARATION EST FORMEE A PARTIR DE CELLULES VIVANTES CONTENANT UN GENE ACTIF DANS LES CELLULES EPITHELIALES HUMAINES, PAR EXEMPLE LES CELLULES KERATINOCYTES, SON ACTIVITE ANTIVIRALE EST SPECIFIQUE DES CELLULES EPITHELIALES HUMAINES, IL EST DISTINCT AU POINT DE VUE DES ANTIGENES DES INTERFERONS ALPHA, BETA ET GAMMA, ET SON ACTIVITE ANTIVIRALE EST STABLE A PH2. APPLICATION A LA LUTTE CONTRE LES VIRUS.

Description

La présente invention concerne une nouvelle composition de matière

(appelée dans la suite du présent mémoire "interféron epsilon" ou interféron E) utile par exemple dans des cultures de cellules épithéliales humaines comme agent antiviral, des procédés de fabrication de cette composition, et des procédés de traitement de cette composition de matière, et des procédés de traitement de cellules épithéliales humaines afin qu'elles résistent

aux infections virales.

Les interférons sont des matières qui possèdent des propriétés antivirales. Ils sont préparés par certains types de cellules qui ont été stimulées par exposition à un virus, à certains acides nucléiques ou à des complexes antigènes-mitogènes. Les interférons sont des produits pharmaceutiques extrêmement puissants qui sont très

prometteurs comme agents cliniques antiviraux et anti-

tumeurs. il existe actuellement trois types connus

d'interférons humains, l'interféron alpha produit par-

des leucocytes humains ou des cellules lymphoblastoides,

l'interféron bêta produit par des fibroblastes, et l'inter-

féron gamma produit par des lymphocytes T humains. Ces

trois interférons sont secrétés par les cellules respec-

tives après que celles-ci ont été stimulées par des virus ou des causes analogues. Les interférons humains peuvent être différenciés les uns des autres par des réactions avec des anticorps, présentant une spécificité

ou d'après les séquences de protéines.

Jusqu'à présent, l'activité antivirale de chaque type particulier d'interféron a ôté mesurée par son aptitude à protéger les fibroblastes humains dans une culture. Une unité antivirale classique d'interféron est la concentration qui protège la moitié des cellules d'une culture de fibroblastes humains contre l'attaque par un virus de stomatite vésiculaire à une concentration normalisée. Une activité antivirale a été détectée dans d'autres cellules d'origine humaine ou animale. Une interférence dans la multiplication du virus de la grippe a d'abord été détectée par Issacs et Lindenmann (1957) dans des cultures de membrane chorioallantoique de poulet. Un autre exemple est la lignée de cellules de Hela qui est une cellule cancéreuse transformée d'origine épithéliale (cervicale) comme indiqué par G. Gey et al., Cancer Research, vol. 12, p. 264-265, 1952. Diverses lignées de cellules transformées ou néoplasiques tirées à l'origine du tissu épithélial humain peuvent être stimulées afin qu'elles produisent de l'interféron, comme décrit dans "Production of Interferon by Human Tumor

Cell Lines", Jameson et al, Archives of Virology 62, 209-

219 (1979).

La demande de brevet français n 83.11 547 décrit l'existence d'une nouvelle matière appelée interféron

epsilon et décrit un procédé de fabrication. Comme l'in-

dique ce document, une culture de cellules épithéliales provenant de l'épiderme humain (kératinocytes) est cultivée

et subit une induction afin qu'elle produise de l'inter-

féron. Celui-ci a été secrété par les cellules dans le milieu de culture puis partiellement purifié par chromatographie par affinité. L'interféron ainsi purifié a montré qu'il possédait des caractéristiques distinctes

de celles des interférons alpha, bêta et gamma connus.

On a constaté qu'une nouvelle matière antivirale originale, l'interféron epsilon, était produite par

les cellules épithéliales humaines, notamment les kérati-

nocytes, que la nouvelle matière était distincte au

point de vue des caractéristiques antigènes des inter-

férons alpha, bêta et gamma, et que la nouvelle matière avait des propriétés antivirales accentuées dans les cellules épithélialeshumaines mais n'avaitpas d'activité

détectable dans d'autres types de cellules humaines.

La nouvelle matière paraît avoir un poids moléculaire

d'environ 20 000 da]tons, tel que l'indique l'électro-

phorèse sur gel de polyacrylamide SDS, et paraît être une espèce spécifique. L'interféron epsilon a présenté une activité antivirale nulle sur les cellules éprouvées

bovines et de muridés.

L'interféron epsilon peut être produit par stimulation de cellules épithéliales diploïdes primaires d'origine humaine avec un virus. De telles cellules peuvent être cultivées par exemple selon le procédé

décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 016 036.

Lorsque le nouvel interféron est produit de cette manière,

d'autres interférons connus sont simultanément produits.

Ce fait, couplé au fait que l'interféron epsilon n'a pas d'activité antivirale détectable sur le type de cellules normalement utilisées dans les analyses d'interférons,

c'est-à-dire les fibroblastes, explique pourquoi l'exis-

tence et l'identité de cette nouvelle substance ont

échappées jusqu'à présent aux spécialistes.

Le nouvel interféron peut aussi être préparé dans des cellules eucaryotes transformées artificiellement

ou naturellement, contenant le code génétique de l'inter-

féron epsilon qui est actif dans les cellules épithéliales normales. Il peut aussi être produit dans ces cellules

modifiées par les techniques mettant en oeuvre l'ADN recom-

binant, c'est-à-dire des cellules contenant un ADN étranger compétent par transcription, comprenant le code génétique de l'interféron epsilon qui est actif dans les cellules

épithéliales humaines.

L'interféron epsilon peut être facilement distingué d'autres interférons par utilisation d'une technique d'analyse de kératinocytes. Cette analyse repose sur l'observation du fait que, parmi tous les interférons connus, seul l'interféron epsilon est actif lorsqu'il est utilisé pour le traitement des cellules épithéliales, mais n'a pas d'activité détectable lorsqu'il est utilisé

pour le traitement d'autres types de cellules.

Ainsi, l'invention concerne un nouveau type

de substance antivirale utile par exemple pour la protec-

tion des cellules épithéliales humaines contre l'attaque par les virus. Elle concerne aussi un procédé de production d'un nouvel interféron de type indigène pour un tissu épithéliale normal humain sain. Elle concerne aussi

un procédé de traitement d'infection virale ou de crois-

sance tumorale dans des tissus épithéliaux. Elle concerne aussi un type d'interféron spécifique des cellules épithé-

liales humaines.

D'autres caractéristiques et avantages de

l'invention ressortiront mieux de la description qui

va suivre, faite en référence au dessin annexé dont

la figure unique est un graphique illustrant une électro-

phorèse de l'interféron épithélial selon l'invention.

On peut cultiver des cellules épithéliales humaines normales in vitro par exemple selon le procédé de Green et al, pour la fabrication d'interféron epsilon, d'une manière générale. Les cellules sont alors soumises à une opération d'induction d'interféron IFN par exposition à certains virus. Après une courte période d'incubation, par exemple de l'ordre d'une heure, l'inducteur peut être retiré et les cellules peuvent être placées dans un milieu normal neuf de culture ou d'entretien puis

soumis à une incubation pendant 24 heures par exemple.

L'exposition des celules à l'inducteur déclenche l'expres-

sion du codage génétique des cellules assurant la produc-

tion d'interféron epsilon. Pendant l'incubation ultérieure,

la cellule synthétise et secrète l'interféron epsilon.

A ce moment, la récolte est réalisée dans le milieu et une analyse montre par exemple une activité antivirale

de l'interféron epsilon.

Les cellules épithéliales stimulées de cette manière produisent d'autres interférons qui ont aussi

une activité antivirale dans les cellules épithéliales.

En conséquence, ces matières contaminantes doivent être retirées afin que les propriétés de l'interféron epsilon puissent être examinées. L'opération peut être réalisée

par neutralisation de l'activité de l'interféron contami-

nant par des anticorps, c'est-à-dire par mélange d'anti-

corps anti-alpha, anti-bêta et/ou anti-gamma au milieu récolté. Evidemment, d'autres opérations de purification peuvent donner une préparation plus concentrée, d'activité

plus élevée.

Le produit obtenu à la' suite de ces opérations ne présente pas de réactivité mutuelle avec un anticorps

de l'interféron alpha, de l'interféron bêta ou de l'inter-

féron gamma dans des expériences de neutralisation.

Il est stable à pH 2 et son activité est détruite par des enzymes protéolytiques. On pense qu'il s'agit d'une protéine glycosylatée. Elle a une masse moléculaire

apparente d'environ 26 000 daltons (déterminée par électro-

phorèse sur gel de polyacrylamide SDS) sous forme glyco-

sylate. Le nouvel interféron présente une activité marquée dans les cellules épithéliales humaines mais pas d'activité détectable dans les fibroblastes et autres types de cellules. Ces caractéristiques font de l'interféron

epsilon une substance originale.

L'interféron epsilon peut être produit à partir de cellules épithéliales normales tirées par exemple de l'épiderme humain, du tissu conjonctif, du tissu vaginal, de l'oesophage, à l'aide d'une "induction normale" (Field et al., Proceeding of the National Academy of Sciences, vol. 58, p. 10041009, 1967) à l'aide du virus de la maladie de Newcastle, (Baron and Issacs, British Medical J., vol. 56, p. 18-20, 1962) et avec le virus de Sendai (paragrippe-1, Gresser, Proceedings of the Society of experimental and Biological Medicine, vol. 108, p. 303-307, 1961). Les niveaux de production varient avec la nature de l'inducteur utilisé et avec les diverses modifications des techniques d'induction. Il apparaît que des cellules kératinocytes relativement jeunes donnent de l'interféron epsilon en plus grande quantité que les cellules âgées. Le virus de la maladie de Newcastle donne de bons résultats. D'autres virus qui peuvent

être utiles sont indiqués dans le tableau suivant.

TABLEAU I

Virus Références Grippe A Gresser et Dull (1964); Andrews (1961) Paragrippe-3 Chany (1960) Rougeole Petralli, Merigan, et Wilbur (1965a); DeMaeyer et Enders (1961) IJ Parotidite épidermique Cantell (1961); Waddell, Wilbur, et Merigan (1968) Rubéole Neva et Weller (1964) Syncytium respiratoire Ray, Gravelle, et Chin (1967); Moehring et Forsyth (1971) Virus de la rage WiKtor et al. (1972) Stomatite vésiculaire Marcus et SeKellick (1977); Wilcek, YamazaKi et Havell (1977) Chikungunya Zimmermann et al. (1972) Sindbis Gresser et Enders (1962) Encéphalite équine Luby, Sanders, et SulKin (1971) occidentale Fièvre jaune Wheelock et Sibley (1965); Wheelock et Edelman (1969) Poliovirus-Type 1 Gresser, Chany, et Enders (1965) Poliovirus-Type 2 Smorodintsev et al. (1970); Ho et Enders (1959a,b) Encephalomyocardite Stewart II, Gosser, et Lockart [(1971a) Rhinovirus-2 Smorodintsev et al. (1971a); Fiala (1972) Rhinovirus-12 Gatmaitan, Stanley, et Jackson

(1973)

Reovirus-2 Oie, Loh, et Ratnayake (1973) Langue bleue du mouton Jameson et Grossberg (1977) Adunuvirus Lysov et al. (1971) Varicelle Vaczi, Horvath. et Hadhazy (1965) Cytomigalovirus humain Vaczi, Horvath, et Hadhazy (1965); Glasgow (1974) Herpes simplex Rasmussen et al. (1974) Vaccine Wheelock (1964); Epstein, Stevens, et Merigan (1972) L'interféron epsilon est actif comme substance antivirale lorsqu'il est utilisé pour le traitement des cellules épithéliales, mais il n'a pas d'activité détectable lorsqu'il est utilisé pour le traitement d'autres types de cellules humaines. Au contraire, l'inter- féron bêta (provenant de cellules de fibroblastes humains) est plus efficace pour le traitement des tissus ou cellules

de fibroblastes humains et a une moindre activité anti-

virale par rapport aux cellules épithéliales humaines.

Ainsi, on peut utiliser les opérations suivantes pour

la protection des tissus ou types de cellules épithé-

liales humaines contre les infections virales et pour l'interruption de la multiplication d'un virus qui a

infecté un tissu ou un type cellulaire donné.

D'abord, une culture de cellules épithéliales, par exemple des kératinocytes, est cultivée par mise

en oeuvre des techniques classiques telles que la techni-

que de Green indiquée précédemment. Les cellules de la culture sont alors traitées afin que l'expression du codage génétique responsable de la production de l'interféron epsilon soit induite. Ceci peut être réalisé par exemple par les techniques classiques d'induction d'interféron. Le produit est alors récolté, par exemple dans le milieu après incubation, puis purifié. Le produit peut être utilisé comme substance antivirale efficace pour le traitement des types de tissus ou de cellules considérés. On peut définir une unité d'interféron epsilon comme étant la concentration qui protège la moitié des cellules dans une culture de cellules kératinocytes humaines en compétition avec un virus introduit dans la culture à une concentration de 1 pfu/cellule. Le

nombre d'unités d'interférons présentes dans une prépara-

tion donnée peut être déterminé d'abord par suppression

de l'activité des interférons contaminants par neutra-

lisation avec des anticorps, par dilution en série de

la préparation, par incubation des cultures de kératino-

cytes avec les échantillons dilués respectifs, puis par mise en compétition des échantillons avec des virus. Le nombre d'unités présentes dans l'échantillon non dilué est déterminé par détermination de la culture qui contient 50 % de cellules vivantes, puis par multiplication par le facteur de dilution de la préparation qui a subi

l'incubation avec la culture.

Des quantités importantes de cette nouvelle substance antivirale peuvent aussi être produites par

deux techniques cellulaires connues supplémentaires.

La première met en oeuvre des cellules eucaryotes transfor-

mées chimiquement, par des virus ou spontanément, telles que des cellules épithéliales. La seconde met en oeuvre des techniques bien établies actuellement à base de ADN recombinant, analogues à celles qui-sont actuellement utilisées pour la production des interférons alpha et bêta.

Selon le premier procédé, des cellules trans-

formées capables de produire de l'interféron epsilon peuvent être obtenues par utilisation de l'une des deux techniques in vivo et in vitro. La première technique (in vivo) met en oeuvre l'isolement direct, à partir

d'un tissu neuf, de typesde cellules épithéliales trans-

formées, et la seconde technique (in vitro) met en oeuvre une procédure de sélection dans laquelle une souche de cellules épithéliales diploïdes humaines normales subit soit une culture à long terme jusqu'à ce qu'un

nombre faible mais détectable de cellules de la popula-

tion subisse une transformation spontanée, soit un trai-

tement de la souche initiale pendant une courte période par un virus ou un agent mutagène connu tel que EMS, MMS ou MNNG afin que la fréquence de transformation soit accrue. Certaines des cellules transformées par l'un des deux procédés in vitro décrit contiennent un code génétique compétent par transcription responsable de

la production d'interféron epsilon.

Les cultures transformées ainsi obtenues peuvent subir une induction de la production d'interféron epsilon par utilisation des techniques normalisées d'induction

telles que décrites précédemment pour les cellules épithé-

liales diploides humaines normales.

Dans la seconde technique, l'acide mARN synthé-

tisé dans les cellules épithéliales à la suite de l'induc-

tion d'interféron est extrait des cellules, éventuellement purifié par ultracentrifugation ou analogue afin qu'il forme une fraction de mARN de spécificité accrue, et l'extrait est utilisé comme modèle pour la synthèse de ADN complémentaire (cADN). Cet acide cADN peut être

produit à l'aide d'enzyme transcriptase inverse de myoblas-

tose aviaire. Le produit final obtenu dans l'opération qui est de l'ADN complémentaire à double spire (dscADN)

qui comprend le code de séquence de la synthèse d'inter-

féron epsilon, et un vecteur eucaryote ou bactérien sont alors traités avec une enzyme de restriction qui assure le clivage de l'acide ADN et forme des sites de liaison par lesquels l'acide dscADN et le vecteur peuvent être fixés. Le vecteur et l'acide ADN sont alors mélangés, soumis à une maturation et liés par des liaisons de covalence à l'aide de l'enzyme ligase. A ce moment, la péparation du vecteur recombinant est utilisée pour

la transformation d'une cellule bactérienne ou eucaryote.

Les cellules transformées contiennent ainsi l'ADN complé-

mentaire de la totalité ou d'une partie de l'ARN contenu à l'origine dans les cellules épithéliales pendant leur

étape de production d'interféron epsilon.

Ces vecteurs recombinants subissent alors

une incubation avec un type approprié de cellule permet-

tant l'opération du vecteur. Il se forme alors une popula-

tion de cellules qui contient une ou plusieurs cellules individuelles capables de synthétiser et de secréter l'interféron epsilon. La population de cellules est alors cultivée afin qu'elle donne une sous- population de cellules ayant un gène exogene compétent par' transcription qui produit de l'interféron epsilon, et cette sous-population est cultivée afin qu'une lignée de cellules capables

de produire des quantités relativement grandes d'inter-

féron epsilon soit établie.

Des caractéristiques particulières de cette technique mettant en oeuvre l'acide ADN recombinant fi- gurent par exemple dans les documents suivants: 1. Brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 237 224

de Cohen et al, "Process For Producing Biologically Func-

tional Molecular Chimeras".

2. Scheller, R. et al, 1977, Clones of Individual Repetitive Sequences from Sea Urchins DNA Constructed with Synthetic Eco R1 Sites, Science, vol. 196, p. 197-200; 3. Blattner, F. et al, 1977, Charon Phages: Safer Derivatives of Bacteriophage Lambda for DNA Cloning, Science, vol. 196, p. 161-169;

4. Broach, J.R., et Hicks, J.B., 1980, Replica-

tion and Recombination Functions Associated with Yeast Plasmid, 2 Micron Circle, Cell, vol. 21, p. 501-508; et 5. Hamer, D. 1981, Synthesis Processing and Secretion of Eukaryotic Proteins in the SV40 - Monkey Cell

System, Recombinant DNA Abstracts, vol. 1, p. 4.

On considère maintenant des exemples de mise

en oeuvre de l'invention, à titrenon limitatif.

EXEMPLE 1

On cultive une culture de cellules épithéliales d'origine épidermique (kératinocytes) obtenue auprès du laboratoire du Dr. Howard Green au Massachusetts Institute of Technology jusqu'à une densité de 1.105 à 2. 105 cellules par centimètre carré, et on l'utilise pour la production d'interféron epsilon à l'aide du procédé d'induction par le virus de la maladie de Newcastle (NDV) (Baron et Issacs, Supra). Le virus utilisé était la souche Bankowski du NDV disponible auprès de Poultry Health Laboratories, Davis, Californie. Quatre échantillons

de 1 cm3 d'un milieu essentiel minimal (MEN, Gibco) conte-

nant 2 % de sérum de veau foetal inactivé thermiquement ("HIFCS") et le virus NDV ont été préparés puis soumis 1 1 à une incubation, à des multiplicités d'infections allant de 0 à 250 pfu de virus/cellules dans les échantillons. Les cultures des cellules ont subi une incubation de 24 h. Le milieu a alors été récolté, acidifié à pH 2 avec HC1 0,1 N, puis conservé à 4 C pendant 5 à 6 jours afin

que le virus NDV soit inactivé.

EXEMPLE 2

L'interféron brut préparé dans l'exemple 1 a subi une détermination de l'activité antivirale après neutralisation d'interférons alpha, bêta et gamma par des anticorps spécifiques de chacun de ces trois types connus d'interférons. Les titrages de neutralisation de chacun des interférons ont été réalisés à l'aide des anti-IFN alpha (NIH), anti-IFN bêta (NIH et Y.D. Tan, Calgary University, Calgary, Alberta, Canada), anti-IFN gamma (S. Baron) et de mélanges de ces antisérums. Les préparations neutralisées restantes ont alors été soumises à des cultures de fibroblastes (humain FS-4) et de cellules épithéliales (humain AR). Les résultats ont montré que l'interféron epsilon n'avait pas d'activité antivirale détectable sur les fibroblastes et présentait une activité

vis-à-vis des virus présents dans les cellules épithé-

liales. Le tableau II qui suit résume un ensemble

complet d'essais de neutralisation et d'activité anti-

virale.

TABLEAU II

Activité antivirale de préparation d'interféron sur des cellules humaines FS-4 et AR Echantillon Traitement Titre d'interféron2(unités/cm3) Anti-a Anti-e Anti-y FS-4 humain AR humain

INF-E - - - 128 64

INF-c + - - 48 32 INF-e - + - 24 32 INF-e - - + 192 32

INF-E + + - <4 32

INF-E + + + <4 32

INF-o - - - 64 4

INF- - - - 128 16

INF-a/B - - - 512 16 INF-y - - - 32 16 INF-a//y - - - 384 64 INF-a/B/y + - 128 48 INF-a/B/y - + - 256 16 INF-a/B/y - - + N.D. 16 INF-a/g/y + + - <4 <4 INF-a/e/y + + + <4 <4 1 Les échantillons ont subi une incubation en présence d'un excès d'antisérum comme indiqué, à 37 C pendant 1 h,

avant que l'activité de l'interféron soit déterminée.

2 Le titre d'interféron a été déterminé par une analyse

cytopathique virale.

3 N.D. indique l'absence de résultats.

Les résultats montrent que l'interféron alpha et l'interféron bêta sont produits simultanément avec l'interféron epsilon. On note que la neutralisation par l'anticorps alpha seul ou l'anticorps bêta seul réduit les unités d'activité d'interféron à la fois

dans les cultures de fibroblastes et de kératinocytes.

La neutralisation par les deux anticorps et avec un mélange d'anticorps alpha, bêta et gamma détruit toute activité antivirale de la préparation epsilon sur les fibroblastes alors que l'activité de 32 unités/cm3 est conservée dans les cellules kératinocytes. Ceci montre la présence d'interféron epsilon et confirme son activité sélective sur les cultures de cellules épithéliales.

EXEMPLE 3

Cet exemple montre la stabilité de l'interféron epsilon à un pH acide. L'interféron epsilon a été préparé par induction de cellules d'épiderme humain avec NDV comme indiqué dans l'exemple 1. Lorsque le

milieu a été récolté, il a été divisé en trois parties.

Le virus a été inactivé dans la première partie comme

décrit dans l'exemple 1, par acidification à pH 2 avec HCl.

La seconde partie a été filtrée pendant 5 jours à l'aide d'un filtre "Millipore" 01310 (limite de masse moléculaire 000, Millipore Corp., Bedford, MA) afin que le virus soit retiré. La troisième partie a été filtrée par le filtre "Millipore" PTMK01310, ayant une limite de masse moléculaire de 100 000, préalablement imprégnée pendant 4 heures dans une solution à 1 % de BSA. Dans tous les cas, la présence de virus résiduel et d'interféron epsilon a été déterminée dans le milieu résultant. Acucun des échantillons n'a présenté d'activité virale et tous les échantillons contenaient la même quantité d'activité

d'interféron epsilon.

EXEMPLE 4

L'effet de l'âge de la culture des kéra-

tinocytes et la multiplicité d'infections du virus induc-

teur sur la production d'interféron epsilon ont été

étudiés. Les résultats sont résumés dans le tableau III.

TABLEAU III

Effet de l'âge de la culture et de la multiplicité d'infectionssur la production d'interféron epsilon M.O.I. Titre d'interféron2 (unités/106 cellules) 14 jours 21 jours 27 jours

0 <6 <3 <4

0,1 10 <3 <4

1 53 2 8

2 79 6 16

210 6 16

157 6 16

210 18 32

210 9 32

70 ND3 12 32

ND 9 32

79 ND ND

250 79 ND ND

i Multiplicité d'infections 2 Les échantillons d'interférons ont subi une incubation en présence d'excès d'antisérum d'interférons alpha et

bêta avant analyse de l'activité sur les kératinocytes.

N.D.- pas de résultats disponibles.

Le tableau III montre que, au moins pour les cellules épithéliales de type kératinocytes, les cellules relativement jeunes, c'est-à-dire presque des cellules confluentes de 14 jours, produisent plus d'interféron epsilon que les cellules plus vieilles. Ce résultat diffère de celui d'expériences réalisées avec d'autres

formes d'interférons dans lesquels on constate habituel-

lement que les cellules plus vieilles donnent des titres plus élevés. Ce phénomène peut être expliqué en partie par l'accumulation de caractéristiques de la kératine

dans les cellules kératinocytes lorsqu'elles vieillissent.

Le tableau montre aussi que la production d'interféron epsilon augmente lors de l'utilisation de concentrations

de virus comprises entre 5 et 20 (multiplicité d'infec-

tions).

EXEMPLE 5

On a fait subir d'abord une centrifugation à

300 g pendant 20 min à de l'interféron epsilon non frac-

tionné. La matière qui surnage a été mélangée à du verre à porosité contrôlée (C.P.G. de Electronucleonics, Inc.) à 4 C sur un appareil "Rotarack Fisher". On a utilisé

0,28 g de verre à porosité contrôlée pour 30 cm3 de ma-

tière cultivée qui surnage. Après 3 heures, la matière qui surnage a été retirée et les perles de verre à porosité

contrôlée ont été entassées dans une colonne (2,5 x 3,1 cm).

La colonne a d'abord été lavée avec quatre volumes de la colonne de PBS puis avec quatre volumesde la colonne de tampon phosphaté NaCl-20mM 1,0 M à pH 7,4. L'interféron epsilon a subi une élution avec quatre volumes de colonne d'un mélange à 50 % en volume/volume d'éthylèneglycol et de tampon phosphaté NaCl-20mM 1,0 M, avant collecte dans un volume égal de tampon phosphaté NaCl-20mM 1,0 M, afin que la concentration finale de l'éthylèneglycol atteigne 25 %. La fraction contenant l'interféron epsilon a été concentrée par ultrafiltration à 1,0-1,6 cm3 puis appliquée à une colonne de polyacrylamide-agarose ("Ultragel" AcA54) (1,6 x 85 cm) en équilibre avec un mélange à 25 % d'éthylèneglycol en volume/volume avec un tampon phosphaté NaCl-20mM 1,0 M, à pH 7,4. L'interféron epsilon a subi alors une élution avec un tampon de mise

à l'équilibre avec un débit de 6,0 cm3/h.

L'interféron epsilon peut être purifié et concentré par chromatographie d'affinité sur un çertain nombre de ligands immobilisés. On peut noter à titre

purement illustratif l'agarose rouge réactif, le phényl-

sépharose (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), l'agarose rouge "Procion", le phénylagarose (BRL, Gaithersburg, Md.), le "Glycogel" B, le N-(3carboxypropionyl)aminodécane

(CPAD) agarose et le N-pyromellitylaminodécane(PMAD)-

agarose (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). L'interféron epsilon peut aussi être purifié sur une colonne contenant

de l'anti-interféron epsilon immobilisé.

EXEMPLE 6

On effectue une analyse de masse moléculaire de matières épithéliales contenant l'interféron produites dans l'exemple 1 et partiellement purifiées comme indiqué dans l'exemple 5, à l'aide d'une électrophorèsesur gel SDS selon le procédé de Lamelli. Les échantillons subissent une incubation à température ambiante pendant 1 heure en présence de 1,0 % de SDS, un tampon 0,05 M de tris-HCl (pH 6,8), 10 % (en volume/volume) de glycérol et 0,001 % de bleu de bromophénol, les échantillons

étant alors chargés sur des gels à 12,5 % de polyacry-

lamide, l'opération étant réalisée pendant 16 heures environ. Après électrophorèse, les voies contenant les références de masse moléculaire sont colorées, les voies Contenant de l'interféron sont découpées en tranches de 3 mm puis sont extraites par secouage avec 0,5 cm3

de PBS contenant 0,5 % de SDS, pendant 20 heures à tempé-

rature ambiante. L'analyse de ces fractions a été réalisée et la masse moléculaire du pic d'activité principale associé à l'interféron a été calculée comme étant d'environ 000 par comparaison de la position sur le gel avec

les références de masse moléculaire.

La figure unique représente l'activité de l'interféron epsilon qui est manifeste dans des cellules épithéliales AR (kératinocytes). La protéine correspondant à l'activité épithéliale a une masse moléculaire apparente de 20 000 environ, et son activité est aussi réduite

d'une manière considérable par traitement par le bêta-

mercaptoéthanol.

La description qui précède montre l'existence

d'un nouveau type d'interféron et décrit sa production, sa purification et sa caractérisation. Bien entendu, les hommes du métier pourront apporter toutes les modifications aux procédés et matériaux indiqués, sans sortir du cadre

de l'invention.

Claims

REVENDICATIONS

1. Préparation à base d'interféron, ayant une activité antivirale, caractérisée en ce que: i) elle est préparée par une cellule vivante contenant un gène actif dans les cellules épithéliales humaines, ii) son activité antivirale est spécifique des cellules épithéliales humaines, iii) elle est distincte au point de vue des antigènes, des interférons alpha, bêta et gamma, et iv) son activité antivirale est stable à pH 2

et est détruite par des enzymes protéolytiques.

2. Préparation selon la revendication 1, caracté-

risée en ce que la cellule vivante est une cellule kérati-

nocyte humaine.

3. Préparation selon la revendication 1, caracté-

risée en ce que la cellule vivante est une cellule euca-

ryote transformée.

4. Préparation selon la revendication 1, carac-

térisée en ce que la cellule est une cellule dans laquelle le gène actif dans les cellules épithéliales humaines est un gène exogène introduit par les techniques de

1 'ADN recombinant.

5. Préparation selon la revendication 1, carac-

térisée en ce que sa masse moléculaire est d'environ 000, lorsqu'elle est déterminée par électrophorèse sur

gel de SDS polyacrylamide.

6. Préparation selon la' revendication 1, carac-

térisée en ce qu'elle n'a pas d'activité antivirale détec-

table dans les cellules dé fibroblastes humains.

7. Préparation selon la revendication 1, carac-

térisée en ce qu'elle a une activité antivirale dans

les kératinocytes humains.

8. Préparation selon la revendication 1, carac-

térisée en ce qu'elle n'a pas d'activité antivirale dans

les cellules de muridés ou de bovins.

9. Procédé de préparation d'un interféron, du type qui comprend: A. la production d'une culture de cellules

vivantes contenant un gène actif dans les 11ules épithé-

liales humaines, B. l'incubation des cellules dans un milieu dans des conditions qui favorisent la synthèse de l'interféron, C. la récolte du milieu, et D. la purification d'un interféron tiré du milieu, ledit interféron étant caractérisé en ce que: i) il est préparé à l'aide d'une cellule vivante contenant un gène actif dans les cellules épithéliales humaines, ii) son activité antivirale est spécifique vis-à-vis des cellules épithéliales humaines, iii) il est distinct au point de vue antigène des interférons alpha, bêta et gamma, et iv) son activité antivirale est stable à pH 2

et est détruite par des enzymes protéolytiques.

10. Procédé selon la revendication 9, caracté-

risé en ce que la culture de cellules vivantes est une culture de cellules épithéliales humaines et, avant l'étape B, un virus est utilisé pour l'induction de

la production dudit interféron par ces cellules.

11. Procédé selon la revendication 10, caracté-

risé en ce que le virus est le virus de la maladie de Newcastle.

12. Procédé selon la revendication 10, caracté-

risé en ce que la culture de cellules est cultivée à

partir de cellules échantillonnées dans un tissu épithé-

lial humain.

13. Procédé selon la revendication 10, caracté-

risé en ce que la culture de cellules est cultivée à partir

de kératinocytes humains.

14. Procédé selon la revendication 9, caracté-

risé en ce que la culture est formée de cellules eucaryotes transformées.

15. Procédé selon la revendication 9, caracté-

risé en ce que la culture contient des cellules qui

comportent un gène exogène actif dans les cellules épi-

théliales humaines.

16. Procédé selon la revendication 9, caracté- risé en ce qu'une matière contaminante choisie dans le groupe qui comprend l'interféron alpha, l'interféron bêta, l'interféron gamma et leurs mélanges est présente dans le milieu récolté, et l'opération de purification comprend l'extraction de l'activité de cet interféron contaminant.

17. Procédé de traitement de cellules épithé-

liales humaines afin qu'une infection virale soit inhibée, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact des cellules à traiter avec une quantité efficace d'une préparation d'interféron selon l'une

quelconque des revendications 1 à 8 afin que l'infection

virale soit inhibée.

18. Procédé selon la revendication 17, caracté-

risé en ce qu'il comprend la mise en contact de cellules

kératinocytes humaines avec ladite préparation d'inter-

féron.