NO852717L - Interferonpreparat. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører et nytt preparat (i det følgende kalt interferon-e eller interferon E) som f.eks. er nyttig i human-epitelcellekulturer som antiviralt middel, samt frem-gangsmåter for fremstilling av materialet. Videre skal det omtales prosesser for behandling av human-epitelceller for å motstå virusinfeksjon.

Interferoner er materialer som har antivirus-egenskaper.

De produseres av visse typer celler som er blitt stimulert ved eksponering for et virus, visse nukleinsyrer eller antigen/mito-gen-komplekser. Interferoner er svært kraftige medikamenter som er svært lovende som kliniske antivirale og antitumor-midler.

Det er for tiden tre kjente typer av human-interferon: interferon-a, produsert av human-leukocytter eller lymfo-blastoidceller; interferon-3, produsert av fibroblaster; og interferon-y, produsert av human-T-lymfocytter. Alle tre utskilles av de respektive celler etter at cellene er stimulert av virus eller analog påvirkning. Human-interferoner kan skjelnes fra hverandre ved type-spesifikke antistoffreaksjoner eller proteinsekvensering.

Tidligere er den antivirale aktivitet hos hver spesielle type interferon blitt målt ved hjelp av evnen til å beskytte human-fibroblastceller i kultur. En konvensjonell antiviral enhet av interferon er den konsentrasjon som beskytter en halvdel av cellene i en human^fibroblastkultur mot påvirkning med Vesicular Stomatitis Virus) ved en standardkonsentrasjon.

Antiviral aktivitet er blitt påvist i andre celler av menneske- og dyre-opprinnelse. Interferens i. mangfoldig-gjørelsen av influensavirus ble først påvist av Issacs og. Lindenmann (1957) i kulturer av kylling-chorioallantoisk membran. Et annet eksempel er Hela^cellelinjen som er en transformert kreftcelle av epitel (cervical)-opprinnelse, som rapportert av G. Gey et al., i Cancer Research, vol. 12,

s. 264-265, 1952. Diverse transformerte eller neoplastiske cellelinjer som opprinnelig ble utledet fra human-epitelvev kan bli stimulert for å produsere interferon, se "Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines", Jameson et al., Archives of Virology 62, 209-219 (1979).

I US-patentsøknad nr. 397.610 (nå falt) har vi åpenbart eksistensen av et nytt materiale, kalt interferon-e, og beskrevet en fremgangsmåte for produksjon av det. Som beskrevet i nevnte søknad, ble en epitelcellekultur av human-epidermal opprinnelse (keratinocytter) dyrket og bragt til å produsere interferon. Interferonet ble utskilt av cellene inn i dyrkningsmediet og ble etterpå delvis renset ved affinitets-kromatografi. Det således rensede interferon viste seg å ha karakteristikker forskjellige fra de kjente a-, 3~og y-interferoner.

Det er oppdaget at et nytt og enestående antiviralt materiale, interferon-e, produseres av human-epitelceller, spesielt keratinocytter, at det nye materiale er antigent forskjellig fra interferon-a, -3 og - y og at det nye materiale har markerte antivirale egenskaper i human-epitelceller, men ingen påviselig aktivitet på andre typer human-celler. Det nye materiale synes å ha en molekylvekt på ca. 20.000 daltons, bestemt ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese og synes å

være substans-spesifikt. Interferon-e har ikke vist noen antiviral aktivitet på de testede storfe- og muse-celler.

Interferon-e kan produseres ved å stimulere primære, diploide epitelceller av menneskeopprinnelse med et virus. Slike celler kan f.eks. dyrkes i. overensstemmelse med den metode som er åpenbart i US-patent nr. 4.016.036 ( Green et al}, hvis åpenbareIse herved inkorporeres ved referanse. Når det nye interferon produseres på denne måte, produseres samtidig andre kjente interferoner. Dette faktum, koblet med det faktum at IFN-epsilon ikke har noen påviselig antiviral aktivitet på den celletype som normalt anvendes i. interferonundersøkelser, d.v.s. fibroblaster, forklarer hvorfor eksistensen og identi-teten til denne nye substans hittil ikke er blitt kjent for fagmannen på området.

Det nye interferon kan også produseres i. naturlig eller kunstig transformerte eukaryote celler som inneholder det gen som koder for e-interferon som er aktivt i normale epitelceller. Det kan også produseres i celler som er modifisert ved rekombinant-DNA-teknikker, d.v.s. celler som inneholder en transkri.psjonelt kompetent fremmed-DNA som inkluderer det gen som koder for interferon-e som er aktivt i human-epitelceller.

Interferon-e kan lett skjelnes fra andre interferoner

ved å anvende en keratinocytt-analyseteknikk som er beskrevet i norsk patentsøknad nr. 85.0536. Læren i nevnte patentsøknad inkorporeres herved ved referanse. Keratinocytt-analysen er basert på den observasjon at av alle kjente interferoner er bare interferon-e aktivt når det anvendes for å behandle epitelceller, men har allikevel ingen påviselig aktivitet når det anvendes for å behandle andre typer celler.

Følgelig er det et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en ny type antiviral substans som f.eks. er anvendelig for å beskytte human-epitelceller mot virusangrep. Et annet formål er å tilveiebringe en fremgangsmåte for å produsere et nytt interferon av den type som er iboende i. normalt, sunt human-epitelvev. Ved hjelp av oppfinnelsen kan man behandle virusinfeksjon eller tumorvekst i epitelvev.

Et annet formål er å tilveiebringe en type interferon som er spesifikk for human-epitelceller. Disse og andre formål og trekk ved foreliggende oppfinnelse vil fremgå av den følgende beskrivelse og fra de medfølgende krav.

Fig. 1 er en kurve som viser elektroforese av epitel-interferonet i henhold til oppfinnelsen.

Bredt sagt, for å produsere interferon-e kan normale human-epitelceller dyrkes in vitro, f.eks. i overensstemmelse med metoden til Green et al. Cellene utsettes deretter for en IFN-induksjonsteknikk ved eksponering for visse vira. Etter en kort inkubering, typisk av størrelsesorden 1 time, kan indusereren bli fjernet og cellene anbragt i normalt, friskt vekstmedium eller vedlikeholdsmedium og inkuberes, f.eks. i 24 timer. Eksponering av cellene for indusereren utløser ekspresjon av cellenes gen eller gener som koder for e-inter-feronproduksjon. Under den påfølgende inkubering vil cellen syntetisere og utskille interferon-e. På dette punkt innhøstes mediet, og hvis det f.eks. analyseres ved den metode som er beskrevet i den ovenfor angitte samtidige søknad nr. 85.0 536, vil det bli funnet å inneholde interferon-e-antiviral aktivitet.

Epitelceller som er stimulert på denne måte produserer andre interferoner som også har antiviral aktivitet i. epitelceller. Følgelig må disse kontaminerende materialer fjernes for at man skal kunne undersøke egenskapene til e-interferon. Dette kan gjøres ved å nøytralisere aktiviteten til det kontaminerende interferon med antistoffer, d.v.s. ved å blande anti-a-, anti-f}- og/eller anti-y-antistof f er med det inn-høstede medium. Naturligvis kan andre rensetrinn produsere et mer konsentrert, preparat med høyere aktivitet.

Produktet som blir resultatet av denne prosess viser ingen kryss-reaktivitet med antistoff til a-interferon, (3-interferon eller y~interferon i nøytralisasjonsforsøk. Det er stabilt ved pH 2, og dets aktivitet ødelegges ved proteolytiske enzymer. Det menes å være et glykosylert protein. Det har en tilsynelatende molekylvekt på ca. 20.000 daltons (bestemt ved SDS polyakrylamidgel-elektroforese) når det er glykosylert.

Det nye interferon oppviser markert aktivitet i. human-epitelceller, men ingen påviselig aktivitet i fibroblastceller eller andre typer celler. Disse karakteristikker markerer interferon-e som en unik substans.

Interferon-e kan produseres ut fra normale epitelceller som f.eks. stammer fra human-epidermer, conjunctiva, vagina og esophagus, under anvendelse av "normal induksjon" (Field et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 58,

s. 1004-1009, 1967) med Newcastle Disease Virus, (Baron og Issacs, British Medical J., vol. 56, s. 18-20, 1962) og med Sendai virus (parainfluenza-1, Gresser, Proceedings of the Society of Experimental and Biological Medicine, vol. 10 8,

s. 303-307, 1961). Produksjonsnivåer varierer med typen av induserer som anvendes og med de forskjellige modifikasjoner av induksjonsteknikkene. Det ser ut som at yngre keratinocytt-celler produserer mer interferon-e enn aldrede celler. Newcastle Disease Virus virker godt. Andre vira som kan være nyttige er angitt i følgende tabell.

Interferon-e er aktivt som antiviral substans når det anvendes for å behandle epitelceller, men har ingen påviselig aktivitet når det anvendes for å behandle andre humån-celletyper. Derimot er 3-interferon (av human-fibroblastcelle-oppri.nnelse) mest effektiv med hensyn til å behandle human-fibroblastceller eller vev og har lavere antivirale egenskaper med hensyn til human-epitelceller. Følgelig kan den følgende fremgangsmåte anvendes for å beskytte human-epitelcelle-typer eller vev fra viral infeksjon, og for å arrestere mangfoldiggjørelse av et virus som har infisert en gitt celletype eller vev.

Først dyrkes en kultur av epitelceller, f.eks. keratinocytter, ved konvensjonelle teknikker, f.eks. den Green-teknikk som det er referert til ovenfor. Kulturens celler behandles deretter for å indusere ekspresjon av det kodende gen som er ansvarlig for produksjon av interferon-e. Dette kan f.eks. gjøres ved konvensjonelle IFN-induksjonsteknikker.

Produktet innhøstes så, typisk fra mediet etter inkubering, og renses. Produktet kan anvendes som en effektiv antiviral substans for behandling av den aktuelle celle- eller vevtype.

Én enhet av interferon-e kan defineres som den konsentrasjon som beskytter en halvdel av cellene i. en human-keratinocytt-cellekultur fra påvirkning av et virus som er introdusert til kulturen ved en konsentrasjon av én pfu/celle. Antall enheter av interferon som er til stede i. et gitt preparat kan bestemmes ved først å fjerne eventuell kontaminerende interferonaktivitet ved nøytralisering med antistoffer, seriefortynning av preparatet, inkubering av kulturer av keratinocytter med de respektive fortynnede prøver og deretter utsette prøvene for påvirkning med et virus. Antall enheter som er til stede i den ufortynnede prøve bestemmes ved å fastslå hvilken kultur inneholder 50% levende celler og deretter multiplisere med fortynningsfaktoren

til preparatet som ble inkubert med kulturen.

Signifikante mengder av denne nye antivirale substans

kan også produseres ved to ytterligere, kjente celle-teknikker. Den første innebærer anvendelse av kjemisk, viralt eller spontant transformerte eukaryote celler, f.eks. epitelceller. Den annen anvender løpende etablerte rekombinant-DNA-teknikker lik dem som løpende anvendes ved produksjon av a- og interferoner.

Ved den første metode kan transformerte celler med evne til å produsere interferon-e oppnås ved å anvende én av to teknikker: in vi.vo eller in vitro. Den første teknikk (in vivo) innebærer direkte isolasjon fra friskt vev av transformerte epitelcelle-typer; den annen teknikk (in vitro) innebærer en seleksjonsprosess hvor en stamme av normale human-diploi.de epitelceller enten dyrkes på langtidsbasis inntil et lite, men påviselig antall celler i. populasjonen gjennomgår spontan transformasjon, eller startstammen behandles i et kort tidsrom med et virus eller et kjent mutagen, f.eks. EMS, MMS eller MNNG, for å øke transformasjonsfrekvensen. Visse av de celler som transformeres enten ved den ene eller den annen av in vitro-metodene som er beskrevet, vil inneholde et transkripsjonelt kompetent kodende gen som er ansvarlig for produksjon av interferon-e.

Transformerte kulturer som således er oppnådd, kan induser-es til å produsere interferon-e ved at det anvendes standard-induksjonsteknikker som beskrevet tidligere for normale human-diploi.de epitelceller.

I den annen teknikk ekstraheres den mRNA som er synteti-sert i epitelceller i. respons på IFN-induksjonen, fra cellene, renses eventuelt ved ultrasentrifugering eller lignende for å gi. en mRNA-f raks jon med øket spesifisitet, og ekstrakten anvendes som en mal for syntese av komplimentær DNA (cDNA). cDNA kan produseres ved anvendelse av Avian Myoblastosis-revers -transkriptase-enzymet. Det endelige resulterende produkt fra denne prosess, dobbeltstrenget komplementær DNA (dscDNA), som inkluderer den sekvens som koder for syntesen av interferon-e, og en bakteriell eller eukaryot vektor behandles deretter med et restriksjonsenzym som splitter DNA og produserer bindingsseter ved hvilke dscDNA og vektoren kan festes. Vektoren og DNA blandes deretter sammen, ringsluttes og bindes kovalent under anvendelse av et ligase-enzym. På dette punkt anvendes rekombinant-vektor-preparatet for å tranformere enten en bakterie- eller eukaryot celle. De transformerte celler inneholder således DNA komplimentært til alt eller en del av den RNA som opprinnelig ble inneholdt i epitelcellene under deres interferon-e-produksjonstrinn.

Disse rekombinant-vektorer inkuberes deretter med en passende celle-type som tillater vektoren å virke. Dette resulterer i en cellepopulasjon som inkluderer en eller flere enkeltceller med evne til å syntetisere og utskille interferon-e. Cellepopulasjonen klassifiseres deretter med sikte på en subpopulasjon av celler som har et eksogent, transkripsjonelt kompetent gen som produserer interferon-e, og denne subpopulasjon dyrkes for å etablere en cellelinje med evne til å produsere relativt store mengder av interferon-e.

Ytterligere detaljer angående denne rekombinant-DNA-teknikk kan f.eks. finnes i. de følgende referanser, hvis åpenbarelser herved inkorporeres ved referanse.

1. US-patent 4.2 37.22 4 (Cohen et al.) med tittelen

"Process For Producing Biologically Functional Molecular Chimeras". 2. Scheller, R. et al., 1977, Clones of Individual Repeti-tive Sequences from Sea Urchins DNA Constructed with Synthetic Eco R1 Sites, Science, vol. 196, s. 197-200; 3. Blattner,F. et al., 1977, Charon Phages: Safer Derivatives of Bacteriophage Lambda for DNA Cloning, Science, vol. 196, s. 161-169;

4. Broach, J.R. og Hicks, J.B., 1980,

Replication and Recombination Functions Associated with Yeast Plasmid, 2 Micron Circle, Cell, vol. 21. s. 501-508; og

5. Hamer, D. 1981, Synthesis Processing and Secretion

of Eukaryotic Proteins in the SV40 - Monkey Cell System, Recombinant DNA Abstracts, vol. Is. 4.

Oppfinnelsen vil lettere forstås av de følgende, ikke-begrensende eksempler.

Eksempel 1

En epitelcellekultur av epidermal opprinnelse (keratinocytter) oppnådd fra laboratoriet til Dr. Howard Green ved Massachusetts Institute of Technology ble dyrket til en

densitet på • 1-2 x 10 5 celler pr. cm 2 og anvendt for produksjon av interferon-e ved hjelp av Newcastle Disease Virus (NDV)-induksjonsmetoden (Baron og Issacs, se ovenfor). Det virus som ble anvendt var Bankowski-stammen av NDV som er tilgjengelig fra Poultry Health Laboratories, Davis, California. Fire prøver av 1 ml av et minimums-essensielt medium (MEM, Gibco) inneholdende 2% varme-inaktivert fetal-kalveserum ("HIFCS") og NDV til et flertall av infeksjoner som varierer fra 0 til 2 50 virus pfu/celle i de prøver som skulle undersøkes, ble fremstilt og inkubert. Cellekulturene ble inkubert i 24 timer. Mediet ble deretter innhøstet, surgjort til pH 2 med 0,1N HC1 og lagret ved 4°C i 5-6 dager for inaktivering av NDV.

Eksempel 2

Det rå interferon fremstilt i henhold til eksempel 1 ble testet med hensyn på antiviral aktivitet etter nøytralisering av interferon-a, interferon-3 og interferon-y med antistoffer som var spesifikke for hver av de tre kjente interferon-typer. Nøytraliseringstitrasjoner av hvert interferon ble utført med anti-IFN-a (NIH), anti-IFN-3 (NIH og Y.H. Tan, Calgary University Calgary, Alberta, Canada), anti-IFN-y (S. Baron), samt blandinger av disse antisera. De gjenværende nøytraliserte preparater ble så testet med hensyn på fibroblast (Human FS-4) og epitel (Human AR)-kulturer. Resultatene indikerte at interferon-e ikke hadde noen påviselig antiviral aktivitet på fibroblaster, men viste aktivitet overfor vira i. epitelceller.

Nedenstående tabell oppsummerer et komplett batteri av nøytralisasjons- og antiviral-aktivitetstester:

Det fremgår av dataene at interferon-a og interferon-3

ble produsert samtidig med interferon-e. Bemerk at nøytrali-sering med a-antistoff alene eller 3~antistoff alene reduserte enhetene av interferon-aktivitet både i fibroblast- og keratinocytt-kulturene. Nøytralisering med begge og med en blanding av a-, 3~ogY~anti.stoffer ødela all antiviral aktivitet hos e-preparatet på fibroblaster mens 32 enheter/ml aktivitet ble igjen i keratinocytt-cellene. Dette viser nærværet av interferon e og bekrefter at det har selektiv aktivitet på epitelcellekulturer.

Eksempel 3

Dette eksempel viser stabiliteten til interferon-e overfor sur pH. Interferon-e ble produsert ved induksjon av human-epidermalceller med NDV i henhold til eksempel 1. Da mediet ble innhøstet, ble det delt opp i tre porsjoner. Viruset ble inaktivert i den første del som beskrevet i eksempel 1, ved surgjøring til pH 2 med HC1. Den annen porsjon ble filtrert i 5 dager gjennom et Millipore 01310-filter (100.000 molekylvektgrense, Millipore Corp., Bedford, MA) for fjerning av viruset. Den tredje porsjon ble filtrert gjennom et Millipore PTMK01310-filter, 100.000 molekylvektgrense, som på forhånd var oppbløtt i 4 timer i. en 1% løsning av BSA. I hvert tilfelle ble det resulterende medium undersøkt både med hensyn på interferon-e og nærvær av resterende virus. Ingen av prøvene viste noen viral aktivitet, og hver prøve inneholdt den samme mengde av interferon-e-aktivitet.

Eksempel 4

Effekten av kulturalder av keratinocytter og en flerhet av- infeksjoner av det induserende virus på produksjonen av e-interferon ble studert. Resultatene er oppsummert i tabell III,

Tabell IIIviser at, i det minste hva epitelceller av keratinocytt-type angår, yngre celler, d.v.s. nesten sammen-løpende 14-dager gamle celler produserer mer interferon-e enn eldre celler gjør. Dette resultat står i kontrast til forsøkene med andre former av interferon, hvor det typisk finnes at eldre celler produserer høyere titere. Dette fenomen kan delvis forklares ved den karakteristiske akkumulering av keratin i keratinocytt-celler etterhvert som de blir eldre. Tabellen viser også at IFN-e-produksjon er høyest når det anvendes virus-konsentrasjoner (flertall av infeksjoner) i området 5-20.

Eksempel 5

Ufraksjonert interferon-e ble først sentrifugert ved

30OG i 20 minutter. Supernatanten ble blandet kant-over-kant på en Fisher Rotarack med regulert poreglass (C.P.G.)

(Electronucleoni.es, Inc.) ved 4°C. 0,2 8 g regulert pore-

glass ble anvendt pr. 30 ml av kultur-supernatant. Etter 3 timer ble supernatanten fjernet og de regulerte pore-glass-perler ble pakket i en kolonne (2,5 x 3,1 cm). Kolonnen ble først vasket med 4 kolonne-volumer av PBS fulgt av 4 kolonne-volumer av 1,0M NaCl-20mM fosfatpuffer, pH 7,4. Interferon-e ble eluert med 4 kolonne-volumer av 50 vol.% etylenglykol -1,0M NaCl-20 mM fosf atpuf fer, pH 7,4 . og oppsamlet i. samme volum av 1,0M NaCl-20 mM fosfatpuffer slik at man fikk en slutt-konsentrasjon av etylenglykol på 25%. Den interferon-e-holdige fraksjon ble konsentrert ved ultrafiltrering til 1,0-1,6 ml og påført en polyakrylamid-agarose (Ultragel) AcA54)-kolonne

(1,6 x 85 cm) bragt i. likevekt med 25 vol.% etylenglykol -1,0 M NaCl-20 mM fosfatpuffer, pH 7,4. Interferon-e ble deretter eluert med likevektsdannende puffer ved en strømningshastighet på 6,0 ml pr. time.

Interferon-e kan renses og konsentreres ved affinitets-kromatografi på et antall av immobili.serte ligander. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, reaktiv rød agarose, fenylsefarose (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), procion rød agarose, fenylagarose (BRL, Gaithersburg, Md), Glycogel B,

N-(3-karboksypropi.onyl) ami.nodekan (CPAD)-agarose og N-pyro-mellitylaminodekan (PMAD)-agarose (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.). Interferon-e kan også renses på en kolonne som inneholder

immobilisert anti-interferon-e.

Eksempel 6

Epitel-interferon-materialer produsert i henhold til eksempel 1 og delvis renset i henhold til eksempel 5, ble utsatt for molekylvektanalyse ved hjelp av SDS-gel-elektroforese ved metoden til Lamelli. Prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 1 time i nærvær av 1,0% SDS, 0,05M tris-HCl (pH 6,8) puffer, 10 vol.% glycerol og 0,001% bromfenol-blått, påført på 12,5%ige polyakrylamidgeler og kjørt i tilnærmet 16 timer. Etter elektroforese ble de spor som inneholdt molekylvektstandardene farvet. Interferon-holdige spor ble delt opp i 3 mm skiver og ekstrahert ved rysting med 0,5 ml PBS som inneholdt 0,5% SDS, i 20 timer ved romtemperatur. Analyser av disse fraksjoner ble utført,

og molekylvekten til hovedaktivitetstoppen som ble assosiert med interferon-e ble beregnet til å være tilnærmet 20.000 ved sammenligning av dens posisjon på gelen med molekylvektstandardene .

I fig. 1 er interferon-e-aktiviteten vist tydelig i.

AR epitel (keratinocytt)-celler. Det protein som tilsvarer epitel-akti.viteten har en tilsynelatende molekylvekt på ca. 20.000 og er også dramatisk redusert i aktivitet ved behandling med 6-merkaptoetanol.

Etter å ha demonstrert eksistensen av en ny type av interferon og beskrevet produksjon av det, samt dets rensning og karakterisering, skulle det være klart for fagmannen på området at han kan gjøre diverse forandringer, modifikasjoner eller tilføyelser til de metoder og materialer som her læres, uten å avvike fra de følgende kravs ånd eller ramme.

Claims (10)

1. Interferonpreparat som har antiviral aktivitet, karakterisert ved at: i) det er laget av en levende celle som inneholder et gen som er aktivt i epitelceller fra menneske; ii) dets antivirale aktivitet er spesifikk for epitelceller fra menneske; iii) det er antigent forskjellig fra interferon-a, interferon-p og interferon-y; og i.v) dets antivirale aktivitet er stabil ved pH 2.

2. Interferonpreparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at den levende celle er en keratinocyttcelle fra menneske.

3. Interferonpreparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at cellen omfatter en celle hvor det gen som er aktivt i epitelceller fra menneske er et eksogent gen innført ved rekombinant-DNA-teknikker.

4. Interferonpreparat som angitt i krav 1, karakterisert ved at det har en molekylvekt på ca. 20.000 ved SDS-polyakrylamidgel-elektroforese.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et interferon, karakterisert ved at det omfatter følgende trinn: A. å produsere en kultur av levende celler som inneholder et gen som er aktivt i. epitelceller fra menneske; B. å inkubere de nevnte celler i et medium under betingelser som fremkaller syntese av interferon; C. å høste nevnte medium; og D. å rense et interferon fra nevnte medium, hvor interferonet i) er laget av en levende celle som inneholder et gen som er aktivt i epitelceller fra menneske; ii) har en antiviral aktivitet som er spesifikk for epitelceller fra menneske; iii) er antigent forskjellig fra interferon a, interferon og interferon y; og iv) har en antiviral aktivitet som er stabil ved pH 2.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at kulturen av levende celler er en kultur av epitelceller fra menneske, og at, før trinn B, et virus anvendes for å indusere de nevnte celler til å produsere nevnte interferon.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at cellekulturen oppdyrkes fra human-keratinocytter.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at kulturen omfatter celler som inneholder et eksogent gen som er aktivt i human-epitelceller.

9. Fremgangsmåte som angitt i. krav 5, karakterisert ved at en forurensning valgt fra gruppen som består av interferon a, interferon 3, interferon y, og blandinger derav er til stede i det hø stede medium, og at rensetrinnet inkluderer det trinn å fjerne aktiviteten til det nevnte kontaminerende interferon.

10. Fremgangsmåte for behandling av epitelceller fra menneske for å inhibere virusinfeksjon, karakterisert ved følgende trinn: å bringe de celler som skal behandles, i kontakt med en effektiv mengde av interferonpreparatet i henhold til krav 1, 2, 3 eller 4 for å inhibere virusinfeksjonen.