JP2002531092A - 腫瘍性細胞成長阻害のための組成物及び方法 - Google Patents

腫瘍性細胞成長阻害のための組成物及び方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、腫瘍性細胞成長阻害のための方法及び組成物に関する。特に、本発明は抗腫瘍組成物及び腫瘍の治療方法に関する。さらに本発明は、成長阻害、例えば抗腫瘍組成物を同定するためのスクリーニング方法に関する。本発明は新規なポリペプチド及びそれらのポリペプチドをコードする核酸分子に係る。またここでは、これらの核酸分子を含むベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチドに結合する抗体、及び本発明のポリペプチドの製造方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、腫瘍性細胞成長を阻害するための方法及び組成物に関する。特に、
本発明は、腫瘍を治療するための抗腫瘍組成物及び方法に関する。さらに本発明
は、成長阻害性、例えば抗腫瘍性化合物を同定するめのスクリーニング方法にも
関する。
【０００２】 （発明の背景） 悪性腫瘍（癌）は、米国において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である
（Boring等, CA Cancel J. Clin., 43: 7 [1993]）。 癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍実体を形成する異常な、又は腫瘍性の細
胞数の増加、これらの腫瘍性腫瘍細胞による隣接組織の侵襲、及び最終的に血液
やリンパ系を介して局所のリンパ節及び離間部位に拡散（転移）する悪性細胞の
生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が成長しない条件下で細胞が
増殖する。癌自体は、異なる侵襲及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々
の形態で顕現する。 近年の癌治療の発達にも関わらず、腫瘍性細胞成長を阻害することのできる新
たな治療薬が大いに必要とされている。従って、本発明の目的は、癌細胞などの
腫瘍細胞の成長を阻害できる化合物を同定することである。
【０００３】 （発明の概要） Ａ． 実施態様 本発明は、腫瘍細胞成長を阻害するための方法及び組成物に関する。より詳細
には、本発明は、哺乳動物患者、好ましくはヒトにおける癌、例えば乳癌、前立
腺癌、直腸癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌及びＣＮＳ癌、白血病、骨髄腫などを含む
腫瘍を治療するための方法及び組成物に関する。 一態様では、本発明は、ここに定義するＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチド、又はそのアゴニストを、製薬的に許容される担体と混合
して含んでなる腫瘍性細胞成長阻害のために有用な物質の組成物に関する。好ま
しい実施態様では、この物質の組成物は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチド、又はそのアゴニストの成長阻害量を含んでいる。他の好
ましい実施態様では、この組成物は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４ポリペプチド、又はそのアゴニストの細胞毒性量を含む。場合によっては、
この物質の組成物は、一又は複数の成長阻害及び／又は細胞毒性及び／又は化学
治療薬を含有してよい。 さらなる態様では、本発明は、ここに定義されるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４
又はＰＲＯ３４４ポリペプチド、又はそのアゴニストの有効量を含んでなる、哺
乳動物における腫瘍を治療するために有用な物質の組成物に関する。この腫瘍は
、好ましくは癌である。
【０００４】 他の態様では、本発明は、前記腫瘍細胞を、ここに定義されるＰＲＯ６５５、
ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド、又はそのアゴニストの有効量に暴
露することを含んでなる、腫瘍細胞の成長を阻害する方法に関する。特別な実施
態様では、アゴニストは、抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ
３４４アゴニスト抗体である。他の実施態様では、アゴニストは、ＰＲＯ６５５
、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子
である。この方法は、インビトロ又はインビボで実施される。 またさらなる実施態様では、本発明は、 （ａ）容器；及び （ｂ）当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物；ここで、当該組成物
は新生細胞成長、例えば腫瘍細胞成長を阻害するのに有用であり、当該組成物中
の活性剤は、ここに定義されるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチド又はそのアゴニストである；そして （ｃ）前記ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３５４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又はそ
のアゴニストの腫瘍性細胞成長の阻害のための用途について言及する前記容器に
貼付されたラベル又は前記容器に収容される包装挿入物とを具備し、当該アゴニ
ストがＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドに結合する抗
体であってもよい製造品に関する。特別な実施態様では、アゴニストは、抗-Ｐ
ＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４アゴニスト抗体である。他
の実施態様では、アゴニストは、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
ポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である。ここに定義されるＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド、またはそのアゴニストを
腫瘍の治療に有効な量で含有する類似の製造品も本発明の範囲内に包含される。
また、ここに定義されるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チド、又はそのアゴニストを含み、さらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治
療薬を付加的に含む製造品も本発明の範囲内である。
【０００５】 Ｂ． さらなる実施態様 一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示する全長アミノ酸配列
、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナ
ルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する
全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４
又はＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤ
ＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくと
も約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８
４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約８６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の
配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、より好ましくは
少なくとも約８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同
一性、より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、
より好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約
９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、より好
ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％
の配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有す
るヌクレオチド配列を含む。
【０００６】 他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示する全長ＰＲＯ６５
５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドｃＤＮＡコード化配列、ここに
開示するシグナルペプチドを欠くＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
ポリペプチドのコード化配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫
通ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの細胞外ドメイン
のコード化配列、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断
片のコード化配列を持つＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対
して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同
一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、
より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約
８６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、より好
ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％
の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましく
は少なくとも約９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の配列
同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、より好ましくは少な
くとも約９４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性
、より好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも
約９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そし
て、より好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含む。
【０００７】 さらなる態様では、本発明は（ａ）ここに開示するＡＴＣＣに寄託されたヒト
タンパク質ｃＤＮＡの任意のものにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも
約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約８２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の
配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、より好ましくは
少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の配列同
一性、より好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、
より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約
９１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、より好
ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％
の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、より好ましく
は少なくとも約９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の配列
同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そして、より好まし
くは少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む単離され
た核酸分子に関する。
【０００８】 本発明の他の態様は、膜貫通ドメインが欠失しているか又は膜貫通ドメインが
不活性化されているＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列、又はそのようなコード化ヌクレオチド配列に相
補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供し、そのようなポリペ
プチドの膜貫通ドメインはここに開示される。従って、ここに記載されるＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが
考慮される。
【０００９】 他の実施態様はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドコ
ード化配列の断片、又はその補体に向けられ、それらは、例えば、場合によって
は抗-ＰＲＯ６５５、抗-３６４又は抗-３４４抗体に対する結合部位を含むポリ
ペプチドをコードするＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチ
ドのコード化断片のハイブリッド形成プローブとして、又はアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドプローブとしての用途が見いだされる。このような核酸断片は、通
常は少なくとも約２０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチ
ド長、より好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長、より好ましくは少なく
とも約５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド長、
より好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約
８０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より好
ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１１
０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より好
ましくは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１４
０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より好
ましくは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１７
０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より好
ましくは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２０
０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、より好
ましくは少なくとも約３００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約３５
０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約４００ヌクレオチド長、より好
ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約５０
０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より好
ましくは少なくとも約７００ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約８０
０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約９００ヌクレオチド長、より好
ましくは少なくとも約１０００ヌクレオチド長であり、ここで「約」という語の
内容は参照する長さのプラス又はマイナス１０％のヌクレオチド配列長を指すこ
とを意味する。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドコー
ド化ヌクレオチド配列の新規な断片は、多くの良く知られた配列アラインメント
プログラムの任意のものを用いてＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
ポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の公知のヌクレオチド配列とを整列
させ、いずれのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドコー
ド化ヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより、日常的な手法
で同定してもよい。このようなＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドコード化ヌクレオチド配列は全てここで考慮される。また、これらの
ヌクレオチド分子断片、好ましくは抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４又は抗-
ＰＲＯ３４４抗体に対する結合部位を含むＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチド断片によってコードされるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又
はＰＲＯ３４４ポリペプチド断片も考慮される。
【００１０】 他の実施態様では、本発明は、上記で特定された単離された核酸配列の任意の
ものにコードされる単離されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドを提供する。 或る態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示する
シグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は
無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列
の特に同定された他の断片を持つＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
ポリペプチドに対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも
約８１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、より
好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４
％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好まし
くは少なくとも約８６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の配
列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、より好ましくは少
なくとも約８９％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一
性、より好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、より好ましくは少なくと
も約９２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９
５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約９７％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の
配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する
アミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドに関する。
【００１１】 さらなる態様では、本発明は、ここに開示するＡＴＣＣに寄託されたヒトタン
パク質ｃＤＮＡの任意のものにコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約
８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、より好まし
くは少なくとも約８２％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の配
列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、より好ましくは少
なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の配列同一
性、より好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、より好ましくは少なくと
も約８８％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９
１％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、より好ま
しくは少なくとも約９３％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の
配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、より好ましくは
少なくとも約９６％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の配列同
一性、より好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、そして、より好ましく
は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲ
Ｏ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドに関する。
【００１２】 さらなる態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示
するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有
又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸
配列の特に同定された他の断片を持つＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４ポリペプチドと比較したときに、少なくとも約８０％ポジティブ、好ましく
は少なくとも約８１％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８２％ポジティ
ブ、より好ましくは少なくとも約８３％ポジティブ、より好ましくは少なくとも
約８４％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ま
しくは少なくとも約８６％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約８７％ポジ
ティブ、より好ましくは少なくとも約８８％ポジティブ、より好ましくは少なく
とも約８９％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、より
好ましくは少なくとも約９１％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９２％
ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９３％ポジティブ、より好ましくは少
なくとも約９４％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９５％ポジティブ、
より好ましくは少なくとも約９６％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９
７％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９８％ポジティブ、そして、より
好ましくは少なくとも約９９％ポジティブのスコアとされるアミノ酸配列を含む
単離されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドに関する
。
【００１３】 特別な実施態様では、本発明は、Ｎ-末端シグナル配列及び／又は開始メチオ
ニンを持たず、上記したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によ
ってコードされる単離されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリ
ペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は
、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯ６５５、ＰＲ
Ｏ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培
地からＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドを回収するこ
とを含む。 本発明の他の態様は、膜貫通ドメインの欠失した又は膜貫通ドメインが不活性
化された、単離されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチ
ドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当
なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６
４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地から
ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドを回収することを含
む。
【００１４】 さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然ＰＲＯ６５５、Ｐ
ＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドのアゴニストに関する。特別な実施態
様では、アゴニストは抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４又は抗-ＰＲＯ３４４
アゴニスト抗体又は小分子である。 さらなる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４ポリペプチドのアゴニストを同定する方法に関し、それは、ＰＲＯ６５５、
ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドによって媒介される生物学
的活性を監視することを含む。好ましくは、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰ
ＲＯ３４４ポリペプチドは天然ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドである。 さらに他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ
３４４ポリペプチド、又はここに記載するＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチドのアゴニスト、又は抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４又
は抗-ＰＲＯ３４４アゴニスト抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成
物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。 本発明の他の実施態様は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリ
ペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト、又は抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲ
Ｏ３６４又は抗-ＰＲＯ３４４アゴニスト抗体の、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４
又はＰＲＯ３４４ポリペプチド、そのアゴニスト又は抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲ
Ｏ３６４又は抗-ＰＲＯ３４４アゴニスト抗体に起因する状態の治療において有
用な医薬の調製のための使用に向けられる。
【００１５】 本発明の他の実施態様では、本発明は、ここに記載するポリペプチドの任意の
ものをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。そのようなベクターの任意
のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌
、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞であってよい。ここに記載する任意のポ
リペプチドの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチ
ドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収する
ことを含む。 他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した
、ここに記載する任意のポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。その
ようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンのＦｃ領域に
融合したここに記載の任意のポリペプチドを含む。 他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特
異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、
ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。 さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列又
はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、
それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導され
うる。
【００１６】 （本発明の詳細な説明） ここで使用される際の「ＰＲＯ６５５」、「ＰＲＯ３６４」又は「ＰＲＯ３４
４」ポリペプチド又はタンパク質は、天然配列ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又は
ＰＲＯ３４４及びＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体（ここで
更に定義される）を包含する。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源からといった種々の供給源から単離し
ても、組換え及び／又は合成法により調製してもよい。 「天然配列ＰＲＯ６５５」、「天然配列ＰＲＯ３６４」又は「天然配列ＰＲＯ
３４４」は、自然から誘導されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然
配列ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドは、自然から単
離でき、又は組換え及び／又は合成手段によって製造できる。「天然配列」ＰＲ
Ｏ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４という用語には、特に、ＰＲＯ６５５
、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態
（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にス
プライシングされた形態)及び自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発
明の一実施態様では、天然配列ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドは、各々Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）又は
Ｆｉｇ６（配列番号：１７）に示される成熟又は全長の天然配列ＰＲＯ６５５、
ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドである。また、Ｆｉｇ２（配列番号
：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）又はＦｉｇ６（配列番号：１７）に各々開示
されるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドは、そこでア
ミノ酸位置１と名付けられるメチオニン残基で開始することが示されるが、各々
Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）又はＦｉｇ６（配列番号
：１７）におけるアミノ酸位置１より上流又は下流何れかに位置する他のメチオ
ニンがＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの開始アミノ
酸残基として用いられることも考えられ可能である。
【００１７】 ここに開示される「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ド
メインを実質的に有しないポリペプチドの形態を意味する。通常、ポリペプチド
ＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそ
のようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のポリペプチドについて
同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために
当該分野において日常的に使用される基準に従い決定されることが理解されるで
あろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定され添付の図
面に示されるドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高
い。このように、本発明の一実施態様では、本発明のポリペプチドの細胞外ドメ
インは成熟アミノ酸配列のアミノ酸１〜Ｘを含み、ここでＸは細胞外ドメイン／
膜貫通ドメイン境界の何れかの側の５アミノ酸以内の任意のアミノ酸である。 ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位
置は、添付の図面に示す。しかし、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しう
るが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの
側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境
界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準
に従って同定しうることを注記する（例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1-6
(1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに
、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に
均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチド
がここに定義されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ
酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリ
ヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００１８】 「ＰＲＯ６５５変異体ポリペプチド」は、以下に定義するような（天然配列Ｐ
ＲＯ６５５ポリペプチド以外の）活性なＰＲＯ６５５ポリペプチドを意味し、（
ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示すＰＲＯ６５５ポリペプチドの残基１又は約
２２〜２０８、（ｂ）ＸがＦｉｇ２（配列番号：２）の１７〜２６の任意のアミ
ノ酸残基である場合のＦｉｇ２（配列番号：２）に示すＰＲＯ６５５のＸ〜２０
８、又は（ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列の特異的誘導断片
のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。 「ＰＲＯ３６４変異体ポリペプチド」は、以下に定義するような（天然配列Ｐ
ＲＯ３６４ポリペプチド以外の）活性なＰＲＯ３６４ポリペプチドを意味し、（
ａ）Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示すＰＲＯ３６４ポリペプチドの残基１又は約
２６〜２４１、（ｂ）ＸがＦｉｇ４（配列番号：７）の２１〜３０の任意のアミ
ノ酸残基である場合のＦｉｇ４（配列番号：７）に示すＰＲＯ３６４のＸ〜２４
１、（ｃ）ＸがＦｉｇ４（配列番号：７）のアミノ酸１５８〜アミノ酸１６７の
任意のアミノ酸である場合のＦｉｇ４（配列番号：７）の１又は約２６〜Ｘ、又
は（ｄ）Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示すアミノ酸配列の特異的誘導断片のアミ
ノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。 「ＰＲＯ３４４変異体ポリペプチド」は、以下に定義するような（天然配列Ｐ
ＲＯ３４４ポリペプチド以外の）活性なＰＲＯ３４４ポリペプチドを意味し、（
ａ）Ｆｉｇ６（配列番号：１７）に示すＰＲＯ３４４ポリペプチドの残基１又は
約１６〜２４３、（ｂ）ＸがＦｉｇ６（配列番号：１７）の１１〜２０の任意の
アミノ酸残基である場合のＦｉｇ６（配列番号：１７）に示すＰＲＯ３４４のＸ
〜２４３、又は（ｃ）Ｆｉｇ６（配列番号：１７）に示すアミノ酸配列の特異的
誘導断片のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有
する。 このようなＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４変異体は、例えば、
Ｎ-又はＣ-末端、並びに天然配列の一又は複数の内部ドメイン内において一又は
複数のアミノ酸残基が付加、又は欠失されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰ
ＲＯ３４４ポリペプチドを含む。
【００１９】 通常、ＰＲＯ６５５変異体は（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示すＰＲＯ６
５５ポリペプチドの残基１又は約２２〜２０８、（ｂ）ＸがＦｉｇ２（配列番号
：２）の１７〜２６の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ２（配列番号：２
）に示すＰＲＯ６５５のＸ〜２０８、又は（ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示
すアミノ酸配列の特異的誘導断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性
、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミ
ノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９
％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２０】 通常、ＰＲＯ３６４変異体は、（ａ）Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示すＰＲＯ
３６４ポリペプチドの残基１又は約２６〜２４１、（ｂ）ＸがＦｉｇ４（配列番
号：７）の２１〜３０の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ４（配列番号：
７）に示すＰＲＯ３６４のＸ〜２４１、（ｃ）ＸがＦｉｇ４（配列番号：７）の
アミノ酸１５８〜アミノ酸１６７の任意のアミノ酸である場合のＦｉｇ４（配列
番号：７）の１又は約２６〜Ｘ、又は（ｄ）Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示すア
ミノ酸配列の特異的誘導断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好
ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸
配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸
配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸
配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸
配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の
アミノ酸配列同一性を有する。
【００２１】 ＰＲＯ３４４変異体は、（ａ）Ｆｉｇ６（配列番号：１７）に示すＰＲＯ３４
４ポリペプチドの残基１又は約１６〜２４３、（ｂ）ＸがＦｉｇ６（配列番号：
１７）の１１〜２０の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ６（配列番号：１
７）に示すＰＲＯ３４４ポリペプチドのＸ〜２４３、又は（ｃ）Ｆｉｇ６（配列
番号：１７）に示すアミノ酸配列の特異的誘導断片と、少なくとも約８０％のア
ミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より
好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ
酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より
好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ
酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より
好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ
酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より
好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ
酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より
好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは
少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００２２】 通常は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体ポリペプチドは
、少なくとも約１０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より
多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、
より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸
長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミ
ノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１０
０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくと
も約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約２５０アミノ酸長、より多くは
少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。 以下に示すように、表１はALIGN-2配列比較コンピュータプログラムの安全な
ソースコードを与える。このソースコードは、UNIX（登録商標）オペレーティン グシステムでの使用のために日常的にコンパイルされ、ALIGN-2配列比較コンピ ュータプログラムを与える。 さらに、表２Ａ-２Ｄは、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いた％
アミノ酸配列同一性（表２Ａ-２Ｂ）及び％核酸配列同一性（表２Ｃ-２Ｄ）を決
定するために下記の方法を使用した仮説的例示を示す図であり、「ＰＲＯ」は対
象とする仮説的ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドのア
ミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象とする「ＰＲＯ」ポリペプチドが
比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「ＰＲＯ-ＤＮＡ」は対象とす
る仮説的ＰＲＯ６５５-、ＰＲＯ３６４-又はＰＲＯ３４４-コード化核酸配列を
示し、「比較ＤＮＡ」は対象とする「ＰＲＯ-ＤＮＡ」核酸分子が比較される核
酸分子のヌクレオチド配列を示し、「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々異なる仮説
的アミノ酸残基を示し、「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」は各々異なる仮説的ヌクレオ
チドを示す。
【００２３】
【００２４】
【００２５】
【００２６】
【００２７】
【００２８】
【００２９】
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【００３８】
【００３９】
【００４０】
【００４１】
【００４２】
【００４３】
【００４４】 ここに定義されるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大
のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的
置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰ
ＲＯ３４４配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセ
ントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための
アラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST
-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能
なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であ
れば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必
要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメ
ータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配
列同一性値は、以下に記載するように、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコ
ードが表１に与えられている配列比較プログラムALIGN-2を用いて得られる。ALI
GN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１
に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用
書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。A
LIGN-2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入
手可能であり、また表１に与えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIG
N-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4
.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2
プログラムによって設定され変動しない。
【００４５】 ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸
配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたア
ミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は
含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメン
トによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全
アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる
場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列
同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列
同一性の計算の例として、表２Ａ-２Ｂは、「比較タンパク質」と称されるアミ
ノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の
計算方法を示す。
【００４６】 特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のように
ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％
アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic
Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配
列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NC
BI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては
初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最
小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５
、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリ
クス＝BLOSUM62を含む。
【００４７】 アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸
配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同
一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％
アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともでき
る）は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアライン
メントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢ
の全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異
なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸
配列同一性とは異なることは理解されるであろう。 さらに、％アミノ酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Al
tschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定しても
よい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定さ
れない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパ
ン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、
及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％アミノ酸配
列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象
とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即
ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であ
ってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸
残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によ
って決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ
酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」
という表現では、アミノ酸配列Ａが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ
酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００４８】 「ＰＲＯ６５５変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ６５５変異体核酸配列
」は、以下に定義するような活性なＰＲＯ６５５ポリペプチドをコードする核酸
分子を意味し、（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示すＰＲＯ６５５ポリペプチ
ドの残基１又は約２２〜２０８をコードする核酸配列、（ｂ）ＸがＦｉｇ２（配
列番号：２）の１７〜２６の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ２（配列番
号：２）に示すＰＲＯ６５５ポリペプチドのアミノ酸Ｘ〜２０８をコードする核
酸配列、又は（ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列の他の特異的
誘導断片をコードする核酸配列のいずれかに対して少なくとも約８０％の核酸配
列同一性を有する。通常、ＰＲＯ６５５変異体ポリヌクレオチドは、（ａ）Ｆｉ
ｇ２（配列番号：２）に示すＰＲＯ６５５ポリペプチドの残基１又は約２２〜２
０８をコードする核酸配列、（ｂ）ＸがＦｉｇ２（配列番号：２）の１７〜２６
の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ２（配列番号：２）に示すＰＲＯ６５
５ポリペプチドのアミノ酸Ｘ〜２０８をコードする核酸配列、又は（ｃ）Ｆｉｇ
２（配列番号：２）に示すアミノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸
配列のいずれかと少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも
約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一
性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少な
くとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の
核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９
１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、
より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少
なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸
配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有
している。ＰＲＯ６５５ポリヌクレオチド変異体は、天然のＰＲＯ６５５ヌクレ
オチド配列を含まない。
【００４９】 「ＰＲＯ３６４変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ３６４変異体核酸配列
」は、以下に定義するような活性なＰＲＯ３６４ポリペプチドをコードする核酸
分子を意味し、（ａ）Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示すＰＲＯ３６４ポリペプチ
ドの残基１又は約２６〜２４１をコードする核酸配列、（ｂ）ＸがＦｉｇ４（配
列番号：７）の２１〜３０の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ４（配列番
号：７）に示すＰＲＯ３６４ポリペプチドのアミノ酸Ｘ〜２４１をコードする核
酸配列、（ｃ）ＸがＦｉｇ４（配列番号：７）のアミノ酸１５８〜アミノ酸１６
７の任意のアミノ酸である場合のＦｉｇ４（配列番号：７）のアミノ酸１又は約
２６〜Ｘをコードする核酸配列、又は（ｄ）Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示すア
ミノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかに対して少な
くとも約８０％の核酸配列同一性を有する。通常、ＰＲＯ３６４変異体ポリヌク
レオチドは、（ａ）Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示すＰＲＯ３６４ポリペプチド
の残基１又は約２６〜２４１をコードする核酸配列、（ｂ）ＸがＦｉｇ４（配列
番号：７）の２１〜３０の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ４（配列番号
：７）に示すＰＲＯ３６４ポリペプチドのアミノ酸Ｘ〜２４１をコードする核酸
配列、（ｃ）ＸがＦｉｇ４（配列番号：７）のアミノ酸１５８〜アミノ酸１６７
の任意のアミノ酸である場合のＦｉｇ４（配列番号：７）のアミノ酸１又は約２
６〜Ｘをコードする核酸配列、又は（ｄ）Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示すアミ
ノ酸配列の他の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかと少なくとも約
８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、よ
り好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも
約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一
性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少な
くとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配
列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましく
は少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の
核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好
ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９
３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、
より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、より好ま
しくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。ＰＲＯ３６４ポリヌ
クレオチド変異体は、天然のＰＲＯ３６４ヌクレオチド配列を含まない。
【００５０】 「ＰＲＯ３４４変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ３４４変異体核酸配列
」は、以下に定義するような活性なＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードする核酸
分子を意味し、（ａ）Ｆｉｇ６（配列番号：１７）に示すＰＲＯ３４４ポリペプ
チドの残基１又は約１６〜２４３をコードする核酸配列、（ｂ）ＸがＦｉｇ６（
配列番号：１７）の１１〜２０の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ６（配
列番号：１７）に示すＰＲＯ３４４ポリペプチドのアミノ酸Ｘ〜２４３をコード
する核酸配列、又は（ｃ）Ｆｉｇ６（配列番号：１７）に示すアミノ酸配列の他
の特異的誘導断片をコードする核酸配列のいずれかに対して少なくとも約８０％
の核酸配列同一性を有する。通常、ＰＲＯ３４４変異体ポリヌクレオチドは、（
ａ）Ｆｉｇ６（配列番号：１７）に示すＰＲＯ３４４ポリペプチドの残基１又は
約１６〜２４３をコードする核酸配列、（ｂ）ＸがＦｉｇ６（配列番号：１７）
の１１〜２０の任意のアミノ酸残基である場合のＦｉｇ６（配列番号：１７）に
示すＰＲＯ３４４ポリペプチドのアミノ酸Ｘ〜２４３をコードする核酸配列、又
は（ｃ）Ｆｉｇ６（配列番号：１７）に示すアミノ酸配列の他の特異的誘導断片
をコードする核酸配列のいずれかと、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好
ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８
２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、
より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくと
も約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同
一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少
なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸
配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好まし
くは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％
の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より
好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約
９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性
、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なく
とも約９８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の
核酸配列同一性を有している。ＰＲＯ３４４ポリヌクレオチド変異体は、天然の
ＰＲＯ３４４ヌクレオチド配列を含まない。
【００５１】 通常は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体ポリヌクレオチ
ドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオ
チド長、より多くは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約
１２０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多
くは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレ
オチド長、より多くは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より多くは少なくと
も約２７０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約３００ヌクレオチド長、よ
り多くは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６００ヌ
クレオチド長、より多くは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上で
ある。
【００５２】 ここに定義されるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４ポリペプチド
-コード化核酸配列に対して同定されている「パーセント(％)核酸配列同一性」
は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙
を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯ６
５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドコード化配列のヌクレオチド
と同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセ
ント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の
範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(D
NASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用
することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対し
て最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、ア
ラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しか
し、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、以下に記載するように、
ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが表１に与えられている配列比較プ
ログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは
ジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権事務
所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録
番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、So
uth San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、また表１に与
えたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペ
レーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパ
イルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定さ
れ変動しない。
【００５３】 ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄと
の、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、
又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ
酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメン
トによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全
ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、Ｃ
のＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なる
ことは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例とし
て、表２Ｃ-２Ｄは、「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ-ＤＮＡ」と
称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００５４】 特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は上記のようにALIG
N-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸
配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids R
es. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プ
ログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAS
T2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に
設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合
長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギ
ャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BL
OSUM62を含む。
【００５５】 配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与
えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与え
られた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は
含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｗ／Ｚの１００倍 ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアライン
メントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ＺはＤ
の全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合
、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異
なることは理解されるであろう。 さらに、％核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altsch
ul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい
。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されな
い、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝
１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及び
スコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％核酸配列同一性
値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有
する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化配列の核酸配列と、対象とする比較
核酸分子（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の配列が比較
される変異体ポリヌクレオチドであってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によ
って決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペ
プチドコード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例え
ば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持
っている核酸配列Ａを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配
列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプ
チドコード化核酸分子の核酸配列である。
【００５６】 他の実施態様では、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体ポリ
ヌクレオチドは、各々活性なＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリ
ペプチドをコードする核酸分子であり、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び
洗浄条件下で、各々Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示す全長ＰＲＯ６５５ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列、Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示す全長ＰＲ
Ｏ３６４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、Ｆｉｇ６（配列番号：１
７）に示す全長ＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイ
ブリッド形成できる。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体ポリ
ペプチドは、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体ポリヌクレオ
チドにコードされるものであってもよい。
【００５７】 上記のように実施されるアミノ酸配列同一性比較の文脈における「ポジティブ
（陽性）」という用語は、比較された配列において同一であるアミノ酸残基ばか
りでなく特性を有するものも含む。対象とするアミノ酸残基に対してポジティブ
値をスコアされるアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又
は対象とするアミノ酸残基の（下記の表３で特定するように）好ましい置換とさ
れるものである。 ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配
列Ｂとの、又はそれに対する％ポジティブ値（あるいは、与えられたアミノ酸配
列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたア
ミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される： 分率Ｘ／Ｙの１００倍 ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメン
トによってポジティブであるとのスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全
アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる
場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なる
ことは理解されるであろう。
【００５８】 「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために
使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収され
たポリペプチドを意味する。好ましくは、単離されたポリペプチドは、それに自
然に付随する全ての付随物を持たない。その自然環境の汚染成分とは、そのポリ
ペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホル
モン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施
態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用
することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得る
のに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を
用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製さ
れる。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４ポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え
細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離され
たポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００５９】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードする「単
離された」核酸分子又は抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３
４４抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、ＰＲＯ６５５、Ｐ
ＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４コード化核酸又は抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６
４、又は抗-ＰＲＯ３４４コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも
１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核
酸は、それに自然に付随する全ての成分が付随していない。単離されたＰＲＯ６
５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４コード化核酸分子又は単離された抗-ＰＲ
Ｏ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４コード化核酸分子は、天然に
見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は
、天然の細胞中に存在するＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４コード
化核酸分子又は抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４コー
ド化核酸分子とは区別される。しかし、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ
３４４ポリペプチドをコードする単離された核酸分子又は抗-ＰＲＯ６５５、抗-
ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４抗体をコードする単離された核酸分子は、
例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にある、通常はＰＲ
Ｏ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又は抗-ＰＲＯ６５５、
抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４抗体を発現する細胞に含まれるＰＲＯ６
５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４-核酸分子又は抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲ
Ｏ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４抗体-核酸分子を含む。
【００６０】 「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード化配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を意味する。例えば、原核
生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配
列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリア
デニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。 核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合」してい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡ
に作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影
響を及ぼすならば、コード化配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結
合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード化配列と
作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合し
たＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェー
ズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要は
ない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような
部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプ
ターあるいはリンカーが使用される。
【００６１】 「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に、例えば単一の抗
-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４モノクローナル抗体(ア
ゴニスト抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗-ＰＲＯ６５５、抗-Ｐ
ＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４抗体組成物、一本鎖抗-ＰＲＯ６５５、抗-Ｐ
ＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４抗体、及び抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６
４、又は抗-ＰＲＯ３４４抗体断片（下記参照）を包含している。ここで使用さ
れる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわ
ち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異
を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
【００６２】 ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般
的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に
、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブ
が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその
融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニール
する能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相
同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い
相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。
さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる
詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley
Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。 ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄の
ために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム
／0.0015Mのクエン酸ナトリウム／0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの
；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において
50%（v/v）ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン／0.1%フィコール／0.1%のポ
リビニルピロリドン／50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの
塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）42℃における50
%ホルムアミド、5xＳＳＣ（0.75MのＮａＣｌ、0.075Mのクエン酸ナトリウム）、
50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハー
ド液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（50μg/ml）、0.1%ＳＤＳ、及び10%のデキス
トラン硫酸と、42℃における0.2xＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム
）中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるＥＤＴＡを含む0
.1xＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。 「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同
定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温
度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、20%ホル
ムアミド、5xＳＳＣ（150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナトリウム）、50mM
リン酸ナトリウム（pH7.6）、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg
/mLの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション
、次いで1xＳＳＣ中37-50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者
であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温
度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００６３】 「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチ
ド」に融合したＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドを含
んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され
得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供す
るに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯポリペプチド
の活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、
抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適
切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜
約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０のアミノ酸残基)を有する。 ここで用いる「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメイ
ンのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を
付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及
び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫
グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへ
シン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近
接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は
、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（Ｉｇ
Ａ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロ
ブリンから得ることができる。
【００６４】 ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯ６
５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持
するＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の形態を意味し、ここで「生
物学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４によって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天
然発生ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドが有する抗原
性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活
性とは、天然又は天然発生ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４が有す
る抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。 ここに開示されるスクリーニングアッセイによって同定できる抗体又は他のア
ゴニスト分子（例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等）の文脈における「生
物学的活性」は、それらの分子が、「治療的有効量」の定義に関連してここに列
挙する効果の一以上を発揮する能力を指すのに使用される。特別な実施態様では
、「生物学的活性」は、腫瘍性細胞成長又は増殖を阻害する能力である。好まし
い生物学的活性は、標的腫瘍（例えば癌）細胞の成長の遅延又は完全な停止を含
む阻害である。他の好ましい生物学的活性は、標的腫瘍（例えば癌）細胞の死を
もたらす細胞毒性活性である。さらに他の好ましい生物学的活性は、標的腫瘍（
例えば癌）細胞のアポトーシスの誘発である。
【００６５】 「免疫学的活性」という語は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープとの免疫学的交差反応性を意味する
。 ここで用いられる「免疫学的交差反応性」とは、候補ポリペプチドが、この活
性を持つＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの定性的生
物学的活性を、公知の活性ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペ
プチドに対して生じたポリクローナル抗血清と競合的に阻害できることを意味す
る。そのような抗血清は、例えばヤギ又はウサギに、完全フロイントアジュバン
ト中の周知の活性類似物を皮下注射し、次いで不完全フロイント中で腹膜内又は
皮下に追加免疫することにより従来の方法で調製される。免疫学的交差反応性は
好ましくは「特異的」であり、これは同定される免疫学的交差反応性分子（例え
ば抗体）の対応するＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
に対する結合親和性が、その分子の他の任意の知られた天然ポリペプチドに対す
る結合親和性より有意に高い（好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少
なくとも約４倍、さらにより好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少な
くとも約８倍高い）ことを意味する。
【００６６】 ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞
成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。 「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴と
する、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに
限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含
まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮
細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸
管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、
腎臓癌、肝臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌
が含まれる。
【００６７】 「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変更の本発明で実施される介入であ
る。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治
療が必要なものは、既に疾患に罹っているもの並びに疾患が防止されるべきもの
を含む。腫瘍（例えば、癌）治療では、治療薬は直接的に腫瘍細胞の病理を低下
させてもよいし、又は腫瘍細胞を他の治療媒介物、例えば放射線及び／又は化学
治療に対してより敏感にしてもよい。 癌の「病理」は、患者の良好な生存を危うくさせる全ての現象を含む。これは
、限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の
正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌生成物の異常レベルでの放出、炎症
又は免疫反応の抑制又は悪化などを含む。
【００６８】 ここに開示されるポリペプチド又はそのアゴニストの「有効量」とは、腫瘍性
細胞成長、腫瘍成長に関しては、標的細胞の成長を或る程度まで阻害できる量で
ある。この用語は、標的細胞の成長阻害、細胞分裂停止及び／又は細胞毒性効果
及び／又はアポトーシスを誘発することのできる量を含む。腫瘍性細胞成長の阻
害の目的のためのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又
はそのアゴニストの「有効量」は、経験的に日常的手法で決定できる。 「治療的有効量」は、腫瘍の治療に関しては、次の効果：（１）遅延化及び完
全な成長停止を含む、腫瘍成長の或る程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（
３）腫瘍サイズの縮小；（４）腫瘍細胞の末梢器官への浸潤の阻害（即ち、減少
、遅延化又は完全な停止）；（５）転移の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な
停止）；（６）抗腫瘍免疫反応の促進、これは、腫瘍の退行又は拒絶をもたらし
てもよいが、必ずしも必要ではない；及び／又は（７）疾患に伴う徴候の１つ又
は複数の或る程度の軽減の１つ又は複数を誘起することのできる量を意味する。
腫瘍の治療の目的のためのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペ
プチド又はそのアゴニストの「治療的有効量」は、経験的に日常的手法で決定で
きる。
【００６９】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又はそのアゴニス
トの「成長阻害量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞の成長をインビトロ又は
インビボで阻害できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＰＲＯ６
５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又はそのアゴニストの「成長
阻害量」は、経験的に日常的手法で決定できる。 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又はそのアゴニス
トの「細胞毒性量」は、細胞、特に腫瘍、例えば癌細胞をインビトロ又はインビ
ボで破壊できる量である。腫瘍性細胞成長の阻害の目的のためのＰＲＯ６５５、
ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又はそのアゴニストの「細胞毒性量
」は、経験的に日常的手法で決定できる。
【００７０】 ここで用いられる「細胞毒性薬」なる用語は、細胞の機能を阻害又は抑制する
及び／又は細胞破壊を生ずる物質を意味する。この用語は、放射性同位体（例え
ば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真
菌、植物又は動物由来の酵素的活性毒素といった毒素、又はその断片を含むとさ
れる。 「化学治療薬」は、腫瘍、例えば癌の治療に有用な化合物である。化学治療薬
の例は、アドリアマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、５-フルオロウラ
シル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテ
パ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（Taxol,
Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Taxot
ere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Rance）、トキソテール、メトトレキセー
ト、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシ
ド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、マイトキサントロン、ビンクリスチ
ン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマ
イシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシ
ン（米国特許第4,675,187号）、メルファラン、及び他の関連するナイトロジェ
ンマスタードを含む。また、この定義に含まれるのは、タモキシフェン及びオナ
プリストンなどの腫瘍へのホルモン作用を調節又は阻害するように作用するホル
モン様薬剤である。
【００７１】 ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にここで同定される任意の
遺伝子を過剰発現する癌細胞の成長をインビトロ又はインビボで阻害する化合物
又は組成物を意味する。即ち、成長阻害剤は、Ｓ相でそのような遺伝子を過剰発
現する細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期
を（Ｓ相以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ相停止を誘発する
薬剤を含む。古典的なＭ相ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブ
ラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピル
ビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させ
るこれらの薬剤は、Ｓ相停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば
、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチ
ン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。さらなる
情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter
1, 表題「Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs」, M
urakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特にp13に見出すことができ
る。
【００７２】 「サイトカイン」という用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細
胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイ
トカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモ
ンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモ
ン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモ
ン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシ
ン；糖タンパク質、例えば濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（
ＴＳＨ）、及び黄体化ホルモン（ＬＨ）；肝臓成長因子；線維芽成長因子；プロ
ラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害因子；マ
ウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長
因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ-β等の神経成長因
子；血小板成長因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因
子；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘
発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー
刺激因子（ＣＳＦｓ）、例えばマクロファージ-ＣＳＦ（Ｍ-ＣＳＦ）；顆粒球-
マクロファージ-ＣＳＦ（ＧＭ-ＣＳＦ）；及び顆粒球-ＣＳＦ（Ｇ-ＣＳＦ）；イ
ンターロイキン（ＩＬｓ）、例えばＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、Ｉ
Ｌ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２
；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α及びＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガン
ド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイ
トカインは、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質を含み、天
然配列サイトカインの生物学的な活性等価物である。
【００７３】 この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に
対する細胞毒性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬
的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs i
n Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-3
82, 615th Meeting, Belfast (1986),及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical
Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug delivery, Borchardt
等（編）, pp.247-267, Human Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、こ
れらに限られないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プ
ロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-
アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、任意に置換されたフェ
ノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミ
ド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオ
ロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定するもので
はないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞毒性薬の
例には、前記の化学療法剤が含まれるが、これらに限られない。 「アゴニスト」という用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示する天然の
ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの生物学的活性に類
似する任意の分子を含む。好適なアゴニスト分子は特に、アゴニスト抗体又は抗
体断片、天然のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの断
片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子などを含む。ＰＲＯ６５５、
ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドのアゴニストを同定する方法は、腫
瘍細胞を候補アゴニストに暴露し、腫瘍細胞成長の阻害を測定することを含みう
る。
【００７４】 「慢性」投与とは、初期の治療効果（活性）を長期間にわたって維持するよう
にするために、急性態様とは異なり連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「
間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的
になされる処理である。 治療の目的とされる「哺乳動物」は、哺乳類に分類される任意の動物を意味し
、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイ
ヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。 一又は複数のさらなる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び
任意の順序での連続投与を含む。
【００７５】 ここで用いられる「担体」は製薬的に許容される担体、賦形剤、又は安定化剤
を含み、それらは、用いられる用量及び濃度でそれに暴露される細胞又は哺乳動
物に対して非毒性である。生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である
ことが多い。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他
の有機酸バッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基
未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免
疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー、グリシン、グルタミ
ン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノー
ス又はデキストラン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレー
ト化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形
成対イオン；及び／又はTWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、
及びPLURONICS(商品名)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００７６】 「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及
び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０,０００ダルトンの異種四量体糖タ
ンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合してお
り、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中
で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド架橋を有
している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有
する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽
鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重
鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ド
メイン間の界面を形成すると考えられている。 「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲
に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使
用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイ
ンにわたって一様には分布していない。それは、共に軽鎖及び重鎖の可変ドメイ
ンにある相補性決定領域(ＣＤＲｓ)又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメ
ントに集中している。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワー
ク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大きくβ-シ
ート配置をとり、β-シート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するル
ープ結合を形成する、ＣＤＲｓにより連結された４つのＦＲ領域をそれぞれ含ん
でいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲにより近接して結合せしめられ、他の鎖のＣＤＲ
と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, NIH Publ. No.91-
3242, Vol.I, 647-669頁(1991)参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に
直接関連しているものではないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与といった
種々のエフェクター機能を示す。
【００７７】 ここで使用される場合の「高頻度可変領域」は、抗原結合の原因となる抗体の
アミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（
例えば、軽鎖可変領域の残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９-９
７(Ｌ３)及び重鎖可変領域の３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１
０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５
版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(
1991)）からのアミノ酸残基、及び／又は「高頻度可変ループ」（例えば、軽鎖
可変領域の残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び
重鎖可変領域の残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ
３)；Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)）からの残基を含む
。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここに定義した高頻度可変領域残基
以外の可変ドメイン残基である。 「抗体断片」は、未変性の抗体の一部、好ましくは未変性の抗体の抗原結合又
は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２、及びＦ
ｖ断片；ダイアボディ(diabody)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10):
1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異
的抗体を含む。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を
持つ２つの同一な抗原結合断片、及び容易に結晶化する能力を反映した名称の残
りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有す
るが、交差結合抗原であり得るＦ(ａｂ')２断片が生成される。
【００７８】 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領
域は、緊密に非共有的に結合した１つの重鎖と１つの軽鎖の二量体からなる。こ
の配置では、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を決定するために各
可変領域の３つのＣＤＲが相互作用する。正確には、６つのＣＤＲが抗体に抗原
結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原特異的な３つのＣ
ＤＲしか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を認識し結合する能力を持つが、結
合部位全体よりは親和性が低い。 また、Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ
１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを
含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によりＦ
ａｂ'断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここにおいて、定常ドメインのシステ
イン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'の記号である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片
は、元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ'断片の対として生成さ
れた。抗体断片の他の化学的結合も知られている。 任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常
ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる
１つ又は２つの明らかに異なる型に分類できる。 それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異
なるクラスに分けられる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、Ｉｇ
Ｄ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（
アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及び
ＩｇＡ２に分けられる。
【００７９】 ここで用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の
集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量で存在する自然に起こりうる突然
変異以外は同一である集団から得られる抗体を意味する。モノクローナル抗体は
高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。さらに、典型的に異な
る決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む従来の（ポリクロ
ーナル）抗体とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対し
て向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリ
ドーマ培養によって合成され、他の免疫グロブリンに汚染されない点において有
利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得
られ、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとは解釈されない抗体の
特徴を示す。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler
等, Nature, 256: 495 [1975]によって最初に記載されたハイブリドーマ法によ
り作成してもよいし、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）
により作成してもよい。また「モノクローナル抗体」はファージ抗体ライブラリ
から、例えば、Clackson等, Nature, 352: 624-628 [1991]及び Marks等, J. Mo
l. Biol., 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いて単離してもよい。 ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含
み、それは、重鎖又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗体クラ
ス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残
りの部分は他の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する
抗体の対応する配列と同一又は相同である抗体、並びにそれらが所望の生物学的
活性を示す限りにおいてそれらの抗体の断片である（米国特許第4,816,567号；M
orrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 [1984]）。
【００８０】 非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘
導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又
はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の
他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリ
ン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ
）が、マウス、ラット、ヤギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来
する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。幾つかの場合
では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が対応する
非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入
されるＣＤＲ又はフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。これ
らの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最大化するために施される。一般にヒ
ト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに
対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のもので
ある少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有する
であろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型
的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらな
る詳細については、Jones等, Nature 321: 522 -525 (1986)；Reichmann等, Nat
ure 332: 323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 -596
(1992)を参照のこと。ヒト化抗体は、抗体の抗原結合領域が対象とする抗原で
マカゲザルを免疫化することにより生産された抗体から由来するPRIMATIZED（商
品名）抗体を含む。
【００８１】 「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含
む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ま
しくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを
更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。
ｓＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.
113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)
のPluckthunを参照のこと。 「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指
し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つの
ドメインの対形成を可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ド
メインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディー
は、例えば、EP404097；WO93/11161；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. U
SA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
【００８２】 「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され又は回収
されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への
使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他の非タンパク質様溶質が含
まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法によって
決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、（２）
スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ
末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)
クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下での
ＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細
胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つ
の成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少な
くとも１つの精製工程により調製される。
【００８３】 「標識」という語は、ここで用いられる場合、抗体に直接的又は間接的に結合
して「標識化」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は
それ自身によって検出可能でもよく（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）
、あるいは、酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変
換を触媒してもよい。 「固相」とは、本発明の化合物が接着できる非水性マトリクスを意味する。こ
こに包含される固相の例は、部分的又は全体的にガラス（例えば、孔の制御され
たガラス）、ポリサッカリド（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリ
スチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで形成されたものを含む。或る
実施態様では、前後関係に応じて、固相はアッセイ用プレートのウェル；その他
では精製用カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）を含むこと
ができる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような別々
の粒子の不連続な固体相も含む。 「リポソーム」は、哺乳動物への薬物（ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチド又はそれに対する抗体）の送達に有用な、脂質、リン脂質
及び／又は界面活性剤を含む種々の型の小さな小胞である。リポソームの成分は
、通常は生物学的メンバーの脂質配列に類似した２層構造に配列される。 「小分子」は、ここで約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
【００８４】 ＩＩ. 本発明の組成物と方法 Ａ．全長ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４ポリペプチド 本発明は、本出願においてＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４ポリ
ペプチドと称されるポリペプチドをコードする新規に同定され単離されたヌクレ
オチド配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、ＰＲ
Ｏ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを
同定し単離した。 以下の実施例に開示するように、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４
４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンはＡＴＣＣに寄託されている。ク
ローンの実際のヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託され
たクローンの配列決定をすることにより当業者によって容易に決定される。予測
されるアミノ酸配列は、日常的な技量を用いてヌクレオチド配列から決定できる
。ここに記載するＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド及
びコード化配列について、本出願人は現時点で入手可能な配列情報に最も適合す
るリーディングフレームと考えられるものを同定した。
【００８５】 Ｂ．ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体 ここに記載した全長天然配列ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドに加えてＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体も調製
できると考えられる。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４変異体は、
ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化
を導入することにより、及び／又は所望のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、適切なアミ
ノ酸変化がＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの翻訳後
プロセスを変えうること、例えばグリコシル化部位の数の変化又は膜固着特性の
改変を理解するであろう。
【００８６】 ここに記載したＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の天然全長配列
又はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の種々のドメインにおける変
異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変
異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果とし
て天然配列ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４と比較してＰＲＯ６５
５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４のアミノ酸配列が変化するような、ＰＲＯ６
５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするコドンの一又は複数の置換、
欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸
のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の一又は複数のドメインの任意
の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響
を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ
３６４又はＰＲＯ３４４の配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較
し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって
見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造又は化学特性を持つ
他のアミノ酸で置換した結果、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的ア
ミノ酸置換とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のア
ミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸
の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然配
列によって発揮される活性について試験することにより決定される。
【００８７】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの断片もここに提
供される。このような断片は例えば全長天然タンパク質と比較した場合、Ｎ-末
端又はＣ-末端で切断されていてもよいし、あるいは内部残基を欠いていてもよ
い。或る種の断片はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
の所望の生物活性に対して必須ではないアミノ酸残基を欠いている。 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４断片は多くの従来の方法の任意
のものによって調製することができる。所望のペプチド断片を化学的に合成して
もよい。他のアプローチは、酵素消化により、例えば特定のアミノ酸残基により
定まる部位でタンパク質を切断することが知られている酵素でタンパク質を処理
するか、適当な制限酵素でＤＮＡを消化させることによりＰＲＯ６５５、ＰＲＯ
３６４又はＰＲＯ３４４断片を産生し、所望の断片を単離することを含む。さら
に他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)により、所望のポリペプ
チド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所
望の末端を定めるオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける５'及び３'プライマーと
して使用する。好ましくは、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリ
ペプチド断片は、各々Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）及
びＦｉｇ６（配列番号：１７）に示される天然のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又
はＰＲＯ３４４ポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活
性を共有する。
【００８８】 特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換という見出しで
表３に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表３に例示
的置換と名前を付け、又は以下にアミノ酸分類を参照して更に記載するような、
より大幅な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【００８９】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの機能及び免疫学
的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えば
シート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を
維持しながら、それらの効果において有意に異なる置換基を選択することにより
達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられ
る： （１）疎水性：ノルノイシン, met, ala, val, leu, ile; （２）中性の親水性：cys, ser, thr; （３）酸性：asp, glu; （４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg; （５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び （６）芳香族：trp, tyr, phe 非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを
必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、よ
り好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００９０】 変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキ
ャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で周知の技術を用いてなすこ
とができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331
(1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異
誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等,
Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他のこの分野で
知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６
４又はＰＲＯ３４４変異体ＤＮＡを作成することもできる。 また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニング
アミノ酸分析を用いることができる。中でも好ましいスキャンニングアミノ酸は
、比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グ
リシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖
を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好まし
いスキャンニングアミノ酸である［Cunninghem及びWells, Science, 244: 1081-
1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的に
は好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが
多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman and Co., N.Y.); Chothia, J.
Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場
合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００９１】 Ｃ．ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４の修飾 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４の共有結合的修飾は本発明の範
囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰ
ＲＯ３４４ポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３
６４又はＰＲＯ３４４の選択された側鎖又はＮ-又はＣ-末端残基と反応できる有
機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えば
ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４を水不溶性支持体マトリクスある
いは抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４抗体の精製方法
又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架
橋剤は、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルア
ルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸
、３,３’-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジ
ルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オ
クタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ
］プロピオイミダート等の試薬を含む。 他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル
及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリ
ル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及び
ヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structur
e and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., San Francisco, pp.79-8
6 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のア
ミド化を含む。
【００９２】 本発明の範囲内に含まれるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリ
ペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パター
ンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここでの
目的のためには、天然配列ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペ
プチドに見出される１つ又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化
部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除による）
、及び／又は天然配列ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４に存在しな
い１つ又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この語句は、存
在する種々の炭水化物部分の性質及び比率の変化を含む、天然タンパク質のグリ
コシル化の定性的変化を含む。 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドへのグリコシル化
部位の付加は、アミノ酸配列の変更によって達成されうる。この変更は、例えば
、天然配列ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４への一又は複数のセリ
ン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合
グリコシル化部位の場合)。場合によっては、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又は
ＰＲＯ３４４アミノ酸配列はＤＮＡレベルでの変化によって、特に所望のアミノ
酸に翻訳されるコドンが産生されるように予め選んだ塩基においてＰＲＯ６５５
、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドをコードしているＤＮＡを突然変
異させることによって変更される。
【００９３】 本発明のポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、ポリペ
プチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は1987年9
月11日公開の国際特許出願第WO 87/05330号及びAplin及びWriston, CRC Crit. R
ev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド上に存在する炭水
化物部分の除去は、化学的又は酵素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ
酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱
グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch.
Biochem Biophys., 259:52 (1987)及びEdge等, Anal. Biochem., 118:131 (1981
)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thota
kura等, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているように種々のエンド
-及びエキソ-グリコシダーゼを使用して達成することができる。
【００９４】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の共有結合的修飾の他の型は、
ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの、種々の非タンパ
ク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、
又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号
；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載され
た方法での結合を含む。 また、本発明のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドは
、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６
４又はＰＲＯ３４４を含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
【００９５】 一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できる
エピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチドとの融合体を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドのアミノ-又はカルボキシ
ル-末端に位置する。このようなＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
ポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を
用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又は
エピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製
によってＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドを容易に精
製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野
で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン（poly-His）又はポリ-ヒス
チジン-グリシン（poly-His-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体
１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及
びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan
等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペ
スウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engi
neering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグ(F
lag)-ペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピト
ープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエ
ピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；
及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。 これに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰ
ＲＯ３４４ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融
合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれ
る）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融
合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯ６５
５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失
又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体
は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及
びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日
発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【００９６】 Ｄ．ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４の調製 以下の説明は、主として、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４核酸
を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによるＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の産生に関する。もちろん、当該分野に
おいて良く知られている他の方法を用いてＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４を調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ
３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた
直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase P
eptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield
, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるイ
ンビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バ
イオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示
により実施してもよい。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合
させて全長のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドを製造
してもよい。
【００９７】 １．ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするＤＮＡの単
離 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするＤＮＡは、ＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ｍＲＮＡを保有し、それを検出可能なレ
ベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得るこ
とができる。従って、ヒトＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ＤＮＡ
は、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリ
から簡便に得ることができる。またＰＲＯ６５５-、ＰＲＯ３６４-又はＰＲＯ３
４４-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法（例えば、
自動化核酸合成）により得てもよい。 ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタン
パク質を同定するために設計された(ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４に対する抗体又は少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プ
ローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又は
ゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＰＲＯ６５
５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードする遺伝子を単離する他の方法はＰ
ＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：
A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００９８】 下記の実施例は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。
プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が
最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スク
リーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であ
るように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く
知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるい
は酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリ
ッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。 このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBan
k等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能
とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の所
定領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同
一性は、この分野で知られここに記載する方法を用いて決定できる。 タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ
酸配列を使用し、また必要ならばｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成
中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来の
プライマー伸展法を使用することにより選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラリ
のスクリーニングにより得られる。
【００９９】 ２．宿主細胞の選択及び形質転換 宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４生
産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモー
ターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅
するために適当に改変された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地
、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一
般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術
は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL
Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。 真核生物細胞形質移入及び原核生物形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、Ｃ
ａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている
。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて
形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカ
ルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物に対して用いられる。ア
グロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (
1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の
植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対し
ては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウ
ム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特
許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van
solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞
中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレ
ーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン
での細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転
換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:52
7-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１００】 ここに記載のベクターにおいてＤＮＡをクローン化あるいは発現するために適
切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核
生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性
生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株、例えば、大
腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大
腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）が公衆に利用可
能である。他の好ましい原核生物宿主細胞は、例えば、大腸菌(Escherichia)、
例えば大腸菌(E. coli)、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシ
エラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア、例えば霊菌
、及び赤痢菌等の腸内細菌科；枯草菌及びビー・リシェニフォルミス(B. lichen
iformis)等の桿菌（例えば、1989年4月12日に発行されたDD 266,710に開示され
たビー・リシェニフォルミス４１Ｐ）；緑膿菌等のシュードモナス；及びストレ
プトマイセスである。これらの例は例示的であり限定するものではない。大腸菌
株Ｗ３１１０は、組み換えＤＮＡ生産発酵の共通の宿主株であるので好ましい宿
主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分
泌する。例えば、株Ｗ３１１０は宿主に外因性のタンパク質をコードする遺伝子
において遺伝子変異をもたらすために修飾してもよく、そのような宿主の例は、
完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔ
ｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ
ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ-ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｋａ
ｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ATCC 55,244)；完全な遺伝子型ｔｏ
ｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５（ａｒｇＦ-ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ
ｒｂｓ７ ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；株３７Ｄ
６の非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異体である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４
；及び1990年8月7日に発行された米国特許第4,946,783号に記載された変異体周
辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、インビトロのクローニン
グ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１０１】 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯ６５５-
、ＰＲＯ３６４-、又はＰＲＯ３４４-コード化ベクターのための適切なクローン
化又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等
真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスポンブ(Schizosaccharom
yces pombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行の
EP 139,383）；クルイベロミセスホスツ(Kluyveromyces hosts)（米国特許第4,9
43,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチ
ス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 73
7 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス
(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24
,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K.
drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (199
0)）、ケーサーモトレランス(K. thermotolerans)及びケーマルキシアナス(K. m
arxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia
pastoris)（EP 183,070; Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [
1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(Trichoderma reesia)（EP 244,234
）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [197
9]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシ
デンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌
、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)
（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（
Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn
等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:
1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [198
5]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、こ
れらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloecker
a)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドト
ルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含
む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Bioche
mistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１０２】 グリコシル化されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の発現に適
切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎生物細胞の例としては、シ
ョウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含ま
れる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ
）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサ
ル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での
増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59
(1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO), （Urlaub及びCha
sin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞（
TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞 (W138, ATCC
CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 06056
2, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある
。
【０１０３】 ３．複製可能なベクターの選択及び使用 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードする核酸(例えば、ｃ
ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複
製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベ
クターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態
とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入さ
れる。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレ
アーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限される
ものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカ
ー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。
これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた
標準的なライゲーション技術を用いる。 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４は直接組換え的に生産されるだ
けではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-
末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの
融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であ
るか、ベクターに挿入されるＰＲＯ６５５-、ＰＲＯ３６４-、ＰＲＯ３４４-、
ＰＲＯ１７２-、又はＰＲＯ１８２-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列
は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性
エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であって
よい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリー
ダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス
(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載さ
れている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラー
ゼリーダー(1990年4月4日発行のEP 362,179)、又は1990年11月15日に公開された
国際特許出願第WO 90/13646号に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物
細胞の発現においては、同一あるいは関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグ
ナル配列、ウイルス分泌リーダーのような他の哺乳動物のシグナル配列をタンパ
ク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１０４】 発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞におい
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、
酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来
する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点
は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノ
ウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに
有用である。 発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される
選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、
メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素
に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子
コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素
を供給するタンパク質をコードする。
【０１０５】 哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジン
キナーゼのように、ＰＲＯ６５５-、ＰＲＯ３６４-又はＰＲＯ３４４-コード化
核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生
型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖され
たＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ細胞系である。酵母菌中での使用に好適な選
択遺伝子は酵母菌プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinch
comb等, Nature, 282：39(1979)；Kingsman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper
等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第44076号あ
るいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突
然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］
。 発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ６５５-、ＰＲＯ３６４-又は
ＰＲＯ３４４-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を指示する
プロモーターを含む。種々の潜在的な宿主細胞により認識されるプロモーターが
知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ
及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel
等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp
)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］
、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモ
ータもまたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするＤＮＡと
作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【０１０６】 酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグ
リセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他
の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Bioch
emistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレー
トムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。 他の酵母菌プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的
効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオ
ネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及び
ガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現
に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【０１０７】 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又は
ＰＲＯ３４４の転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1
989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、
ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィル
ス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムか
ら得られるプロモーター、異種性哺乳動物から得られるプロモーター、例えばア
クチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーター
から得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適
合し得る限り制御される。 より高等の真核生物によるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコ
ードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによっ
て増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモー
ターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝
子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ
、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的に
は、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、
複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガ
ロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエン
ハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４コード化配列の５'又は３'位でベクター
中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置して
いる。
【０１０８】 また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多
細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮ
Ａの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤ
ＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これら
の領域は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするｍＲＮＡ
の非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを
含む。 組換え細胞培養でのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の合成に適
応化するのに適切なさらに他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nat
ure, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060;
及びEP 117,058に記載されている。
【０１０９】 ４．遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子の増幅又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識された
プローブを用い、例えば、従来からのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量
化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-520
5 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成
法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二重鎖
、ＲＮＡ二重鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ-タンパク二重
鎖を含む、特異的二重鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次
いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二重鎖は表面に結
合しており、その結果二重鎖の表面での形成の時点でその二重鎖に結合した抗体
の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色又はアッ
セイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳
動物で調製することができる。簡便には、抗体は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４
又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの天然配列に対して、又はここで提供されるＤＮ
Ａ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４
又はＰＲＯ３４４ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列
に対して調製され得る。
【０１１０】 ５．ポリペプチドの精製 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の形態は、培地又は宿主細胞の
溶解液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例え
ばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の発現に用いられる細胞は、凍結融解サ
イクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理
的手段によって破壊することができる。 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４を組換え細胞タンパク又はポリ
ペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順によ
り精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相Ｈ
ＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィ
ー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例え
ばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテ
インＡセファロースカラム；及びＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知
られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Prot
ein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (19
82)に記載され種々のタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製
過程は、例えば、用いられる産生方法及び特に産生されるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ
３６４又はＰＲＯ３４４の性質に依存する。
【０１１１】 Ｅ．抗体 本発明の組成物及び方法で使用するための候補薬剤の幾つかは、ＰＲＯ６５５
、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの生物学的活性を模倣する抗体及
び抗体断片である。 １．ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポ
リクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを
、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤
又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免
疫化剤は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又はその
融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性
が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タン
パク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血
清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれ
る。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰ
Ｌ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコ
ラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択
されるであろう。
【０１１２】 ２．モノクローナル抗体 あるいは、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は
、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブ
リドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マ
ウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化す
ることで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリ
ンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。 免疫化剤は、典型的にはＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペ
プチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合に
は末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用されるか、あるいは非ヒト哺乳動物源が望
まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチ
レングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化細胞系と融合させ、
ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化細胞系は、通常
は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細
胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫細胞系が使用される。ハイブリドー
マ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複
数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキ
サンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いて
いると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン
及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖
を阻止する。
【０１１３】 好ましい不死化細胞系は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安
定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性の
ものである。より好ましい不死化細胞系はマウス骨髄腫系であり、これは例えば
カリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerや
メリーランド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
より入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及び
マウス-ヒト異種骨髄腫細胞系も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:30
01 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Appl
ications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。 次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３
６４又はＰＲＯ３４４に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好
ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特
異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬ
ＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッ
セイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例
えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャ
ード分析法によって測定することができる。
【０１１４】 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及び
ＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物
においてインビボで腹水として成長させることもできる。 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳
動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン
精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０１１５】 また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567
号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び
軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使
用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細
胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡ
は発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク
質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクロ
ーナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列
に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US
. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列
に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合するこ
とにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、
本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原
結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することが
できる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメ
インに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに
置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。 抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく
知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現
を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイン
トで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換
するか欠失させて架橋を防止する。 一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その
断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使
用して達成できる。
【０１１６】 ３．ヒト及びヒト化抗体 本発明の抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウ
ス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはそ
の断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結
合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むもので
ある。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、
ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ド
ナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント
抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基
は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピ
エント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されな
い残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全て
のＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全
てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも
１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最
適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常
領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); R
iechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Bio
l., 2:593-596 (1992)］。
【０１１７】 非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒト
アミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移
入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト
抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［
Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1
988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類
ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施され
る。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的
に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4
,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及
び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によ
って置換されたヒト抗体である。
【０１１８】 また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol
. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含む
この分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及
びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる
（Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1
985；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)）。同様に、ヒト抗体はヒ
ト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン
遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生する
ことができる。負荷の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含む
あらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産
が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,8
06号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号
、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg
等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fish
wild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotec
hnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-9
3 (1995)に記載されている。
【０１１９】 ４．二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合
において、結合特異性の一方はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４に
対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセ
プター又はレセプターサブユニットに対してである。 二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精
製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の
手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-
3659 (1991)に開示されている。
【０１２０】 所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードす
るＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿
入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更
なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)
を参照されたい。 ＷＯ９６／２７０１１に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子
間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセント
を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの
少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の
小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置
き換えられる。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」
を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はトレオニン)と置き換えるこ
とにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような
不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提
供される。
【０１２１】 二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性
抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文
献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製するこ
とができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解
性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は
、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを
安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はつ
いでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導
体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再
転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成
する。生成された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用する
ことができる。 大腸菌からＦａｂ'断片を直接回収し、化学的に結合して二重特異性抗体を形
成してもよい。Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全にヒト
化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片
は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学結合させて二重特異性抗
体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプター
を過剰発現している細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合でき、ヒト乳房腫瘍標的に
対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性をトリガーする。
【０１２２】 組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法
もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して
生産された。Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及び
Ｊｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが遺伝子融合により二つの異
なった抗体のＦａｂ'部分に結合された。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元
されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。
この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollin
ger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により記述された
「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供し
た。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短い
リンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してな
る。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶ Ｈ ドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖
Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方法もまた報告さ
れている。Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
【０１２３】 二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することがで
きる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。 例示的二重特異性抗体は、ここで与えられるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又は
ＰＲＯ３４４ポリペプチド上の２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは
、抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、又は抗-ＰＲＯ３４４ポリペプチドアー
ムは、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）等の
白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)
及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）に結合
するアームに結合し、細胞防御メカニズムを特定のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４
又はＰＲＯ３４４ポリペプチド発現細胞に集中するようにしてもよい。二重特異
性抗体は、細胞毒性薬を特定のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドを発現する細胞に局在化させるのに使用してもよい。これらの抗体は
、ＰＲＯ６５５-、ＰＲＯ３６４-、ＰＲＯ３４４-、ＰＲＯ１７２-、又はＰＲＯ
１８２-結合アーム及び細胞毒性薬又はキレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、Ｄ
ＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡに結合するアームを有する。他の対象とする二
重特異性抗体は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドに
結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１２４】 ５．ヘテロ抱合体抗体 ヘテロ抱合体抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロ抱合抗体は２つの共有
結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に
対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の
治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この
抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使
用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィ
ド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素
を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレ
ート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,676,98
0号に開示されているものが含まれる。
【０１２５】 ６．エフェクター機能の設計 本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における
抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導
入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産
生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は
増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)を有しうる。
Caron等, J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992)及びShopes, J. Immunol. 148:29
18-2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、
Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565(1993)に記載されているようなヘテロ
二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し
、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することがで
きる。Stevensonら, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
【０１２６】 ７．免疫複合体 本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の
酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち
、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。 このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることので
きる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活
性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ
鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリ
テス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパ
ク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ
、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica char
antia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オ
フィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミ
トゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phe
nomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様
々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、 ２１２ Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０１２７】 抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、
例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチ
ルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等
）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジ
ドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジ
アゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２
，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-
２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は
、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することがで
きる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン
トリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合の
ためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。 他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター
」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患
者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細
胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（例えば
アビジン）を投与する。
【０１２８】 ８．免疫リポソーム また、ここに開示するタンパク質、抗体などは免疫リポソームとして調製して
もよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8
2: 3688 (1985); Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及
び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知
られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,
013,556号に開示されている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆
相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して
押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ
'断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているよ
うに、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（
ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等,
J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０１２９】 Ｆ．腫瘍性細胞成長又は増殖を阻害できるタンパク質の同定 本出願で開示したタンパク質を、国立癌学会（ＮＣＩ）の実験的、疾患指向性
、インビトロ薬剤スクリーニングで現在使用されている６０腫瘍系のパネルで検
定した。このスクリーニングの目的は、異なる型の腫瘍に対する細胞毒性及び／
又は細胞増殖抑制活性を有する分子を同定することである。ＮＣＩは毎年10,000
を越える新たな分子をスクリーニングしている（Monks等, J. Natl. Cancer Ins
t., 83: 757-766 (1991); Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10)
: 1-12 [1989]）。この実験に使用された腫瘍細胞系は、上掲のMonks等に記載さ
れている。本出願のタンパク質によって成長が有意に阻害された細胞系を実施例
で特定した。 結果は、試験したタンパク質が種々の癌細胞系において細胞増殖抑制性、そし
て或る場合及び濃度では細胞毒性活性を示すことを明らかにした。 腫瘍（例えば癌）についての他の細胞ベースのアッセイ及び動物モデルも、Ｎ
ＣＩ癌スクリーニングの発見を裏付け、ここで同定したタンパク質と腫瘍精細胞
成長の進行及び病因との関係をさらに理解するのに使用できる。例えば、（以下
に記載するような）トランスジェニック動物における腫瘍から一次培地は、ここ
の細胞ベースのアッセイで使用できるが、安定な細胞系が好ましい。トランスジ
ェニック動物から連続細胞系を誘導する技術はこの分野で公知である（例えば、
Small等, Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 [1985]参照）。
【０１３０】 Ｇ．動物モデル 腫瘍の進行及び原因におけるここに同定される遺伝子の役割を更に理解するた
めに、そして抗体、及び小分子アゴニストを含む天然ポリペプチドの他のアゴニ
ストを含む候補治療薬の有効性を試験するために、種々の良く知られた動物モデ
ルが使用できる。これらのモデルのインビボの性質により、特にヒト患者におけ
る反応を予測できる。腫瘍及び癌（例えば、乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌など
）の動物モデルは、非組換え及び組換え（トランスジェニック）動物の両方を含
む。非組換え動物モデルは、例えば、齧歯類、例えばマウスモデルを含む。この
ようなモデルは、標準的な技術、例えば、皮下注射、尾部静脈注射、脾臓移植、
腹膜内移植、腎被膜下移植、又はオルトピン(orthopin)移植、例えば大腸組織に
移植された大腸癌細胞により、腫瘍細胞を同系マウスに導入することにより作成
される。（1997年9月18日に発行されたＰＣＴ公報WO 97/33551参照。） 癌遺伝子の研究におそらく最もしばしば用いられる動物種は、免疫不全マウス
、特にヌードマウスである。ハイポ／形成不全を持つヌードマウスがヒト腫瘍異
種移植の宿主として行動するという観察は、この目的のための広い用途を導いた
。常染色体劣性ｎｕ遺伝子が、例えば、ＡＳＷ、Ａ／Ｈｅ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／
ｃ、Ｂ１０．ＬＰ、Ｃ１７、Ｃ３Ｈ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７、ＣＢＡ、ＤＢＡ、Ｄ
ＤＤ、Ｉ／ｓｔ、ＮＣ、ＮＦＲ、ＮＦＳ、ＮＦＳ／Ｎ、ＮＺＢ、ＮＺＣ、ＮＺＷ
、Ｐ、ＲＩＩＩ及びＳＪＬを含むヌードマウスの極めて多数の異なる共通遺伝子
系統に導入された。さらに、遺伝的な免疫不全を持つヌードマウス以外の広範な
他の動物が生育され、腫瘍異種移植のレシピエントとして用いられた。さらなる
詳細については、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven 及び B. Wi
nograd 編, CRC Press, Inc., 1991を参照。
【０１３１】 これらの動物に導入される細胞は、周知の腫瘍／癌細胞系、例えば上記列挙し
た腫瘍細胞系、及び、例えばＢ１０４-１-１細胞系（ｎｅｕプロトオンコジーン
で形質移入された安定ＮＩＨ-３Ｔ３細胞系）；ｒａｓ-形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３
細胞：Ｃａｃｏ-２（ATCC HTB-37）、中程度に良く分化したグレードＩＩヒト大
腸腺癌細胞系、ＨＴ-２９（ATCC HTB-38）から、あるいは腫瘍及び癌から誘導す
ることができる。腫瘍又は癌細胞の試料は、手術を受けている患者から、液体窒
素中での凍結及び保存を含む標準的な条件を用いて得ることができる（Karmali
等, Br. J. Cancer 48, 689-696 [1983]）。 腫瘍細胞は、ヌードマウスなどの動物に、種々の手法によって導入できる。マ
ウスの皮下（ｓ．ｃ．）空間は、腫瘍移植に非常に好ましい。腫瘍は、固体ブロ
ックとして、トロチャー(trochar)を用いてニードル生検として、細胞懸濁物と
してｓ．ｃ．移植できる。固体ブロック又はトロチャー移植のために、適切な大
きさの腫瘍組織断片がｓ．ｃ．空間に導入される。細胞懸濁物は、原発腫瘍又は
安定な腫瘍細胞系から新たに調製され、皮下注射される。また腫瘍細胞は、皮下
植え込みとして注射することもできる。この位置において、種菌が皮膚結合組織
の下層とｓ．ｃ．組織との間に析出される。Boven及びWinograd (1991), 上掲。
乳癌の動物モデルは、例えば、神経芽腫細胞（それからｎｅｕ癌遺伝子が最初に
単離される）、又はｎｅｕ形質移入ＮＩＨ-３Ｔ３細胞をヌードマウスに移植す
ることにより、基本的にはDrebin等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9129-9
133 (1986)に記載されているように生成される。
【０１３２】 同様に、大腸癌の動物モデルは、大腸癌細胞を動物、例えばヌードマウスに継
代し、これらの動物における腫瘍の発現を導くことにより生成される。ヌードマ
ウスにおけるヒト大腸癌の同所性移植モデルは、例えば、Wang等, Cancer Resea
rch 54, 4726-4728 (1994)及びToo等, Cancer Research 55, 681-684 (1995)に
記載されている。このモデルは、いわゆるAntiCancer, Inc. (San Diego, Calif
ornia)から市販の「METAMOUSE」に基づく。 動物に生じた腫瘍は、取り出してインビトロで培養することができる。インビ
トロ培地からの細胞は、次いで動物に継代することができる。これらの腫瘍は、
さらなる試験及び薬物スクリーニングの標的として提供され得る。あるいは、継
代から得られる腫瘍は単離でき、継代前細胞及び１又はそれ以上の継代後に単離
した細胞のＲＮＡを、対象とする遺伝子の識別可能な発現について分析する。こ
のような継代技術は、周知の腫瘍又は癌細胞系で実施することができる。
【０１３３】 例えば、Ｍｅｔｈ Ａ、ＣＭＳ４、ＣＭＳ５、ＣＭＳ２１、及びＷＥＨＩ-１６
４がＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの線維肉腫に導入され（DeLeo等, J. Exp. Med. 146,
720 [1977]）、それは、種々の抗原の抗-腫瘍活性の研究のための高度に制御可
能なモデル系を提供する（Palladino等, J. Immunol. 138, 4023-4032 [1987]）
。簡便には、腫瘍細胞は細胞培地中でインビトロで成長させる。動物に注射する
前に、細胞系は洗浄してバッファー中に約１０ｘ１０６から１０ｘ１０７細胞／
ｍｌの細胞密度で懸濁する。次いで動物を１０から１００μｌの細胞懸濁物で皮
下感染し、腫瘍が現れるまで１から３週間放置する。 さらに、最も完全に研究された実験的腫瘍の一つであるマウスのルイス肺（３
ＬＬ）癌腫は、研究用腫瘍モデルとして用いることができる。この腫瘍モデルに
おける有効性は、肺の小細胞癌腫（ＳＣＣＬ）と診断されたヒト患者の治療にお
ける有利な効果と相関していた。この腫瘍は、影響を受けたマウスからの腫瘍断
片又は培地に残った細胞の注射に際して正常マウスに導入でき（Zupi等, Br. J.
Cancer 41, suppl. 4, 309 [1980]）、証拠は、腫瘍がたった一つの細胞の注射
から開始され、感染した腫瘍細胞の極めて高い集団が生存することを示している
。この腫瘍モデルに関する更なる情報については、Zacharski, Haemostasis 16,
300-320 [1986]を参照のこと。
【０１３４】 移植された腫瘍の動物モデルにおける試験化合物の有効性を評価する一つの方
法は、治療前後での腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植した腫
瘍の大きさは、二又は三次元のスライドキャリパーで測定される。二次元に制限
された測定は、腫瘍の大きさを正確に反映せず、従って、通常は数式を用いて対
応する容積に換算される。しかしながら、腫瘍の大きさの測定は極めて不正確で
ある。候補薬の治療効果は、治療-誘発性の成長遅延及び特異的な成長遅延とし
てより良く記述できる。腫瘍成長の記述における他の重要な変数は、腫瘍容積倍
加時間である。Rygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immun
e-Deficient Animals, Wu及びSheng編, Basel, 1989, 301によって報告されたプ
ログラムなどの、腫瘍成長の計算及び記述のためのコンピュータプログラムも利
用可能である。しかし、腫瘍に続く壊死及び炎症反応が実際には少なくとも初期
に腫瘍の大きさを増大させ得ることを注記しておく。従って、これらの変化は、
形態学的方法及びフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く監視する
必要がある。 組換え（トランスジェニック）動物モデルは、ここに同定された遺伝子のコー
ド部分を、トランスジェニック動物作成のための標準的技術を用いて、対象とす
る動物のゲノムに導入することにより加工できる。トランスジェニック動物は、
「導入遺伝子」又は動物自体又は動物の祖先に出生前段階（例えば胚段階）でゲ
ノムに導入された遺伝物質を有するものである。トランスジェニック操作の標的
として提供できる動物は、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、モルモッ
ト、ヒツジ、ヤギ、ブタ、及び非-ヒト霊長類、例えばヒヒ、チンパンジー及び
サルを含む。これらの動物に導入遺伝子を導入するのにこの分野で知られた技術
は、前核マイクロインジェクション（Hoppe及びWanger, 米国特許第4,873,191号
）；胚系列へのレトロウイルス媒介遺伝子転移（例えば、Van der Putten等, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]）；胚性肝細胞での遺伝子標的
化（Thompson等, Cell 56, 313-321 [1989]）；胚のエレクトロポレーション（L
o, Mol. Cel. Biol. 3, 1803-1814 [1983]）；精子媒介遺伝子転移（Lavitrano
等, Cell 57, 717-73 [1989]）を含む。概説のためには、例えば、米国特許第4,
736,866号を参照のこと。
【０１３５】 本発明の目的のために、トランスジェニック動物は、その一部にのみ導入遺伝
子を有するもの（「モザイク動物」）を含む。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子
として、又はコンカテマー、例えば頭部と頭部又は頭部と尾部の直列型として組
み込まれる。特定の細胞型への導入遺伝子の選択的導入も、例えば、Lasko等, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6232-636 (1992)の技術に従って可能である。 トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は、標準的技術によって監
視できる。例えば、導入遺伝子の組み込みの確認にサザンブロット分析又はＰＣ
Ｒ増幅が用いられる。次いで、ｍＲＮＡ発現のレベルは、インサイツハイブリッ
ド形成、ノーザンブロット分析、ＰＣＲ、又は免疫組織化学などの技術を用いて
分析できる。動物は、腫瘍又は癌発生の徴候についてさらに試験される。
【０１３６】 自発的な動物腫瘍の治療におけるここに同定されるポリペプチドに特異的に結
合する抗体、及び他の候補薬の有効性も試験できる。このような研究のための適
切な標的は、ネコ口腔扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。ネコ口腔ＳＣＣは高度に侵
襲的な悪性腫瘍で、ネコに最も通常の口腔悪性腫瘍であり、この種に報告される
口腔腫瘍の６０％以上を占める。それは、離れた部位には殆ど転移しないが、こ
の転移の低い発生率は単にこの腫瘍を持つネコの短い生存期間を反映しているに
すぎない。これらの腫瘍は通常手術できないが、主にネコの口腔の解剖学的形状
による。現在では、この腫瘍の有効な治療法は存在しない。研究に入る前に、各
々のネコに完全な臨床検査、生体組織検査を施し、コンピュータ断層撮影（ＣＴ
）によりスキャンした。舌下口腔扁平上皮細胞腫瘍を持つと診断されたネコは研
究から排除した。舌はこの腫瘍のために麻痺し始め、治療がこの腫瘍を殺した後
でも、動物は自分で餌を取ることができないであろう。各々のネコを長期に渡っ
て繰り返し治療する。腫瘍の写真を治療期間中の毎日及び引き続く再チェックの
時点で撮影した。治療の後、各ねこに再度ＣＴスキャンを施した。ＣＴスキャン
及びラジオグラフは、その後８週間ごとに評価した。データは、対照群と比較し
た生存数、反応性及び毒性における相違について評価した。ポジティブ反応は、
腫瘍の縮小、好ましくは生存の質の向上又は生存期間の延長を必要とする。 さらに、他の自発的動物腫瘍、例えばイヌ、ネコ、及びヒヒの線維肉腫、腺癌
、リンパ腫、クロンドローマ(chrondroma)、平滑筋肉腫も試験できる。これらの
イヌ及びネコでの乳腺癌は、その発現及び挙動がヒトのものに極めて類似してい
るので、好ましいモデルである。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの
型の腫瘍の発生比率によって制限される。
【０１３７】 Ｈ．候補薬についてのスクリーニングアッセイ 候補薬のスクリーニングアッセイは、個々に同定されたポリペプチドのレセプ
ターと競合的に結合又は複合体形成する化合物、及びそのようなレセプターを通
したシグナルを同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイ
は、特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スルー
プットスクリーニングに従うアッセイを含む。小分子とは、抗体合成有機又は無
機化合物を含むと考え、それらは、ペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポ
リ）ペプチド-免疫グロブリン融合体、特に、限定されないが、ポリ-及びモノク
ローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びそれら
の抗体又は断片のキメラ又はヒト化形、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体
を含んでいる。アッセイは、種々の形式で実施でき、この分野で良く特徴付けら
れたタンパク質-タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、
イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む。 結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離され
るか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された
遺伝子にコードされるポリペプチドのレセプター即ち候補薬が、共有又は非共有
結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は
、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成さ
れる。あるいは、固定化すべきポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノ
クローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。ア
ッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標
識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了
したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を
検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定
化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が
標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に
結合する標識抗体によって検出できる。
【０１３８】 候補化合物が相互作用するが特定のレセプターに結合しない場合、そのレセプ
ターとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知
られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、
同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統
的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同
研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Pr
oc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの
遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. US
A 89, 5789-5793 (1991)］に開示されているように監視することができる。酵母
菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメ
インからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメ
インとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイ
ブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッド
タンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに
融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合してい
る。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御
下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成
に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダー
ゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの
特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全な
キット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この
系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、
並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができ
る。
【０１３９】 Ｉ．製薬組成物 本発明のポリペプチド、ここに同定したタンパク質に特異的に結合するアゴニ
スト抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子
は、癌を含む腫瘍の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。 抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合す
る最小阻害断片が通常は好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標
的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このよ
うなペプチドは、化学的に合成でき及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成で
きる（例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]
）。 また、ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化
合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい
。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、例えば細胞毒性薬、サイトカイン、
化学治療薬、又は成長阻害剤といったその機能を向上させる薬剤を含んでもよい
。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する
。
【０１４０】 ここで同定されるポリペプチド、又はそれらのアゴニストの治療用製剤は、所
望される程度の純度を持つ活性成分を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意
の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保
存される（Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed.
[1980]）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度
で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー
；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメ
チルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズア
ルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又は
ベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテ
コール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレ
ゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼ
ラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性
ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又
はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖
類、二糖類、及び他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニ
トール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イ
オン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）及び／又はトゥイーン(TWEEN)
（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコー
ル（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１４１】 ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、
好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。ある
いは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤
を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合
わせで存在する。 また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により
調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼ
ラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中
、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマ
ルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括
されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science 16t
h edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。 インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過
膜を通した濾過により容易に達成される。 治療的抗体組成物は、一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば
、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバッグ又は
バイアルに入れられる。
【０１４２】 徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体
疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、
例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は
、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレー
ト)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）
、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビ
ニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロ
リドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)
-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸な
どのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒド
ロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身
体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝
集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす
。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができ
る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ-Ｓ結合形成
であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの
凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリ
クス組成物の開発によって達成されうる。
【０１４３】 Ｊ．治療方法 本発明のポリペプチド及び抗体、ペプチド及び小分子アゴニストを含むそれら
のアゴニストは、種々の腫瘍、例えば癌の治療に用いてもよい。治療される状態
又は疾患の例としては、良性又は悪性腫瘍（例えば、腎臓(renal)、肝臓、腎臓(
kidney)、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺、外陰部、胸腺
、肝癌(hepatic carcinoma)；肉腫；膠芽細胞腫；及び種々の頭部及び頸部の腫
瘍）；白血病及びリンパ悪性疾患；ニューロン、グリア、星状、視床下部及び腺
、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔疾患などの疾患；及び炎症、脈管形成
及び免疫学的疾患が含まれる。本発明の抗腫瘍剤（ここに開示したポリペプチド
及びそれらの活性に類似したアゴニスト、例えば抗体、ペプチド及び有機小分子
を含む）は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとし
て又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、又は筋肉内、腹膜内、脳脊髄
内、眼内、動脈内、病巣内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸
入経路などにより投与される。
【０１４４】 他の治療的養生法を本発明の抗癌剤の投与に組み合わせてもよい。例えば、こ
のような抗癌剤で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又は
それに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調
製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実
務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量ス
ケジュールはまたChemotherapy Service, M.C. Perry編, Williams and Wilkins
, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学治療薬は、本発明の抗腫瘍剤
の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与し
てもよい。本発明の抗癌剤は、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物又は
オナプリストンなどの抗プロゲステロン（EP 616812参照）の、これらの分子に
ついて知られた用量と組み合わせてもよい。
【０１４５】 また、腫瘍関連抗原に対する抗体、例えばＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３
、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも
好ましい。ときどきは、患者にサイトカインを投与することも有利である。好ま
しい実施態様では、ここの抗癌剤は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、ま
ず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗癌剤を投与する。しかしながら、同時
投与、又は本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤につ
いての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との
組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
【０１４６】 疾患の予防又は治療のための、ここでの抗腫瘍剤の適切な用量は、上記で定義
したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬
剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び薬剤に対する反応、及
び主治医の裁量に依存する。薬剤は、患者に、一回又は一連の治療に渡って適切
に投与される。動物実験は、ヒトの治療に有効な用量を決定するための信頼性の
ある指針を提供する。有効な用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti J.
及びChappell. W.「The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics」,To
xicokinetics and New Drug Development, Yacobiら編, Pergamon Press, New Y
ork 1989, 42-46に開示されているような原理に従い実施することができる。
【０１４７】 例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（
例えば、０．１−２０ｍｇ／ｋｇ）の抗腫瘍剤が、例えば、１又はそれ以上の別
々の投与あるいは連続注入により患者に投与するための最初の候補用量である。
典型的な１日の用量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／
ｋｇ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾
患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量
計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイによ
って容易に監視される。特に用量及び送達方法に対する指針は文献にて提供され
ており；例えば米国特許第4,657,760号、同5,206,344号又は同5,255,212号を参
照のこと。異なる調製物が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること
、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる
方式で輸送することが必要であることが予想される。
【０１４８】 Ｋ．製造品 本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製
造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例
えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラ
スチックなどの材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有
効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注
射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよ
い）。組成物中の活性剤は本発明の抗腫瘍剤である。容器上又は添付されるラベ
ルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製
造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬
的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備してもよい。さらに、他のバ
ッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッ
ケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよ
い。
【０１４９】 以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り
込む。
【０１５０】 （実施例） 実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に
従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特
定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、
マナッサス、ＶＡである。
【０１５１】 実施例１ ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４をコードするｃＤＮＡクローンの
単離 （Ａ）ＰＲＯ６５５ 発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Phar
maceuticals、Palo Alto, CA）を検索し、インターフェロンとの相同性を持つＥ
ＳＴを同定した。可能な相同性はIncyteＥＳＴ３７２８９６９（次いでＤＮＡ４
９６６８と命名される）と哺乳動物アルファインターフェロンとの間で記された
。相同性は検査によって確認した。 ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト小腸（ＬＩＢ９９）から単
離した。ヒトＰＲＯ６５５をコードするｃＤＮＡクローンを単離するのに用いた
ｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を
用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴ
でプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、Ｎｏｔ
Ｉで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクロー
ニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まな
いｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照
）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
【０１５２】 次いで、上記のＥＳＴ配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含
むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ６５５の全長コード化配
列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを
合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは、一般に２０〜３０ヌクレオチ
ドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるよう
に設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ長である。全長クロー
ンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからの
ＤＮＡを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って
、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いでポジテ
ィブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用い
た対象とする遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。 用いたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通り： 逆方向ＰＣＲプライマー１： 5'-TCTCTGCTTCCAGTCCCATGAGTGC-3'(配列番号：３) 逆方向ＰＣＲプライマー２： 5'-GCTTCCAGTCCCATGAGTGCTTCTAGG-3'(配列番号：４) ハイブリッド形成プローブ： 5'-GGCCATTCTCCATGAGATGCTTCAGCAGATCTTCAGCCTCTTCAGGGCAA-3'(配列番号：５)
【０１５３】 全長クローンが同定され、それはヌクレオチド位置６２１−６２３に見かけの
翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置１２４５−１２４７に停止シグナルを持
つ単一のオープンリーディングフレームを有していた（Ｆｉｇ１；配列番号：１
）。予想されるポリペプチド前駆体は、２０８アミノ酸長であり、約２４,４１
４ダルトンの算定分子量及び約８．９２の見積もりｐＩを有する。Ｆｉｇ２（配
列番号：２）に示された全長ＰＲＯ６５５配列の分析により様々な重要なポリペ
プチドドメインの存在が証明されたが、それらの重要なポリペプチドドメインに
対して与えられる位置はおよそ上記のようである。全長ＰＲＯ６５５配列（Ｆｉ
ｇ２、配列番号：２）の分析により次のことが証明された：約アミノ酸１−約ア
ミノ酸２１のシグナルペプチド：約アミノ酸９５−約アミノ酸９９、約アミノ酸
１０４−約アミノ酸１０８のＮ-グリコシル化部位：約アミノ酸１８１−約アミ
ノ酸１８５のカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位：約アミノ酸１３３−約アミノ
酸１３９のＮ-ミリストイル化部位：及び約アミノ酸１４７−約アミノ酸１６６
のインターフェロンアルファ、ベータ及びデルタファミリーシグネーチャー。ク
ローンＤＮＡ５０９６０−１２２４は1997年12月3日にＡＴＣＣに寄託され、Ａ
ＴＣＣ寄託番号２０９５０９が付与された。 Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分
析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分
析により、ＰＲＯ６５５アミノ酸配列と種々のヒトＩＦＮ-α種との間の約３５
−４０％の配列同一性が証明された。相同性は、Ｆｉｇ２（配列番号：２）に示
す配列の２２−１８９アミノ酸領域において最も高い。ヌクレオチドレベルでは
、ＩＮＦ-αのコード化配列との相同性は約６０％である。
【０１５４】 （Ｂ）ＰＲＯ３６４ 発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース及び企業のＥＳＴデータベース（
LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を検索し、腫瘍壊
死因子レセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのポリペプチドのメンバーと相同性示
すＥＳＴ（IncyteＥＳＴ３００３４６０番）を同定した。 次いで、IncyteＥＳＴ３００３４６０番及び他のＥＳＴ配列に対して、BLAST
（Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480(1996)）及び「phrap」（
Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）を用いてコン
センサス配列を組み立てた。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ４４８２５と
命名する。 ＤＮＡ４４８２５コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする
配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３６４の全長コ
ード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレ
オチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０〜３０ヌ
クレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与
えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ長である。全
長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラ
リからのＤＮＡを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology
のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次い
でポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一
方を用いた対象とする遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。 用いたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通り： 正方向ＰＣＲプライマー１： 5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3'(配列番号：８) 正方向ＰＣＲプライマー２： 5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3'(配列番号：９) 正方向ＰＣＲプライマー３： 5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3'(配列番号：１０) 逆方向ＰＣＲプライマー１： 5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3'(配列番号：１１) 逆方向ＰＣＲプライマー２： 5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3'(配列番号：１２) 逆方向ＰＣＲプライマー３： 5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3'(配列番号：１３) ハイブリッド形成プローブ１： 5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3'(配列番号：１４) ハイブリッド形成プローブ２： 5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3'(配列番号：１５)
【０１５５】 ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡをヒト小腸組織から単離した。Ｐ
ＲＯ３６４をコードするｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライ
ブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準
的方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライ
ムし、ＳａｌＩヘミキナーゼ化アダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切
断し、ゲル電気泳動で適切にサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニ
ングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たな
いｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)）に
独特のＸｈｏｌ及びＮｏｔＩ部位においてクローン化した。 ＤＮＡ４７３６５−１２０６の全長クローンが同定され、それはヌクレオチド
位置１２１−１２３に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置８４４−
８４６に停止シグナルを持つ単一のオープンリーディングフレームを有していた
（Ｆｉｇ３；配列番号：６）。予想されるポリペプチド前駆体は、２４１アミノ
酸長であり、約２６,０００ダルトンの算定分子量及び約６．４３の見積もりｐ
Ｉを有する。 Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示された全長ＰＲＯ３６４配列の分析により様々
な重要なポリペプチドドメインの存在が証明されたが、それらの重要なポリペプ
チドドメインに対して与えられる位置はおよそ上記のようである。全長ＰＲＯ３
６４配列の分析により次のことが証明された：約アミノ酸１−約アミノ酸２５の
シグナルペプチド：約アミノ酸１６３−約アミノ酸１８３の潜在的膜貫通ドメイ
ン：約アミノ酸１４６−約アミノ酸１５０のＮ-グリコシル化部位：約アミノ酸
５−約アミノ酸１１、約アミノ酸８−約アミノ酸１４、約アミノ酸２５−約アミ
ノ酸３１、約アミノ酸３０−約アミノ酸３６、約アミノ酸３３−約アミノ酸３９
、約アミノ酸１１８−約アミノ酸１２４、約アミノ酸１２２−約アミノ酸１２８
、及び約アミノ酸１５６−約アミノ酸１６２のＮ-ミリストイル化部位：約アミ
ノ酸１６６−約アミノ酸１７７の原核生物膜リポタンパク脂質結合部位、及び約
アミノ酸１７１−約アミノ酸１９３のロイシンジッパーパターン。 クローンＤＮＡ４７３６５−１２０６は1997年11月7日にＡＴＣＣに寄託され
、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３６が付与された。 Ｆｉｇ４（配列番号：７）に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分
析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分
析により、ＰＲＯ３６４アミノ酸配列と腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメ
ンバーとの間の配列同一性が証明され、よって、ＰＲＯ３６４が腫瘍壊死因子レ
セプターファミリーの新規なメンバーでありうることを示している。 全長天然ＰＲＯ３６４ポリペプチドのアミノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列の詳細な調査により、Nocentini等, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 94: 6216-6221 (1997)に報告されたマウスＧＩＴＲタンパク質と
の相同性が証明された。従って、ＰＲＯ３６４は、Nocentini等に報告されたマ
ウスＧＩＴＲタンパク質のヒト対応物を代表することが可能である。
【０１５６】 （C）ＰＲＯ３４４ Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の既知の分泌タンパク質からの細
胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（あるとすれば分泌シグナル配列を含む）をＥＳＴ
データベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは公的なＥＳＴデータベー
ス（例えばGenBank）及び企業のＥＳＴデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte
Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含んでいた。検索は、コンピュータプロ
グラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480(1
996)］を用い、ＥＳＴ配列の６フレーム翻訳に対するＥＣＤタンパク質配列の比
較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコアが７０（９０
の場合もある）又はそれ以上となる比較物を集団化し、プログラム「phrap」（P
hil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサス
ＤＮＡ配列に組み込んだ。 コンセンサスＤＮＡ配列を、前記したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に
対して構築した。このコンセンサスＤＮＡ配列をここでＤＮＡ３４３９８と命名
する。いくつかの場合にはコンセンサス配列はBLAST及びphrapの繰り返しサイク
ルを用いて伸長し、該配列を上で検討したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限
り伸長させた中間コンセンサスＤＮＡ配列から取り出す。 ＤＮＡ３４３９８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする
配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３４４の全長コ
ード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレ
オチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０〜３０ヌ
クレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与
えるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ長である。幾
つかの場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きな場合に更な
るオリゴヌクレオチドを合成する。全長クローンについて幾つかのライブラリを
スクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上掲のAusubel等, Curre
nt Protocols in Molecular Biologyに従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ
増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリ
ゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて態様とする遺伝子をコードする
クローンの単離に使用した。
【０１５７】 ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した： 正方向ＰＣＲプライマー１： 5'-TACAGGCCCAGTCAGGACCAGGGG-3'(配列番号：１８) 正方向ＰＣＲプライマー２： 5'-AGCCAGCCTCGCTCTCGG-3'(配列番号：１９) 正方向ＰＣＲプライマー３： 5'-GTCTGCGATCAGGTCTGG-3'(配列番号：２０) 逆方向ＰＣＲプライマー１： 5'-GAAAGAGGCAATGGATTCGC-3'(配列番号：２１) 逆方向ＰＣＲプライマー２： 5'-GACTTACACTTGCCAGCACAGCAC-3'(配列番号：２２) さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成
プローブをコンセンサスＤＮＡ３４３９８配列から構築した： ハイブリッド形成プローブ： 5'-GGAGCACCACCAACTGGAGGGTCCGGAGTAGCGAGCGCCCCGAAG-3'(配列番号：２３)
【０１５８】 ｃＤＮＡライブラリーの構築のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織から単離した
。ｃＤＮＡクローンを単離するために用いたｃＤＮＡライブラリーは、Invitrog
en, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって作成し
た。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、ＳａｌＩヘミキ
ナーゼ化アダプターの平滑末端で結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で
適切にサイズ分割をし、決められた方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫ
Ｂ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５Ｂは、ＳｆｉＩ部位を持たないｐＲＫ５Ｄの前駆体
である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)）に独特のＸｈｏｌ及びＮ
ｏｔＩ部位においてクローン化した。 上記のように単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、全長ＰＲＯ３４４
ポリペプチド（ここでＤＮＡ４０５９２−１２４２と命名する［Ｆｉｇ５；配列
番号：１６］）とＰＲＯ３４４ポリペプチドの誘導タンパク質配列が得られた。 上で同定した全長クローンは、ヌクレオチド位置２２７−２２９に見掛けの翻
訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置９５６−９５８の停止シグナルを持つ単一
のオープンリーディングフレームを有していた（Ｆｉｇ５；配列番号：１６）。
予想されるポリペプチド前駆体は、２４３アミノ酸長であり、約２５,２９８ダ
ルトンの算定分子量及び約６．４４の見積もりｐＩを有する。Ｆｉｇ６（配列番
号：１７）に示された全長ＰＲＯ３６４配列の分析により様々な重要なポリペプ
チドドメインの存在が証明されたが、それらの重要なポリペプチドドメインに対
して与えられる位置はおよそ上記のようである。全長ＰＲＯ３４４配列の分析に
より次のことが証明された：約アミノ酸１−約アミノ酸１５のシグナルペプチド
：約アミノ酸１１−約アミノ酸１７、約アミノ酸６８−約アミノ酸７４、及び約
アミノ酸２１６−約アミノ酸２２２のＮ-ミリストイル化部位：及び約アミノ酸
７７−約アミノ酸８０の細胞接着配列。 クローンＤＮＡ４０５９２−１２４２は1997年11月21日にＡＴＣＣに寄託され
、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４９２が付与された。
【０１５９】 実施例２ インサイツハイブリッド形成 インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及
び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位
の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と局在化、特定のｍＲＮ
Ａ合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。 インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1
994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、ＰＣＲ生成３３Ｐ-標識リボ
プローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト
組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（20g/ml）で１５分間３７
℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツ
ハイブリッド形成する。(３３-Ｐ)ＵＴＰ-標識アンチセンスリボプローブをＰＣ
Ｒ産物から生成し、５５℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2
(商品名)核トラックエマルションに浸漬して４週間露出する。
【０１６０】 ３３Ｐ-リボプローブ合成 6.0μl（125mCi）の３３Ｐ-ＵＴＰ（Amersham BF 1002, SA＜2000 Ci/mmol）
をスピード真空乾燥させた。乾燥３３Ｐ-ＵＴＰを含む各管に以下の成分を添加
した： 2.0μlの5ｘ転写バッファー 1.0μlのＤＴＴ（100mM） 2.0μlのＮＴＰ混合物（2.5mM: 各10μlの10mM GTP, CTP及びATP+10μlのH2O
） 1.0μlのＵＴＰ（50μM） 1.0μlのＲＮＡｓｉｎ 1.0μlのＤＮＡテンプレート（1μg） 1.0μlのＨ２Ｏ 1.0μlのＲＮＡポメラーゼ（ＰＣＲ産物についてT3＝AS, T7=S,通常） 管を３７℃で１時間インキュベートし、1.0μlのRQ1 ＤＮａｓｅを添加し、次
いで３７℃で１５分間インキュベートした。90μlのＴＥ（10mMトリスpH7.6／1m
MのＥＤＴＡpH8.0）を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMi
crocon-50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム１０を用いてスピンさせた（6
分間）。濾過ユニットを第２の管に変換し、プログラム２を用いてスピンさせた
（3分間）。最終回収スピンの後、100μlのＴＥを添加した。1μlの最終生成物
をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUOR IITMで数えた。 プローブをＴＢＥ／尿素ゲル上で走らせた。1-3μlのプローブ又は5μlのＲＮ
Ａ ＭｒｋＩＩＩを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で９５℃
に３分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシング
し、試料を負荷し、180-250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラ
ップし、−７０℃冷凍機内で補強スクリーンを持つＸＡＲフィルムに１時間から
終夜露出した。
【０１６１】 ３３Ｐ-ハイブリッド形成 Ａ．凍結切片の前処理 スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で５分間
解凍した。トレイを５５℃のインキュベータに５分間配置して凝結を減らした。
スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で５分間固定し、0.
5ｘＳＳＣで５分間室温で洗浄した（25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O）。0.5μg/ml
のプロテイナーゼ中、３７℃で１０分間の脱タンパクの後（250mlの予備加熱Ｒ
Ｎａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中の10mg/mlストック12.5μl）、切片を0.5
ｘＳＳＣで１０分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各
2分間脱水した。 Ｂ．パラフィン包埋切片の前処理： スライドを脱パラフィンし、ＳＱ Ｈ２Ｏ中に配置し、2ｘＳＳＣで室温におい
て各々５分間２回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼＫ（250ｍｌの
ＲＮａｓｅ無しＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μｌ；３７℃、１５分間）
−ヒト胚又は８ｘプロテイナーゼＫ（250mlのＲＮａｓｅバッファー中100μl、
３７℃、３０分間）−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5ｘＳＳＣでの
リンス及び脱水は上記のように実施した。 Ｃ．プレハイブリッド化： スライドをＢｏｘバッファー（4ｘＳＳＣ、50%ホルムアミド）−飽和濾紙で列
を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリッド形成バッ
ファー（3.75gデキストラン硫酸＋6mlＳＱ Ｈ２Ｏ）で被覆し、ボルテックスし
、キャップを外して２分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75ml
のホルムアミド、3.75ｍｌの20ｘＳＳＣ及び9mlのＳＱ Ｈ２Ｏを添加し、組織を
良くボルテックスし、４２℃で1-4時間インキュベートした。
【０１６２】 Ｄ．ハイブリッド形成： スライド当たり1.0ｘ10６cpmのプローブ及び1.0μlのｔＲＮＡ（50mg/mlスト
ック）を９５℃で３分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48
μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの３３ Ｐ混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを５５℃
で終夜インキュベートした。 Ｅ．洗浄： 洗浄は、2ｘ10分間、2ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡで室温で実施し（400mlの20ｘSSC＋
16mlの0.25M EDTA、Ｖｆ＝４Ｌ）、次いでＲＮａｓｅＡ処理を３７℃で３０分間
行った（250mlＲＮａｓｅバッファー中10mg/mlを500μｌ＝20μg/ml）。スライ
ドを2ｘ10分間、ＥＤＴＡで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り
：５５℃で２時間、0.1ｘＳＳＣ、ＥＤＴＡ（20mlの20ｘSSC＋16mlのEDTA、Ｖｆ ＝４Ｌ）。 Ｆ．オリゴヌクレオチド ここに開示したＤＮＡ配列の一つについてインサイツ分析を実施した。これら
の分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである： （１）ＤＮＡ４７３６５−１２０６（ＰＲＯ３６４） p1： 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAC CCG AGC ATG GCA CAG CAC-3'(配
列番号：２４) p2： 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT CCC AGC CGC CCC TTC TC-3'(配
列番号：２５) Ｇ．結果 ここに開示した上記のＤＮＡ配列についてインサイツ分析を実施した。これら
の分析からの結果は次の通りである： （１）ＤＮＡ４７３６５−１２０６（ＰＲＯ３６４）（新規なTNF-レセプター相
同体） 胎児においては、椎骨体の前表面を内張する筋膜で発現が観察された。さらに
、胎児網膜全体に発言が見られた。胎児ニューロン全体に低レベルの発現が見ら
れた。その他の全ての組織なネガティブであった。
【０１６３】 実施例３ ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４のハイブリッド形成プローブとし
ての使用 以下の方法は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするヌ
クレオチド配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記述する。 （それぞれ図１、３及び５、それぞれ配列番号：１、６及び１６に示されたよ
うな）全長又は成熟ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４又はその断片
のコード化配列を含むＤＮＡを、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノ
ムライブラリの同種ＤＮＡ（ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の天
然発生変異体をコードするもの等）のスクリーニングのためのプローブとして用
いられる。 ハイブリッド形成及びいずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターの洗浄は
、以下の高緊縮性条件下で実施される。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ
３４４ポリペプチドをコードしている遺伝子から誘導された放射線標識プローブ
のフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5x ＳＳＣ、0.1%ＳＤ
Ｓ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード
液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で４２℃で２０時間実施した。フィルタ
ーの洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳ水溶液中で、４２℃で実施した。 全長天然配列をコードするＤＮＡと所望の配列同一性を持つＤＮＡは、次いで
この分野で知られた標準的技術を用いて同定できる。
【０１６４】 実施例４ 大腸菌におけるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の発現 この実施例は、大腸菌での組換え発現による非グリコシル化形態のＰＲＯ６５
５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の調製を例示する。 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするＤＮＡ配列を、選
択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅する。プライマーは、選択された発
現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種
々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌
から由来するもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン
及びテトラサイクリン耐性のためのの遺伝子を含んでいる。ベクターは、制限酵
素で消化され脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いでベクターに結合さ
せられる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、
ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエン
テロキナーゼ切断部位を含む）、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。 ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用い
て選択した大腸菌株の形質転換するために使用される。形質転換体は、それらの
ＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選
択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認さ
れる。 選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜
成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。
次に細胞を所望の光学密度になるまで成長させ、その間に発現プロモーターが作
動する。 更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離により採集してできる。遠心分離で得
られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化でき、次
いで可溶化ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４タンパク質を金属キレ
ート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製することがで
きる。
【０１６５】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４は、以下の手法を用いて、大腸
菌においてポリＨｉｓタグ形態で発現させてもよい。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６
４又はＰＲＯ３４４をコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最
初に増幅する。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応す
る制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの
迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク分解的除去を与える他の有用な
配列を含んでいる。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベク
ターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) c
lpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用する。形質転換体は、最初に
50mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ
Ｄ６００に達するまで成長させる。ついで培養物をＣＲＡＰ培地（3.57gの（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４、0.71gのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、1.07gのＫＣｌ、5.36g
のDifco酵母抽出物、500ml水中の5.36gのSheffield hycase SF、並びに110mMの
ＭＰＯＳ、pH7.3、0.55%（w/v）のグルコース及び7mMのＭｇＳＯ４の混合で調製
）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長さ
せた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析により発現を確認し、バルク培養
物を遠心分離して細胞のペレットとする。細胞細胞ペレットを精製及び再折りた
たみまで凍結させる。 0.5から1Lの発酵（6-10gペレット）からの大腸菌ペーストを、７Mのグアニジ
ン、２０mMのトリス、pH8バッファー中で１０容量（w/v）で再懸濁させる。固体
硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０.１M
及び０.０２Mとし、溶液を４℃で終夜撹拌する。この工程により、亜硫酸化によ
りブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質が得られる。溶液をBeck
man Ultracentrifuge中で40,000rpmで３０分間濃縮する。上清を金属キレートカ
ラムバッファー（6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4）の３−５容量で希釈
し、０.２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化する。透明化抽出物は
、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５mlのQiagen Ni2+-NTA金属キ
レートカラムに負荷する。カラムを５０mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol
grade）を含む添加バッファー、pH７.４で洗浄した。タンパク質を２５０mMのイ
ミダゾールを含有するバッファーで溶離する。所望のタンパク質を含有する画分
をプールし、４℃で保存する。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて
計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もる。
【０１６６】 試料を、２０mMのトリス、pH８.６、０.３MのＮａＣｌ、２.５Mの尿素、５mM
のシステイン、２０mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再
折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみ
させる。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マ
イクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を４℃で１２
−３６時間ゆっくり撹拌する。リフォールディング反応はＴＦＡを最終濃度０.
４%（約３のｐＨ）まで添加することにより停止させる。タンパク質をさらに精
製する前に、溶液を０.２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリ
ルを最終濃度２−１０%になるまで添加する。再折りたたみされたタンパク質を
、Poros R1/H逆相カラムで、０.１%ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０%のア
セトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかける。Ａ280吸収を持つ
画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたた
みされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質
の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎
水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最
低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離さ
れる。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて
、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。 所望の折りたたまれたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニ
トリルを除去する。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG２５
Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０.１４Mの塩化
ナトリウム及び４%のマンニトールを含む２０mMのＨＥＰＥＳ、pH６.８に調製す
る。 ＰＲＯ６５５及びＰＲＯ３６４は、上記の手法によりポリ-hisタグ形態で大腸
菌において成功裏に発現された。
【０１６７】 実施例５ 哺乳動物細胞におけるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の発現 この実施例は、哺乳動物細胞での組換え発現による潜在的にグリコシル化形態
のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の調製を例示する。 発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照
）を用いた。場合によっては、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４Ｄ
ＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、上掲のSambrook等に記載された
ような結合方法を用いてＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ＤＮＡの
挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５-ＰＲＯ６５５、ｐＲＫ５-ＰＲＯ３
６４又はｐＲＫ５-ＰＲＯ３４４と呼ばれる。 一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト
２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及
び又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの培地中で組織培養プレートにおいて成
長させて集密化する。約１０μgのｐＲＫ５-ＰＲＯ６５５、ｐＲＫ５-ＰＲＯ３
６４又はｐＲＫ５-ＰＲＯ３４４ＤＮＡをＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードする約１μ
gのＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１
mMトリス-ＨＣｌ、０.１mMのＥＤＴＡ、０.２２７MのＣａＣｌ２に溶解させる。
この混合物に、滴状の、５００μｌの５０mMのＨＥＰＥＳ（pH７.３５）、２８
０mMのＮａＣｌ、１.５mMのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形
成させる。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させる。
培養培地を吸引し、２mlのＰＢＳ中２０%グリセロールを３０秒間添加した。２
９３細胞を、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間
インキュベートした。 形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（単独）又は２００μ
Ci/mlの３５Ｓ-システイン及び２００μCi/mlの３５Ｓ-メチオニンを含む培養培
地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピン
フィルターで濃縮し、１５%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、
ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの存在を現す選択さ
れた時間にわたってフィルムに暴露する。形質転換した細胞を含む培地は、更な
るインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセ
イで試験する。
【０１６８】 これに換わる技術では、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４は、So
mparyrac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラ
ン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフ
ラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μgのｐＲＫ５-ＰＲＯ６５５、ｐＲＫ
５-ＰＲＯ３６４又はｐＲＫ５-ＰＲＯ３４４ＤＮＡを添加する。細胞は、まずス
ピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ−デキ
ストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０%グ
リセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ/m
lウシインシュリン及び０.１μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラス
コに再度導入する。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞
片を除去する。次いで発現されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
を含む試料を濃縮し、透析又はカラムクロマトグラフィー等の任意の選択した方
法によって精製する。 他の実施態様では、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をＣＨＯ細
胞で発現させることができる。ｐＲＫ５-ＰＲＯ６５５、ｐＲＫ５-ＰＲＯ３６４
又はｐＲＫ５-ＰＲＯ３４４は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキストランなどの既
知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細
胞培養物をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は３５Ｓ-メチオニン
等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６
４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に
置換してもよい。好ましくは、培養物を約６日間インキュベートし、次いで条件
培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４ポリペプチドを含む培地を濃縮して、任意の選択した方法によって精製する
ことができる。
【０１６９】 また、エピトープタグＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チドは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６
４又はＰＲＯ３４４はｐＲＫ５ベクターからサブクローニングする。サブクロー
ン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施されてバキュロウイルス発現ベクター中のポリ
-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグとインフレームで融合できる。ポリ-
ｈｉｓタグＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４挿入物は、次いで、安
定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベク
ターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで
（上記のように）形質移入する。発現を確認するために、上記のように標識化を
行ってもよい。発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰ
ＲＯ３４４を含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティ
クロマトグラフィー等の任意の選択された方法により精製できる。 またＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４は、一過性発現法でＣＨＯ
及び／またはＣＯＳ細胞において又は他の安定な発現法でＣＨＯ細胞において発
現させてもよい。 ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質
は、各タンパク質の可溶形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇ
Ｇ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ
作成物（イムノアドヘシン）及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現される
。
【０１７０】 ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of
Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載されたよう
な標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングする。ＣＨＯ発現
ベクターは、対象とするＤＮＡの適合制限部位５'及び３'を有し、ｃＤＮＡの便
利なシャトル化ができるように作成される。ＣＨＯ細胞での発現に用いたベクタ
ーは、Lucas等, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたよう
なもので、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ
）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ
発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。 所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superf
ect（商品名）(Quiagen), Dosper（商品名）及びFugene（商品名）（Boehringer
Mannheim）を使用して約一千万のＣＨＯ細胞に導入する。細胞は、上掲のLucas
等に記載されているように成長させる。約３ｘ１０−７細胞を、下記のような更
なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させる。
【０１７１】 プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより
混合する。内容物を１０mlの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００rpmで
５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０mｌの選択培地（０.２μm濾過
ＰＳ２０、５%の０.２μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させる。次い
で細胞を９０mlの選択培地を含む１００mlスピナーに分けた。１−２日後、細胞
を１５０mlの選択培地を満たした２５０mlスピナーに移し、３７℃でインキュベ
ートする。さらに２−３日後、２５０ml、５００ml及び２０００mlのスピナーを
３ｘ１０５細胞/mlで播種する。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、
生産培地に再懸濁させる。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には
1992年6月16日に発行の米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用する
。３Lの生産スピナーを１.２ｘ１０６細胞/mlで播種する。０日目に、細胞数と
ｐＨを測定する。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施す
る。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、３０mlの５００g/
Lのグルコース及び０.６mlの１０%消泡剤（例えば３５%ポリジメチルシロキサン
エマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）を加える。生産を通
して、ｐＨは７.２近傍に調節し維持する。１０日後、又は生存率が７０%を下回
るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０.２２μmフィルターを通して濾過する
。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷する。
【０１７２】 ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はＮｉ２＋−ＮＴＡカラム(Qiag
en)を用いて精製する。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５mMの濃度まで
添加する。条件培地を、０.３MのＮａＣｌ及び５mMイミダゾールを含む２０mMの
Ｈｅｐｅｓ, pH７.４バッファーで平衡化した６mlのＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに
４−５ml/分の流速で４℃においてポンプ供給する。負荷後、カラムをさらに平
衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０.２５Mイミダゾールを含む平衡バッファ
ーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０mMのＨｅｐｅｓ、０
.１４MのＮａＣｌ及び４%のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で２５mlのG２
５ Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。 イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製す
る。条件培地を、２０mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH６.８で平衡化した
５mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷する。負荷後、カラムを平衡バ
ッファーで強く洗浄した後、１００mMのクエン酸, pH３.５で溶離する。溶離し
たタンパク質は、１mlの画分を２７５μlの１Mトリスバッファー, pH９を含む管
に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質は、続い
てポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。
均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより及び、エドマン(Edman)分解によ
りＮ-末端アミノ酸配列決定により評価する。 ＰＲＯ３６４は上記の手法によりＣＨＯ細胞において安定に発現された。さら
にＰＲＯ３６４はＣＨＯ細胞において一過性発現手法により発現された。
【０１７３】 実施例６ 酵母菌でのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の発現 以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の
組換え発現を記載する。 第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６
４又はＰＲＯ３４４の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成す
る。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするＤＮＡ及びプロ
モーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯ６５５、
ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードするＤＮＡを選択したプラスミ
ドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、天然ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又
はＰＲＯ３４４シグナルポリペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチドをコード
するＤＮＡ、又は、例えば酵母菌アルファ因子又はインベルターゼ分泌シグナル
／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４の発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。 酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０%トリ
クロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシー
ブルー染色でゲルの染色をすることができる。 続いて組換えＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４は、発酵培地から
遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルター
を用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯ６５５、ＰＲ
Ｏ３６４又はＰＲＯ３４４を含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィ
ー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１７４】 実施例７ バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４
４の発現 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における組換え発現を記載す
る。 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４をコードする配列は、バキュロ
ウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させる。このよう
なエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ
領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Novagen）などの市販されているプラスミ
ドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡
単には、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４コード化配列又はＰＲＯ
６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４コード化配列の所望部分（膜貫通タンパ
ク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外ならば成熟タン
パク質をコードしている配列など）が、５'及び３'領域に相補的なプライマーで
のＰＣＲにより増幅される。５'プライマーは、隣接する（選択された）制限酵
素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化さ
れ、発現ベクターにサブクローニングされる。 組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold（商品名）ウイ
ルスＤＮＡ（Pharmingen）を、スポドプテラフルギピルダ（Spodoptera frugipe
rda）（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLか
ら市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日イ
ンキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイ
ルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vector
s: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載され
ているように実施する。
【０１７５】 次いで、発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ
３４４は、例えば、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより
以下のように精製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (199３)
に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製する。
簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５mlのＨｅｐｅｓ
、pH７.９；1２.５mMのＭｇＣｌ２；０.1mMのＥＤＴＡ；１０%のグリセロール；
０.１%のＮＰ-４０；０.４MのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音
波処理する。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０
mMリン酸塩、３００mMＮａＣｌ、１０%のグリセロール、pH７.８）で５０倍希釈
し、０.４５μｍフィルターで濾過する。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qi
agenから市販）を５mlの総容積で調製し、２５mlの水で洗浄し、２５mlの負荷バ
ッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物は、毎分０.５mlでカラムに負荷す
る。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッ
ファーで洗浄する。次に、カラムを非特異的に結合したタンパク質を溶離する二
次洗浄バッファー（５０mMのリン酸塩；３００mMのＮａＣｌ、１０%のグリセロ
ール、pH６.０）で洗浄する。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラ
ムを二次洗浄バッファー中で０から５００mMのイミダゾール勾配で展開する。１
mlの分画を回収し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Q
iagen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析する。溶離し
たＨｉｓ１０−タグＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４を含む分画を
それぞれプールし、負荷バッファーで透析する。
【０１７６】 あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４の精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラ
フィーを含む既知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。 ＰＣＲ増幅に続いて、各コード化配列をバキュロウイルス発現ベクター（Ｉｇ
Ｇ融合物に対するpb.PH.IgG及びポリＨｉｓタグタンパク質に対するpb.PH.His.c
）にサブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュロウイ
ルスＤＮＡ（Pharmingen）を１０５スポドプテラグフルギペルダ（Spodoptera f
rugiperda）（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）にリポフェクチン（Gibco BR
L）を用いて同時形質移入する。pb.PH.IgG及びPH.Hisは、市販のバキュロウイル
ス発現ベクターｐＶＬ１３９３（Pharmingen）の修飾物であり、Ｈｉｓ又はＦｃ
タグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、１０%のＦ
ＢＳ（Hyclone）を添加したHinkのＴＮＭ-ＦＭ培地で成長させる。細胞は、２８
℃で５日間インキュベートする。上清を回収し、続いて１０%ＦＢＳを添加したH
inkのＴＮＭ-ＦＨ培地におけるＳｆ９細胞感染による約１０の感染効率（ＭＯＩ
）での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を２８℃で３日間インキュベートする
。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、１ml
の上清の２５mlのヒスチジンタグタンパク質用のＮｉ２＋-ＮＴＡビーズ（QIAGE
N）又はＩｇＧタグタンパク質用のプロテインＡセファロースCL-４Bビーズ（Pha
rmacia）へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により既知の濃度のタンパ
ク質標準と比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により測定する。 第１の増幅ウイルス上清をＥＳＦ-９２１培地（Expression System LLC）で成
長させるＳｆ９細胞のスピナー培地（５００ml）の約０.１のＭＯＩでの感染に
使用する。細胞は２８℃で３日間インキュベートする。上清を回収して濾過する
。バッチ結合及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、スピナー培養物の発現が確認される
まで、必要に応じて繰り返す。
【０１７７】 形質移入細胞からの条件培地（０.５〜３L）を、遠心分離により細胞を除去し
０.２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収する。ポリ-Ｈｉｓ
タグ作成物については、タンパク質作成物をＮｉ２＋-ＮＴＡカラム（Qiagen）
を用いて精製する。精製前に、イミダゾールを条件培地に５mMの濃度まで添加す
る。条件培地を、０.３MのＮａＣｌ及び５mMイミダゾールを含む２０mMのＨｅｐ
ｅｓ, pH７.４バッファーで平衡化した６mlのＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに４-５ml
/分の流速で４℃においてポンプ供給する。負荷後、カラムをさらに平衡バッフ
ァーで洗浄し、タンパク質を０.２５Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離
する。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０mMのＨｅｐｅｓ、０.１４Mの
ＮａＣｌ及び４%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH６.８中で２５mlのG
２５ Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。
【０１７８】 タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培
地から精製する。条件培地を、２０mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH６.８
で平衡化した５mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷する。負荷後、カ
ラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００mMのクエン酸, pH３.５で溶離
する。溶離したタンパク質は、１mlの画分を２７５mlの１Mトリスバッファー, p
H９を含む管に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパ
ク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中
で脱塩する。タンパク質の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電
気泳動及びエドマン(Edman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定により評価され
る。 ＰＲＯ３４４は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞において発現された。 あるいは、ｈｉｇｈ-５細胞を取り込んだ変更を加えたバキュロウィルスの手
段を使用してもよい。この手段では所望の配列をコード化しているＤＮＡは、適
切な系、例えばＰｆｕ（Stratagene）で増幅され、又はバキュロウィルス発現ベ
クターに含まれていたエピトープタグの上流（５'側）に融合される。そのよう
なエピトープタグはポリＨｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域
）を含む。ｐＩＥ１−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような商業的に入手可能なプラス
ミドから得られるプラスミドを含む様々なプラスミドが利用されてもよい。ｐＩ
Ｅ１−１及びｐＩＥ１−２ベクターは安定に形質転換された昆虫細胞（１）にお
けるバキュロウィルスｉｅ１プロモーターからの組み替えタンパク質の構成的な
発現のために設計される。プラスミドは複数のクローン化部位の配向でのみ異な
り、ｈｒ５エンハンサーエレメント並びに感染していない昆虫細胞でのｉｅ１媒
介遺伝子発現に重要であることが知られているすべてのプロモーター配列を含む
。ｐＩＥ１−１及びｐＩＥ１−２は翻訳開始部位を含み、融合タンパク質の生産
に使用される。簡単に言えば、所望の配列または配列の所望部分（例えば膜貫通
タンパクの細胞外ドメインをコード化する配列）はＰＣＲによって５'と３'領域
に相補的なプライマーを使って増幅される。５'プライマーはフランキング（選
択された）制限酵素部位を組み込む。次いで生成物はこれらの選択された制限酵
素で消化された発現ベクター中にサブクローニングされる。例えば、ｐＩＥ１−
１の誘導体はヒトＩｇＧ（ｐｂ.ＰＨ.ＩｇＧ）のＦｃ領域又は所望の配列の下流
（３'側）の８ヒスチジン（ｐｂ.ＰＨ.Ｈｉｓ）を含む。好適には、ベクター作
成物は確認のために配列決定される。
【０１７９】 ｈｉｇｈ-５細胞は２７℃、ＣＯ２無しの、ＮＯｐｅｎ／ｓｔｒｅｐの条件下
で５０％の集密度まで生育する。それぞれの１５０ｍｍプレートに対し塩基配列
を含む条件３０μｇのｐＩＥベースベクターを１mlのEx-Cell培地（培地：Ex-Ce
ll401+1/100L-Glu JRH Bioscience #14401-78P(注：この培地は光感受性である)
）と混合され、分離したチューブで１００μｌのCellFectin（CellFECTIN（Gibc
oBRL#10362-010）（ボルテックスで混合））を１mlのEx-Cell培地でと混合する
。２つの溶液を混ぜ合わせ、室温で１５分間インキュベートする。８mlのEx-Cel
l培地を２mlのDNA/CellFECTIN混合物に加え、先にEx-Cell培地で洗浄しておいた
ｈｉｇｈ−５細胞上に重ねる。ついでプレートを室温で１時間暗所でインキュベ
ートする。DNA/CellFECTIN混合物は時に吸引され、細胞は一度Ex-Cellで洗浄し
て過剰のCellFECTIN混合物を除去し、３０mlの新鮮なEx-Cell培地を加え、２８
℃で３日間インキュベートする。上清を収集し、バキュロウィルス発現ベクター
での配列の発現をヒスチジンタグタンパク質に対してはＮｉ２＋-ＮＴＡビーズ
（ＱＩＡＧＥＮ）の、ＩｇＧタグタンパク質に対してはプロテインＡセファロー
スＣＬ−４Ｂビーズ（Pharmacia）の２５mlに対する１mlの上清をバッチ結合さ
せ、次いでクーマーシブルー染色によりタンパク質標準の既知の濃度と比較する
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により決定する。
【０１８０】 形質移入細胞からの条件培地（０.５〜３L）を、遠心分離により細胞を除去し
０.２２ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収する。ポリ-Ｈｉｓ
タグ作成物については、配列を含むタンパク質をＮｉ２＋-ＮＴＡカラム（Qiage
n）を用いて精製する。精製前に、イミダゾールを条件培地に５mMの濃度まで添
加する。条件培地を、０.３MのＮａＣｌ及び５mMイミダゾールを含む２０mMのＨ
ｅｐｅｓ, pH７.４バッファーで平衡化した６mlのＮｉ−ＮＴＡカラムに４-５ml
/分の流速で４８℃でポンプ供給する。負荷後、カラムを更なる平衡バッファー
で洗浄し、タンパク質を０.２５Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する
。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０mMのＨｅｐｅｓ、０.１４MのＮａ
Ｃｌ及び４%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH６.８中で２５mlのG２５
Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵する。 タンパク質のイムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培
地から精製する。条件培地を、２０mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH６.８
で平衡化した５mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷する。負荷後、カ
ラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００mMのクエン酸, pH３.５で溶離
する。溶離したタンパク質は、１mlの画分を２７５mlの１Mトリスバッファー, p
H９を含む管に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパ
ク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中
で脱塩する。タンパク質の均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルとエドマン(E
dman)分解によるＮ-末端アミノ酸配列決定及び所望または必要に応じて他の分析
手段により評価される。 ＰＲＯ３６４及びＰＲＯ３４４は、ｈｉｇｈ-５細胞を用いる上記のバキュロ
ウィルス法を用いて発現された。
【０１８１】 実施例８ ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４に結合する抗体の調製 この実施例は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４に特異的に結合
できるモノクローナル抗体の調製を例示する。 モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば
、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ６５５、
ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
を含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をするこ
となくなすことができる。 Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は
腹腔内に１−１００マイクログラムで注入したＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又は
ＰＲＯ３４４免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ-ＴＤＭアジュバ
ント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠
に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択した
アジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウ
スをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、
抗-ＰＲＯ３４４、抗-ＰＲＯ１７２又は抗-ＰＲＯ１８２抗体の検出のためのＥ
ＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマ
ウスから周期的に採取してもよい。
【０１８２】 適当な抗体力価が検出された後、抗体に対して「ポジティブ」な動物に、ＰＲ
Ｏ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４の最後の静脈内注射を注射することが
できる。３から４日後にマウスを屠殺して脾臓細胞を取り出した。次いで脾臓細
胞を（35%ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９
７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合
させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いでそれをＨＡＴ（ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プ
レートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの
増殖を阻害させた。 ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４に対す
る反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ
３６４又はＰＲＯ３４４に対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジテ
ィブ」ハイブリドーマ細胞の決定は当業者の技量の範囲内である。 ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、
抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４、抗-ＰＲＯ３４４、抗-ＰＲＯ１７２又は抗
-ＰＲＯ１８２モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブ
リドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもでき
る。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、
それに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、
抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマト
グラフィーを用いることもできる。
【０１８３】 実施例９ 特異的抗体を用いたＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
の精製 天然又は組換えＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドは
、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、
プロ-ＰＲＯ６５５、プロ-ＰＲＯ３６４又はプロ-ＰＲＯ３４４ポリペプチド、
成熟ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド、又はプレ-Ｐ
ＲＯ６５５、プレ-ＰＲＯ３６４又はプレ-ＰＲＯ３４４ポリペプチドは、対象と
するＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドに特異的な抗体
を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和
性カラムは抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４又は抗-ＰＲＯ３４４ポリペプチ
ド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。 ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロ
テインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいず
れかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アン
モニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水
液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セ
ファロース(商品名)（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー
樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹
脂は製造者の指示に従って洗浄される。 このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又
はＰＲＯ３４４ポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰ
ＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの精製において利用さ
れる。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分
離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるい
は、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドは、細胞が成長する培地中に有用な量で分泌される。 可溶化ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド含有調製物
は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
Ｏ３４４ポリペプチドの優先的な吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の
高イオン強度バッファー）で洗浄される。ついで、カラムは、抗体／ＰＲＯ６５
５、抗体／ＰＲＯ３６４、又は抗体／ＰＲＯ３４４ポリペプチド結合を分解する
条件下（例えば、約２−３といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオ
ン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４
４ポリペプチドが回収される。
【０１８４】 実施例１０：薬剤スクリーニング 本発明は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又はそ
の結合断片を種々の薬剤スクリーニング技術において使用することによる化合物
のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯ６５５
、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態で
も、固体支持体に固定されても、細胞表面に担持されていても、細胞内に位置し
ていてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６
４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移
入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移
入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのよう
な細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイ
に使用できる。例えば、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チド又は断片と試験される試薬の間での複合体の形成を測定してよい。あるいは
、試験する試薬によって生ずるＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチドとその標的細胞又は標的レセプターとの間の複合体形成における減少
を試験することもできる。 しかして、本発明は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニン
グ方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又
はＰＲＯ３４４ポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とＰＲＯ６５５、Ｐ
ＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又は断片との間の複合体の存在につい
て、又は(ii)ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又は断
片と細胞との間の複合体の存在について、当該分野でよく知られた方法によって
検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３
６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なイ
ンキュベーションの後、自由なＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポ
リペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が
、特定の試薬がＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドに結
合する又はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド／細胞複
合体を阻害する能力の尺度となる。
【０１８５】 薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親
和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9
月13日に公開されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多
数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾
つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４
ポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４
又はＰＲＯ３４４ポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯ６５５、
ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドはこの分野で良く知られた方法によ
り検出される。精製したＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆
することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持
体上に固定化するのに使用できる。 また、本発明は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
に結合可能な中和抗体がＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニン
グアッセイも考慮する。このようにして、抗体は、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４
又はＰＲＯ３４４ポリペプチドと、一又は複数の抗原決定基を共有する任意のペ
プチドの存在を検出するのに使用できる。
【０１８６】 実施例１１：合理的薬剤設計 合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（すなわち、
ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド）又はそれらが相互
作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造
的類似物を製造することである。これらの例の任意のものが、ＰＲＯ６５５、Ｐ
ＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボ
でＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの機能を促進又は
阻害する薬剤の創出に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21
(1991)）。 一アプローチ法では、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプ
チド、又はＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド-インヒ
ビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により
、又は最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定される。分子の構造を
解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３
４４ポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少な
いが、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの構造に関す
る有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られること
もある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ
３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド様分子の設計又は効果的なインヒビターの
同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Bioche
mistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような改善された活性又は安定性
を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されてい
るような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして
作用する分子を含む。
【０１８７】 また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離
しその結晶構造を解明することもできる。このアプローチ法は、原理的には、そ
れに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成す
る。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）
を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の
鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる
。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプ
チドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコア
として機能するであろう。 本発明により、十分な量のＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリ
ペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。また、
ここに提供したＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドアミ
ノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に換えて、又はそれに加えてコンピュータモデル
化技術を用いるものへの手引きを提供する。
【０１８８】 実施例１２ インビトロ抗腫瘍アッセイ ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチドの抗増殖活性を、
Skehan等, J. Natl. Cancer Inst., 82:1107-1112(1990)により本質的に記載さ
れているようなスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染色結合アッセイを使用して、国
立ガン研究所（ＮＣＩ）の治験疾患指向インビトロ抗ガン薬発見アッセイにおい
て決定した。この研究で使用した６０の腫瘍細胞株（「ＮＣＩパネル」）並びに
インビトロでの維持と培養の条件はMonks等, J. Natl. Cancer Inst., 83:757-7
66 (1991)によって記載されている。このスクリーニングの目的は異なったタイ
プの腫瘍に対して試験化合物の細胞障害及び／又は細胞分裂停止活性を最初に評
価することである（上掲のMonks等；Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Upda
te, 3(10):1-12[1989]）。 およそ６０のヒト腫瘍細胞株由来の細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco）で
収集し、一度洗浄し、ＩＭＥＭに再懸濁させ、その生存度を決定した。細胞懸濁
物をピペット（１００μｌ容量）で別個の９６ウェルのマイクロタイタープレー
トに加えた。過成長を防ぐため、６日のインキュべーションに対する細胞密度は
２日のインキュべーションのものより少なかった。安定化のために３７℃での２
４時間のプレインキュベーション時間で播種が可能になった。意図した試験濃度
の２倍希釈物が、時間ゼロの時点で１００μｌの分割量でマイクロタイタープレ
ートウェルに加えられた（１：２の希釈）。試験化合物を５倍半の対数希釈で評
価した（１０００から１００,０００倍）。インキュベーションは５％のＣＯ２
雰囲気及び１００％湿度で２日間及び６日間行われた。 インキュべーション後、培地を取り除き、細胞を４０℃で０．１mlの１０％ト
リクロロ酢酸中に固定した。プレートを脱イオン水で５回洗浄し、乾燥させ、１
％酢酸中に０．１ml入った０．４％スルホローダミンＢ染料（Sigma）で３０分
間染色し、１％酢酸で４回洗い流して、未結合染料を取り除き、乾燥させ、０．
１mlの１０ｍＭトリス塩基[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン]、ｐＨ１０
．５で５分間染色物を抽出した。４９２ｎｍでのスルホローダミンＢの吸光度（
ＯＤ）をコンピュータに接続した９６ウェルのマクロタイタープレートリーダー
を使用して測定した。
【０１８９】 試験試料は一回又は複数の濃度で少なくとも４０％の成長阻害効果を示すとポ
ジティブと考えられる。結果を次の表４に示すが、そこでは腫瘍細胞型の省略記
号は次の通りである： ＮＳＣＬ＝非小細胞肺ガン；ＣＮＳ＝中枢神経系
【０１９０】 材料の寄託 次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １０８０１ ユ
ニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０−２２０９米国
(ＡＴＣＣ)に寄託した： 材料 ATCC寄託番号 寄託日 DNA50960-1224 209509 1997年12月 3日 DNA47365-1206 209436 1997年11月 7日 DNA40592-1242 209492 1997年11月21日
【０１９１】 これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペス
ト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の
日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の
合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、何れが最初に来ようと
も、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄
託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法
第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３
７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定し
た者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０１９２】 本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた
場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のもの
と速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従い
あらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセン
スであるとみなされるものではない。 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本
発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものでは
ないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈される
ものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の
範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】 天然配列ＰＲＯ６５５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番
号：１）を示す図であり、配列番号：１は、ここで「ＤＮＡ５０９６０-１２２
４」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ２】 Ｆｉｇ１に示した配列番号：１のコード化配列から誘導され
たアミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【Ｆｉｇ３】 天然配列ＰＲＯ３６４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番
号：６）を示す図であり、配列番号：６は、ここで「ＤＮＡ４７３６５-１２０
６」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ４】 Ｆｉｇ３に示した配列番号：６のコード化配列から誘導され
たアミノ酸配列（配列番号：７）を示す図である。
【Ｆｉｇ５】 天然配列ＰＲＯ３４４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番
号：１６）を示す図であり、配列番号：１６は、ここで「ＤＮＡ４０５９２-１
２４２」と命名されるクローンである。
【Ｆｉｇ６】 Ｆｉｇ５に示した配列番号：１６のコード化配列から誘導さ
れたアミノ酸配列（配列番号：１７）を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/02 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 43/00 １０５ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 19/00 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ 21/08 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ６０／１１３，２９６ (32)優先日 平成10年12月22日(1998．12．22) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４４，７５８ (32)優先日 平成11年７月20日(1999．7．20) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１４５，６９８ (32)優先日 平成11年７月26日(1999．7．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 460 Ｐｏｉｎｔ Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ Ｂｌｖｄ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080 ＵＳＡ (72)発明者 ゴッダード，オードリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94131， サンフランシスコ，コンゴ ストリート 110 (72)発明者 ガーニー，オースティン，エル． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002， ベルモント，デビー レーン １ (72)発明者 ヒラン，ケネス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94114， サン フランシスコ，セワード ストリー ト 64 (72)発明者 ネイピエール，メアリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， ヒルズボロー，ハイン・ロード 1015 (72)発明者 ウッド，ウィリアム，アイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94010， ヒルス ボロー，サウスダウン コート 35 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA78 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA44 BA80 CA04 CA07 CA09 CA11 CA20 DA02 DA03 DA06 DA12 EA02 EA04 GA03 GA11 GA13 GA18 GA19 HA03 HA13 HA14 4B064 AG01 AG27 CA02 CA06 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 CE07 CE10 CE12 CE20 DA01 DA13 4B065 AA26X AA58X AA72X AA90X AA91X AA93X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA05 BB01 BC01 BD01 BD14 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA03 AA07 AA17 AA20 AA27 BA01 BA02 BA08 BA22 CA18 CA25 DA01 DA21 NA14 ZB212 ZB261 ZB271 ZC412 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA28 EA50 FA72 FA74 GA22 GA25 GA26

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
    、又はそのアゴニストの治療的有効量を、製薬的に許容される担体と混合して含
    んでなる、腫瘍性細胞成長阻害のために有用な物質の組成物。
  2. 【請求項２】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
    、又はそのアゴニストの成長阻害量を含む請求項１に記載の物質の組成物。
  3. 【請求項３】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
    、又はそのアゴニストの細胞毒性量を含む請求項１に記載の物質の組成物。
  4. 【請求項４】 さらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治療薬を付加的に
    含む請求項１に記載の物質の組成物。
  5. 【請求項５】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド
    、又はそのアゴニストの治療的有効量を含んでなる、哺乳動物における腫瘍を治
    療するために有用な物質の組成物。
  6. 【請求項６】 前記腫瘍が癌である請求項５に記載の物質の組成物。
  7. 【請求項７】 癌が、乳癌、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、子宮癌、前立腺
    癌、肺癌、膀胱癌、中枢神経系癌、骨髄腫及び白血病からなる群から選択される
    請求項６に記載の物質の組成物。
  8. 【請求項８】 腫瘍細胞の成長を阻害する方法において、前記腫瘍細胞を、
    ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド、又はそのアゴニス
    トの有効量に暴露することを含んでなる方法。
  9. 【請求項９】 前記アゴニストが、抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４又は
    抗-ＰＲＯ３４４アゴニスト抗体である請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記アゴニストが、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
    Ｏ３４４ポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である請求項８に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】 前記暴露工程が、インビトロで行われる請求項８に記載の
    方法。
  12. 【請求項１２】 前記暴露工程が、インビボで行われる請求項８に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】 容器；及び 当該容器内に収容された活性剤を含有する組成物とを具備し、前記組成物中の
    活性剤がＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチド又はそのア
    ゴニストである製造品。
  14. 【請求項１４】 腫瘍細胞成長を阻害するための前記組成物の用途を記した
    、前記容器に貼付られたラベル又は前記容器に挿入された包装挿入物をさらに具
    備する請求項１３に記載の製造品。
  15. 【請求項１５】 前記アゴニストが、抗-ＰＲＯ６５５、抗-ＰＲＯ３６４又
    は抗-ＰＲＯ３４４アゴニスト抗体である請求項１３に記載の製造品。
  16. 【請求項１６】 前記アゴニストが、ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲ
    Ｏ３４４ポリペプチドの生物学的活性を模倣する小分子である請求項１３に記載
    の方法。
  17. 【請求項１７】 前記活性剤が、哺乳動物における腫瘍の治療に有効な量で
    存在する、請求項１３に記載の物質の製造品。
  18. 【請求項１８】 さらなる成長阻害薬、細胞毒性薬又は化学治療薬を付加的
    に含む請求項１３に記載の物質の製造品。
  19. 【請求項１９】 Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、
    及びＦｉｇ６（配列番号：１７）に示すアミノ酸配列からなる群から選択される
    アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％の核酸
    配列同一性を有する単離された核酸。
  20. 【請求項２０】 Ｆｉｇ１（配列番号：１）、Ｆｉｇ３（配列番号：６）、
    及びＦｉｇ５（配列番号：１６）に示すヌクレオチド配列からなる群から選択さ
    れるヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する単
    離された核酸。
  21. 【請求項２１】 Ｆｉｇ１（配列番号：１）、Ｆｉｇ３（配列番号：６）、
    及びＦｉｇ５（配列番号：１６）に示すヌクレオチド配列の全長コード化配列か
    らなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０％の核酸配
    列同一性を有する単離された核酸。
  22. 【請求項２２】 ＡＴＣＣ登録番号２０９５０９、２０９４３６又は２０９
    ４９２の下で寄託されたＤＮＡの全長コード化配列に対して少なくとも約８０％
    の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
  23. 【請求項２３】 請求項１９から２２のいずれか一項に記載の核酸を含むベ
    クター。
  24. 【請求項２４】 当該ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識され
    るコントロール配列に作用可能に結合した請求項２３に記載のベクター。
  25. 【請求項２５】 請求項２３項に記載のベクターを含む宿主細胞。
  26. 【請求項２６】 前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項２５項に記載の宿主細
    胞。
  27. 【請求項２７】 前記細胞が大腸菌である請求項２５項に記載の宿主細胞。
  28. 【請求項２８】 前記細胞が酵母菌細胞である請求項２５項に記載の宿主細
    胞。
  29. 【請求項２９】 前記細胞がバキュウロウイルス感染昆虫細胞である請求項
    ２５項に記載の宿主細胞。
  30. 【請求項３０】 ＰＲＯ６５５、ＰＲＯ３６４又はＰＲＯ３４４ポリペプチ
    ドを製造する方法において、請求項２５に記載の宿主細胞を前記ポリペプチドの
    発現に適した条件下で培養し、そして培養培地から前記ポリペプチドを回収する
    ことを含んでなる方法。
  31. 【請求項３１】 Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、
    及びＦｉｇ６（配列番号：１７）に示すアミノ酸配列からなる群から選択される
    アミノ酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離さ
    れたポリペプチド。
  32. 【請求項３２】 Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、
    及びＦｉｇ６（配列番号：１７）に示すアミノ酸配列からなる群から選択される
    アミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブのスコアとされる
    単離されたポリペプチド。
  33. 【請求項３３】 ＡＴＣＣ登録番号２０９５０９、２０９４３６又は２０９
    ４９２の下で寄託されたＤＮＡの全長コード化配列によってコードされるアミノ
    酸配列に対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
    。
  34. 【請求項３４】 異種アミノ酸配列に融合した請求項３１から３３のいずれ
    か一項に記載のポリペプチドを含むキメラ分子。
  35. 【請求項３５】 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項
    ３４に記載のキメラ分子。
  36. 【請求項３６】 前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である
    請求項３４に記載のキメラ分子。
  37. 【請求項３７】 請求項３１から３３のいずれか一項に記載のポリペプチド
    に特異的に結合する抗体。
  38. 【請求項３８】 前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗
    体である請求項３７に記載の抗体。
  39. 【請求項３９】 （ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：
    ７）、及びＦｉｇ６（配列番号：１７）に示すポリペプチドであって、それに付
    随するシグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列； （ｂ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、及びＦｉｇ６
    （配列番号：１７）に示すポリペプチドの細胞外ドメインであって、そのシグナ
    ルペプチドを有するものをコードするヌクレオチド配列；又は （ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、及びＦｉｇ６
    （配列番号：１７）に示すポリペプチドの細胞外ドメインであって、それに付随
    するシグナルペプチドを欠くものをコードするヌクレオチド配列に対して少なく
    とも約８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
  40. 【請求項４０】 （ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：
    ７）、及びＦｉｇ６（配列番号：１７）に示すポリペプチドであって、それに付
    随するシグナルペプチドを欠くもの； （ｂ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、及びＦｉｇ６
    （配列番号：１７）に示すポリペプチドの細胞外ドメインであって、そのシグナ
    ルペプチドを有するもの；又は （ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、及びＦｉｇ６
    （配列番号：１７）に示すポリペプチドの細胞外ドメインであって、それに付随
    するシグナルペプチドを欠くものに対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同
    一性を有する単離されたポリペプチド。
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