FR2531865A1 - Preparation a base d'interferon et son procede de fabrication - Google Patents

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE NOUVELLE COMPOSITION DE MATIERE PRESENTANT UNE ACTIVITE ANTIVIRALE. LA MATIERE PEUT ETRE PREPAREE PAR EXEMPLE PAR EXPOSITION DE CELLULES EPITHELIALES HUMAINES DIPLOIDES PRIMAIRES A UN VIRUS OU CERTAINS ACIDES NUCLEIQUES, PUIS PAR INCUBATION DES CELLULES DANS DES CONDITIONS QUI PROVOQUENT LA FORMATION DE LA COMPOSITION QUI EST UN NOUVEL INTERFERON SECRETE DANS LE MILIEU DE CULTURE. LA MATIERE OBTENUE, LORS D'ANALYSES DE SON ACTION SUR DES CULTURES D'ORIGINE HUMAINE ET BOVINE, PRESENTE UN PROFIL ORIGINAL D'ACTIVITE. LA MATIERE NE PRESENTE PAS DE REACTIVITE MUTUELLE NOTABLE AVEC DES ANTISERUMS PREPARES EN REFERENCE AUX INTERFERONS-A, B ET G DANS DES ANALYSES PAR NEUTRALISATION. APPLICATION A LA LUTTE CONTRE LES INFECTIONS PAR LES VIRUS.

Description

La présente invention concerne une nouvelle composition tion de matière

(appelée dans la suite du présent mémoire "interféron epsilon" ou "IFN-s" utile par exemple dans des

cultures de cellules humaines ou autres comme agent anti-

viral et/ou de lutte contre la prolifération, ainsi que des procédés de fabrication d'une telle composition et des procédés de traitement de cellules épithéliales humaines

afin qu'elles résistent aux infections virales.

Les interférons sont des matières qui possèdent des propriétés antivirales On les prépare à l'aide de

certains types de cellules qui ont été stimulées par expo-

sition à un virus, à certains acides nucléiques et à des complexes antigènes-mitogènes Les interférons sont des produits pharmaceutiques extrêmement puissants qui sont

très prometteurs comme agents cliniques antiviraux et anti-

tumeurs.

Il existe actuellement trois types connus d'in-

terférons humains: l'interféron alpha (IFN-ac), préparé à partir des leucocytes humains ou de cellules lymphoblastoîdes, l'interféron béta (IFN-0), préparé à partir de fibroblastes,

et l'interféron gamma (IFN-y), préparé à partir de lympho-

cytes T humains Ces trois interférons sont secrétés par les cellules respectives après stimulation de celles-ci par

virus, certains acides nucléiques ou des complexes antigènes-

mitogènes Des indications récentes montrent que ces inter-

férons peuvent comprendre un mélange de protéines à structure liée, et non une seule protéine Les interférons humains peuvent être différenciés les uns des autres par leur niveau différent d'activité sur des cultures de cellules humaines

et bovines Une analyse utilisée pour la mesure de -l'acti-

vité peut être réalisée comme décrit dans The Interferon System, William E Stewart, Springer Verlag Co, New York, 1978, qui est une variante de la méthode de Ho et Enders, The Proceedings of the National Academy of Sciences, Volume 45, pages 385-389, 1959 IFN-a a un niveau d'activité antivirale sur les cultures de cellules de reins de boeufs qui est de 1 à 5 fois son activité sur des cultures de fibroblastes humains IFN-e a un niveau d'activité antivirale sur des cultures de cellules de reins de boeufs de 1/100 à 2/100 fois son activité sur des cultures de fibroblastes humains IFN-y a une activité sur des cultures de cellules de boeufs inférieure à 1/100 fois son activité sur des cul-

tures de fibroblastes humains.

Dans le procédé le plus productif de fabrication de IFN-a à partir de leucocytes humains, une unité environ d'interféron est produite par 50 cellules IFN-y est préparé à partir des lymphocytes T humains avec un rendement d'environ

1 unité pour 1000 cellules IFN-e préparé à partir de fibro-

blastes humains a un rendement optimal d'environ 1 unité

pour 15 cellules.

Une unité antivirale d'interféron correspond à la concentration qui protège la moitié des cellules d'une culture de fibroblastes humains soumises à la compétition

du virus de stomatite vésiculaire à une concentration nor-

malisée ou standard (un pfu/cellule).

On a détecté une activité antivirale dans des milieux provenant d'autres cellules d'origine humaine et animale Une interférence sur la multiplication du virus de la grippe a été détectée d'abord par Issacs et Lindenman ( 1957) dans des cultures de membrane chorioallantoique de poulet Un autre exemple est la série de cellules de Hela qui est une cellule cancéreuse transformée d'origine épithéliale (cervicale) comme indiqué par G Gey et al, Cancer Research, Vol 12, p 264-165, 1952 L'activité de l'interféron a été détectée dans diverses séries de cellules transformées ou néoplasiques tirées à l'origine du tissu épithélial humain, comme décrit dans Production of Interferon by Human Tumor Cell Lines,

Jameson et al, Archives of Virology 62, 209-219 ( 1979).

On a observé que des préparations connues d'interféron humain possédaient une activité antivirale dans des cultures de

cellules humaines.

L'invention concerne la découverte et la produc-

tion d'un nouveau type de matière antivirale, appelée "interféron E" Cette nouvelle matière qui, comme les autres interférons, parait être- composée d'au moins deux protéines reliées fonctionnellement, peut être produite par exemple par traitement de cellules épithéliales humaines normales

par une technique d'induction d'interféron, puis par incuba-

tion des cellules dans des conditions qui favorisent la production du nouvel interféron IFN-c, contrairement aux

substances alpha, béta et gamma connues, a un niveau d'ac-

tivité antivirale,dans des cultures de cellules de reins de boeufs, compris entre 1/4 et 1/2 fois environ son activité

dans des cultures humaines IFN-e ne présente pas de réacti-

vité mutuelle notable avec des antisérums préparés en oppo-

sition à IFN-t, IFN-e, ou IFN-y dans des analyses par neu-

tralisation Il est stable à p H 2 Sa production par des cellules épithéliales est éliminée par introduction d'inhibiteurs de synthèse d'"ARN" ou d'inhibiteurs de synthèse de protéines dans la culture L'activité antivirale

de préparation contenant IFN-c est détruite par des protéases.

IFN-E peut être préparé par tout type de cellules épithéliales diploïdes humaines primaires Des cultures de cellules humaines d'épiderme et de tissusconjonctif, vaginal

et d'oesophage ont aussi été utilisées avec succès.

Des exemples non limitatifs d'autres types de tissus épithé-

liaux qui peuvent être utilisés sont les tissus du nez, du

pharynx, des bronches, de la plèvre et de l'intestin.

On a découvert de façon avantageuse que des bellules épithé-

liales primaires peuvent subir une induction afin qu'elles produisent un interférons, à l'aide des techniques déjà utilisées de manière connue pour la production d'autres types d'interférons à partir de leucocytes, 'de lymphoblastes

et de fibroblastes Dans une technique avantageuse d'induc-

tion mettant en oeuvre le Virus de la Maladie de Newcastle (souche Ban Kowski) ou le Virus Sendai, il faut 100 à 500 cellules épithéliales pour la production d'une unité de

IFN-*.

Comme indiqué précédemment, IFN-E est préparé par des cellules épithéliales diploïdes primaires d'origine humaine L'expression "cellules épithéliales diploïdes primaires humaines",ou des cultures de telles cellules, désigne dans le présent mémoire des cellules échantillonnées dans un tissu humain sainou une culture de telles cellules préparées par exemple selon le procédé décrit-dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N O 4 016 036 Ces types de cultures de cellules doivent étre-distingués des cellules *non humaines, des cellules humaines d'origine autre que épithéliale, et

des cellules épithéliales transformées ou néoplasiques.

Le nouvel interféron peut aussi être produit dans des cellules eucaryotes transformées naturellement ou artificiellement, contenant la partie de l'acide nucléique épithélial humain responsable de la production de IFN-e et dans des cellules modifiées par les techniques dl ADN recombinant. On a aussi découvert qu'un interféron préparé à partir d'un type donné de cellules humaines, par exemple

de cellules épithéliales, possédait une plus grande acti-

vité antivirale sur ce type particulier de cellules que sur d'autres types de cellules humaines Ainsi, l'interféron epsilon a accru les possibilités antivirales et antitumeurs dans le traitement du tissu épithélial soumis à une tumeur ou une infection virale, par rapport à son efficacité relative à d'autres types de cellules humaines, Ainsi, l'invention concerne un nouveau type de substance antivirale utile par exemple pour la protection des cellules humaines contre l'attaque des virus Elle concerne aussi un procédé de fabrication d'interféron du

type indigène au tissu épithélial humain sain normal.

Elle concerne aussi un procédé de traitement de la crois-

sance de tumeur ou d'infection virale dans un type parti-

culier de tissu par exposition à un interféron tiré du même type de tissu Elle concerne aussi un type d'interféron qui est plus actif sur des cellules épithéliales humaines que sur d'autres types de cellules humaines, par exemple

les fibroblastes humains.

De façon générale, des cellules épithéliales humaines normales peuvent être cultivées in vitro (par exemple, selon la méthode décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 4 016 036) sous forme d'une monocouche, dans des microcapsules par mise en oeuvre du procédé décrit dans la demande de brevet des Etats-Unis d'Amérique No 243 586 déposée le 14 mars 1981 par Jarvis et al, ou par d'autres procédés, lors de la préparation d'interféron E. Les cellules sont alors soumises à une technique d'induction

de IFN par exposition à certains virus ou acides nucléiques.

Par exemple, le milieu de culture peut être remplacé par un milieu contenant un inducteur connu d'IFN du type viral ou acide nucléique Après une courte incubation, par exemple de l'ordre de une heure l'agent inducteur est retiré, et les cellulessont placées dans un milieu normal neuf de culture ou d'entretien et incubent-par exemple pendant 24 heures L'exposition des cellules à l'agent inducteur déclenche l'expression du code d' ADN des cellules pour la production d'interféron epsilon Pehdànt l'incubation ultérieure, la cellule synthétise et secrète IFN-c A-ce moment, la culture est récoltée et, si elle est analysée par exemple par la méthode de Ho et Enders (Proceedings of the National Academy of Science, Volume 45,

pages 385-389, 1959), on constate qu'elle possède une-

activité antivirale de IFN-e.

Le produit-qui est obtenu par ce procédé ne

présente pas une réactivité mutuelle importante avec un anti-

corps de IFN-ft, IFN-e ou IFN-y dans des expériences de

neutralisation Il est stable à p H 2 et est de nature pro-

téinique Des expériences d'immunoabsorption indiquent que des antisérums anti-IFN-e réagissent avec une partie de l'interféron produit par des cellules épithéliales ayant subi l'induction Le nouvel interféron présente aussi un profil d'activité, dans les cellules des mammifères,

qui est différent de celui du type connu d'interféron.

Ces caractéristiques chimiques montrent bien que IFN-c

est une substance originale.

IFN-E est fabriqué de façon satisfaisante actuellement par des cellules épithéliales normales tirées de l'épiderme, du tissu conjonctif, du tissu vaginal et de l'oesophage humain, par "induction normale" (Field et al, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol 58, p 1004-1009, 1967) et "superinduction" (Havell et Vilcek, Antimicrobial Agents in Chemotherapy, Vol 2, p 476-484, 1972) avec l'acide nucléique, poly I-C (Miles Laboratories), avec le Virus de la Maladie de Newcastle lBaron et Issacs, British Medical J, Vol 56, p 18-20, 1962) et avec le virus Sendai (paragrippe-1, Gresser, Proceedings of the Society of Experimental and Biological Medicine, Vol 108, p 303-307, 1961) Les résultats des analyses montrent que toutes les techniques d'induction et tous les types

différents de cultures de cellules éprouvées donnent IFN-E.

Les niveaux de production varient avec la nature de l'agent inducteur utilisé et avec les diverses modifications des techniques d'induction Le virus de la maladie de Newcastle donne de bons résultats D'autres virus qui peuvent être

utilisés sont indiqués dans le tableau qui suit.

TABLEAU'I

Virus Références Grippe A Paragrippe-3 Rougeole Par otidite épidermique Rubéole Syncytium respiratoire Virus de la rage Stomatite vésiculaire Chi Kungunya Sindbis Encéphalite équine occidentale Fièvre jeune PoliovirusType 1 Poliovirus-Type 2 Encéphalomyocardite Rhinovirus-2 Rhinovirus-12 Reovirus-2 Langue bleue du mouton Adenovirus Varicelle Cytomégalovirus humain Herpes simplex Vaccine Gresser et Dull ( 1964); Andrews ( 1961) Chany ( 1960) Petralli, Merigan, et Wilbur -( 1965 a); De Maeyer et Enders ( 1961) Canteli ( 1961); Waddell, Wilbur, et Merigan ( 1968) Neva et-Weller ( 1964) Ray, Gravelle, et Chin ( 1967); Moehring et Forsyth ( 1971) Wiktor et ali ( 1972) Marcus et Sekellick ( 1977); Wilcek, Yamazaki et Havell ( 1977) Zimmermann et al ( 1972) Gresser et Enders ( 1962) Luby, Sanders, et Sulkin ( 1971) Wheelock et Sibley ( 1965); Wheelock et Edelman ( 1969) Gresser, Chany, et Enders ( 1965) Smorodintsev et al ( 1970); Ho et Enders -( 1959 a,b) Stewart II, Gosser, et Lockart ( 1971 a) Smorodintsev et al ( 1971 a); Fiala ( 1972) Gatmaitan, Stanley, et Jackson

( 1973)

Oie, Loh, et Ratnayake ( 1973) Jameson et Grossberg ( 1977) Lysov et al ( 1971) Vaczi, Horvath, et Hadhazy ( 1965) Vaczi, Horvath, et Hadhazy ( 1965) Glasgow ( 1974) Rasmussen et al ( 1974) Wheelock ( 1964); Epstein, Stevens, et Merigan ( 1972) On aaussi constaté que des interférons fabriqués à partir d'un type choisi de cellules humaines telles que épithéliales, fibroblastes, vasculaires, hépatiques, rénales,

etc, sont particulièrement efficaces comme agents anti-

viraux ou antitumeurs pour le traitement des tissus humains formés du type choisi de cellules Ainsi, IFN-c est surtout efficace lorsqu'il est utilisé pour le traitement des cellules épithéliales, et on constate qu'il a une plus faible activité lorsqu'il est utilisé pour le traitement d'autres types de cellules humaines De même, IFN-E-(ayant pour origine des fibroblastes humains) est plus efficace pour letraitement des tissus ou fibroblastes humains et a donc des propriétés antitumeurs et antivirales-plus faibles vis-à-vis des cellules d'autres types de tissus

humains.

Ainsi, on peut utiliser le procédé suivant pour

la protection d'un tissu ou d'un type donné de cellules-

contre l'infection virale, afin que la multiplication d'un virus qui a infecté un tissu ou un type donné de cellules soit arrêtée, ou que la croissance d'une tumeur dans un

tissu donné soit arrêtée.

Une culture de cellules du type considéré est d'abord formée par croissance par la mise en oeuvre des techniques classiques telles que (dans le cas des cellules épithéliales) la technique de Green décrite dans le-brevet précité des Etats-Unis d'Amérique N O 4 016 036 Les cellules de la culture sont alors traitées afin qu'elles

induisent l'expression de la partie de son code ADN res-

ponsable de la production de l'interféron ú L'opération

peut être réalisée par exemple par les techniques d'in-

duction de IFN décrites dans la suite du présent mémoire.

Le produit est alors récolté, par exemple dans le milieu après incubation Le produit peut être utilisé comme substance antivirale ou antitumeur efficace pour le

traitement des cellules ou du type des tissus en question.

Des cultures de cellules in vitro sont protégées contre l'attaque virale par addition de 2 à 5 unités de IFN-e/cm Cette concentration est efficace pour la protection de cellules épithéliales ayant une densité de 0,5 * 10 à

2

2,5 * 10 cellules/cm

Des quantités notables de cette substance anti-

virale nouvelle peuvent aussi être fabriquées par deux

techniques cellulaires supplémentaires actuellement connues.

La première met en oeuvre des types de cellules eucaryotes transformées spontanément, viralement ou chimiquement,

analogues à celles utilisées antérieurement pour la pro-

duction de IFN-a à partir de séries de cellules lympho-

blastoîdes humaines La seconde technique met en oeuvre des techniques connues dl' ADN recombinant, analogues à celles qui sont couramment utilisées actuellement pour la

production de IFN-a et IFN-e.

Selon le premier procédé, des cellules trans-

formées capables de produire IFN-c peuvent être obtenues par utilisation de l'une des deux techniques: in vivo ou

in vitrow La première technique (in vivo) implique l'iso-

lement direct à partir de tissu frais de type de cellules transformées; la seconde technique (in vitrol implique une opération de sélection dans laquelle une souche de cellules diploïdes humaines normales est cultivée à long terme jusqu'à ce qu'un nombre faible mais détectable de la population subisse une transformation spontanée ou la souche initiale est traitée pendant une courte période avec un virus ou un mutagène connu tel que EMS, MMS, ou MNNG

afin que la fréquence de transformation soit accrue.

Certaines des cellules transformées par l'une de ces deux techniques in vitro contient une partie du code ADN des

cellules épithéliales responsables de la production IFN-s.

Des cultures transformées ainsi obtenues peuvent subir une induction afin qu'elles produisent IFN-s par utilisation des techniques classiques d'induction telles que décrites précédemment pour les cellules épithéliales

diploïdes humaines normales.

Dans la seconde technique, le m ARN synthétisé dans les cellules épithéliales à la suite de l'induction de IEN est extrait des cellules, est purifié éventuellement par ultracentrifugation ou analogue afin que la fraction m ARN obtenue ait une spécificité accrue, et l'extrait est utilisé comme calibre pour la synthèse d' ADN complémentaire (c ADN) Le c ADN peut être préparé à l'aide de l'enzyme transcriptase inverse Avian Myoblastosis Le produit final résultant de l'opération, ADN complémentaire standard double (dsc ADN) qui contient le codage de séquence pour la synthèse de IFN-e, et un vecteur eucaryote ou bactérien sont alors 1 D traités avec une enzyme restrictive qui provoque un clivage d' ADN et donne des sites de liaison par lesquels le dsc ADN et le vecteur peuvent être fixés Le vecteur et ADN sont alors mélangés, recuits et liés par des liaisons covalentes à l'aide d'un enzyme ligase A ce moment, la préparation de vecteur recombinant est utilisée pour la transformation

d'une cellule bactérienne ou eucaryote Les cellules trans-

formées contiennent ainsi ADN complémentaire de la totalité ou d'une partie de ARN contenu à l'origine dansles cellules

épithéliales pendant leur étape de production de IFN-e.

Ces vecteurs recombinants sont alors incubés avec un type approprié de cellules qui permet l'opération du vecteur Il apparaît alors une population de cellules

qui contient des cellules individuelles capables de synthé-

tiser et de secréter IFN-c La population de cellules est alors analysée systématiquement afin qu'elle donne une sous-population de cellules produisant IFN-e, et cette sous-population est cultivée afin qu'elle donne une série de cellules capables de produire des quantités relativement

grandes de IFN-e.

D'autres caractéristiques de cette technique mettant en oeuvre ADN recombinant figurent par exemple dans les documents suivants: 1 1 1 Brevet des Etats-Unis d'Amérique n 4 237 224 Cohen et al "Process for producing biologically functional molecular chimeras"; 2 Scheller, R et al, 1977, Clones of individual repetitive sequences from sea urchins ONA constructed with synthetic eco R 1 sites, Science, Vol 196, p 197-200; 3 Blattner, F et al, 1977, Charon Phages: Safer derivatives of bacteriophage lambda for DNA cloning, Science, Vol 196, p 161-169;

4 Broach, J R, et Hic Ks, J B, 1980, Replica-

tion and recombination functions associated with yeast plasmid, 2 micron circle, Cell, Vol 21, p 501-508; et Hamer, O 1981, Synthesis processing and secretion of eukaryotic proteinsin the SV 40 Monkey cell

system, Recombinant DNA Abstracts, Vol 1, p 4.

D'autres caractéristiques et avantages de-l 'in-

vention ressortiront mieux de la description qui va suivre

d'exemples non limitatifs donnés à titre purement illustratif.

Exemple 1 On cultive une culture de cellules épithéliales d'épiderme humain provenant du laboratoire de Howard Green, Massachusetts Institute of Technology jusqu'à une densité

2

de cellules de I à 2 10 cellules par cm, dans un milieu essentiel minimal (MEM, "Gibco") contenant 10 % dé sérum foetus de veau inactivé thermfiiquement (incubé à 56 C pendant minutes: HIFCS) On expose quatre cultures équivalentes incubées dans MEM et 2 % de HIFCS pendant I heure à'37 C à poly ( 1-C)-( 9 S) qui est un acide nucléique de masse moléculaire élevée disponible dans le commerce auprès de PL Laboratories (Milwau Kee, Wisconsin), en quantité égale à 0, 1, 10 et 100 microgrammes/cm 3 (technique d'induction précédente de Field et al) On lave alors deux fois les cultures avec MEM et on les fait incuber dans le même

milieu avec addition de 2 % de HIFCS pendant 24 heures.

Le milieu est collecté et analysé par la méthode de Stewart II, The Interferon System, p 17-18 On n'observe aucune activité antivirale détectable dans les cultures incubées avec O et I pg/cm de poly (I C) On détecte environ 10 unités/cm 3 de IFN-E dans les échantillons obtenus à partir de cultures

ayant subi une induction avec 10 et 100 pg de poly (I C).

Exemple 2

On répète le procédé de l'exemple 1, mais on utilise une technique modifiée de "superinduction" (Havell and Vilcek, supra) afin d'essayer d'augmenter la production de IFN-E On incorpore 50 pg/cm 3 de cyclohexamide (inhibiteur de synt Fèse de protéine) avec l'acide poly (IC) Après incubation d'une heure, on lave les cellules et on les -fait incuber pendant 3 heures supplémentaires dans MEM contenant -3 2 % de HIFCS et 50 pig/cm-3 de cyclohexamide On lave alors à nouveau lescellules et on les fait incuber avec MEN

contenant 50 pg/cm de cyclohexamide et 5,0 pg/cm d'actino-

mycine D (inhibiteur de synthèse d' ARN) pendant 2 heures supplémentaires A la fin de cette incubation, on lave deux fois les cellules puis on les fait incuber pendant 24 h à 37 C dans un milieu normal La culture du milieu et l'analyse comme indiqué dans l'exemple 1 -ne permettent:laproduction d'aucune quantité détectable de IFN-E dans les cultures induites avec O et I pg/cm 3 de poly (I-C) La culture induite avec 10 pg/cm de poly (I C) donne 100 unités/cm 3 de IFN-E Les cultures induites par 100 pg/cm 3 de poly (I-C)

assurent 1-a production de plus de 330 unités/cm de IFN-E.

Exemple 3 On utilise une culture de cellules épithéliales d'origine épidermique contenant I à 2 105 cellules (exemple 1)

pour la préparation de IFN-c à l'aide de la méthode d'induc-

tien par levirus de la maladie de Newcastle (NOV) (Baron and Issacs, supra) Le virus utilisé était la souche Bankowski de NDV disponible auprès de Poultry Health Laboratories, Davis, Californie On prépare quatre échantillons de 1 cm de MEM contenant 2 % de HIFCS et assez de NDV pour que la concentration finale soit respectivement de 0, 100-200, 25-50

et 1-16 virus pfu/cellule dans les échantillons.

On ajoute alors 0,2 cm des préparations respectives de virus

de I cm (agent inducteur virus) dans les cultures des cel-

lules qui sont alors secouées pendant 30 minutes à intervalles

de 5 minutes à 37 C La partie restante de 0,8 cm 3 des pré-

parations de NDV est alors ajoutée et les cultures subissent une incubation pendant 30 minutes supplémentaires Les cultures de cellules sont alors lavées deux fois avec un milieu normal, 1 cm de milieu neuf est ajouté à chaque

culture, et les cultures subissent une incubation de 24 heures.

Le milieu est alors récolté, acidifié à p H 2 avec H Cl 0,1 N et conservé à 4 C pendant 5 à 6 jours afin que NDV devienne inactif Ensuite, le milieu récolté est neutralisé

avec Na OH 0,1 N et la présence de IFN-ú est analysée.

Dans l'échantillon ne contenant pas de virus NDV (témoin), toute activité antivirale est absente L'échantillon ayant subi une induction avec 100 à 200 particules de virus par

cellule NDV contient environ 5 00 à 1000 unités de IFN-E/cm.

La culture induite avec la préparation de NDV contenant à 50 particules de virus par cellule contient environ 170 à 330 unités de IFN-e/cm 3 La culture induite avec la préparation de NDV contenant 1 à 16 particules de virus

par cellule contient environ 50 à 170 unités de IFN-/cm 3.

Comme l'indique cette expérience; une culture de cellules contenant i à 2 * 105 cellules/cm 3 peut donner environ 500 à 1000 unités de IFN-E/cm Le rendement est ainsi de l'ordre de 1 unité de IFN-g produite pour 100 à

500 cellules de la culture.

Exemple 4

On répète le procédé de l'exemple 3, mais on

utilise le virus de paragrippe-1 (Sandai),à diverses con-

centrations, comme agent inducteur à la place du virus NDV (voir Gresser, supra) Le virus Sendai tel qu'il est acheté

(Flow Laboratories) contient 10 000 à 40 000 unités hé-

3 -

magglutinantes par cm.

Dans une culture dans laquelle la préparation commerciale de virus est diluée I à 3 fois, on prépare 1000 unités/cm 3 de IFN-e Une dilution de I à 10 donne

TABLEAU II

Résultats d'expériences d'interféron * Induction de l'exemple + Procédé d'induction de ** Procédé d'induction de ++ Procédé d'induction de 1 avec 100 pg/cm 3 de poly I C l'exemple 2 avec 100 lg/cm 3 de poly I-C l'exemple 3 avec dilution 1/3 de NOV ( 100-200 particules de virus/cellule)

l'exemple 4 avec dilution 1/4 de la solution de base.

Type des cellules Méthode d'induction Unités IFN-s/cm 3 Unités IFNs/cellule Conjonctif humain poly 1-C * 33 3,3 x 10-5 " " poly I*C + 330 3, 3 x 104 "I néant (témoin) 0 O Epiderme humain poly I-C * O O " " Sendai ++ 330 3,3 x 10-4 " " NDV ** 1000 l,0 x 103 " " néant (témoin) O O

_ __ _ _ _

%A oe y' US unités/cm 3 et une dilution de 1 à 33 donne 100 unités/cm Aucune activité antivirale ne peut être détectée dans la

culture témoin dont le virus a été omis.

Le tableau II ci-avant résume les résultats des expériences des exemples I à 4 effectués -avec des cultures de cellules de tissu conjonctif humain et de cultures de cellules d'épiderme humain avec diverses techniques d'induction

Exemple 5

Comme on a montré de façon classique que les interférons étaient par définition des protéines, on a éprouvé des échantillons de IFN-e afin de déterminer si l'activité antivirale présente dans les échantillons était due à un composant à base de protéine Les expériences sont réalisées par incubation d'échantillons de IFN-a (standard NIH), de IFN-B (standard NIH) , et de IFN-ú (tiré de kératinocytes épithéliaux induits par NDV) en présence d'enzymes protéolytiques connus, puis par analyse

de la matière traitée afin que l'activité antivirale res-

tante soit déterminée On fait incuber à 37 C pendant I h des échantillons de IFN-c L ( 16 unités/cm), de IFN-e ( 16

3 3

unités/cm), et de IFN-E ( 32 unités/cm) dans MEM, en présehce soit de trypsine (Sigma Chemical Co, St Louis, Missouri) ou de Pronase (Sigma) à des concentrations de -3 3,3-100 pg/cm 3 Après la fin de la réaction, l'activité protéolytique restante dans les échantillons est neutralisée par addition de HIFCS jusqu'à concentration finale de 33 % (volume/volume) Les échantillons sont alors analysés afin que l'activité antivirale restante induite par IFN soit

déterminée par microtitrage sur des cellules GM-2767.

Les résultats sont les suivants: SENSIBILITE PROTEOLYTIQUE DE IFN-e Ces résultats montrent que l'activité antivirale

observée dans les échantillons de IFN-s est due à la pré-

sence d'un ou plusieurs composants sous forme de protéines, étant donnéel'élimination totale de l'activité par le traitement par les enzymes protéolytiques Le caractère 28 protéinique de IFN-ú apparait aussi dans le fait que les inhibiteurs de synthèse de protéines et d'ARN bloquent

la production de IFN-s.

Exemple 6

Cet exemple montre la stabilité de IFN-s pour les p H acides On prépare IFN-c par induction de cellules

d'épiderme humain à l'aide de NDV selon l'exemple 3.

Lorsque le milieu est récolté, il est divisé en trois parties Le virus est inactivé dans la première partie comme décrit dans l'exemple 3, par acidification à p H 2 avec H Cl La seconde partie est filtrée pendant 5 jours sur un filtre "Millipore" 01310 (limite de masse moléculaire 000, Millipore Corp, Bedford, MA) afin que le virus soit extrait La troisième partie est filtrée par un filtre "Millipore" PTMK 01310, ayant une limite de masse moléculaire de 100 000, imprégné préalablement pendant 4 heures dans

une solution à 1 % de BSA.

Enzyme Concentration protéolytique d'enzyme Activité antivirale IFN restante (t*g/cm 3) IFN-a IFN-e IFN-e Trypsine 100 O O O

33 O O O

I 2 4

3,3 8 8 16

0 16 16 32

Pronase 10 O O O

3,3 O O O

O 16 16 32

Dans tous les cas, le milieu résultant est analysé afin que la présence de IFN et de virus résiduel soit déterminée Les résultats sont les suivants-: Stabilité de IFN-e à p H acide Traitement Titre initial Titre final Titre d'IFN de IFN de virus de virus 3 (pfu/nm 3) (pfu/cm 3) (u/cm 3) p H 2, 5 jours 1,1 o 108 O 128 Filtré par

PTHKO 1310 1,1 108 O 128

Filtré par 8

PSVP 01310 1,1 O 10 O 128

Au.un des échantillons n'a montré une activité virale quelconque et tous les échantillons avaient la même quantité d'activité de IFN-e Ce résultat montre que l'activité de IFN-e est stable à un p H acide,

Exemple 7

On compare les propriétés immunologiques de IFN-e (préparé par induction par NOV de cellules d'épiderme humain comme décrit dans l'exemple 3), de IFN-c, de IFN-e (NIH) et de IFN-y (obtenus auprès de S Baron, University of Texas Medical School, Galveston, Texas)ï On effectue des titrages

par neutralisation de chaque interféron à l'aide d'anti-

IFN-a(NIH), d'anti-IFN-e (NIH et Y H Tan, Calgary University, Calgary, Alberta, Canada), d'anti-IFN-y (S Baron), et de mélanges de ces antisérums Des dilutions en série d'un-facteur 2 des antisérums appropriés sont effectués

dans MEM avec une plaque de microtitrage à 96 cuves.

On ajoute dans les duves des dilutions allant de 32 IU/cm à 2 IU/cm 3 de chaque préparation de IFN et on fait incuber les plaques d'abord à 37 C pendant I heure, puis à 4 C pendant 1 heure afin que le complexe anticorps-IFN puisse se former On ensemence alors avec des fibroblastes humains (dépôt de cellules mutantes humaines GM-2767) à raison de 2 * 104 cellules par cuve, et, après 20 à 24 heures d'incubation à 37 C, elles sont soumises à une dose étalon

de virus de stomatite vésiculaire ( 1 pfu/cellule).

Après 24 à 48 heures à 37 C, on observe toutes les cuves au microscope afin que l'inhibition transmise par l'interféron de l'effet cytopathique induit par le virus soit déterminée (CPE) Les résultats sont les suivants: Quantité d'antisérum nécessaire à la neutralisation de IFN 3 (unité de neutralisation par cm) Le sérum témoin de n'a pas d'activité mouton vis-à-vis neutralisante. de IFN de fibroblastes N.D = non déterminé a antisérum préparé avec des moutons vis-à-vis des IFN respectifs b dérivés dekératinocytes d'épiderme, non obligatoirement dépourvus de fibroblastes (induits par NDV) c dérivés de kératinocytes épidermiques dépourvus de

fibroblastes (induits par NDV).

On peut voir d'après les tableaux qui précèdent que: Echantillon Conc IFN 3 Anti-a Anti Anti-aa unités/cm a a Anti-Sa IFN-a 16 N D > 3 000 N D. (NIH Std) 8 N D > 3 000 N D.

4 82 > 3 000 125

IFN-e 8 > 3 000 375 750 (NIH std) 4 > 3 000 188 750

2 > 3 000 188 47

IFN-E 8 > 3 000 > 3 000 188

AR-I Vb 4 > 3 000 375 188

2 > 3 000 375 47

IFN-ú 16 > 3 000 > 3 000 375

AOB 8 > 3 000 > 3 000 375

c 2 > 3 000 1500 94

a) IFN-a est neutralisé à la fois par les anti-

sérums anti-c L et anti-a/anti-e en mélange Comme prévu, il faut deux fois plus de mélange anti-L/e que d'anti-a

pour la neutralisation de la même quantité'de IFN-a.

(Des quantités analogues d'antisérums neutralisent des

quantités analogues de IFN-a).

b) IFN-6 est neutralisé à la fois par les anti-

sérums anti-$ et anti-e/anti-6 en mélange Il faut encore 2 foisplus d'antisérum anti-a/e que d'antisérum anti-/

pour la neutralisation de la même quantité de IFN-e.

c) Il faut moins de la moitié du mélange d'antisérum anti-a/anti-$ par rapport à l'antisérum anti-e

pour la neutralisation de la même quantité de IFN-E.

IFN-s neréagit pas avec les antisérums dirigés contre r FN-y.

Cet exemple montre que IFN-e est distinct immuno-

logiquement de IFN-c et IFN-e, et IFN-y et est donc chimi-

quement distinct de ces interférons humains connus.

Exemple 8

En plus des indications sérologiques présentées

dans l'exemple 7,on utilise IFN-e qui a subi une immune-

précipitation partielle, dans une expérience de neutrali-

sation On ajoute à des échantillons de cet interféron du anti-e IFN (polyclonal obtenu à partir de NIH ou monoclonal obtenu à partir de Y H Tan) Le mélange incube pendant 1 h à 35 C puis 1 heure à 4 C afin que le complexe IFN-anticorps puisse se former, et le complexe, avec l'excès éventuel d'anticorps, est retiré par incubation d'esantisérums complexés et non complexés en présence de "Sepharose" A de protéines (Sigma) avec unorapport de 30 pl à 1,5 pl du mélange réactionnel IFN non complexe et restant est soumis à un second stade d'immunoprécipitation et les échantillons sont analysés afin que l'activité de IFN soit déterminée comme décrit, à l'aide de l'analyse d'inhibition CPE Les résultats sont les suivants: Lorsque AOB-IFN- -ayant précipité préalablement

* est utilisé dans l'essai de neutralisation, réalisé exac-

tement comme indiqué dans l'exemple 7, on obtient les -résultats suivants: Quantité d'antisérum nécessaire à la neutralisation de IFN (unités de neutralisation) Echantillon Concentration IFN Anti-g Mélange d'anti-a/6 u/cm 3 AOB IFN-e 16 > 3 000 1 500 absorbé avec 8 > 3 000 375 antisérum 4 > 3 000 94 anti-g AOB IFN-e 16 > 3 000 1 500 absorbé avec 8 > 3 000 188 antisérum 4 1 500 94 témoin AOB IFN-e 8 > 3 000 1 500 non absorbé 4 375 4

1 12 24

NIH IFN-B 16 750 750

8 188 375

4 94 188

Le sérum témoin de mouton de IFN de fibroblastes n'a pas

d'activité neutralisante.

Echantillon Titre Ière précip Titre 2 ème précip Titre IFN riginal IFN d'anticorps d'IFN d'anticorps d'IFN unités/cm 3 avec: après avec: après 1 e 2 e AOB-IFN-s 1024 Anti-e 256 Anti-e 256 polyclonal polyclonal AOB-IFNs 1024 Anti-g 1024 Anti-g 1024 monoclonal monoclonal AOB-IFN-e 1024 Antig 1024 Anti-g 1024 monoclonal polyclonal AOB-IFN-e 1024 Anti-g 256 Anti-g 256 polyclonal monoclonal Les résultats des tableaux qui précèdent montrent qu'une partie de la préparation de IFN-E'ne peut pas être

neutralisée par l'antisérum anti-a même lorsque deux anti-

corps différents anti-e sont utilisés Cependant, même après précipitation poussée par les antisérums anti-S, une partie supplémentaire de IFN-c peut être précipitée avec un mélange d'antisérums anti-a/e Ces résultats montrent aussi que IFN-E est distinct immunologiquement

et chimiquement des autres interférons humains connus.

Exemple 9

IFN-E produit par induction de cellules d'épiderme humain avec NDV comme indiqué dans l'exemple 3, peut être purifié et concentré par chromatographie par affinité sur un certain nombre de ligands immobilisés Ceux-ci comprennent notamment, à titre non limitatif, l'agarose rouge réactif, la phényl-"Sepharose" (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo), l'agarose rouge Procion, le phényl agarose

(BRL, Gaithersburg, I Md), le Glycogel B, le N-( 3-carboxy-

propionyl) aminodécane (CPAD) agarose et le N-pyromellityl-

aminodécane (PMAD) agarose-(Pierce Chemical Co, Rockford, Ill). On applique 8 cm de IFN-s dans MEM contenant 900 unités de IFN-E dans une colonne de 0,5 cm d'agarose rouge réactif On lave la colonne avec 10 cm 3 d'un tampon phosphaté 20 m M (p H 7,4) IFN est alors élué avec trois quantités égales à 2 cm d'éthylène glycol à 50 % dans un tampon phosphaté 20 m M contenant du chlorure de sodium 1 M. Chaque fraction est collectée dans un volume égal de tampon

phosphaté 20 m M afin que l'éthylène glycol soit dilué.

La colonne est lavée finalement avec 5 cm 3 supplémentaires de tampon phosphaté 20 m M Les concentrations des protéines

sont mesurées par absorption à 280 nm (OD-280).

Les résultats figurent dans le tableau suivant: Purification de IFN à' l'aide d'agarose rouge réactif Titre OD Purifica IFN Séparation Fraction de colonne Volume Fraction de colonne O D 280 IFN total tion total de IFN (unités/cm 3) (cm 3) (unités) (multiple) (unités) (%) Matière originale 2, 95 128 7 20,65 O 896 100 Matière traversant 1,995 8 7 13,97 56 0,5 ler lavage au phosphate 20 m M 0,911 4 5 4,6 20 0,02 2 ème lavage au phosphate 20 m M 0,088 2 5 0,44 10 0,01 lers 2 cm 3 d'éthylène glycol 0, 721 128 4 2,88 7,2 512 57 2 èmes 2 cm 3 d'éthylène glycol 0,123 256 4 0, 49 43 i 024 114 3 èmes 2 cm 3 d'éthylène glycol 0,021 16 4 ' 0,084 250 64 0,7 Lavage au phosphate 20 m M N D O 5 O O M M co hl 4 l oe Ch % O Les deux premières fractions d'éthylène Elycol sont combinées et la fraction résultante contient tout IFN-e appliqué sur la colonne, présentant une purification de

facteur 6 par rapport à la matière originale.

Dans d'autres expériences analogues, on applique jusqu'à 68 cm de IFN-E 'sur la colonne et on récupère IFN

dans un volume final de 8 cm Ceci représente une concen-

tration de 8,5 fois de la matière.

Lorsque IFN-E est appliqué-à au moins deux ligands immobilisés successivement, on peut obtenir une purification plus grande Par exemple, on applique un échantillon de IFN-S à une colonne de CPAD et on fait subir une élution comme décrit dans le procédé précédent Les fractions combinées contenant IFN indiquent une purification d'environ 9 fois et subissent une dialyse avec un tampon phosphaté 20 m M afin que l'éthylène Èlycol soit extrait L'échantillon est albrs appliqué sur une colonne de PMAD agarose, développée de la même manière IFN-É est récupéré avec un rendement de 70 à 100 % et une purification supplémentaire de 5 fois par rapport

à la protéine totale.

Cet exemple montre que IFN-ú peut être purifié par des ligands immobilisés divers à considérer seuls ou en combinaison.

Exemple 10

On fait subir d'abord une centrifugation à IFN-c non fractionné à 300 g pendant 20 minutes La matière qui surnage est mélangée par retournement sur un appareil Fischer Rotarack avec un verre de porosité contrôlée (C P G) (Electronucleonios, Inc) à 4 C On utilise 0,28 g de verre

de porosité contrôlée pour 30 cm de culture qui surnage.

Après 3 heures, la matière qui surnage est extraite et les perles de verre de porosité réglée sont entassées dans une colonne ( 2,5 x 3,1 cm) La colonne est d'abord lavée avec 4 volumes de colonne de PBS, puis 4 volumes de colonne de Na C 1 1,0 M-tampon phosphaté 20 m M à p H 7,4 IFN- s est alors élué avec 4 volumes de colonne de 50 % d'éthylène glycol en volume/volume-Na Cl 1,0 M-tampon phosphaté 20 m M à p H 7,4, Puri Fictionde FN à l'aide de verre de porosité réglée etd'"Ultra'gal' Ac A 54 Titre IFN Protéine Activité Purifica Séparation Protéine IFN Volume total total spécifique tion de IFN Fraction de colonne mg/cm 3 u/cm 3 (cm 3 % (unités) (mg) Cx 104) (multiple) (% Matière originale (après centifugation) 0,034 2,560 420 1 075 200 14,28 7,53 -100 C.P G qui surnage N D 32 405 12 960 1,20 1 er lavage PBS N D 32 55 1 760 0,16 2 ème lavage l,0-M N D 16 56 896 0,08 Na Ci 20 m M

P 04 7,14

% Ethylène glycol 0,094 7 776 112 870 912 10,53 8,27 1,10 81,0 l,OM Na Cl20 m M P 04 7,4 Fraction concentrée % éthylène glycol N D 512 000 1,6 819 200 N D 76,2 I'Ultragel Ac A" 0,05 25 600 31,0 793 6 È O 1,55 51,2 7,0 73, 8 PQ -à Co O'. f A Purification de IFN-s puis est collecté dans un volume égal de Na Cl 1,0 M-tampon phosphaté 20 m M afin que la concentration finale d'éthylène

glycol soit de 25 % La fraction contenant IFN-c est concen-

trée par ultrafiltration à 1,0-1,6 cm 3 et est appliquée à une colonne de polyacrylamide-agarose ("Ultragel" Ac A 54) ( 1,6 x 85 cm) équilibrée par 25 % d'éthylène glycol (en

volume/volume) NO Cl 1,0 M-tampon phosphaté 20 m M à p H 7,4.

IFN-E est alors élué avec une solution tampon d'équilibrage

3 3 "

à un débit de 6,0 cm 3/h On collecte des fractions de 2 cm et on analyse la présence de IFN et la teneur en protéine (analyse Loury) Les résultats sont donnés dans le tableau ci-avant +

Exemple 1

On soumet les préparations de IFN-e, IFN-a et IFN-e, contenant de la matière brute partiellement purifiée selon l'exemple 10 (p-IFN-s) et pIFN-s absorbé-interféron anti-souris, à une analyse des masses moléculaires par

électrophorèse sur gel SDS selon le procédé de Lamelli.

Les échantillons subissent une incubation à température ambiante pendant I heure en présence de 1,0 % de SDS, de tampon de tris-HC 1 0,05 M (p H 6, 8), de glycérol à 10 % (en volume/volume) et de bleu de bromophénol à 0, 001 %, chargé sur des gels de polyacrylamide à 12,5 %, et les essais durent environ 16 heures Après électrophorèse, les zones allongées contenant les références de masse moléculaire sont ensemencées Les régions contenant IFN sont découpées en tranches de 3 mm et extraites par secouage avec 0,5 cm de PBS contenant 0,5 % de SDS pendant 20 heures à température ambiante L'analyse de ces fractions est réalisée sur des cellules GM-2767 et la masse moléculaire de chaque pic d'activité est calculée par comparaison avec la position sur le gel par rapport aux références de masse moléculaire Les résultats sont les suivants: Masse moléculaire de IFN Les trois fractions obtenues avec les échantillons de IFN

présentent une activité antivirale sur les cellules GM-2767.

La fraction de poids moléculaire 22,0 À 10 obtenue à partir de IFN-s ne présente pas d'activité sur des cellules de

reins de boeufs (MDBK) Les deux autres fractions de IFN-

017,5 K, 20,0 K) ont une activité d'environ 25 % sur les

cellules MDBK comme sur les cellules GM-2767.

Exemple 12

Le pouvoir antiviral de IFN-E (produit par induction par NDV à partir de cellules d'épiderme humain comme dans l'exemple 3), IFN-a (obtenu auprès de National Institute of Health, NIH), et IFN-B (NIH) est comparé dans des cultures de cellules d'épiderme humain normal, par

rapport à des fibroblastes diploides humains normaux.

Des dilutions en série des trois préparations de IFN sont ajoutées dans les cuves d'une-plaque de microtitrage avec des cultures de référence de cellules d'épiderme humain normal et de fibroblastes:humains normaux Après 18 à 24 heures d'incubation à 37 C, les cellules de chaque cuve sont soumises à l'action d'une dose standard de virus de stomatite vésiculaire ( 1 pfu/cellule) Après 36 à 96 h (lorsque des témoins indiquent une mort des cellules de %), chaque cellule est observée au microscope afin que la résistance au virus soit déterminée Les résultats sont les suivants: M.M des maxima d'activité (% d'activité INF récupérée) ao L E 18 K ( 27,6) 19,7 K ( 44,8) 22,5 K ( 27,6) e ( 1,83), 22,0 K ( 98, 2) e (brut) 17,5 K ( 41,0) 20,0 K ( 7,4) 22,0 K ( 51,6) p-IFN-z 17,5 K ( 35,4) 20,0 K ( 2,53) 22,0 K ( 62,0) p-IFN-E non lié 17,5 K ( 9,2) 20,0 K O 22,0 K ( 90,8) p-IFN-E lié 17,5 K ( 68,0) 20,0 K ( 15,3) 22,0 K ( 16,8)

253 1865

TABLEAU III -

Unités d'activité/cm de IFN sur: Interféron Fibroblastes (FS-4) Epithélium a

IFN-E 32-64 512-2048

IFN-a 128-512 64 IFN-e 32-256 8-32 a fibroblastes de J Vilcek diploïdes humains normaux obtenus auprès

(N.Y U, N Y, N Y).

Comme l'indique le tableau qui précède, IFN-E produit par le code dl ADN des cellules épithéliales a un pouvoir bien supérieur (d'un 'facteur de l'ordre de 16) comme agent antiviral par rapport aux cellules épithéliales que par rapport aux fibroblastes IFN-c préparé à partir au code ADN tiré des leucocytes humains et des cellules lymphoblastoldes, a un pouvoir supérieur (d'un facteur pouvant atteindre 8) par rapport aux fibroblastes que par rapport aux cellules épithéliales, et IFN-$, produit à partir du code ADN des fibroblastes a un plus grand pouvoir (pouvant atteindre 30 x) vis-à-vis des fibroblastes

que vis-à-vis des cellules épithéliales.

Exemple 13

On utilise le procédé de l'Exemple 11 pour l'analyse de l'activité antivirale relative des interférons t,e,y et ú sur les cellules de reins de boeufs (cellules MDBK ATCC CCL 22), par rapport aux fibroblastes trisomiques humains ( 3 copies du chromosome 21 dépôt de pellules mutantes humaines GM-2767 47, XX, t 21) Les résultats de l'analyse sont les suivants:

1 3

Unités d'activité/cm de IFN sur Type IFN MDBK GM-2767 aî > 512 512 e 6 O O 128 y O 128

Eú 8-16 32

Les résultats obtenus pour IFN a, "et y sont conformes aux -

résultats déjà indiqués Les résultats de IFN-c montrent que ce nouvel interféron a une activité de 2 à 4 fois environ plus importante sur les cellules GM-2767 que sur les cellules de reins de boeufs.

Exemple 14

Le nouvel interféron présente aussi une activité contre lazprolifération, comme peut l'indiquer l'inhibition de la multiplication des cellules lymphoblastoîdes humaines

(cellules de Daudi) 10 000 cellules lymphoblastoides hu-

maines environ sont revêtues de 200 microlitres de milieu dans chaque cuve d'une plaque de microtitrage On ajoute alors diverses dilutions de IFN a, e et E à chaque cuve et le nombre de cellules viables est compté après 1, 2 et 4 jours Les résultats figurent dans-le tableau qui suit:

ANALYSE DES CELLULES DE DAUDI

Nombre de cellules viables/cuve Ces résultats montrent que 10 unités supprimer la croissance des cellules

de 90 %.

de INF-E de Daudi peuvent pour plus (x 10 4)

Type et concen-

tration d'IFN Jour 1 Jour 2 Jour 4 a 100 u 6,0 4,8 6,8 u 4,8 5,2 6,0

U 7,2 9,6 6,4

u 5,2 9,6 18,4 c 100 u 6,0 5,2 4,8 u 5,6 5,2 6,0 Témoin (sans IFN) 8,0 21, 5 67

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Exemple 15

On met en équilibre des échantillons de IFN-a, B et ú avec une solution saline tamponnée au phophate (PBS), du dodécyl sulfate de sodium (SDS), et un mélange de SDS, de mercaptoéthanol (BME) et d'urée à 100 C Le détergent SDS dénature de manière connue les protéines par altération

de leur conformation, et BME réduit les liaisons bisulfure.

On constate que INF-a, 6 et C diffèrent de façon très nette par leur sensibilité à ces réactifs Plus précisément, INF-a est stable dans SDS seul, mais est rendu notablement inactif en présence d'un mélange de SDS, d'urée et de BME; IFN-e est pratiquement inactivé dans SDS seul mais est stable dans un mélange de SDS, d'urée et de BME, et INF-s est relativement stable dans SDS seul et dans le mélange de SDS et de BME- urée Dans PBS, à 100 C, il reste moins

de 5 % de l'activité des trois interférons.

Dans des expériences analogues, on détermine que INF-a qui a été précédemment inactivé par le mélange SDS-BME, peut être réactivé parmi son équilibre à 100 C

avec un mélange de SDS-PBS, que INF-e qui a été antérieu-

rement inactivé dans SOS seul peut être réactivé dans un mélange de SDSBME-urée-PBS, et que IFN-ó qui a été inactivé antérieurement dans PBS peutit être réactivé par mise en équilibre à 100 C en présence de PBSSDS, avec ou sans BME-urée Ces observations montrent encore l'originalité

de la préparation de IFN-E selon l'invention.

Exemple 16

Cette expérience concerne la comparaison des

propriétés de liaison et d'élution de IFN-ú et IFN-

sur une colonne de "Sepharose" bleue (Pharmcia) Les

colonnes sont préparées selon les instructions des fa-

bricants et chargées à température ambiante d'échantillons IFN-a ou IFN-E dans PBS Les élutions sont réalisées avec Na Cl 1,0 M dans PBS et de l'éthlyène glycol à 50 % (en volume/volume) dans un tampon de phosphate sadique 20 m M. Chaque préparation d'interféron est traitée sur deux colonnes contenant des lots différents de "Sepharose" bleue, et on obtient les résultats suivants:

253186 5

Liaison des interférons à la "Sepharose" bleue Cet exemple montre que les interférons e et ont des affinités différentes à la "Sepharose" bleue et des comportements différents lors de l'élution La "Sepharose" bleue fixe environ 90 à 97 % de l'activité de INF-s mais seulement 60 % environ de INF-s sont liés dans les mêmes conditions En outre, alors que 20 à 30 % de INF-$ sont récupérés avec Na Cl 1,0 M, 3 à 4 % seulement de l'activité

de IFN-e sont récupérés dans des conditions analogues.

Enfin, une quantité pouvant atteindre 80 % environ de

l'activité de INF-$ est éluée avec une combinaison d'éthy-

lène glycol à 50 % et Na Cl 1,0 % alors que 50 % environ seulement de l'activité de INF-g sont récupérés dans des

conditions analogues.

% d'activité récupéré avec Fraction IFN-e IFN-c Tra Versant colonne + 20 m M de tampon phosphaté 44,0-44,2 2,5-10,2 Elution avec Na Cl 1,OM 2,7 4, 3 19,3-30 Elution avec éthylène glycol %/Na Cl 1,OM dans 20 m M de tampon phosphaté 51,9-52,3 60,0-78,2

253 1865

Claims (11)

REVENDICATIONS

1 Préparation à base d'interféron ayant une activité antivirale, la préparation étant fabriquée par culture de cellules vivantes contenant au moins une partie du code d' ADN d'une cellule épithéliale humaine afin que l'interféron soit synthétisé et par récolte d'une fraction riche dans l'interféron de la culture, la préparation d'interféron étant caractérisée en ce que i) elle est stable à p H 2, ii) 'son activité antiviral e est détruite par des enzymes protéolytiques, iii) elle ne présente pas de réactivité mutuelle vis-à-vis d'un anticorps de l'interféron ou l'interféron-y, et iv) son activité antivirale sur des cellules de reins de boeufs MDBK est comprise entre le 1/4 et la 1/2 de son activité sur des

fibroblastes trisomiques humains (GM-2767).

2 Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la culture est une culture de cellules

épithéliales humaines.

3 Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la culture contient des cellules

eucaryotes transformées.

4 Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la culture contient des cellules dans lesquelles la partie du code ADN est insérée dans

les cellules par les techniques de l'ADN recombinant.

Préparation selon la revendication 1, caractérisée par un profil original de réactivité mutuelle vis-à-vis d'un mélange d'antisérums anti-a et antie tel que deux fois plus de l'interféron sont neutralisés par le mélange que par l'antisérum anti-e seul, pour des

unités égales d'activité neutralisante.

6 Procédé de fabrication d'une préparation d'interféron, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: A la production d'une culture de cellules vivantes contenant une portion du code de l'ADN de cellules épithéliales humaines; B l'incubation des cellules dans un milieu

dans des conditions qui favorisent la synthèse de l'inter-

féron; et

C la récolte d'une fraction riche dans l'inter-

féron des cellules, l'interféron ayant pour caractéristique: i) d'être stable à p H 2; ii) d'avoir une activité antivirale détruite par des enzymes protéolytiques, iii) de ne pas présenter de réactivité mutuelle vis-à-vis d'un anticorps de l'interféron-o L ou de l'interféron-y, et iv) d'avoir une activité antivirale sur des cellules de reins de boeufs MDBK comprise entre le 1/4 et la 1/2 de son activité sur

des fibroblastes trisomiques humains (G M-2767).

7 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la culture des cellules vivantes est une culture de cellules épithéliales humaines, et avant l'étape B, un virus est utilisé afin qu'il induise la production de

l'interféron par les cellules.

8 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la culture de l'étape A contient des cellules

eucaryotes transformées.

9 Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la culture-de l'étape A contient des cellules dans lesquelles la partie du code de l'ADN est insérée dans les cellules par des techniques mettant en oeuvre

1 '"ADN recombinant".

Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le virus est choisi dans le groupe qui comprend le

virus de la maladie de Newcastle et le virus Sendai.

11 Procédé selon la revendication 10, caracté-

risé en ce que le virus est la souche Bankowski du virus

de la maladie de Newcastle.

12 Procédé selon la revendication 7, caracté-

risé en ce que la culture de cellules est formée à partir de cellules échantillonnées dans un tissu épithélial humain choisi dans le groupe qui comprend l'épiderme, le tissu

conjonctif, le tissu vaginal et l'oesophage.